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대한자기공명의과학회지 12:8-19(2008)1가톨릭대학교 의과대학 의공학교실2한국기초과학지원연구원 자기공명영상팀3가톨릭대학교 의과대학 분자생명의학과접 수 : 2008년 1월 16일, 수 정: 2008년 4월 1일, 채 택 : 2008년 4월 21일통신저자 : 최보영, (137-040) 서울시 서초구 반포동 505번지, 가톨릭대학교 의과대학 의공학교실

Tel. (02)590-2427 Fax. (02) 590-2425 E-mail: bychoe@catholic.ac.kr

인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

최보영1·우동철1·김상영1·최치봉1·이성임2·김은희2·홍관수2·전영호2·정재준2·김상수3·임향숙3

목적 : 본 연구에서는 인체 뇌 대사물질에 대하여 2D MR 기술인 correlation spectroscopy

(COSY) 와 nuclear Overhauser effect/enhancement spectroscopy (NOESY)를 직접

적용하고, 데이터를 획득하여 인체 뇌대사물질들간의 스칼라 짝지움 (coupling)과 쌍극자

(dipolar) 상호작용- NOE에 대한 분석을 통하여 결합연결관계 및 공간연결관계에 대한 정

보를 획득하고자 하였다.

대상 및 방법 : 모든 2-D (dimensional) MR 실험 (즉, COSY와 NOESY)은 z축 능동차폐

펄스경사자장, 삼중공명 동결탐침기가 장착된 Bruker Avance 500 (11.8 T) 장비에서 298

K에 수행되었다. MRS상에서 뇌 대사물질과 유사하도록 만든 희석액을 만들었고, 최종 MRS

샘플은 10% D2O를 이용하였다. 2-D 스펙트라는 2048 복합 (complex) 데이터 포인트로서

총 320개 의 free induction decay (FID)를 평균화 (averaging)하였고, H2O에서 얻어진

스펙트라는 8012 Hz 였다. 반복지연 (repetition delay) 시간은 2초, 각각의 FID는 4개의

평균화를 선택하였다. 얻어진 2D-COSY, 2D-NOESY 데이터는 Top Spin 2.0 소프트웨어

에서 후 처리기법 (post-processing)에 의해 분석되었다. 분석 대상 대사물질은 N-acetyl

aspartate (NAA), creatine (Cr), choline (Cho), glutamine (Gln), glutamate (Glu),

myo-inositol (Ins), lactate (Lac)로서 총 7 가지 화학물로서 주요 목표 피크로 정했다.

결과 : 인체 뇌 대사물질에 대한 대칭형태의 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼을 획득하

였고, COSY 스펙트럼상에서는 오직 1.0-4.5 ppm 사이에서만 교차피크들이 생성된 반면

NOESY 스펙트럼상에서는 1.0-4.5 ppm 외에도 7.9 ppm에서 공명 교차피크를 발견할 수

있었다. COSY 스펙트럼을 통하여 lactate에서 메틸 프로톤과 CH 프로톤의 COSY 크로스

피크가 발견되었고, NAA에서 메틸렌 프로톤들간과 메틸렌 프로톤과 NH프로톤의 크로스피

크가 발견되었고, Ins에서 CH 프로톤 들간의 크로스피크가 발견되었다. NOESY 스펙트럼

을 통하여 NAA 분자내 NH 프로톤과 메틸 (-CH3) 프로톤과의 NOESY 크로스피크가 발

견되었고, lactate에서 메틸 프로톤과 CH 프로톤과의 크로스피크가 발견되었고, Cr에서 메

틸 프로톤과 메틸렌 프로톤과의 크로스피크가 발견되었고, Glu에서 메틸렌 프로톤 들간과 또

한 메틸렌 프로톤과 CH 프로톤과의 크로스피크가 발견되었고, Gln에서 메틸렌 프로톤과 CH

프로톤과의 크로스피크가 발견되었고, Ins에서 CH 프로톤 들간의 크로스피크가 발견되었다.

결론 : 본 연구에서는 in vitro 상태의 인체 뇌 대사물질에 2D-COSY와 2D-NOESY 기술

을 직접 적용하고, 결합연결관계 및 공간연결관계에 대한 정보를 성공적으로 획득하여 분석

하여 보았다. 본 연구 결과물은 향후 인체 내 in vivo 2D-COSY를 이용한 뇌 대사물질 연

구에 매우 유용하리라 사료된다.

