enzimas da água de coco: caracterização da peroxidase e...
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Yanina Madalena de Arruda Calvette
Enzimas da água de coco: caracterização da
peroxidase e emprego de alta pressão hidrostática
para inativação das enzimas deteriorantes
Rio de Janeiro – RJ
2007
Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Bioquímica Médica- IBqM
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Yanina Madalena de Arruda Calvette
Enzimas da água de coco: caracterização da peroxidase e uso
de alta pressão hidrostática para inativação das enzimas
deteriorantes
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química Biológica do Instituto de Bioquímica Médica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à obtenção do grau
de doutor em Química Biológica.
Orientador: Jerson Lima da Silva
Professor Titular - IBqM-UFRJ
Dr. Amauri Rosenthal
CTAA-EMBRAPA - Co-orientador
Rio de Janeiro
2007
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Enzimas da água de coco: caracterização da peroxidase e uso de
alta pressão hidrostática para inativação das enzimas
deteriorantes
Calvette, Yanina Madalena de Arruda, Enzimas da água de coco: caracterização da
peroxidase e uso de alta pressão hidrostática para inativação das enzimas deteriorantes/ Yanina Madalena de Arruda Calvette. Rio de Janeiro, 2007.
Tese (Doutorado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Bioquímica Médica, 2007. xxii, 190 fls., 36 ils. Inclui bibliografia
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Yanina Madalena de Arruda Calvette
Enzimas da água de coco: caracterização da peroxidase e uso de alta pressão hidrostática para inativação das enzimas deteriorantes
Rio de Janeiro, 12 de janeiro de 2007
Banca examinadora:
____________________________________________________ Profa. Andréa Tompson da Poian – Presidente da banca
Prof. Adjunta - Instituto de Bioquímica Médica – Universidade Federal do Rio de Janeiro.
____________________________________________________
Profa. Maria Heidi Marques Mendez Prof. Adjunto – Departamento de Bromatologia – Faculdade de Farmácia – Universidade Federal
Fluminense
____________________________________________________ Prof.ª Eliane Fialho de Oliveira
Prof. Adjunto – Instituto de Nutrição - Universidade Federal do Rio de Janeiro
____________________________________________________
Prof. Carlos Frederico Leite Fontes Prof. Adjunto - Instituto de Bioquímica Médica – Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
____________________________________________________ Prof. Júlio Alberto Mignaco (Revisor e suplente)
Prof. Adjunto – Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal do Rio de Janeiro.
____________________________________________________
Profa.. Kátia Gomes de Lima Araújo (Suplente externo) Prof. Adjunto - Departamento de Bromatologia - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal
Fluminense
____________________________________________________ Dr. Amauri Rosenthal – Co-orientador
Chefe Geral - Pesquisador III, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, EMBRAPA, como co-orientador.
____________________________________________________
Prof. Jerson Lima da Silva - Orientador Prof. Titular – Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal do Rio de
Janeiro
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Resumo
O consumo da água de coco (AC) é maior em países produtores, como o Brasil; onde é apreciada pelas qualidades peculiares de seu sabor e também por ser uma bebida similar às bebidas isotônicas que têm propriedades de reposição de eletrólitos. Sua comercialização ocorre principalmente in natura, dentro do fruto inteiro, em conseqüência da ação de enzimas nativas e/ou pela introdução de microrganismos deteriorantes durante a abertura do fruto. Produtos processados obtidos da água de coco têm pouca aceitação em razão das modificações sensoriais ocasionadas pelos tratamentos convencionais utilizados atualmente. As enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) são responsáveis pela maioria das modificações desfavoráveis em alimentos. Nas plantas, estas enzimas catalisam mais de uma reação e atuam sobre diferentes substratos, sendo as mudanças na cor e sabor e alterações nas características nutricionais as principais conseqüências. O uso da alta pressão hidrostática (APH) para inativar as enzimas deteriorantes é uma alternativa aos métodos convencionais que empregam a temperatura.
A POD, do grupo das oxidoredutases, é uma glicoproteína que na água de coco foi identificada após purificação usando concentração por ultrafiltração e etapas de filtração em Sephadex G-75, seguida da eluição em coluna de troca aniônica (POROS® 20 HQ), resultando em solução com 338,3 µmoles (tetraguaiacol).(mg proteína)-1.min-1 da principal isoenzima (pI=5,2). Outras duas isoenzimas ácidas foram identificadas (pI = 4,5 e pI= 5,0) por focalização isoelétrica. O peso molecular da peroxidase entre 41.000 e 42.000, foi determinado em SDS-PAGE avaliando amostras desnaturadas obtidas por concentração da água de coco por ultrafiltração e frações obtidas por diferentes técnicas cromatográficas. Este valor foi inferior ao calculado por filtração em gel (entre 44.000 e 47.000), mas ligeiramente superior ao valor obtido usando a amostra não desnaturada em SDS-PAGE.
Para o processamento da AC foram realizados processos usando combinações entre 3 níveis de temperatura de processo (20, 40 e 60ºC), 4 níveis de pressão (0,1; 300; 500 e 800 MPa) e 3 níveis de tempo de processo (30, 60 e 90 minutos). Estas combinações resultaram em aproximadamente 200 experimentos analisados pelo módulo de desenho experimental (DOE) através da metodologia de superfície de resposta. Os resultados observados para a PPO foram mais confiáveis (R2aj ~1) na avaliação estatística (ANOVA). Respostas reprodutíveis e confiáveis para avaliação da POD ocorreram somente após a adição de Tween 80 0,003%, o uso de surfactante evitou a intensa adsorção da POD à superfície das embalagens que ocorreu mais intensamente a 40 e 60ºC.
A inativação total da POD ocorreu usando 800 MPa, 50ºC e 30 min, sendo o tempo uma condição não significativa para o resultado do processo. A inativação total da PPO ocorreu nas mesmas condições de pressão e temperatura, mas foram necessários 90 minutos de processo para atingir o mesmo objetivo. Nestas condições o parâmetro tempo foi uma variável significativa. A inativação total e a não regeneração da POD e da PPO foram confirmadas pelos resultados obtidos na avaliação das amostras 24 horas após o processamento. O uso de APH a temperatura ambiente foi ineficaz para inativação das enzimas.
Este perfil classifica as enzimas da água de coco como barorresistentes e também termorresistentes como indicam resultados do aquecimento a 60ºC da água de coco (após 90 minutos houve retenção total da atividade da POD e 74% da PPO). Foi também observada ativação da POD em baixas pressões (entre 0,1 e ~400 MPa), ocorrendo maior elevação da atividade (147%) em processos empregando 250 MPa a 40ºC; mas acima de 500 MPa foi observada uma rápida e progressiva inativação da enzima. A velocidade de inativação da PPO foi proporcional ao aumento da pressão até 500 MPa, ocorrendo diminuição desta velocidade
vi
quando foram utilizadas pressões acima deste valor. O emprego de APH a sobre a peroxidase de raiz forte (HRP in MES pH 5,8 adicionado de Tween 80) levou à inativação da enzima quando foram empregadas condições semelhantes àquelas usadas para a água de coco, sem, contudo, apresentar indícios de ativação em qualquer das condições utilizadas.
Os resultados obtidos demonstraram a eficiência do emprego da APH para inativação da POD e PPO da água de coco quando forem empregadas temperatura e pressão iguais ou superiores a 50ºC e 800 MPa. O tempo de processamento foi parâmetro importante a ser considerado para a inativação da PPO, porém pouco significativo para a inativação da POD.
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Abstract
The consumption of coconut water is larger in the producing countries, where it is appreciated by the peculiar qualities of its flavor and, also, by the fact of being similar to the isotonic beverages with electrolytes reposition properties. It is sold commercially, mainly in natura, inside the fruit itself, to avoid fast deterioration due to action of native enzymes and/or microorganisms introduced during the fruit opening. Processed products obtained from the coconut water are poorly accepted due to the sensorial modifications caused by currently used conventional treatments. The peroxidase (POD) and the polyphenoloxidase (PPO) enzymes are responsible for most of the adverse modifications in food. In the plants, these enzymes catalyze more than one reaction and acts on different substrates, causing mainly color changes, off-flavors, enzymatic browning and nutritional characteristics modifications. High hydrostatic pressure (HHP) processing to inactivate the deteriorating enzymes is an alternative to the conventional heating processes.
The peroxidase, from the oxidoreductase group, is a glycoprotein that was identified in coconut water after purification using concentration by ultrafiltration and filtration in Sephadex G-75, followed by elution in anionic exchange column (POROS® 20 HQ), resulting in a solution with 338.3 µmols (tetraguaiacol).(mg protein)-1.min-1 of the main isoenzyme (pI=5.2). Another two acidic isoenzymes (pI=4.5 and 5.0) were identified by isoelectric focusing. The coconut water peroxidase molecular weight, between 41.000 and 42.000, were obtained running denatured samples in SDS-PAGE. These values were inferior to the ones obtained by gel filtration (between 44.000 and 47.000), but slightly superior to the values obtained using non-denatured samples in SDS-PAGE. This technique, followed by gel washing with buffer added by 0.1% Triton X-100 and then by H2O2 1.0 mM plus guaiacol 20 mM, was also employed to identify the peroxidase band and rapidly recognize the POD main isoforms present in the coconut water
HHP processing at ambient temperature was inefficient for POD and PPO inactivation. Processes had been carried through using combinations of 3 levels of processing temperature (20, 40 e 60°C), 4 levels of pressure (0.1; 300; 500 and 800 MPa) and 3 levels of processing time (30, 60 and 90 minutes). These combinations resulted in approximately 200 experiments analyzed by the experimental design module (DOE) using response surface methodology. The PPO observed results were more reliable (R2aj ~l.0) in the statistical evaluation (ANOVA). Reliable and reproducible responses occurred in POD evaluation only after the addition of Tween 80 0.003%. The surfactant prevented the intense enzyme adsorption to the packages’ surfaces, being more intense at 40 and 60°C.
The total POD inactivation was attained using 800 MPa, 50ºC and 30 minutes, with time being not significant to the process result. The total PPO inactivation was obtained using the same pressure and temperature conditions, although 90 minutes were needed to attain the same goal. In these conditions the parameter time was a significant variable. The total POD and PPO inactivation and no regeneration effect was confirmed by results obtained evaluating processed samples stored for 24h.
This profile classifies the coconut water enzymes as baroresistent and also thermoresistent as indicated by results observed heating coconut water at 60°C (after 90 minutes process there was 100% POD and 74% PPO activity retention). It was also observed POD activation at low pressures (between 0.1 and ~400 MPa), occurring higher activation (147%) in process using 250 MPa at 40ºC, but above 500 MPa was observed a fast enzyme inactivation, proportional to pressure increasing. The PPO inactivation velocity was proportional to the increase of pressure up to 500 MPa, slowing down when the pressure was above that value. The evaluation of HHP effect on commercial horseradish enzyme (HRP in
viii
MES pH 5.8 added by Tween 80) resulted in enzyme inactivation when similar conditions were used to those employed on coconut water, without showing any kind of activation effect.
The data show the efficiency of HHP to inactive POD and PPO from coconut water when using pressure and temperature equal or higher than 50ºC and 800 MPa. The processing time is an important factor considering PPO inactivation, with less significance for POD inactivation.
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Agradecimentos
Quero agradecer profundamente às pessoas que eu tive a felicidade de encontrar neste
longo caminho e à Universidade Federal Fluminense por permitir que esse caminho fosse
seguido.
Inicialmente, agradeço ao Jerson, meu orientador, por ter acreditado na minha
capacidade e ter possibilitado o desenvolvimento deste trabalho nos diferentes laboratórios
vinculados às suas pesquisas. Da mesma forma agradeço à Débora, que esteve sempre
presente e facilitou meu convívio dentro de todos estes ambientes.
Devo agradecer ao Amauri Rosenthal pelo incentivo inicial e pela possibilidade de
complementação dos experimentos junto a Universidade de Reading, na Inglaterra.
Greetings to Professor David Ledward, Food Bioscience Department director, for his
effort, leading me through all the facilities. Also reminding Dr Niranjan, Dr Richard Frazier
and Aklila for the efficient help during the last experiments on the same Department from the
University of Reading, England.
Quero agradecer profundamente à Kátia, que além da amizade constante e do
incentivo sempre necessário, foi absolutamente importante ajudando a superar os momentos
finais.
Ao Júlio que, além de revisor, foi uma pessoa que acreditou neste trabalho.
Aos muitos amigos do LTPV/LAPA e especialmente aqueles que acompanharam o
desenrolar da história durante muito tempo. Yra, uma grande amiga e um exemplo de
profissional, uma grande cientista, mas também companheira do dia a dia. Carol, alguém
especial por ser tão “na dela”, um exemplo de como conviver com pessoas muito diferentes.
Junto com Leo, o marido, aquela fera em computador. Dani, com saudades, pois está distante
mas sempre presente nas minhas lembranças. E Andréia, que participou do início e do final,
sempre com uma ajuda especial.
x
A lista é enorme, mas vou tentar lembrar os nomes daqueles que estiveram mais
próximos, esta é a melhor forma de recordá-los no futuro: Mônica, a cientista do prêmio
Nobel (em breve), Ana Cristina, com muito carinho, Ana Paula, com garra. Ygara & Pedro &
Ivanildo, Theo e André. Mais recentemente Marcos, Patrícia, Tiago, Mariana e Priscila. E
outros, sempre mais, todos os anos, todos os semestres.
É importante lembrar também aqueles de fora do laboratório. Pedro, que me
entrevistou e marcou por ter criado uma grande expectativa sobre as pessoas com quem eu iria
trabalhar, mas também pelos incontáveis churrascos oferecidos para Orlando, grande amigo
também. Ao Horácio, que me ensinou os primeiros passos sobre peroxidase.
A todos meus amigos do bloco “A” e do final de tarde nas sextas feiras, quando nos
reuníamos esperando o trânsito melhorar.
A minha amiga Martha, que sempre demonstrou uma admiração muito grande e a
quem eu admiro por entender as pessoas exatamente como são e gostar delas porque assim o
são.
No final da lista, mas com certeza os muito importantes, aquela turma que foi privada
constantemente da minha presença e, mesmo assim, sempre entendeu e reconheceu. Minha
família, meu rumo, minha âncora, meus amores. Meu marido, Beto, sempre acreditando em
mim e no meu potencial. Meus filhos Enrico, Bruno e Luca, luzes que sempre brilham,
iluminando minha vida e meu caminho.
xi
Lista de Abreviaturas e Siglas
A280 Absorvância avaliada em 280 nm
A403 Absorvância avaliada em 403 nm
Abs Absorvância
AC Água de coco verde
ANOVA Teste estatístico por análise de variância
AOT Bis(2-etilhexil) sulfosuccinato de sódio
APH Alta pressão hidrostática
Aprox Aproximadamente
A280 Medida de absorvância utilizando comprimento de onda à 280 nm
A403 Medida de absorvância utilizando comprimento de onda à 403 nm
CI Composto I
CII Composto II
CIII Composto III
cmc Concentração micelar crítica;
col. Colaboradores
VC Volume de Coluna
DTABr Brometo de n-dodeciltrimetilamonio
FAO (Food Agricultural Organization) Organização sobre Alimentos e Agricultura das Nações Unidas
FC Fração central em filtração em gel
FF Fração final em filtração em gel;
FI Fração inicial em filtração em gel;
h Horas
HRP Peroxidase de raiz forte
HRP-C ou HRPc Isoenzima C da raiz forte
IEF Focalização isoelétrica
ME β-mercaptoetanol
MES Ácido 2-(N-Morfolino)-etanosulfônico
min Minutos
P Pressão
xii
PC Pico central em cromatografia de troca aniônica
pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto isoelétrico
PM Peso molecular
POD Enzima peroxidase
PPO Enzima polifenoloxidase
RF Fator de retenção
SDS- PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com na presença de dodecil sulfato de sódio
t Temperatura
T Tempo
T(0) Tempo zero, imediatamente após o processamento
T(24 h) Avaliação após 24 h mantendo o produto sob refrigeração
TCA Ácido tricloroacético
Tris Tris[hidroximetil] metilamina
UF Água de coco verde concentrada por ultrafiltação
UHT “Ultra high temperature” - temperaturas ultra elevadas
VM Volume morto em cromatografia de troca aniônica
WHO “World Heath Organization” – Organização Mundial da Saúde – OMS
xiii
Sumário
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 1
1.1. A ÁGUA DE COCO ................................................................................................................................... 1
1.1.1. Composição da água de coco ....................................................................................... 2
1.1.2. As bebidas isotônicas.................................................................................................... 3
1.1.3. Outros usos para a água de coco.................................................................................. 4
1.1.4. Importância do tratamento da água de coco ................................................................ 5
1.2. A PEROXIDASE E OS ALIMENTOS.......................................................................................................... 7
1.2.1. Estrutura da peroxidase................................................................................................ 9
1.2.2. Atividade catalítica da peroxidase.............................................................................. 12
1.2.3. Funções fisiológicas da peroxidase e suas isoenzimas............................................... 15
1.3. POLIFENOLOXIDASE E OS ALIMENTOS............................................................................................... 17
1.3.1. Estrutura da polifenoloxidase..................................................................................... 18
1.3.2. Atividade catalítica da polifenoloxidase..................................................................... 20
1.4. ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA PARA PROCESSAMENTO DE ALIMENTOS.................................... 21
1.4.1. Processamento por APH versus processamento térmico............................................ 25
1.4.2. Efeito da APH sobre alimentos, proteínas e enzimas ................................................. 27
1.4.3. Efeito da APH sobre microrganismos ........................................................................ 32
1.5. ADSORÇÃO DE PROTEÍNAS E O USO DE SURFACTANTES ................................................................. 35
2. OBJETIVOS.................................................................................................................................... 39
2.1. OBJETIVOS GERAIS............................................................................................................................... 39
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................................................... 39
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 41
3.1. ENZIMAS E REAGENTES....................................................................................................................... 41
3.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS..................................................................... 41
3.3. MEDIDA DA ATIVIDADE DA PEROXIDASE – POD............................................................................. 42
3.4. MEDIDA DA ATIVIDADE DA POLIFENOLOXIDASE – PPO................................................................. 44
3.5. CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ÁGUA DE COCO (AC) ............................................................ 45
3.5.1. Amostras usadas para concentração por ultrafiltração e purificação. ...................... 45
3.5.1.1. Ultrafiltração de pequenos volumes ..................................................................................45
3.5.1.2. Ultrafiltração de grandes volumes .....................................................................................46
3.5.2. Cromatografia de filtração em gel.............................................................................. 46
3.5.3. Cromatografia de troca iônica por perfusão.............................................................. 48
xiv
3.6. ESTIMATIVA DO PESO MOLECULAR POR SDS-PAGE ..................................................................... 49
3.7. ESTIMATIVA DOS PONTOS ISOELÉTRICOS DAS ISOENZIMAS DA POD........................................... 51
3.8. PROCESSAMENTO POR ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA – APH..................................................... 54
3.8.1. Equipamentos usados para pressurização.................................................................. 54
3.8.1.1. Equipamento de APH para avaliações espectrofotométricas durante o
processamento..........................................................................................................................................54
3.8.1.2. Equipamento de APH para processamento de alimentos em laboratório..............55
3.8.2. Processamento I – Utilização de embalagens flexíveis .............................................. 57
3.8.2.1. Preparo da amostra..................................................................................................................58
3.8.2.2. Condições de processo...........................................................................................................58
3.8.3. Processamento II – Utilização de embalagens rígidas............................................... 60
3.8.3.1. Preparo da amostra..................................................................................................................60
3.8.3.2. Condições de processo...........................................................................................................61
3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................................ 64
3.9.1. Análise dos resultados – Processo II .......................................................................... 66
3.9.2. Análise dos resultados – Processo III......................................................................... 66
3.10. CINÉTICA DE INATIVAÇÃO DA POD A 60ºC ................................................................................... 67
4. RESULTADOS................................................................................................................................ 68
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA ÁGUA DE COCO (AC).................................................................................... 68
4.2. CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA PEROXIDASE (EA) ...................................................... 70
4.2.1. Relação produto formado/concentração de enzima ................................................... 70
4.2.2. Efeito da concentração do peróxido de hidrogênio na cinética da peroxidase.......... 72
4.3. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA PEROXIDASE ....................................................... 75
4.3.1. Ultrafiltração .............................................................................................................. 77
4.3.1.1. Ultrafiltração de pequenos volumes ..................................................................................77
4.3.1.2. Ultrafiltração de grandes volumes .....................................................................................78
4.3.2. Cromatografia de filtração em gel – Cálculo do Peso Molecular da POD da água de
coco....................................................................................................................................... 79
4.3.3. Cromatografia de troca iônica em sistema de perfusão ............................................. 82
4.3.4. Padrão eletroforético da água de coco e PM da peroxidase...................................... 85
4.3.5. Estimativa dos valores de Ponto Isoelétrico (pI)........................................................ 90
4.4. AVALIAÇÃO INICIAL DO EFEITO DA APH SOBRE A ÁGUA DE COCO.............................................. 94
4.4.1. Processamento I - Avaliação da atividade da peroxidase durante a pressurização .. 95
4.4.2. Processamento II - Avaliação inicial do efeito da APH sobre a POD e PPO............ 98
4.4.2.1. Atividade residual da POD – T(0) e T(24 h) ...............................................................100
4.4.2.2. Atividade residual da PPO – T(0) e T(24 h)................................................................103
xv
4.4.2.3. Efeito da temperatura sobre a POD................................................................................106
4.5. TRATAMENTO MATEMÁTICO DO EFEITO DA APH SOBRE AS ENZIMAS POD E PPO USANDO
DADOS EXPERIMENTAIS - PROCESSAMENTO III ............................................................................ 108
4.5.1. Adsorção da POD à embalagem............................................................................... 108
4.5.2. Adição de Tween 80 .................................................................................................. 111
4.5.3. Processamento por APH em embalagens de Teflon ................................................. 113
4.5.3.1. Peroxidase – T(0) ..................................................................................................................115
4.5.3.2. Peroxidase – T(24 h) ............................................................................................................121
4.5.3.3. Polifenoloxidase – PPO T(0) .............................................................................................123
4.5.3.4. Polifenoloxidase – T(24 h) .................................................................................................127
4.5.4. Efeito da Alta Pressão Hidrostática sobre a enzima HRP ....................................... 129
4.5.4.1. Solução de peroxidase de raiz forte – atividade enzimática em T(0) ...................129
4.5.4.2. Solução de peroxidase de raiz forte - atividade enzimática em T(24 h)...........131
5. DISCUSSÃO.................................................................................................................................. 133
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA ÁGUA DE COCO ........................................................................................... 133
5.2. PROCESSAMENTO POR ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA ............................................................... 137
5.2.1. Uso da pressão à temperatura ambiente .................................................................. 138
5.2.2. Efeito da temperatura combinada ou não com alta pressão hidrostática ................ 140
5.2.3. Porque a adsorção deve ser um parâmetro considerado ......................................... 144
5.2.4. Entendendo as flutuações da atividade da peroxidase ............................................. 145
5.2.5. Uso de surfactantes: padronização das causas e dos resultados ............................. 147
5.2.6. Modelagem estatística e estudo do efeito da APH sobre as enzimas deteriorantes da
água de coco ....................................................................................................................... 148
5.2.7. Efeito da APH sobre os microrganismos.................................................................. 154
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................................. 156
7. PERPECTIVAS FUTURAS......................................................................................................... 157
8. ANEXOS ........................................................................................................................................ 158
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 163
10. ANEXOS II………………………………………………......……………………………..…….184
xvi
Lista de figuras
Figura 1: Estrutura da peroxidase de raiz forte – HRP....................................................... 10
Figura 2: Mecanismo geral da peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio usando
o guaiacol como receptor de prótons e elétrons................................................................................ 13
Figura 3: Representação esquemática da tirosinase do cogumelo A. bisporus................... 19
Figura 4: Reação do catecol com oxigênio, catalisada pela PPO.. ...................................... 20
Figura 5: Esquema simplificado de processos de APH.. ...................................................... 24
Figura 6: Efeito do tratamento por APH (400 MPa) sobre uma embalagem de isopor.. 27
Figura 7: Sistema de APH laboratorial para leitura óptica.. .............................................. 55
Figura 8: Aparelho de APH utilizado no processamento da água de coco verde. ............. 56
Figura 9: Embalagens em Teflon rígido empregadas para processamento da água de coco
e da solução de HRP............................................................................................................................ 60
Figura 10: Relação entre a concentração de água de coco e o valor calculado de atividade
enzimática (EA) na mistura reativa................................................................................................... 71
Figura 11: Dependência da velocidade de oxidação do guaiacol catalisada pela peroxidase
da água de coco à concentração de H2O2. ......................................................................................... 73
Figura 12: Esquema simplificado das vias de inativação da peroxidase a partir do
composto intermediário do ciclo de catálise (Composto II)............................................................. 74
Figura 13: Fluxograma utilizado para a concentração e caracterização da enzima
peroxidase obtida a partir da água de coco. ..................................................................................... 76
Figura 14: Perfil de eluição da POD em resina Sephadex G-75.......................................... 80
Figura 15: Perfil de eluição da POD em resina Poros 20 HQ.............................................. 83
Figura 16: Perfil da eluição da POD em resina Poros 20 HQ. ............................................ 84
Figura 17: Padrão de eletroforese da amostra concentrada (UF) e de frações efluentes em
Sephadex G-75 ..................................................................................................................................... 88
Figura 18: Perfil eletroforético das frações obtidas em cromatografia de perfusão em
coluna de troca aniônica. .................................................................................................................... 89
Figura 19: Perfil de focalização isoelétrica da água de coco em gel de agarose corado com
azul de Coomassie. .............................................................................................................................. 91
xvii
Figura 20: Padrão de focalização isoelétrica da água de coco e frações obtidas durante
filtração em gel. ................................................................................................................................... 93
Figura 21: Padrão de focalização isoelétrica da água de coco e frações obtidas em
cromatografia de troca iônica. ........................................................................................................... 94
Figura 22: Efeito do uso de APH a 25 e 40ºC sobre a POD da água de coco e a influência
na formação do composto corado (tetraguaiacol),. .......................................................................... 97
Figura 23: Efeito do uso de APH a 10ºC sobre a POD da água de coco e a influência na
formação do composto corado (tetraguaiacol), ................................................................................ 98
Figura 24: Atividade residual da peroxidase da AC processada por APH em embalagens
flexíveis. .............................................................................................................................................. 101
Figura 25: Efeito combinado da pressão e temperatura sobre a atividade residual da PPO
da água de coco.................................................................................................................................. 105
Figura 26: Cinética de inativação da peroxidase a 60ºC.................................................... 107
Figura 27: Avaliação da adsorção da enzima POD em diferentes superfícies, usando
guaiacol e H2O2. ................................................................................................................................. 109
Figura 28: Atividade da enzima peroxidase na água de coco após 4 h ou 24 h em contato
com a embalagem (a 4ºC) ................................................................................................................. 110
Figura 29: Atividade da POD na presença de diferentes concentrações de Tween 80.... 112
Figura 30: Gráfico de Pareto para POD - EA% POD T(0). .............................................. 116
Figura 31: Superfície de resposta: influência da pressão e tempo sobre a atividade da
POD de AC tratada por APH em T(0). ........................................................................................... 118
Figura 32: Superfície de resposta para a atividade da POD -T(0) em condições específicas
de processamento da água de coco................................................................................................... 120
Figura 33: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 4 para
atividade residual da POD – T(24 h) ............................................................................................... 123
Figura 34: Gráfico de Pareto para PPO – EA% PPO T(0). .............................................. 124
Figura 35: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 5 para
atividade residual da PPO – T(0) na água de coco. ........................................................................ 125
Figura 36: Superfície de resposta para a atividade da PPO – T(0), em condições
específicas de processamento da água de coco................................................................................ 126
xviii
Figura 37: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 6 para a
atividade residual da PPO – T(24 h) na água de coco.................................................................... 129
Figura 38: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 7 para
atividade residual da POD da solução de enzima HRP em T(0).. ................................................. 130
Figura 39: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 8 para
atividade residual da POD da enzima HRP em T(24 h) ................................................................ 132
xix
Lista de Tabelas
Tabela 1: Exemplo de alimentos ácidos comercialmente estéreis preservados por APH. 23
Tabela 2: Sensibilidade de alguns microrganismos selecionados à alta pressão
hidrostática. ......................................................................................................................................... 33
Tabela 3: Padrões Sigma MW 14.000 – 60.000.................................................................... 51
Tabela 4: Padrões Sigma IEF – MIX 3,6-9,3. ....................................................................... 53
Tabela 5: Níveis de combinação de variáveis independentes e valores resultantes para
atividade enzimática nas variáveis dependentes............................................................................... 59
Tabela 6: Níveis de combinação de variáveis independentes e valores resultantes para
atividade enzimática nas variáveis dependentes: %EA PODAC T(0) - %EA PODAC (T24 h) -
%EA PPOAC (T0) e %EA PPOAC T(24 h); %EA HRP T(0) - %EA HRP (T24 h) ..................... 62
Tabela 7: Características da água de coco utilizada para concentração e purificação..... 69
Tabela 8: Recuperação da peroxidase utilizando ultrafiltração e cromatografia de
filtração em gel em Sephadex G-75. .................................................................................................. 78
Tabela 9: Atividade da peroxidase obtida após concentração em equipamento semi-
industrial. ............................................................................................................................................. 79
Tabela 10: Valores obtidos na eluição dos padrões utilizados para estimativa do peso
molecular por cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75. ................................................. 81
Tabela 11: Recuperação da peroxidase da água de coco durante procedimentos............. 85
de ultrafiltração, filtração em gel e eluição por cromatografia de perfusão em coluna
fortemente aniônica............................................................................................................................. 85
Tabela 12: Variáveis de processo empregadas no tratamento das amostras de AC
acondicionadas em sacos plásticos termossoldáveis... ...................................................................... 99
Tabela 13: Efeito da temperatura (com e sem pressurização) sobre a atividade residual
da peroxidase da água de coco adicionada de 0,003% Tween 80 imediatamente após 90 minutos
de processamento. ............................................................................................................................. 121
Tabela 14: Efeito da temperatura (com e sem pressurização) sobre a atividade residual
da PPO da água de coco adicionada de 0,003% Tween 80 ............................................................ 127
xx
Anexos
Anexo 1: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo
modelo estatístico para a peroxidase e a polifenoloxidase da água de coco,
imediatamente após o processamento por alta pressão hidrostática – T(0)....................158
Anexo 2: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo
modelo estatístico para a peroxidase e a polifenoloxidase da água de coco processada por
alta pressão hidrostática e armazenada por 24 horas – T(24 h). .....................................160
Anexo 3: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo
modelo estatístico para a peroxidase comercial de raiz forte (HRP), imediatamente após o
processamento por alta pressão hidrostática – T(0) e após um dia de armazenamento sob
refrigeração – T(24 h).............................................................................................................162
Anexo 4: Curriculum Vitae .....................................................................................184
Anexo 5: Patente em depósito ..................................................................................186
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
O progresso tecnológico está condicionado ao avanço do conhecimento, um
verdadeiro mergulho nas minúcias do comportamento de todo e qualquer ser vivo. Os
resultados obtidos em pesquisas no campo da bioquímica/química/microbiologia podem, e
devem, ser considerados ferramentas tecnológicas. Este caminho pode ter como conseqüência
avanços substanciais na qualidade dos processos tecnológicos, além de difundir para esta área
o conhecimento adquirido nos estudos básicos das ciências da vida.
A tecnologia de alta pressão hidrostática (APH) se mostra como uma verdadeira
proposta inovadora, aparecendo como possível paradigma no setor de alimentos. O estudo
desta tecnologia por grupos brasileiros deverá contribuir não só para o maior conhecimento,
como também para a efetiva implementação desse método em um setor altamente importante
para a economia brasileira.
1.1. A ÁGUA DE COCO
A água de coco imaturo, tecnicamente o endosperma líquido do fruto de coqueiro
(Cocus nucifera L.), é uma bebida (talvez a mais pura, nutritiva e saudável) habitualmente
consumida nos trópicos. Ela mantém suas melhores características quando dentro da sua
embalagem natural, o fruto de coco verde, onde é naturalmente estéril, vindo a sofrer
rapidamente grandes alterações após a abertura do coco, e durante seu possível processamento
e embalagem (WOODROOF, 1979). As modificações que ocorrem na água de coco são
conseqüência da presença, naturalmente ou por contaminação, de enzimas e microrganismos
Introdução
2
deteriorantes, o que incorre em período muito curto de manutenção da qualidade entre a
retirada da água do fruto e o seu consumo.
A água de coco faz parte de um grupo de alimentos que pode ser classificado como
simplesmente um refresco, podendo ser também chamada de bebida isotônica, ou ainda,
alimento funcional devido às suas características sensoriais e composição. Este produto é
consumido pelo grande público em conseqüência de pelo menos uma destas propriedades,
sendo considerada uma opção capaz de substituir algumas misturas comerciais oferecidas no
mercado de bebidas (SAAT, 2002).
A relevância do desenvolvimento de um processo para conservação da água de coco
que permita a conservação das características naturais do produto por um tempo mais
prolongado está associada a diferentes fatores. Primariamente, às propriedades singulares
presentes neste alimento, que o posicionam como uma bebida isotônica natural; em seguida,
às características na composição, que ocasionam alterações extremamente rápidas após a
abertura do fruto e, finalmente, à inviabilidade econômica do transporte do coco inteiro por
longas distâncias em virtude do peso e volume do fruto.
1.1.1. Composição da água de coco
A água do coco é uma solução levemente ácida e que contém sais, proteínas, açúcares,
vitaminas, fito-hormônios e gorduras neutras. Em termos de composição mineral, a água de
coco é relativamente rica em potássio e pobre em sódio e a quantidade média de água é
aproximadamente 400 mL por coco (CAMPOS et al., 1996).
A água de coco é mais agradável ao paladar quando o fruto está entre sete e nove
meses de maturação, chegando a atingir aproximadamente 25% do peso do fruto inteiro e
possuindo um conteúdo em sólidos totais de quase 5%. A composição em aminoácidos como
alanina, arginina, cisteína e serina é maior do que no leite bovino e a concentração de
Introdução
3
proteínas atinge entre 100 a 500 mg/L (MACIEL, 1992), possuindo somente cerca de 0,01%
de gordura. O pH da água de coco é variável e dependente de vários fatores, mas em média
está entre 4,5 a 5,5 (FAO/WHO, 2002).
A concentração média (mg.L-1) de minerais em diferentes marcas de água de coco
embaladas e vendidas no mercado brasileiro foi determinada por Sousa e colaboradores:
cálcio (178-232), magnésio (87-129), manganês (1,8-3,8), ferro (0,08-0,18), zinco (0,2-0,36) e
cobre (0,09-0,19) (SOUSA et al, 2005). As bebidas isotônicas contêm, além de água,
eletrólitos e outros minerais, vitaminas, vários carboidratos complexos e aminoácidos. A água
de coco naturalmente supre estas recomendações e inclui uma série de outros elementos com
atividade biológica que lhe conferem propriedades adicionais e singulares.
1.1.2. As bebidas isotônicas
O mercado mundial de bebidas isotônicas não-carbonatadas cresceu de maneira
estrondosa nos últimos anos, sendo o setor de maior crescimento dentro da indústria mundial
de refrigerantes (HOLLINGSWORTH, 2000). A água de coco é considerada uma opção
bastante interessante, sendo capaz de substituir algumas misturas comerciais oferecidas no
mercado (SAAT, 2002). Porém, a introdução da água de coco no mercado internacional está
relacionada ao desenvolvimento de um processo para embalagem e conservação, de tal forma
que não ocorra degradação de seu valor nutricional e qualidades sensoriais. A importância do
processamento da água de coco está relacionada à impossibilidade de seu cultivo em países
desenvolvidos, potencialmente grandes consumidores, devido a inadequações de área e de
clima (HOLLINGSWORTH, 2000).
O consumo da água de coco é freqüente em todos os países tropicais e no Brasil possui
um mercado próximo a 1,5% do total de bebidas carbonatadas artificiais (segundo o Sindicato
Nacional dos Produtores de Coco do Brasil - Sindicoco). Além disso, é um mercado que vem
Introdução
4
crescendo em média cerca de 20% ao ano A produção brasileira atual de água de coco
embalada ainda é ligeiramente inferior à produção de bebidas isotônicas e significativamente
inferior (cerca de 10%) ao consumo calculado de água de coco in natura, estimado em
aproximadamente 930 milhões de litros/ano em 2004 (HERBÁRIO, 2004).
Em 2000, a FAO (Food Agricultural Organization), órgão da ONU (Organização das
Nações Unidas), patenteou processo não-térmico, utilizando micro-filtração, para o
tratamento da água de coco (AMORIGGI e SATIN, 1998, patente CA2219968). Morton
Satin, chefe do Serviço de Gerenciamento das Indústrias Agrícolas e de Pós-colheita e
responsável técnico pelo processo, justificou da seguinte forma a importância da pesquisa
sobre processos que permitam a manutenção das qualidades singulares da água de coco: “A
água de coco é uma bebida isotônica natural que possui o mesmo nível de balanceamento de
eletrólitos que ocorre em nosso sangue. Desta forma, pode-se dizer que é o fluído da vida”
(em FAO/WHO, 2002, p.9).
1.1.3. Outros usos para a água de coco
Os componentes da água de coco formam um sistema diluído de nutrientes que possui
uma composição biológica próxima a do soro glicosado isotônico. Esta propriedade confere à
água de coco a possibilidade de ser utilizada também no plano médico, para tratamento da
desidratação grave ou auxiliar na desnutrição protéica de crianças e idosos (ANZALDO,
1985), em diarréias leves (KHAN et al., 2003), e emergencialmente, como solução
intravenosa (PETROIANU, 2004).
