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• 源自希腊语的 taxis (“arrangement”排列) and nomos (“law”法规)
Classification (分类): 由具体到抽象---收集大量描述有关个体的 文献资料,整理成科学的分类系统
Identification(鉴定) :从抽象到具体---将未识别的生物归类为
某一确定分类单元的行为和结果 Nomenclature(命名): 对每个新的类型微生物进行命名的过程
• Taxonomy (分类学) is an agreement among people
1)NCBI数据库:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy 优点:对自己的序列进行比较分析 缺点:有很多错误的分类信息
2)RDP数据库: http://rdp.cme.msu.edu(适用于群落结构分析)
优点1:从NCBI取出16S rRNA基因序列后,通过分析确认其分类信息
优点2:对很多(几百条)序列确定分类信息
3)LPSN数据库: http://www.bacterio.cict.fr/ 优点:严格按照分类规则建立,能了解不同层次分类(包括典型菌株信息)
缺点:不能比较测序结果,不能进行分类鉴定
4) EzTaxon: http://eztaxon-e.ezbiocloud.net 优点:包括典型菌株信息,也能比较测序结果,可以进行分类鉴定
5)Bergey氏原核生物分类系统:不仅是序列信息,形态学、生化信息全
• Category (taxon, 分类单位)– Domain (域)
- Phylum,Division(门)
- Class (纲)
- Order (目)
- Family (科)
- Genus (属)
- species (种) (
各级分类单元
Fungi
Eukarya
Ascomycota
Hemiascomycetes
Saccharomycetales
Saccharomycetaceae
Saccharomyces
S. cerevisiae
Baker’s yeast
Species
Genus
Family
Order
Class
Phylum
Kingdom
Domain
All organisms
M. okinawensis
Methanothermococcus
Methanococcaceae
Methanococcales
Methanococci
Euryarcheota
None assigned for archaea
Archaea
Methanococcus E. coli
E. coli
Escherichia
Enterobacteriaceae
Enterobacteriales
Gammaproteobacteria
Proteobacteria
None assigned for bacteria
Bacteria
门
域
纲
目
科
属
种
界
菌株又称品系(在非细胞型的病毒中则称毒株或株),表示任何由
一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁殖而成的纯遗传型群体及
其一切后代。
菌株(strain)
菌株 (strain) = 纯培养物 (pure culture)
= 克隆 (clone)
典型菌株(type strain)
一个种内的一个典型菌株作为这个种的具体代表。
注意:典型菌株一般由两个以上国家的菌种保藏 机构保藏,以便备
查考、索取和购买。
• sp. vs spp.– Bacillus sp. (一种芽孢杆菌)
– Bacillus spp. (若干种芽孢杆菌)
• Strain (菌株)– Escherichia coli K12
• Type strain (典型菌株)
Rhizobium daejeanense L61T
微生物命名 (拉丁文)
例: Escherichia coli, E. coli, Escherichia sp. K12, Escherichia sp.,Escherichia spp., and “the genus Escherichia”
属名可用缩写,但种名不能缩写
属名可以单独用,但种名必须与属名一起用
属名和种名必须要用斜体,当手写时需用下划线
文章中第一次用学名时需要用全称,第二次开始属名可以用缩写(但必须与种名一起用)。
如果用缩写后可能与其它属引起混淆,就不能用缩写。
Escherichia coli K12属名 种名 菌株名
俗名(common name)
指普通的、通俗的、地区性的名字,具有
大众化和简明的优点,但往往涵义不够确切,
易于重复,使用范围局限。
例如,“结核杆菌” 是Mycobacterium tuberculosis
(结核分枝杆菌)的俗名;
“红色面包霉”是Neurospora crassa(粗糙脉孢菌)
的俗名。
• Approved List of Bacterial Name (International Journal of Systematic Bacteriology 1980, 30:255-429)
– 在 Approved List之前,没有固定的规律来描述新的种
e.g., 链霉菌(Streptomyces )属曾同时包含超过3,000 种