서 론

최 근 까 지 자 기 공 명 분 광 법 (magnetic resonance

spectroscopy; MRS)은 생체 내 대사물질들을 정량분석하고,

생물학적 분자의 3차원 구조를 결정하는데 가장 강력한 방법

가운데 하나로 자리매김하여 왔고, 또한 비침습적으로 생체검

사 (biopsy)을 시행하지 않고 인체내의 여러 가지 대사산물들

을 식별하고 정량분석할 수 있는 방법으로서 질병부위의 물질

대사 변화를 토대로 진단에 도움을 주고 질병의 치료효과를 평

가하는 데 성공적으로 사용되어 왔다 (1-6). 또한 분자구조를

결정하는 방법 가운데 x-선 결정학 (crystallography)방법은

샘플이 고체형, 즉 결정형 (crystal)으로 제공되지 않으면 구

조를 밝힐 수 없는 반면에 자기공명분광법은 생체 내 비침습

적으로 생리학적 조건의 액체상태에서 직접 구조를 결정하므

로 현존하는 분자 구조 결정 방법 중 가장 정확성있는 방법으

로 평가 받아 왔다. 그러나, 자기공명분광법은 x-선 결정학적

인 방법에 비하여 분자량이 큰 거대분자 (분자량 10K 달톤 이

상)인 경우 분석하는데 매우 어렵고, 또한 데이터 획득하는데

매우 장시간을 요구하는 단점을 가지고 있다.

자기공명분광법 (MRS)에 의한 3차원 구조를 결정하는 가장

중요한 정보는 양성자들간의 3차원 거리정보와 이면각

(dihedral angle)이다. 양성자들간의 3차원 거리정보는 nuclear

Overhauser effect/enhancement (NOE)에 의해 획득되는데,

NOE 신호강도는 양성자들간의 거리에 의해 결정된다. 또한 이

면각은 vicinal coupling constant 분석법에 의하여 얻어진다.

따라서 양성자들간의 3차원 거리정보와 이면각에 대한 종합적

인 정보를 토대로 3차원 구조가 결정되므로 각 양성자들의 공

명피크들의 assignment는 원적으로 필수불가결하다. 그러므로

스펙트럼의 완벽한 assignment는 구조결정에 있어서 총체적

핵심이라고 볼 수 있다. 양성자 vicinal coupling constant 는

두 개의 양성자 간의 공간적 관계 정보를 제공하는데 Karplus

상관관계 그래프를 통하여 이면각은 90도에서 최소값을 갖고,

0도 및 180도에서 최대값을 갖는다 (7, 8).

지금까지 2-D (dimensional) MR 기술은 스펙트럼의

assignment를 결정하는데 지대한 역할을 해왔다. 특히 생물학

적 중요 물질들 (예, DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 등)을 포

함하여 새로운 약물의 3차원 구조분석 및 결정은 바이오 혁신

에 혁혁한 공로를 해왔다 (9). 2D MR 기술은 크게 결합연결

관계 (through-bond connectivity)과 공간연결관계 (through-

space connectivity)로서 2가지로 구분한다. 결합연결관계를

위하여 chemical shift correlation spectroscopy (COSY)

(10), relay COSY (11), total COSY (TOCSY) (12) and

homonuclear Hartman-Hahm (HOHAHA) spectroscopy

(13) 방법 등이 있고, 공간연결관계를 위하여 nuclear

Overhauser spectroscopy (NOESY) (14)와 rotating frame

NOESY (ROESY) (15)가 있다.

최근 2-D (dimensional) MR 기술을 인체 내에 적용하는

시도가 이루어지고 있고, 그 동안 몇 가지 괄목할만한 연구 성

과가 발표되었다 (16-20, 25, 26, 27). 그 중 인체 뇌에 대

한 연구가 가장 많이 이루지고 있고 (16-17, 21,23-24) 근

육 (18, 19)과 유방 (20)등에서도 이루어지고 있다.

본 연구에서는 인체 뇌 대사물질에 대하여 2D MR 기술인

COSY와 NOESY를 직접 적용하고, 데이터를 획득하여 인체 뇌

대사물질들간의 스칼라 짝지움(coupling)과 쌍극자 (dipolar)

상호작용-NOE에 대한 분석을 통하여 결합연결관계 및 공간

연결관계에 대한 정보를 획득하고자 하였다.

대상과 방법

1. 배경2D MR 기술은 기존 1D MR 기술에서 한 단계 더 앞선 기

술이다. 즉, 기존 1D MR 기술에서 사용된 초기 준비기간

(preparation period)과 신호 획득기간 (detection period) 사

이에 스핀 전개기간 (evolution period)과 스핀 혼합시간

(mixing time)을 삽입하면 된다. 전형적인 2-D MRS 펄스시

퀀스 diagram을 Figure 1에서 볼 수 있다. 스핀 전개시간을

t1으로 정의하고 신호획득 시간을 t2로 정의한다. 따라서 스펙

트럼 결과는 t1과 t2의 2차원 데이터로 구성되고, 이 데이터

를 2차원 Fourier transform (FT)하여 스펙트럼화 한다.

일반적으로 초기 준비기간에는 스핀들이 외부자기장의 영향

을 받으면서 열 평형상태를 유지하게 되고, 스핀 전개기간에는

90도 펄스의 영향을 받은 직후 스핀들은 외부자기장을 중심으

로 주어진 t1 시간 동안 자유롭게 세차운동을 하면서, 스핀들

간의 자화가 명시/분류 (labeling) 된다. 스핀 혼합시간에는 첫

번째 스핀에서 두 번째 스핀으로 자화가 이전하는데, 이 때 혼

합시퀀스에서 자화 이전의 두 가지 특성, 즉 스칼라 짝지움

(coupling)과 쌍극자 (dipolar) 상호작용 (NOE)를 선택할 수

인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

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Fig. 1. Typical pulse sequence diagram for 2D-correla-tion spectroscopy (COSY). This consists of preparation,evolution, mixing, and detection periods.