Em conseqüência de sua composição, ela também pode ser usada como meio de
cultura para fungos, leveduras, bactérias formadoras de ácido, cultivo de vírus vegetais, no
desenvolvimento de meristemas vegetativos e florais (PREVOT 1968), como líquido de
Introdução
5
conservação de sêmen (ALMEIDA e SOARES, 2002) e para o cultivo de células de vários
animais (ANDRADE, 2002).
Bustamante apresenta a água de coco como uma solução biológica com núcleos que
aparecem como sincícios que, juntos com sistemas associados, apresentam propriedades para
expressar proteínas de outras fontes de forma comparável com preparados comerciais
existentes no mercado (BUSTAMANTE, 2002). O mesmo autor mostra a possibilidade do
uso do coqueiro para a produção de diferentes proteínas através da técnica de vetores
recombinantes de DNA (BUSTAMANTE, 2004).
1.1.4. Importância do tratamento da água de coco
Infelizmente o acesso à água de coco in natura não é possível em qualquer lugar e a
qualquer momento. Este fato torna interessante que se desenvolvam métodos para
industrialização e conservação da água de coco extraída do seu fruto. Além da ação de
microrganismos introduzidos durante a abertura do fruto e durante todas as etapas de
processamento, a principal fonte de deterioração da água de coco está relacionada à ação de
enzimas nativas, sobretudo a peroxidase (POD) e a polifenoloxidase (PPO), responsáveis pela
maioria das modificações desfavoráveis que ocorrem após o processamento de frutos. Elas
estão naturalmente presentes em todos os estágios de maturação da fruta, ocorrendo picos
bastante elevados justamente em épocas semelhantes àquelas usadas para colheita visando o
consumo da água de coco, ou seja, entre seis e oito meses (MUJER, 1983).
Após a abertura do fruto, a água de coco pode sofrer várias alterações de origem
química ou microbiológica, sendo bastante freqüente o aparecimento de uma cor rosa que
pode ocorrer após horas ou dias, dependendo do tipo e intensidade do tratamento realizado.
Satin (2000) cita este fato como sendo o aparecimento de “uma bela cor rosa” (SATIN, 2000).
Para as grandes indústrias este fato é responsável por perdas consideráveis do produto
Introdução
6
processado e dificuldades para a manutenção da qualidade. Também é possível observar
várias outras alterações após a extração da água de coco do fruto, porém todas estas
modificações não possuem dados ou estudos divulgados na literatura científica.
Tradicionalmente a ação das várias enzimas deteriorantes de alimentos, como a
peroxidase (POD) e a polifenoloxidase (PPO), sempre foi evitada utilizando-se os métodos
convencionais de processamento de alimentos: calor, modificações no pH e na atividade de
água ou por adição de agentes químicos (FELLOW, 2006). Processamento de alimentos
significa a conversão (refinamento) de material biológico cru em alimentos para o
consumidor, mantendo sua qualidade durante o transporte, comércio e armazenamento.
Atualmente, os processos utilizados para industrialização da água de coco incluem a
esterilização tradicional ou ultra-rápida (UHT) e a pasteurização, que deve ser
invariavelmente acompanhada de refrigeração e/ou combinada com o uso de aditivos e
conservantes (ABREU, 2006). Por estar classificada como alimento pouco ácido, a
esterilização é o único processo que permite a comercialização da bebida sem refrigeração,
porém é o processo que resulta em maiores e mais drásticas conseqüências aos atributos
nutricionais e sensoriais. Processos convencionais utilizados em grande escala pela indústria
de alimentos possuem a desvantagem de também inativar e/ou destruir componentes
benéficos presentes nos alimentos em conseqüência, principalmente, do emprego do calor
(FELLOW, 2006). Estas modificações reduzem a importância da água de coco como bebida
isotônica, além de diminuir a aceitação do produto junto ao público a procura de alternativas
naturais (FAO/WHO, 2002).
Introdução
7
1.2. A PEROXIDASE E OS ALIMENTOS
A peroxidase de plantas (EC 1.11.1.7 – doador: peróxido oxiredutase) pertence à
classe III dentro da superfamília I das peroxidases, que inclui também as peroxidases de
bactérias e fungos. Elas são amplamente distribuídas no reino vegetal, sendo encontradas em
todas as plantas onde tenham sido investigadas (WELINDER, 1992; SMITH e VEITCH,
1998; DUNFORD, 1999; VEITCH e SMITH, 2001), sendo crescente as peroxidases obtidas
de fontes animais (PICOT et al., 1994).
A peroxidase, uma heme proteína, é sempre vista como uma enzima que usa o
peróxido de hidrogênio como substrato oxidante produzindo água. Este fato não deve
esconder sua importância nas funções fisiológicas das células onde é encontrada. A
peroxidase promove uma série de reações, e deste modo, tem uma versatilidade não superada
por qualquer outra enzima. A variedade de reações catalisadas ocorre porque ela não existe
como uma única enzima, mas sim, é encontrada na forma de isoformas que podem ser
facilmente identificadas por focalização isoelétrica (ROBINSON, 1991).
A POD faz parte de um grande grupo de enzimas, conhecido como oxiredutases, que
são consideradas responsáveis pela alteração das características sensoriais, modificações da
textura e da composição nutricional de muitos vegetais crus e também de vários alimentos
processados e armazenados (LU e WITAKER, 1974, REED, 1975; VÁMOS-VIGYÁZÓ,
1981). A peroxidase pode participar da inativação da vitamina C, catalisar o descoloramento
dos carotenóides na ausência de ácidos graxos insaturados e da descoloração de antocianinas,
podendo também catalisar a reação de degradação de ácidos graxos insaturados, produzindo
elementos voláteis que alteram o sabor e o aroma (WHITAKER, 1996). Sua ação está
relacionada à oxidação de compostos fenólicos naturais do alimento e, deste modo, existe uma
Introdução
8
relação da peroxidase com a presença de sabores desagradáveis (off-flavors) e mudanças na
coloração (off-colours) nos materiais crus ou sub-processados.
As peroxidases são conhecidas por serem especialmente termoresistentes e pela
possibilidade de sofrerem regeneração da sua atividade após certo tempo de processamento.
Isto pode ocorrer quando expostas à temperatura ambiente ou armazenadas nas temperaturas
de congelamento, mesmo após o tratamento térmico do produto. As possíveis causas foram
avaliadas por diferentes autores utilizando peroxidase in natura, purificada ou semi-purificada
provenientes de diferentes fontes. Alguns resultados descritos são pouco conclusivos e
eventualmente conflitantes.
Segundo estudos realizados na peroxidase da couve-de-bruxelas e em laranjas, os
resultados descrevem a regeneração da atividade tanto para a enzima pura ou dispersa em
solução aquosa quanto no alimento inteiro, ocorrendo a restauração normalmente após um
período de poucas horas (McLELLAN e ROBINSON, 1984; FORSYTH et al., 1999). Este
comportamento foi considerado pouco usual e sem paralelo em relação a outras enzimas
(ROBINSON, 1991).
Lu e Witaker determinaram que a peroxidase purificada da raiz forte (HRP-C) sofre
uma regeneração da atividade depois de uma inativação pelo calor, concluindo que o
tratamento térmico necessário para a inativação da POD deve ser mais prolongado do que
aquele usado para outras enzimas (LU e WITAKER, 1974). Adams mostrou ocorrer forte
regeneração da HRP em solução pura (pH 5,6) após aquecimento a 70ºC. Indica, também, que
a regeneração da atividade pode ser acompanhada por uma reforma na estrutura da maior
isoenzima (ADAMS, 1991).
O fenômeno de regeneração da POD está também associado à temperatura empregada
após o tratamento térmico. A peroxidase de batatas sofreu até 60% de regeneração quando a
Introdução
9
temperatura de incubação após o tratamento térmico passou de 4ºC para 23ºC
(BOUCOIRAN, 2000).
O comportamento da peroxidase durante o aquecimento e resfriamento ou
congelamento é o tópico mais investigado em relação a esta enzima. Tradicionalmente, a
avaliação da atividade residual da peroxidase tem sido relacionada à eficiência do
processamento devido à sua alta estabilidade térmica. A inativação térmica da POD obtida a
partir de várias fontes é, em certas condições, um processo bifásico e parcialmente reversível.
Segundo Vámos-Vigyázó a enzima é composta de unidades ou frações com diferentes índices
de resistência térmica e parte de sua atividade é restaurada após períodos mais curtos ou mais
longos de estocagem, dependendo da intensidade do tratamento térmico realizado, assim
como da temperatura de armazenamento (temperatura ambiente ou sob refrigeração)
(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
1.2.1. Estrutura da peroxidase
Os estudos iniciais sobre peroxidase foram realizados usando a enzima extraída da raiz
forte ou rábano silvestre (horseradish – HRP) e, até hoje, a maior parte das conclusões gerais
sobre as peroxidases de plantas são fundamentadas nos estudos sobre a isoenzima HRP-C
(HRP - isoenzima C). Esta isoforma é a enzima mais abundante da raiz forte, sendo muito
utilizada para estudos estruturais, mas sua estrutura somente foi determinada por cristalografia
em 1997 (GAJHEDE et al., 1997) e mais recentemente foram descritos os intermediários do
ciclo catalítico (BERGLUND , 2002).
Resumidamente, segundo Welinder, esta glicoproteína possui 308 resíduos de
aminoácidos, um grupamento ferriprotoporfirina IX (1,3,5,8-tetrametil-2,4-divinil-6,6-ácido
dipropiônico) ou ferro(III)protoporfirínico IX, usualmente chamado grupo heme ou
grupamento hemina, e cadeias laterais de carboidratos. O peso molecular é próximo a 44.000,
Introdução
10
onde os carboidratos representam cerca de 20%. Eles se apresentam como oito resíduos
laterais compostos principalmente por N-acetilglicosamina, manose, fucose e xilose. Entre os
vários resíduos de aminoácidos, a enzima apresenta um resíduo de triptofano, 8 resíduos de
cisteína (responsáveis pelas 4 pontes de enxofre) e 3 de histidina (WELINDER, 1976). A
estrutura da enzima é dominada por estruturas do tipo α-hélice, mas aparece também uma
pequena região de folhas-beta (Figura 1A). Outra característica importante é a rede de pontes
de hidrogênio, provável responsável pela estabilidade da estrutura secundária e terciária da
enzima (WELINDER, 1992).
Figura 1: Estrutura da peroxidase de raiz forte – HRP. Em (A): Representação tridimensional da estrutura cristalina da isoenzima C da peroxidase de raiz forte (em Veitch, 2004). O grupo heme (em vermelho) está localizado entre os domínios distal e proximal, cada um com um átomo de cálcio (em azul), as regiões alfa-hélice e folhas-beta são representadas em púrpura e amarelo, respectivamente. Em (B): Representação do grupo heme e o átomo de ferro, em vermelho. His 170 é o resíduo de histidina proximal e His42 é o resíduo distal e, além disso, estão mostrando outros resíduos importantes para a ação da HRP-C. Em (C): Estrutura do grupo prostético heme, que possui uma extremidade exposta onde os compostos reduzidos são oxidados, mas não se ligam.
Introdução
11
A atividade catalítica do grupo heme (Figura 1C) é influenciada principalmente pelos
grupos que o circundam, sendo que a maior parte das peroxidases contém uma histidina na
posição proximal (His170) do grupo heme (Figura 1B), que liga o grupo à enzima através de
uma ligação coordenada entre o nitrogênio da cadeia lateral do aminoácido e o átomo de
ferro. Esta histidina foi mostrada como estabilizante de altos estados de oxidação do ferro, o
que é necessário para o ciclo catalítico. O segundo sítio de ligação coaxial (localizado na parte
do grupo heme descrita como distal) é desocupado no estado basal, mas disponível ao H2O2
durante a catálise. Em posição distal ao heme, aparece outra histidina (His42) e uma arginina
(Arg38). Essa histidina é importante na catálise ácido-base, e a arginina auxilia na
estabilização das cargas (VEITCH, 2004). A importância destes dois sítios foi confirmada por
ensaios de mutagênese (KUMMER et al., 1996).
Os substratos aromáticos são oxidados na parte distal desocupada do grupo, mas não
se ligam ao grupo heme. Ortiz de Montellano e colaboradores propuseram que os elétrons dos
substratos permanecem ligados nas vizinhanças do grupo heme, através de interações
hidrofóbicas com Tyr-185 e por pontes de hidrogênio a Arg-183 (ORTIZ DE
MONTELLANO et al., 1988).
As características do grupo heme possibilitam a observação de uma banda de absorção
muito forte na região azul do espectro e o valor de absorção obtido nesta região é conhecido
como banda Soret (IUPAC, 1997), que é típica para cada proteína que contém grupo heme e é
dependente do estado geral do grupo heme e da proteína. As peroxidases, com seu
grupamento protoporfirínico, absorvem em comprimentos de onda próximos a 400 nm, sendo
que a peroxidase de raiz forte absorve intensamente a 403 nm (GEORGE, 1952).
As peroxidases de plantas possuem dois moles de Ca++ por mol de proteína. Este
cálcio é um componente chave no ciclo da peroxidase, sendo necessário mais de 10 mM em
Introdução
12
solução para a enzima conservar sua atividade, assim como para que ocorra a estabilização da
sua estrutura terciária (MARAÑÓN et al., 1993).
1.2.2. Atividade catalítica da peroxidase
A peroxidase é uma enzima de grande importância, que catalisa a oxidação de um
grande número de estruturas aromáticas na presença de peróxidos, o que ocorre via grupo
prostético heme. A reação geral catalisada pelas enzimas contendo grupamento heme foi
descrita por Poulos e colaboradores em 1980 usando como modelo a enzima citocromo c
(POULOS et al., 1980). A maior parte das reações catalisadas pela HRP-C e outras
peroxidases pode ser resumida pela equação abaixo (VEITCH, 2004):
H2O2 + AH2 2H2O + 2AH*
Onde AH2 e AH* representam o substrato redutor e seu produto na forma de radical,
respectivamente. Os substratos típicos incluem fenóis aromáticos, ácidos fenólicos, indóis,
aminas e sulfonatos. Existe uma série destes compostos que ocorrem naturalmente nos tecidos
das plantas e que podem ser oxidados por pequenas quantidades de H2O2 (ROBINSON,
1991). A transformação do peróxido de hidrogênio em água não é a função primária das
peroxidases, já que existem outras enzimas para a regulação dos níveis de peróxido na célula.
A Figura 2 representa a oxidação de um elemento redutor (representado pelo guaiacol)
pela peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio. Neste esquema podem ser
identificados três estágios cíclicos: primeiramente, a enzima é oxidada e, posteriormente,
reduzida em dois passos seqüenciais, com transferência de um elétron a partir do guaiacol
(CRITCHLOW e DUNFORD, 1973; HENRIKSEN, 1999). Esta reação ocorre comumente
para peroxidases, e pode ser utilizada para medir a concentração e a atividade de enzima
Introdução
13
mesmo na presença de misturas de substâncias. Para isto é necessário mensurar em
espectrofotômetro a quantidade do produto reduzido formado, o tetraguaiacol, obtido a partir
dos radicais formados pela ação da enzima.
Figura 2: Mecanismo geral da peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio usando o guaiacol como receptor de prótons e elétrons. Os Compostos I e II são intermediários no ciclo de catálise da enzima, que forma radicais que levam à produção do tetraguaiacol e água.
O mecanismo de catálise da HRP revisto por Dunford e mais tarde por Veitch e Smith,
indica que a geração de radicais nas duas etapas de redução pode resultar em produtos de
reação com perfil bastante complexo, incluindo dímeros, trímeros e oligômeros maiores que
eles mesmos e que podem agir como substratos redutores em novas reações subseqüentes
(DUNFORD; 1999; VEITCH e SMITH, 2001).
A primeira etapa do ciclo catalítico é a reação entre H2O2 e o Fe(III) do estado basal
da enzima para gerar o composto I, um intermediário em estado de oxidação elevado (estado
de oxidação +5), composto de um centro ferro-oxoferril (IV) - [Fe(IV)=O] e um radical π-
catiônico do tipo porfirínico, que permanece deslocado sobre o anel heme. Em termos
Introdução
14
formais, o composto I é dois equivalentes de oxidação acima do estado basal sendo
descarregado em duas reações seqüenciais de um único elétron com um substrato redutor,
produzindo radical e água.
A primeira etapa de redução em um elétron, quando o radical π-catiônico é
neutralizado, requer a participação de um substrato redutor e conduz à geração do composto
II, uma espécie ferro-oxoferril (IV) que é um equivalente de oxidação acima do estado basal
(estado de oxidação formal +4) e água. Ambos os compostos I e II são oxidantes poderosos,
com potencial redox estimado ao redor de +1V. Nesta etapa ocorre a formação de um
substrato radicalar além do composto II. Finalmente, o Composto II é reduzido por uma
segunda molécula de substrato para o estado ferro III latente. As características do substrato
redutor determinam as velocidades destas duas etapas, mas elas são normalmente mais lentas
do que a reação inicial com o peróxido e em muitos casos a redução do composto II possui a
velocidade limitante (BANCI, 1997; HINER et al., 2001, VEITCH, 2004).
As três etapas do ciclo para a peroxidase catiônica do rabanete – HRP-C estão
descritas nas equações abaixo, onde não estão representadas as cargas do grupamento heme
(GAJHEDE, 2001):
HRP C[(Fe(III))Porf2¯]+ + H2O2 HRP C[(Fe(IV) = O) Porf*¯ ]* + + H2O
Composto nativo Composto I
HRP C[(Fe(IV) = O) Porf*¯]* + + AH HRP C [(Fe(IV) = O)Porf2¯]-H+ + A*
Composto II
HRP C[(Fe(IV) = O)Porf2¯]-H+ + AH HRP C[(Fe(III))Porf2¯] + + H2O + A*
Composto nativo
Introdução
15
A oxidação das moléculas de substratos pelas peroxidases de plantas é acompanhada
pela transferência de prótons. Na HRP-C, o destino final do próton é uma histidina distal (His
42) no caso da redução do composto I. O elétron é transferido do substrato redutor para o
grupo heme e o radical resultante se dissocia da enzima. No caso da redução do composto II, a
histidina distal induz a transferência do próton. Ambos os prótons transferidos podem
envolver a molécula de água, que é posicionada eqüidistantemente entre a histidina do sítio
ativo e a posição antecipada do oxigênio ferril dos compostos I e II. Segundo Dunford, estas
características relacionadas à histidina distal (aceptora de prótons e estabilizadora de cargas)
são estendidas para todas as peroxidases de plantas (DUNFORD, 1999).
Nas frutas e vegetais as peroxidases estão localizadas dentro das células na forma
parcialmente solúvel no citoplasma, mas aparecem também em formas parcialmente
insolúveis quando ligadas covalente e ionicamente à parede celular ou associadas a certas
organelas (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981; KHAN e ROBINSON, 1993). A proporção entre as
formas solúveis e insolúveis pode variar durante o amadurecimento. A fração solúvel pode ser
extraída com água ou com tampão de baixa força iônica (0,05 - 0,18 M), a fração ionicamente
ligada com um tampão de força iônica maior contendo NaCl ou CaCl2, e a forma
covalentemente ligada usando-se enzimas celulolíticas ou pectinolíticas (VÁMOS-
VIGYÁZÓ, 1981).
1.2.3. Funções fisiológicas da peroxidase e suas isoenzimas
A formação de radicais altamente reativos obtidos nas reações catalisadas pela
peroxidase e a possibilidade de que, mais tarde, participem de reações não enzimáticas,
mostram as diversas possibilidades relacionadas com as funções da enzima in vivo. Entre as
várias funções podemos citar seu envolvimento em reações cruzadas, tais como a formação
das ligações de grupos diferulato a partir de ferulatos ligados a polímeros de polissacarídeos e
Introdução
16
pectina; também a formação das ligações da ditirosina ou das ligações cruzadas dos
monômeros fenólicos na formação da suberina, além do acoplamento oxidativo dos
compostos fenólicos como parte da biosíntese da lignina (VEITCH, 2004, GAJHEDE, 2001).
Sua função também foi relacionada à resposta ao estresse e às injúrias
(MOERSCHABACHER, 1992) e, segundo Savitsky, ao mecanismo de ação do hormônio de
crescimento IAA (ácido indol-3-acético) (SAVITSKY et al., 1999). Grande parte das
dificuldades para compreender a totalidade das funções da peroxidase em plantas está
relacionada à presença de um grande número de isoperoxidases e a dificuldade em associá-las
a funções fisiológicas específicas.
Para Robinson, as isoformas da POD em plantas podem ser classificadas de acordo
com seus pontos isoelétricos, e de maneira simples podem ser divididas em três grupos: com
pI entre 3 e 6, um grupo neutro e outro com pI entre 8 e 10. O autor relaciona esta variedade
de isoperoxidases à existência de um grande número de pares de genes das peroxidases das
plantas localizados em diferentes cromossomos (ROBINSON, 1991). Recentemente foram
identificados 73 genes completos na planta modelo Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, sendo
que foi prevista a codificação de enzimas estáveis para a maioria destes genes (WELINDER
et al., 2002). Cada espécie de planta parece possuir um conjunto de isoenzimas, todas com
potencial para conduzir uma série de diferentes funções (VEITCH, 2004).
As isoenzimas estão contidas em diferentes compartimentos celulares, principalmente
na membrana celular, no citoplasma e nos vacúolos das células. O transporte das peroxidases
até seu ponto de ação é considerado um mecanismo de controle da ação das enzimas
(ROBINSON, 1991). A atividade da peroxidase deve ser também controlada por regulação
gênica, tanto na formação da apoenzima como na biosíntese do grupo heme (VAN
HUYSTEE, 1991).
Introdução
17
Na raiz forte, a isoenzima HRP-C e a isoenzima HRP-A possuem menos de 60% de
identidade na seqüência de aminoácidos. Enquanto a HRP-C é básica com pI 8,8 e possui
cerca de 18% do PM (~43.000) como porção glicosilada, a HRP-A possui pI na faixa ácida
(3,9), sendo altamente glicosilada (23% do peso molecular) (HINER et al., 2001).
1.3. POLIFENOLOXIDASE E OS ALIMENTOS
A polifenoloxidase – PPO (EC 1.14.18.1 – monofenol, dihidroxifenilalanina: oxigênio
oxidoredutase) ou tirosinase, como é mais tradicionalmente conhecida, catalisa a reação
oxidativa associada ao escurecimento e à deterioração dos tecidos de frutas e vegetais. A PPO
foi identificada pela primeira vez em cogumelos (Agaricus bisporus), em 1885, sendo
amplamente distribuída entre microrganismos, animais e plantas.
A PPO é responsável pela oxidação enzimática de polifenóis, etapa fundamental no
desenvolvimento vegetal por estar relacionada a reações de acoplamento que ocorrem
posteriormente a sua ação e que estão envolvidas em vários caminhos biosintéticos, incluindo
a formação da lignina, tanino e melanina (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
Em revisão publicada em 1991, Zawistowski e colaboradores mostraram que a PPO
aparece como uma enzima intracelular presente em várias organelas e eventualmente no
citoplasma, onde aparece preferencialmente associada à membrana dos cloroplastos. A
enzima de maçãs recém coletadas aparece na forma particulada nos cloroplastos e na
mitocôndria. Seu máximo de atividade é atingido um pouco antes da fruta atingir o máximo
de maturidade, que ocorre no mesmo momento do aumento da PPO solúvel. De uma maneira
geral, o aparecimento da PPO está relacionado ao envelhecimento e às injúrias pós-colheita
que causam a ruptura da membrana de organelas e, assim, a liberação da PPO
compartimentalizada e também dos compostos fenólicos contidos em vacúolos. A
Introdução
18
concentração da enzima em determinados vegetais está relacionada com as muitas variáveis
de espécie, cultivar, idade, maturação e demais variações agronômicas (ZAWISTOWSKI et
al., 1991).
Polifenoloxidase de várias fontes foram purificadas e isoladas, mas a freqüente
contaminação com pigmentos e a ocorrência de múltiplas formas retardaram a sua
caracterização. Os principais problemas observados foram relacionados principalmente à
presença de compostos fenólicos e proteases na célula vegetal, que agem alterando as
características da enzima. A presença de várias isoformas, formas imaturas, maduras latentes
e forma ativa também dificultam a identificação. Sabe-se que existe uma multiplicidade de
formas relacionadas e que este fato tem relação com a associação/dissociação (ou outro
fenômeno) que ocorre entre unidades similares ou diferentes da enzima, que pode ocorrer
tanto “in vivo” como durante os procedimentos de purificação da enzima (ZAWISTOWSKI et
al., 1991).
1.3.1. Estrutura da polifenoloxidase
Algumas polifenoloxidases são bem caracterizadas e, dependendo da fonte, seu peso
molecular pode variar entre 29.000 e 200.000, com subunidades de 29.000 a 67.000. A
tirosinase de cogumelos é uma enzima referência para estudos sobre a polifenoloxidase.
Na batata doce, a polifenoloxidase aparece em uma única forma com peso molecular
de 96.000 e, quando submetida a gel desnaturante de poliacrilamida, aparece com peso
molecular de 25.000. Isto indica que a PPO deste vegetal é um tetrâmero composto de 4
unidades de peso molecular similar (LOURENÇO et al., 1995). Em repolhos, Fujita e
colaboradores descrevem a PPO como sendo uma enzima monomérica de peso molecular de
aproximadamente 30.000 (FUJITA et al., 1995).
Introdução
19
Por aparecerem em concentrações muito baixas nos organismos, a determinação da
seqüência de aminoácidos da maior parte das enzimas somente foi possível com a técnica de
seqüenciamento de DNA. As enzimas de várias plantas sofrem modificações pós-tradução,
sendo a mais importante a proteólise de uma extensão N-terminal de cerca de 10 kDa, que
leva à formação da enzima ativa. O sítio ativo apresenta dois íons cobres que aparecem em
três estados: meta, desoxi e oxi durante a reação de oxidação (SEO et al., 2003).
Figura 3: Representação esquemática da tirosinase do cogumelo (Agaricus bisporus). O sítio ativo é representado pelos dois átomos de cobre (esferas amarelas) em destaque, em roxo e amarelo estão representadas estruturas α-hélice e folhas beta, respectivamente (Comba et al., 2005).
A tirosinase do cogumelo A. bisporus (esquematicamente representada na Figura 3) é
um tetrâmero composto de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L). Existem dois
tipos de cadeias pesadas, α e β, podendo formar as isoenzimas Hα2L2 ou Hβ2L2. A enzima
possui 3 domínios, dos quais o domínio central possui os dois sítios de ligação contendo os
dois íons de cobre. O domínio do sítio ativo aparece conservado na PPO de várias fontes,
Introdução
20
onde aparecem 6 resíduos de histidina que ligam um par de íons cobre que interagem tanto
com oxigênio molecular como com os substratos fenólicos. A presença de várias cisteínas é
responsável por parte da estabilização da estrutura, sendo que o número de resíduos varia
conforme o organismo de origem. Em plantas são encontradas, em média, 11 resíduos (SEO
et al., 2003).
1.3.2. Atividade catalítica da polifenoloxidase
A PPO usa oxigênio molecular para catalisar duas reações diferentes: a co-oxidação de
monofenóis a o-difenóis (atividade monofenolase ou cresolase) e a subseqüente oxidação
destes compostos a o-quinonas (atividade difenolase ou catecolase).
Zawistowski e colaboradores descreveram que, de uma maneira geral, as difenolases
ou tirosinases são as formas mais comuns das polifenoloxidases se apresentarem nos vegetais
(ZAWISTOWSKI et al., 1991). Para elas, a reação geral (um ciclo) envolve a oxidação de
duas moléculas de o-difenol a 2 moléculas de o-quinona, com concomitante redução do
oxigênio (O2) por 4 elétrons, produzindo 2 moléculas de água. Neste ciclo, a enzima passa por
cinco estados (Edesoxi, Eoxi, Eoxi-D, Emet e E met-D), produzindo no final o-quinonas
(LERCH, 1994). A Figura 4 mostra a oxidação do catecol, um difenol, à benzoquinona, uma
o-quinona, em reação usada para mensurar a atividade da PPO in vitro.
Figura 4: Reação do catecol com oxigênio, catalisada pela PPO. A reação é responsável pela reação in vitro usada para quantificação da atividade da enzima e pela formação de o-quinonas instáveis que podem sofrer posterior polimerização.
Introdução
21
Todas as atividades demonstradas ou hipotizadas para a PPO possuem em comum o
requerimento de oxigênio como substrato (MARTINEZ e WHITAKER, 1995). As o-quinonas
instáveis são posteriormente polimerizadas (Figura 4) por via não-enzimática a pigmentos
marrons, vermelhos e pretos, que são responsáveis pela perda de qualidade nutricional e
sensorial.
A ação da PPO sobre as catequinas, ésteres do ácido cinâmico (por exemplo, ácido
clorogênico), 3,4 dihidroxifenilalanina e tirosina é responsável por indesejáveis reações de
escurecimento que ocorrem particularmente durante o processamento e armazenamento de
frutas e vegetais, afetando adversamente sua cor, gosto e valor nutricional. A inibição do
escurecimento enzimático e, portanto, da polifenoloxidase, é um dos grandes propósitos da
indústria de alimentos (WEEMAES et al., 1998).
Entre as plantas, a PPO das uvas, das maçãs e das batatas vem sendo intensamente
estudada em conseqüência dos problemas causados no processamento do vinho, suco e
alimentos processados com batata, respectivamente. Estes estudos mostram que, embora
dependendo da forma como a enzima se apresenta, ela pode ser considerada uma enzima de
baixa termoestabilidade. Tratamentos térmicos entre 70 e 90ºC com relativamente curta
duração, podem ser usados para reduzir ou eliminar completamente a atividade da enzima.
Em contraste, a atividade da enzima é relativamente estável e continua presente mesmo a
temperaturas abaixo de zero (ZAWISTOWSKI et al., 1991).
1.4. ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA PARA PROCESSAMENTO DE ALIMENTOS
O processamento por alta pressão (em inglês: High Pressure Processing: HPP),
também chamado como Alta Pressão Hidrostática ou APH (em inglês: HHP) ou Pressão
Ultra-Alta (inglês: UHP), submete alimentos líquidos ou sólidos, embalados ou não, a
Introdução
22
pressões entre 100 e 800 MPa. A temperatura durante o tratamento pode estar entre valores
abaixo de 0ºC até acima de 100ºC. O uso da APH em alimentos é uma extensão da tecnologia
empregada normalmente em outros processos industriais, principalmente na manufatura de
cerâmica, diamantes e metal prensado (U.S.FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2000).
Os valores de pressão utilizados para o processamento de alimentos por APH são
muito altos quando o objetivo é obter produtos com vida mais longa durante o
armazenamento. Pode-se comparar o valor de processamento médio por APH (500 MPa ≅
72.000 PSI) ao peso de 2 elefantes sobre um morango (MEYER, 2000).
A indústria de alimentos iniciou o uso da alta pressão como processo de conservação
de alimentos durante a década de 80, sendo que, neste período o objetivo estava totalmente
voltado para a inativação de microrganismos. Desde início do século XX, cientistas
descrevem a inibição do crescimento celular, e em 1970 já era conhecida a grande
sensibilidade dos microrganismos à APH durante a fase exponencial de crescimento
(LARSEN, 1918 e ZOBELL, 1970 apud ARROYO, 1997).
Em 1989, Ogawa, no Japão, foi pioneiro na proposta para utilização da APH como
processo de esterilização de sucos de frutas cítricas e de outras frutas (em ALEMAN et al.
1996). A patente japonesa de propriedade da TAIYO FISHERY CO. LTD., descreve o uso de
APH para vários alimentos com o objetivo de inativar enzimas deteriorantes de diferentes
fontes e indica seu uso para a produção de geléias (YASUHIKO et al., 1988).
Atualmente, vários produtos tratados por alta pressão estão presentes principalmente
nos mercados do Japão, Estados Unidos da América, França, Inglaterra e outros países da
Europa. Entre os vários produtos oferecidos sobressaem as frutas, sucos de frutas, iogurtes,
geléias e molhos de frutas, ostras e carnes nobres (HEREMANS, 2002). O mercado para os
produtos processados por alta pressão vem sofrendo um incremento constante em
Introdução
23
conseqüência do aumento do mercado para alimentos com qualidades sensoriais e nutricionais
elevadas.
A partir de maio de 2001 os alimentos que utilizam esta tecnologia foram
regulamentados na Comunidade Européia (COMISSÃO EUROPÉIA, 2001), mas devem ser
rotulados como alimentos "pasteurizados por alta pressão”. Na Tabela 1, estão descritos
alguns produtos já comercializados nos Estados Unidos da América produzidos por
processamento por APH e que atendem as especificações de esterilidade para alimentos
ácidos (FARKAS, 2003).
Tabela 1: Exemplo de alimentos ácidos comercialmente estéreis preservados por APH.
PRODUTO PRESSÃO (MPa)
TEMPO de PROCESSO (min)
EMBALAGEM
Arroz espanhol 340 30 Sacos flexíveis
Macarrão com molho 340 30 Sacos flexíveis
Iogurte com pedaços de pêssego
340 30 Sacos flexíveis
Laranja e abacaxi 340 30 Sacos flexíveis
Arroz espanhol 580 15 Embalagem tipo bandeja
Sobremesa de limão 580 15 Embalagem tipo bandeja
Iogurte líquido 580 15 Embalagem tipo bandeja
Frango oriental com arroz
580 15 Embalagem tipo bandeja
Frutos do mar com arroz
580 15 Embalagem tipo bandeja
Macarrão vegetariano 580 15 Embalagem tipo bandeja
Molho guacamole 540 3 Saco polietileno multicamada
Suco de maçã 540 3 Saco polietileno multicamada * 100 MPa é aproximadamente igual a 15,000 psi ** enchimento asséptico
Introdução
24
O processamento de alimentos por APH pode ser efetuado utilizando equipamentos
industriais oferecidos no mercado internacional. Alimentos em geral podem sofrer
processamento descontínuo, para isto são embalados antes do processo e posteriormente
submetidos à pressurização como está representado na Figura 5B. Outro procedimento pode
ser utilizado para produtos líquidos, como sucos e molhos, que podem sofrer pressurização de
forma contínua seguida de acondicionamento em embalagem asséptica (Figura 5A).
Figura 5: Esquema simplificado de processos de APH. Em A – processo contínuo de alimentos fluídos: o líquido é bombeado de forma contínua, sendo retido e pressurizado durante o tempo pré-estabelecido e após a despressurização é embalado em condições assépticas. Em B – processo descontínuo de alimentos líquidos: o alimento é pré-acondicionado e várias embalagens são pressurizadas em batelada, após o tempo pré-estabelecido o material é despressurizado (Fonte: AVURE TECHNOLOGIES INCORPORATED, 2006).
Introdução
25
1.4.1. Processamento por APH versus processamento
térmico
A esterilização tradicional ou ultra-rápida (UHT) e a pasteurização convencional e o
branqueamento são processamentos utilizados em grande escala pela indústria de alimentos
visando o aumento da conservação de uma grande variedade de produtos. Este efeito ocorre
em conseqüência da eliminação ou diminuição da quantidade de microrganismos e enzimas
deteriorantes presentes na matéria prima usada para a produção dos alimentos.
Branqueamento é o termo comum usado para descrever a inativação pelo calor das
enzimas naturalmente presentes nos vegetais e sempre envolve um aquecimento curto por
períodos de 2 a 3 minutos, a temperaturas entre 70ºC e 100 ºC. Pasteurização é o tratamento
pelo calor que possibilita a destruição dos microrganismos patogênicos presentes na matéria
prima empregando 63ºC durante 30 min ou 72ºC por 20 segundos. Esterilização usa
temperaturas acima de 100ºC, normalmente 121ºC por 15 minutos ou mais ou temperaturas
acima de 140ºC durante vários segundos e significa a destruição de todos os microrganismos,
vegetativos ou não (FELLOW, 2006). Além da inativação das enzimas e também dos
microrganismos pelos processos que utilizam o calor, sabe-se que, como conseqüências
secundárias, possivelmente serão observadas alterações tanto nas características sensoriais
quanto nutricionais do produto obtido (CHEFTEL e CHEFTEL, 1992).
Atualmente grande parte das pesquisas visando desenvolver novas tecnologias para o
processo de alimentos é conseqüência do aumento significativo de consumidores que exigem
alimentos minimamente processados, mas com qualidade garantida, que sejam
nutricionalmente superiores aos encontrados no mercado (MARTH, 1998) e, contrapondo à
tendência recente do “fácil de usar”, sejam “idêntico ao natural.”
(www.leatherheadfood.com).
Introdução
26
Durante as duas últimas décadas foram publicados numerosos artigos descrevendo
tecnologias classificadas como alternativas para a preservação de alimentos. Pelo fato destes
processos não utilizarem o aquecimento ou, se o utilizam, o fazem em níveis bastante
discretos, eles são normalmente referidos como tecnologia alternativa (ou não-térmica) de
preservação. Entre estas tecnologias, a alta pressão hidrostática (APH), que usa centenas de
mega-pascal (MPa), normalmente entre 400 MPa (4.000 atm ou 58.000 PSI) a mais de 700
MPa (7.000 atm ou 100.000 PSI), é citada como uma das mais promissoras (BEHSNILIAN,
et al., 2003).
Uma das principais vantagens desta tecnologia, em contraste com o processamento por
altas temperaturas, é que ela mostra uma grande possibilidade de manter os atributos
característicos do alimento fresco porque pouco afeta as ligações covalentes. Portanto,
processos característicos de degradação como a reação de Maillard, formação de sabores
inadequados e destruição de vitaminas ocorrem em velocidade mais lenta durante a
pressurização (HENDRICKX et al., 1998).
