entwicklung eines mir-atr-sensors zur prozesskontrolle · pdf fileentwicklung eines...
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Entwicklung eines MIR-ATR-Sensors zur Prozesskontrolle in der chemischen Industrie
und Biotechnologie
vorgelegt von
Dipl.-Ing.-Päd. Dipl.-Ing. (FH)
Daniel Geörg
geb. in Speyer
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
— Dr.-Ing. —
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Hajo Haase
Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Frank-Jürgen Methner
Gutachter: Prof. Dr. Thomas Beuermann
Gutachter: Prof. Dr. Peter Neubauer
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03.07.2017
Berlin 2017
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Formelzeichen ..................................................................................... III
Zusammenfassung ........................................................................................................... VI
Abstract .......................................................................................................................... VII
1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................ 1
2 Stand des Wissens und der Technik .............................................................................. 3
2.1 MIR-ATR-Spektroskopie.................................................................................................. 3
2.1.1 Absorptionsspektroskopie .................................................................................. 3
2.1.2 MIR-ATR-Technik ................................................................................................ 5
2.1.3 Spektrometrische Messaufbauten ..................................................................... 6
2.1.4 Chemometrische Kalibration .............................................................................. 8
2.2 MIR-ATR-Sensorik ......................................................................................................... 11
2.2.1 Messaufbau und Komponenten ....................................................................... 11
2.2.2 Kalibrationsmethode ........................................................................................ 14
2.2.3 Stand der Technik ............................................................................................. 15
2.3 Chemischer Musterprozess Veresterung ..................................................................... 16
2.3.1 Reaktionsmechanismus .................................................................................... 16
2.3.2 Dynamisches Gleichgewicht ............................................................................. 17
2.4 Biotechnologischer Musterprozess Hefefermentation ................................................ 19
2.4.1 Backhefe als Modellorganismus ....................................................................... 19
2.4.2 Der Stoffwechsel von Hefe ............................................................................... 20
2.4.3 Batch-Kultivierung von Backhefe ...................................................................... 21
3 Material und Methoden ............................................................................................. 22
3.1 Veresterung und anschließende Destillation ............................................................... 22
3.1.1 Apparatur .......................................................................................................... 22
3.1.2 Auslegung und Ablauf der Veresterung mit anschließender Destillation ........ 24
3.1.3 Prozessverfolgung mit dem MIR-ATR-Spektrometer ....................................... 26
3.2 Hefefermentation ......................................................................................................... 29
3.2.1 Apparatur .......................................................................................................... 29
3.2.2 Kultivierungsbedingungen bei der Hefefermentation ..................................... 31
3.2.3 Referenzanalytik HPLC ...................................................................................... 32
3.3 Simulation eines MIR-ATR-Sensors anhand von MIR-ATR-Spektren ........................... 33
3.3.1 Simulationsmethode......................................................................................... 33
3.3.2 Spektrenaufnahme und –konvertierung mit OPUS .......................................... 35
3.3.3 Datenimport und Sensorsimulation mit LabVIEW ........................................... 38
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors .................................................................. 47
4.1 Auslegung des Sensors und Elektronik des Prototyps ................................................. 47
4.1.1 Aufbau des MIR-ATR-Sensors ........................................................................... 47
4.1.2 Auswahl der optischen Bandpassfilter ............................................................. 51
4.1.3 Aufbau der Elektronik und Leitungsführung .................................................... 52
4.1.4 Elektronik zur Ansteuerung der Lichtquelle ..................................................... 54
4.1.5 Elektronik zur Detektorsignalverstärkung ........................................................ 56
4.1.6 Bewertung herkömmlicher Detektorsignalverstärker ..................................... 60
II
4.1.7 Software, Datenerfassung und Signalverarbeitung.......................................... 62
4.2 Vergleich der Sensorsignale während einer Veresterung mit anschließender Destillation mit einer Simulation .................................................................................. 63
4.3 Wiederholbarkeit der Sensorsignale ............................................................................ 65
4.4 Vergleich des Messeffektes für Glucose und Ethanol mit einer Simulation ................ 67
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation ......................... 70
5.1 Versuchsdurchführung ................................................................................................. 70
5.1.1 Zeitlicher Verlauf der sieben Versuchsdurchgänge .......................................... 70
5.1.2 Stoffmengenbilanz und Überprüfen der Versuchsauslegung mit Hilfe der Referenzanalytik ............................................................................................... 71
5.2 MIR-ATR-Sensor ausgestattet mit optischen Standardfiltern ...................................... 72
5.2.1 MIR-ATR-Spektren ............................................................................................ 72
5.2.2 Kalibration des MIR-ATR-Sensors ..................................................................... 74
5.2.3 Prozessverfolgung ............................................................................................. 76
5.3 Sensoroptimierung durch analytspezifische Filter ....................................................... 78
5.3.1 Filterwahl .......................................................................................................... 78
5.3.2 Kalibration des simulierten MIR-ATR-Sensors .................................................. 80
5.3.3 Prozessverfolgung ............................................................................................. 81
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation ................................................................. 83
6.1 Versuchsdurchführung ................................................................................................. 83
6.2 MIR-ATR-Sensor ausgestattet mit optischen Standardfiltern ...................................... 83
6.2.1 MIR-ATR-Spektren ............................................................................................ 83
6.2.2 Kalibration des MIR-ATR-Sensors ..................................................................... 85
6.2.3 Prozessverfolgung ............................................................................................. 86
6.3 Sensoroptimierung durch analytspezifische Filter ....................................................... 87
6.3.1 Filterwahl .......................................................................................................... 87
6.3.2 Kalibration des simulierten MIR-ATR-Sensors .................................................. 88
6.3.3 Prozessverfolgung ............................................................................................. 89
7 Diskussion .................................................................................................................. 91
7.1 Entwicklung des MIR-ATR-Sensors ............................................................................... 91
7.2 Prozessverfolgung einer Veresterung und Destillation ................................................ 92
7.3 Prozessverfolgung einer Hefefermentation ................................................................. 93
8 Ausblick ..................................................................................................................... 95
Verzeichnisse .................................................................................................................. 96
Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 96
Vorveröffentlichungen ...................................................................................................... 102
Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... 103
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................... 106
Anhang .......................................................................................................................... 108
A Anhang zur Sensorsimulation ..................................................................................... 108
B Anhang zur Sensorentwicklung .................................................................................. 110
C Anhang zur Veresterung und Destillation .................................................................. 119
D Anhang zur Hefefermentation ................................................................................... 129
III
Abkürzungen und Formelzeichen
𝑎 Chemische Aktivität A
𝛼 Anfangsordinate (Achsenabschnitt) eines MLR-Modells zur Sensorkalibration Alpha
AS Ameisensäure As
ATR Abgeschwächte Totalreflexion ATR
𝛽 Einfallswinkel des Lichtes an der ATR Grenzfläche Beta
𝛽F1 … 𝛽F4 Steigungen eines MLR-Modells zur Sensorkalibration Betafeins
𝛽krit Grenzwinkel der Totalreflexion Betakrit
𝑐 Konzentration (Stoffmenge pro Volumen) C
C Elektrischer Kondensator (Bauelement) C
𝑐0 Standardeinheit der Konzentration: 1 mol L-1 C0
𝑐𝑒 Konzentration im Gleichgewicht Ce
𝑐predicted Vorhergesagte Analytkonzentration Cpredicted
𝑐true Wahre Analytkonzentration Ctrue
CWL Zentralwellenlänge (central wave length) Cwl
𝑑 Schichtdicke (optische Weglänge) D
𝑑ATR Schichtdicke eines ATR-Aufbaus Datr
𝑑eff Effektive Schichtdicke pro Reflexionsstelle Deff
Δ𝐺0 Freie Standardenthalpie der Chemie (bei 0 °C und 1 bar) DeltaG0
Δ𝐺′0 Freie Standardenthalpie der Biochemie (bei 25 °C und 1 bar) Deltagstrich0
Δ𝑥 Laufwegunterschied in einem FT-Spektrometer Deltax
𝑑p Eindringtiefe (penetration depth) an einer Reflexionsstelle Dp
3D, 4D Dreidimensional, vierdimensional Dreid
EF Ethylformiat Ef
𝐸(𝜆) Extinktion Elambda
𝜀(𝜆) Molarer dekadischer Extinktionskoeffizient Epsilon
ET Ethanol ET
Ext Extinktion Ext
𝑓 Frequenz F
F1, F2… Optische Bandpassfilter des MIR-ATR-Sensors Feins
FFT Schnelle Fouriertransformation (Fast Fourier Transform) Fft
FIFO First in first out Fifo
FIR Fernes Infrarot (Spektralbereich) Fir
IV
FT Fourier Transformation FT
FWHM Halbwertsbreite (full width at half maximum transmission) Fwhm
GBW Verstärkungsfaktor-Bandbreite-Produkt (Gain-Bandwidth-Product) Gbw
GC Gaschromatographie GC
HPLC High performance liquid chromatography HPLC
𝑖 Laufvariable (Analyt-, Proben-, Kanal-, Stoffindex) I
𝐼 Elektrischer Strom I
𝐼 Lichtintensität I
IC Integrierter Schaltkreis (integrated circuit) Ic
𝐼(Δ𝑥) Vom Laufwegunterschied abhängige Lichtintensität Ideltax
𝐼(𝜆) Wellenlängenabhängige Lichtintensität Ilambda
𝐼0(𝜆) Referenzintensität Inulllambda
IR Infraroter Spektralbereich IR
𝐾 Gleichgewichstkonstante K
LabVIEW Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench labview
𝜆 Wellenlänge des Lichtes Lambda
LC Flüssigchromatograpie (liquid chormatography) LC
m Masse M
MIR Mittelinfraroter Spektralbereich MIR
MLR Multiple lineare Regression MLR
MOSFET Metalloxid-Feldeffekttransistor MOSFET
𝑛 Brechungsindex N
𝑁 Anzahl der Reflexionsstellen eines ATR-Aufbaus N
NIR Nahinfraroter Spektralbereich Nir
𝑛p Brechungsindex des ATR-Prismas Np
𝑛, 𝑝, 𝑚 Endvariablen (Kanalanzahl, Analytanzahl, Anzahl zur Kalibration bzw. Validierung verwendeter Proben, Anzahl an Reaktionspartnern)
Npm
𝑛s Brechungsindex der Probe Ns
NTC Thermistor (Halbleitertemperatursensor mit negativem Temperaturkoeffizient)
Ntc
𝜈 Stöchiometrischer Koeffizient Ny
OPV Operationsverstärker Opv
PCR Hauptkomponentenanalyse (principal component regression) PCR
PLS 2 PLSR Algorithmus zur PLS-Modellerstellung mit gleichzeitiger Vorhersage mehrerer Analyten
Pls1
V
PLS 1 PLSR Algorithmus zur PLS-Modellerstellung mit Vorhersage eines Analyten Pls2
PLSR Partial least square regression PLSR
Q Schaltendes elektronisches Bauelement (z.B. Transistor) Q
QCL Quantenkaskadenlaser Qcl
𝑅 Universelle Gaskonstante R
R Ohmscher Widerstand (Bauelement) R
𝑅 Ohmscher Widerstand (elektrische Größe) R
RMSECV Fehler der Modellvalidierung (root mean squared error of cross validation) Rmsecv
𝑅2 Bestimmtheitsmaß Rquadrat
SEC Kalibrationsfehler (standard error of calibration) Sec
S1, S2… Optische Bandpassfilter des simulierten MIR-ATR-Sensors Seins
SEP Vorhersagefehler (standard error of prediction) Sep
TDMS Technical Data Management Streaming Tdms
𝑇 Absolute Temperatur Temp
𝑡 Zeit Time
TO Transistor outline (Gehäusebezeichnung) to
𝑇 Transmission Trans
𝑈 Elektrische Spannung U
UV Ultravioletter Spektralbereich Uv
V Volumen V
VI LabVIEW-Programm (Virtual Instrument) Vi
VIS Sichtbarer Spektralbereich Vis
W Wasser W
ZnSe Zinkselenid ZnSe
VI
Zusammenfassung
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein photometrischer MIR-ATR-Sensor entwickelt
(MIR: Mittelinfraroter Spektralbereich, ATR: Abgeschwächte Totalreflexion) zur in-situ-
Verfolgung von chemischen Reaktionen und biotechnologischen Prozessen. Der kompakte
und preiswerte Sensor enthält keine beweglichen Teile und kann daher wesentlich einfacher
in eine Prozessumgebung integriert werden als ein FT-MIR-Spektrometeraufbau (FT: Fourier
Transformation). Die Optik besteht aus einem elektrisch modulierten Schwarzkörperstrahler
als IR-Lichtquelle, einem ATR-Prisma aus Zinkselenid (ZnSe) und vier Thermosäulendetektoren,
welche jeweils mit einem optischen Bandpassfilter ausgestattet sind. An der Grenzfläche
zwischen dem ATR-Prisma und der Probe werden stoffspezifische Absorptionsbanden dazu
genutzt, die Analyten quantitativ zu bestimmen. Die Hardware und Software des Sensors
wurde selbst entwickelt (Komponentenwahl, Schaltplan, Platinendesign, Datenerfassung,
Signalverarbeitung und –aufzeichnung) und ein Prototyp gebaut. Insbesondere wurde der
Detektorsignalverstärker hinsichtlich seiner Störfestigkeit optimiert, sodass auch in einer
rauen Umgebung eine gute Signalqualität gewährleistet ist.