있다. 신호 획득기간에는 두 번째 스핀으로 이전된 자화 신호

를 탐지하게 된다.

2차원 FT을 통하여 2개의 주파수축에 대한 스펙트럼을 산

출하는데 Figure 2는 전형적인 동종 핵종간의 스펙트럼을 보

여준다. 여기서 2차원 스펙트럼에서 대각선 (diagonal) 피크

(즉, Ad와 Bd)와 교차 (cross) 피크 (즉, ABx)로 구성된다.

2D 스펙트럼은 대각선을 중심으로 대칭이며, 한 방향으로 투

시 (projection) 되는 스펙트럼을 바로 1D 스펙트럼에 해당한

다. 대각선 피크들은 동일한 같은 스핀 (즉, Ad와 Bd)으로부

터 자화가 전개되므로 자화 전이가 이루어지지 않아 그대로 그

자리에 존재하게 된다. 반면에 교차 (cross) 피크 (즉, ABx)

는 스핀 혼합시간 동안 첫 번째와 두 번째 스핀들간의 자화가

전이되어 그 결과 나타난 생성물이다. 따라서 대각선 피크들간

의 상호관계가 있는 경우 교차피크가 생성된다. 그러므로 교차

피크들은 2D MR 스펙트럼에서 가장 중요한 정보를 함유하고

있다고 볼 수 있다.

Figure 3은 전형적인 아미노산 backbone 구조를 보여주는

모식도이다. 아미노기 (NH3+)와 카르복실기 (COO-) 사이에

Cα이 존재하고, Cα에 붙어있는 연결된 H를 Hα로 명시하고 이

어서 Cβ에 붙어있는 연결된 H를 Hβ로 명시하고 이어서 Cγ에

붙어있는 연결된 H를 Hγ로 명시한다. 이러한 구조를 갖는 아

미노산을 2D 스펙트럼으로 산출하면 Figure 4와 같은 결과를

얻을 수 있다.

Figure 4는 전형적인 2-D COSY 스펙트럼으로서 Figure 3

최보영 외

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Fig. 2. General spectrum of 2D-homonuclear MR spec-troscopy. This consists of diagonal and cross peaks. Across peak (ABx) can be made if there is any relationshipbetween proton (A) and proton (B). The characters ‘d’and ‘x’represent diagonal and cross peaks, respective-ly. The ω1 and ω2 axes represent data obtained during t1(evolution period) and t2 (detection period), respective-ly. 2D Fourier transform (FT) yields the 2D spectrumwith two frequency axes.

Fig. 3. The general amino acid backbone structure. TheCαexists between the amino group (NH3) and carboxyl(COOH) group. The Hα, Hβ, and Hγrepresent protonsattached to Cα, Cβ, and Cγ, respectively. The characterR’represents the carbon chain, which can be continu-ous.

Fig. 4. The typical 2D-COSY spectrum of the amino acidbackbone in Figure 3. This shows diagonal and crosspeaks for 3-bond coupling connectivity.

인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

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Fig. 5. Chemical structures of the major human brain metabolites. Proton number is assigned with respect to carbon.

에서 보여준 아미노산 구조물에서 NH, Hα, Hβ, Hγ등의 3-

bond coupling connectivity를 대각선 (diagonal) 피크 와 교

차 (cross) 피크를 통하여 보여준다. 자화가 스칼라 coupling

을 통하여 이전되었음을 알 수 있다. 4J coupling constant는

거의 0에 가까우므로 3 bond 이상인 경우 거의 교차 피크를

얻을 수 없다. 또한 NH와 Hα의 교차피크는 아미노산 backbone

구조를 표시하는 이면각에 대한 정보를 얻을 수 있기 때문에

매우 중요하다. 참고로 각각 두 개의 Hβ와 Hγ양성자들은 서

로간의 구별을 못할 정도로 일치된 화학적 자기적 성질을 가

지므로 2D 스펙트럼상에서 역시 구별할 수 없다. 양성자 자기

공명 분광법에 의하여 탐지 가능한 주요 인체 뇌 대사물질들

의 화학 구조를 Figure 5에서 확인 가능하다.