Outra vantagem evidente do tratamento por APH é o baixo custo com energia. Embora
o custo de uma planta de APH seja bastante elevado, a economia de energia em conseqüência
do processamento em grande escala, torna-o menos oneroso (SMELT, 1998). Torrez e
Velasquez discutem o uso do processamento por APH e apontam a utilização plena da
capacidade de produção da planta industrial de APH como solução para viabilizar a
necessidade de grande investimento de capital (TORRES e VELÁSQUEZ, 2005).
Em contrapartida, a literatura também oferece exemplos de efeitos que podem ser
considerados adversos quando do uso da APH, em grande parte relacionados à atividade e/ou
aumento de atividade de enzimas nas células. Este fato está relacionado com mudanças na
estrutura das proteínas, que podem ser reversíveis ou não (CHEFTEL, 1992). Diferentes
enzimas têm aumento ou decréscimo na atividade enzimática, estando os resultados
Introdução
27
relacionados com a fonte da enzima e com as características do processo
(tempo/temperatura/níveis de pressão).
1.4.2. Efeito da APH sobre alimentos, proteínas e enzimas
O princípio isostático de Le Chatelier indica que a pressão é transmitida de maneira
uniforme e quase instantânea através de um líquido biológico. Sendo desta maneira, pode-se
afirmar que o tempo de processo com alta pressão seria independente do tamanho da amostra
e também que o uso da alta pressão não ocasiona a formação de um gradiente ao longo do
produto ou da embalagem em processo (TAUSCHER, 1995).
A Figura 6 mostra o efeito da pressurização sobre uma embalagem de isopor, que
aparece íntegra em conseqüência da uniformidade do processo. Esta característica representa
a maior vantagem deste procedimento quando comparado ao aquecimento, já que este forma
um gradiente de temperatura dentro do material biológico. Em relação ao consumo de energia,
o aumento em 400 MPa necessita da mesma quantidade de energia necessária para elevar a
temperatura em 30ºC (CHEFTEL, 1995).
Figura 6: Efeito do tratamento por APH (400 MPa) sobre uma frágil embalagem de isopor. A imagem da direita é o resultado do emprego de APH sobre a embalagem apresentada à esquerda (AVURE TECHNOLOGIES INCORPORATED, 2006)
Introdução
28
O equilíbrio químico e a velocidade de uma reação são influenciados pelo aumento da
pressão. Geralmente, um processo, seja uma reação química ou uma transição de fase,
ocorrerá melhor sob pressão se o produto final ocupar um volume menor que o estado inicial
(Principio de Le Chatellier, “escapar da força”). Desta forma, a aplicação de pressão favorece
todos os processos que são associados com a redução de volume. Transições de fase e reações
químicas nas quais o produto final possui um volume menor do que o da substância inicial
deverão, portanto, ser favorecidas (CHEFTEL, 1995).
Os constituintes de um alimento reagem de modo diferente quando expostos à alta
pressão. Como as ligações covalentes são conservadas quando submetidas à pressão,
moléculas pequenas (por exemplo, vitaminas e substâncias envolvidas com o sabor) são
menos sensíveis que moléculas grandes (por ex. proteínas) que possuem uma conformação
espacial sustentada por forças mais fracas (CHEFTEL, 1995).
Pode-se afirmar que a alta pressão age sobre a estrutura e a atividade de várias
proteínas e enzimas, podendo ocorrer quebra de interações eletrostáticas e de uma parte das
ligações hidrofóbicas, além de ocasionar um aumento da força das pontes de hidrogênio. A
desnaturação protéica e a inativação de enzimas ocorrem tanto pelo uso do calor como da
pressão, mas estes tratamentos têm diferentes efeitos sobre as ligações covalentes. No caso da
pressão, não ocorre qualquer modificação das ligações covalentes além de não alterar as
ligações do tipo pontes de dissulfeto (CHEFTEL, 1995).
Os principais efeitos da alta pressão sobre o alimento são: (KNORR, 1993)
(1) inativação de microrganismos;
(2) modificação de biopolímeros, tais como desnaturação de proteínas, formação de
géis, ativação ou inativação de enzimas e modificação nas características de degradação ou
extração de compostos;
Introdução
29
(3) retenção de qualidade, especialmente com relação ao aroma, sabor e valor
nutricional;
(4) alteração das características físicas e funcionais do produto, incluindo mudança na
densidade, temperatura de congelamento e fusão e atributos de textura;
(5) inativação de enzimas biologicamente ativas, que levariam à conseqüente
deterioração do alimento.
A estrutura nativa é o arranjo tri-dimensional de proteínas funcionais quando em seu
ambiente natural. Quando uma proteína é desnaturada, as características tri-dimensionais de
seu arranjo são rompidas (ocorre desenovelamento da proteína), e, consequentemente, sua
atividade fisiológica é perdida. Proteínas são parcialmente desenoveladas pela desnaturação
pelo calor, por substâncias químicas, e pela alta pressão, sendo que a perda da atividade
fisiológica pode ocorrer com discretas modificações que acontecem, na maior parte das vezes,
apenas na estrutura terciária (BALNY e MASSON, 1993).
As modificações causadas nas enzimas pelo uso de pressões muito elevadas não estão
relacionadas aos efeitos obtidos em conseqüência do uso de altas temperaturas. Da mesma
forma, a resistência das enzimas a pressões muito elevadas não está diretamente relacionada à
resistência a altas temperaturas, sendo assim, os conhecimentos sobre resistência à
temperatura não podem ser transportados às condições de alta pressão (HENDRICKX et al.,
1998).
A pressão pode influenciar uma reação enzimática de diversas maneiras: (1)
Aumentando a atividade enzimática; (2) Modificando a especificidade pelo substrato; (3)
Inativando a enzima (TAUSCHER, 1995). O efeito da APH na velocidade e no grau de
desnaturação irreversível de enzimas deteriorantes de alimentos depende da composição e da
estrutura da enzima, do pH e tipo de solutos do líquido em que a enzima está presente, bem
como dos parâmetros de processo empregados (BUTZ, 1997).
Introdução
30
Seyderhelm e colaboradores classificaram as enzimas quanto aos níveis de pressão
necessários para inativação (do mais baixo ao mais elevado): lipoxigenase, lipase, fosfatase
alcalina, polifenoloxidase e peroxidase. A comparação levou em consideração as condições
distintas empregadas dentro de limites entre 0,1 a 900MPa, temperaturas entre 25 e 60ºC, pH
entre 3-7 e tempo de tratamento entre 2 a 45 minutos em soluções-modelo de tampões
(SEYDERHELM et al., 1996).
Para a peroxidase são apresentadas várias possibilidades que explicam como a
estrutura da proteína pode resistir à desnaturação térmica, entre várias, algumas merecem
destaque:
1º Isoformas catiônicas possuem uma forte afinidade por polímeros carregados como
pectinas, o que aumenta a estabilidade da enzima e pode explicar sua termoestabilidade in
vivo (VIEILLE e ZEIKUS, 1996);
2º As isoformas podem ser glicosiladas, o que leva ao aumento da estabilidade da
proteína como um todo (POMAR et al., 1997);
3º Existe relação entre as propriedades termoestáveis da POD e a formação de
agregados de POD termoestáveis (ROBINSON et al. 1989).
Entre as ligações que fazem parte da formação de uma proteína, as que parecem ser
mais desestabilizadas pela pressão são as mais fracas, tais como forças de dispersão de
London (SILVA e WEBER, 1993). A diminuição do volume que acompanha a desnaturação
(aproximadamente 30 a 80 mL por mol) é dada pela formação ou ruptura de pontes não
covalentes (mudanças no volume conformacional) e por rearranjos das moléculas de solvente
(mudanças no volume de solvatação) (HENDRICKX et al., 1998). Para Silva e Weber, a
baixa compressibilidade das proteínas é bastante conhecida, sendo este fenômeno relacionado
com a invariabilidade das ligações covalentes. Os autores explicam que os resultados obtidos
com o uso da pressão sobre proteínas podem ser resumidos pela proposição de que as
Introdução
31
proteínas, quando em alta pressão, são infiltradas com água. Isto ocorre de modo similar,
quando as proteínas são incubadas em soluções de concentrações apropriadas de guanidina ou
uréia à pressão atmosférica (SILVA e WEBER, 1993).
A maioria das proteínas globulares monoméricas sofre alterações somente quando
submetidas a pressões na faixa 500 e 1200 MPa (SILVA et al., 2001). Isto porque a estrutura
secundária das proteínas é grandemente estabilizada por pontes de hidrogênio que são pouco
sensíveis ao emprego de pressão. Quando uma ponte de hidrogênio intra-cadeia é desfeita,
uma nova ponte de hidrogênio proteína-água se forma o que resulta em variação de volume
igual a zero.
Em geral, a maior parte das proteínas desnatura em pressões superiores a 400 MPa. As
estruturas na forma de α-hélices são normalmente mais compressíveis do que as fitas-β
(TAUSCHER, 1995). Dependendo da enzima, diferentes níveis de pressão podem ter efeitos
diferenciados, ocasionando tanto a inativação como a ativação das enzimas. Outros fatores,
tais como pH, temperatura, composição do substrato e do meio também podem afetar as
enzimas (CHEFTEL, 1995; HENDRICKX et al., 1998).
As alterações causadas pela compressão dos alimentos são inicialmente identificadas
na estrutura do líquido solvente, a água. O caráter polimórfico da água quando comprimida
vem sendo continuamente estudado resultando na caracterização de 15 fases identificadas
durante a compressão da água entre 0,1 MPa e 1.000 MPa (1GPa). O diagrama de fases
resultante é bastante complexo, ainda mais quando são usadas temperaturas negativas ou
acima da temperatura de vaporização da água, e pressões até 1 GPa. Como conseqüência,
vários solutos tem suas propriedades químicas alteradas (HEMLEY, 2000).
Os efeitos observados em experimentos usando APH em enzimas ou outros
componentes dos alimentos dissolvidos em tampões podem não representar o efeito do
processamento em diferentes tipos de matérias primas, já que a composição do alimento pode
Introdução
32
alterar substancialmente a resposta à pressão. Os tampões tradicionais como fosfato ou acetato
podem sofrer alterações substanciais do seu pK, causando modificações de pH das soluções
quando pressurizadas. Para a avaliação do efeito da pressurização de substâncias dissolvidas
em água são descritos vários tampões pouco alterados durante o processo (KITAMURA e
ITOH, 1987). Os tampões biológicos MES, indicado para a faixa de pH entre 5,5-6,7 e Tri-
HCl, indicado para a faixa de pH entre 7,0-9,0 aparecem como confiáveis na manutenção da
estabilidade do pH de soluções aquosas submetidas à pressurização. Os resultados obtidos
para a enzima diluída em tampão MES são considerados livres da influência da modificação
de pH que pode ocorrer quando uma solução é pressurizada.
1.4.3. Efeito da APH sobre microrganismos
O efeito da APH sobre os microrganismos varia enormemente, os mecanismos exatos
que ocasionam a inibição e inativação não são totalmente descritos, mas estão relacionados a
vários fatores intrínsecos e extrínsecos que afetam a estrutura e funções celulares, resultando
na morte da célula. Entre os fatores intrínsecos é de extrema importância o efeito da pressão
sobre as membranas celulares, que altera estas estruturas mantidas juntas pela ação de pontes
de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Segundo Smelt e colaboradores, o uso de APH leva à
perda de ATP em conseqüência de alterações na membrana celular ocasionadas pela quebra
das moléculas de fosfolipídios, desnaturação das proteínas e alteração da permeabilidade
celular (SMELT et al., 1994).
Mañas e Mackey, usando processamento por alta pressão hidrostática, indicam ser
suficiente o uso de 200 MPa para eliminar células na fase exponencial, sendo porém
necessário, mais de 500 MPa para células na fase estacionária. Os autores, avaliando o efeito
da APH sobre a Escherichia coli, indicam ser este fato conseqüência das modificações no
Introdução
33
envelope celular e conseqüentes perturbações na resposta das trocas osmóticas e perda de
proteína e RNA para o meio extracelular (MAÑAS e MACKEY, 2004).
O processo de alta pressão é descrito na literatura como bastante eficiente na
eliminação de formas vegetativas de bactérias, leveduras e mofos em processos que utilizem
pressões superiores a 700 MPa à temperatura ambiente. Patterson (2005) em revisão sobre o
efeito da APH sobre os microrganismos, lista alguns resultados do uso do processamento por
APH sobre diferentes microrganismos presentes em vários alimentos, que estão, em parte,
reproduzidos na Tabela 2, a seguir. Os valores mostram que o uso de APH leva à eliminação
de grande parte da população microbiana, resultando em aumento considerável da
conservação dos alimentos que utilizam este processamento (PATTERSON, 2005).
Tabela 2: Sensibilidade à alta pressão hidrostática para alguns microrganismos selecionados (modificado de Patterson, 2005). Microrganismo Substrato Condições de
tratamento Inativação (redução em unidades de log10)
Referência (em Patterson, 2005)
Bactérias formadoras de esporos
C. botulinum esporos tipo E (Alasca)
Fosfato de Sorensen 0,067 mol-1 , pH 7
827 MPa/5 min/ 50ºC
5 Reddy et al., 1999
C. sporogenes - esporos Peito de frango 680 MPa/ 80ºC/ 20min 2 Crawford et al., 1996
B. stearothermophilus esporos
Água 600 MPa/ 5 min/ 70ºC em ciclos
5 Hayakawa et al., 1994
C. sporogenes, B. subtilis, B. stearothermophilus esporos
Embutido de carne 621 MPa/ 98ºC/ 5 min > 5 >9 >10
Wilson e Baker, 2001
Vírus
HIV- 1 Meio de cultura 550 MPa/25ºC/ 10min 4 Otake et al., 1997
Febre aftosa 250 MPa/ -15ºC/1 mol-1 uréia/ 60min
cerca de 4 Ishimaru et al., 2004
Hepatite A Meio de cultura de tecidos – água do mar
275 MPa/ 21ºC/ 5 min 7 Kingsley et al. 2002
Introdução
34
O mesmo autor descreve a ação da APH sobre as diferentes formas microbianas:
• Bactérias vegetativas: de uma maneira geral as bactérias Gram positivas
tendem a ser mais resistentes que as Gram negativas e os cocos mais resistentes que os
bastões. Existem várias exceções, porém a maior ou menor resistência não esta
relacionada à sensibilidade a outros agentes de inativação.
• Mofos e leveduras: A presença deste grupo de microrganismos está muito mais
associada a danos e alterações causadas aos alimentos e produtos derivados do que a
doenças causadas ao ser humano. As formas vegetativas são mais sensíveis, porém os
esporos podem se mostrar bastante resistentes. O tratamento por alta pressão
Microrganismo Substrato Condições de tratamento
Inativação (redução em unidades de log10)
Referência (em Patterson, 2005)
Bactérias vegetativas
Campylobacter jejuni Embutido de carne de porco
300 MPa/2510 min
Shigehisa et al., 1991
Salmonella Senftenberg 775W
Alimento infantil 340 MPa/23ºC/ 10 min
Metrick et al., 1989
Escherichia coli O157:H7 NCTC 12079
Leite UHT Carne de ave
600 MPa/ 20ºC/ 15 min
Patterson et al., 1995
Staphylococcus aureus Leite UHT Carne de ave
600 MPa/20ºC/15 min Patterson et al., 1995
Listeria monocytogenes Leite UHT Carne de ave
375 MPa/20ºC/15 min Patterson et al., 1995
Vibrio parahaemolyticus O3:K6
Ostras 300 MPa/10ºC/ 3 min 5 Cook, 2003
Lactobacillus helveticus Leite de cabra 500 MPa/10ºC/ 10 min 3 Gervilla et al., 1997b
Pseudomonas fluorescens Leite de cabra 450 MPa/10ºC/ 10 min 4 Gervilla et al., 1997b
Leveduras e Mofos
Saccharomyces cerevisiae Embutido de carne de porco
300 MPa/ 20ºC/ 10 min
2 Shigehisa et al., 1991
Byssochlamys nivea ascospores
Suco de uva aw = 0,97 Geléia de frutas vermelhas aw = 0,84
700 MPa/ 70ºC/ 30 min
4 <1
Butz et al. ,1996
Introdução
35
hidrostática é bem sucedido para eliminação de grande parte destes microrganismos. A
APH aparece também eficiente na quebra de micotoxinas, como a patulina produzida
por Aspergillus, Penicillium e outros fungos.
• Os esporos bacterianos são efetivamente os organismos mais resistentes a APH
e assim como podem resistir a vários outros tratamentos químicos ou físicos, Os
esporos de Clostridium botulinum podem resistir a 1000 MPa .
A combinação entre calor e APH é descrita por vários autores como sendo eficiente na
eliminação de esporos de muitas bactérias. Matser e colaboradores citam o resultado de
Reddy e colaboradores, que obtiveram a redução em 5 unidades logarítmicas para esporos do
tipo E do C. botulinum em processo usando 50-55ºC e pressão de 827 MPa. O autor descreve
resultados que indicam a destruição de esporos bacterianos através da seleção cuidadosa da
combinação entre APH e temperatura (MATSER et al., 2004).
1.5. ADSORÇÃO DE PROTEÍNAS E O USO DE SURFACTANTES
O fenômeno de adsorção pode ser caracterizado pelo enriquecimento de uma camada
interfacial em um ou mais componente. Este termo pode também ser utilizado para processos
nos quais moléculas acumulam na camada interfacial, sendo dessorção o termo usado para
definir quando uma substância é liberada desta camada (EVERETT, 2001).
A adsorção de proteínas em superfície sólida é um fenômeno bastante conhecido. Para
estudá-lo é necessário considerar as características de cada proteína envolvida no fenômeno, a
composição e outras características físico-químicas (pH, temperatura, sais dissolvidos, entre
vários outros parâmetros) do meio em que ela esteja dissolvida. Muitos fatores como: atrações
eletrostáticas, ligações covalentes, pontes de hidrogênio ou interações não-polares entre o
Introdução
36
adsorvido e as espécies da interface, interações laterais entre as espécies adsorvidas, efeitos de
dessolvatação, interações entre as espécies dissolvidas e precipitações na superfície, devem
ser consideradas. O envolvimento destas muitas variáveis resulta em grande falta de
conhecimento sobre o fenômeno (BALL e JONES, 1995).
Algum grau de adsorção vai ocorrer em qualquer interface líquido-sólido, embora
muitas vezes, ela possa ser tão pequena a ponto de ser considerada desprezível. A adsorção de
moléculas numa interface sólido-líquido cria uma região de transição na ordem de dimensões
moleculares na qual a composição do sistema é diferente, tanto da parte sólida como da parte
líquida. Uma região interfacial típica mostra uma concentração maior de um dos componentes
da fase líquida (a substância que sofre adsorção) (ANANTHAPADMANABHAN, 1993).
A modificação estrutural em conseqüência da adsorção pode levar a um estado de
maior desordem, o que significa um impulso que conduz a proteína para o estado adsorvido, e
isto ocorre para algumas proteínas como a lactoalbumina que adsorve em superfícies
hidrofílicas mesmo com condições eletrostáticas adversas. O comportamento de algumas
proteínas (como a lisozima) favorece a adsorção preferencialmente em materiais sólidos e
rígidos sob a influência tanto de efeitos hidrofóbicos como eletrostáticos (BALL e JONES,
1995).
Alguns parâmetros importantes na adsorção de proteínas por diferentes derivados de
látex foram estudados por Kawaguchi e colaboradores, que quantificaram a interação de
proteínas com partículas de copolímero de látex preparados com diferentes cargas em
soluções diluídas de proteínas, minimizando assim, possíveis interações proteína-proteína.
Este experimento indicou, contrariamente ao que era previsto, que a carga da proteína tem
pouca importância sobre a possibilidade de seu empacotamento na superfície dos diferentes
polímeros de látex testados. Foi observado que superfícies altamente hidrofílicas têm pouca
afinidade por proteínas e por isto pouca importância na adsorção. Consequentemente, um
Introdução
37
aumento da hidrofobicidade ou da carga das superfícies causa, assim, um aumento da
adsorção (KAWAGUCHI et al., 1985).
Surfactantes são compostos que apresentam na mesma molécula uma parte apolar
(hidrófoba – cauda) e uma parte polar (hidrófila – cabeça). Os grupos polares ou hidrofílicos
podem ser carregados (aniônicos, catiônicos ou "zwiteriônicos") ou neutros (polioxietileno,
resíduos de polihidroxilo) e a parte apolar é normalmente composta por uma ou duas cadeias
de hidrocarbonetos. A solubilidade dos surfactantes em água é baixa em conseqüência de o
contato hidrocarboneto/água ser desfavorável.
Outra conseqüência espontânea da solubilização dos surfactantes em água é a
formação de micelas aquosas. A formação de micelas ocorre em uma concentração particular
de sulfactante conhecida como cmc (concentração micelar crítica). Acima da cmc, tanto
micelas como monômeros estão presentes e a adição de mais surfacatante resultará em um
aumento no número de micelas, enquanto que a concentração de monômeros continuará
essencialmente a mesma. (ANANTHAPADMANABHAN, 1993).
Durante muitos anos, os surfactantes foram considerados desnaturantes não-
específicos de proteínas, porém na literatura vários deles foram descritos como responsáveis
pelo aumento da atividade e/ou da estabilização de algumas enzimas. Surfactantes não-iônicos
não interagem eletrostaticamente com proteínas e por serem considerados "suaves",
normalmente não causam desnaturação da proteína. De acordo com a constituição química da
porção hidrófoba, dão origem a séries de compostos com diferentes nomes comerciais, sendo
as mais conhecidas as séries Brij (álcool), Triton X (p-t-octilfenol), Triton N (nonilfenol),
Span (ésteres de ácidos graxos) e Tween (ésteres de sorbitol).
O efeito do surfactante sobre a estrutura da enzima e sua atividade é o resultado de
interações químicas seletivas que podem ser influenciadas tanto pela estrutura da enzima
como pela química do surfactante. O detergente pode também se ligar à estrutura da enzima e
Introdução
38
causar uma mudança conformacional para uma forma mais ativa sendo que geralmente o
grupo cabeça do surfactante tem papel principal (SAVELLIA, 2000). Resultados mostram que
o aumento na eficiência catalítica está relacionado não somente à distribuição da enzima e do
substrato entre as pseudo-fases aquosas e micelar, mas também a modificações na
conformação da proteína (CELEJ et al. 2004).
Objetivos
39
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GERAIS
Purificar e caracterizar a enzima peroxidase da água de coco;
Avaliar o efeito do processamento por alta pressão hidrostática sobre as
enzimas peroxidase e polifenoloxidase da água de coco;
Demonstrar a eficiência do tratamento por APH conjugado à temperatura sobre
a inativação da peroxidase e polifenoloxidase.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Indicar condições que permitam a preservação da atividade da POD durante o
manuseio, concentração e purificação da enzima a partir da água de coco;
Avaliar diferentes métodos de concentração para obtenção da enzima POD;
Determinar o peso molecular da POD da água de coco através da
cromatografia de filtração em gel e em SDS-PAGE;
Avaliar o uso de coluna de troca aniônica em sistema de perfusão para a
purificação da POD;
Identificar o(s) ponto(s) isoelétrico(s) da(s) principal(is) isoforma(s) da POD
da água de coco;
Empregar pressões extremas (entre 100 e 800 MPa) para o processamento da
água de coco e avaliar o efeito sobre a atividade residual das enzimas POD e PPO.
Objetivos
40
Determinar o efeito do uso isolado e conjugado da pressão, temperatura e
tempo sobre a atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase;
Quantificar a atividade residual da POD e PPO na água de coco imediatamente
após o tratamento empregando APH e 24 horas após o tratamento, conservando o
produto sob refrigeração;
Comparar o efeito do tratamento por APH sobre a POD da água de coco com
os valores obtidos após o tratamento da peroxidase de raiz forte comercial nas mesmas
condições.
Material e Métodos
41
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ENZIMAS E REAGENTES
Sigma Chemicals (Saint Louis – USA): Enzima HRP tipo VI-A Sigma
aproximadamente 1000 Unidades/mg (ABTS), RZ (Reinheitszahl)~3,0 (Razão A403/A275) 0,5-
1,0 mg/ml em H2O deionizada. Padrões Sigma Dalton Mark VII-L para SDS-PAGE, padrões
de peso molecular para filtração em gel (Sigma MW-FG-200 faixa: 12,000-200,000), padrões
de focalização isoelétrica (IEF-MIX 3,6-9,3), acrilamida, Tampões Tris-HCl e MES [Ácido 2-
(N-Morpholino)etanosulfônico], peróxido de hidrogênio e guaiacol, Tween®80 e azul de
Coomassie G-250.
As placas de focalização isoelétrica Iso-gel em agarose pH 3,6 - 9,3 eram da BGA
(Rockland, ME USA); a coluna Sephadex G-75 da Pharmacia Co. (Uppsala, Sweden); a
coluna de troca iônica POROS® 20 HQ foi obtida da PerSeptive Biosystems, USA.
Todos os outros reagentes foram de grau ACS (em acordo com padrões da American
Chemical Society).
3.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
A concentração total de proteínas das diferentes amostras foi determinada pelo método
de Lowry usando Kit Sigma (Sigma Diagostics, St Louis, USA), que usa a albumina de soro
bovino como padrão, segundo protocolo da Sigma No. 5656. A absorvância usando
comprimento de onda de 750 nm foi avaliada em espectrofotômetro Perkin Elmer UV/VIS
Lambda 20 (LOWRY, 1951; Sigma Diagnostic).
Material e Métodos
42
A medida da absorvância a 280 nm foi utilizada para o monitoramento da eluição de
proteínas e peptídeos durante as várias etapas da concentração e purificação da água de coco.
3.3. MEDIDA DA ATIVIDADE DA PEROXIDASE – POD
A atividade da peroxidase foi determinada usando a medida da velocidade de oxidação
do guaiacol a tetraguaiacol na presença de peróxido de hidrogênio e enzima, sempre à
temperatura ambiente. Neste ensaio, a velocidade de utilização do peróxido de hidrogênio
(dx/dt) depende da concentração da enzima presente na água de coco quando a concentração
do substrato oxidante (H2O2) e do doador de elétrons (guaiacol) estiver em excesso. O
procedimento utilizado foi adaptado de método descrito por Kaplan, indicado para uso em
soluções com mistura de proteínas contendo concentrações variáveis de enzima (KAPLAN,
1955).
Foi empregado guaiacol (1-hidroxi-2-metoxibenzeno) na concentração de 20 mM, na
presença de peróxido de hidrogênio 1,0 mM, numa solução de tampão MES 50 mM (pH 5,5).
As absorvâncias foram registradas a 470 nm em espectrofotômetro Perkin Elmer UV/VIS
Lambda 20 (The Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, USA) com sistema multi-células, após
agitação rápida da mistura da água de coco, guaiacol e peróxido de hidrogênio em tampão
MES contra branco contendo guaiacol e peróxido de hidrogênio diluído em água. O período
de registro da medição foi de 10 a 15 min para a água de coco.
As soluções de guaiacol e peróxido de hidrogênio foram preparadas na concentração
desejada pela dissolução dos reagentes em água destilada e armazenadas a 4ºC. As soluções
foram consideradas estáveis pelo menos por 24 h e não mais que uma semana.
Os testes foram conduzidos usando-se diferentes alíquotas da enzima (na forma de
água de coco ao natural ou concentrada, como solução da enzima purificada ou solução da
Material e Métodos
43
enzima comercial em tampão), de forma a obter valores de leitura da absorvância dentro de
uma faixa de valores limitada aos valores ótimos do equipamento. Obteve-se sempre um
volume final de 1,0 mL em cubeta de quartzo ou descartável de acrílico após a adição de
todos os reagentes.
Para o cálculo da atividade enzimática (EA POD) foram registradas as variações dos
valores de absorvância pelo tempo (dAbs.min-1) após a adição do peróxido de hidrogênio e
guaiacol à solução contendo a enzima. Na região onde a reação apresentou uma cinética de
ordem zero (porção linear inicial da curva obtida) foi calculado o valor de velocidade inicial
através de regressão linear. Para a maior parte destes cálculos foi utilizado o programa de
Análise Avançada de Cinética que faz parte do módulo UV KingLab, programa de cálculos
do espectrofotômetro utilizado. Este programa permitiu selecionar manualmente a parte linear
correta da curva, recurso importante no caso de reações cinéticas complexas (como é o caso
da medida da atividade da peroxidase e da polifenoloxidase da água de coco). O intervalo de
tempo usado foi diferente para cada amostra em conseqüência de uma fase de latência
variável sempre presente em todas as amostras de água de coco.
Para determinação da atividade enzimática a partir valores de absorvância (DO)
medidos em equipamento destituído deste programa, obteve-se os valores de velocidade
inicial a partir da média dos valores máximos e constantes obtidos na derivação da
absorvância em função do tempo na parte linear da curva.
A atividade enzimática da peroxidase foi expressa referente a 1,0 mL da amostra em
avaliação como EA POD = dAbs.min-1.mL-1 (atividade enzimática da peroxidase por minuto e
por mL de água de coco). Para procedimentos realizados objetivando obter a atividade
residual das enzimas após algum tipo de processamento, a medida foi realizada no início e no
final do experimento. Para expressar a alteração, optou-se pelo cálculo do resultado em
percentual de atividade residual, onde:
Material e Métodos
44
%EA POD = EAfinal . EAinicial -1. 100
Sendo:
%EA: Percentual da atividade residual da peroxidase
EAinicial: valor de atividade enzimática obtido na avaliação da solução usada antes de
qualquer tratamento;
EAfinal: valor obtido imediatamente após qualquer tipo de tratamento utilizado sobre a
solução da enzima.
3.4. MEDIDA DA ATIVIDADE DA POLIFENOLOXIDASE – PPO
A atividade da polifenoloxidase foi obtida medindo a oxidação de catecol 100 mM em
MES 50 mM (pH 6,5) à temperatura ambiente, segundo procedimento indicado por Weemaes
e colaboradores (WEEMAES et al., 1998). As absorvâncias foram registradas a 390 nm em
espectrofotômetro Perkin Elmer UV/VIS Lambda 20 (The Perkin-Elmer Corporation,
Norwalk, USA) após agitação muito rápida da mistura obtida pela adição da solução de
catecol à água de coco, empregando uma mistura de catecol e tampão como branco.
A medida foi realizada na parte linear inicial da curva, usando regressão linear. Para
isto foi utilizado o programa de Análise Avançada de Cinética que faz parte do módulo
software UV KingLab. Para a maioria das amostras foi empregado o registro dos primeiros
dois minutos de medição.
Os resultados da medida de atividade residual da polifenoloxidase foram expressos
como atividade residual para 1,0 mL da amostra em avaliação: EA PPO = (dAbs.min-1.mL-1)
ou como atividade relativa (%); para isto a atividade foi medida no início e no final de um
processo e expressa considerando o valor inicial igual a 100%.
Material e Métodos
45
3.5. CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ÁGUA DE COCO (AC)
3.5.1. Amostras usadas para concentração por ultrafiltração
e purificação.
Para cada grupo de técnicas e/ou procedimento foram utilizados frutos verdes (Cocos
nucifera) em estágio de maturação indicado para o consumo da água (entre 8 e 10 meses).
As análises para identificação e caracterização da enzima peroxidase foram realizadas
usando a mistura do conteúdo de 10 frutos adquiridos no mercado local. Após higienização,
empregando detergente tipo doméstico, o líquido foi extraído por sucção sem contato com a
parte externa do coco. Este procedimento foi realizado depois da retirada da fibra externa e
cuidadosa raspagem na camada mais interna da casca (já em contato com o endosperma).
Neste ponto, a abertura do fruto foi realizada com a perfuração da camada branca do
endosperma utilizando o próprio material empregado para sucção (ponteira descartável)
encaixada em tubo de látex acoplado a frasco kitazato e bomba de vácuo. Todo conteúdo foi
filtrado em filtro de microfibras (Whatman GF/A) e/ou centrifugada a 10.000g, separado em
pequenas alíquotas e congelado a -20ºC. Para o uso, as amostras foram descongeladas à
temperatura ambiente no dia do procedimento.
3.5.1.1. Ultrafiltração de pequenos volumes
Para cada amostra final obtida (água de coco ultrafiltrada - UF), foram utilizados entre
1.000 a 1.500 mL da água de coco obtida por sucção sem contato com a casca. Porções de 100
mL de água de coco foram sendo descongeladas (à temperatura ambiente) imediatamente
antes do uso. A concentração foi realizada em unidades de ultrafiltração Amicon com
membrana Millipore de polietersulfona PM10 com peso molecular de corte (cut off) de 10
kDa. Foi utilizado um aparato com capacidade de 400 mL com agitação e pressão de
Material e Métodos
46
Nitrogênio de 3,5 bar. Foram necessários entre 2 a 3 dias de concentração, realizada em
câmara refrigerada entre 4 e 8ºC. Em todos os procedimentos, a avaliação do líquido efluente
resultou negativa para atividade da POD.
A suspensão retida foi filtrada em membrana 0,45µm (HT Tuffryn Membrane) e a
solução límpida obtida foi mantida a -20ºC e descongelada para as etapas seguintes. Este
procedimento foi empregado para concentração das amostras utilizadas na purificação por
filtração em gel e troca iônica e determinação do perfil eletroforético.
3.5.1.2. Ultrafiltração de grandes volumes
Grandes quantidades de água de coco fresca foram concentradas em duas fases.
Inicialmente foi utilizado o módulo UF/OR para ultrafiltração e osmose reversa (modelo
1420, fabricante DDS/Brasil) com membrana GR 60pp para 25 kDa e 0,72 m2 de área de
membrana. O equipamento foi operado a baixa temperatura (12ºC) obtida por banho
refrigerado e pressão inicial de 3,5 bar, que chegou a 9,0 bar no final do processo. Na
seqüência, utilizou-se a unidade Amicon para a obtenção de amostras mais concentradas.
A limpeza do módulo UF/OR após e antes da concentração foi efetuada com NaOH a
1% com posterior passagem intensa de água, segundo procedimento interno da Embrapa,
onde foi realizada esta etapa.
3.5.2. Cromatografia de filtração em gel
Na cromatografia de filtração em gel, as moléculas em solução são separadas em
função de seus pesos moleculares, que ocorre durante a passagem desta solução por uma
coluna com o meio cromatográfico que é uma matriz de gel. A escolha de um gel e de um
tampão eluente compatíveis às características do composto a ser fracionado leva à difusão
Material e Métodos
47
diferencial das proteínas em ordem de PM decrescente, que podem ser recolhidas em
alíquotas contendo as substâncias fracionadas (PHARMACIA BIOTECH, 6ª.ed.).
Foi utilizada coluna de vidro LK 16 Pharmacia (1,6 x 90 cm) com adaptadores de
fluxo na parte superior e inferior. O fluxo foi controlado por bomba peristáltica colocada antes
da coluna. A coluna usada foi empacotada com a resina Sephadex G-75 (81,5 cm) equilibrada
com o mesmo tampão utilizado para a eluição (Tris-HCl 25 mM com NaCl 50 mM, pH 8,0).
A corrida foi monitorada avaliando a concentração de proteínas no efluente através da medida
da absorvância a 280 nm (Pharmacia LKB – Unicord SII). Frações de 2,0 a 4,0 mL foram
automaticamente recolhidas (Pharmacia-LKB 2211-Superack) e avaliadas para atividade da
POD e PPO.
Para o cálculo do peso molecular da peroxidase foi utilizada uma curva de calibração,
construída empregando as proteínas albumina, anidrase carbônica e citocromo c do Kit Sigma
de Padrões de Peso Molecular (12.000 a 66.000). As proteínas foram preparadas na
concentração de 2 mg/mL em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 + 0,1 M KCl, segundo
procedimento descrito pelo fabricante (Sigma Technical Bulletin, 1987).
O cálculo do peso molecular da proteína desconhecida foi obtido comparando-se a
razão entre Ve/Vo da proteína em questão com o valor obtido na relação das proteínas padrões
com PM conhecido (Ve é o volume de eluição e Vo é o Volume morto). O cálculo do volume
morto da coluna foi baseado no volume requerido de efluente para a eluição do azul de
dextrano (PM aprox. 2.000.000).
Esta técnica também foi empregada como etapa intermediária na purificação da POD.
Uma única fração com atividade para a enzima (identificadas pelo teste com guaiacol e H2O2)
foi obtida pela eluição de cada amostra de água de coco concentrada (UF), sendo detectada,
normalmente, entre os tubos 18 a 22. O conteúdo dos tubos 19 a 21 (central) foi misturado e o
material foi dialisado em membrana de celulose (Sigma PM-12.000) durante 24 h contra duas
Material e Métodos
48
vezes 2,0 L de tampão MES 10 mM (pH 6,0) a 4ºC. O mesmo procedimento foi realizado, em
separado, para a parte inicial (tubo 18) e parte final (tubo 22). Estas amostras foram
concentradas através de secagem dentro do próprio saco de diálise em câmara fria a 4ºC com
circulação de ar durante 48 a 72 horas e posteriormente utilizadas.
3.5.3. Cromatografia de troca iônica por perfusão
A cromatografia por troca aniônica é considerada uma das metodologias com
resultados bastante satisfatórios para a separação da enzima peroxidase, já que as diferentes
isoformas da peroxidase aparecem nos vegetais geralmente nas formas catiônica e/ou aniônica
(MCLELLAN e ROBINSON, 1981).