Die Praktikabilität des MIR-ATR-Sensors zur Verfolgung von chemischen Prozessen wurde
während der Veresterung von Ethanol und Ameisensäure zu Ethylformiat und Wasser mit
anschließender Destillation des Esters getestet. Alle vier an der Reaktion beteiligten Stoffe
konnten inline verfolgt werden. Der Standardvorhersagefehler betrug 0,43 mol L-1 für Ethanol,
0,36 mol L-1 für Ameisensäure, 0,38 mol L-1 für Ethylformiat und 0,68 mol L-1 für Wasser. Als
Referenzgerät wurde ein FT-MIR-Spektrometer mit Diamant-ATR-Einheit eingesetzt. Darüber
hinaus wurde der MIR-ATR-Sensor in einem biotechnologischen Musterprozess erprobt.
Während der aeroben Batch-Fermentation von Backhefe (Saccharomyces cerevisiae) konnten
die Ethanol- und Glucosekonzentration simultan in Echtzeit verfolgt werden. Gemessen wurde
jeweils in einer Probenschleife. Der Standardvorhersagefehler betrug 6,15 g L-1 für Glucose
und 1,36 g L-1 für Ethanol. Als Referenz wurden HPLC-Analysen durchgeführt (HPLC: high
performance liquid chromatography). Der MIR-ATR-Sensor wurde mittels multipler linearer
Regression kalibriert und so die in den vier photometrischen Kanälen gemessenen
Absorptionen zu den Analytkonzentrationen in Beziehung gesetzt. Die zeitlichen Verläufe der
Sensorsignale stimmen mit den Konzentrationswerten der Referenzmethode gut überein.
Des Weiteren wurde eine Simulationsmethode auf Basis von MIR-ATR-Spektren entwickelt,
mit welcher das Ansprechverhalten eines MIR-ATR-Sensors vorhergesagt werden kann. Durch
Variation der Transmissionsbereiche der optischen Bandpässe können mit diesem Werkzeug
optimale Filter für eine bestimmte Messaufgabe ermittelt werden. Durch Tausch der
optischen Filter kann der Sensor so für eine Vielzahl von Prozessen in der chemischen,
pharmazeutischen und der Getränkeindustrie angepasst werden.
VII
Abstract
A MIR-ATR sensor (MIR: mid-infrared, ATR: attenuated total reflectance) has been developed
for in situ monitoring of chemical reactions and biotechnological processes. The compact and
low-priced sensor has been designed without moving parts and can therefore be implemented
in a process environment much easier than a FT-MIR spectrometer setup (FT: Fourier
Transform). The optical setup consists of an electrical modulated black body radiator as IR
light source, a zinc selenide (ZnSe) ATR prism and four thermopile detectors, each equipped
with an optical bandpass filter. At the surface of the ATR prism, which is covered with the
sample, analyte specific absorption bands are used for quantitative measurements. Hardware
and software of the built prototype was self-developed (component selection, circuit
schematic, circuit board, data acquisition, signal processing and logging). The electromagnetic
immunity of the detector amplifier was optimized to ensure good signal quality even in harsh
environments.
The practical applicability to monitor chemical processes with the MIR-ATR sensor was tested
during esterification of ethanol and formic acid to ethyl formate and water with subsequent
distillation of the ester. All four substances involved in the reaction could be monitored in-line.
The standard error of prediction for ethanol, formic acid, ethyl formate, and water were
0.43 mol L-1, 0.36 mol L-1, 0.38 mol L-1, and 0.68 mol L-1, respectively. For reference analysis, a
FT-MIR spectrometer with diamond ATR module was applied. Additionally, the suitability of
the MIR-ATR sensor for process tracking in biotechnology was tested. Glucose and ethanol
concentrations could be monitored simultaneously in real-time during aerobic batch-
fermentations of Saccharomyces cerevisiae. A bypass loop has been used for all measure-
ments. The standard errors of prediction were 6.15 g L-1 and 1.36 g L-1 for glucose and ethanol,
respectively. For reference analysis, high-performance liquid chromatography (HPLC) was
applied. The sensor was calibrated by multiple linear regression (MLR) in order to link the
measured absorbance in the transmission ranges of the four optical sensor channels to the
analyte concentrations. The temporal courses of the sensor signals are in accordance with the
concentration values achieved by the reference method.
Furthermore, a simulation procedure based on MIR spectra is presented to predict the
response characteristics of a MIR-ATR sensor if the transmission ranges of the filters are varied.
Using this tool optimized bandpass filters for a specific measuring task can be identified. By
exchanging the optical filters, the sensor can be adapted to a wide range of processes in the
chemical, pharmaceutical, and beverage industries.
1 Einleitung und Zielsetzung 1
1 Einleitung und Zielsetzung
Ein elementarer Bestandteil moderner industrieller Anlagen sind automatisierte Prozess-
leitsysteme. Bereits seit Jahren wird in Fachkreisen die Zukunft der Automatisierungstechnik
diskutiert und hierbei stets auf deren Schlüsselrolle für den technologischen Fortschritt in der
Industrie verwiesen (FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT, 2014; VDI, 2013, , 2014). Unter den
Schlagwörtern „Industrie 4.0“ oder „Cyber Physical Systems“ zog die Weiterentwicklung von
Automatisierungssystemen in den politischen Diskurs ein (BUNDESMINISTERIUM FÜR BILDUNG UND
FORSCHUNG (BMBF), 2014) und wurde Teil milliardenschwerer Wirtschaftsförderungs-
programme der Europäischen Union (EUROPÄISCHE KOMISSION, 2014). Demnach ist davon
auszugehen, dass auch langfristig Automatisierungstechnik und deren Weiterentwicklung für
die Industrie von großer Bedeutung sein wird.
Eine Herausforderung für zukünftige Prozessleitsysteme besteht in der Verbesserung der
Kenntnisse über einen laufenden Prozess. Das Bereitstellen aller relevanten Prozessparameter
in Echtzeit ist Voraussetzung für gute Automatisierungen. Inline-Messtechnik wird daher von
der biotechnologischen über die pharmazeutische und chemische Industrie bis zur
Lebensmittelproduktion bevorzugt eingesetzt. Die entfallende Probennahme und Proben-
aufbereitung im Vergleich zu Online-/Atline-/Offline-Messtechnik ist für die Implementierung
und den Betrieb in einer Anlage von großem Nutzen. Die automatisierte Beeinflussung eines
laufenden Prozesses aufgrund seines aktuellen Ist-Zustandes hin zu einem Soll-Zustand ist mit
elektronischen Systemen seit über fünf Jahrzehnten Standard (WELLER, 2013). Laborgeräte
führen meist Atline- oder Offline-Messungen durch und können daher in der Regel nicht
innerhalb eines Prozessleitsystems eingesetzt werden.
Bei der Entwicklung neuer Prozesse ist der Übergang vom Laborversuch zum Technikum und
später zur Anlage im Produktionsmaßstab bedeutend einfacher, wenn die im Labor
eingesetzte Analytik mit übertragen werden kann. Hierfür muss Sensorik zur Verfügung stehen,
mit welcher die im Labor erprobte Analysentechnik prozessfähig wirtschaftlich abgebildet
werden kann. Eine bei Versuchen im Labor häufig eingesetzte Messmethode ist die
Absorptionsspektroskopie. Lichtleiter aus Quarzglas ermöglichen die Anbindung einer Sonde
im Prozess an ein außerhalb der Prozessumgebung platziertes Spektrometer für die kürzeren
Wellenlängenbereiche von ultraviolettem (UV) über sichtbares (VIS) bis hin zu nahinfrarotem
(NIR) Licht. Die im Labor ausgearbeitete spektroskopische Analytik kann in diesen Spektral-
bereichen direkt in den Prozess übertragen und deren Ergebnisse dem Prozessleitsystem
bereitgestellt werden. Für den hochselektiven mittelinfraroten Wellenlängenbereich sind
keine geeigneten Lichtwellenleiter verfügbar, sodass das Spektrometer von der Messstelle im
Prozess nicht örtlich getrennt werden kann. Ebenso ist der Einsatz eines prozessfähigen MIR-
Spektrometers in den meisten Fällen wirtschaftlich nicht vertretbar oder wird aufgrund der
mechanisch schwierigen Integration in eine Anlage vermieden. Für diese im Labor weit
verbreitete Technik besteht daher aktuell eine große Hürde für den Einsatz im Prozess.
1 Einleitung und Zielsetzung 2
Ziel dieser Arbeit ist es, diese Lücke zwischen Labor- und Prozessanalytik für die MIR-ATR-
Technik (ATR: Abgeschwächte Totalreflexion) zu schließen. Für flüssige und feste Proben ist
die MIR-ATR-Spektroskopie im Labor etabliert. Da der Einsatz eines MIR-Spektrometers in
einer Prozessumgebung im Allgemeinen nicht umsetzbar ist, soll ein prozessfähiger Inline MIR-
ATR-Sensor entwickelt werden, auf welchen die im Labor entwickelte spektroskopische
Analytik übertragen werden kann. Die Einsatzfähigkeit des Prototyps soll durch die Verfolgung
von chemischen und biotechnologischen Musterprozessen nachgewiesen werden.
2 Stand des Wissens und der Technik 3
2 Stand des Wissens und der Technik
2.1 MIR-ATR-Spektroskopie
2.1.1 Absorptionsspektroskopie
Die optische Absorptionsspektroskopie in der Analytik
Die optische Spektroskopie wird für qualitative und quantitative Analysen sowohl im Labor als
auch in industriellen Anlagen eingesetzt. Da die inter- und intramolekularen Bindungen analyt-
spezifische Absorptionsbanden verursachen, kann insbesondere die Infrarotspektroskopie zur
Strukturaufklärung genutzt werden. Nach dem LAMBERT-BEERschen Gesetz (siehe Formel 2-1)
sind Absorption und Konzentration proportional zueinander. Dieser direkte Messeffekt wird
genutzt, um Analytkonzentrationen aus den Absorptionsspektren mittels univariater oder
multivariater (chemometrischer) Auswertemethoden zu bestimmen. Im Gegensatz zu
anderen Analysenmethoden wie Massenspektrometrie, Kernspinresonanzspektroskopie oder
Chromatographie (GC, LC) kann bei der optischen Spektroskopie die Probe häufig direkt und
nicht invasiv vermessen werden. Messmethoden, welche auf physikalischen Parametern wie
Leitfähigkeit, Brechungsindex oder Schallgeschwindigkeit basieren, haben den Nachteil, dass
hier nur ein indirekter Zusammenhang mit der Stoffkonzentration besteht und sie daher bei
Mehrkomponentensystemen schnell an ihre Grenzen stoßen.
Die Absorption von Licht als Messeffekt
Beim Durchdringen einer Probe wird das Licht einer Lichtquelle von der Referenzintensität
𝐼0(𝜆) auf eine kleinere Intensität 𝐼(𝜆) in Abhängigkeit von der Wellenlänge 𝜆 abgeschwächt.