2. 샘플 및 2D-COSY, 2D-NOESY 실험 및 데이터 분석

MRS상에서 뇌 대사물질과 유사하도록 희석액을 만들었고,

내용물은 GE brain MRS 팬톰 (GE Medical Systems,

Milwaukee, WI, USA)을 위한 자료를 참고하였다 (Table 1)

(21). 모든 실험은 z 축 능동차폐 펄스경사자장 (z-actively

shielded Pulsed Field Gradient: PFG) 코일이 장착되고, 삼

중공명 동결탐침 (triple resonance cryoprobe가 장착된

Bruker Avance 500 (11.8 Tesla) 장비 에서 구적 탐지법

(quadrature detection mode)에 의해 수행되었다. 또한 모든

2D 실험은 298 K에 수행되었다. PFG 기술은 수분 용매신호

강도를 효율적으로 억제하면서 모든 H2O/D2O에 사용 가능하

최보영 외

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Table 1. Phantom Ingredients of the Various Metabolites in the Brain Mimicking Solution

Compound Abbreviation CAS no. Concentration

Potassium phosphate monobasic KH2PO4 [7779-77-0] 50.0 mMSoduim hydroxide NaOH [1310-73-2] 56.0 mMSodium azide [26628-22-8] 0.01 %L-Glutamic acid Glu [6106-04-3] 12.5 mML-Glutamine Gln [6106-04-2] 12.5 mMCreatine hydrate Cr [6020-87-7] 10.0 mMCholine chloride Cho [67-48-1] 3.0 mMN-Acetyl-L-aspartatic acid NAA [997-55-7] 12.5 mMMyo-inositol Ins [87-89-8] 7.5 mMDL-Lactic acid Lac [16891-53-5] 5.0 mMMagnevist Gd-DPTA 1 ml/l

a bFig. 6. In vitro 2D MRS spectra for human brain metabolites including from 0 ppm to 12 ppm for full scale data. (a)COSY spectrum (b) NOESY spectrum. Cross peaks were observed at 7.9 ppm as well as from 1.0 ppm to 4.5 ppm (ar-row).

다. 따라서 본 연구에서도 PFG 기술을 채택하여 수분신호강도

를 억제하였다. 최종 MRS 샘플은 10% D2O를 이용하였다. 2D

spectra는 2048 복합 데이터 포인트로서 총 320개의 FID를

평균화 하였고, H2O에서 얻어진 스펙트라는 8012 Hz 였다.

반복지연 (repetition delay) 시간은 2초, 각각의 FID는 4개의

평균화를 선택하였다. 2D-NOESY 스펙트럼을 얻기 위하여

150 ms의 혼합시간을 사용하였다. 모든 2D 실험은 time

proportional phase incrementation (TPPI) 방법을 사용하였

다 (22).

획득한 2D-COSY, 2D-NOESY 데이터는 Top Spin 2.0 소

프트웨어 (Bruker Biospin)에서 후처리 기법에 의해 분석되었

다. NAA 피크를 기준점 (reference point) 2.02 ppm으로 정

하였다. Gaussian shape fitting를 이용하여 대사물질 정량분

석을 시도하였다. 주요 분석대상 대사물질은 N-acetyl

aspartate (NAA), creatine (Cr), choline (Cho), glutamine

(Gln), glutamate (Glu), myo-inositol (Ins), lactate (Lac)

로서 총 7가지 화학물이었고, 화학적 이동 (chemical shift) 값

은 기존 발표된 데이터를 사용하였다 (Table 2) (23, 24). 총

7가지 주요 대사물질의 화학적 이동을 표출하는 양성자들의 명

칭은 Table 2에 명시되어 있다. 또한 각 양성자들의 화학구조

상의 위치 및 번호 (numbering)는 Figure 5에 명시되어 있다.

결 과

인체 뇌 대사물질로 선정한 주요 분석대상 대사물질 (NAA,

Cr, Cho, Gln, Glu, Ins) 7개 화학물질의 스펙트럼을 확인할

수 있었다. 인체 뇌 대사물질을 이용하여 2D MR 기법인 2D-

COSY와 2D-NOESY 스펙트럼을 성공적으로 획득하였다

(Figure 6). 전반적으로 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼

은 대각선을 중심으로 대칭형을 이루었다. 동종핵종 (수소-수

소) 2D 기술으로서 횡축/종축 모두 양성자 화학적 전이

(chemical shift) 범위에서 표시되었다. 2.02 ppm 위치에서

NAA를 확인하여, 기준점으로 결정한 후 다른 대사물질들에 대

한 화학적 전이를 명시하였다. NAA를 이용한 공명기준 결과

Cr (3.03 ppm), Cho (3.22 ppm), Lac (1.28 ppm) 등 주요

대사물질들의 피크를 명확하게 확인할 수 있었다.