• 统一的系统
• 理事会:International committee on systematic bacteriology (ICSB) (系统细菌学国际委员会)
• 规则:细菌命名法的国际法规
• 官方杂志
– International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB)– International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)
(From 2000)
• 没有纯培养
• 通过有限的信息描述
– 16S rDNA– Morphology(形态学) (荧光原位杂交后 TEM,
SEM)– Ecology(生态学-生存环境、生长条件)
– 其它信息(全基因组分析等)
二、三域学说及其发展
三域学说是70年代末由C.R. Woese对大量微生
物和其他生物进行16S和18S rRNA的寡核苷酸
检测,并比较其同源性水平后提出的。
域:一个比界更高的界级分类单元。
细菌域
古生菌域
真核生物域
甲烷球菌
甲烷栖热菌
甲烷杆菌
古生球菌
嗜盐甲烷菌
甲烷八叠球菌
热原体
甲烷螺菌
盐杆菌
盐球菌
甲烷嗜热菌
热网菌
热变型菌
热球菌 硫化叶菌
硫还原球菌
Korarchaeota
Crenarchaeota
Euryarchaeota 广古生菌
泉古生菌
古古生菌
1923年第1版1925年第2版1930年第3版1934年第4版1939年第5版1948年第6版1957年第7版1974年第8版1994年第9版
《伯杰氏鉴定细菌学手册》
第9版的伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群,
将古生菌部改编为5个群,全书描写约500个属。
划分为四大类:
第一类 具细胞壁的革兰氏阴性细菌
第二类 具细胞壁的革兰氏阳性细菌
第三类 无细胞壁的细菌
第四类 古生菌
《伯杰氏系统细菌学手册》第1版(1984年)是在《伯杰氏鉴定
细菌学手册》第8版(1974年)的基础上,根据10多年来细菌分
类所取得的进展编写的。
《系统手册》的新内容:
G+C mol%、核酸杂交、16 S rRNA寡核苷酸序列等系统发育方面
的资料,特别是许多新的分类单元的划分,都是经过核苷酸序列
比较后提出的。
《伯杰氏系统细菌学手册》
1984-1989年第1 版
2000-2012年第2 版
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition ) Springer, New York
Volume 1 (2001) The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria
Volume 2 (2005)The Proteobacteria (变形菌门)
Volume 3 (2009)The Firmicutes (厚壁菌门)
Volime 4 (2011) The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes
(Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres,Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia,Chlamydiae, and Planctomycetes
Volume 5 (2012)The Actinobacteria (放线细菌门)
真菌界
子囊菌门
担子菌门
接合菌门
壶菌门
无性型真菌类
子囊菌纲
酵母菌纲
裂殖酵母纲
外囊菌纲
新乳霉纲
肺囊霉纲
担子菌纲
锈菌纲
黑粉菌纲
接合菌纲
毛菌纲
目前得到学术界较广泛采用的是Ainsworth的分类系统。
Ainsworth等人的菌物分类系统纲要
第九版(2001)
2、数值分类鉴定
• 基于借助于计算机分析大量的表型的性质
– (e.g. 300 strains x 200 tests)• 更多的分析项目
• 同样缺乏均一性
• 费力的
• API 细菌数值鉴定系统 (API system)• Biolog细菌数值鉴定系统
• ad hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics of International Committee on Systematic Bacteriology
(ICSB, 细菌系统学国际委员会) - Wayne et al. (1987) IJSB 37:463-464
– 细菌的物种应该反应基因组的关系
– 基于直接或间接的测量基因组核苷酸序列的比较
– 基因组测序 (直接的) – 理想的,但以前是不切实际
– DNA-DNA 杂交 (间接的)
种的定义
– 在最优化的杂交温度下,全基因组杂交,70%结合(同源性) The phylogenetic definition of species generally would include strains with approximately 70% or greater DNA-DNA relatedness and with 5°C or less Tm. Both values must be considered.