Die Referenzintensität 𝐼0(𝜆) wird – je nach Spektralbereich und Anwendung – häufig gegen
die Probenmatrix ohne Analyt oder gegen ein Medium mit geringer Absorption, wie zum
Beispiel Umgebungsluft, gemessen. Bei Veränderungen der Optik, der Intensität der Licht-
quelle oder der Empfindlichkeit des Detektors muss die Referenzintensität 𝐼0(𝜆) jeweils neu
bestimmt werden. BEER (BEER, 1852) formulierte auf Basis der Vorarbeiten von BOUGUER
(BOUGUER, 1729) und LAMBERT (LAMBERT, 1760) einen Zusammenhang (LAMBERT-BEER-Gesetz)
zwischen der Analytkonzentration 𝑐 und der Extinktion 𝐸(𝜆), welcher die Lichtabsorption als
Messeffekt für quantitative Analysen beschreibt (GÜNZLER, 2003):
𝐸(𝜆) = − log10 (
𝐼(𝜆)
𝐼0(𝜆))
= 𝜀(𝜆) ⋅ 𝑐 ⋅ 𝑑
2-1
mit der Extinktion 𝐸 (logarithmierte relative Abschwächung des Lichtes), der Referenz-
intensität 𝐼0, der Intensität 𝐼 nach Passieren der Probe, dem molaren dekadischen Extinktions-
koeffizient 𝜀 des Analyten, der Konzentration 𝑐 des Analyten und der optischen Weglänge 𝑑
in der Probe.
2 Stand des Wissens und der Technik 4
Für eine Probe, welche sich aus mehreren (𝑛) Analyten zusammensetzt, summieren sich die
Einzelabsorptionen zu einem resultierenden Absorptionsspektrum:
𝐸(𝜆) = 𝑑 ⋅ ∑ 𝜀𝑖(𝜆) ⋅ 𝑐𝑖
𝑛
𝑖=1
2-2
Anhand spektroskopischer Absorptionsmessungen ist es möglich, die verschiedenen
Bestandteile mehrkomponentiger Proben gleichzeitig quantitativ zu bestimmen, sofern sich
die Absorptionsspektren 𝜀𝑖(𝜆) der einzelnen Analyten unterscheiden (siehe 2.1.4).
Spektralbereiche und Anregungsmechanismen
Durch die Absorption eines Photons kann ein Molekül (Fest- oder Flüssigphase) in einen
höheren elektronischen Zustand gebracht (UV/VIS-Spektroskopie) oder Molekülschwing-
ungen angeregt werden (IR-Spektroskopie). Dagegen ist eine Rotationsanregung von Mole-
külen nur in der Gasphase möglich. Da der vorgestellte MIR-ATR-Sensor nur für hoch konzen-
trierte Analyten eingesetzt werden kann, wird hier auf die Rotationsanregung und Spektros-
kopie in der Gasphase nicht weiter eingegangen. Bei der Wechselwirkung von ultraviolettem
(200 nm < 𝜆UV ≤ 370 nm) oder sichtbarem Licht (370 nm < 𝜆VIS ≤ 780 nm) mit Valenz-
elektronen werden diese auf ein Orbital mit höherem Energieniveau gebracht. Die Anregung
von Valenzelektronen im UV/VIS-Bereich führt zu breiten unspezifischen Absorptionsbanden
und gestattet nur dann eine Mehrkomponentenanalyse, wenn es sich um Mischungen aus
unterschiedlichen Chromophoren handelt. Die Entwicklung eines ATR-Sensors für den UV/VIS-
Bereich ist wegen der potenziell wenigen Anwendungen nicht verfolgt worden.
Infrarotes Licht regt die Schwingungen in Molekülen an (zwischen Atomen oder Atom-
gruppen), sofern sich während der Schwingung das Dipolmoment im Molekül ändert. Die
meisten Moleküle besitzen eine Vielzahl von Normalschwingungen und können daher sehr gut
anhand ihrer IR-Absorptionsspektren unterschieden werden. Im nahinfraroten Spektral-
bereich (0,78 µm < 𝜆NIR < 2,5 µm, 12820 cm−1 > 𝜈NIR > 4000 cm−1 ) werden Ober- und
Kombinationsschwingungen angeregt. Die vielen Kombinationsmöglichkeiten der verschie-
denen Modi schlägt sich in breiten, überlappenden und somit wenig spezifischen Absorptions-
banden nieder. Zudem wird im NIR-Bereich ein Teil der chemischen Information nicht erfasst,
da lediglich anharmonische Bindungsschwingungen angeregt werden können. Diese bestehen
nur bei wenigen funktionellen Gruppen (C-H, O-H, N-H, S-H, C=O). Quantitative Mess-
methoden auf Basis von NIR-Absorptionsspektren erfordern daher häufig eine Vorver-
arbeitung der Spektren und eine chemometrische Kalibration.
Ein wesentlich größeres Einsatzgebiet bietet die Absorption durch Grundschwingungen.
Angeregt werden diese durch mittelinfrarotes Licht (2,5 µm < 𝜆MIR < 25 µm, 4000 cm−1 >
𝜈MIR > 400 cm−1). Die Absorptionen im MIR bieten mit schmalen, intensiven Absorptions-
2 Stand des Wissens und der Technik 5
banden gute Voraussetzungen für spezifische und sensitive Messmethoden. Eine Struktur-
aufklärung ist für viele Analyten, insbesondere in der organischen Chemie, möglich (HESSE u. a.,
2012). Damit eignet sich die Absorption im mittelinfraroten Spektralbereich als Messeffekt für
die Sensorentwicklung dieser Arbeit.
2.1.2 MIR-ATR-Technik
Mit der Proportionalität zwischen Extinktion und Konzentration nach LAMBERT-BEER (siehe
Formel 2-1) können Analyten quantitativ bestimmt werden. In spektrometrischen und photo-
metrischen Messaufbauten muss daher die Detektorelektronik im linearen Arbeitsbereich
betrieben werden. Bei Absorptionen oberhalb von 2, also der Transmission von weniger als
einem Hundertstel im Vergleich zur Referenzintensität, ist dies schwierig sicherzustellen. Eine
Kalibration auf Basis linearer Modelle (siehe 2.1.4) könnte dann nicht mehr möglich sein. Es
ist daher sinnvoll, die Optik der Messaufbauten so zu gestalten, dass lediglich moderate
Extinktionen unterhalb von 2 auftreten.
Der Extinktionskoeffizient 𝜀(𝜆) ist festgelegt durch den Analyten und dessen Aggregatzustand.
Der Bereich der Konzentration 𝑐 ist durch die Messaufgabe vorgegeben. Folglich muss für die
Auslegung der Optik der noch freie Parameter 𝑑, die optische Weglänge in der Probe, so
gewählt werden, dass 𝐸 < 2 erfüllt ist. Bei flüssigen Proben ist im mittelinfraroten
Spektralbereich aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten in der Regel eine Schichtdicke
von einigen Mikrometern notwendig (ŠAŠIĆ & OZAKI, 2010). Sie liegt demnach in der Größen-
ordnung der Wellenlänge des Lichtes. Transmissionsküvetten mit solch kleinen optischen
Weglängen sind nur schwer zu realisieren und anfällig für Verschmutzung bei gleichzeitig
hohem Aufwand für die Reinigung. Eine praktikablere Möglichkeit, optische Weglängen im
Bereich der Wellenlänge zu realisieren, ist die ATR-Technik. Hierbei wird der Lichtstrahl an der
Grenzfläche zwischen einem Prisma und der Probe totalreflektiert, dringt jedoch an der
Reflexionsstelle in der Größenordnung einer Wellenläge in die Probe ein und wird dabei
teilweise absorbiert. Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau einer ATR-Messzelle mit
𝑁 = 3 Reflexionsstellen zwischen Probe und Prisma. Das Prisma muss einen höheren
Brechungsindex aufweisen als die Probe 𝑛p > 𝑛s und der Einfallswinkel 𝛽 des Lichtes muss
oberhalb des Grenzwinkels der Totalreflexion 𝛽krit liegen.
𝛽 > 𝛽krit = arcsin (
𝑛s
𝑛p) 2-3
2 Stand des Wissens und der Technik 6
Probe
dp < λ
β np
ns
DetektorLichtquelle Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Optik einer ATR-Messzelle mit drei Reflexionsstellen zwischen Probe
und Prisma.
Die optische Eindringtiefe 𝑑p (’penetration depth‘) ist abhängig von den Brechungsindizes 𝑛p
und 𝑛s, der Wellenlänge des Lichtes 𝜆 und dem Einfallswinkel 𝛽 (HARRICK, 1967):
𝑑p =
𝜆
2 ⋅ 𝜋 ⋅ 𝑛p ⋅ √sin2 𝛽 − (𝑛s
𝑛p⁄ )
2
2-4
Das ATR-Prisma muss dabei aus einem Material bestehen, welches das Licht gut transmittiert.
Im mittelinfraroten Spektralbereich eignen sich unter anderem Diamant und Zinkselenid
(ZnSe), die beide denselben Brechungsindex von 𝑛𝑝 = 2,4 besitzen. Für MIR-ATR-Optiken aus
diesen Materialien ist bei der Messung mit unpolarisiertem Licht die effektive Weglänge 𝑑eff
ungefähr das Zweifache der Eindringtiefe 𝑑p (AVERETT u. a., 2008). Mit der Anzahl der
Reflexionen 𝑁 zwischen dem ATR-Prisma und der Probe ergibt sich für die optische Weglänge
in der Probe 𝑑ATR:
𝑑ATR = 𝑁 ⋅ 𝑑eff
= 𝑁 ⋅ 2 ⋅ 𝑑p
=𝑁 ⋅ 𝜆
𝜋 ⋅ 𝑛p ⋅ √sin2 𝛽 − (𝑛s
𝑛p⁄ )
2
2-5
2.1.3 Spektrometrische Messaufbauten
Spektrometer erfassen die wellenlängenabhängige Absorption 𝐸(𝜆) einer Probe über einen
weiten Spektralbereich mit hoher Auflösung. Beispielsweise misst das FT-MIR-Spektrometer
Alpha von Bruker von 7500 cm-1 bis 360 cm-1 mit einer Auflösung besser als 2 cm-1 (BRUKER,
2011a, S. 93). Aufgrund der niedrigen Lichtintensitäten und der geringen Empfindlichkeit der
eingesetzten Detektoren werden im MIR-Bereich fast keine Gitterspektrometer, sondern
überwiegend Fourier-Transformationsspektrometer verwendet. Der Aufbau eines FT-MIR-
Spektrometers ist schematisch in Abbildung 2 dargestellt.
2 Stand des Wissens und der Technik 7
Abbildung 2: Aufbauschema eine FT-MIR-Spektrometers (BEUERMANN, 2016).
Aufgrund der unterschiedlich langen Lichtwege in den Interferometerarmen 𝐼(Δ𝑥) (Lichtweg
zum festen bzw. zum beweglichen Spiegel) entsteht ein polychromatisches Interferogramm in
Abhängigkeit der Spiegelposition Δ𝑥 . Per Fouriertransformation wird das Interferogramm
nach der Analog-Digital-Wandlung aus dem Ortsbereich in ein Spektrum im Wellenlängen-
bzw. Wellenzahlbereich überführt. Die Optik arbeitet demnach nicht dispersiv, d. h. das Licht
wird nicht in seine spektralen Komponenten zerlegt, sondern alle Wellenlängen treffen gleich-
zeitig auf den Detektor. Dies hat Vorteile bei der spektralen Auflösung und dem Signal-zu-
Rauschverhältnis im Vergleich zu Aufbauten mit Gitter-Monochromatoren. Für das Inter-
ferometer sind allerdings bewegte Teile in einer optischen Bank notwendig. Ebenso bedingt
die komplexe Signalverarbeitung den Einsatz leistungsfähiger Rechner.
FT-MIR-Laborspektrometer sind in der Forschung und Entwicklung, bei der Qualitätskontrolle
und in der Prozessanalysentechnik als Online-, Atline- oder Offline-Aufbauten etabliert.
Beispiele für Laborgeräte sind die Alpha- oder Tensor-Geräte von Bruker, die Nicolet-Serie von
ThermoFisher Scientific, oder das ReactIR 15 von Mettler Toledo. Die entsprechenden FT-MIR-
Prozessspektrometer sind beispielsweise Matrix-MF und IRcube von Bruker oder ReactIR 45P
von Mettler Toledo. Aufgrund des vibrationsempfindlichen Interferometers ist die Integration
in eine Prozessumgebung häufig schwieriger als bei NIR-Spektrometern, welche mit einem
monolithischen Gitter ausgestattet sind.