Figure 6에서 보듯이 수분억제에 의한 수직/수평 노이즈 피

크가 많이 포함되어 있어도 전반적으로 NOESY 교차피크의 개

인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

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Table 2. Chemical shift (δ)a and COSY/NOESY Connectivities of the Typical Brain Metabolites by Proton MRS.b

Compound (ppm) Resonance COSY Connectivity NOESY Connectivity

NAA 2.02 CH3 CH2(3,Hα)+CH2 (3,Hβ) CH3 + NH2.50 CH2(3,Hα)2.70 CH2 (3,Hβ)4.39 CH(2)8.00 NHc

Cr 3.03 CH3 CH3 +CH23.93 CH2

Cho 3.24 N(CH3)3

3.56 CH2 (2)4.07 CH2 (1)

Glu 2.11 CH2 (3) CH2 (3)+ CH2 (4) CH2 (3)+CH2 (4)2.35 CH2 (4) CH2 (3)+CH(2)3.76 CH(2)

Gln 2.14 CH2 (3) CH2 (3) +CH(2)2.46 CH2 (4)3.79 CH(2)6.13 CH(1’) c

8.25 CH(2)8.54 CH(8)

Ins 3.27 CH(5) CH(5)+ CH(4,6) CH(5)+ CH(4,6)3.53 CH(1,3) CH(1,3)+CH(4,6) CH(1,3)+ CH(2)3.59 CH(4,6) CH(1,3)+ CH(2)4.05 CH(2)

Lac 1.33 CH3(3) CH3(3)+ CH(2) CH3(3)+ CH(2)4.11 CH(2)

a VS. TMS at 0.0ppmb Abbreviations are listed in Table 1c Temperature-dependent chemical shift; in vivo ? = 7.85 ppmd Sugar proton

수가 COSY 교차피크의 개수보다 많은 것이 밝혀졌다. 일차원

스펙트럼상으로 수분억제 정도 측면에서 NOESY 스펙트럼이

COSY 스펙트럼보다 더 우수하였다. COSY 스펙트럼상에서는

오직 1.0-4.5 ppm 사이에서만 교차피크들이 생성되었다. 반

면 NOESY 스펙트럼상에서는 1.0-4.5 ppm 외에도 7.9 ppm

에서 공명 교차피크를 발견할 수 있었다. 이는 NAA 분자내

NH 양성자와 메틸 (-CH3) 양성자는 3차원 공간상에서 5 Å

이내에 존재함을 의미한다.

COSYLactate: 1.33 ppm에서 확인된 lactate 메틸 (-CH3) 양성

자와 4.11 ppm에서 확인된 lactate 양성자 (-CH-)와의 3

bond coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 6a).

NAA: 2.50 ppm에서 확인된 NAA 메틸렌 (-CH2: 3Hα) 양

성자와 2.70 ppm에서 확인된 NAA 메틸렌 양성자 (-CH2:

3Hβ)와의 3 bond coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure

7a).

Glu: 2.11 ppm에서 확인된 메틸렌 (CH2(3)) 양성자와 2.35

ppm에서 확인된 메틸렌 (CH2(4)) 양성자와의 3 bond

coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7a).

Ins: 3.27 ppm에서 확인된 메틴 (CH(5)) 양성자와 3.59

ppm에서 확인된 메틴 (CH(4,6)) 양성자와의 3 bond coupling

교차피크가 발견되었고, 같은 Ins 분자구조 내에서 3.53 ppm

에서 확인된 메틴 (CH(1,3)) 양성자와 3.59 ppm에서 확인된

메틴 (CH(4,6)) 양성자와의 3 bond coupling 교차피크가 발

견되었고, 또한 같은 Ins 분자구조 내에서 3.53 ppm에서 확

인된 메틴 (CH(1,3)) 양성자와 4.05 ppm에서 확인된 메틴

(CH(2)) 양성자와의 3 bond coupling 교차피크가 발견되었다

(Figure 7a, Figure 9a).

NOESYLactate: 1.33 ppm에서 확인된 메틸 ((-CH3)) 양성자와

4.11 ppm에서 확인된 메틴 (CH(2)) 양성자와의 through

space coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7b).

Cr: 3.03 ppm에서 확인된 메틸 (CH3) 양성자와 3.93 ppm

에서 확인된 메틸렌 (CH2) 양성자와의 through space

coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7b).

Glu: 2.11 ppm에서 확인된 메틸렌 (CH2(3)) 양성자와 3.76

ppm에서 확인된 메틴 (CH(2)) 양성자와의 through space

coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7b). 또한 2.11 ppm

에서 확인된 메틸렌 (CH2(3)) 양성자와 2.35 ppm에서 확인

된 메틸렌 (CH2(4)) 양성자와의 through space coupling 교

차피크가 발견되었다 (Figure 8b).

Gln: 2.14 ppm에서 확인된 메틸렌 (CH2(3)) 양성자와 3.79

ppm에서 확인된 메틴 (CH(2)) 양성자와의 through space

coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7b).

Ins: 3.27 ppm에서 확인된 메틴 (CH(5)) 양성자와 3.59

ppm에서 확인된 메틴 (CH(4,6)) 양성자와의 through space

coupling 교차피크가 발견되었다 (Figure 7b, Figure 9b). 또

한 같은 Ins 분자구조 내에서 3.53 ppm에서 확인된 메틴

(CH(1,3)) 양성자와 4.05 ppm에서 확인된 메틴 (CH(2)) 양

성자와의 through space coupling 교차피크가 발견되었다.

최보영 외

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a bFig. 7. In vitro 2D MRS spectra for human brain metabolites including from 1 ppm to 4.5 ppm. The typical scale in-cluding for brain metabolites. (a) COSY spectrum (b) NOESY spectrum

(Figure 7b, Figure 9b).