基因测序 : 用目标基因代表整个基因组 (rDNA, rpo, gyr)
SSU rRNA优点:
• 存在于大多数物种 (真核生物, 古细菌, 真细菌)
• 便于测序
– 基于保守区域的PCR (ca. 1,500 nt)– 基于保守区域的测序
• 大型数据库
– > 2,000,000 small subunit rDNA sequences
16S rDNA 测序
不同的分支
新的属
Genomic species
YesNo
新的种
70%>
70%<
化学的,表型的数据的支持
Yes
现有的物种单元
物种: 小于97% 16S rDNA 相似度
DNA-DNA hybridization with species showing 16S rDNA 相似度>97%
mRNA
PROTEIN
• 总的细胞内蛋白和包膜蛋白的电泳图谱
Chemotaxonomic markers
• 胞内脂肪酸• 极性脂质• 醌类• 聚胺类• 细胞壁组分
Expressed features
• 形态学• 生理学• 酶学• 血清学
表型信息
总的DNA:• GC含量• RFLP •DNA-DNA杂交
DNA
DNA 基因型信息
DNA 片段:• 基于PCR的DNA指纹印迹• DNA探针• DNA 测序
rRNA
• 测序
• GenBank, EMBL16S
23S
5S
(1)接触酶反应
(2)糖醇类发酵试验
(3)甲基红(M.R)试验
(4)甲基乙酰甲醇(V.P)试验
(5)吲哚试验
(6)硝酸盐还原
(7)亚硝酸盐还原
(8)大分子物质水解反应
(9)碳源利用试验
(10)氮源利用试验
化学分类: 细胞化学成分用作鉴定指标
1. 细胞壁的化学成份
2. 全细胞水解液的糖型
3. 磷酸类脂成分的分析
4. 枝菌酸的分析
5. 醌类的分析
6. 脂肪酸分析
对于不同属的鉴定是有用的
弱点 - 微生物的化学组成取决于环境 - 必须同一条件下培养
16S rRNA gene 在分子分类学应用
16S rRNA …
• 所有的细菌都具备的古老的分子
• 功能恒定
• 普遍分布
• 系统发生距离上中度保守
More than 2,000,000 of 16S rRNA gene sequences are currently available on RDP.
Procaryote EukaryoteOveral size 70S 80S
Small subunit 30S 40S Number of proteins ~21 ~30 RNA size (number of base)
16S(~1500bp)
18S(~2300bp)
Large subunit 50S 60S Number of proteins ~34 ~50 RNA size (number of base)
23S (~2900bp)5S (~120bp)
28S (~4200bp)5.8S (~160bp)5S (~120bp)
核糖体(Ribozome) structure
线粒体和叶绿体的核糖体跟原核生物的核糖体更相似
16S rRNA gene
9F
341F
518F
536R907F
1100R
1512R
16S rRNA gene
Primer 1512R
5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
Primer 9F
5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
am
plific
atio
n
Electrophoresis1.6 Kb
测序: PCR 产物或克隆的基因
纯化 基于PCR的循环测序
341F partial sequence
9F
520F
536R
907F
1100R
1512R
full sequence
纯化的PCR产物
16S rRNA基因序列完全一致
不同16S rRNA基因之间
存在序列差异
载体+ 16S rDNAs
克隆 测序
序列分析
用ez-taxon数据库搜索相近序列
选择参考株
Alignment
构建系统发生树
16S rDNA 相似度≤ 97%: 不同的种
(Stackebrandt & Goebel, 1994)
GC含量作为分类学的标记
A + T + G + C
G + Cⅹ100%
• 原核生物之间GC 含量变化范围 20% - 80%
• 相同的 GC 含量不意味着相同的碱基组成
• Minimal value in the overall taxonomic characterization of genus and species
Difference in mol% G+C = 0% ≠ same species
Difference in mol% G+C ≥ 5% ≈ different species
Difference in mol% G+C ≥ 10% ≈ different genus
Cell
细胞裂解 (化学的 & 物理的)
蛋白酶处理
RNA酶处理
DNA
RNA
protein
DNA 变性
核酸酶处理
碱性磷酸酶处理
P
P
P
P
P
P
P
HPLC 分析: 270 nm
• DNA序列间的部分相似进行杂交
•对于区分相近的生物的非常敏感的方法 (“>99% 16S rDNA” 或“相同的 GC 含量” 都有可能对应 “<70% 杂交值”)
Hybridization value ≥ 70% : same species
Brevibacterium casei DSM 20657T AJ251418
Brevibacterium linens DSM 20425T X77451
Target
Brevibacterium iodinum NCDO 613T X76567
Probe: strain of interestBrevibacterium aureum Enb15 AY299092
Brevibacterium aureum Enb17 AY299093
95
99
83
91
97
0.01
感兴趣的菌株 相关微生物完全无关的 e.g. E. coli
变性
(+) control 靶 (-) control
单链 DNAs固定到膜上
washing
洗出未结合的 DNAs
与鲑鱼精DNA预杂交
• 鲑鱼精 DNA 是与细菌 DNA完全无关的DNA.