Durch den Einsatz von Lichtleitern aus Quarzglas kann ein NIR-Spektrometer zudem problem-
los 100 m entfernt von einer Messsonde platziert werden und damit außerhalb einer rauen
Betriebsumgebung. Mit fasergekoppelten MIR-Systemen ist dies nur sehr eingeschränkt
möglich, denn entsprechende Sonden mit MIR-Lichtleitern, wie bei den Systemen Matrix-MF
von Bruker (BRUKER, 2013), ReactIR von Mettler Toledo (METTLER TOLEDO, 2014) oder MB-Rx von
ABB (ABB, 2012), können nur kurze Distanzen von wenigen Metern überbrückt werden. Neben
IR-Detektor
(DTGS, MCT)
IR-Lichtquelle
(SiC, ZrO2/Y2O3)
Probe:
Pressling,
Küvette,
ATR-Aufbau
beweglicher
Spiegel
Kollimator-
spiegel
Zentralposition (Δx = 0)
Δx
fester Spiegel
PC
He-Ne-Laser
(l = 632,8 nm)
Strahlteiler,
Interferenz
Laser-Detektor
(Si-Photodiode)
2 Stand des Wissens und der Technik 8
der hohen Dämpfung sind MIR-Lichtleiter außerdem mechanisch empfindlich und erlauben
lediglich große Biegeradien, was einen flexiblen Einbau erschwert. Ebenso ist der verfügbare
Spektralbereich eingeschränkt: Bei Lichtleitern aus Arsen-Schwefel-Chalcogenidglas auf
6500-1600 cm-1, bei Lichtleitern aus Silber-Halogenid auf 3300-550 cm-1 (ART PHOTONICS, 2016).
Es bleibt abzuwarten, ob neuere Entwicklungen wie Hohlkernfasern (LASER COMPONENTS, 2012)
oder hochreine Arsen-Selen-Chalcogenidfasern (IRFLEX, 2015) zukünftig höhere Transmissions-
grade ermöglichen und von den Sondenherstellern eingesetzt werden.
2.1.4 Chemometrische Kalibration
Univariate und multivariate (chemometrische) Kalibration
Zum Erstellen quantitativer spektrometrischer Analysemethoden sind Kenntnisse über den
Zusammenhang zwischen den Absorptionsspektren 𝐸(𝜆) und den Analytkonzentrationen 𝑐𝑖
erforderlich (siehe Formel 2-2). Eine direkte Bestimmung der 𝑐𝑖 aus den gemessenen 𝐸(𝜆)
unter Berücksichtigung der Extinktionskoeffizienten 𝜀𝑖(𝜆) ist in der Regel nicht möglich, da die
𝜀𝑖(𝜆) von der Probenmatrix (Lösungsmittel, andere Analyten) und der Temperatur beeinflusst
werden. Spektrometrische Methoden zur quantitativen Analytbestimmung werden daher
empirisch anhand der Absorptionsspektren von Kalibrationsproben erstellt.
In Messanwendungen, bei denen spezifische Absorptionsbanden der einzelnen Analyten
spektral separiert vorliegen, ist eine univariate Kalibration der Analyten möglich. Dabei wird
jeweils ein skalares Merkmal für jeden Analyten aus den Spektren ermittelt, beispielsweise
die Fläche einer Absorptionsbande oder die Extinktion bei einer definierten Wellenzahl. Häufig
wird bei der Auswertung die Basislinie anhand von einem oder zwei Punkten neben der
Absorptionsbande korrigiert, um temporäre Drifteffekte zu kompensieren. Durch eine
einfache lineare Regression der gemessenen Extinktion bzw. Fläche gegen die Analytkonzen-
trationen werden die Parameter (Achsenabschnitt und Steigung) der linearen Kalibrations-
funktion bestimmt (GÜNZLER, 2003).
Falls die Absorptionsbanden der einzelnen Analyten überlappen, ist eine univariate Auswerte-
methode nicht mehr anwendbar. Dies ist zum Beispiel der Fall bei der in dieser Arbeit
beschriebenen Analyse von Reaktionsmischungen bei der Veresterung von Ameisensäure und
Ethanol mit anschließender Destillation (siehe Kapitel 5 sowie Abbildung 10). Eine quantitative
Auswertung ist dennoch möglich mittels multivariater Kalibration (Chemometrie), bei der das
gesamte Spektrum – oder zumindest große Teile davon – für ein lineares Modell verwendet
werden. Der Erfolg einer multivariaten Methode hängt entscheidend davon ab, inwieweit sich
die Absorptionsspektren der einzelnen Analyten charakteristisch unterscheiden. In der
optischen Spektroskopie werden am häufigsten die PLSR (partial least squares regression) und
die PCR (principal component regression) zur quantitativen Analyse eingesetzt (HAALAND &
THOMAS, 1988). Die hierfür notwendigen Schritte sind in Abbildung 3 als Ablaufschema
2 Stand des Wissens und der Technik 9
dargestellt. Eine direkte MLR (multiple linear regression) ohne vorherige Hauptkomponenten-
analyse der Kalibrationsspektren ist nicht sinnvoll, da die Spektren üblicherweise multi-
kollinear sind. Bedingt ist dies durch mehrere Absorptionsbanden eines Analyten und die
Breite der Banden über mehrere Datenpunkte hinweg. Dies kann zu Singularitäten bei der
Regression und zu instabilen Modellen führen (OTTO, 2007, S. 201).
Planen des Kalibrations-probensatzes
Vermessen der Kalibrationsproben
PCR oder PLSRmit Kreuz- oder
Test-Set-Validierung
Beurteilen der Methode:
Zufriedenstellend?
Optimierung
neinjaMethode geeignet zur Probenanalyse
Vorverarbeiten der Kalibrationsspektren
Abbildung 3: Ablaufschema zum Erstellen einer chemometrischen PCR- oder PLSR-Methode.
Strategien zur Erstellung eines Kalibrationsprobensatzes
Für eine erfolgreiche Kalibration mittels PCR oder PLSR müssen Korrelationen zwischen den
abhängigen Variablen (Analytkonzentrationen) im Kalibrationsprobensatz vermieden werden.
Das „Design of Experiment“ ist daher idealerweise orthogonal angelegt. Die Variation der
Analyten erfolgt dann linear unabhängig voneinander. In der Literatur sind hierzu diverse
Ansätze beschrieben (central composite, BOX-BEHNKEN, LATTICE u. a.) (DEMING & MORGAN, 1993;
OTTO, 2007), die beispielsweise von der Chemometrie-Software Unscrambler von CAMO
unterstützt werden (CAMO, 2006). Die praktische Umsetzung dieser systematischen Ansätze
ist anhand von Beispielen in der Literatur beschrieben (ADAMS, 2004; CORNELL, 2002).
Die Spektroskopiesoftware OPUS von Bruker zeigt einen anderen Weg: Mit der Funktion
“Kalibrations-Design“ wird nach Vorgabe der Komponenten und der zugehörigen Konzen-
trationsbereiche ein zufällig zusammengesetzter Kalibrationsprobensatz vorgeschlagen, der
auf seine Varianz geprüft wird. Bestimmtheitsmaße zwischen jeweils zwei Analyten, die
kleiner sind als 0,7, gelten als akzeptabel (BRUKER, 2011b, S. 60).
Spektrenvorverarbeitung
Vor der eigentlichen Modellerstellung können die Kalibrationsspektren vorverarbeitet werden,
mit dem Ziel ein besseres Kalibrationsmodell zu erhalten. Die spektralen Informationen
werden verändert, um den Einfluss systematischer (z. B. Offset) und zufälliger Störungen (z. B.
Rauschen) zu reduzieren. Hierzu werden unter anderem die Subtraktion einer Konstanten
2 Stand des Wissens und der Technik 10
oder einer Geraden, die erste und zweite Ableitung, Vektornormierung, Minimum-Maximum-
Normierung und die Multiplikative Streukorrektur eingesetzt. Für die in dieser Arbeit ange-
wendete PLSR führte eine Vorverarbeitung der Spektren nicht zu einem besseren Kalibrations-
modell (siehe 3.1.3). Daher werden die einzelnen Möglichkeiten zu Vorverarbeitung hier nicht
näher erläutert.
Erstellen und Validieren des Kalibrationsmodells
Aus den Kalibrationsspektren wird nach einer etwaigen Vorverarbeitung ein Kalibrations-
modell mittels Regression erstellt. Bei der hier eingesetzten PLSR wird die große Zahl an (multi-
kollinearen) unabhängigen Variablen (Anzahl der Datenpunkte in den Spektren) auf wenige
(linear unabhängige) „latente“ Variablen reduziert. Diese geben die analytabhängigen
Veränderungen in den Absorptionsspektren wieder; Zur Analytvorhersage irrelevante
Informationen bleiben außen vor. Im Gegensatz dazu beschreiben die Hauptkomponenten der
Kalibrationsspektren, welche innerhalb einer PCR zur Dimensionsreduktion berechnet werden,
sämtliche spektrale Unterschiede im Kalibrationsspektrensatz. Dies ist jedoch nicht zwangs-
läufig die beste Basis für eine quantitative Vorhersage (ABDI, 2010, S. 98).
Mittels PLSR ist es möglich, ein Kalibrationsmodell zur gleichzeitigen Vorhersage mehrerer
Analyten zu erstellen (PLS 2), wobei auch die Korrelationen zwischen den abhängigen
Variablen (Analyten) in das Modell einfließen. Solche Kalibrationen sind zwar unempfindlich
gegen Rauschen, jedoch werden Kalibrationsexperimente üblicherweise orthogonal angelegt
(siehe oben) und enthalten daher keine oder nur geringe Korrelationen zwischen den Analyten.
Dies stellt eine möglichst unabhängige Analytbestimmung sicher. Dagegen haben separate
PLS-Modelle für jeden einzelnen Analyten (PLS 1) den Vorteil, Nichtlinearitäten besser berück-
sichtigen zu können und werden deshalb bevorzugt eingesetzt (CAMO, 2006, S. 115).
Die Mathematik der PLSR ist in der Literatur eingehend beschrieben und entsprechende
Regressionsalgorithmen (NIPALS, SIMPLS u. a.) sind als Softwareroutinen verfügbar, sodass
eine weitere Betrachtung an dieser Stelle nicht erforderlich ist (ADAMS, 2004; OTTO, 2007;
WEHRENS, 2011). Für die Leistungsfähigkeit einer chemometrischen Methode ist ohnedies ein
sorgfältig geplanter Kalibrationsprobensatz und eine geeignete Vorverarbeitung der Spektren
entscheidender als die Wahl der Regressionsmethode (WEHRENS, 2011, S. 162).
Ein Qualitätsparameter zur internen Bewertung einer Regression ist der RMSECV (root mean
squared error of cross validation), in welchem der zu erwartende Fehler in der Einheit des
kalibrierten Analyten abgeschätzt wird:
RMSECV = √∑(𝑐𝑖,true − 𝑐𝑖,predicted)
2
𝑛
𝑛
𝑖=1
. 2-6
2 Stand des Wissens und der Technik 11
Zur Berechnung des RMSECV wird für alle 1 … 𝑛 Kalibrationsproben jeweils ein PLS-Modell
basierend auf 𝑛 − 1 Proben erstellt und mit diesem anhand des ausgelassenen Spektrums die
Konzentration 𝑐𝑖,predicted vorhergesagt. Die Wurzel der mittleren quadratischen Abwei-
chungen zwischen den wahren Konzentrationen 𝑐𝑖,true und den vorhergesagten 𝑐𝑖,predicted
ergibt den RMSECV. Dieser ist ein Maß für den Fehler eines Regressionsmodells unter
Verwendung aller Kalibrationsproben. Neben der Kreuzvalidierung gibt es weitere Heran-
gehensweisen zur Modellvalidierung, wie beispielsweise die Test-Set-Validierung, bei welcher
der Probensatz in Kalibrationsproben und zu analysierende Proben geteilt wird. Diese wurde
hier jedoch nicht eingesetzt, da der verwendete Datensatz (51 Proben) nicht ausreichend groß
war.