그리고 Figure 10에서 볼 수 있듯이 2.00- 2.15 ppm 사

이에는 2.02 ppm 의 NAA 메틸 (CH3) 양성자, 2.11 ppm의

Glu 메틸렌 (CH2(3)) 양성자, 2.14 ppm의 Gln 메틸렌

(CH2(3)) 양성자들이 거의 비슷한 공명주파수 하에 겹쳐져 있

는 모습을 보여준다.

Lactate는 2D-COSY 스펙트럼의 1.33 ppm에서 명확한 두

개 (doublet) 피크로 확인되었다 (Figure 11).

인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

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a bFig. 8. In vitro 2D MRS spectra for human brain metabolites including from 1.9 ppm to 2.8 ppm. (a) COSY spectrum(b) NOESY spectrum. The cross peaks were observed for neurotransmitter (Glx) around 2.5 ppm as an evidence forthe closest distance between corresponding protons.

a bFig. 9. In vitro 2D MRS spectra for human brain metabolites including from 3.11 ppm to 4.2 ppm. (a) COSY spectrum(b) NOESY spectrum. The cross peaks were observed for myo-Inositol (Ins) at 3.5 ppm.

COSY와 NOESY를 직접 적용하여 인체 뇌 대사물질들간의

스칼라 짝지움 (coupling)과 쌍극자 (dipolar) 상호작용-NOE

에 대한 양성자들간의 3-bond 연결관계 및 공간거리 연결관

계에 대한 connectivity는 Table 2에 정리되어 있다.

결 론

본 연구에서는 in vitro 상태의 인체 뇌 대사물질에 2-D MR

기술, 즉 2D-COSY와 2D-NOESY 기술을 직접 적용하고, 데

이터를 획득하여 인체 뇌 대사물질들간의 스칼라 짝지움

(coupling)과 쌍극자 (dipolar) 상호작용-NOE에 대한 분석을

통하여 결합연결관계 및 공간연결관계에 대한 정보를 성공적

으로 획득하여 분석하여 보았다.

인체 뇌 대사물질 중 주요 분석대상으로 선정한 총 7가지

화학물 (NAA, Cr, Cho, Gln, Glu, Ins)은 스펙트럼상에서 모

두 확인 가능하였다. 팬톰 화학물 제작 시 농도를 이미 학계

에 발표된 수치를 사용하였기에 정량분석을 이루어 지지 않았

다. 그러나 조영제 Magnevist에 화학적 이동 (chemical shift)

및 정량에 대한 정보는 확보할 수 없었다. 이는 Magnevist의

농도가 1 ml/l. (Table 1)로서 너무 미량이라 스펙트럼상에 표

출되지 못한 가능성도 있으리라 사료된다.

예상한대로 2차원 COSY와 NOESY 스펙트럼은 1차원 스펙

트럼보다 1차원 증가한 만큼 해상도가 향상되었다. 단순한 투

시 (projection)선 만을 보여주는 1차원 스펙트럼에 비하여 2

차원 스펙트럼은 여러 가지 다양한 병리학적 변화와 직결되는

대사물질의 변화를 측정하는데 사용할 수 있는 교차피크를 보

여준다.

수분억제를 위한 CHESS 펄스에 의하여 2D 스펙트럼은 대

각선을 중심으로 정확히 대칭을 이루지 않기 때문에 일반적으

로 대각선을 중심으로 아래에 위치한 교차피크를 사용한다

(25). 물론 대각선을 중심으로 대칭성을 이용한 평균치 산출

방법으로 이차원 후처리 기법에 분석할 수 있으나 인공

(artificial) 크로스피크 발생 가능성이 있으므로 배제하였다. 결

최보영 외

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a bFig. 10. In vitro 2D MRS spectra for human brain metabolites including from 1.96 ppm to 2.2 ppm. (a) COSY spec-trum (b) NOESY spectrum. The peaks for neurotransmitter at 2.0 ppm were not distinguishable in 1D spectrum, butcan be identified in 2D spectrum.

Fig. 11. In vitro 2D-COSY spectra for human brainmetabolites. The cross peaks for lactate at 1.3 ppm wereobserved as doublet.

론적으로 2D-COSY 스펙트럼은 피크를 분해하는데 정확도가

매우 탁월함을 확인할 수 있었다.

본 연구결과 중 COSY 스펙트럼을 통하여 분자 내 through

bond 상호작용에 관한 정보를 획득할 수 있었는데, 특히 3-

bond 연결 (connectivity) 정보를 직접 획득할 수 있다. 따라

서 COSY 크로스피크가 발견되면 우선적으로 해당 양성자들

간에 3-bond의 연결 고리가 형성되어 있음을 확인할 수 있

다. 따라서 우선적으로 Lac에서 메틸 양성자와 메틴 양성자와

의 COSY 크로스피크가 발견되었고, NAA에서 메틸렌 양성자

들간과의 크로스피크가 발견되었고, Gln에서 메틸렌 양성자들

간의 크로스피크가 발견되었고, Ins에서 메틴 양성자들간의 크

로스피크가 발견되었다. 이는 분자 구조학상 3-bond 연결 상

태를 재확인 시켜주는 결과이다.