A separação de diferentes compostos através da cromatografia de troca iônica envolve
a adsorção dos componentes da amostra por grupos carregados com cargas contrárias e que se
encontram covalentemente ligados a um suporte sólido. A separação ocorre em conseqüência
da eluição por fracionamento usando um tampão aquoso de maior força iônica que os grupos
adsorvidos. A diferença de afinidade ao eletrólito empregado determina a força de atração dos
componentes protéicos pela matriz que serão, consequentemente, eluídos em diferentes
tempos, podendo ser recolhidos em diferentes frações (MOORE e STEIN, 1951).
Para a separação das isoformas da POD foi empregada coluna POROS® 20 HQ
fortemente aniônica, indicada para separação rápida de peptídeos e proteínas, conectada ao
sistema BioCAD/SPRINT Perfusion Chromatography. Para purificação foi aplicado 1,0 mL
de amostras semi-purificadas, previamente obtidas por cromatografia de filtração em gel. A
coluna foi eluída com tampão MES 25 mM (pH 6,0) com uma velocidade de eluição de 5,0
mL/min em coluna com 1,66 mL de volume de coluna (VC).
Para a eluição das proteínas foi utilizado um gradiente linear de duas etapas: 1ª etapa:
40 VC de tampão em gradiente de NaCl entre 0 e 0,15 M; 2ª etapa: 30 VC de tampão em
Material e Métodos
49
concentração de NaCl entre 0,15 e 1,0 M. Para eluição total da amostra foi utilizado uma
etapa final de 20 VC com tampão MES com NaCl 1 M.
3.6. PERFIL ELETROFORÉTICO DA ÁGUA DE COCO E ESTIMATIVA DO PESO
MOLECULAR DA POD POR SDS-PAGE
A eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose permite a separação das proteínas
em função de suas características como polieletrólitos. O dodecilsulfato de sódio (SDS) é um
detergente aniônico usado para dissolver proteínas e outros compostos apolares na água.
Quando este detergente é adicionado em uma razão maior do que 2,0 g/g de proteína, todos os
polipeptídios em solução serão desnaturados, formando complexos proteína-SDS
proporcionais ao tamanho do polipeptídio e que possuem mobilidade no gel proporcional ao
tamanho. Desta forma, é possível relacionar o peso molecular com a mobilidade destes
complexos.
As amostras de água de coco concentrada (UF) e as frações obtidas por sua eluição em
cromatografia de filtração em gel e em troca iônica foram concentradas e dialisadas em
membrana de celulose 10 mm (Sigma 250-7U) capaz de reter proteínas com peso molecular
superior a 12.000 usando 2,0 mL da amostra contra 2,0 L de tampão fosfato 50 mM pH 5,5
em agitação e mantido sob refrigeração durante uma noite.
As diferentes amostras obtidas foram avaliadas conforme procedimento descrito por
Laemmli (LAEMMLI, 1970). Para preparação do gel de separação foi utilizado tampão Tris-
HCl 75 mM, (pH 8,8) com 0,2% de SDS e 10% de uréia, 12% de poliacrilamida.e no preparo
de gel de concentração foi usado 3% de poliacrilamida com tampão pH 6,8 (WEBER e
OSBORN, 1969). Para tampão de eluição, foi usado Tris-HCl 25 mM e glicina 192 mM
contendo 0,1% de SDS (pH 8,3).
Material e Métodos
50
Para preparo das amostras desnaturadas usadas para cálculo de PM, cada uma delas foi
adicionada de tampão de amostra Tris-HCl 125 mM (pH 6,8) com 0,5% de SDS na proporção
de 1:1 e 10% de mercaptoetanol (ME) e colocadas em banho fervente por 2 a 3 minutos. Para
cada gel foi utilizado também um conjunto de proteínas padrão Sigma Dalton Mark VII-L
para eletroforese em gel de SDS, faixa de PM: 14.200-60.000 e padrão para peroxidase: HRP
tipo VI-A 0,5 mg/mL, para ambos empregando uma relação de 1:2 para o tampão de amostra.
Para reconhecer as bandas com atividade para POD, as mesmas amostras foram preparadas
em condições não desnaturantes, adicionadas de tampão de amostra sem ME e a mistura não
foi fervida. Foi aplicado cerca de 20µL da mistura amostra + tampão.
Os experimentos foram conduzidos em sistema BIO-RAD (Min-Protean II) de
eletroforese vertical empregando corrente entre 60 e 80 mA, evitando ultrapassar 500 V e
sempre a temperatura ambiente (cerca de 20ºC). Após a corrida, os géis contendo as amostras
não-desnaturadas foram imersos por 30 minutos em solução de tampão MES 25 mM (pH 5,8),
contendo Triton X-100 0,1% (AKINS et al., 1992). Em seguida o gel foi lavado somente com
o tampão por mais 2 x 20 minutos e imediatamente corado para avaliação da atividade da
POD. Este procedimento é obtido pela imersão do gel em 50 mL de tampão MES (pH 5,5)
com guaiacol 20 mM e peróxido de hidrogênio 1,0 mM.
Para o cálculo do peso molecular cada amostra preparada de modo desnaturante e não
desnaturante foi aplicada lado a lado em um gel e, em paralelo, foi preparado outro gel
contendo somente as amostras desnaturadas. Após a coleta dos dados relativos à atividade da
POD usando o programa Gene Tools do sistema Gene Genius Gel Documentation (SynGene,
Synoptics Ltd, UK), os géis contendo as amostras não desnaturadas foram colocados em
solução fixadora durante 12 h (12% TCA v/v em água) e após corado com solução de azul de
Coomassie G-250 0,25% dissolvido em mistura de metano/ácido acético/ água (4,93:1:4,93),
durante 2,0 h ou mais (NEUHOFF et al., 1988). A descoloração foi realizada usando uma
Material e Métodos
51
mistura de metanol/ácido acético glacial/água (50 ml:75 ml:875 ml) até que não ocorresse
mais descoramento das bandas.
O peso molecular aparente da peroxidase foi estimado usando a curva RF versus PM
obtida para os padrões Sigma 14.200 – 66.000, descrito na Tabela 3 e calculados pelo
programa de análise Gene Tools, usando a relação entre cada RF e a distância do topo e banda
final do corante.
Tabela 3: Padrões Sigma MW 14.000 – 60.000
Proteína Peso Molecular
Albumina de soro bovino 66.000
Ovalbumina 45.000
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
36.000
Anidrase carbônica 29.000
Trypsinogênio tratado com PMSF 24.000
Inibidor de tripsina 20.000
α-lactoglobulina 14.200
3.7. ESTIMATIVA DOS PONTOS ISOELÉTRICOS DAS ISOENZIMAS DA POD
As proteínas possuem tanto cargas positivas como negativas, sendo que sua carga
líquida é dependente do pH. O pH que resulta em uma carga líquida igual a zero, é chamado
de ponto isoelétrico ou pI. Neste ponto, as proteínas são mais facilmente cristalizáveis e
menos estáveis e normalmente insolúveis. As isoenzimas da peroxidase normalmente
possuem pontos isoelétricos bastante diferentes, entre 3,0 e 9,0, possibilitando deste modo, a
separação por focalização isoelétrica (ROBINSON, 1991).
Material e Métodos
52
Uma propriedade importante das proteínas é que muitas existem como isômeros de
carga, já que possuem o mesmo peso molecular. Isto ocorre normalmente em função de
mutações que afetam os resíduos carregados, resultando em isômeros com diferentes cargas e,
portanto, diferentes pI. Em glicoproteínas, os carboidratos que fazem parte da estrutura
também influenciam a carga final da proteína. (VOET e VOET, 2004).
Na técnica de focalização isoelétrica (IEF), as proteínas sofrem eletroforese num gel
contendo um gradiente de pH. Este gradiente é gerado por compostos conhecidos como
anfólitos, que são uma mistura de tampões anfóteros com diferentes valores de pI. Durante a
eletroforese, eles migram de acordo com sua carga e formam um gradiente de pH.
Para realizar uma análise de focalização isoelétrica, as proteínas são aplicadas sobre
um gel (poliacrilamida ou agarose) onde então é aplicada uma corrente elétrica. As proteínas
na mistura, deverão então migrar de acordo com a densidade de cargas até que encontrem a
parte do gel com pH correspondente ao seu pI. Neste ponto a carga líquida é zero e a
migração deixa de ocorrer, a focalização ocorre em função do aumento da definição que
ocorre nesta zona de maior estabilidade onde a proteína é isoelétrica (WESTERMEIER,
2001).
A focalização isoelétrica foi realizada utilizando-se placas em agarose prontas para o
uso, pH 3-10 (FMC, Rockland ME, EUA) em célula de eletroforese horizontal Multiphor
(LKB), usando resfriamento com água (aprox. 12-15ºC). Foram utilizados 5,0 a 8,0 µL de
amostras e padrões (Sigma IEF mix-3,6-9,3 – Tabela 4) em cada poço, que penetraram no gel
pela aplicação de 1W durante 10 min. Em seguida as amostras foram focalizadas por 30 a 40
minutos com 25 W de potência, não excedendo 1500 V.
Para solução de eletrólito anódico e catódico foram utilizadas solução de ácido acético
0,5 M pH 2,6 e solução de NaOH 1,0 M pH 13, respectivamente (em
http://www.fst.rdg.ac.uk/courses/fs460/prac3/prac3.htm).
Material e Métodos
53
Após focalização das amostras os géis foram corados pela mistura guaiacol + H2O2,
para visualização das bandas com atividade para a POD por poucos minutos (somente o
suficiente para o aparecimento da cor marron-avermelhada característica) e imediatamente
retirados e avaliados pelo programa Gene Genius. Estes mesmos géis foram
subsequentemente fixados por uma solução de TCA 12% + ácido salicílico 3,6% + metanol
36% v/v final e corados com azul de Coomassie 2%. Após esta coloração foram feitos novas
avaliações usando o mesmo programa.
Os pontos isoelétricos das isoperoxidases foram calculados para as bandas que
apresentaram atividade enzimática, mas usando as medidas de RF obtidos na placa após
coloração com azul de Coomassie. Para o cálculo foram utilizados os valores de RF
calculados para os padrões apresentados na Tabela 4, a seguir.
Tabela 4: Padrões Sigma IEF – MIX 3,6-9,3.
FONTE pI aproximado
Amiloglicosidase (Aspergillus niger) 3,6
Inibidor da Tripsina (soja) 4,6
β-Lactoglobulina A (leite bovino) 5,1
Anidrase carbônica II (eritrócitos bovinos) 5,9
Anidrase carbônica I (eritrócitos humanos) 6,6
Mioglobina (coração de cavalo) 6,8 – 7,2
Lectina (Lens culinaris) 8,2-8,6-8,8
Tripsinogênio (pâncreas bovino) 9,3
Material e Métodos
54
3.8. PROCESSAMENTO POR ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA – APH
3.8.1. Equipamentos usados para pressurização
3.8.1.1. Equipamento de APH para avaliações espectrofotométricas durante o
processamento.
O equipamento utilizado para a avaliação da evolução do efeito da pressurização sobre
a atividade enzimática da peroxidase da água de coco após adição de seu substrato, peróxido
de hidrogênio e guaiacol, foi descrito por Paladini e Weber em 1981 (Figura 7). O
equipamento é constituído por duas partes: uma bomba de aço temperado Vasomax que
apresenta três janelas ópticas de safira que permitem a realização de medidas espectroscópicas
durante a operação de pressurização; um gerador manual acoplado a esta bomba, composto
por um pistão, duas válvulas, um reservatório de etanol (que recebe a amostra), um
manômetro (até 50.000 PSI = 310 MPa) e um tubo de conexão. Este tipo de equipamento
permite a obtenção de até 300 MPa. O etanol foi utilizado como líquido para compressão por
possuir índice de refração igual ao do quartzo, o que permite a realização de medidas
espectroscópicas (PALADINI e WEBER, 1981).
Material e Métodos
55
Figura 7: Sistema de APH laboratorial para leitura óptica. A figura mostra o aparato que é constituído por duas partes: (A) Uma bomba de aço temperado que apresenta três janelas ópticas de quartzo, que permitem a realização de medidas espectroscópicas durante a operação de pressurização e um gerador manual acoplado a esta bomba, composto por: (B) um pistão com duas válvulas; (C) um reservatório de etanol (que recebe a amostra) e (D) um manômetro (até 50.000 PSI) com tubo de conexão.
3.8.1.2. Equipamento de APH para processamento de alimentos em laboratório
Foi utilizado o equipamento MINI FOOD LAB PLUNGER PRESS Job No. 5344
(Stansted Fluid Power Ltd., Essex - England) com câmara de pressurização medindo 40 mm x
300 mm e com capacidade para pressurização até 900 MPa. O líquido usado para
pressurização (mistura de óleo de mamona 20% em etanol) foi mantido aquecido usando
equipamento de banho termostatizado externo conectado a termopares internos.
A Figura 8 mostra um desenho esquemático do equipamento utilizado para o
processamento das amostras e que é semelhante aos equipamentos industriais utilizados para
o processo descontínuo de APH. Neste caso, para cada processamento, o equipamento deve
Material e Métodos
56
ser aberto, carregado e após o processo, descarregado. Este equipamento (1), altamente
resistente, contém o líquido interno para pressurização do produto (10), o que ocorre na
câmara de pressurização (5). Esta câmara possui uma tampa também altamente resistente à
pressão e um pistão que é operado por pressão hidráulica proveniente de equipamento externo
(2). O líquido de pressurização é aquecido externamente (4), circulando através de jaquetas
também externas (9) e a temperatura de processo (8) é monitorada por termopares (7) e
mantida com o uso de isolamento térmico (6) externo ao equipamento de pressão. O nível do
líquido de pressurização foi mantido constante sendo abastecido pelo tanque de líquido de
pressurização (3).
Figura 8: Aparelho de APH utilizado no processamento da água de coco verde. 1 – Equipamento de alta pressão; 2 – Bomba de alta pressão; 3 – Recipiente para líquido para câmara de pressão; 4 – Recipiente para líquido de aquecimento do equipamento de alta pressão; 5 – Câmara de pressurização; 6 – Isolamento térmico; 7 – Termopar; 8 – Comandos para controle da pressão e tempo de processo; 9 – Circulação para manutenção do aquecimento do equipamento; 10 – Produto (amostra) a pressurizar.
Material e Métodos
57
3.8.2. Condições do processamento da água de coco por APH
3.8.2.1. Processamento I – Utilização de garrafas de quartzo com tampas flexíveis
3.8.2.1.1. Preparo da amostra
Foram necessárias adaptações do método utilizado (descrito no item 3.3) visando obter
valores menores e lineares para a velocidade inicial da POD durante toda a pressurização.
Para isto foram utilizadas quantidades sub-ótimas de peróxido de hidrogênio (0,2 mM)
guaiacol (15 mM) e 50 ou 100 µL de água de coco. O tempo de preparo das amostras e o
início e fim da pressurização foram iguais ou semelhantes para todas as amostras.
A mistura (água de coco + H2O2 + guaiacol em volume final de 1,0 mL) foi
acondicionada em garrafas de quartzo, com capacidade de aproximadamente 1,0 mL,
especialmente desenhadas para pressurização e para leitura espectrofotométrica. Estas
garrafas foram fechadas com tampas de polietileno com altura superior a 1,0 cm, suficiente
para permitir a pressurização do conteúdo da garrafa e acomodadas na bomba de
pressurização (Figura 7 (A)).
3.8.2.1.2. Condições de processo
Os parâmetros do processo foram adequados à capacidade do equipamento. Foram
utilizadas pressões entre 100 MPa e 300 MPa nas temperaturas de 10ºC, 25ºC e 40ºC.
A temperatura da bomba de pressurização foi mantida por circulação de água fria ou
aquecida obtida empregando banho termostatizado e o monitoramento foi realizado por
termopares instalados na parte interna da câmara de pressurização. Todo o conjunto foi
mantido em posição adequada para a leitura da absorvância, realizada durante toda a
pressurização em espectrofotômetro GBC modelo Cintra 20 e os dados foram registrados pelo
programa GBC spectral.
Material e Métodos
58
3.8.2.2. Processamento II – Utilização de embalagens flexíveis
3.8.2.2.1. Preparo da amostra
A água de coco utilizada foi obtida após a mistura do conteúdo de 10 frutos, de onde o
líquido foi retirado por sucção sem contato com a parte externa do fruto. Alíquotas da mistura
foram congeladas a -20ºC e, a cada dia de processo, uma parte foi descongelada e usada para
preparar quatro amostras contendo cada uma 1,0 mL de AC utilizadas em cada condição de
processo. As amostras foram acondicionadas em sacos preparados com filme flexível
termosoldável CRYOVAC® tipo BB4L e pressurizadas em equipamento próprio para
processamento de alimentos por alta pressão (Figura 8), pré-aquecido durante 12 horas na
temperatura de processo.
3.8.2.2.2. Condições de processo
As condições de processo foram determinadas por desenho experimental pré-
estabelecido, segundo Rosenthal (comunicação pessoal), descrito na Tabela 5. Para o
processamento por APH da água de coco foram empregados três níveis para os parâmetros
tempo (15, 30 e 45 min) e temperatura (20, 40 e 60ºC) conjugados com cinco diferentes níveis
de pressão (0,1; 100; 300; 500 e 600 MPa).
Todas as combinações foram avaliadas para T(0) – realizada imediatamente após o
término da pressurização, T(24 h) e T(7 d) - com as amostras processadas e mantidas sob
refrigeração (4ºC) durante 24 horas e 7 dias respectivamente. Este procedimento foi idêntico
para POD e PPO.
As amostras, utilizadas para avaliação do efeito de armazenamento pós-processo sobre
as enzimas, foram mantidas sob refrigeração durante o tempo referido e antes de cada
Material e Métodos
59
avaliação da atividade enzimática, foram mantidas a temperatura ambiente por
aproximadamente uma hora.
Tabela 5: Níveis de combinação de variáveis independentes e valores resultantes para atividade enzimática nas variáveis dependentes, em desenho experimental com 23 procedimentos para cada combinação (126 corridas no total).
Experimento Temperatura (°C)
Pressão (MPa)
Tempo (min)
Atividade POD e PPO T(0)
Atividade POD e PPO
T(24 h)
Atividade POD e PPO
T(7 d)
1 60 0.1 0 S* S S
2 60 0.1 30 S S S
3 60 100 15 S S S
4 60 300 15 S S S
5 60 300 30 S S S
6 60 300 45 S S S
7 60 500 45 S S S
8 60 600 30 S S S
9 40 0.1 0 S S S
10 40 0.1 30 S S S
11 40 100 15 S S S
12 40 100 45 S S S
13 40 300 15 S S S
14 40 300 45 S S S
15 40 500 15 S S S
16 40 600 30 S S S
17 20 0.1 0 S S N**
18 20 0.1 30 S S N
19 20 100 45 S S N
20 20 300 15 S S N
21 20 300 45 S S N
22 20 500 15 S S N
23 20 600 30 S S N
S*: experimento realizado; N**: experimento não realizado (amostras deterioradas)
Material e Métodos
60
3.8.2.3. Processamento III – Utilização de embalagens rígidas
3.8.2.3.1. Preparo da amostra
A água de coco utilizada foi retirada de 10 frutos e alíquotas da mistura foram
congeladas a -20ºC; a cada dia de processo uma parte foi descongelada. A solução da enzima
peroxidase de raiz forte – HRP (tipo VI-A Sigma) em concentração de 0,01µg.mL-1 foi
preparada diariamente diluindo em tampão MES 50 mM (pH 5,8-6,0) uma solução estoque
contendo 0,50 µg.mL-1 de HRP mantida congelada. A adição de 0,003% Tween 80 foi
realizada imediatamente após o descongelamento da água de coco e durante a diluição da
HRP em tampão. Para cada processamento foram preparadas três embalagens contendo cada
uma 3,0 mL de amostra.
Foram utilizadas embalagens de Teflon® rígido (Figura 9) com capacidade de 5 mL,
que após serem vedadas com tampas possuindo anéis de vedação, foram colocadas em sacos
plásticos termosoldáveis contendo no seu interior água pré-aquecida. Durante o fechamento
dos sacos plásticos foi evitada a inclusão de bolhas de ar na água.
Figura 9: Embalagens em Teflon rígido empregadas para processamento da água de coco e da solução de HRP. 1 – Amostra pronta para processo, acondicionada nas embalagens de teflon e contida em sacos termosoldáveis repletos de água à temperatura de processo; 2 e 3 – Embalagens tampadas; 4 – Detalhe dos anéis de vedação da tampa.
Material e Métodos
61
Todas as avaliações de atividade enzimática foram realizadas em espectrofotômetro de
múltiplos canais à temperatura ambiente.
3.8.2.3.2. Condições de processo
Os parâmetros de processo utilizados (tempo, temperatura e intensidade de
pressurização) foram planejados em conseqüência dos resultados previamente obtidos
(Processamentos I e II). Foram empregados três níveis para temperatura (20, 40 e 60ºC) e
tempo (30, 60 e 90 min) conjugados com quatro níveis de pressão (0,1; 300; 500 e 800 MPa),
resultando em 23 diferentes condições de processo, todos realizados em duplicata (56
avaliações da atividade enzimática). Cada uma das condições de processo foi avaliada em
T(0): medida da atividade enzimática residual realizada imediatamente após o término da
pressurização (temperatura das amostras ao final da despressurização aproximadamente 20ºC)
e em T(24 h): a mesma medida, realizada nas amostras embaladas, processadas e mantidas
sob refrigeração (4ºC) durante 24 horas. Este procedimento foi idêntico para cada uma das
enzimas.
Os detalhes de cada combinação estão descritos na Tabela 6, que lista as 192
avaliações enzimáticas propostas. Igual procedimento foi realizado para a avaliação da
peroxidase de raiz forte (HRP): %EA HRP T(0) - %EA HRP (T24 h), resultando em 56
valores para atividade residual.
Para cada tratamento foram utilizados dois controles: 1º Controle: (T amb.) - atividade
residual da enzima em amostra embalada e mantida à temperatura ambiente (~20ºC) durante o
mesmo tempo usado para o processo e 2º Controle: (0,1 MPa) – em amostra embalada e
mantida em banho termostatizado na mesma temperatura e tempo de processo, sem pressão
(= P ambiente: 0,1 MPa).
Material e Métodos
62
Tabela 6: Níveis de combinação de variáveis independentes e valores resultantes para atividade enzimática na água de coco das variáveis dependentes: %EA PODAC T(0) - %EA PODAC (T24 h) - %EA PPOAC (T0) e %EA PPOAC (T24 h), em desenho experimental com 23 procedimentos (em duplicata) para cada combinação (192 corridas, já excluídas as avaliações não realizadas em T(24 h)).
Corrida Temperatura Tempo Pressão %EA POD T(0)
%EA POD (24 h)*
%EA PPO T(0)
%EA PPO T(24 h)*
1 20 30 0.1(a) S** S S S
2 40 30 0.1(b) S S S S
3 40 30 300 S S S S
4 40 30 500 S S S S
5 40 30 800 S S S S
6 20 30 0.1(a) S S S S
7 40 30 0.1(b) S S S S
8 40 30 300 S S S S
9 40 30 500 S S S S
10 40 30 800 S S S S
11 20 60 0.1(a) S N*** S N***
12 40 60 0.1(b) S N S N
13 40 60 300 S N S N
14 40 60 500 S N S N
15 20 60 0.1(a) S N S N
16 40 60 0.1(b) S N S N
17 40 60 300 S N S N
18 40 60 500 S N S N
19 20 90 0.1(a) S S S S
20 40 90 0.1(b) S S S S
21 40 90 300 S S S S
22 40 90 500 S S S S
23 40 90 800 S S S S
24 20 90 0.1(a) S S S S
25 40 90 0.1(b) S S S S
26 40 90 300 S S S S
27 40 90 500 S S S S
28 40 90 800 S S S S
29 20 30 0.1(a) S S S S
30 60 30 0.1(b) S S S S
31 60 30 300 S S S S
Material e Métodos
63
Corrida Temperatura Tempo Pressão %EA POD T(0)
%EA POD (24 h)*
%EA PPO T(0)
%EA PPO T(24 h)*
32 60 30 500 S S S S
33 60 30 800 S S S S
34 20 30 0.1(a) S S S S
35 60 30 0.1(b) S S S S
36 60 30 300 S S S S
37 60 30 500 S S S S
38 60 30 800 S S S S
39 20 60 0.1(a) S N S N
40 60 60 0.1(b) S N S N
41 60 60 300 S N S N
42 60 60 500 S N S N
43 20 60 0.1(a) S N S N
44 60 60 0.1(b) S N S N
45 60 60 300 S N S N
46 60 60 500 S N S N
47 20 90 0.1(a) S S S S
48 60 90 0.1(b) S S S S
49 60 90 300 S S S S
50 60 90 500 S S S S
51 60 90 800 S S S S
52 20 90 0.1(a) S S S S
53 60 90 0.1(b) S S S S
54 60 90 300 S S S S
55 60 90 500 S S S S
56 60 90 800 S S S S
* As amostras foram mantidas em embalagens fechadas sob refrigeração até o momento da medida de atividade
**S = avaliação realizada
***N = avaliação não realizada
(a)1o Controle: controle do processo, amostra mantida a temperatura ambiente durante o mesmo tempo empregado para o processamento;
(b) 2o Controle: controle do tratamento por APH, amostra mantida a temperatura de processo (banho termostatizado) durante o mesmo tempo empregado para o processamento.
Material e Métodos
64
3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados de atividade residual enzimática (%EA POD e %EA PPO) obtidos pelo
processamento por APH da água de coco nas condições citadas para os processos II e III
(itens 3.8.2.2. e 3.8.2.3, respectivamente) foram avaliados através da Metodologia de
Superfície de Resposta utilizando recursos do programa STATISTICA (Data Analysis
Software System – versão 6, StatSoft Inc., 2001) ou do programa Statistical Analitical System
(SAS). A expressão dos resultados em modelos e equações ficou restrita aos grupos de
processamento onde foram obtidos valores confiáveis e significativos.
A metodologia de superfície de resposta envolve a modelagem da relação entre:
• Variáveis explanatórias (independentes), que são normalmente fatores
experimentais, genericamente chamados de X1, X2, X3...
• Variáveis de resposta (dependentes), que são os valores observados em
conseqüência da do uso das variáveis independentes, genericamente chamados Y1, Y2,
Y3...
O estudo dos resultados de um trabalho experimental através do uso da metodologia
de superfície de resposta permite a otimização de processos, ou seja, escolher os níveis X1,
X2... que forneçam os níveis desejados de Y1, Y2... Permite também um maior entendimento
do processo utilizado, o que torna possível atingir um melhor controle deste processo.
Através desta metodologia é possível observar o efeito do emprego simultâneo de
diversos fatores experimentais (variáveis de processo) e estudar as interações entre eles e,
caso isto não ocorra, é possível reconhecer este fato e, mesmo assim, estudar individualmente
cada fator utilizado.
A modelagem dos efeitos de vários fatores em uma resposta envolve o ajuste a um
modelo matemático que passa a descrever uma “Superfície de Resposta”. Se o formato do
Material e Métodos
65
modelo não é conhecido, os modelos polinomiais de segunda ordem possuem uma fórmula
geral bastante flexível.
Modelo polinomial de segunda ordem com variáveis genéricas:
Y = β0 + β1.X1 + β2.X2 + β3.X3 + β11.X12 + β22
2.X22 + β33
2.X32 + β12.X1.X2 + β13. X1.X3 + β23.X2.X3
Onde:
β0 = coeficiente de intersecção β = coeficiente de regressão que descreve o efeito de cada variável na condição
específica descrita β1, β2 e β3 - efeitos lineares β11, β22 e β33 - efeitos quadráticos β12, β13 e β23 – interações entre os efeitos lineares e quadráticos Y = variável dependente X = variáveis independentes
A equação (ou modelo) final para cada dependente (%EA POD T(0); %EA POD T(24
h); %EA PPO T(0); %EA PPO T(0); %EA PPO T(24 h); %EA HRP T(0); %EA HRP T(24
h)) foi definida avaliando as variáveis independentes nas formas linear e quadrática e a
relação entre elas. O modelo final pode ser simplificado, o que pode ajudar na interpretação,
para isto interações e efeitos quadráticos que forem “não significativos” (p>0,05) podem ser
retirados. Se forem utilizadas muitas variáveis independentes é possível ajustar modelos de
superfície de resposta a cada uma, porem é necessário avaliar todos juntos no momento de
interpretar os resultados (GENTLE, 2002).
A obtenção de um modelo ajuda a interpretação da importância dos efeitos de cada
parâmetro empregado experimentalmente (variáveis independentes) sobre a atividade residual
de cada enzima (variáveis dependentes), além de possibilitar a obtenção de resultados
(resultados previstos ou calculados) que poderiam ser obtidos empregando parâmetros
diferentes daqueles usados (sempre dentro dos limites usados experimentalmente) (MYERS e
MONTGOMERY, 2002).
Material e Métodos
66
Para a simplificação das equações obtidas foram utilizadas informações de um
diagrama de Pareto, obtido para cada uma das variáveis dependentes. O diagrama de Pareto é
um gráfico de barras, obtido a partir da análise de variância, que ordena a freqüência das
ocorrências, da maior para a menor, permitindo identificar a importância de cada fator
(variáveis independentes = condições de processo). Sua maior utilidade é a de permitir uma
fácil visualização e identificação das causas mais significativas.
3.9.1. Análise dos resultados – Processo II
No processamento empregando embalagens flexíveis (Processo II, item 3.8.2.2.), a
variável de resposta Y (%EA POD e %EA PPO - percentual da atividade enzimática residual)
foi calculada em relação a três variáveis independentes: temperatura, pressão e tempo.
Temperatura e tempo foram avaliados em três níveis (baixo, médio e alto) e a pressão em
cinco níveis (0,1, 100, 300, 500, 600 MPa). O desenho completo resultou em 23 pontos
experimentais sem repetições, que foram avaliados nos momentos T(0), T(24 h) e T(7 d),
resultando em 126 corridas, descritas na Tabela 5.. As amostras processadas a 20ºC não foram
avaliadas após sete dias devido à deterioração do conteúdo.
Os resultados obtidos foram analisados empregando a análise de variância (ANOVA)
levando em consideração os valores significativos (p<0,05) calculados pelo programa
estatístico Statistical Analitical System (SAS).
3.9.2. Análise dos resultados – Processo III
Os resultados obtidos para o processamento da água de coco acondicionada em
embalagens de teflon e adicionada de 0,003% de Tween 80 (Processo III – item 3.8.2.3)
foram analisados pelo programa STATISTICA (Data Analysis Software System – versão 6,
Material e Métodos
67
StatSoft Inc., 2001) empregando o módulo de Desenho Experimental (DOE) do método de
Estatística Industrial & Six Sigma.
A análise dos dados foi realizada pelo Desenho de Superfície Não-Fatorial de
Composição Central que usou três blocos de variáveis independentes (tempo, temperatura e
pressão) para cada uma das variáveis dependentes (Y = %EA POD e %EA PPO).
Temperatura e tempo foram avaliados em três níveis (20 – 40 e 60ºC e 30 – 60 e 90ºC,
respectivamente) e a pressão em quatro níveis (0,1 – 300 – 500 e 800 MPa). O desenho
completo resultou em 23 pontos experimentais realizados em duplicata e que foram avaliados
nos tempos T(0) e T(24 h), resultando em 192 corridas descritas na Tabela 6.
3.10. CINÉTICA DE INATIVAÇÃO DA POD A 60ºC
Para a avaliação do efeito do uso do calor (60ºC) foi utilizada água de coco, obtida
pela mistura do conteúdo de 10 frutos, embalada e congelada e descongelada a temperatura
ambiente imediatamente antes do ensaio. A água de coco (3,0 mL) foi colocada em tubos
pirex (12x75 mm) que foram imediatamente imersos em banho termostatizado pré-aquecido a
60ºC. Para cada tempo de aquecimento foi retirado um tubo que foi rapidamente resfriado em
banho de gelo. Após a retirada da alíquota usada na avaliação da atividade residual (400 µL),
o tubo contendo o restante da água de coco foi mantido em banho de gelo por 3 horas. Após
este tempo, cada tubo foi retirado do gelo e mantido 20 minutos a temperatura ambiente e
uma alíquota de cada amostra foi novamente avaliada quanto à atividade residual da POD.
Resultados
68
4. RESULTADOS
O uso de um novo processo industrial como a APH implica necessariamente no estudo
das características da matéria prima a ser utilizada. No caso da água de coco (AC) ocorrem
grandes alterações no produto “in natura”, com rápida deterioração principalmente da cor e
do sabor; alterações que podem ocorrer também em produtos obtidos pelo processamento
térmico da água de coco (CAMPOS et al., 1996). Sob o ponto de vista bioquímico, este fato é
conseqüência da destruição e/ou modificação dos componentes naturais deste líquido e
principalmente da atividade residual de certas enzimas.
As enzimas apresentam perfis bastante específicos e característicos em função da fonte
onde estão sendo estudadas. As enzimas presentes na água de coco são pouco caracterizadas,
incluindo a peroxidase e a polifenoloxidase, consideradas as principais enzimas responsáveis
pela deterioração de alimentos processados. O estudo das características e do comportamento
destas enzimas deve ser aprofundado para que seja determinada a importância da atividade
residual de ambas nos produtos industriais obtidos a partir da água de coco.
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA ÁGUA DE COCO (AC)
A água de coco analisada foi obtida de uma mistura do conteúdo de vários frutos,
segundo procedimento descrito no item 3.5.1. Parte deste material foi avaliada imediatamente
após a abertura dos frutos, quando foram obtidos os resultados descritos na Tabela 7. O
restante da água de coco foi congelado em pequenas porções para serem descongeladas em
etapas posteriores.
Resultados
69
Tabela 7: Características da água de coco utilizada para concentração e purificação. Valores obtidos utilizando amostra fresca.
Característica Valor
Volume médio por fruto (mL) 420
pH 5,8
Atividade da peroxidase (dA.min-1).mL-1AC 0,85
Atividade da polifenoloxidase (dA.min-1).mL-1AC* 0,75
Proteína (mg.mL-1) 1,71
Sólidos solúveis (ºBrix)** 5,5
Concentração de POD*** µmoles(tetraguaiacol).mL-1. min-1 µmoles(tetraguaiacol).(mg proteína)-1. min-1
0,03195 0,0187
*AC: Água de coco ** ºBrix: Medida em refratômetro para avaliação da concentração de açúcares solúveis. *** Relativo ao tetraguaiacol formado (ε guaiacol = 26,6 cm-1.mM-1)
O volume médio foi obtido avaliando o conteúdo de cada fruto (entre 360 mL e 450
mL). As características da água de coco obtidas são próprias desta amostragem, podendo
variar consideravelmente em função das características agronômicas e das técnicas utilizadas
para o plantio da palmeira. A fase de maturação é outra característica importante na avaliação
da atividade das enzimas naturais do líquido (WOODROOF, 1979).
Os outros resultados foram obtidos na mistura final. O pH médio (5,8) foi semelhante
aos valores entre 4,7 e 6,4 observados por Campos e colaboradores (CAMPOS et al., 1996). A
concentração de proteínas foi acima do valor descrito por Magalhães e colaboradores, que
obteve como valor máximo 1,27 g.L-1 em frutos provenientes da região do Rio de Janeiro
(MAGALHÃES et al., 2005).
Resultados
70
As atividades residuais das enzimas PPO e POD foram semelhantes aos valores
obtidos nas avaliações subseqüentes usando as amostras congeladas/descongeladas
diariamente para cada novo procedimento. Os resultados mostram que o congelamento da
água de coco (-20ºC) manteve a atividade das enzimas estável durante mais de um ano. Na
literatura, o valor da atividade enzimática é geralmente reportado como percentual de
atividade residual, que avalia a atividade antes e depois de um procedimento e, desta forma,
não é facilmente comparável
4.2. CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA PEROXIDASE (EA)
4.2.1. Relação produto formado/concentração de enzima
A atividade da peroxidase foi utilizada constantemente como medida da quantidade de
enzima presente nas amostras de água de coco natural, ou como atividade residual após algum
tipo de processamento. A atividade residual da peroxidase também foi utilizada para avaliar
os diferentes métodos de concentração da água de coco ou as diferentes etapas de purificação
da enzima.
O gráfico na Figura 10A apresenta os valores de velocidade inicial (dAbs.min-1)
descritos como atividade da peroxidase (EA POD), obtidos a partir dos valores das medidas
de absorvância observadas na fase linear da curva de Absorvância (DO) versus tempo (Figura
10B). As amostras avaliadas correspondem a diferentes diluições da água de coco descrita na
Tabela 7. Os resultados em EA POD (dAbs.min-1) foram obtidos como descrito no item 3.3.
Os valores mostram ocorrer uma proporcionalidade na formação do produto corado
(tetraguaiacol – medido espectroscopicamente) e a quantidade de água de coco usada. O
aumento ou diminuição da velocidade medida em cada experimento realizado foi interpretado
Resultados
71
como aumento ou diminuição da quantidade de enzima ativa nas condições usadas:
absorvância em 470 nm, para uma concentração fixa de guaiacol (20 mM) em tampão MES
50 mM (pH 5,5) e H2O2 1,0 mM ou H2O2 5,0 mM em volume final de 1,0 mL.
Figura 10: Relação entre a concentração de água de coco e o valor calculado de atividade enzimática (EA) na mistura reativa. Em (A): valores de velocidade inicial gerados pela determinação do valor constante e máximo a partir da derivada dos valores da curva de absorvância obtida pela formação do tetraguaiacol em A470 nm, usando 20 mM de guaiacol e H2O2 . Círculos: H2O2 1,0 mM; Triângulos: H2O2 5,0 mM. Em (B) curvas originais de variação da absorvância usadas para cálculo dos valores registrados nos gráficos do quadro A.