Anhand des Bestimmtheitsmaßes 𝑅2 ( 0 ≤ 𝑅2 ≤ 1 ) kann beurteilt werden, inwieweit die
vorhergesagten und wahren Konzentrationen miteinander korrelieren:
𝑅2 = (
Cov(𝑐𝑖,true 𝑐𝑖,predicted)
Var(𝑐𝑖,true) ⋅ Var(𝑐𝑖,predicted))
2
, 2-7
mit der Kovarianz Cov(𝑐𝑖,true 𝑐𝑖,predicted) zwischen den vorhergesagten und den wahren (z. B.
eingewogenen) Konzentrationen und den jeweiligen Varianzen Var(𝑐𝑖,true) und
Var(𝑐𝑖,predicted). Mit Hilfe von 𝑅2 kann ein geeigneter Rang (Anzahl der latenten Variablen) für
die chemometrische Methode gefunden werden. Ein gewählter Rang ist als gut zu bewerten,
falls ein höherer Rang zu keinem signifikant verbesserten 𝑅2 führt. Bei einem zu hohen Rang
enthalten die zusätzlichen latenten Variablen dann keine für Kalibration relevanten Infor-
mationen mehr. Dadurch werden störende Anteile spektralen Rauschens mit in die PLSR
aufgenommen (’overfitting‘), was zu einer Verschlechterung der Analysenergebnisse führt
(CONZEN, 2005, S. 11, 60).
2.2 MIR-ATR-Sensorik
2.2.1 Messaufbau und Komponenten
Wie bereits in Kapitel 2.1 beschreiben wurde, ist es aufwändig ein FT-MIR-ATR-Spektrometer-
system in eine Prozessumgebung zu integrieren. Anstatt flüssige Proben anhand molekül-
spezifischer MIR-Absorptionsbanden (überwiegend Grundschwingungen) zu vermessen, wird
in der Prozessanalytik häufig auf den NIR-Spektralbereich (Ober- und Kombinations-
schwingungen) ausgewichen, da hier lange Quarzlichtleiter eingesetzt werden können. Dies
ermöglicht es, die faseroptische Messsonde direkt am Reaktor zu installieren und Lichtquelle
sowie Spektrometer räumlich getrennt unterzubringen. Für die Gasphase gibt es hingegen für
eine Vielzahl von Analyten Geräte, welche die Absorption im mittelinfraroten Spektralbereich
zur quantitativen Bestimmung nutzen (ABB, 2013; BLUESENS, 2016; EMERSON, 2015). Diese filter-
basierten IR-Gasanalysatoren mit Transmissionsküvette sind robust, weil kein empfindliches
Interferometer verbaut ist. Sie erfassen kein Spektrum, sondern lediglich die mittlere
2 Stand des Wissens und der Technik 12
Extinktion im Durchlassbereich der eingesetzten Bandpassfilter. Für MIR-Messungen in der
Flüssigphase sind Schichtdicken von wenigen Mikrometern erforderlich. Dies ist mit Küvetten
kaum noch zu realisieren, sodass auf die ATR-Technik ausgewichen wird. Photometrische MIR-
ATR-Messaufbauten werden bisher jedoch kaum angeboten (siehe 2.2.2), obwohl viele
chemische und biochemische Reaktionen mit großer wirtschaftlicher Bedeutung in der Flüssig-
phase stattfinden. Daher besteht für photometrische MIR-ATR-Sensoren ein großes Potenzial
in der Prozessanalysentechnik. Ein möglicher Aufbau eines solchen Sensors ist in Abbildung 4
schematisch dargestellt. Die optischen Bauelemente im Lichtweg sind im Folgenden näher
beschrieben. Die Elektronik wird unter Kapitel 3.3 erläutert.
Lichtquelle ATR-Optik Detektorenoptische
Bandpass-filter
Steuerung, Kalibration,
Anzeige
Verstärkung,ADC
DemodulationModulation
Lichtweg
Elektronik
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines MIR-ATR-Sensors.
In filterbasierten IR-Sensoren werden üblicherweise breitbandige Schwarzkörperstrahler als
Lichtquelle eingesetzt. Einige Hersteller bieten Typen an, die elektronisch moduliert werden
können – zum Teil mit Frequenzen oberhalb von 10 Hz (AXETRIS, 2014; HELIOWORKS, 2010;
MICRO-HYBRID ELECTRONIC GMBH, 2016). Ein aufwändiges mechanisches ’choppen‘ zur Störunter-
drückung kann dadurch entfallen. Preisgünstige Mikroglühlampen, welche sich ebenfalls
elektronisch modulieren lassen, werden oftmals in IR-Gassensoren, beispielsweise zur CO2-,
Ethanol- oder Methanbestimmung, als Lichtquelle eingesetzt. Diese emittieren aufgrund der
begrenzten Transmission des Glaskörpers jedoch lediglich Licht bis zu einer Wellenlänge von
ca. 4,5 µm und können damit nicht für den hochselektiven und sensitiven Spektralbereich
unterhalb von 2000 cm-1 eingesetzt werden (HEIMANN SENSOR, 2008a).
Die von der IR-Lichtquelle emittierten Photonen passieren die ATR-Optik und werden dabei
zum Teil während der abgeschwächten Totalreflexion in der Probe absorbiert. Die ATR-Optik
ist aufgebaut wie die in MIR-ATR-Spektrometern verwendete (siehe 2.1.2).
Das spektrale Ansprechverhalten der Detektorkanäle in einem MIR-ATR-Sensor wird von den
Transmissionsbereichen der optischen Bandpässe bestimmt. Für eine hohe Sensitivität und
Spezifität sollten diese idealerweise bei einer Absorptionsbande eines Analyten oder in einem
geeigneten Referenzbereich liegen. Außerhalb davon sollten sie möglichst gut blockieren.
Hierfür eignen sich Interferenzfilter mit Halbwertsbreiten (FWHM: full width at half maximum
transmission) von ca. 30 cm-1 im Bereich 4000-1500 cm-1 und mit ca. 20 cm-1 bei kleineren
Wellenzahlen, wie sie von Spectrogon AB (Schweden) oder Northumbria Optical Coatings (UK)
2 Stand des Wissens und der Technik 13
angeboten werden (LASER COMPONENTS, 2013; SPECTROGON, 2015). In dieser Größenordnung
liegen auch die Halbwertsbreiten von typischen MIR-Absorptionsbanden. Es gibt auch Filter
mit größeren oder kleineren Halbwertsbreiten. Sind die Filter breitbandiger als die
Absorptionsbande, dann führt dies zu Nichtlinearitäten (Abweichung von LAMBERT-BEER-
Gesetz). Dagegen haben schmale Filter niedrige Lichtintensitäten zur Folge, was sich in einem
kleineren Störabstand des Sensors niederschlagen würde.
Üblicherweise sind die optischen Filter in das Detektorgehäuse integriert und werden bei der
Herstellung des Detektors in den Deckel eines Standard-Halbleitergehäuses montiert, z. B.
TO-46, TO-39 oder TO-8 (JEDEC, 2016). Derzeit werden Sensoren mit einem, zwei, drei oder
vier optischen Filtern und zugehörigen Detektorelementen angeboten (HEIMANN SENSOR, 2014;
INFRATEC, 2016; LASER COMPONENTS, 2015; MICRO-HYBRID, 2016). Zum Teil ist für jeden Kanal auch
ein Vorverstärker integriert. In solchen integrierten Mehrkanaldetektoren wird das pyro-
elektrische Material Lithiumtantalat (LiTaO3) oder eine als Silizium-Halbleiterstruktur auf-
gebaute Thermosäule (elektrische Reihenschaltung von mehreren zehn Thermoelementen)
zur thermischen Strahlungsdetektion eingesetzt. Solche Detektorelemente sind preisgünstig
und erfassen einen sehr breiten Spektralbereich von UV über VIS, NIR, MIR bis FIR (fernes
Infrarot). Typen für den Massenmarkt, beispielsweise zum Einsatz in Bewegungsmeldern,
kosten mit integriertem Filter nur wenige Euro (FARNELL ELEMENT14 DEUTSCHLAND, 2016). Ein
Nachteil thermischer Strahlungsdetektoren besteht in ihrer geringen spezifischen Detektivität.
Anhand dieser lassen sich Photodetektoren unterschiedlicher Prinzipien hinsichtlich ihrer
Leistungsfähigkeit vergleichen (PIOTROWSKI & ROGALSKI, 2007, S. 6f). In Tabelle 1 sind hierzu
wichtige Kenngrößen kommerziell verfügbarer MIR-Detektoren aufgelistet.
Es ist zu erkennen, dass die photoelektrischen Detektoren eine wesentlich höhere spezifische
Detektivität als die thermischen aufweisen. Diese decken jedoch entweder nicht den
kompletten mittelinfraroten Spektralbereich ab (InAs und PbSe) oder können aufgrund ihres
Preises und der benötigten Kühlung mit flüssigem Stickstoff nicht in einen Sensor integriert
werden (HgCdTe/InSb Sandwich). Den bislang größten bekannten pyroelektrischen Effekt
bietet L-Alanin dotiertes deuteriertes Triglycinsulfat (DLaTGS). Die bei Raumtemparatur
theoretisch maximal mögliche spezifische Detektivität liegt bei 1,8 ∙ 1010 cm Hz1/2 W-1
(INFRATEC, 2013a, S. 7). Kommerziell verfügbare DLaTGS-Sensoren erreichen allerdings nur
Werte, welche um eine Größenordnung niedriger liegen. Der Sensoreffekt von DLaTGS geht
oberhalb der Curie-Temperatur von 61 °C verloren und nur die Dotierung mit L-Alanin
verhindert einen permanenten Funktionsverlust. Da in der Praxis diese Temperatur über-
schritten werden kann, ist DLaTGS nicht für den Einsatz in einem Sensor geeignet. Somit
kommen für einen MIR-Sensor nur thermische Detektoren auf Basis von LiTaO3 oder
Thermosäulen in Frage.
2 Stand des Wissens und der Technik 14
Tabelle 1: Vergleich von MIR-Detektoren nach Prinzip und Spektralbereich. Aufsteigend sortiert nach spezifischer Detektivität.
Detektions-prinzip
Detektormaterial Spez. Detektivität
cm Hz1/2 W-1 Kosten Spektralbereich
µm
thermisch (thermo-
elektrisch)
Thermosäule (Thermoelemente
in Reihe)
1,5 ∙ 108 (HEIMANN SENSOR,
2008b) niedrig
meist 0,1 bis 100, teils 0,1 bis 1000, abhängig von der
Absorptions-schicht
thermisch (pyroelektrisch)
LiTaO3 bis 6,0 ∙ 108
(INFRATEC, 2016) niedrig
DLaTGS bis 1,1 ∙ 109
(LASER COMPONENTS, 2015, S. 75)
mittel
Photoelektrisch (photovoltaisch)
InAs bei +25 °C bis 1,0 ∙ 1010
(LASER COMPONENTS, 2015, S. 39)
mittel 1,6 bis 3,5
photoelektrisch (photoleitend)
PbSe bei -30 °C (peltiergekühlt)
bis ca. 2,0 ∙ 1010 (Laser Components,
2015, S. 57) mittel 1,0 bis 4,9
HgCdTe/InSb Sandwich bei -196 °C (gekühlt mit
flüssigem Stickstoff)
bis 1,0 ∙ 1011 (LASER COMPONENTS,
2009, S. 10) hoch 2,0 bis 15
2.2.2 Kalibrationsmethode
Die optischen Bandpässe in den Kanälen des MIR-ATR-Sensors werden so gewählt, dass
möglichst spezifische Analytbanden erfasst werden. Damit sind die Korrelationen zwischen
den einzelnen Kanälen gering – eine geeignete Planung des Kalibrationsprobensatzes voraus-
gesetzt (siehe 2.1.4 ’design of experiment‘). Im Gegensatz zu den multikollinearen MIR-ATR-
Spektren ist daher eine Kalibration basierend auf den Kanälen des MIR-ATR-Sensors per multi-
linearer Regression (MLR) möglich. Eine Reduktion auf wenige „latente“ Variable durch eine
PLSR oder auf wenige Hauptkomponenten bei einer PCR ist nicht erforderlich.
Bei der Kalibration wird mittels multilinearer Regression ein Zusammenhang zwischen den
Konzentrationen in den Kalibrationsproben 𝑐true und den gemessenen Extinktionen 𝐸𝑖 in den
𝑝 (hier 𝑝 = 4 ) Sensorkanälen ermittelt. Mit den so erhaltenen Koeffizienten 𝛼 und 𝛽𝑖
gestatten es anschließend bei zu analysierenden Proben die gemessenen Extinktionen in die
gesuchte Konzentration umzurechnen.