본 연구결과 중 NOESY 스펙트럼을 통하여 분자 내 through

space 상호작용에 관한 정보를 획득할 수 있었는데, NOESY

크로스피크가 발견되면 우선적으로 해당 양성자들간의 거리가

공간상에서 5 Å 이내에 존재함을 의미한다. 따라서 우선적으

로 NAA 분자내 NH 양성자와 메틸 (CH3) 양성자와의 NOESY

크로스피크가 발견되었고, Lac에서 메틸 양성자와 메틴 양성

자와의 크로스피크가 발견되었고, Cr에서 메틸 양성자과 메틸

렌 양성자와의 크로스피크가 발견되었고, Glu에서 메틸렌 양성

자들간과 또한 메틸렌 양성자와 메틴 양성자와의 크로스피크

가 발견되었고, Gln에서 메틸렌 양성자와 메틴 양성자와의 크

로스피크가 발견되었고, Ins에서 메틴 양성자들간의 크로스피

크가 발견되었다. 이는 분자 구조학상 3차원 공간적으로 매우

의미 있는 결과들로서 사료된다.

인체 뇌 대사물질을 사용하여 획득한 COSY와 NOESY 데

이터는 향후, 인체에서 직접 획득한 COSY와 NOESY의 데이

터를 비교 분석하는데 매우 유용하리라 사료된다. 본 연구의

COSY와 NOESY는 11.8T에서 획득한 자료로서 현재 임상적

으로 활발히 이용하고 있는 1.5T, 3T의 자료 보다 상당히 정

밀하고 정확한 정보를 제공하리라 예상한다.

Thomas 와 그의 동료들은 1.5T를 이용하여 처음으로 인체

뇌에서 2D-COSY를 획득하는 시도를 하였고 (16), 비록 저

해상도이지만 성공적인 결과물을 얻었다. 그 후 Thomas 와 그

의 동료들은 3T에서 인체 뇌 in vivo 2D-COSY를 보고하였

는데, 본 연구결과와 비교하여 대사물질 중 γ-aminobutyric

acid (GABA)의 존재가 추가되었고, 다른 대사물질들은 모두

동일하였다 (17). In vivo 2D-COSY는 in vitro에 비하여 스

펙트럼 노이즈가 무척 많이 포함되었는데, 이는 2D-COSY를

획득하기에 3T에서도 아직 충분한 SNR확보가 문제가 되는 것

으로 추정한다.

반면 7.0T (Varian 300 MHz)에서 생체 내 쥐 뇌의 2D-

COSY를 획득한 Welch와 그의 동료들은 ISIS-COSY기법을

이용하여 노이즈가 없는 고해상도 스펙트럼을 획득하는데 성

공했다 (26). 그들이 제안한 Image selected in vivo

spectroscopy (ISIS)-COSY기 법 은 outer-volume

suppression (OVS)에 위한 노이즈 억제에 매우 뛰어난 반면

수분억제 효율성에서 매우 심각한 단점을 나타냈다.

임상적으로 1.5T에서 2D-COSY와 DQF (double quantum

filtered)-COSY를 급성 백혈병환자의 Tibial bone marrow에

서 획득하여 임상에 적용하는 시도도 보고되었는데 (27), 정

상인과 환자군에서 Tibial bone marrow의 T1과 T2 시간의

차이가 상당히 큰 것으로 나타났다.

일반적으로 COSY의 화학적이동 assignment를 NOESY 보

다 우선적으로 실행하는데 그 이유는 COSY의 through bond

상호작용에 대한 확실한 정보를 먼저 확보하고 실험에 임하기

때문이다. 특히 단백질, DNA, RNA, 탄수화물과 같은 거대분

자의 COSY와 NOESY 화학적이동 assignment는 상당히 복잡

하며 어려운데, 이는 3차원 분자구조가 액체상태에서 고정되어

있지 않고 dynamic하게 움직이기 때문이다. 특히 예상하지 못

한 3차원 구조로부터 발생할 수 있는 NOESY 크로스피크의

출현이 종종 발생하는데, 이러한 거대분자의 NOESY 크로스피

크이야말로 액체상태의 거대분자의 3차원구조를 결정하는데 가

장 핵심적이고 귀중한 정보로 평가 받고 있다. 따라서 이러한

NOESY 크로스피크의 집합체를 모두 동원하여 분자들간의 제

한거리 (constraint distance)를 필수조건으로 한 모든 가능한

분자구조를 모두 제시하고, 이를 에너지 최소화 (energy

minimization)하여 가장 안정된 분자구조를 결정하고, 그 후 인

체에 적합한 열에너지 조건을 주입하여 분자 동력학 (molecular

dynamics)을 통하여 인체 내에서 3차원 분자구조 실존 가능

성을 분자 궤적 (molecular trajectory)으로 유추할 수 있다.