O intervalo de tempo usado para cálculo da atividade da enzima peroxidase foi
diferente em cada curva, variando entre poucos segundos a vários minutos, como
conseqüência, principalmente, da variação da amplitude da fase de latência inicial. Na Figura
10B as setas indicam o intervalo utilizado para avaliações em duas curvas obtidas durante a
medida dos valores de absorvância (ou DO: densidade ótica) referentes à formação do
composto colorido (tetraguaiacol) observadas empregando diferentes concentrações de água
de coco. O intervalo utilizado foi determinado pelo programa UV KingLab ou obtido
conforme indicado no item 3.3. Neste gráfico pode ser observado ser maior a fase lag inicial
quanto menor a concentração de enzima (menor volume de água de coco) e,
consequentemente, maior o tempo de leitura necessário para avaliar a reação catalisada pela
Resultados
72
peroxidase. Para evitar possíveis falsos resultados, o registro da absorvância durante a medida
da atividade da peroxidase foi realizado empregando até 20 minutos para as amostras muito
diluídas.
Segundo McLellan e Robinson, as técnicas que avaliam o produto obtido pela catálise
da enzima peroxidase contida em material vegetal não respondem de forma linear
imediatamente após o início da reação, sendo este fato explicado pela presença de diferentes
isoenzimas no material não purificado (MCLELLAN e ROBINSON, 1987).
As medidas foram realizadas em pH 5,5 conforme método original (KAPLAN, 1955).
Para outros produtos de origem vegetal, o pH utilizado para avaliação da POD empregando
H2O2 e guaiacol é sempre de 5,5, com eventuais alterações para obtenção de condições
específicas, como a utilização de pH 6,0 para bananas (MACDONALD e SCHASCHKE,
2000).
4.2.2. Efeito da concentração do peróxido de hidrogênio na
cinética da peroxidase
A concentração de peróxido de hidrogênio empregada em todos os procedimentos de
medida da atividade da peroxidase foi determinada experimentalmente observando o efeito da
concentração do substrato na cinética da enzima.
A Figura 11A mostra os valores de velocidade inicial obtidos a partir da derivada das
medidas de absorvância em função do tempo de reação (dAbs.min-1) e expressa como
atividade enzimática (EA POD) para um volume total de 1,0 mL de água de coco. Pode ser
verificado que a concentração do composto corado (tetraguaiacol) formado pela oxidação do
guaiacol (20 mM) aumenta rapidamente com pequenos aumentos na concentração de H2O2
até cerca de 1,0 mM (Figura 11A e detalhada em B) e, a partir daí, a velocidade decresce
gradativamente, até resultar em inibição total a partir de 40-50 mM. Os valores entre 1,0 a 3,0
Resultados
73
mM são relativos à faixa de saturação da peroxidase da água de coco pelo substrato, que é
bastante restritiva em conseqüência da inativação da enzima pelo peróxido de hidrogênio.
Figura 11: Dependência da velocidade de oxidação do guaiacol catalisada pela peroxidase
da água de coco à concentração de H2O2. Em (A) cada curva (símbolos em cinza e verde) representa amostras diferentes. Foi empregado guaiacol 20 mM em MES 50 mM (pH 5,5) a temperatura ambiente. EA=velocidade de oxidação do guaiacol (∆Abs470*min-1). Em (B) detalhes das fases de aumento exponencial da velocidade e saturação da enzima pelo substrato.
A enzima pode ser inibida tanto por altas concentrações de substrato (H2O2), como por
altas concentrações de guaiacol, sendo a velocidade de reação dependente de ambos. Para o
peróxido, sabe-se que em altas concentrações, maior será a inibição da atividade da enzima e
também que maior será a inibição causada pelo aumento da concentração do guaiacol
(RICHARD e NICOLAS, 1989).
A Figura 12 mostra esquematicamente as três reações gerais que ocorrem quando a
enzima peroxidase age sobre o substrato (reações de 1 a 3, já detalhadas no item 1.2.2) e
algumas reações adicionais que podem ocorrer quando for adicionado excesso de peróxido de
hidrogênio e que resultam na produção de formas inativas da peroxidase. Estas reações foram
descritas em revisão recente que mostra os mecanismos propostos por Nakajima e Yamazaki
(NAKAJIMA e YAMAZAKI, 1987). Na revisão, os autores indicam uma série de reações de
Resultados
74
inativação em seguida à reação do grupo heme com o hidroperóxido e propõem diversos
mecanismos de inativação que ocorrem em vários estágios (VALDERRAMA et al., 2002).
Figura 12: Esquema simplificado das vias de inativação da peroxidase a partir do composto intermediário do ciclo de catálise (Composto II) (adaptado de Valderrama et al., 2002).
Na Figura 12, a reação 4 mostra a oxidação de uma porção significativa do Composto
II, que pode ocorrer quando houver excesso de H2O2 ou ausência do agente redutor. Esta
situação leva à conversão do Composto II em um radical livre peróxi-ferro(III)porfirina
chamado Composto III (CIII), uma forma enzimática irreversivelmente inativa. Este elemento
não faz parte do ciclo da peroxidase, mas é produzido sob condições de exposição excessiva
do CII protonado a espécies oxidativas em reação parcialmente mediada pelo radical
superóxido. A partir deste elemento, a peroxidase pode seguir vários caminhos, como a
Resultados
75
quebra do anel heme (reação 5) ou oxidação protéica (reação 6 e 7), ambas são situações que
levam à inativação da peroxidase.
Estas características definem o peróxido de hidrogênio como substrato suicida. Este
efeito negativo limita as condições de medida de atividade da enzima a parâmetros bastante
estreitos. Reações suicidas da peroxidase causadas pelo peróxido de hidrogênio podem ser
evitadas usando diferentes concentrações de enzima, peróxido de hidrogênio e/ou guaiacol.
(MOOSAVI MOVAHEDI et al., 1999).
A inibição total da peroxidase de raiz forte quando em contato com peróxido de
hidrogênio sem a presença do substrato redutor foi demonstrada por Schmidt (SCHMIDT,
2002). O autor cita serem necessárias várias horas de contato com altas concentrações de
peróxido de hidrogênio (até 100 vezes a concentração normalmente usada para determinação
da atividade).
4.3. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA PEROXIDASE
Na água de coco, a peroxidase aparece naturalmente solúvel e, junto com outras
enzimas, é responsável pela alteração do produto após a abertura do fruto. Identificar e
controlar sua presença é fator essencial para a manutenção da qualidade de produtos que
contenham água de coco.
As características peculiares da água de coco (alta concentração de sais e açúcares,
proporcionalmente a um baixo conteúdo de sólidos totais dissolvidos) resultam em
dificuldades no uso de técnicas clássicas para concentração, como a liofilização (ocorre a
formação de “xarope” não cristalizável) ou a precipitação com sulfato de amônio ou acetona
(baixa concentração de proteínas).
Resultados
76
O esquema apresentado na Figura 13 mostra de forma simplificada o fluxograma
utilizado para obtenção da peroxidase da água de coco. Cada etapa foi conduzida conforme
procedimentos detalhados em material e métodos e os resultados estão descritos nas seções a
seguir.
Figura 13: Fluxograma utilizado para a concentração e caracterização da enzima peroxidase obtida a partir da água de coco. As etapas estão descritas em cada secção a seguir.
Resultados
77
4.3.1. Ultrafiltração
A técnica de ultrafiltração foi utilizada visando à recuperação do material retido pela
membrana usada. Quando o objetivo for o efluente, esta técnica também pode ser utilizada
para conservação, como ocorre para o processamento da água de coco descrito por Amoriggi
e Satin (AMORIGGI e SATIN, 1998) e na produção da bebida a base de água de coco,
descrita por Cabral e colaboradores (CABRAL et al., 2002).
4.3.1.1. Ultrafiltração de pequenos volumes
A concentração de água de coco em pequenas quantidades (até 1,5 L) foi realizada
usando ultrafiltração em concentrador Amicon (membrana 10 kDa), como descrito em
material e métodos no item 3.5.1.1. Um exemplo do rendimento obtido está detalhado na
Tabela 8, quando foram utilizados 950 mL de água de coco. O rendimento da concentração
foi avaliado considerando a quantidade de proteínas obtida (avaliada pelo método de Lowry) e
a atividade da peroxidase calculada em relação a um mililitro de água de coco.
Os resultados em atividade específica expressam o índice de concentração da POD em
relação ao conteúdo de proteínas. O aumento em onze vezes da concentração em proteínas
obtido na ultrafiltração mostra a eficiência deste procedimento para retirada de pequenos
peptídeos que fazem parte da composição da água de coco. A ultrafiltração permitiu também a
retirada de açúcares e sais, facilitando etapas posteriores.
Resultados
78
Tabela 8: Recuperação da peroxidase utilizando ultrafiltração e cromatografia de filtração em gel em Sephadex G-75.
Volume (mL)
Concentração de proteína (mg.mL-1)
Atividade POD (dAbs.min-1). .mL-1 (1) ou .mg-1proteína (2)
Atividade específica (3)
Água de coco natural*
950 1,71 (1) 0,85 (2) 0,497*
1
Ultrafiltrada 15 10,8 (1) 59,5 (2) 5,5
11
Sephadex G-75 frações centrais
0,7 4,537 (1) 106,45 (2) 26,46
53,2
(1) Atividade POD/mL = dAbs.min-1.mL-1 (2) Atividade POD/mg proteína = dAbs.min-1.mL-1.mg-1(proteína). (3) Atividade específica POD: dAbs.min-1.mg-1(proteína) em relação ao valor inicial (*) obtido na água de coco natural
4.3.1.2. Ultrafiltração de grandes volumes
Foi empregado o módulo UF/OR para ultrafiltração e osmose reversa e membrana
para 25 kDa. Utilizando-se 45 frutos, que renderam 17,1 L, obteve-se 0,79 L de amostra
concentrada (UF) que, após centrifugação a 8.000-10.000 g, mostrou perda proporcional de
51,9% no conteúdo de peroxidase em relação à água de coco original, acompanhada de uma
perda menos acentuada no conteúdo de proteínas. Os valores obtidos estão descritos na
Tabela 9. Perdas em conseqüência da passagem de enzima para o efluente foram nulas ou
negligenciáveis.
Resultados
79
Tabela 9: Atividade da peroxidase obtida após concentração em equipamento semi-industrial.
EA POD (dAbs.mL-1).mL-1AC
Volume (L)
nº vezes concentrada
EA POD nº vezes concentrada
Perda POD%
Volume água de coco
17,0 0,17
Volume UF** inicial
0,8 21,25 2,213* 13 38,74
UF centrifugada 0,79 1,735 21.6
UF final 0,79 21,25 1,735 13 51,97
* valor EA POD do efluente igual a zero **UF = água de coco ultrafiltrada
A grande perda de peroxidase durante a operação de concentração inviabilizou a
utilização desta técnica para a obtenção da enzima. O produto concentrado, constituído da
fração retida pela membrana filtrante, apresentou uma perda de atividade da POD maior do
que 50% em relação à água de coco usada.
O baixo rendimento na recuperação da peroxidase, conseqüência de perdas acentuadas
ocorridas durante algumas etapas dos diferentes procedimentos usados para concentração, foi
um alerta sobre as dificuldades para obtenção de grandes quantidades da enzima POD da água
de coco.
4.3.2. Cromatografia de filtração em gel – Cálculo do Peso
Molecular da POD da água de coco
A água de coco concentrada por ultrafiltração (UF) foi utilizada para a obtenção da
enzima POD semi-purificada empregando a técnica de filtração em gel em coluna de
Sephadex G-75 previamente equilibrada. As condições de eluição estão descritas no item
3.5.2 na seção material e métodos.
Resultados
80
A eluição da amostra foi monitorada pela medida de A280nm. O conteúdo de cada tubo
de coleta (cerca de 3,0 mL) também foi avaliado em A403 nm para detecção do grupo heme e
para a atividade das enzimas POD e PPO. A Figura 14 mostra o perfil cromatográfico obtido
pela aplicação de 2,0 mL de água de coco concentrada (UF) nas condições descritas.
Figura 14: Perfil de eluição da POD em resina Sephadex G-75, empregando tampão Tris-
HCl 25 mM com NaCl 50 mM (pH 8,0), fluxo: 0,25 mL.min-1. Símbolos em azul escuro: atividade da POD (oxidação do guaiacol por H2O2 medida em A470 nm); símbolos em azul claro: atividade da PPO (oxidação do catecol medida em A393 nm). As setas indicam as frações recolhidas durante a purificação da POD.
A Figura 14 mostra a eluição da peroxidase em apenas uma fração (coletada nos tubos
18 a 22), identificada somente após reação com guaiacol e H2O2, já que em conseqüência da
baixa concentração de proteína (avaliação por medida da absorvância – A280 nm) não foi
possível realizar a detecção da enzima empregando a medida da absorvância que corresponde
à banda Soret do grupo heme (A403nm). A eluição da polifenoloxidase também ocorreu em
apenas uma fração, com atividade sobreposta, em parte, à fração observada para a peroxidase
(tubos 16 a 24). O material recolhido foi posteriormente avaliado misturando os três tubos
Resultados
81
com maior atividade para POD (tubos 19, 20 e 21), mantendo separadamente o material
inicial e final (tubos 18 e 22).
A purificação da peroxidase utilizando a filtração em gel está resumida na Tabela 8,
apresentada anteriormente. Os resultados mostram um aumento (cerca de 50 vezes) da
atividade específica da enzima na fração recolhida, avaliada após diálise e concentração por
secagem conduzida no próprio saco de diálise. Outras técnicas de concentração
(ultracentrifugação e liofilização) foram empregadas, porém resultando em perdas acentuadas
de enzima. O material obtido foi utilizado na avaliação das características da água de coco em
SDS-PAGE (desnaturante e não desnaturante) e na focalização isoelétrica (IEF) em
procedimentos descritos a seguir, foi também utilizado para purificação de isoformas da POD
utilizando cromatografia de troca iônica.
Para o cálculo do peso molecular da peroxidase foi utilizada uma curva de calibração
construída a partir dos valores obtidos na eluição dos padrões e descritos na Tabela 10.
Tabela 10: Valores obtidos na eluição dos padrões utilizados para estimativa do peso molecular por cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75.
Padrões PM
RF (mm)
Volume (Ve)*
Ve/Vo**
Albumina (soro bovino) 66.000 48,5 58,2 1,29
Anidrase carbônica (eritrócitos)
29.000 72 86,4 1,91
Citocromo c (coração de cavalo)
12.400 90.5 108,6 2,40
Azul de dextrano 2.000.000 37,7 45,24 1
Peroxidase da água de coco 44.144 46.029 47.808
59,5 58,43 57,3
71,39 70,12 68,76
1,578 1,55 1,52
* Ve = [(RF mm. velocidade papel-1) . fluxo mL.min-1) **Vo = volume morto (obtido na eluição do Azul de dextrano).
Resultados
82
Para construção da curva de calibração foram relacionados os valores dos logaritmos
dos PM dos padrões versus os valores de Ve/Vo. O valor de RF para a enzima foi calculado
após a identificação do tubo com maior atividade enzimática. Na avaliação de diferentes
amostras, os valores calculados obtidos para peso molecular da peroxidase variaram entre
44.000 e 47.000.
4.3.3. Cromatografia de troca iônica em sistema de perfusão
O uso da cromatografia de troca aniônica fez parte da seqüência empregada para
obtenção da enzima peroxidase, como foi resumido em fluxograma apresentado na Figura 13
do item 4.3 deste capítulo.
O material aplicado na coluna POROS® 20 HQ fortemente aniônica (colunas com
capacidade para 1,0 ou 5,0 mL, acoplada ao sistema de perfusão BioCAD) foi obtido em
prévia aplicação de água de coco concentrada em coluna de Sephadex G-75, dialisado e
concentrado empregando diferentes procedimentos.
Inicialmente, o material coletadas pela eluição em Sephadex (tubos 18 a 22) foi
dialisado e concentrado no próprio saco de diálise. A aplicação de 1,0 mL da mistura do
conteúdo de todos os tubos identificados apresentou o perfil descrito na Figura 15, em
experimento utilizando gradiente linear de duas etapas. As frações eluídas foram coletadas
manualmente, cada uma correspondendo a um pico em A280nm e foram imediatamente
avaliadas quanto à atividade da POD. A maior parte dos picos dos peptídeos e proteínas
observados foi obtida na primeira etapa do gradiente, entre 0 M e 0,15 M de NaCl em tampão
MES. Como ocorreu na cromatografia de filtração em gel, a concentração de peroxidase não
foi suficiente para monitoramento usando o comprimento de onda de 403 nm.
Foi registrada atividade da peroxidase essencialmente em duas frações: 1ª: no volume
morto (VM) com alta concentração de proteínas (A280nm) e baixa atividade para POD; 2ª:
Resultados
83
durante o gradiente salino inicial (concentração de NaCl aproximada de 0,078 M) com baixa
concentração em proteínas mas elevada atividade enzimática.
Figura 15: Perfil de eluição da POD em resina Poros 20 HQ. Amostra aplicada: 1,0 mL da mistura da enzima eluída em Sephadex G-75 e com atividade para POD (tubos 18 a 22), dialisada e concentrada no saco de diálise. Eluente: MES 25 mM (pH 6,0). Linha azul: proteína medida em A280nm; linha cinza: grupo heme medido em A403nm; linha preta: gradiente salino (NaCl, 0-0,15 e 0,15-1,0 M); círculos azul claro: atividade da POD (∆abs470 min-1 para 200 µL de eluato).
Os melhores resultados para purificação da peroxidase foram alcançados quando as
amostras usadas para aplicação na coluna de troca iônica foram previamente tratadas
empregando concentrador tipo absorção de solvente (Vivapore RC 30.000), com membrana
de 30 kDa em recipiente transparente padrão (SAN) composto por uma mistura de
poliestireno e poliacrilnitrila.
As amostras assim preparadas foram aplicadas na coluna de troca iônica resultando no
perfil apresentado na Figura 16. A curva referente à medida em 280 nm mostra a eluição de
Resultados
84
uma única fração protéica, observada durante a primeira etapa do gradiente salino (entre zero
e 0,15 M de NaCl) equivalendo a 66,4 mL de tampão e correspondendo à concentração de
NaCl de aproximadamente 0,068 M. Esta fração, coletada entre 5 e 7 minutos de corrida,
exibiu elevada atividade para a POD e o registro em 280 nm foi coincidente com um pico em
403 nm. Uma pequena quantidade de proteínas, com pouca atividade enzimática, foi
observada no volume morto (VM).
Figura 16: Perfil da eluição da POD em resina Poros 20 HQ. Amostra aplicada: 2,0 mL da
fração obtida em Sephadex G-75 com atividade para a POD (somente tubos 19 a 21), desalinisada e concentrada em Vivapore 30.000. Eluição com MES 25 mM (pH 6,0), conforme descrito em material e métodos; gradiente de sal aplicado de NaCl, 0 – 0.15 e 0.15 a 1.0 M (linha verde escuro tracejada).
A pureza das frações recolhidas nos diferentes procedimentos foi avaliada
posteriormente através de SDS-PAGE e por focalização isoelétrica, procedimentos descritos
nos próximos itens (itens 4.3.4 e 4.3.5 respectivamente).
Resultados
85
A Tabela 11 apresenta uma compilação de valores obtidos durante as diferentes etapas
da purificação da POD da água de coco. As evidências de perda de peroxidase, sempre mais
acentuadas em soluções puras, indicam ser necessária cautela para uso dos valores indicados.
Tabela 11: Recuperação da peroxidase da água de coco durante procedimentos de ultrafiltração, filtração em gel e eluição por cromatografia de perfusão em coluna fortemente aniônica.
Amostra(1) dAbs.min-1
.mL-1 µmoles(tetraguaiacol) .mL-1. min-1(3)
µmoles(tetraguaiacol). (mg proteína)-1. min-1
Água de coco 0,85 0,03195 0,0187
Ultrafiltrada 59,5 0,237 0,207
Filtração em gel 106,45 4,002 0,882
Cromatografia Perfusão (2)
54 2,03 338,3
(1) As frações obtidas por ultrafiltração e filtração em gel foram avaliadas após diálise e concentração.
(2) Foi considerada fração obtida após o uso de Vivapore 30.000: 6 µg proteína. mL-1
(3) ε Guaiacol = 26,6 cm-1 mM -1.
A tentativa de obtenção e conservação de frações com atividade para POD foi um
enorme exercício de paciência e persistência, pois, independente da técnica utilizada ou do
método empregado para armazenamento, ocorreram perdas constantes e, até então,
inexplicáveis de enzima.
4.3.4. Perfil eletroforético da água de coco e PM da POD
A água de coco possui ótimas características como líquido hidratante; desta forma, é
natural que a concentração de substâncias dissolvidas seja bastante baixa, especialmente
enzimas como a peroxidase. Para a determinação do perfil eletroforético da AC e do peso
molecular da peroxidase foi necessário utilizar alíquotas concentradas e dialisadas, tanto da
Resultados
86
amostra in natura, como de todas as frações obtidas durante as diferentes etapas de
purificação.
As amostras foram preparadas na forma nativa e desnaturada (conforme descrito em
material e métodos, item 3.6) e aplicadas em gel SDS-PAGE, sendo utilizado tampão de
corrida contendo SDS para ambas. Após a corrida, executada à temperatura ambiente, os géis
utilizando amostra não desnaturada foram revelados para atividade da POD. Para isto foram
lavados com solução tampão MES 25 mM (pH 5,8) contendo Triton X-100 0,1%, que remove
uma grande parte do SDS e permite, em parte, que a enzima peroxidase se reestruture
(AKINS et al., 1992). Após este procedimento, os géis foram corados com guaiacol+H2O2 e
imediatamente avaliados usando o programa Gene Genius. O mesmo gel foi corado com azul
de Coomassie para evidenciar todas as proteínas presentes na amostra e também avaliado
usando o programa Gene Genius.
A Figura 17 mostra o perfil eletroforético da água de coco e das diferentes partes da
fração purificada obtida em cromatografia de filtração em gel (tubos 18 a 22), todas aplicadas
ao gel na forma desnaturada e não desnaturada, em linhas intercaladas. A Figura 17A mostra
as bandas com atividade para a POD e a Figura 17B mostra o mesmo gel após coloração com
azul de Coomassie. Soluções da enzima peroxidase de raiz forte (HRP) na forma não-
desnaturada e desnaturada (Figura 17A e B, linhas L1 e L2, respectivamente) foram aplicadas
como referência.
Na água de coco concentrada (UF), a coloração em guaiacol revelou a presença de três
diferentes bandas com importante atividade para peroxidase (Figura 17A, linha L9) e a
coloração com azul de Coomassie (Figura 17B, L9) evidenciou a presença de várias outras
proteínas. Após esta última coloração foi possível observar uma boa correlação entre as
bandas obtidas nas linhas onde foram aplicadas as amostras não desnaturadas (Figura 17B,
L9) e determinadas bandas da amostra desnaturadas (Figura 17B, L8).
Resultados
87
A Figura 17 mostra, também, o perfil eletroforético das amostras coletadas pela
eluição da água de coco concentrada em cromatografia de filtração em gel. A peroxidase
aparece destacada nas linhas L6 e L7 da Figura 17A e Figura 17B, referentes aos tubos
contendo a parte central da fração com atividade para a enzima (tubos 19 a 21). Esta mesma
amostra, após coloração com azul de Coomassie, indicou a presença de duas bandas bem
definidas (Figura 17B - L6). A banda com maior migração no gel não mostrou atividade para
POD e pode ser visualizada tanto na linha correspondente à amostra desnaturada (Figura 17B
– L6) como na não desnaturada (Linhas 7 na Figura 17A e Figura 17B), indicativo de que a
presença desta proteína de baixo peso molecular não foi conseqüência da desestruturação da
POD. A primeira parte da fração coletada – tubo 18 foi aplicada nas linhas L3 e L4 da Figura
17A e B e nas linhas L11 e L12 foram aplicadas amostras do tubo 22 (parte final).
A aplicação de amostras não desnaturadas em gel de SDS-PAGE permitiu, além da
detecção da banda referente à POD, também a detecção de diferentes formas da peroxidase na
amostra in natura com migração diferenciada no gel. Nestas condições todos os tubos (tubos
18 a 22) apresentaram sempre três bandas, mas em diferentes proporções.
A eluição em Sephadex não foi suficiente para a purificação da POD, o que pode ser
observado pela presença de várias outras proteínas nas diferentes amostras após coloração
com azul de Coomassie. A coloração prévia utilizando guaiacol resultou sempre em bandas
mais fortemente coradas com azul de Coomassie, porém menos definidas, provavelmente em
conseqüência da dispersão da amostra no gel durante a imersão no tampão de lavagem.
Resultados
88
Figura 17: Padrão de eletroforese da amostra concentrada (UF) e frações efluentes em Sephadex G-75, dialisadas contra tampão Tris-HCl (pH 8,0) e concentradas. Em (A) SDS-PAGE com aplicação intercalada de amostras preparadas de forma não desnaturante e desnaturante, corado inicialmente com guaiacol e H2O2; Em (B) o mesmo gel, corado com azul de Coomassie após fixação com TCA 12%. Em ambos: L1-enzima peroxidase de raiz forte (HRP) não desnaturada e L2-desnaturada; L3-tubo 18, amostra desnaturada e L4 não desnaturada, L5-Padrões Sigma 14.000-66.000, L6- tubos 19 a 21, amostra desnaturada e L7- não desnaturada, L8-UF desnaturada e L9-não desnaturada, L10-Padrões, L11- tubo 20, amostra desnaturada e L12- não desnaturada. Linha tracejada cinza: indicação aproximada da migração da POD.
O peso molecular da peroxidase foi calculado na água de coco concentrada e nas
diferentes amostras, obtendo-se valores entre 41.000 e 42.000. Para o cálculo foi utilizada a
curva de RF (das amostras desnaturadas) versus PM obtida para os padrões Sigma 14.200 –
66.000 (Tabela 3), calculados pelo programa de análise Gene Tools. Nas amostras não
desnaturadas a peroxidase sempre apareceu na forma de uma banda mais intensa, porém
menos definida, após a coloração com azul de Coomassie e o PM calculado foi ligeiramente
inferior (entre 38.000 e 41.000) àquele calculado para as amostras desnaturadas.
A peroxidase de raiz forte (HRP) foi avaliada nas mesmas condições, apresentando
somente uma banda quando desnaturada com valor de PM calculado = 43.500 (Figura 17A,
linha L2) em relação aos padrões usados, e quatro bandas quando não desnaturada (Figura
17B, linha L1). Das quatro bandas observadas, três mostraram atividade quando coradas com
Resultados
89
guaiacol e H2O2 e não migraram, permanecendo no gel de separação (pH 6,8). A última banda
migrou até o RF correspondente à migração da proteína desnaturada e não mostrou atividade
enzimática.
A Figura 18 mostra outro gel corado como indicado acima. Nas linhas L1 e L4 foram
aplicadas diferentes amostras provenientes da aplicação da água de coco concentrada em
Sephadex e coluna POROS®20 HQ (ambas eluídas durante a primeira etapa do gradiente
salino – entre 0,068 e 0,078 M). A amostra aplicada na linha L1 foi desalinizada e
concentrada (antes e depois da cromatografia de troca iônica) em saco de diálise; a amostra da
linha L4 utilizou concentrador tipo absorção de solvente (Vivapore).
Figura 18: Perfil eletroforético das frações obtidas em cromatografia de perfusão em coluna de troca aniônica. Em (A) gel com amostras não desnaturadas coradas em guaiacol+H2O2. Em (B) mesmo gel corado com azul de Coomassie. Em ambos: L1 - Amostra obtida após perfusão em coluna POROS em gradiente salino (entre 0,068 e 0,078 M) desalinisada e concentrada em saco de diálise; L2 - Padrões 66.000 – 14.200 Sigma; L3 - Amostra obtida pela filtração em gel (tubos 19 a 21), desalinisada e concentrada em Vivapore; L4 - Amostra obtida após perfusão em coluna POROS, desalinisada e concentrada em Vivapore.
Resultados
90
A amostra aplicada na linha L3 foi obtida pela concentração em Vivapore da fração
obtida pela aplicação de água de coco concentrada em filtração em gel.
Em todas as amostras empregando o concentrador por adsorção a presença de
contaminantes foi mais discreta, aumentando a pureza da amostra. Foi observada, também,
uma redução acentuada da perda de enzima durante o procedimento de desalinisação e
concentração.
4.3.5. Estimativa dos valores de Ponto Isoelétrico (pI) da
POD da água de coco
A variedade de isoformas da peroxidase em plantas é bastante detalhada na literatura,
existindo um perfil próprio de isoenzimas da peroxidase para cada diferente produto estudado,
como já foi descrito anteriormente.
Para obtenção dos valores dos pontos isoelétricos das isoformas da POD da água de
coco foram avaliadas diferentes amostras concentradas e várias frações obtidas durante a
purificação. A Figura 19A (linha L2) mostra o perfil isoelétrico de todos os peptídeos e
proteínas encontrados na água de coco concentrada por UF em membrana com corte de 10
kDa e corados com azul de Coomassie após isoeletrofocalização em agarose. Os valores de pI
foram obtidos através de cálculos de RF em relação aos padrões usando o programa Gene
Genius Gel Documentation.
Como pode ser observado, grande parte das proteínas apresentaram pI na faixa ácida,
entre pH 4,5 e 5,7, com maior concentração entre 4,6 e 5,0. Entre todas as bandas
visualizadas, aquela com ponto isoelétrico próximo ao pH 5,2 se destaca pela nitidez e
intensidade. Na faixa básica, somente uma banda é significativa, com pI próximo ao pH 9,1.
Diferentes amostras de água de coco concentrada apresentaram perfis muito semelhantes,
diferindo essencialmente na concentração de cada banda.
Resultados
91
Figura 19: Perfil de focalização isoelétrica da água de coco em gel de agarose corado com azul de Coomassie. Em (A) gel de focalização isoelétrica, onde L1 - água de coco concentrada (UF) apresentada com os valores de pI calculados; L2 – Padrões para focalização isoelétrica (pH 3,6 – 9,3) apresentado com os valores de pI de cada padrão. Em (B) Perfil gráfico das bandas obtidas (verticalizado para melhor comparação com as respectivas bandas): em verde: amostra UF, em cinza: padrões de focalização.
A Figura 20 (quadros A e B) mostra o perfi da água de coco concentrada e também de
várias frações obtidas após filtração em gel. Todas as amostras foram aplicadas in natura no
gel de agarose e, após a focalização, foram coradas com peróxido de hidrogênio+guaiacol
para identificação e registro das bandas com atividade (Figura 20A) e imediatamente fixadas e
coradas com azul de Coomassie (Figura 20B). Comparando os registros da mesma placa
obtidos em ambas as colorações, foi possível reconhecer as bandas com atividade e calcular o
pI através dos valores de RF usando como referência os padrões pH 3-10 (Figura 20B, linha
L4). A adição de reagentes para identificação da atividade da POD foi realizada antes da
fixação resultando em difusão de proteínas para a solução e, consequentemente, bandas
Resultados
92
menos definidas. Objetivando maior acuidade nos resultados, os cálculos dos RF dos padrões
e amostras foram sempre comparados aos valores obtidos nas placas fixadas (Figura 19).
Todas as amostras apresentaram várias bandas reveladas por azul de Coomassie
(Figura 20B), com uma maior concentração de proteínas na faixa de pH entre 4,5 e 5,2. A
Figura 20A mostra as isoformas da POD presentes, onde é possível observar que as principais
bandas são ácidas e com valores de pontos isoelétricos bastante próximos.
A banda mais intensa, em ambas as colorações e em todas as amostras, obteve um
valor de pI calculado entre pH 5,1 e 5,2 e aparece mais intensamente na água de coco UF
(Figura 20 linhas L5a e L5b, L6a e L6b) e com menos intensidade na alíquota final obtida na
eluição em Sephadex (tubo 22 - Figura 20: L2a e L2b). A isoforma mais ácida (pI = 4,5)
aparece em maior concentração na parte final (linhas L2a e L2b). A terceira isoforma
apresentou pI = 5,0, aparecendo em maior concentração na parte principal (tubos 19 a 21,
linhas L3a e L3b) e em menor concentração na amostra integral concentrada – UF (linhas L5a
e L5b e linhas L6a e L6b). Esta isoenzima corresponde a uma banda fortemente corada com
azul de Coomassie, sugerindo uma proteína com baixa atividade para peroxidase.
As frações concentradas apresentaram outras bandas muito discretas com caráter
básico (valores entre pH 6,6 e 8,8), visualizadas principalmente na coloração com guaiacol,
considerada bastante sensível a concentrações extremamente baixas de peroxidase.
Resultados
93
Figura 20: Padrão de focalização isoelétrica da água de coco e frações obtidas durante filtração em gel. Em A: gel corado com guaiacol/H2O2; Em B: o mesmo gel corado com azul de Coomassie. Em ambos: L1 – peroxidase de raiz forte Sigma (HRP-tipo V); L2 – Alíquota final (tubo 22, com média atividade para a POD) obtida pela eluição da água de coco UF em Sephadex. L3 – Alíquota principal (tubos 19 a 21, com alta atividade para POD) obtida em Sephadex; L4: Padrões (pH 3,6-9,3); L5 – Amostra água de coco concentrada – UF-1; L6 – água de coco UF-2; L7 – Alíquota inicial (tubo 18, com baixa atividade para POD) obtida em eluição em Sephadex.
A focalização da enzima comercial de raiz forte (Figura 20, linhas L1a e L1b) mostrou
a presença de várias isoformas (10 facilmente identificadas), principalmente na região neutra
e básica, mostrando um perfil completamente diferente da POD da água de coco. Shannon,
Kay e Lew descreveram um total de sete isoenzimas presentes na raiz forte, indicando a
isoenzima HRP-C como a maior fração com pI = 8,8 (SHANNON et al., 1966).
A Figura 21 mostra outro gel corado para atividade (A) e com azul de Coomassie (B).
A linha L1a mostra o isolamento da principal isoforma, obtido após aplicação em coluna de
troca iônica seguida por desalinisação/concentração em Vivapore, usando amostra
previamente eluída em coluna de Sephadex. Os cálculos confirmaram o valor de 5,2 para
ponto isoelétrico. As linhas L3a e L3b foram carregadas com esta mesma fração, porém
concentrada e desalinisada por diálise (membrana de celulose 12.000), resultando em amostra
Resultados
94
com concentração muito baixa de proteína, visível somente após coloração para atividade da
peroxidase. Na linha L4, nova amostra de água de coco concentrada por UF.
Figura 21: Padrão de focalização isoelétrica da água de coco e frações obtidas em cromatografia de troca iônica. Em (A) Amostras não desnaturadas coradas com guaiacol+H2O2; Em B: mesmas amostras coradas com azul de Coomassie após A. Em ambas: L1 - Amostra obtida após perfusão em coluna POROS em gradiente salino (entre 0,068 e 0,078 M ) desalinisada e concentrada em Vivapore). L2 - Padrões (pH 3,6-9,3) L3 - Amostra obtida após perfusão em coluna POROS em gradiente salino (entre 0,068 e 0,078 M ) desalinisada e concentrada em saco de diálise; L4 - Amostra de água de coco concentrada – UF.
4.4. AVALIAÇÃO INICIAL DO EFEITO DA APH SOBRE A ÁGUA DE COCO
A combinação do uso de APH e calor moderado para inativação de enzimas
responsáveis pela alteração de alimentos é uma alternativa para conservar as características
nutricionais e sensoriais de produtos que possuem enzimas termorresistentes ou
barorresistentes (SEYDERHELM et al., 1996; LÓPEZ-MALO et al., 1998; MACDONALD e
SCHASCHKE, 2000).
Resultados
95
No presente trabalho, objetivando a avaliação do efeito do processamento da água de
coco usando alta pressão hidrostática e a identificação das condições mais adequadas para
obter a inativação das enzimas peroxidase e polifenoloxidase, foram empregadas diferentes
combinações de três importantes parâmetros de processo: temperatura, tempo e intensidade de
pressurização. Para obter informações quanto à validade de cada um dos procedimentos
utilizados na preservação, as atividades das enzimas foram avaliadas durante a pressurização e
em tempos diferentes após o processo: imediatamente após o final do processo – T(0), vinte e
quatro horas após o final do processo – T(24 h) e eventualmente sete dias T(7 d) após o
processamento (em ambos conservando as amostras sob refrigeração). Para todas as
condições foi realizada em paralelo a avaliação do processamento por APH sobre a
peroxidase de raiz forte em solução.
4.4.1. Processamento I - Avaliação da atividade da
peroxidase durante a pressurização
A observação do comportamento da peroxidase durante a pressurização foi importante
instrumento para identificar algumas características desta enzima presente na água de coco. O
efeito da pressurização foi avaliado in situ usando equipamento para tratamento por APH com
janela ótica, acoplado a espectrofotômetro e em condições de manutenção da temperatura da
câmara de pressurização (Figura 7).
A atividade da peroxidase durante a pressurização foi avaliada pelo incremento da
absorvância em conseqüência da formação do composto corado – tetraguaiacol, medida
iniciada imediatamente após o fechamento da câmara de pressurização. Foi necessário realizar
adaptações do método utilizado (descrito no item 3.3) visando obter valores menores e
lineares para a velocidade inicial da POD durante toda a pressurização.
Resultados
96
Não foi realizada a avaliação do comportamento da polifenoloxidase em conseqüência
da resposta extremamente rápida da enzima quando adicionada de catecol.