𝑐predicted = 𝛼 + ∑ 𝛽𝑖 ⋅ 𝐸𝑖
𝑝
𝑖=1
2-8
Für jeden Analyten wird ein eigenständiges MLR-Modell 𝑐predicted = 𝑓(𝐸𝑖) erstellt. Die Anzahl
𝑛 der dafür verwendeten Proben muss dabei deutlich größer sein als die Anzahl der zu
bestimmenden Parameter (𝑛 > 𝑝 + 1). Die MLR ist im Detail in der Literatur beschrieben
(OTTO, 2007, S. 200ff) und entsprechende Algorithmen sind als Funktionen in PC-Software
2 Stand des Wissens und der Technik 15
vorhanden, beispielsweise RGP() in Microsoft Excel, glmfit() in Mathworks MATLAB oder lm()
in der Statistiksprache R. Zur Beurteilung einer erstellten MLR-Kalibration dienen das
Bestimmtheitsmaß 𝑅2 zwischen 𝑐𝑖,trueund 𝑐𝑖,predicted (siehe Formel 2-7) und der Kalibrations-
fehler SEC (standard error of calibration), welcher ein Maß für die zu erwartende Genauigkeit
der Methode ist.
SEC = √∑ (𝑐𝑖,true − 𝑐𝑖,predicted)
2𝑛𝑖=1
𝑛 − 𝑝 − 1 2-9
Zusätzlich kann das Modell mit 𝑚 weiteren Proben mit bekannter wahrer Analytkonzentration
𝑐𝑖,true (Einwaage oder Referezmethode) anhand des Bestimmtheitsmaßes 𝑅2 und des Vorher-
sagefehlers SEP (standard error of prediction) extern validiert werden.
SEP = √∑ (𝑐𝑖,true − 𝑐𝑖,predicted)2𝑚
𝑖=1
𝑚 2-10
2.2.3 Stand der Technik
Hach Lange (Düsseldorf) bietet einen Inline MIR-ATR-Sensor für die Getränkeindustrie zur
Bestimmung der Analyten Ethanol, CO2, Zucker und organische Säuren an (HACH LANGE, 2014;
VITALSENSORS, 2012). Dessen Optik basiert auf einem ATR-Prisma aus Saphir mit drei
Reflexionen. Der Spektralbereich ist somit auf unter ca. 4,5 µm bzw. über 2200 cm-1
eingeschränkt (KORTH KRISTALLE GMBH, 2016). Lediglich für gelöstes CO2 kann damit auf eine
intensive und spezifische Absorptionsbande bei 2343 cm-1 (FALK & MILLER, 1992) kalibriert
werden. Die übrigen Analyten werden lediglich anhand vergleichsweise unspezifischer
Banden erfasst (z. B. C-H-Streckschwingung bei 3000 cm-1). Anton Paar (Graz) bietet einen
Sensor mit baugleicher ATR-Optik lediglich zur Bestimmung von gelöstem CO2 an (ANTON PAAR,
2013, S. 520). Der VitalSensor kann mit seiner Saphiroptik die Hauptabsorptionsbanden
typischer Analyten in der Getränkeindustrie nicht erfassen, da diese im langwelligen
Fingerprintbereich liegen (Ethanol bei 1045 cm-1, C=O-Bande der Carbonsäuren bei 1700 cm-1,
Zucker bei 1200-1000 cm-1). Der mögliche Vorteil einer hochselektiven MIR-Absorptions-
messung gegenüber der klassischen indirekten Extrakt- und Ethanolbestimmung per
Brechungsindex und Schallgeschwindigkeit wird daher nicht genutzt.
Theuer u. a. beschreiben einen experimentellen MIR-ATR-Sensor zur Detektion von Isocya-
naten in der Flüssigphase (THEUER u. a., 2015). Deren Hauptabsorptionsbanden (-N=C=O)
liegen bei 2275 cm-1 und sind intensiv sowie frei von Überlagerung anderer relevanter
Analyten. Zudem können diese mit optischen Standardfiltern aus der CO2-Gasanalytik erfasst
werden (INFRATEC, 2013b, S. 5). Der Prototyp des Sensors nutzt ebenfalls ein Saphirprisma mit
Mehrfachreflexion. Dies ermöglicht Konzentrationsmessungen bis in den Bereich von ppm.
Sowohl das ATR-Prisma als auch die als Lichtquelle verwendete Mikroglühlampe
2 Stand des Wissens und der Technik 16
(INTERNATIONAL LIGHT TECHNOLOGIES, 2002) lassen keine Anpassung des Sensors auf andere
Analyten im hochselektiven Spektralbereich unterhalb von 2200 cm-1 zu.
Dagegen verwendet der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte MIR-ATR-Sensor eine IR-
Lichtquelle ohne spektral limitierendes Glasfenster und ZnSe als ATR-Material. Dies
ermöglicht Absorptionsmessungen von ca. 4000 cm-1 bis 620 cm-1.
2.3 Chemischer Musterprozess Veresterung
2.3.1 Reaktionsmechanismus
Zur Erprobung des entwickelten MIR-ATR-Sensors in einem chemischen Musterprozess wird
eine Veresterung von Ameisensäure und Ethanol zu Ethylformiat und Wasser mit
anschließender Destillation verfolgt. Ausgehend von den Edukten Säure und Alkohol bauen
sich die Produkte Ester und Wasser säurekatalysiert bis zum dynamischen Gleichgewicht auf,
die Edukte entsprechend ab (FISCHER-Veresterung).
HCOOH + C2H5OH ⇌ HCOOC2H5 + H2O
Ameisensäure + Ethanol ⇌ Ethylformiat + Wasser
AS + ET ⇌ EF + W
Dabei erfolgt sowohl die Hinreaktion (Veresterung) als auch die Rückreaktion (Hydrolyse) über
mehrere Zwischenschritte, an welchen die katalytische Wirkung einer deprotonierten Säure
zu erkennen ist (Abbildung 5). Verwendet werden üblicherweise Salz- oder Schwefelsäure
(HART & KINDLER, 2007). Die einzelnen Schritte sind in der Literatur eingehend beschrieben
(NELSON u. a., 2013).
Abbildung 5: Reaktionsmechanismus zur Veresterung bzw. Hydrolyse von Carbonsäureestern (LATSCHA u. a.,
2008).
Eine Base wirkt ebenfalls katalytisch, jedoch bilden die Basenkationen (z. B. Na+) mit der
Ameisensäure ein Salz (Formiat), sodass eine basisch katalysierte Hydrolyse (Verseifung)
irreversibel verläuft (LATSCHA u. a., 2008). Für den Einsatz in einem Versuch mit dem Ziel der
Esterbildung, sind Basen demnach nicht als Katalysatoren geeignet.
2 Stand des Wissens und der Technik 17
2.3.2 Dynamisches Gleichgewicht
Zwischen der Veresterung und der Hydrolyse stellt sich ein dynamisches Gleichgewicht ein.
Die Lage des Gleichgewichtes beschreibt das Massenwirkungsgesetz:
𝐾 = ∏ 𝑎𝑖
𝜈𝑖
𝑛
𝑖=1
2-11
Mit der Gleichgewichtskonstante 𝐾, dem Stoffindex 𝑖, der Anzahl der Reaktionspartner 𝑛, der
Aktivität 𝑎 und dem stöchiometrischen Koeffizienten 𝜈. Für stark verdünnte Lösungen ohne
Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und gelöstem Stoff (ideale Lösungen) gilt mit der
Standardkonzentration 𝑐0 = 1 mol L−1 (MOORE & PATERNO, 1990):
𝑎𝑖 = 𝑐𝑖
𝑐0 2-12
Für die vorliegende Veresterung ergäbe sich im Gleichgewicht (𝑒 = equilibrium):
𝐾 =
𝑐𝑒(EF) ⋅ 𝑐𝑒(W)
𝑐𝑒(AS) ⋅ 𝑐𝑒(ET) 2-13
Aufgrund der hohen Konzentration der Stoffe liegen jedoch keine verdünnten Lösungen vor.
Das so formulierte Massenwirkungsgesetz ist folglich nur sehr eingeschränkt gültig (siehe
unten).
Die Gleichgewichtskonstante1 𝐾 ist für flüssige Systeme nur schwer theoretisch zu bestimmen.
Es gilt zwar auch hier der allgemeingültige Zusammenhang im Gleichgewicht zwischen 𝐾 und
der Änderung der freien Standardenthalpie2 Δ𝐺0 , diese lässt sich jedoch ebenso nur für
verdünnte Lösungen näherungsweise errechnen (MOORE & PATERNO, 1990):
Δ𝐺0 = −𝑅𝑇 ln 𝐾 2-14
mit der universellen Gaskonstante 𝑅 und der absoluten Temperatur 𝑇.
Somit ist es nicht möglich die zu erwartenden Gleichgewichtskonzentrationen über das
Massenwirkungsgesetz und eine errechnete Gleichgewichtskonstante zu bestimmen.
Prinzipielle Wirkungszusammenhänge lassen sich am Massenwirkungsgesetz jedoch erkennen:
1 Die berechnete Gleichgewichtskonstante 𝐾 ist bezogen auf die Einheit 𝑐0 = 1 mol L−1. In der Literatur wird diese als 𝐾𝑐 bezeichnet. Bei der beschriebenen Reaktion sind die stöchiometrischen Koeffizienten 𝜈 entweder +1
oder -1, deswegen folgt aus dem Massenwirkungsgesetz, dass 𝐾𝑐 gleich der auf Stoffmengenanteil in mol mol−1 bezogenen Gleichgewichtskonstanten 𝐾𝑎 ist. In dieser Arbeit wird daher nicht zwischen 𝐾𝑎 und 𝐾𝑐 unterschieden. Zudem beziehen sich sämtliche Betrachtungen auf die Flüssigphase, sodass die auf Partialdrücke bezogene Gleichgewichtskonstante 𝐾𝑝 nicht relevant ist. 2 Δ𝐺0 bezieht sich hier auf die Standardbedingungen der Chemie: Temperatur 0 °C und 1 bar Druck.
2 Stand des Wissens und der Technik 18
- Das Gleichgewicht kann auf die Seite der Produkte verschoben werden, indem ein
Edukt im Überschuss vorgelegt wird oder ein Produkt entzogen wird.
- Wenn Schwefelsäure eingesetzt wird, hat dies eine zweifache Wirkung auf die
Reaktion: Die Beschleunigung der Reaktion (Katalyse) und das Verschieben des
Gleichgewichtes zur Produktseite durch das Binden von Wasser (LATSCHA u. a., 2008).
Kuhnert (KUHNERT, 2004) hat unter anderem die Gleichgewichtskonzentrationen der hier
eingesetzten Veresterungsreaktion von Ameisensäure und Ethanol zu Ethylformiat und
Wasser untersucht. Das Stoffmengenverhältnis von Ameisensäure zu Ethanol in der Vorlage
wurde hierbei über den gesamten Bereich von fast reinem Alkohol bis zu fast reiner Säure
variiert. Die Gleichgewichtskonzentrationen wurden messtechnisch ermittelt und liegen in
sehr gutem Einklang mit einer entsprechenden UNIFAC 3 -Prozesssimulation. Mit diesen
Gleichgewichtskonzentrationen lässt sich das Massenwirkungsgesetzt nach 2-13 auf Gültigkeit
überprüfen.
Für die Gleichgewichtskonstante wird ein vom Vorlageverhältnis Ameisensäure zu Ethanol
unabhängiger Wert erwartet. Tatsächlich variiert die „Konstante“, wie in Abbildung 6
ersichtlich, im Bereich von ca. 3-8, was die beschränkte Gültigkeit von 2-13 bestätigt.
Abbildung 6: Gleichgewichtskonstante der Veresterung abhängig vom Anteil der Ameisensäure in der
Vorlage nach (KUHNERT, 2004, Abb. 38).
Unter der Voraussetzung, dass anfangs ( 𝑡0 = 0 h ) noch keine Produkte vorhanden sind
(𝑐0(W) = 𝑐0(EF) = 0 mol L−1), können mit diesen abgeschätzten und empirisch bestätigten
Werten für 𝐾 – bei bekannten Einwaagekonzentrationen der Edukte 𝑐0(ET) und 𝑐0(AS) – die
3 Abkürzung für Universal Quasichemical Functional Group Activity Coefficients, ein Verfahren zur Abschätzung von Aktivitätskoeffizienten nach dem Prinzip der Mischung von Strukturgruppen.