Acknowledgements본 연구는 서울시 R&BD Program (10550), the Korea

Health 21 R&D Project, Ministry of Health & Welfare,

Republic of Korea (02-PJ3-PG6-EV07-0002),

(A081057), 한국과학재단 목적기초연구과제 (R01-2007-

000-20782-0)로 지원되었다. 또한 본 연구는 한국기초과학

지원연구원 (Korea Basic Science Institute: KBSI) NMR 장

비를 사용하여 연구결과를 획득하였다.

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인체 뇌 대사물질에서의 In vitro 2D-COSY와 2D-NOESY 스펙트럼 분석 평가

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Address reprint requests to : Bo-Young Choe, Ph.D. Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, The Catholic University of Korea, #505 Banpo-Dong, Seocho-Gu, Seoul 137-040, Korea.Tel. 82-2-590-2427 Fax. 82-2-590-2425 E-mail: bychoe@catholic.ac.kr

Evaluations of Spectral Analysis of in vitro 2D-COSY and 2D-NOESY onHuman Brain Metabolites

Bo-Young Choe1, Dong-Cheol Woo1, Sang-Young Kim1, Chi-Bong Choi1, Sung-Im Lee2, Eun-Hee Kim2, Kwan Soo Hong2, Young-Ho Jeon2, Chaejoon Cheong2,

Sang-Soo Kim3, Hyang-Sook Lim3

1Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea2MR Team, Korea Basic Science Institute, Choongbuk, Korea

3Department of Molecular Genetics, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea

Purpose : To investigate the 3-bond and spatial connectivity of human brain metabolites by scalar cou-pling and dipolar nuclear Overhauser effect/enhancement (NOE) interaction through 2D- correlationspectroscopy (COSY) and 2D- NOE spectroscopy (NOESY) techniques. Materials and Methods : All 2D experiments were performed on Bruker Avance 500 (11.8 T) with the z-shield gradient triple resonance cryoprobe at 298 K. Human brain metabolites were prepared with 10%D2O. Two-dimensional spectra with 2048 data points contains 320 free induction decay (FID) averaging.Repetition delay was 2 sec. The Top Spin 2.0 software was used for post-processing. Total 7 metabolitessuch as N-acetyl aspartate (NAA), creatine (Cr), choline (Cho), glutamine (Gln), glutamate (Glu), myo-in-ositol (Ins), and lactate (Lac) were included for major target metabolites.Results : Symmetrical 2D-COSY and 2D-NOESY spectra were successfully acquired: COSY cross peakswere observed in the only 1.0-4.5 ppm, however, NOESY cross peaks were observed in the 1.0-4.5 ppmand 7.9 ppm. From the result of the 2-D COSY data, cross peaks between the methyl protons (CH3(3)) at1.33 ppm and methine proton (CH(2)) at 4.11 ppm were observed in Lac. Cross peaks between the meth-ylene protons (CH2(3,Hα)) at 2.50ppm and methylene protons (CH2,(3,HB)) at 2.70 ppm were observed inNAA. Cross peaks between the methine proton (CH(5)) at 3.27 ppm and the methine proton (CH(4,6)) at3.59 ppm, between the methine proton (CH(1,3)) at 3.53 ppm and methine proton (CH(4,6)) at 3.59 ppm,and between the methine proton (CH(1,3)) at 3.53 ppm and methine proton (CH(2)) at 4.05 ppm were ob-served in Ins. From the result of 2-D NOESY data, cross peaks between the NH proton at 8.00 ppm andmethyl protons (CH3) were observed in NAA. Cross peaks between the methyl protons (CH3(3)) at 1.33ppm and methine proton (CH(2)) at 4.11 ppm were observed in Lac. Cross peaks between the methyl pro-tons (CH3) at 3.03 ppm and methylene protons (CH2) at 3.93 ppm were observed in Cr. Cross peaks be-tween the methylene protons (CH2(3)) at 2.11 ppm and methylene protons (CH2(4)) at 2.35 ppm, and be-tween the methylene protons(CH2 (3)) at 2.11 ppm and methine proton (CH(2)) at 3.76 ppm were ob-served in Glu. Cross peaks between the methylene protons (CH2 (3)) at 2.14 ppm and methine proton(CH(2)) at 3.79 ppm were observed in Gln. Cross peaks between the methine proton (CH(5)) at 3.27 ppmand the methine proton (CH(4,6)) at 3.59 ppm, and between the methine proton (CH(1,3)) at 3.53 ppmand methine proton (CH(2)) at 4.05 ppm were observed in Ins. Conclusion : The present study demonstrated that in vitro 2D-COSY and NOESY represented the 3-bondand spatial connectivity of human brain metabolites by scalar coupling and dipolar NOE interaction. Thisstudy could aid in better understanding the interactions between human brain metabolites in vivo 2D-COSY study.

Index words : Magnetic resonance spectroscopy (MRS), 2D-MR, COSY, NOESY

J. Korean Soc. Magn. Reson. Med. 12:8-19(2008)