As Figura 22 e Figura 23 mostram as curvas de medida da Absorvância obtidas
durante a pressurização da água de coco em três diferentes temperaturas: 10 – 25 e 40ºC nas
condições: pressão atmosférica (0,1 MPa), 100 MPa e 300 MPa, realizadas em uma única
etapa ou realizando a pressurização em etapas de 50 MPa (cada situação é indicada no próprio
quadro).
Os resultados demonstraram a ineficiência do uso da APH para inativação da POD nas
condições empregadas. A acomodação da janela óptica à nova condição de pressurização (que
ocorre aos 5 minutos) interfere na avaliação espectrofotométrica, dificultando o cálculo da
velocidade inicial da POD. Para uma avaliação aproximada foi obtido uma curva ajustada
usando uma equação não linear do modelo de curva sigmóide de três parâmetros do programa
SigmaPlot 8.02.
A Figura 22A mostra o efeito da pressurização a 25ºC empregando 100 e 300 MPa em
uma única etapa, 300 MPa com aumento da pressão em etapas de 50 MPa a cada 5 minutos e
também a amostra não pressurizada (0,1 MPa). As curvas ajustadas (Figura 22B) mostram o
aumento da velocidade inicial, aproximadamente duas vezes maior após aplicação de 300
MPa, em relação à amostra não pressurizada na mesma temperatura. O aumento gradativo da
pressão até 300 MPa também resultou no aumento da velocidade (não calculada). Quando foi
empregado 100 MPa a 25ºC a modificação da velocidade foi insignificante.
O tratamento da água de coco empregando 300 MPa e temperatura de 40ºC (Figura
22C e D) resultou em aumento significativo da atividade enzimática (aproximadamente 6
vezes), observado nos primeiros minutos de pressurização (valores obtidos em cálculo usando
a curva ajustada da Figura 22D ). A medida da atividade da enzima nesta temperatura sem
pressurização (controle 40ºC) também mostrou um aumento de atividade em relação à
Resultados
97
amostra não pressurizada à 25ºC. Estes resultados forneceram uma idéia sobre a influência da
pressão sobre a ativação da POD e o sinergismo que ocorre pela combinação com a
temperatura.
Figura 22: Efeito do uso de APH a 25 e 40ºC sobre a POD da água de coco e a influência na formação do composto corado (tetraguaiacol), após a adição de H2O2 0,2 mM e guaiacol 15 mM. Em todos os quadros: linha pontilhada: amostra sem pressurização à temperatura de processo; linha sólida: amostra pressurizada a 300 MPa à temperatura de processo. Em A e C: Curvas registradas durante pressurização; Em B e D: detalhes das curvas ajustadas obtidas para os primeiros 10 min de pressurização. No processamento a 25ºC, quadro A: linha verde escuro contínua: pressurização em etapas de 50 MPa e linha em azul claro indica a mesma amostra pressurizada a 100 MPa.
Resultados
98
Experimentos semelhantes foram conduzidos usando temperaturas inferiores, sendo a
escolha de 10ºC condicionada à capacidade do equipamento. A aplicação de 300 MPa
resultou em valores de absorvância representados na Figura 23, ocorrendo um discreto
incremento em relação aos valores obtidos quando a reação foi conduzida sem pressão à
mesma temperatura (detalhe na Figura 23B).
Figura 23: Efeito do uso de APH a 10ºC sobre a POD da água de coco e a influência na formação do composto corado (tetraguaiacol). Em ambos os quadros: linha pontilhada: amostra sem pressurização a 10ºC; linha sólida: amostra pressurizada a 300 MPa a 10ºC. Em: B mostra as curvas ajustadas obtidas para os primeiros 14 min de pressurização
4.4.2. Processamento II - Avaliação inicial do efeito da APH
sobre a POD e PPO
Inicialmente, o processamento da água de coco por APH, foi realizado utilizando
procedimento semelhante ao utilizado nas indústrias de alimentos. A água de coco foi
acondicionada em sacos de filme flexível CRYOVAC®, impermeável e termossoldável,
possuidor de características específicas para este processamento: permite a compressão da
Resultados
99
amostra, possui resistência mecânica, é impermeável ao líquido de pressurização usado, é uma
barreira altamente eficiente ao O2 e possui propriedades superiores de fechamento por calor
obtendo proteção inclusive contra contaminação microbiana
(http://www.cryovac.com/eu/es/library/casehits.abp.html).
A água de coco utilizada foi obtida pela mistura do conteúdo de 10 frutos resultando
na amostra descrita na Tabela 7 (item 4.1). Uma porção de água de coco congelada foi
descongelada a cada dia de processo.
Para este estudo, foi empregada a combinação de três níveis de temperatura e tempo e
cinco níveis de pressão. Para melhor monitorar o resultado do processamento, as amostras
foram avaliadas sistematicamente após 24 h – T(24 h) e sete dias – T(7 d) de armazenamento
sob refrigeração, além da avaliação realizada imediatamente após o processamento – T(0). As
condições empregadas para processamento estão sumarizadas na Tabela 12, descrita a seguir e
previamente detalhadas em material e métodos na Tabela 5.
Tabela 12: Variáveis de processo empregadas no tratamento das amostras de AC acondicionadas em sacos plásticos termossoldáveis. (0,1 MPa = Pressão atmosférica)
Variáveis dependentes
Variáveis independentes
Enzimas avaliadas
Temperatura de Processo (ºC)
Tempo de Processo (min)
Alta Pressão Hidrostática (MPa)
Avaliações da atividade enzimática (EA)
POD 20 (temperatura ambiente)
15 0,1* T(0) imediatamente após processo, mantido em banho de gelo.
PPO 40 30 100 T(24 h) – 24 h após o processo, amostra mantida em refrigeração.
60 45 300 T(7 d) – 7 dias após-processo, sob refrigeração
500
600
Resultados
100
Todos os processamentos empregando combinações de tempo e pressão a 20ºC
resultaram em amostras visivelmente alteradas após sete dias de armazenamento. Estas
amostras foram descartadas e não foram determinadas as possíveis causas das alterações.
Estas mesmas amostras não apresentaram alterações de suas características
imediatamente após o processamento - T(0) e após um dia de armazenamento sob refrigeração
- T(24 h) sendo, portanto, avaliadas da mesma forma como foram efetuados os controles de
atividade residual da POD e PPO após processamento a 40 e 60ºC em T(0), T(24 h) e T(7 d).
4.4.2.1. Atividade residual da POD – T(0) e T(24 h)
Os valores obtidos na medida da atividade residual da POD da água de coco,
processada nas condições descritas acima foram considerados pouco reprodutíveis, resultando
em medidas pouco confiáveis, segundo avaliação estatística. Para representar estes resultados
não foram utilizados os recursos da Metodologia de Superfície de Resposta previstos
inicialmente durante o planejamento dos experimentos. Esta metodologia foi aplicada
somente para os resultados obtidos na avaliação da atividade residual da PPO (item 4.4.2.2.).
Independente da avaliação estatística, os resultados foram essenciais para orientar a
execução de novos experimentos e para a interpretação de resultados obtidos posteriormente.
Os valores da atividade residual da POD para todas as condições pré-estabelecidas estão
descritos nos gráficos da Figura 24.
Resultados
101
Figura 24: Atividade residual da peroxidase da AC processada por APH em embalagens flexíveis. Temperatura de processo – Em A: 20ºC; B: 40ºC; C: 60ºC. Série 1: T(0); série 2: T(24 h); série 3: T(7 dias).
Resultados
102
As diferentes combinações de processo empregando 20ºC (Figura 24A) foram
ineficientes, já que não ocorreu diminuição da atividade da peroxidase na água de coco
processada empregando pressões até 300 MPa e a diminuição da atividade residual observada
após o emprego de 500 e 600 MPa não foi permanente. Neste caso, ocorreu aumento após 24
horas de armazenamento, quando foram observados níveis semelhantes aos iniciais (antes do
processamento). A manutenção da atividade da enzima foi, provavelmente, uma das causas da
alteração da água de coco observada após 7 dias de armazenamento sob refrigeração do
produto processado.
O processamento a 60ºC empregando pressões mais elevadas (Figura 24C) resultou na
inativação quase total da enzima (atividade residual inferior a 3%) e na manutenção destes
níveis mesmo após o armazenamento. Nestas condições de processo, os resultados sugerem
que a intensidade da pressão e a temperatura são parâmetros fundamentais para a inativação
da enzima, mas o tempo de processo parece ter menor influência sobre os resultados.
O processamento por APH a 40ºC (Figura 24B) empregando 500 e 600 MPa resultou
em valores de atividade da POD superiores àqueles obtidos empregando pressões inferiores
(100 e 300 MPa), com posterior diminuição da atividade durante o armazenamento. Foram
observados aumentos da atividade da POD também nos produtos avaliados após 24 horas ou 7
dias (mantido sob refrigeração) quando submetido a diferentes condições de processo:
processamento a 20ºC usando pressões elevadas (500 e 600 MPa – Figura 24A),
processamento a 40ºC empregando usando pressões médias (100 e 300 MPa – Figura 24B) e
processamento a 60ºC sem pressão ou pressão bastante baixa (100 MPa – Figura 24C).
As causas da variação das respostas ao processamento por APH podem estar
associadas ao efeito conjunto da temperatura e da pressão e poderiam ser explicadas de várias
formas, sempre encontrando ampla referência na literatura especializada.
Resultados
103
O aumento da atividade da enzima durante o armazenamento da amostra processada
poderia ser interpretado como regeneração da enzima e, consequentemente, de sua atividade.
Este efeito foi registrado para a peroxidase de vários vegetais, podendo ocorrer horas ou dias
após o processamento do alimento por calor (ADAMS, 1997; FORSYTH et al., 1999;
BOICORAN, 2000).
Os valores de atividade residual inferiores, observados também nas amostras controle
(amostras embaladas e conservadas de forma idêntica àquelas processadas por APH),
levantaram dúvidas sobre a validade do uso da teoria da regeneração como explicação dos
resultados obtidos. Em experimentos a serem descritos (item 4.5.1 – Adsorção da POD à
embalagem), resultados semelhantes foram avaliados levando em consideração outros fatores:
tipo de embalagem, material da embalagem e preparo da amostra, entre outros.
Novos experimentos empregando a APH para processamento da água de coco (a
serem descritos no item 4.5) foram realizados levando em consideração os resultados
apresentados na Figura 24 e estruturados para evitar as flutuações da atividade da POD
descritas acima.
4.4.2.2. Atividade residual da PPO – T(0) e T(24 h)
Para a determinação do efeito do processamento da água de coco por APH sobre a
atividade residual da PPO foram avaliados os 23 experimentos apresentados na Tabela 5.
Os resultados obtidos para a polifenoloxidase, descritos a seguir, mostram uma enzima
com perfil muito diferente da POD, pois apresentou resultados reprodutíveis que permitiram o
emprego da análise estatística dos dados obtidos. Os resultados da atividade residual da PPO
foram analisados pelo programa estatístico Statistical Analitical System (SAS). Para
selecionar a melhor equação foi empregado a análise de variância (ANOVA) e os termos
usados foram selecionados segundo o nível de significância de cada variável (p<0,05).
Resultados
104
A partir dos parâmetros empregados (variáveis independentes), foram obtidos os
coeficientes de regressão normalizados utilizados na Equação 1, que descreve um modelo
quadrático para representar a atividade residual da PPO imediatamente após o processamento
– T(0). O modelo teve ajuste satisfatório aos dados experimentais, com valor de coeficiente de
correlação ajustado (R2aj) igual a 0,84.
Equação 1:
EA PPO T(0) = 0,228 – 0,00244.T – 0,000312.P + 0,000000303. P2
Onde:
EA PPO T(0) = Atividade residual da polifenoloxidase avaliada após processamento;
T = temperatura (ºC);
P = pressão (MPa);
t = tempo de processo (minutos)
O efeito combinado da pressão e da temperatura sobre a atividade da PPO pode ser
visualizado no gráfico apresentado na Figura 25A. A temperatura e a pressão apresentaram
efeito linear negativo na variável de resposta, ou seja, quanto maior a temperatura e/ou a
pressão, menor a atividade enzimática. O valor da relação coeficiente de regressão versus
efeito linear da pressão foi o termo mais importante para o resultado final. O tempo de
processo não teve participação significativa no domínio estudado (p>0,05), assim como as
interações entre as variáveis: P versus T, P versus t e T versus t, que não foram utilizados para
compor a equação.
Neste modelo a pressão foi a única variável independente que apresentou o efeito
quadrático, sendo incluída no modelo mesmo com valor de p>0,05. Seu efeito pode ser
observado por uma discreta curvatura na superfície de resposta, com concavidade para cima,
resultando numa eficiência cada vez menor em conseqüência do aumento da pressão. Esta
situação explica porque a enzima não foi totalmente inativada nas condições usadas.
Resultados
105
Para todas as condições empregadas houve redução da atividade da polifenoloxidase,
porém, da mesma forma que para a POD, as condições de tratamento utilizadas não levaram à
inativação total da enzima. O processamento a 60ºC resultou em acentuada inativação e o
processamento empregando 40ºC implicou em discretas diminuições na atividade.
Figura 25: Efeito combinado da pressão e temperatura sobre a atividade residual da PPO da água de coco. Em A: imediatamente após o processamento por APH – T(0); em B: 24 h após o processamento por APH – T(24 h).
Pela análise de variância (ANOVA) da atividade residual da PPO após 24 h de
estocagem foi obtido o modelo expresso pela Equação 2. O modelo teve razoável ajuste aos
dados experimentais, com valor de Raj2 igual a 0,79.
Equação 2:
EA PPO T(24 h) = 0,174 – 0,00203 .T – 0,0000637. P
Onde:
EA PPO T(24 h) = Atividade PPO após processamento, mantida 24 h sob
refrigeração;
Resultados
106
Os efeitos da pressão e da temperatura sobre a atividade residual da PPO podem ser
visualizados no gráfico apresentado na Figura 25B. O modelo indica que apenas os termos
lineares relacionados à temperatura e à pressão foram significativos. Os dois fatores
apresentaram efeito linear negativo (ou seja, quanto maior o valor, menos a atividade
enzimática resultante). O efeito linear da pressão foi bastante inferior ao obtido em T(0), o
que indica a importância do uso de maiores temperaturas para o processo em APH da água de
coco. Neste caso, o efeito quadrático da pressão não foi significativo, o que indica maior
linearidade na resposta ao aumento da temperatura e pressão. A relação entre estes dois
parâmetros é importante para o efeito final do processamento, porém a eficiência seria muito
maior se o termo que inclui a relação entre os dois (T versus P) fizesse parte do modelo.
O controle do processamento avaliando a atividade residual após 24 horas demonstrou
uma grande tendência à irreversibilidade da inativação da enzima PPO na água de coco
usando APH.
A análise estatística evidenciou a importância do efeito combinado da pressão e
temperatura para a inativação da PPO. O conjunto de resultados mostrou a ineficiência do uso
de tratamentos por APH inferiores a 500 MPa e também do uso da APH à temperatura
ambiente, evidenciando a necessidade de condições mais drásticas para que as enzimas
deteriorantes da água de coco possam sofrer inativação. A necessidade de pressões acima de
600 MPa em processos que usam temperatura ambiente já foi documentado por outros autores
(CASTELLARI et al.,1997; GOMES e LEDWARD, 1996; SEYDERHELM et al., 1996;
WEEMAES et al., 1998).
4.4.3. Efeito da temperatura sobre a POD
Foram realizados também experimentos para avaliar o efeito isolado do aquecimento
sobre a peroxidase da água de coco. A água de coco foi aquecida dentro de tubos de vidro e
Resultados
107
rapidamente resfriado em banho de gelo, utilizando-se uma alíquota de 400 µL para a
avaliação da atividade da enzima. O restante do conteúdo foi conservado em banho de gelo
durante 3 horas, de onde foram retiradas alíquotas para avaliar o efeito do aquecimento
seguido pelo resfriamento rápido. Resultados referentes às duas situações estão representados
na Figura 26.
Figura 26: Cinética de inativação da peroxidase a 60ºC. Em (A): Efeito do aquecimento da água de coco seguido de resfriamento. Círculo em cinza escuro: atividade residual da POD avaliada em alíquotas retiradas durante aquecimento em banho termostatizado a 60°C. Círculos em branco: mesmas amostras avaliadas após 3,0 horas em banho de gelo. Em (B): Detalhes do início do aquecimento: avaliação realizada durante o aquecimento em novo ensaio.
O aquecimento da água de coco pura, sem o uso de pressão, equivale à condição
empregada para as amostras usadas como controle do Processo II (item 4.4.2), que mostraram
resultados de atividade residual da POD semelhantes ao perfil descrito acima. Estes valores
descrevem uma enzima bastante sensível à temperatura e a variações das condições de
manuseio e estocagem.
Em conseqüência destas flutuações não foi possível utilizar os modelos matemáticos
normalmente empregados para descrição da cinética de inativação enzimática pelo calor.
Vários autores, usado diferentes vegetais ou a enzima purificada descreveram o
Resultados
108
comportamento atípico da peroxidase (ADAMS, 1997; HENLEY e SADANA, 1985; KHAN
e ROBINSON, 1993; TAMURA e MORITA, 1975)
4.5. TRATAMENTO MATEMÁTICO DO EFEITO DA APH SOBRE AS ENZIMAS
POD E PPO USANDO DADOS EXPERIMENTAIS
4.5.1. Adsorção da POD à embalagem
Para superar as dificuldades encontradas na obtenção de resultados confiáveis, foi
necessário realizar o controle das embalagens usadas para o processamento da água de coco e
soluções da enzima. Várias embalagens, empregadas nas diferentes etapas de concentração e
purificação e outros procedimentos de rotina, foram avaliadas quanto ao grau de adsorção da
enzima POD à superfície destes frascos.
Para esta avaliação, as embalagens contendo água de coco (3 mL) foram armazenadas
durante 24 horas sob refrigeração ou à temperatura ambiente. Após este tempo, o conteúdo foi
desprezado e a embalagem lavada com água destilada por 3 vezes. Ao frasco ainda úmido foi
adicionada uma mistura de guaiacol e peróxido de hidrogênio (nas concentrações
normalmente usadas), que revelou a presença de POD adsorvida ao frasco. O efeito visual
pode ser observado na Figura 27.
A Figura 28 mostra os valores de atividade da enzima na água de coco armazenada
dentro de diferentes frascos, avaliada pela retirada de alíquotas após 4 horas à temperatura
ambiente ou 24 horas sob refrigeração. Todas as amostras, em maior ou menor grau,
mostraram valores de atividade da POD inferiores ao inicial.
Resultados
109
Figura 27: Avaliação da adsorção da enzima POD em diferentes superfícies, usando guaiacol e H2O2. Diferentes frascos em contato com água de coco durante 24 horas, esvaziados e enxaguados com água destilada. Em A: Tubos de ensaio (A1, A2 e A3) contendo previamente água de coco in natura; Em B: Recipientes de Teflon rígido contendo previamente: B1: água de coco in natura, B2: AC+0,003% Tween-80, B3: AC+0,003% AOT - bis(2-etilhexil) sulfosuccinato de sódio.
A medida da concentração de proteínas (A280) foi realizada na água de coco
conservada tanto nos frascos plásticos (tipo eppendorf, capacidade para 1 mL) como nas
amostras colocadas em tubos de vidro (tipo pirex, capacidade para 10 mL). Os valores obtidos
foram ligeiramente inferiores ao inicial e pouco conclusivos sobre a perda de proteína ou da
atividade enzimática.
O resultado obtido para a água de coco embalada em saco de diálise (protegido em
embalagem termossoldável fechada a vácuo) foi mais um indicativo da importância do tipo de
embalagem e mostrou a possibilidade do uso de substâncias tensoativas para evitar perdas de
enzima por adsorção à embalagem.
Resultados
110
Figura 28: Atividade da enzima peroxidase na água de coco após 4 h ou 24 h em contato com a embalagem (a 4ºC). Barra azul claro: EA POD avaliada imediatamente após descongelamento; Barras brancas: atividade avaliada em alíquotas retiradas da amostra após 4 horas em contato; Barras em cinza: atividade avaliada em alíquotas retiradas após 24 horas da amostra em contato com o recipiente. Barra azul escuro: atividade da água de coco mantida 24 horas em saco de diálise.
A constatação do fenômeno de adsorção mostrou a provável causa das flutuações da
medida da atividade da enzima POD durante as diferentes etapas de trabalho. Vários
resultados registrados até este momento foram reavaliados e relacionados à capacidade de
adsorção da enzima, que mostrou ser variável em função do material da embalagem, tempo de
contato da água de coco com o recipiente e dependente da temperatura usada.
A perda de enzima por adsorção não é um fator normalmente considerado durante os
testes para avaliação de sua atividade em alimentos.
Resultados
111
4.5.2. Adição de Tween 80
Para evitar a adsorção da peroxidase aos frascos foram testados diferentes surfactantes
não iônicos. Segundo Scopes, a maior parte das enzimas pode tolerar até 3% (peso/volume)
de detergente não iônico sem desnaturar (SCOPES, 1987). Tween 80, DTAB (brometo de
dodeciltrimetilamonio) e AOT (sulfosuccinato bis-(2-etilhexil) de sódio) foram testados. Os
melhores resultados foram obtidos empregando Tween 80 (Figura 27-B1), já que DTAB e
AOT (Figura 27-B2) não evitaram a adsorção nas concentrações usadas (entre 0,01 e 0,1%).
Tween-80 (éster de polietileno sorbitol de ácidos graxos) é um detergente não-iônico
não desnaturante, que possui normalmente 20 unidades de óxido de etileno, um sorbitol e uma
unidade de ácido oléico. É muito utilizado como agente solubilizante de enzimas de
membrana e para reduzir ligações não específicas a materiais hidrofóbicos. A concentração
micelar crítica do Tween-80 é de 0,0013 a 0,0015g/100mL (%). A ligação entre a peroxidase
de raiz forte e Tween 80 em concentrações abaixo da concentração micelar crítica (cmc) foi
avaliada por eletroforese capilar por Huang e colaboradores e os resultados mostraram que o
surfactante se mantém ligado à proteína provavelmente através de ligações hidrofóbicas
(HUANG et al., 2003).
A Figura 29B mostra os valores da atividade enzimática da POD obtidos pela adição
de Tween 80 à água de coco, em concentrações variando entre 0,001% e 0,004%.
Concentrações de Tween 80 abaixo de 0,002% resultaram em perda da enzima POD por
adsorção ao recipiente após 24 h de contato da água de coco com o frasco, o que foi
observado pela adição de guaiacol e peróxido de hidrogênio aos frascos enxaguados com água
destilada (Figura 29A).
Com o uso de 0,003% de Tween não foi observada adsorção da peroxidase ao
recipiente, ocorrendo também um discreto aumento na atividade da enzima. A adição da
mesma concentração do detergente resultou no aumento da atividade da enzima em todas as
Resultados
112
amostras, sendo a medida da atividade enzimática proporcional à quantidade de enzima usada
(volume de água de coco) conforme ilustra a Figura 29A. A literatura indica a faixa da
concentração micelar crítica (cmc) do Tween 80 entre 0,0013 e 0,0015%, ficando clara a
necessidade de uma concentração maior do que este limite para impedir a adsorção da POD à
superfície do recipiente.
Figura 29: Atividade da POD na presença de diferentes concentrações de Tween 80. Em (A): Teste de adsorção da POD nas embalagens previamente cheias de água de coco misturada com as concentrações de Tween 80 correspondentes em B e posteriormente esvaziadas e enxaguadas, adicionadas de guaiacol e peróxido de hidrogênio. Em (B): Valores da atividade da POD de alíquotas da água de coco + Tween 80 (em Teflon, 24 h) retirada antes do enxágüe: círculos em branco: valores obtidos em alíquota retirada imediatamente após enchimento do frasco; círculos em cinza: alíquotas retiradas após 24 h sob refrigeração, antes do enxágüe.
A padronização da metodologia para processamento da água de coco utilizando
embalagens de Teflon e a adição de 0,003% de Tween 80 possibilitou a obtenção de
Resultados
113
resultados reprodutíveis nos testes para avaliar a atividade residual da POD após diferentes
tipos de processamento. O uso dos frascos de Teflon tornou possível o controle da superfície
de contato da água de coco com a embalagem e o Tween 80 impediu a adsorção da peroxidase
à superfície da embalagem.
Durante a determinação da concentração ideal de Tween 80, experimentos pontuais
mostraram ocorrer aumento progressivo da atividade da POD com o aumento da concentração
do surfactante, até atingir concentrações próximas de 0,02%. A partir desta concentração a
atividade enzimática decai chegando até valores próximos à zero.
4.5.3. Processamento III: Processamento por APH em
embalagens de Teflon
As amostras foram preparadas como descrito em material e métodos e processadas
imediatamente ou mantidas sob refrigeração para processamento no mesmo dia do preparo. A
solução da enzima pura de raiz forte – HRP foi realizada em tampão MES para evitar
possíveis variações de pH em conseqüência da pressurização (KITAMURA e ITOH, 1987). A
adição de Tween 80 foi realizada imediatamente após descongelamento das amostras ou junto
ao preparo da solução de HRP.
As amostras foram preparadas segundo um procedimento padrão utilizando
embalagens e tampas de Teflon® rígido produzidas especialmente para ensaios em
equipamento de APH. A tampa com anéis de látex permitiu perfeita vedação e possibilitou a
compressão da amostra contida no interior. A embalagem com volume padronizado permitiu
controlar a superfície de contato entre o líquido e a embalagem.
As soluções foram acondicionadas nas embalagens de Teflon e pré-aquecidas por 1 a 2
minutos em banho termostatizado na temperatura desejada. Para o processamento industrial, é
Resultados
114
altamente recomendável que o pré-aquecimento seja rápido e que o processo por alta pressão
seja conduzido imediatamente após o pré-aquecimento.
O processamento de alimentos é caracterizado pela interação entre as condições
utilizadas. Para que o processo resulte no produto esperado é muito importante determinar a
melhor combinação entre todos os parâmetros empregados, sempre levando em consideração
os limites impostos pelo equipamento. A intensidade de um tratamento por APH está
diretamente relacionada ao valor de pressão escolhido, como também ao tempo durante o qual
esta pressão será aplicada e estes dois fatores podem resultar em diferentes respostas em
conseqüência da temperatura selecionada.
Foram empregadas temperaturas consideradas não agressivas às qualidades sensoriais
da água de coco (40 e 60ºC e temperatura ambiente – 20ºC, para controle), conjugadas a
diferentes níveis de pressão: 800 MPa (valor máximo permitido pelo equipamento) e valores
intermediários (300 e 500 MPa), durante 30, 60 e 90 minutos de processo, onde todas as
combinações foram realizadas em duplicata. Os parâmetros de processo empregados foram
escolhidos em conseqüência dos resultados previamente obtidos. As atividades residuais das
enzimas peroxidase e polifenoloxidase foram avaliadas imediatamente e 24 horas após o
processamento (mantendo as amostras sob refrigeração). Os resultados foram expressos como
percentual de atividade enzimática residual %EA T(0) e %EA T(24 h), onde os valores de
atividade da amostra controle, embaladas sob as mesmas condições e mantidas à temperatura
ambiente, foram considerados 100%.
Para este estudo foram realizadas 23 combinações entre os valores de pressão, tempo e
temperatura escolhidos para estudo (descritas na Tabela 6, em material e métodos) realizadas
em duplicata e que resultaram em 192 avaliações da atividade enzimática. Estes dados foram
analisados pelo programa STATISTICA, na forma de três blocos de variáveis independentes
Resultados
115
(pressão, temperatura e tempo) para cada uma das variáveis dependentes: POD ou PPO,
ambas em dois momentos, T(0) e T(24 h).
Nossos resultados registraram a inativação total das enzimas peroxidase e
polifenoloxidase empregando as condições extremas de pressão, temperatura e tempo (800
MPa - 60ºC - 90 min). Outras combinações resultaram em índices variáveis de atividade
residual, ocorrendo a ativação da POD com o uso de 300 MPa e 40ºC em 30 minutos e
redução da atividade da polifenoloxidase à metade após o uso de 500 MPa e 60ºC também em
30 minutos.
4.5.3.1. Peroxidase – T(0)
A análise de variância (ANOVA) dos resultados da atividade residual da peroxidase
em T(0) em função das variáveis independentes (pressão, temperatura e tempo de tratamento)
resultou no modelo expresso pela Equação 3:, construída empregando os valores originais de
cada variável independente (T: tempo, t: temperatura e P: pressão) e onde foram incluídos
somente os termos significativos (p<0,05).
Equação 3:
%EA PODAC T(0) = 43,8 + 3,74.T - 0,046.T2 + 0,31.P - 0,00043.P2 - 0,0023.T.P
Os níveis de significância de cada efeito foram obtidos pela interpretação do gráfico
de Pareto que consta da Figura 30. A retirada dos termos não significativos alterou a
importância relativa de cada variável remanescente, resultando em um novo gráfico onde
apareceram somente os termos significativos com os valores recalculados (gráfico não
apresentado). Todas as demais equações descritas nas próximas seções seguem estes mesmos
critérios.
Resultados
116
Figura 30: Gráfico de Pareto para POD - EA% PODAC T(0). Obtido a partir da análise de variância dos valores de atividade residual da peroxidase imediatamente após o processamento – Os valores das barras mostram a importância de cada parâmetro de processo (variáveis independentes: temperatura, tempo e pressão) e suas variações lineares (L), quadráticas (Q) e interação linear entre duas variáveis (1), (2) ou (3) sobre o efeito final do processamento (variável dependente - %EAPOD(T0)). A linha vermelha representa o nível de significância: à esquerda estão os efeitos (parâmetros) não-significativos (p>0,05), que não foram considerados para o modelo; à direita estão os efeitos significativos (p<0,05), que foram considerados para a construção do modelo representado pela equação.
Todos os resultados experimentais e os valores calculados pelo modelo obtido estão
descritos no Anexo 1.
O coeficiente de correlação ajustado (R2aj) determinado foi 0,73, indicando que o
modelo estabelecido pela análise estatística explica razoavelmente a variação da atividade da
peroxidase dentro das condições de processo estudadas. Os valores de R2 e R2aj podem ser
interpretados como a proporção de variabilidade ao redor da média da variável dependente e
mostra o quanto o modelo se ajusta aos resultados analisados. Quanto mais próximo a 1,0,
maior a relação entre os dados usados e a regressão (modelo) obtida.
Os valores de cada termo estão vinculados aos limites de cada variável independente
aos quais foram multiplicados (de 20 a 60ºC, de 30 a 90 min e de 0,1 a 800 MPa), desta forma
o peso de cada um dos parâmetros avaliados pode ser calculado individualmente para
Resultados
117
identificar a importância de cada fator ou como um produto único final que é obtido pela
equação (%EA PODAC). Por exemplo, considerando os limites de pressão com 799,9
unidades e de temperatura com 40 unidades, cada grau incrementado na temperatura equivale
a 19,99 unidades de pressão e o peso final de cada um será obtido quando for multiplicado
pelo coeficiente de regressão. O modelo pela equação acima pode ser representado por um
gráfico de superfície de resposta como o da Figura 31.
A equação 3 mostra a influência da pressão sobre os resultados finais do tratamento
empregado, pois aparece em todos os termos da equação (linear, quadrático e em interação
com a temperatura). O efeito quadrático negativo indica uma curvatura com concavidade para
baixo. O efeito linear positivo descreve o aumento da atividade residual da peroxidase em
função da pressão, que será referido como ativação enzimática e resulta em valores maiores
que o inicial, abrangendo uma grande região (entre 0,1 e cerca de 400 MPa). O termo com
sinal negativo, que descreve a interação entre a temperatura e a pressão, também foi
significativo para diminuição da atividade residual da peroxidase e reforça a importância do
efeito combinado entre estas duas variáveis para a eficiência do processamento.
O efeito linear positivo da temperatura indica existir uma temperatura superior à
inicial, onde a atividade é o máximo e foi considerado o principal fator no cálculo da ativação
da enzima, que ocorreu em todos os modelos obtidos para a peroxidase.
A Figura 31 representa a superfície de resposta usando a Equação 3, onde a
temperatura (T) foi mantida constante e os intervalos de pressão e tempo restritos aos valores
empregados experimentalmente (0,1 a 800 MPa e 30 a 90 minutos). Na Figura 31A, o modelo
representa o uso do processamento empregando temperatura fixa (40ºC), pressão entre 0,1 e
800 MPa e tempo de processo entre 30 e 90 min e mostra a ineficiência do uso de APH para
inativação total da enzima nesta temperatura, independente do tempo de processo e da pressão
empregada. Em (B), o gráfico resultante mostra a mesma relação, porém mantendo constante
Resultados
118
a temperatura de 60ºC, o que resultou na inativação total da peroxidase quando os níveis de
pressão foram próximos ao máximo (800 MPa), independente do tempo empregado. O
aumento em 20ºC alterou substancialmente os resultados do processamento, tornando viável o
emprego da APH visando à inativação da POD da água de coco.
Figura 31: Superfície de resposta: influência da pressão e tempo sobre a atividade da POD de AC tratada por APH em T(0), calculada empregando temperaturas de processo fixas. Quadro (A): 40ºC; quadro (B): 60ºC.
A Equação 1, obtida pela análise estatística, pode ser útil para calcular parâmetros de
processo que satisfaçam requisitos desejados. Desta forma, foi possível determinar que o
processo empregando 50ºC, 30 min e 800 MPa (que pode ser observado no gráfico
apresentado na Figura 32A), resulta em produto com um percentual de atividade residual
calculado (previsto) igual a -0,96, ou seja, o emprego da pressão a 50ºC, nestas condições,
seria suficiente para inativar a enzima peroxidase.
O emprego de pressões inferiores a 800 MPa resultou em produto com diferentes
níveis de atividade residual da POD. Experimentalmente, obteve-se uma atividade residual de
Resultados
119
cerca de 50% do valor inicial após um processamento empregando 500 MPa durante 30 min a
60ºC. A ineficiência de pressões inferiores para inativação da peroxidase também é descrita
por Seyderhelm, que indica uma retenção quase total da atividade da peroxidase de cenoura
após 30 min a 600 MPa e 60ºC (SEYDERHELM et al., 1996).
Para quaisquer valores de tempo ou temperatura mantidos constantes (Figura 31A e B
e Figura 32A), o efeito quadrático da pressão sempre resultou em superfícies de resposta
curvas. A concavidade para baixo indica que em determinadas condições de processo pode ser
atingido o máximo da atividade enzimática, onde os valores são acima daqueles obtidos para
amostras sem processamento (controle). As condições para ativação máxima da POD ocorrem
quando a temperatura está próxima de 40ºC e os valores de pressão entre 250 e 300 MPa; o
tempo de processo não é essencial para uma ativação máxima, assim como não é fator
importante para a inativação total da enzima. A ativação enzimática ocorre para todos os
níveis de temperatura e tempo empregados dentro de uma faixa bastante ampla de pressão.
Na Figura 32B, o gráfico mostra o ponto máximo de ativação que equivale a um
processo empregado 250 MPa e 40ºC durante 30 minutos, o que resultou em produto com
uma atividade residual prevista de 147,03%. Também ocorreu ativação da POD quando o
processo for conduzido a 60ºC, em valores mais baixos de pressão (valor calculado para o
máximo de ativação: 118,5% em processo empregando 200 MPa durante 30 min).
Os valores obtidos experimentalmente (Anexo 1) estão próximos aos calculados,
tendo o ponto de máxima ativação ocorrido com o emprego de 300 MPa, 40ºC e 30 minutos
onde a atividade enzimática média foi próxima a 160% da atividade inicial. Esta coincidência
de resultados indica que o modelo pode ser empregado para prever o resultado de processos
que não foram realizados, facilitando o planejamento de procedimentos práticos. O resultado
teórico pode indicar as melhores combinações para a inativação da enzima e também os
valores que poderiam conduzir a resultados pouco convenientes.
Resultados
120
Figura 32: Superfície de resposta para a atividade da POD -T(0) em condições específicas de processamento da água de coco: Em (A) Variações da atividade residual da POD empregando o modelo proposto com tempo fixo de 30 minutos e variando pressão e temperatura e que mostra os resultados empregando a combinação 50ºC, 30 min e 800 MPa. Em (B) Variação da atividade da POD fixando a pressão (250 MPa), que resulta em maior ativação da POD quando a temperatura for 40ºC.
O efeito da pressão e a importância da interação entre pressão e temperatura podem
ser avaliados quando são comparados aos valores das medidas de atividade residual obtidas
nas amostras (água de coco + Tween 80 0,003%) que sofreram apenas aquecimento (banho
termostatizado) sem pressurização. Alguns valores experimentais constam na Tabela 13, que
mostra resultados experimentais de %EA para as enzimas da água de coco mantendo as
amostras sob aquecimento (20ºC, 40ºC e 60ºC) com o uso ou não de diferentes níveis de
pressão. Os valores de atividade das enzimas expostas à temperatura em banho termostatizado
a 40 ou 60ºC foi somente ligeiramente diferente dos resultados obtidos nas amostras controle
(temperatura ambiente), sendo que a 60ºC após 90 minutos de aquecimento, foi constatada a
perda de apenas 5,4% da atividade da POD. Ocorreu cerca de 10 % de ativação da enzima
após exposição à temperatura de 40ºC, número bastante inferior ao valor obtido quando a
enzima foi pressurizada a 300 MPa nesta mesma temperatura.
Resultados
121
Tabela 13: Efeito da temperatura (com e sem pressurização) sobre a atividade residual da peroxidase da água de coco adicionada de 0,003% Tween 80 imediatamente após 90 minutos de processamento. Os resultados estão expressos em percentual de atividade residual em relação ao 1º controle (T ambiente).