• 充当非特异性的配体 使靶 DNA中未结合的受体饱和
• 去除非特异性的 DNA-DNA 结合(不完全互补的结合)
鲑鱼精 DNA 使非特异位点饱和
标记的探针 DNA 可能的非特异性结合
特异位点
非特异位点靶 DNA
杂交膜
固定的靶 DNA
鲑鱼精 DNA
杂交膜
预杂交
Washing
底物与酶的反应
链霉亲和素
β-D-galactosidase
F
F
杂交膜
添加酶
Washing
酶
杂交膜
添加底物
底物
4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside
37℃酶反应
基因型信息16S rRNA 基因测序GC含量DNA-DNA 杂交
化学分类信息脂肪酸
醌
细胞表型信息形态学(显微镜,菌落)生长条件 (温度, pH, 盐度)碳源的利用 (API kit) 酶活性 (API kit)
Fig. Phylogenetic tree constructed from a comparative analysis of 16S rDNA gene sequences showing the relationships of strain L61 with other related species.
G+C contents
DNA-DNA hybridization
61.3%, in the range of Rhizobium (57%-63%)
• Lower than 10% with R. gianidii, R. galegae, R. huautlense, A. tumefaciens.
Rhizobium daejeonense sp. nov. (dae.jeon.en'se N.L. neut. adj. daejeon, pertaining to Daejeon a city in Korea, where the type strain of this species was isolated).• Cells are a gram-negative, aerobic, motile, non-spore forming rod (0.6-0.7 1.1-1.3 m) with
peritrichous flagella. • The colonies appearing on YMA within 3 days of incubation at 28 C are circular, cream
colored, semi-translucent, and sized 1.5-3.0 mm in diameter.• Catalase, oxidase, urease, -galactosidase, and -glucosidase are positive. Gelatin
liquefaction, indole production, and arginine dihydrogenase are negative. No nitrate reduction to nitrite. (Enzyme activity)
• Cells grew at 41 C, in 0-2% NaCl, or in a pH range of 5-10; however it could not grow at 4 C or 45 C, in 2.5% NaCl, or in a pH range higher than 10 or lower than 4.5.
• Nodules were formed in Medicago sativa by this strain. A nifH encoding a nitrogenase complex was detected.
• DNA G+C content is 60.1-60.9%, as determined by means of HPLC. The cellular fatty acids are C16:0 (2.2-3.3%), C18:0 (2.1-3.2%), C19:0 cyclo ω8c (9.9-16.8%), C20:3 ω6,9,12c (2.7-3.3%), summed feature 3 (7.2-7.7%) and summed feature 7 (67.8-73.7%).
• The available carbon source is propionate, caprate, valerate, histidine, acetate, L-alanine, 3-hydroxy-benzoate, maltose, D-glucose, fucose, D-sorbitol, L-proline, rhamnose, D-ribose, inositol, D,L-lactate, arabinose, mannose, mannitol, maltose, and malate; the no available carbon source is citrate, itaconate, suberate, glycogen, phenyl-acetate, adipate, D-melibiose, 2-ketogluconate, N-acetyl-Glucosamine, malonate, 5-ketogluconate, and gluconate.
• L-Glutamic acid, L-methionate, L-phenylalanine, L-cysteine, and free- and nickel-complexed cyanides were used as nitrogen source, but D,L-tryptophan and glycine were not.
• Cells are resistant against ampicillin (20 and 100 g ml-1) and erythromycin (20 μg ml-1); however they are not resistant against tetracycline (50 μg ml-1), erythromycin (100 g ml-1), chloramphenicol (100 μg ml-1) or kanamycine (100 μg ml-1).
• The strains were isolated from a cyanide-degrading bioreactor originally inoculated
by an activated sludge from a municipal sewage treatment plant (Daejeon, Korea).
• The type strain is L61T (= KCTC 12121T = IAM 15042T = CCBAU 10050T) and the reference strain is L22 (= KCTC 12120 = IAM 15041).