0
2
4
6
8
10
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Gle
ich
gew
ich
tsko
nst
ante
Stoffmengenanteil Ameisensäure in der Vorlage
2 Stand des Wissens und der Technik 19
Verhältnisse im Gleichgewicht vorhergesagt werden. Aus dem Massenwirkungsgesetz und der
Stöchiometrie der Reaktion ergibt sich der umgesetzte Anteil 𝑐𝑥 bis zum Gleichgewicht:
𝐾 =
𝑐𝑥2
(𝑐0(AS) − 𝑐𝑥) ⋅ (𝑐0(ET) − 𝑐𝑥) 2-15
Hierbei ist 𝑐𝑥 gleich der Konzentration der Produkte im Gleichgewicht: 𝑐𝑥 = 𝑐𝑒(EF) = 𝑐𝑒(W)
und ebenso gleich der Abnahme der Edukte: 𝑐𝑒(AS) = 𝑐0(AS) − 𝑐𝑥, 𝑐𝑒(ET) = 𝑐0(ET) − 𝑐𝑥.
Löst man die quadratische Gleichung 2-15 nach 𝑐𝑥 auf, so erhält man:
𝑐𝑥1,2
=𝐾
2(𝐾 − 1)⋅ (𝑐0(AS)+𝑐0(ET))
±√𝐾2
4(𝐾 − 1)⋅ (𝑐0(AS)+𝑐0(ET)) −
𝐾
𝐾 − 1⋅ 𝑐0(AS) ⋅ 𝑐0(ET)
2-16
Dabei kann der positive Wurzelterm ausgeschlossen werden, da wegen 𝐾 > 1 (siehe
Abbildung 6) bereits 𝐾
2(𝐾−1)⋅ (𝑐0(AS)+𝑐0(ET)) größer ist als min{𝑐0(AS), 𝑐0(ET)}. Es kommt
lediglich der Ausdruck mit negativem Wurzelterm als Lösung in Frage, da nicht mehr Edukt
umgesetzt werden kann als ursprünglich eingewogen wurde, 𝑐𝑥 ≤ min{𝑐0(AS), 𝑐0(ET)}.
𝑐𝑥 =
𝐾
2(𝐾 − 1)⋅ (𝑐0(AS)+𝑐0(ET))
−√𝐾2
4(𝐾 − 1)⋅ (𝑐0(AS)+𝑐0(ET)) −
𝐾
𝐾 − 1⋅ 𝑐0(AS) ⋅ 𝑐0(ET)
2-17
Die zu erwartenden Produktkonzentrationen im Gleichgewicht lassen sich somit anhand der
Gleichgewichtskonstanten aus Abbildung 6 und Formel 2-17 vorhersagen.
2.4 Biotechnologischer Musterprozess Hefefermentation
2.4.1 Backhefe als Modellorganismus
Bereits seit Beginn der Erforschung von Mikroorganismen ab ca. 1850 wird die Fermentation
von Hefen auch in großtechnischen, wirtschaftlich bedeutenden Verfahren eingesetzt (SAHM
u. a., 2013). Bis heute ist die Kultivierung von Hefe Grundlage vieler biotechnologischer
Prozesse, beispielsweise für die Herstellung von Medizinprodukten oder Lebensmitteln
(Backwaren, Bier, Wein) oder für die Ethanolproduktion für Kraftstoffe. Seit Mitte der 1930er
Jahre werden Stämme der Spezies Saccharomyces cerevisiae, umgangssprachlich Backhefen,
auch als Modellorganismen in der Forschung und Lehre eingesetzt (HERSCHEL ROMAN, 1981).
Die Molekular- und Zellbiologie ist gut beschrieben, die Stoffwechselvorgänge sind bekannt
(WALKER, 1998). Backhefen können im Vergleich zu anderen Modellorganismen wie
Säugerzellen oder Kolibakterien in kurzer Zeit und unter unkritischen Bedingungen kultiviert
2 Stand des Wissens und der Technik 20
werden. Die Verfolgung einer Hefefermentation ist daher ein gut geeigneter Musterprozess
zur Erprobung des MIR-ATR-Sensors in einer biotechnologischen Anwendung.
2.4.2 Der Stoffwechsel von Hefe
Hefe kann sowohl unter Anwesenheit von Sauerstoff (aerob) als auch unter dessen Ausschluss
(anaerob) leben. In beiden Fällen katabolisiert die Zelle eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose,
C6H12O6) zunächst im Cytoplasma über den EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS-Weg (Glykolyse). Aus
1 Mol Glucose werden hierbei 2 Mol des Stoffwechsel-Zwischenproduktes Pyruvat (C3H4O3)
gebildet, 2 Mol ADP (Adenosindiphosphat) mit Phosphatresten (Pi) zum Energieträger ATP
(Adenosintriphosphat) phosphoryliert und 2 Mol des Coenzyms NAD (Nicotinamidadenin-
dinukleotid) aus der oxidierten Form NAD+ zu NADH reduziert (CYPIONKA, 2010):
Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ ⟶ 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
Unter Aufnahme von Sauerstoff (Atmung) kann das Pyruvat aus dem Tricarbonsäurezyklus
(Citratzyklus) heraus über die Atmungskette zu CO2 und Wasser vollständig oxidiert werden.
Insgesamt ist diese aerobe Veratmung von Glucose energetisch deutlich günstiger für die Zelle
im Vergleich zur anaeroben alkoholischen Gärung. Dies zeigt die Zusammenfassung der
Abbaureaktionen in Tabelle 2. Neben dem 19-fach höheren Energiegewinn für die Zelle in
Form von ATP ist zudem die Triebkraft der Abbaureaktion deutlich größer, da die Änderung
der freien Standard-Gibbs-Energie4 Δ𝐺′0 der Atmung um den Faktor 11 größer ist als Δ𝐺′0 der
Gärung.
Tabelle 2: Zusammenfassung der Veratmung und Vergärung von Glucose durch Hefe und deren theoretische Energieausbeuten (ANNEMULLER u. a., 2008).
Stoffwechselweg Reaktion Δ𝐺′0
kJ Mol-1
Energiegewinn für die Zelle Mol ATP pro Mol Glucose
Atmung C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O - 2880 38
Gärung C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 - 260 2
Bei höheren Substratkonzentrationen ( 𝑐(Glucose) > 0,1 g L−1 ) wird jedoch auch unter
oxischen Bedingungen ein Teil des Substrates wie bei einer anaeroben Fermentation zu
Ethanol und CO2 vergoren (Crabtree-Effekt) (SAHM u. a., 2013). Hierbei wird aus dem Pyruvat
nach der Glykolyse zunächst unter Abgabe von CO2 Acetaldehyd hergestellt. Anschließend
wird Acetaldehyd zu Ethanol reduziert.
4 Δ𝐺′0 bezieht sich hier auf die Standardbedingungen in der Biochemie: 25 °C, 1 bar Umgebungsdruck und Aktivität 1. Eine Ausnahme bildet die Aktivität von Wasser, was durch den Strich angezeigt wird. Die Konzentration der Hydroniumionen wird zu 10-7 Mol L-1 festgelegt (physiologisch neutraler pH-Wert von 7), was einer Wasserkonzentration von 55,5 Mol L-1 entspricht (CYPIONKA, 2010).
2 Stand des Wissens und der Technik 21
2.4.3 Batch-Kultivierung von Backhefe
Das passende Fermentationsverfahren zum Test des MIR-ATR-Sensors ist das Batch- oder
Satzverfahren. Bei diesem wird die gesamte eingesetzte Menge aller Substrate zu Beginn im
Fermentationsmedium vorgelegt. Durch die anfänglich hohe Glucosekonzentration, die bis
zum Ende der Fermentation komplett abgebaut wird, ergibt sich eine große Dynamik dieses
Analyten. Dies ist vorteilhaft für die Erprobung des MIR-ATR-Sensors, da die zu erwartenden
Messeffekte beim Prototypsensor im Bereich weniger Milliextinktionen liegt (vgl. 6.2).
Dagegen ist beim Fed-Batch- oder Zulaufverfahren, bei welchem ein oder mehrere Substrate
erst im Laufe des Prozesses nach und nach zugeführt werden, nur mit einer geringen Dynamik
der Glucosekonzentration zu rechnen. Eine kontinuierliche Fermentation, bei der ständig
Substrate zugeführt und Produkte abgezogen werden, ist wegen des hohen technischen
Aufwandes und aufgrund der konstanten Stoffkonzentrationen im Fermenter weniger
geeignet zur Erprobung des MIR-ATR-Sensors.
3 Material und Methoden 22
3 Material und Methoden
3.1 Veresterung und anschließende Destillation
3.1.1 Apparatur
Als chemischer Musterprozess wird mit dem MIR-ATR-Sensor eine Veresterung von Ethanol
und Ameisensäure zu Ethylformiat und Wasser mit anschließender Destillation des Gleich-
gewichtsgemisches verfolgt. Der Reaktionsmechanismus ist in 2.3.1 beschrieben, den schema-
tischen Aufbau des Versuchs zeigt Abbildung 7.
Schlauchpumpe
Daten-erfassung
Probenkühler
Reaktor
MIR-ATR- Sensor
FT-MIR-ATR-Spektrometer
Daten
Probenschleife
Temperatur-erfassung
PT100
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Online-Messungen in der Probenschleife sowie der Sensorik und
Datenerfassung bei der Veresterung.
Ein 500 mL Dreihalskolben mit einem magnetischen Rührer dient als Reaktionsgefäß. Die
Temperatur des Reaktionsgemisches wird mit einem PT-100 Temperatursensor zur Kontrolle
erfasst und aufgezeichnet. Während der Veresterung wird der Reaktor weder erwärmt noch
gekühlt. Das Foto des Versuchsaufbaus für die Veresterung zeigt Abbildung 8. Darauf ist zu
erkennen, dass der Reaktor bereits in das Wasserbad für die spätere Destillation taucht. Dieses
befindet sich jedoch während der Veresterung auf Raumtemperatur. Ein Rücklaufkühler am
mittleren Hals des Reaktors verhindert das Entweichen der flüchtigen Bestandteile des
Reaktionsgemisches. Reaktion und Probentransport erfolgen in einem geschlossenen System
bei Umgebungsdruck. Am linken Hals des Reaktors sind die Schläuche für die Probenentnahme
und -rückführung montiert. Eine Schlauchpumpe durchspült die Probenschleife mit einer
3 Material und Methoden 23
konstanten Rate von 8 mL min-1. Auf der rechten Seite ist eine Temperatursonde montiert.
Weiterhin wird der Reaktor über diesen Stutzen befüllt.
Die Probentemperatur wird mittels des Durchlaufkühlers in der Probenschleife über die
gesamte Versuchsdauer hinweg konstant gehalten. Dies ist selbst dann gewährleistet, wenn
die Temperatur im Reaktionsgefäß während der Destillation maßgeblich erhöht wird. Das
gepumpte Reaktionsgemisch wird mit dem MIR-ATR-Sensor und dem MIR-ATR-Spektrometer
(System aus der Alpha-Serie der Firma Bruker) jeweils in einer Durchflusszelle vermessen. Die
Signale des Sensors und die erfasste Temperatur werden in selbst entwickelten LabVIEW-
Programmen jeweils sekündlich aufgezeichnet. Ein MIR-ATR-Spektrum wird zyklisch jede
Minute mit der Spektroskopiesoftware OPUS 7 von Bruker erfasst und gespeichert.
Rücklaufkühler
Reaktor
Wasserbad
Magnetrührerund Heizplatte
MIR-ATR-Sensor
Probenkühler
Schlauchpumpe
MIR-ATR-Spektrometer
Befüllstutzen, PT100
Abbildung 8: Bild des Versuchsaufbaus zur chemischen Prozessverfolgung während der Veresterung.
Für die Destillation im Anschluss an die Veresterung wird der Rücklaufkühler durch einen
Destillationskopf mit Kühler und Sammelgefäß ersetzt und das Reaktionsgefäß im schwach
siedenden Wasserbad erhitzt. Den für die Destillation veränderten Versuchsaufbau zeigt
Abbildung 9.
3 Material und Methoden 24
Thermometer
Destillationskopf
Kühler
Sammelgefäß
Abbildung 9: Bild des Versuchsaufbaus zur chemischen Prozessverfolgung während der Destillation.
3.1.2 Auslegung und Ablauf der Veresterung mit anschließender Destillation
Auslegung des Veresterungsversuchs
Das Gleichgewicht wird auf die Seite der Produkte Wasser und Ethylformiat verlagert, indem
ein Überschuss an Ameisensäure vorgelegt wird. So wird der Alkohol fast vollständig verestert.