4.5.3.2. Peroxidase – T(24 h)
Para o controle do efeito do processamento nas condições escolhidas foi importante
avaliar se o efeito da aplicação do processamento por APH em combinação com diferentes
valores de temperatura e tempo resultou na inibição permanente da atividade enzimática. A
reação enzimática pode ter sua velocidade aumentada ou inibida pela pressão, dependendo se
o volume relacionado com a reação for positivo ou negativo. A pressão induz modificações na
interação enzima-substrato e no mecanismo de reação, podendo ocorrer sobre uma etapa
particular limitante da velocidade ou sobre toda a velocidade catalítica. As alterações de
atividade causadas pelo processamento podem ser reversíveis ou irreversíveis e a inativação
está relacionada a mudanças conformacionais na estrutura da proteína. O efeito observado
depende do tipo de enzima, da natureza do substrato, parâmetros de pressão, temperatura e
tempo usados no processo (LUDIKHUYZE & HENDRICKX, 2001).
PEROXIDASE
PROCEDIMENTO 20ºC 40ºC 60ºC
Controle (T ambiente)* 100,0 100,0 100,0
0.1MPa** 100,0 109,1 94,4
300MPa 142,1 158,8 111,3
*Amostra controle, mantida embalada à temperatura ambiente sem pressão, durante o tempo de processo; **Banho termostatizado à pressão atmosférica (0,1 MPa) na temperatura indicada, controlada por termostato pressão.
Resultados
122
Todas as amostras processadas empregando 40 e 60ºC, 30 e 90 min e 0,1, 300, 500 e
800 MPa foram avaliadas após 24 h de armazenamento sob refrigeração. Os resultados
obtidos (%EA PODAC T 24 h) são explicados pelo modelo descrito na Equação 4, que usa os
valores originais significativos indicados pela análise estatística - ANOVA. Foi obtido um
valor de R2aj = 0,71, indicando um modelo que explica de forma discreta o que ocorre com a
peroxidase da água de coco após armazenamento das amostras processadas por APH.
Equação 4:
%EA PODAC T(24 h) = 0,94 + 6,82.T - 0,09.T2 + 0,124.P -0,0003.P2
Todos os valores experimentais e previstos pelo modelo estatístico estão listados no
Anexo 2.
O modelo mostra que os efeitos linear e quadrático da pressão continuam mantendo
uma grande influência sobre a atividade residual. Para T(24 h) a combinação entre
temperatura e pressão deixa de ser significativa (p>0,05) e aumenta a importância da
temperatura de processo, que tem influência na curvatura existente no modelo (termo
quadrático) e grande influência na ativação da enzima (termo linear positivo).
Na Figura 33, os gráficos de superfície de resposta representam os resultados obtidos a
partir do modelo proposto. Eles refletem discretas alterações na atividade residual da enzima
em relação aos valores obtidos em T(0), já que os valores da atividade enzimática aparecem
levemente inferiores. O efeito de ativação da enzima em conseqüência do processamento
persistiu mesmo depois do armazenamento e, principalmente, foi constatado que a inativação
total da enzima, observada ao final do processamento nas condições citadas anteriormente foi
mantida, podendo-se afirmar que a enzima foi totalmente inativada, não ocorrendo reativação
durante o armazenamento.
Resultados
123
Figura 33: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 4 para atividade residual da POD – T(24 h) da AC após processamento por APH e armazenamento do produto 24 horas sob refrigeração. Em (A): Processamento a 40ºC. Em (B): 60ºC.
Os resultados descritos acima contrastam substancialmente com aqueles obtidos
quando a água de coco foi processada sem a adição de Tween 80 (Processamento II – item
4.4.2.1.).
4.5.3.3. Polifenoloxidase – PPO T(0)
Os valores de atividade residual da polifenoloxidase obtidos imediatamente após o
tratamento da água de coco por APH – %EA PPOAC T(0) foram avaliados através da análise
de variância – ANOVA, resultando no gráfico de Pareto apresentado na Figura 34 e no
modelo descrito pela Equação 5, que utilizou os valores originais das variáveis significativas
(p<0,05). Para estes resultados, o coeficiente de correlação ajustado (R2aj) determinado foi
0,88, significando que o modelo descreve bem o efeito das variáveis independentes sobre a
atividade residual da PPO. Todos os valores experimentais obtidos e os valores previstos pelo
modelo estão listados no Anexo 1.
Resultados
124
Equação 5:
%EA PPOAC T(0) = 83,37 + 0,50.T + 0,35.t – 0,036.P – 0,012.T.t – 0,0015.T.P
Figura 34: Gráfico de Pareto para PPO – EA% PPO AC T(0). Obtido a partir da análise de variância dos valores de atividade residual da peroxidase imediatamente após o processamento.
A pressão é a variável independente com maior importância e sua influência negativa
é linear, o que indica um aumento gradativo da inativação com o aumento da intensidade,
sendo também negativa a influência da combinação entre a pressão e a temperatura. A
ausência de termos quadráticos indica um modelo predominantemente linear. A temperatura
contribuiu de maneira acentuada às características do processo, aparecendo como efeito
isolado e também conjugada tanto com a pressão como com o tempo. A influência positiva da
temperatura linear descreve uma tendência de aumento da atividade quando os fatores tempo
e pressão forem muito baixos, já que nas combinações a temperatura sempre aparece como
parâmetro de inativação.
As superfícies de resposta resultantes do emprego deste modelo proposto são
apresentadas na Figura 35, que mostra a importância do aumento da temperatura de 40ºC para
Resultados
125
60ºC e a conseqüente inativação da polifenoloxidase nas condições extremas. O quadro (A)
representa o processamento a 40ºC e indica que nesta temperatura, independente do aumento
da pressão e do tempo de processo, não ocorre inativação total da PPO, o que ocorre quando a
temperatura de processo for 60ºC (B).
Figura 35: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 5 para atividade residual da PPO – T(0) na água de coco. Para a construção dos dois gráficos foi avaliada a variação de pressão versus tempo de processamento mantendo a temperatura fixa. Em (A): 40ºC. Em (B): 60ºC.
O efeito linear negativo da pressão levou a uma expressiva diminuição da atividade da
enzima empregando menores níveis de pressão. O uso de pressões intermediárias, como no
processamento empregando 500 MPa a 60ºC durante 30 minutos, foi suficiente para reduzir a
atividade residual calculada a cerca de 40%. Isto indica ser possível o emprego de pressões
mais suaves quando o objetivo do processamento for a diminuição da atividade da
polifenoloxidase. É necessário considerar que a POD nestas condições mantém cerca de 80%
da sua atividade.
Resultados
126
Quando calculamos o valor da atividade residual da PPO nas condições mínimas
propostas para inativação da peroxidase (800 MPa, 50ºC por 30 min), o valor para a PPO
alcança valores próximos de 15%, o que indica não ter ocorrido inativação total da enzima
nestas condições. Para a PPO, o tempo de aplicação da pressão é uma variável significativa e,
desta forma, para que o processamento da água de coco ocorra com sucesso utilizando uma
temperatura mais suave, é necessário um maior tempo de processo.
Na Figura 36A, a superfície de resposta mostra as características do processamento
por 90 minutos, indicando as possibilidades de valores da atividade da enzima, calculadas
dentro do intervalo de temperatura e pressão iguais aos experimentais. O modelo mostra a
possibilidade do uso de 50ºC para inativação da polifenoloxidase, desde que o tempo
empregado seja ampliado para 90 minutos.
Figura 36: Superfície de resposta para a atividade da PPO – T(0), em condições específicas de processamento da água de coco: Em (A) Variações da atividade residual da PPO empregando o modelo proposto e tempo fixo de 90 minutos, variando pressão e temperatura; Em (B) Variação da atividade da POD fixando a pressão (800 MPa).
Resultados
127
É importante ressaltar que tanto para a PPO como para a POD, o uso de 800 MPa é
fator crítico para a inativação. Na Figura 36B, o gráfico mostra o efeito do uso de 800 MPa
nas diferentes condições de tempo e temperatura. A PPO foi mais resistente ao uso de 800
MPa porém mais sensível aos valores intermediários de pressão. O aumento da pressão foi
sempre acompanhado de decréscimo na atividade residual. A Tabela 14 mostra alguns valores
experimentais obtidos nas condições descritas neste parágrafo.
Tabela 14: Efeito da temperatura (com e sem pressurização) sobre a atividade residual da PPO da água de coco adicionada de 0,003% Tween 80, imediatamente após processamento, durante 90 minutos. Os resultados estão expressos em percentual de atividade residual em relação ao 1º controle (Tamb).
4.5.3.4. Polifenoloxidase – T(24 h)
A análise estatística dos valores da atividade residual da polifenoloxidase obtidos após
armazenamento – T(24 h) resultou no modelo apresentado na Equação 6. O coeficiente de
correlação ajustado (R2aj) para este modelo foi 0,8. Os valores experimentais obtidos e os
valores previstos pelo modelo estão listados no Anexo 2.
POLIFENOLOXIDASE
PROCEDIMENTO 20ºC 40ºC 60ºC
Controle a T ambiente* 100,0 100,0 100,0
0.1MPa** 100,0 88,2 74,3
300MPa 106,6 83,4 42,4
* T ambiente: Amostra mantida embalada à temperatura ambiente sem pressão durante o tempo de processo; ** 0,1 MPa: Amostra embalada, imersa em banho com água aquecida na temperatura indicada (controlado por termostato), sem o uso de pressão.
Resultados
128
Equação 6:
%EA PPOAC T(24 h) = 181,08 - 3,86.T + 0,05.T2 – 0,537.t - 0,0097.P – 0,003.T.P + 0,0007.t.P
Este modelo apresenta várias modificações em relação à equação obtida para T(0) e
foi usado para obter a superfície de resposta apresentada na Figura 37.
A combinação dos coeficientes de correlação positivos e negativos da temperatura,
isolada e em combinação com a pressão, demonstrou ocorrer um aumento da atividade da
PPO durante o armazenamento quando a temperatura de processo utilizada foi elevada e
tempo e pressão forem baixos. Este efeito pode ser visualizado na superfície de resposta da
Figura 37B, onde é descrito um processo conduzido a 60ºC durante 30 minutos.
A Figura 37A mostra os valores calculados (previstos) para a atividade residual
empregando 40ºC nos mesmos intervalos de pressão e tempo usados no quadro B. Os
resultados mostram dois pontos importantes: primeiro, o processamento a 40ºC não é
suficiente para inativar a enzima, independente das outras condições empregadas e, segundo,
a utilização de processos a 60ºC pode ocasionar o aumento da atividade da PPO durante o
armazenamento quando as pressões forem muito baixas, próximo a pressão atmosférica e o
aquecimento ocorrer durante pouco tempo.
Resultados
129
Figura 37: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 6 para a
atividade residual da PPO – T(24 h) na água de coco. Para ambos os quadros foram avaliados a variação de pressão versus tempo de processamento, mantendo a temperatura fixa. Em (A): Processamento a 40ºC. Em (B): 60ºC.
O emprego de pressões intermediárias não provocou maiores modificações durante o
armazenamento, desta forma, as amostras processadas a 500 MPa obtiveram os mesmos
valores de atividade residual referentes ao T(0), cerca de 40% do valor da amostra controle.
O cálculo da atividade residual nas condições mais amenas de processo propostas
inicialmente (50ºC, 30 min e 800 MPa) resultou em valores que indicam a inativação após o
armazenamento, o que não foi constatado imediatamente após o processamento.
4.5.4. Efeito da Alta Pressão Hidrostática sobre a enzima
HRP
4.5.4.1. Solução de peroxidase de raiz forte – atividade enzimática em T(0)
A equação resultante da análise de variância (ANOVA) do modelo de superfície de
resposta estudado é descrita pela Equação 7, obtida utilizando os valores originais e incluindo
somente os termos significativos (p<0,05). O coeficiente de correlação (R2aj.) foi 0,90
Resultados
130
indicando que a equação representa os valores experimentais de forma adequada. Todos os
valores experimentais obtidos e previstos pelo modelo estatístico estão listados no Anexo 3.
Equação 7:
%EA HRP T(0) = 175,39 – 1,38.T – 0,124.t – 0,125.P
A equação mostra influência de todos os parâmetros, na forma linear e negativa, sobre
a atividade enzimática residual da enzima HRP em solução. A pressão é a independente com
maior influência (valores entre 0,1 e 800 multiplicados por 0,125). O modelo é bastante
simples e aparece representado na Figura 38, de onde é possível deduzir que ocorre inativação
da enzima em qualquer condição de aumento de um dos parâmetros indicados. A Figura 38A
mostra que a enzima aumenta sua atividade quando mantida sob aquecimento a 40ºC
Figura 38: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 7 para atividade residual da POD da solução de enzima HRP em T(0). Solução da enzima em tampão MES 50 mM pH 5,8. Em (A): Tempo de processo fixo: 30 minutos; Em (B) Temperatura de processo fixa: 60ºC.
Resultados
131
O efeito da pressurização sobre a enzima peroxidase de raiz forte em solução de
tampão foi bastante eficiente, ocorrendo diminuição da atividade da peroxidase para todas as
combinações de temperatura e pressão, que não à pressão ambiente. O tempo de processo,
parâmetro não significativo no modelo obtido para a peroxidase da água de coco, teve maior
significado para inativação da peroxidase da enzima comercial.
O modelo apresentado na equação e descrito pelo gráfico de superfície de resposta da
figura anterior é bastante diferente do modelo obtido para a enzima peroxidase da água de
coco, principalmente por não ter sido detectado qualquer sinal de ativação da enzima nas
pressões intermediárias em qualquer nível de temperatura empregado. Foi observada maior
sensibilidade da enzima aos valores intermediários de pressão. Calculando a atividade
residual em processo empregando 500 MPa durante 30 minutos a 60ºC, obteve-se somente
25% de atividade residual.
O processo foi efetivo para a inativação da enzima usando 800 MPa em temperatura
superior a 50ºC para qualquer tempo de processo empregado.
4.5.4.2. Solução de peroxidase de raiz forte - atividade enzimática em T(24 h)
Os valores da atividade enzimática após o armazenamento foram obtidos para a
enzima em solução, e resultaram no modelo descrito pela Equação 8 (com R2aj. = 0,79),
obtidos após análise de variância e eliminação dos fatores não significativos. Todos os valores
experimentais obtidos e os valores previstos pelo modelo estão listados no Anexo 3.
Equação 8:
%EA HRP T(24 h) = 210,33-2,09.T+0,15.t-0,198.P-0,0.P2-0,01.T.t+0,002.T.P +0,0003.t.P
O modelo é bastante complexo se comparado ao modelo obtido em T(0). Todos os
fatores foram significativos, em grande parte com índices muito próximos de 0,05. Os
Resultados
132
resultados obtidos pela aplicação do modelo indicam que os valores da atividade enzimática
decrescem ligeiramente após 24 horas de armazenamento. Considerando as mesmas
condições de processo exemplificada para T(0) (500 MPa durante 30 minutos a 60ºC), o valor
previsto para atividade da POD permaneceu em 26%.
Figura 39: Superfície de resposta resultante do modelo proposto pela equação 8 para atividade residual da POD da enzima HRP em T(24 h), solução em tampão MES 50 mM (pH 5,8). Em (A): Tempo de processo fixo em 30 minutos; Em (B): Temperatura de processo fixa em 60ºC.
O modelo demonstra, principalmente, a eficiência do tratamento por alta pressão nas
condições empregadas, visto não ter ocorrido aumento da atividade residual após 24 horas.
Parâmetros empregados em processos que resultaram em inativação total da enzima (800
MPa, acima de 50ºC) foram confirmados experimentalmente e através do modelo.
Discussão
133
5. DISCUSSÃO
Independente de como o mercado possa classificar esta bebida, única nos seus
atributos, a ciência e a tecnologia podem desenvolver técnicas que permitam conhecer e
evoluir nos procedimentos que levem à melhor utilização da água de coco. A literatura técnica
é rarefeita de informações, além do mais, esta bebida possui peculiaridades que resultam em
uma série de dificuldades adicionais àquelas encontradas no processamento de sucos de frutas
em geral.
5.1. CARACTERIZAÇÃO DA ÁGUA DE COCO
Os valores encontrados na caracterização de um dos lotes (10 frutos) usado na
purificação da peroxidase: pH levemente ácido (5,8), baixo conteúdo de sólidos solúveis
(5,5ºBrix) e a presença de concentrações de 0,019 µmoles (tetraguaiacol).mg-1proteína.min-1
em peroxidase, descrevem um líquido com características ideais para a atividade de várias
enzimas e também para o desenvolvimento de microrganismos deteriorantes. Estas
características acarretam sérios problemas para todos que pretendem utilizá-lo, já que a
alteração da qualidade é imediata e ocorre em poucas horas, mesmo sob refrigeração.
Na água de coco, o surgimento de uma cor rosa é considerada uma das principais
alterações no produto processado e armazenado. A alteração da cor sugere a ação da
polifenoloxidase (FRIEDMAN, 1996; WEEMAES et al., 1998) e/ou da peroxidase (LU e
WITAKER, 1974; VEITCH e SMITH, 2001 e VEITCH, 2004) presentes no produto e o
controle destas enzimas, passa a ser uma condição para obtenção de um produto mais
aceitável.
Discussão
134
O rápido decréscimo da atividade da peroxidase observado nos primeiros
experimentos foi considerado um indicativo de instabilidade da enzima, dado contrastante
com registros que reconhecem a grande habilidade da água de coco em proteger elementos
biológicos. Esta propriedade é explorada empregando a água de coco como agente
conservador de células de animais (ANDRADE, 2002), líquido usado para conservação de
sêmen animal (ALMEIDA e SOARES, 2002) ou ainda como líquido natural único que
possibilita a expressão de proteínas recombinantes (BUSTAMANTE, 2004).
Na avaliação da água de coco fresca, mantida sob refrigeração, foi observada perda de
aproximadamente 90% da atividade da POD após 3 dias, não ocorrendo o mesmo com a
polifenoloxidase (perda inferior a 10%). Para compreender e avaliar estas flutuações foi
importante caracterizar a peroxidase e, desta forma, suprir a falta de informação da literatura
científica sobre esta enzima na água de coco.
A ultrafiltração foi escolhida para concentração da água de coco, resultando em
amostras (UF) com cerca de 10 vezes mais proteínas e com atividade relativa da peroxidase
cerca de 60 vezes maior do que a água de coco natural. Um método de ultrafiltração
semelhante foi descrito por Magalhães e colaboradores como procedimento para eliminação
das enzimas POD e PPO da água de coco. Os resultados mostraram ausência total da
peroxidase no líquido efluente (permeado), tanto utilizando membrana com corte de 25 kDa
como membranas de 50 kDa. O mesmo resultado não ocorreu para a polifenoloxidase que
apareceu discretamente no efluente obtido com o uso da membrana de 50 kDa
(MAGALHÃES et al., 2005).
A cromatografia de filtração em gel foi uma etapa inicial importante, mas não
suficiente, para a purificação da enzima. Nesta etapa também foi obtido o valor de peso
molecular (entre 44.000 e 47.000), superior ao encontrado utilizando a técnica de SDS-PAGE
desnaturante, que revelou valor entre 41.000 e 42.000. Duarte e colaboradores determinaram
Discussão
135
o peso molecular da peroxidase da água de coco usando cromatografia de filtração em gel,
obtendo peso molecular de 49.200, e 44.630 utilizando a técnica de SDS-PAGE (DUARTE et
al., 2002).
Para explicar a diferença dos valores obtidos em filtração em gel e SDS-PAGE,
podemos citar o fato das peroxidases serem altamente glicosiladas (POMAR et al., 1997) e
existirem várias isoformas (VEITCH, 2004). Estas características podem ter contribuído para
a variação do peso molecular calculado pela técnica de filtração em gel porque influenciam
fortemente a carga global da proteína e sua afinidade pela matriz (WESTERMEIER, 2001).
Para a determinação do peso molecular em SDS-PAGE os valores foram calculados
após a aplicação de amostras obtidas em várias etapas da purificação da enzima. Na
determinação do peso molecular usando estas amostras desnaturadas, o valor encontrado foi
semelhante à maioria dos valores indicados na literatura para peroxidase de outros vegetais.
Em kiwi, o peso molecular da POD foi descrito como sendo entre 40.000 e 42.000
(PRÉSTAMO e ARROYO, 1998), para amendoim foram obtidos valores entre 37.000 e
40.000 (O’DONNELL et al., 1992. Estes valores foram superiores ao PM calculado para a
isoenzima neutra do nabo – 36.000 (DUARTE-VÁZQUEZ, 2001).
O valor do peso molecular obtido pela aplicação das amostras não desnaturadas em
SDS-PAGE foi ainda menor (entre 38.000 e 41.000), conseqüência da migração diferenciada
ocasionada pela manutenção das características estruturais inerentes à enzima. Andrews e
colaboradores reportaram pesos moleculares de 43.000, 48.000, 53.000 e 58.000, relativos a
todas as bandas observadas em amostras não desnaturadas da peroxidase de tomates
(ANDREWS et al., 2000).
A água de coco concentrada não desnaturada apresentou três bandas com atividade
para a POD. Resultados ssim obtidos usando frações recolhidas durante a purificação
demostram a relação entre estas bandas e as isoenzimas observadas por isofocalização. A
Discussão
136
facilidade de uso sugere o emprego da técnica de SDS-PAGE usando amostras não
desnaturadas para o acompanhamento da purificação de uma única isoforma da peroxidase da
água de coco. Diferenças na seqüência de resíduos de aminoácidos da proteína e/ou
composição da cadeia lateral de carboidratos são descritas como características das diferentes
isoenzimas da peroxidase (WELINDER, 1992; GIJZEN e VAN HUYSTEE, 1994; VEITCH,
2004) e podem estar relacionadas com a obtenção das três bandas observadas.
Os melhores resultados para purificação da peroxidase foram alcançados quando as
amostras usadas para troca iônica foram previamente tratadas empregando concentrador tipo
absorção de solvente (Vivapore RC 30.000) com membrana de 30 kDa em recipiente
transparente padrão (SAN) composto por uma mistura de poliestireno e poliacrilnitrila. Houve
uma diminuição considerável dos contaminantes e, principalmente, não ocorreu perda de
atividade da enzima.
A técnica de focalização isoelétrica foi utilizada para identificar e caracterizar as
isoperoxidases da água de coco previamente observadas em gel SDS-PAGE empregando
condições não desnaturantes. Foram identificadas três importantes isoenzimas, todas aniônica,
com pI na faixa ácida (4,5 ; 5,0 e 5,2). A amostra obtida após fracionamento em coluna de
troca aniônica (previamente concentrada por ultrafiltração e eluída em coluna de filtração em
gel) também foi avaliada, revelando a eficiência deste procedimento para isolamento da
principal isoforma da peroxidase da água de coco (pI = 5,2). Acreditamos termos obtidos as
isoformas naturalmente presente na água de coco já que não foram utilizadas técnicas capazes
de produzir artefatos (DUNFORD, 1999).
Shannon, Kay e Lew descreveram um total de sete isoenzimas para a raiz forte
(SHANNON et al., 1966). A isoenzima HRP-C é a maior fração com pI = 8,8. Atualmente
são descritas até quinze isoenzimas da raiz forte e, eventualmente, outras isoformas
identificadas usando focalização isoelétrica são muitas vezes consideradas artefatos em
Discussão
137
conseqüência dos procedimentos adotados durante a purificação (ZAWISTOWSKI et al.,
1991; VEITCH, 2004). Na petúnia foram reconhecidas nove diferentes isoenzimas
(HENDRIKS, 1991) e em pêssegos foram observada duas isoformas básicas com pI próximo
a 8,0 e somente uma ácida (pI = 4,5) (ALBA et al, 2000). Vámos-Vigyázó sugeriu que a
variação do número de isoenzimas da peroxidase identificadas e caracterizadas em frutas e
hortaliças poderia estar relacionada ao estágio fisiológico dos frutos e às diferenças ecológicas
e ambientais, como também, aos diferentes procedimentos de identificação e de purificação
(VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
5.2. PROCESSAMENTO POR ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA
Para o desenvolvimento de processos utilizando a alta pressão hidrostática é essencial
conhecer as diferentes conseqüências do seu uso, isoladamente ou em conjunto com outras
variáveis, sobre a atividade das enzimas. Sabe-se que as enzimas, assim como todas as
proteínas, possuem diferentes índices de barotolerância e, além disto, mostram
susceptibilidade a distintos efeitos protetores em função da composição do líquido da solução
(matéria-prima) (SEYDERHELM et al., 1996). O caráter protetor de proteínas, lipídeos e
carboidratos é fator determinante para o efeito do processamento sobre a enzima ou qualquer
outro componente ou, até mesmo, sobre os microrganismos presentes no alimento (SIMPSON
e GILMOUR, 1997)
A avaliação da atividade da peroxidase durante a pressurização da água de coco foi
realizada após adição de seu substrato, H2O2 e guaiacol (item 4.4.1), empregando pressões até
300 MPa. Durante a pressurização a 40ºC, os valores de absorvância registrados mostraram
uma enzima resistente à pressão e um incremento em cerca de 6 vezes na atividade enzimática
em relação aos valores obtidos para a amostra não pressurizada. O efeito durante a
Discussão
138
pressurização usando 300 MPa a 25ºC foi mais discreto e o aumento da atividade enzimática
da amostra foi cerca de duas vezes o valor calculado para a amostra mantida à mesma
temperatura sem pressurização.
Resultados sobre a avaliação do efeito da pressão durante o processo são pouco
comuns. Os valores observados para a peroxidase da água de coco contrastam com os valores
obtidos por García e colaboradores, que observaram não ter ocorrido alteração da velocidade
de reação da HRP em solução durante a pressurização a 300 MPa, independente da
temperatura usada (25 ou 40ºC) (GARCÍA et al., 2002).
5.2.1. Uso da pressão à temperatura ambiente usando água
de coco pura
Nesta primeira etapa o efeito do processamento por alta pressão hidrostática sobre as
enzimas POD e PPO da água de coco foi avaliado empregando um equipamento semi-
industrial e amostras de água de coco pura, embaladas em filme flexível. Os resultados
detalhados no item 4.4.2 mostram duas enzimas bastante diferentes entre si e resultados
difíceis de avaliar. A polifenoloxidase da água de coco mostrou evidências de uma forte
resistência ao processamento por APH nas condições usadas e a peroxidase mostrou
resultados confusos, pouco reprodutíveis e, consequentemente, considerados pouco
confiáveis. Independente das dificuldades de avaliação destes resultados, ficou evidente a
ineficácia do processamento da água de coco por APH usando temperatura ambiente quando
foi observado aumento da atividade da POD em avaliação realizada 24 horas após o
processamento e a alteração do produto após sete dias de armazenamento.
Os valores da atividade enzimática residual, obtidos após o final do processamento
usando 600 MPa, mostraram que a polifenoloxidase sofreu redução em cerca de 40% da
atividade inicial, independente do tempo de processo. Pressões inferiores resultaram em
Discussão
139
valores proporcionalmente maiores. A enzima peroxidase apresentou valores semelhantes ao
inicial nos processos empregando pressões inferiores a 500 MPa e atividade residual abaixo
de 50% do valor inicial quando foram empregados 500 ou 600 MPa. Ocorreram alterações
importantes dos valores da POD após 24 horas, elevando a atividade residual aos níveis
semelhantes ao inicial.
Não existe referência sobre o efeito do tratamento por APH sobre as enzimas POD ou
PPO da água de coco, porém a ineficiência da pressurização à temperatura ambiente (20ºC)
para a inativação da peroxidase de outros vegetais está bem descrita para outros vegetais. Van
Buggenhout e colaboradores descreveram uma redução muito discreta na atividade destas
enzimas após processamento de tomate e cenoura e também das enzimas puras obtidas destes
mesmos vegetais, preparadas em sistemas padrões e processadas empregando valores de
pressão entre 0,1 e 500 MPa (VAN BUGGENHOUT et al., 2006). Em cenoura, Seyderhelm e
colaboradores, mostraram a retenção quase total da atividade da peroxidase empregando 600-
700 MPa a 25ºC (SEYDERHELM et al., 1996). Temperaturas levemente superiores (35ºC)
também foram ineficientes para inativar a POD em pressões até 600 MPa, sendo registrado
aumento da estabilidade da enzima empregando pressões abaixo de 396 MPa (SOYSAL,
2004). Para ervilha (QUAGLIA et al., 1996), o tratamento à temperatura ambiente usando 900
MPa por 10 minutos não foi suficiente para inativação total, resultando na redução de 88% da
atividade da POD. Em maçãs o uso de pressão entre 800 e 1000 MPa a 20ºC não foi
suficiente para inativar a POD (PRÉSTAMO et al., 2001).
Em purê de abacate (guacamole) a PPO foi descrita como a principal enzima
deteriorante, não sendo inativada totalmente por processo empregando até 517 MPa durante
30 minutos à temperatura ambiente, levando a alterações da cor do produto durante o
armazenamento (LÓPEZ-MALO et al., 1998). Gomes e Ledward descrevem a ativação da
PPO empregando pressão à temperatura ambiente em fatias de maçã processadas durante 10
Discussão
140
min a 800 MPa (GOMES e LEDWARD (1996). Hernández e Cano indicam o aumento da
atividade da PPO de purê de tomates (HERNÁNDEZ e CANO, 1998). Asaka e Hayashi e
Asaka e colaboradores, descreveram a PPO de extrato livre de células de peras como sendo
ativadas por pressão entre 400-600 MPa (ASAKA e HAYASHI, 1991 e ASAKA et al. 1994).
Atividade residual após tratamento por APH a 20ºC ocorre inclusive com outras
enzimas mais sensíveis, como a hidroperóxido liase de tomate que retém cerca de 20% de sua
atividade, mesmo após tratamento a 650 MPa durante 12 minutos (RODRIGO et al., 2006).
Os autores relacionam a intensa atividade da enzima como conseqüência do método extrativo,
muito agressivo, utilizando intensa agitação com Triton X-100.
5.2.2. Efeito da temperatura combinada ou não com alta
pressão hidrostática
Para distinguir o efeito da pressão e da temperatura e descrever a cinética de
inativação da peroxidase pelo calor, foram realizados testes aquecendo a água de coco pura a
60ºC sem pressurização. Foram necessários menos de 100 segundos de aquecimento nesta
temperatura para que a atividade residual da enzima na alíquota avaliada fosse nula.
Existem poucas indicações sobre o efeito de processos que empreguem o calor sobre
as enzimas da água de coco. Em estudo conduzido por Campos e colaboradores, a peroxidase
da água de coco verde foi inativada por aquecimento a 90ºC após 310 segundos, e se mostrou
mais sensível que a polifenoloxidase, que foi inativada após 550 segundos nesta temperatura
(CAMPOS et al., 1996). Os autores descreveram a ocorrência de modificações acentuadas na
qualidade sensorial da água de coco ao término do tratamento. Murasaki e colaboradores,
usando 90ºC, mostraram uma peroxidase bastante sensível, inativada com menos de 100
segundos de aquecimento, enquanto que a PPO mostrou a necessidade de um tempo maior
para inativação (400 segundos), mas em ambos os casos, a inativação foi parcial. O autor
Discussão
141
destacou a contradição entre os resultados obtidos e as reconhecidas características de
termoresistência da peroxidase (MURASAKI et al., 2003). Em trabalho conduzido por Mujer
e colaboradores, a peroxidase da polpa do coco (endosperma) foi totalmente inativada após
aquecimento por 15 min a 100ºC (MUJER et al., 1983).
Nos experimentos realizados a peroxidase apresentou curvas não-lineares com
aproximadamente três fases: inicialmente, uma linha reta inclinada por um período
relativamente curto, a seguir uma porção curva intermediária e finalmente uma linha quase
reta, mas com pouca inclinação como terceira fase (Figura 26). Resultados semelhantes,
descrevendo uma cinética de inativação pelo calor em 3 fases, foram observados e descritos
para vários vegetais. Forsyth e colaboradores descreveram o comportamento cinético da POD
da couve-de-bruxelas frente ao tratamento térmico como trifásico e mostraram que as
isoenzimas aniônicas possuíam uma grande regeneração da atividade enzimática após o
tratamento térmico. Os autores indicaram a habilidade da enzima em readquirir o grupo heme
previamente liberado como principal causa desta propriedade (FORSYTH et al., 1999).
A característica não-linear e as diferentes fases de inativação da POD em vegetais
foram descritas por vários autores. Em alguns estudos a fase de latência inicial e a não-
linearidade da cinética da peroxidase foram relacionadas à presença de diferentes
isoperoxidases termoestáveis e termolábeis no alimento in natura (LING & LUND, 1978;
MCLELLAN e ROBINSON, 1987). Entretanto Forsyth e colaboradores (1999) observaram
que, mesmo após a purificação das isoformas, as curvas de inativação se apresentaram de
forma não linear fazendo parte de um fenômeno bastante complexo (FORSYTH et al., 1999).
Lopez e colaboradores descreveram este fato como conseqüência de diferentes estados de
agregação da proteína (LOPEZ et al., 1994). Henley e Sadana associaram este fenômeno com
características de termoestabilidade distintas para cada isoenzima em conseqüência de uma
Discussão
142
cinética de inativação com a formação de intermediários parcialmente inativos (HENLEY e
SADANA, 1985).
Em 1975, Tamura e Morita sugeriram a perda do grupo heme e a formação de uma
apo-proteína após o aquecimento (TAMURA e MORITA, 1975). Adams mostrou que
fragmentos de heme foram formados durante a inativação de uma solução da enzima de raiz
forte, sendo a cinética não linear de inativação pelo calor conseqüência da recuperação e
regeneração da atividade da peroxidase em pH ácidos e indicou ser a variação na regeneração
a maior causa para um comportamento não-linear da enzima. Adams reafirmou este fato após
a observação da ocorrência de uma cinética simples de primeira ordem quando não ocorre
regeneração após aquecimento da enzima em condições neutras (ADAMS, 1997).
Khan e Robinson identificaram uma grande estabilidade da POD de manga em
processamentos térmicos, o que foi atribuído à maior proporção de hidróxi-aminoácidos em
uma das isoformas purificadas. A falta de linearidade obtida na inativação desta isoenzima
pura foi relacionada à micro-heterogeneidade conseqüente da presença de quantidades
variáveis de carboidratos neutros covalentemente ligados que não afetam a ponto isoelétrico,
mas podem afetar a termoestabilidade. Os autores ressaltam que este fato ainda não foi
provado (KHAN e ROBINSON, 1993). A peroxidase de uma palmeira africana mostrou uma
estabilidade enorme numa faixa de pH entre 2 e 12, com a manutenção da atividade após
tratamento térmico a 70° C por 1 h, com manutenção total quando o pH foi mantido perto da
neutralidade (pH ótimo), mas com resultados discretamente inferiores em pH entre 4 e 11
(SAKHAROV e SAKHAROVA, 2002).
Os primeiros resultados obtidos durante o controle do efeito do processo de
pressurização da água de coco pura mostraram a enzima peroxidase como sendo bastante
sensível ao calor (Figura 24A, item 4.4.2), com perfil semelhante a vários exemplos
encontrados na literatura. Em goiaba, o efeito da temperatura, avaliado imediatamente após o
Discussão
143
processo indica perda total de atividade empregando aquecimento por 88-90ºC durante 24
segundos (YEN e LIN, 1996). No extrato bruto de quiabo em frações obtidas em filtração em
gel, os valores de temperatura necessária para inativar cerca de 50% da enzima foi 60ºC por 5
min e a 70ºC pelos mesmos 5 min a atividade remanescente chega a menos de 10% nas
alíquotas retiradas na amostra em aquecimento (YEMENICIOGLU et al 1998). O perfil de
inativação térmica descrito por Boucoiran para a POD de batatas, após um tratamento de
cerca de 5 min a 80ºC, revelou uma enzima com inativação constante e quase linear
(BOUCOIRAN, 2000).
A interpretação dos resultados da cinética de inativação da peroxidase da água de coco
pelo calor e a semelhança com aqueles obtidos para peroxidases de vários outros vegetais
poderiam explicar os valores flutuantes e irregulares obtidos durante a pressurização das
amostras usando temperaturas acima da temperatura ambiente. Nossos resultados apontavam
uma enzima sensível, diferente das características esperadas para uma enzima cuja detecção é
indicada como medida da eficiência do tratamento térmico sobre o alimento (FELLOW,
2006).
Foram realizados controles em situações de variações discretas no tempo ou
temperatura de armazenamento das amostras e os resultados não foram suficientes para
sugerir uma resposta sobre o comportamento da POD. Tokarska e colaboradores também
observaram ocorrer flutuação de atividade da peroxidase mantida em ambiente com
temperatura e luz controladas durante 72 a 144 horas. Os autores relacionaram os resultados a
mudanças espontâneas e específicas na estrutura tridimensional da enzima (TOKARSKA et
al., 1993).
Discussão
144
5.2.3. Porque a adsorção deve ser um parâmetro
considerado
A resposta para as constantes variações da atividade da peroxidase, observadas
durante a execução de diferentes técnicas ou processos utilizando a água de coco ou uma
solução da enzima comercial, foi obtida após a verificação da adsorção da enzima aos frascos
e embalagens. A adsorção da POD às paredes dos frascos foi constatada visualmente pela
adição dos substratos (guaiacol e peróxido de hidrogênio em tampão) aos frascos vazios (após
contato com a água de coco), como descrito no item 4.5.1. Na avaliação de alíquotas do
conteúdo, foi verificada perda rápida (poucas horas) da atividade da POD. A adsorção da
enzima aos frascos justifica os baixos valores de atividade observados nas alíquotas de água
de coco avaliadas, que devem ser relacionados à perda de enzima e não à perda da atividade
da enzima.
A adsorção da enzima peroxidase à embalagem é favorecida por temperaturas
próximas a 40ºC, ocorrendo mesmo à temperatura de refrigeração ou próximas de 60ºC. De
posse destas informações, reavaliamos o gráfico que mostra a “inativação” da peroxidase com
emprego de 60ºC (Figura 26) e sugerimos que a atividade da POD ali descrita indique o perfil
aproximado da adsorção da enzima à embalagem. Entretanto, é necessário cautela,
principalmente porque resultados posteriores indicaram ocorrer, paralelamente à adsorção, a
ativação da peroxidase pela temperatura.
Gebicka e Jurgas descreveram a perda de atividade da peroxidase de raiz forte em
solução (HRP) como conseqüência de diferentes mecanismos tais como desnaturação, danos
oxidativos, inibição, contaminação por microrganismos e adsorção por superfícies sólidas.
Sendo que a adsorção da enzima pela superfície de vidro foi considerada não uma perda de
atividade, mas uma perda de enzima (GEBICKA e JURGAS, 2004).
Discussão
145
A capacidade de adsorção da peroxidase em superfícies sólidas foi descrita por
Kawaguchi e colaboradores que avaliaram a adsorção da peroxidase (HRP) em suportes
derivados do látex, sintetizados com diferentes composições e testados em soluções bastante
diluídas da enzima. A peroxidase de raiz forte demonstrou uma acentuada adsorção ao
derivado homopoliestireno, extremamente hidrofóbico, em conseqüência da menor polaridade
da peroxidase e de seu maior peso molecular e, de maneira menos acentuada, mas constante,
aos outros derivados mais hidrofílicos de látex. Neste experimento a adsorção da POD não foi
considerada muito dependente da concentração de eletrólitos em solução, já que as forças
eletrostáticas e pontes de hidrogênio pouco contribuem para o fenômeno de adsorção da
enzima ao látex. A atividade da POD adsorvida às partículas de tamanho uniforme foi
independente da estrutura da superfície e resultou em enzima adsorvida com atividade
enzimática ligeiramente inferior (cerca de 0,8 vezes) à atividade da enzima nativa. Foi
observado também a ocorrência do fenômeno de dessorção da enzima para todos os sistemas
criados (KAWAGUCHI et al., 1985).
Berkowitz e Weber demonstram a inativação in vitro da HRP por frascos de
poliestireno usados na execução de imunoensaios e a possibilidade de evitar esta inativação
pelo uso de Tween. Os autores citaram a diferença de estabilidade da POD em relação à PPO,
já que a última pôde ser extraída e permaneceu com atividade constante durante um mês a
4ºC, enquanto que a POD desapareceu após 6-8 horas (BERKOWITZ e WEBER, 1981).
5.2.4. Entendendo as flutuações da atividade da peroxidase
A dessorção, fenômeno subseqüente à adsorção, foi considerado a causa do aumento
da atividade da POD observada 24 horas após o processamento (T24 h). Este fato, não
coincidentemente, ocorreu somente nos testes onde a baixa atividade enzimática foi
relacionada à adsorção da enzima ao recipiente. A recuperação de atividade da peroxidase foi
Discussão
146
verificada nas amostras de água de coco pura embalada em sacos flexíveis e aquecidas e/ou
pressurizadas, avaliadas nos tempos T(24 h) e T(7 d). Os resultados descritos mostram uma
elevada “recuperação” da atividade da POD após 24 horas, principalmente após
processamento empregando 40ºC (Figura 24-B). Esta recuperação poderia ser interpretada
como regeneração da enzima e, consequentemente, de sua atividade. A idéia de recuperação
da atividade da enzima em solução é bastante explorada e documentada e geralmente
identificada como regeneração da estrutura da enzima. Vários alimentos processados por
calor, por alta pressão, ou ambos, foram descritos pela habilidade da regeneração da atividade
da peroxidase durante o armazenamento.
O aumento da atividade enzimática após 24 h nas amostras de água de coco pura
pressurizada a 40ºC (item 4.2.2), foi semelhante aos resultados descritos por Soysal que
quantificou o efeito da combinação do uso de pressão e temperatura sobre a peroxidase de
cenoura. Nos resultados, o autor descreve maior perda de atividade da peroxidase de amostras
mantidas em banho a 45ºC à pressão atmosférica durante 15 minutos do que em amostras
pressurizadas (100 a 396 MPa) usando a mesma temperatura e tempo (SOYSAL, 2004).
Estudos sobre a enzima peroxidase da batata após tratamento térmico (entre 70 e
100ºC) mostram a reativação da enzima após incubação do extrato de batata a 23ºC durante
três horas, quando ocorre entre 10 a 60% de regeneração da atividade (BOUCOIRAN, 2000).
A peroxidase do tabaco foi definida como possuindo boa estabilidade térmica (65ºC) e
mostrou restauração da atividade perdida durante o aquecimento em conseqüência da
incubação das amostras a 4ºC por 1 hora (GAZARYAN et al., 1996). Adams, usando a
enzima pura – HRP em solução, concluiu ser a regeneração da atividade da POD a causa da
cinética de primeira ordem não linear da inativação térmica (ADAMS, 1997).
A metodologia para cálculo da taxa de regeneração inicia, normalmente, com a
retirada de alíquota da solução a partir de amostras conservadas em banho aquecido e
Discussão
147
termostatizado. Forsyth e colaboradores mostraram a regeneração da peroxidase em amostras
tratadas por calor durante 2 minutos a 60ºC em micro tubos contendo 70 µL de solução de
enzima. Para monitorar a regeneração, as amostras tratadas foram resfriadas a 30ºC e
alíquotas foram avaliadas durante as 2,5 horas subseqüentes (FORSYTH et al., 1999).
5.2.5. Uso de surfactantes: padronização das causas e dos
resultados
Durante os testes utilizando sacos de celulose para diálise como embalagem para a
água de coco (recobertos por filme termosoldado impermeável), foi constatado aumento da
atividade da POD (entre 350 e 550% em relação à atividade inicial). A presença de glicerol,
usado como umectante (Sigma D9277) e responsável pelo resultado, mostrou a possibilidade
do uso de substâncias tensoativas para evitar a adsorção da peroxidase às embalagens.
A adição de 0,003% de Tween 80 na água de coco e na solução da peroxidase de raiz
forte foi suficiente para evitar perdas de enzima por adsorção ao recipiente e, em
conseqüência, falsos resultados na medida da atividade residual. A concentração usada, pouco
acima da concentração micelar crítica (cmc), aumentou discretamente, porém de forma
proporcional, a atividade da enzima. O uso deste tensoativo permitiu que a medida da
atividade da enzima, avaliada em alíquotas, revelasse com precisão a modificação da
atividade enzimática no produto final após cada processamento. Seu uso deve ser restrito às
amostras usadas para avaliação da atividade residual da POD e não ao produto “água de coco”
a ser utilizado para consumo.
Davletshin e Egorov avaliaram a ação de surfactantes não iônicos sobre a peroxidase
de raiz forte e revelaram diferentes fases de ativação e inativação da enzima (DAVLETSHIN
e EGOROV, 2000). Marcozzi e colaboradores constataram que a adição de cloreto de
benzalcônico a 0,01% (= 0,3 mM) aumentou a atividade da lactoperoxidase em 30% nas
Discussão
148
primeiras 2 horas, quando comparado à atividade da enzima pura em solução tampão,
provavelmente em conseqüência de interações hidrofóbicas e eletrostáticas com este
surfactante catiônico. Os autores descreveram esta superatividade como um comportamento
anormal, conseqüência da organização lenta do sistema. Além disto, o uso do surfactante
levou a preservação da atividade da enzima por até 10 dias, enquanto que a enzima nativa
perderia a atividade em até 3 dias. Assim, sugeriram que a presença do surfactante mantém a
estrutura secundária e cria um ambiente mais hidrofóbico para a enzima (MARCOZZI et al,
1998).
Segundo Celej e colaboradores, os resultados obtidos na avaliação da α-quimotripsina
em solução de CTAB (brometo de hexadeciltrimetilamônio) através de estudos
espectroscópios de fluorescência intrínseca do triptofano, dicroísmo circular e FTIR
(espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier), demonstraram que o
aumento na eficiência catalítica pode estar relacionado não somente à distribuição da enzima
e do substrato entre as pseudo-fases aquosas e micelar, mas também a uma discreta
modificação na conformação da proteína (CELEJ et al., 2004).
5.2.6. Modelagem estatística e estudo do efeito da APH sobre
as enzimas deteriorantes da água de coco
Para a correta avaliação do efeito do processamento por APH sobre as enzimas da
água de coco e da solução de HRP foram adicionados 0,003% de Tween 80 a cada uma das
soluções antes do tratamento. Considerando alguns resultados previamente obtidos (água de
coco processada em embalagens flexíveis), não foi utilizado pressão à temperatura ambiente,
o limite máximo de pressão foi elevado para 800 MPa e o tempo máximo de processo
aumentou para 90 minutos.
Discussão
149
As combinações entre as variáveis independentes (parâmetros de processo): 3 níveis
de temperatura (20, 40 e 60ºC), 3 níveis de tempo (30, 60 e 90 minutos), 4 níveis de pressão
(0,1, 300, 500 e 800 MPa), além da a realização de duplicatas, resultaram em 56 diferentes
processos e 192 medidas de atividade enzimática para a água de coco e igual número para a
solução de peroxidase de raiz forte. Com o uso do programa STATISTICA, empregando o
módulo de Desenho Experimental (DOE) do Método de Estatística Industrial & Six Sigma,
estas medidas resultaram na construção de modelos representados por uma equação
polinomial para cada variável dependente (atividade enzimática residual - %EA para PODAC
T(0), PODAC T(24 h), PPOAC (T0), PPOAC T(24 h), HRP (T0) e HRP T(24 h)). Utilizando
estes modelos foi possível descrever graficamente os valores experimentais obtidos e calcular
valores de atividade enzimática residual prevista para o emprego de valores de parâmetros de
processo não utilizados experimentalmente (mas compreendidos dentro dos intervalos
utilizados).
O valor do coeficiente de correlação ajustado (R2aj) forneceu uma noção rápida sobre
o nível de ajuste dos resultados. Para a polifenoloxidase, os R2aj foram sempre maiores
(próximos a 1,0) do que para a POD, significando maior adequação dos modelos obtidos aos
valores usados. O gráfico de Pareto foi um recurso usado para identificar os termos
significativos (p<0,05) obtidos na relação entre as variáveis independentes empregadas
(tempo, temperatura e pressão) nas formas linear, quadrática ou combinada.
Reprodutibilidade, foi o primeiro resultado importante alcançado pelo uso do
protocolo proposto, o que resultou na obtenção de resultados confiáveis que permitem afirmar
ter ocorrido inativação total das enzimas peroxidase e polifenoloxidase da água de coco
empregando algumas combinações experimentais (p. ex.: 800 MPa, 60ºC e 90 minutos) ou em
condições previstas dentro da superfície de resposta (p. ex.: 800 MPa, 50ºC e 90 minutos). A
inativação total da peroxidase pode ocorrer empregando 800 MPa, 50ºC e 30 minutos, o que
Discussão
150
mostra uma enzima mais sensível (se assim podemos dizer) do que a PPO. Todos estes
resultados descrevem duas enzimas barorresistentes. Avaliando os resultados do aquecimento
das enzimas por 90 minutos a 60ºC podemos dizer que são também termorresistente, já que a
peroxidase não sofreu alteração (manutenção de 95 a 100% da atividade inicial) e a
polifenoloxidase, ligeiramente mais sensível ao calor, manteve cerca de 70% da atividade
inicial após ser submetida às mesmas condições.
A baroestabilidade da peroxidase é descrita por Seyderhelm e colaboradores que
indicam uma retenção quase total da atividade da POD de cenoura após 30 min a 600 MPa e
60ºC (SEYDERHELM et al., 1996). Quaglia e colaboradores indicam 12% de POD residual
para a peroxidase de feijões verdes quando tratada a 900 MPa, 60ºC por 5 minutos
(QUAGLIA et al, 1996).
O controle do processamento avaliando a atividade residual após 24 horas – T(24 h)
demonstrou a eficiência do tratamento usado, já que os valores da atividade residual da POD e
PPO após um dia sob refrigeração foram semelhantes aos valores iniciais – T(0). Este fato
pode ser considerado indicativo de que as alterações ocorridas na estrutura da peroxidase
estariam relacionadas a rearranjos estruturais ocasionados pela ação conjunta da pressão e da
temperatura e que este fato não teria sido alterado substancialmente durante o armazenamento
sob refrigeração. Estes resultados foram opostos àqueles obtidos para as amostras de água de
coco natural submetidas ao processamento por APH em embalagens flexíveis sem a adição de
Tween 80.
A queda da atividade da PPO da água de coco foi proporcional ao aumento da pressão
e da temperatura nos processos empregando valores intermediários de pressão, decrescendo a
influência da intensidade de pressurização em processos acima de 500 MPa. Utilizando o
modelo obtido foi possível prever 60% de inativação da enzima empregando 500 MPa a 60ºC
Discussão
151
durante 30 minutos. É necessário considerar que a POD nestas condições mantém cerca de
80% da sua atividade.
Os valores da atividade residual da PPO foram usados para comparação dos dois
processamentos semi-industriais empregados: Processamento II – em embalagens flexíveis
usando a água de coco pura (item 4.4.2) e Processamento III – em embalagens rígidas, com
adição de 0,003% de Tween 80 (item 4.5.3). A polifenoloxidase apresentou resultados
reprodutíveis e semelhantes em ambas as condições, revelando que a adição de Tween 80 não
alterou a avaliação da atividade residual da enzima e que, portanto, o uso do surfactante não
alterou a importância do estudo realizado.
Na avaliação da atividade da polifenoloxidase após armazenamento por 24 horas, o
modelo matemático descreveu modificações em relação ao modelo obtido em T(0). Esta
mudança pode estar indicando a ocorrência de alterações na enzima como conseqüência da
pressurização, mas que ocorrem durante o armazenamento. Não ocorreu ativação da
polifenoloxidase da água de coco como conseqüência do emprego da pressão, porém ocorreu
uma discreta ativação da enzima em conseqüência do aquecimento durante o armazenamento
sob refrigeração.
Em estudo avaliando o grau de inativação de enzimas sabidamente resistes à pressão,
Bayindirli e colaboradores observaram que em sucos de maçã, laranja, cereja e damasco, o
emprego de 450 MPa a 50ºC durante 60 minutos resultaram em mais de 90% de inativação da
polifenoloxidase (BAYINDIRLI et al., 2006). Processos conduzidos a temperatura ambiente
descrevem a PPO de cogumelos (tirosinase comercial em solução) com um discreto aumento
a 100 MPa e uma atividade residual de 64% a 300 MPa (VAN BUGGENHOUT et al., 2006).
Tratamento de solução da enzima PPO de cogumelo (tirosinase comercial de em tampão
fosfato) foi realizado à 800 MPa durante 10 e 20 min ocorrendo uma diminuição da atividade
da PPO em 28 e 43% respectivamente (HAYAKAWA et al., 1996).
Discussão
152
Outro resultado importante, mesmo que contrário aos objetivos do estudo, foi a
constatação do efeito ativador da pressão sobre a enzima peroxidase, bem definido pela
superfície côncava das superfícies de resposta obtidas. O aumento ocorreu em conseqüência
do uso de pressões baixas e médias (entre 0,1 e 400 MPa) a qualquer temperatura dentro do
intervalo estudado, porém mais intensamente próximo aos 40ºC. A condição com o maior
valor previsto para ativação da peroxidase foi 250 MPa a 40ºC durante 30 minutos, elevando
a atividade residual da POD para 147,03%. Experimentalmente, o ponto de maior ativação
aconteceu com o emprego de 300 MPa, 40ºC e 30 minutos, quando foi obtido 160% de
atividade enzimática em relação à inicial.
Em purê de tomate, a aplicação de 15 minutos de processo resultou na ativação da
POD usando tanto 20ºC e pressões abaixo de 350 MPa, como empregando 30 ou 60ºC e
pressões mais elevadas (entre 350 e 500 MPa) (HERNÁNDEZ e CANO, 1998). Em laranjas,
os resultados do processamento por APH foram vinculados a cada condição experimental.
Cano e colaboradores descreveram a ativação da peroxidase quando o suco da fruta foi
processado por tratamentos de APH até 400 MPa usando temperaturas entre 32 e 60ºC
durante 15 minutos. Os autores vincularam a inativação da enzima ao uso de temperaturas
inferiores a 32ºC, o que acarretou 50% de inativação da enzima (CANO et al., 1997). A
peroxidase de lichia, uma pequena fruta da família do guaraná, sofreu ativação chegando a
300% do valor inicial em processos a 200 MPa usando temperaturas de 20, 40 e 60ºC,
ocorrendo o índice máximo com o emprego de 40ºC. O mesmo produto teve inativação de
50% da POD e 90% da PPO com o emprego de 600 MPa a 60ºC durante 20 minutos,
(PHUNCHAISRI e APICHARTSRANGKOON, 2005).
Préstamo e colaboradores descreveram o aumento de atividade após o processamento
por APH como conseqüência do aumento da quantidade de enzimas solúveis em vegetais
(PRÉSTAMO et al., 2001). Na água de coco o aumento da atividade da POD pelo uso de
Discussão
153
APH pode estar está relacionado a alterações na estrutura da enzima não sendo conseqüência
da alteração da estrutura do vegetal processado, já que as enzimas estão dissolvidas
totalmente no citoplasma da fruta, que é a própria água de coco. Segundo Anese e
colaboradores o efeito de ativação em conseqüência do tratamento combinado de
APH/temperatura pode ser atribuído a configurações reversíveis e/ou a mudanças
conformacionais na enzima e/ou no substrato (ANESE et al. 1995).
Para o processamento da solução de raiz forte – HRP (em MES, pH 5,8 adicionada de
0,003% de Tween 80) foram empregadas as mesmas condições usadas para o processamento
da água de coco. O modelo estatístico obtido na avaliação do efeito da APH sobre esta enzima
foi bastante diferente daquele calculado para a peroxidase da água de coco. Para a enzima
comercial, o tempo de processo foi significativo para a obtenção da inativação e valores
intermediários de pressão foram mais eficientes. Desta forma, um processo empregando 500
MPa durante 30 minutos a 60ºC foi suficiente para inativar 75% da enzima. Porém, da mesma
forma que a peroxidase da água de coco, a inativação total somente foi alcançada com o
emprego de 800 MPa usando a temperatura mínima de 50ºC. O efeito da pressão foi sempre
de inativação e em momento nenhum ocorreu ativação da enzima.
Avaliando a enzima de raiz forte pura em solução, Préstamo e colaboradores
observaram a diminuição da atividade da enzima proporcional ao aumento da pressão até
atingir 600 MPa, em processos usando 20ºC. Pressões maiores resultaram em aumento da
atividade, que ocorreu até 1000 MPa e a variação do tempo (15 a 30 min) não afetou os
resultados (PRÉSTAMO et al., 2001).
Smeller e colaboradores indicaram a necessidade de mais de 12000 MPa para
desenovelar a principal isoenzima da peroxidase de raiz forte (HRP-C) e indicaram este valor
como sendo muito superior ao necessário para inativar a grande maioria das enzimas. Existem
poucas enzimas que necessitem processamentos com pressões iguais ou superiores (o inibidor
Discussão
154
da tripsina pancreática bovina é uma delas). Abaixo de 1.000 MPa ocorrem modificações
muito pequenas na estrutura. Este fato não é conseqüência direta das características estruturais
dos principais componentes da molécula, já que a substituição do grupo heme, remoção do
cálcio, ligação de substrato ou redução da ligação de enxofre não modificaram a estabilidade
da enzima frente à aplicação de pressão (SMELLER et al., 2003). Segundo Dumoulin, mesmo
a retirada da porção carboidrato não pode ser responsabilizada pela estabilidade da enzima, já
que sua retirada reduz somente em 15% a estabilidade (DUMOULIN, 1999).
5.2.7. Efeito da APH sobre os microrganismos
O efeito da APH, isoladamente ou conjugada com temperatura, sobre os
microrganismos contaminantes de um alimento está relacionado ao tipo de microrganismo e
às características de cada produto.
Vários tipos de alimentos foram processados empregando APH objetivando a redução
ou eliminação de microrganismos e conseqüente aumento da vida de prateleira e da segurança
do produto obtido. Segundo Bayindirli, o processamento de amostras de sucos de maçã,
laranja, cereja e damasco por APH usando 350 MPa a 40ºC durante 5 minutos foi suficiente
para inativar completamente os microorganismos adicionados (Staphylococcus aureus 485,
Escherichia coli O157- H7 933 e Salmonella enteritidis FDA) (BAYINDIRLI et al., 2006).
Em suco de goiaba, o emprego de 600 MPa a 25ºC durante 15 minutos resultou na diminuição
da carga microbiana a índices de contaminação inferiores aos obtidos empregando tratamento
por pasteurização, com a vantagem da manutenção das principais características sensoriais do
produto até 40 dias sob refrigeração (YEN e LIN, 1996). Cléry-Barraud e colaboradores
avaliaram a cinética de destruição de esporos do Bacillus anthracis, divulgando ser necessário
apenas 4 minutos de processamento a 500 MPa quando a temperatura for de 75ºC, tempo 85
Discussão
155
vezes menor do que seria necessário se o aquecimento fosse realizado sem pressurização
(CLÉRY-BARRAUD et al. 2004)
Estes e vários outros resultados indicam que as condições utilizadas neste estudo para
o processamento da água de coco objetivando a inativação das enzimas POD e PPO seriam
suficientes para permitir a conservação da água de coco processada pos APH livre de
microrganismos deteriorantes e patogênicos, se conservada sob refrigeração.
Conclusões
156
6. CONCLUSÕES
A peroxidase da água de coco tem PM entre 41.000 e 42.000;
A principal isoenzima da peroxidase na água de coco possui pI=5,2,
aparecendo outras duas isoformas também ácidas, com pI=4,5 e pI=5,0;
A cromatografia de troca aniônica pode ser usada com sucesso para obter a
principal isoforma da POD;
As enzimas POD e PPO da água de coco são inativadas pelo processamento
por APH empregando 800 MPa e temperatura superior a 50ºC;
A POD foi mais sensível às condições máximas de processamento, porém mais
resistente às pressões intermediárias;
A POD sofre ativação pela pressão em temperaturas acima de 20ºC em faixa
de pressurização que varia conforme a temperatura usada;
Para a PPO o aumento da pressão foi sempre acompanhado de decréscimo na
atividade residual;
O tempo de processo por APH tem pouca influência sobre a inativação da PPO
e muito pouco sobre a inativação da POD;
A peroxidase comercial – HRP não é ativada pela pressão e responde de forma
linear e negativa ao aumento da pressão.
A eliminação do fator adsorção da POD pela adição de Tween 80 possibilitou a
obtenção de resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis;
O uso de Tween 80 não alterou os resultados da polifenoloxidase, indicando
não ocorrer adsorção desta enzima.
A metodologia de superfície de resposta foi eficiente para descrever e prever o
efeito do tratamento por APH sobre as enzimas da água de coco.
Perspectivas Futuras
157
7. PERPECTIVAS FUTURAS
Avaliar a aceitação do produto em teste sensorial.
Avaliar o efeito das condições do processamento por APH empregadas sobre a
microbiota eventualmente adicionada à água de coco durante o manuseio para
produção.
Avaliar tecnicamente a enorme capacidade de adsorção da peroxidase à
superfícies sólidas, indicando a possibilidade do uso desta propriedade para retirada da
enzima.
Avaliar o efeito ativador momentâneo de pressões intermediárias que ocorre
durante a elevação da pressão até atingir o nível necessário para inativação sobre o
produto final obtido.
Avaliar a relação da ação da POD e/ou da PPO com o surgimento da cor
rosada frequentemente observada nos produtos processados.
Identificar a PPO da água de coco e discriminar entre a atividade da POD e
PPO, já que ambas são eluídas na mesma fração de gel filtração, mas têm
comportamentos diferentes em relação à capacidade de adsorção, a resistência à
temperatura e pressão e também diferentes comportamentos durante o
armazenamento.
Anexos
158
8. ANEXOS
Anexo 1: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo modelo estatístico para a peroxidase e a polifenoloxidase da água de coco, imediatamente após o processamento por alta pressão hidrostática – T(0).
Peroxidase Polifenoloxidase
Valor obs*
Valor previsto
Residual Valor obs*
Valor previsto
Residual Tempera-tura (oC)
Tempo (min)
Pressão (MPa)
T(0) T(0) T(0) T(0) T(0) T(0)
20 30 0 100.00 100.00 0.00 100.00 96.77 3.23
40 30 0 118.18 118.98 -0.80 86.49 99.72 -13.23
40 30 300 184.75 146.27 38.48 67.91 71.35 -3.44
40 30 500 135.45 121.92 13.54 69.86 52.43 17.44
40 30 800 2.93 21.56 -18.63 22.77 24.04 -1.27
20 30 0 100.00 100.00 0.00 100.00 96.77 3.23
40 30 0 96.55 118.98 -22.43 84.63 99.72 -15.10
40 30 300 146.26 146.27 -0.01 67.75 71.35 -3.60
40 30 500 140.50 121.92 18.59 63.81 52.43 11.39
40 30 800 6.76 21.56 -14.79 5.94 24.04 -18.11
20 60 0 100.00 100.00 0.00 100.00 100.13 -0.13
40 60 0 100.92 118.98 -18.06 99.06 95.99 3.08
40 60 300 164.57 146.27 18.30 59.46 67.61 -8.16
40 60 500 136.59 121.92 14.67 56.50 48.69 7.81
20 60 0 100.00 100.00 0.00 100.00 100.13 -0.13
40 60 0 99.93 118.98 -19.05 99.71 95.99 3.73
40 60 300 145.08 146.27 -1.18 49.86 67.61 -17.76
40 60 500 128.83 121.92 6.92 61.15 48.69 12.46
20 90 0 100.00 100.00 0.00 100.00 103.48 -3.48
40 90 0 126.71 118.98 7.73 87.62 92.25 -4.63
40 90 300 179.20 146.27 32.93 92.40 63.88 28.53
40 90 500 146.65 121.92 24.73 66.67 44.96 21.71
40 90 800 2.68 21.56 -18.88 2.30 16.57 -14.27
20 90 0 100.00 100.00 0.00 100.00 103.48 -3.48
40 90 0 91.44 118.98 -27.54 89.21 92.25 -3.04
40 90 300 148.37 146.27 2.11 74.65 63.88 10.77
40 90 500 106.10 121.92 -15.81 49.50 44.96 4.54
40 90 800 0.73 21.56 -20.83 0.75 16.57 -15.82
Anexos
159
20 30 0 100.00 100.00 0.00 100.00 96.77 3.23
60 30 0 94.17 100.77 -6.60 91.78 102.67 -10.89
60 30 300 135.47 114.51 20.96 73.55 65.48 8.07
60 30 500 48.48 81.13 -32.65 30.56 40.67 -10.11
60 30 800 0.00 -32.78 32.78 7.69 3.46 4.23
20 30 0 100.00 100.00 0.00 100.00 96.77 3.23
60 30 0 99.32 100.77 -1.45 120.26 102.67 17.59
60 30 300 152.34 114.51 37.82 88.59 65.48 23.11
60 30 500 38.64 81.13 -42.49 24.54 40.67 -16.13
60 30 800 0.00 -32.78 32.78 0.00 3.46 -3.46
20 60 0 100.00 100.00 0.00 100.00 100.13 -0.13
60 60 0 119.69 100.77 18.92 98.85 91.84 7.00
60 60 300 175.59 114.51 61.08 61.78 54.65 7.13
60 60 500 50.87 81.13 -30.26 20.72 29.84 -9.12
20 60 0 100.00 100.00 0.00 100.00 100.13 -0.13
60 60 0 112.34 100.77 11.57 97.67 91.84 5.83
60 60 300 142.55 114.51 28.04 55.87 54.65 1.22
60 60 500 52.32 81.13 -28.81 18.31 29.84 -11.53
20 90 0 100.00 100.00 0.00 100.00 103.48 -3.48
60 90 0 116.92 100.77 16.15 66.90 81.02 -14.11
60 90 300 121.70 114.51 7.19 61.03 43.82 17.21
60 90 500 1.80 81.13 -79.32 0.14 19.02 -18.88
60 90 800 0.00 -32.78 32.78 0.00 -18.19 18.19
20 90 0 100.00 100.00 0.00 100.00 103.48 -3.48
60 90 0 84.29 100.77 -16.48 81.68 81.02 0.66
60 90 300 100.84 114.51 -13.67 23.80 43.82 -20.02
60 90 500 0.00 81.13 -81.13 3.33 19.02 -15.69
60 90 800 0.00 -32.78 32.78 0.00 -18.19 18.19
* Valor obs. = Valor observado = Valor experimental
Anexos
160
Anexo 2: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo modelo estatístico para a peroxidase e a polifenoloxidase da água de coco processada por alta pressão hidrostática e armazenada por 24 horas – T(24 h).
Peroxidase Polifenoloxidase
Valor obs*
Valor previsto
Residual Valor obs*
Valor previsto
Residual Tempera-tura (oC)
Tempo (min)
Pressão (MPa)
T(24 H) T(24 H) T(24 H) T(24 H) T(24 H) T(24 H)
20 30 0 122.22 101.48 20.74 81.76 108.07 -26.31
40 30 0 108.79 130.32 -21.53 83.99 91.88 -7.89
40 30 300 153.64 138.01 15.63 55.27 62.03 -6.76
40 30 500 133.33 110.21 23.12 55.54 42.12 13.42
40 30 800 10.10 19.10 -9.00 9.12 12.26 -3.14
20 30 0 100.00 101.48 -1.48 100.00 108.07 -8.07
40 30 0 89.35 130.32 -40.97 69.56 91.88 -22.31
40 30 300 130.79 138.01 -7.22 57.19 62.03 -4.84
40 30 500 119.06 110.21 8.86 45.63 42.12 3.51
40 30 800 12.09 19.10 -7.01 4.56 12.26 -7.70
20 90 0 114.66 101.48 13.17 59.47 75.84 -16.37
40 90 0 116.78 130.32 -13.53 53.12 59.64 -6.52
40 90 300 227.19 138.01 89.18 51.17 41.69 9.48
40 90 500 134.44 110.21 24.23 35.23 29.72 5.51
40 90 800 2.76 19.10 -16.34 2.35 11.76 -9.42
20 90 0 90.98 101.48 -10.51 54.12 75.84 -21.72
40 90 0 90.98 130.32 -39.34 68.37 59.64 8.73
40 90 300 164.17 138.01 26.16 67.57 41.69 25.88
40 90 500 96.81 110.21 -13.39 42.32 29.72 12.60
40 90 800 0.27 19.10 -18.83 1.20 11.76 -10.56
20 30 0 100.00 101.48 -1.48 139.52 108.07 31.44
60 30 0 104.90 87.46 17.44 130.69 116.38 14.31
60 30 300 103.80 95.15 8.65 113.80 70.08 43.73
60 30 500 34.29 67.35 -33.06 11.70 39.20 -27.50
60 30 800 0.08 -23.76 23.85 4.11 -7.12 11.23
20 30 0 103.41 101.48 1.93 125.94 108.07 17.87
60 30 0 96.54 87.46 9.08 107.77 116.38 -8.61
60 30 300 133.81 95.15 38.65 73.15 70.08 3.08
60 30 500 15.43 67.35 -51.92 16.61 39.20 -22.58
60 30 800 0.00 -23.76 23.76 0.00 -7.12 7.12
20 90 0 80.60 101.48 -20.89 97.60 75.84 21.76
Anexos
161
60 90 0 129.35 87.46 41.89 80.62 84.14 -3.52
60 90 300 129.98 95.15 34.82 63.93 49.74 14.19
60 90 500 1.06 67.35 -66.29 3.39 26.80 -23.41
60 90 800 0.00 -23.76 23.76 3.47 -7.61 11.08
20 90 0 100.00 101.48 -1.48 77.25 75.84 1.41
60 90 0 90.46 87.46 3.00 79.52 84.14 -4.62
60 90 300 65.12 95.15 -30.03 50.41 49.74 0.67
60 90 500 0.00 67.35 -67.35 4.03 26.80 -22.77
60 90 800 0.00 -23.76 23.76 0.00 -7.61 7.61
* Valor obs. = Valor observado = Valor experimental.
Anexos
162
Anexo 3: Tabela dos valores experimentais obtidos e valores previstos pelo modelo estatístico para a peroxidase comercial de raiz forte (HRP), imediatamente após o processamento por alta pressão hidrostática – T(0) e após um dia de armazenamento sob refrigeração – T(24 h).
HRP T(0) HRP T(24 h)
Tempera-tura (oC)
Tempo (min)
Pressão (MPa)
Valor obs*
Valor previsto
Residual Valor obs*
Valor previsto
Residual
40 30 0.1 100.00 116.44 -16.44 99.65 118.71 -19.06
40 30 300 91.81 79.05 12.76 93.21 83.02 10.19
40 30 500 77.53 54.11 23.42 75.78 56.16 19.63
40 30 800 0.17 16.70 -16.53 0.52 11.28 -10.75
40 30 0.1 100.00 116.44 -16.44 99.65 118.71 -19.06
40 30 300 77.92 79.05 -1.13 93.21 83.02 10.19
40 30 500 74.13 54.11 20.02 75.78 56.16 19.63
40 30 800 1.89 16.70 -14.81 0.52 11.28 -10.75
40 90 0.1 100.00 108.98 -8.98 101.92 103.06 -1.14
40 90 300 87.61 71.58 16.02 97.91 73.55 24.36
40 90 500 59.86 46.65 13.21 60.73 50.81 9.92
40 90 800 0.17 9.24 -9.06 0.35 12.11 -11.76
40 90 0.1 100.00 108.98 -8.98 94.75 103.06 -8.32
40 90 300 87.42 71.58 15.84 80.41 73.55 6.86
40 90 500 46.97 46.65 0.33 42.52 50.81 -8.29
40 90 800 0.00 9.24 -9.24 0.48 12.11 -11.63
60 30 0.1 100.00 88.84 11.16 81.38 70.66 10.71
60 30 300 37.56 51.45 -13.89 39.59 46.60 -7.01
60 30 500 11.89 26.51 -14.62 12.36 27.50 -15.13
60 30 800 0.00 -10.90 10.90 0.00 -5.75 5.75
60 30 0.1 100.00 88.84 11.16 89.08 70.66 18.41
60 30 300 59.57 51.45 8.13 40.71 46.60 -5.89
60 30 500 11.91 26.51 -14.59 14.89 27.50 -12.60
60 30 800 0.00 -10.90 10.90 0.00 -5.75 5.75
60 90 0.1 100.00 81.38 18.62 48.02 42.69 5.33
60 90 300 24.33 43.98 -19.65 10.96 24.81 -13.85
60 90 500 0.83 19.05 -18.21 1.84 9.83 -7.99
60 90 800 0.00 -18.36 18.36 0.00 -17.24 17.24
60 90 0.1 100.00 81.38 18.62 54.74 42.69 12.04
60 90 300 17.47 43.98 -26.51 4.32 24.81 -20.50
60 90 500 0.32 19.05 -18.73 0.32 9.83 -9.51
60 90 800 0.00 -18.36 18.36 0.00 -17.24 17.24
* Valor obs. = Valor observado = Valor experimental.
Referências Bibliográficas
163
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Patente
184
Anexo 4: Curriculum Vitae
Nome: Yanina Madalena de Arruda Calvette
Nascimento: 20/10/1955
Naturalidade: Gramado – RS
FORMAÇÃO ACADÊMICA:
Curso de Graduação: Farmácia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul –
UFRGS, de março de 1973 a julho de 1976.
Cursos de Ênfase na graduação: Bioquímica de Alimentos, Bioquímica
Análises Clínicas, Indústria de Medicamentos – UFRGS, de agosto de 1976 a
dezembro de 1978.
Curso de Especialização: Química Avançada - Universidade Federal de Mato
Grosso – UFM, de março de 1980 a dezembro de 1981.
Curso de Especialização: Laticínios - Istituto Sperimentale Lattiero-Caseario -
Milão - Itália, de setembro de 1983 a maio de 1984.
Curso de Mestrado: Tecnologia de Alimentos - Universidade Federal do Ceará
– Fortaleza, UFC, de março de 1988 a dezembro 1990. Título da Dissertação:
Processamento do gergelim e utilização da farinha desengordurada como
complemento protéico da farinha extrudada de caupi.
Curso de Doutorado: Curso de Química Biológica no Instituto de Bioquímica
Médica – Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, em colaboração com
a Universidade de Reading, Inglaterra, a partir de 2001.
ATIVIDADE PROFISSIONAL ATUAL
Patente
185
Professora Assistente IV - Departamento de Tecnologia Farmacêutica,
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense. Ingresso em
fevereiro de 1994.
Disciplinas ministradas:
Curso de graduação em Farmácia - Disciplina: Enzimologia e Tecnologia das
Fermentações I e II;
Curso Especialização em Ciência de Medicamentos e Alimentos - Disciplina:
Biotecnologia em Alimentos.
PATENTE EM ANDAMENTO:
Calvette, Y. M. A.; Rosenthal, A.; Silva, J. Água de coco processada, bebida
isotônica a base de água de coco e processo para inibição de suas enzimas nativas.
Patente em depósito junto ao INPI, Brasil.
Patente
186
Anexo 5: Patente em depósito:
ÁGUA DE COCO PROCESSADA, BEBIDA ISOTÔNICA A BASE DE ÁGUA, DE COCO E PROCESSO PARA INIBIÇÃO DE SUAS ENZIMAS NATIVAS.
Patente
187
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
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