Eine überschüssige Vorlage von Ethanol hätte dieselbe Verlagerung auf die Produktseite zur
Folge und wäre auf Grund des niedrigeren Preises von Ethanol wirtschaftlicher als eine
überschüssige Zugabe von Ameisensäure. Im industriellen Umfeld ist ein Alkoholüberschuss
daher die übliche Vorgehensweise zur Herstellung von Carbonsäureestern. Die Destillation
des Esters ist dann allerdings apparativ deutlich aufwändiger, da der überschüssige Ethanol
wesentlich flüchtiger ist als der hier beschriebene Ameisensäureüberschuss. Durch den Säure-
überschuss kann die Destillation bei Normaldruck mit einem einfachen Destillieraufsatz nach
CLAISEN mit LIEBIGkühler zur Kondensation durchgeführt werden. Der Einsatz einer Kolonne
oder einer wesentlich aufwändigeren Schleppmitteldestillation ist nicht notwendig.
Mit 100 mL Ethanol 96 % V/V und 124 mL Ameisensäure 99 % m/m werden die Edukte im
Stoffmengenverhältnis 1:2 vorgelegt. Die Zusammensetzung der Vorlage ist in Tabelle 3
aufgeführt. Die eingesetzten Chemikalien (Daten siehe Tabelle 17 im Anhang) enthalten auch
wenige Massenprozent Wasser. Somit ist die Vorlage zwar nicht vollständig, aber doch
annähernd produktfrei. Als Katalysator werden 0,1 mL 25% m/m Schwefelsäure verwendet.
Durch diese geringe Menge wird nur wenig Wasser gebunden.
3 Material und Methoden 25
Tabelle 3: Veresterung: Zusammensetzung der Vorlage bestehend aus 100 mL Ethanol 96 % V/V und 124 mL Ameisensäure 99 % m/m.
Stoff (rein) Masse
g Stoffmenge
mol Konzentration
mol L-1 Stoffmengenanteil
mol mol-1
Ethanol ET 76,0 1,65 7,4 0,31
Ameisensäure AS 150,0 3,25 14,5 0,62
Wasser W 6,4 0,35 1,6 0,07
Die zu erwartenden Stoffkonzentrationen im Gleichgewicht lassen sich anhand der Einwaage
und der unter 2.3.2 beschriebenen Zusammenhänge abschätzen. Nach Abbildung 6 ist für den
Stoffmengenanteil Ameisensäure in der Vorlage von 0,62 mol mol-1 die Gleichgewichts-
konstante 𝐾 ≈ 8. Für eine produktfreie Vorlage ergeben sich nach Formel 2-17 die Produkt-
konzentrationen von Wasser und Ethylformiat zu 6,7 mol L-1 im Gleichgewicht. Die Anteile von
Ethanol und Ameisensäure sollten sich dementsprechend auf 0,7 mol L-1 beziehungsweise
7,8 mol L-1 verringern. Das in der Vorlage enthaltene Wasser wird nicht berücksichtigt, daher
sollte sich das tatsächliche Gleichgewicht gemäß 2-13 bei etwas niedrigeren Esterkonzen-
trationen und etwas höheren Eduktkonzentrationen einstellen. Anhand dieser Abschätzung
lässt sich überprüfen, ob die Veresterung bis zum erwarteten Gleichgewicht verläuft.
Ablauf des Veresterungsversuchs
1. Aufbau der Apparatur für die Veresterung (siehe Abbildung 8)
2. Referenzmessung mit MIR-ATR-Spektrometer und MIR-ATR-Sensor gegen Luft
3. Start der Messungen mit Spektrometer und Sensor sowie der Temperaturerfassung
4. Vorlage von Ethanol5
5. Start der Schlauchpumpe, Befüllen der Probenschleife
6. Zugabe der Ameisensäure
7. Zugabe des Katalysators
8. Nach Erreichen des Gleichgewichts wird die Apparatur für die Destillation umgebaut
(siehe Abbildung 9).
9. Start der Destillation durch Erhitzen des Reaktors im Wasserbad
10. Sobald die Destillation stoppt (keine beobachtbare Kondensation mehr im Kühler), ist
der Versuch beendet.
Durch das Erhitzen des Reaktors während der Destillation in einem schwach siedenden
Wasserbad kondensieren im Destillationskopf lediglich Ethylformiat und evtl. Ethanol aus.
Ameisensäure und Wasser bleiben im Reaktor zurück. Das Destillat besteht somit haupt-
sächlich aus dem Ester, denn der Säureüberschuss in der Vorlage hat eine kleine Ethanol-
konzentration zum Start der Destillation zur Folge (sieh oben). An die Reinheit des Destillats
5 Das ZnSe-Prisma des MIR-ATR-Sensors ist nicht für den Einsatz mit reiner Ameisensäure geeignet, daher wird zuerst Ethanol in die Apparatur gegeben.
3 Material und Methoden 26
bestehen keine Anforderungen, da der Versuch als chemischer Musterprozess für den Test
des MIR-ATR-Sensors durchgeführt wird. Es ist daher nicht erforderlich das Destillat
hinsichtlich seiner genauen Zusammensetzung näher zu untersuchen. Eine Riechprobe sollte
den überwiegenden Anteil des Esters bestätigen. Ethylformiat besitzt einen typischen Geruch
nach Rum (Arrak) und ist leicht von Ethanol zu unterscheiden.
3.1.3 Prozessverfolgung mit dem MIR-ATR-Spektrometer
Kalibration der Online MIR-ATR-Spektroskopie
Der Verlauf der Stoffkonzentrationen im Reaktor wird in Echtzeit mit dem MIR-ATR-
Spektrometer verfolgt. Diese Analyse dient als Referenz für den MIR-ATR-Sensor. Zusätzlich
kann mithilfe der Absorptionsspektren der Verlauf der Sensorsignale in den einzelnen Kanälen
simuliert und durch einen Vergleich mit den realen Sensorsignalen die Funktion der Optik und
Elektronik des Sensors überprüft werden.
Abbildung 10: MIR-ATR-Spektren der am chemischen Musterprozess beteiligten Analyten Wasser,
Ameisensäure, Ethanol und Ethylformiat.
Voraussetzung für eine verlässliche Prozessanalytik auf Basis der MIR-ATR-Spektren sind
spezifische Absorptionsbanden für die jeweils zu bestimmenden Analyten. Abbildung 10 zeigt
die Absorptionsspektren der Reinstoffe Wasser, Ameisensäure, Ethanol und Ethylformiat. Da
diese vier Analyten unterschiedliche MIR-Absorptionsspektren aufweisen, sollte eine
quantitative Mehrkomponentenanalyse möglich sein. Die Absorptionsbanden der Analyten
0,0
0,2
0,4
0,6
3800 3400 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Wasser, vollentsalzt
Ameisensäure 99 % m/m
Ethanol 94 % m/m
Ethylformiat 99 % m/m
3 Material und Methoden 27
überlagern sich jedoch gegenseitig, sodass eine chemometrische Kalibration einer univariaten
Auswertung vorzuziehen ist.
Die Möglichkeiten zur Datenvorbehandlung wurden eingehend untersucht. Dabei stellte sich
eine Kalibration ohne Datenvorbehandlung als die beste Variante heraus (HÄFFNER, 2015).
Ebenso wurden verschiedene Strategien zur Planung und dem Vermessen der Kalibrations-
proben verglichen. Der Kalibrationsprobensatz enthält neben Zweistoffmischungen auch
Mischungen sämtlicher vier Analyten. Trotz eines möglichen reaktionsbedingten Fehlers
führte die Verwendung von Vierstoffmischungen zu einer deutlichen Verbesserung des
Kalibrationsmodells. Von den vier zu erfassenden Analyten reagieren jeweils Wasser mit
Ethylformiat und Ethanol mit der Ameisensäure. Proben, bei denen entweder die Edukt- oder
die Produktseite stark überwiegt, streben von der angesetzten Mischung in Richtung
Gleichgewicht. Für die Präparation und das Vermessen der Kalibrationsproben wurde eine
Vorgehensweise ausgearbeitet um den hierdurch verursachten Fehler zu minimieren:
1. Ansetzen von nicht-reaktiven Stammlösungen (jeweils 50 mL) aus jeweils zwei
Komponenten
2. Kühlen der Stammlösungen auf 2 °C
3. Mischen (Pipettieren) und Homogenisieren von zwei Stammlösungen zu einer
Kalibrationsprobe mit einem Gesamtvolumen von 1 mL
4. Unmittelbares Vermessen der Kalibrationsprobe.
5. Wiederholung für die nächste Probe ab 3.
Verwendet werden drei Stammlösungen aus Wasser und Ethanol (W-ET) und drei
Stammlösungen aus Ameisensäure und Ethylformiat (AS-EF) gemäß Tabelle 18 im Anhang. Die
Einwaagen sind so gewählt, dass der für die Analyse der Veresterung und der anschließenden
Destillation relevante Konzentrationsbereich von den Kalibrationsproben gleichmäßig abge-
deckt wird. Alle 6 Stammlösungen werden untereinander mit 3 verschiedenen Mischungs-
verhältnissen (1:1, 1:2 und 2:1) kombiniert. So ergeben sich 45 Zwei- und Vierstoffmischungen
aus 3 mal 15 Kombinationen6 (siehe Tabelle 19 im Anhang). Zusammen mit den 6 Stamm-
lösungen sind dies insgesamt 51 Kalibrationsproben. Kalbrationsprobe Nr. 32 muss bereits vor
der Modellerstellung von der Kalibration ausgeschlossen werden, da sich wegen der geringen
Löslichkeit von Ethylformiat in Wasser zwei Phasen bilden.
Die für eine chemometrische Auswertung notwendige lineare Unabhängigkeit der Konzen-
trationsverhältnisse (siehe 2.1.4) ist nur bedingt gegeben. Das Bestimmtheitsmaß zwischen
W-AS, W-EF, ET-AS und ET-EF nach Tabelle 4 ist deutlich größer als Null aufgrund des
6 Aus der Kombinatorik: Möglichkeiten des Ziehens ohne Zurücklegen von 2 Elementen aus einer Grund-gesamtheit von 6: Binomialkoeffizient 6 über 2
3 Material und Methoden 28
systematischen Vorgehens beim Mischen der Stammlösungen mit wenigen Mischungs-
verhältnissen. Allerdings ist in keinem Fall 𝑅2 > 0,5, sodass lediglich schwache Korrelationen
zwischen manchen Komponenten bestehen. Die eingeschränkte lineare Unabhängigkeit im
Kalibrationsdatensatz wurde aufgrund des minimalen Präparationsfehlers der angewandten
Strategie toleriert.
Tabelle 4: Korrelation (Bestimmtheitsmaß R²) der Komponenten in den Kalibrationsproben der Chemometrie zur Veresterung.
𝑅2 zwischen ↓und → Wasser W Ethanol ET Ameisensäure AS
Ethanol ET 0,04 1 ↙
Ameisensäure AS 0,26 0,34 1
Ethylformiat EF 0,39 0,47 0,05
Chemometrische Modellerstellung und -validierung
Zum Erstellen des chemometrischen Modells mit Quant 2 unter Opus 7.0 der Firma
Bruker Optik wurde der gesamte vermessene Spektralbereich von 4000-600 cm-1 ohne
Datenvorbehandlung verwendet. Quant 2 arbeitet ausschließlich mit dem PLS1-Algorithmus.
Für jeden Analyten wird eine eigenständige Regression auf den Kalibrationsdatensatz
durchgeführt. Validiert wurde das Modell per Kreuzvalidierung mit jeweils einer ausge-
lassenen Probe. Der Rang wurde auf 6 begrenzt, da bei 4 Analyten verlässliche Modelle ab
einem Rang von 4 möglich sein sollten. Neben der nicht berücksichtigten Probe Nr. 32 (siehe
oben) wurden nach einer ersten Regressionsrechnung auch die von Quant 2 als Ausreißer
erkannten Spektren der Kalibrationsproben 3, 6, 17, 23 und 47 (siehe Tabelle 19 im Anhang)
von der Kalibration ausgeschlossen und die Ausgleichsrechnung erneut durchgeführt. An den
Qualitätsparametern der Validierung 𝑅2 und RMSECV, aufgelistet in Tabelle 5, ist zu erkennen,
dass erwartungsgemäß ab einem Rang von 4 die Regression auf die verbliebenen 45
Kalibrationsproben mit einem Bestimmtheitsmaß 𝑅2 > 0,995 gut funktioniert. Für Ethanol
stellt sich ab Rang 4 keine Verbesserung des Modells mehr ein, daher ist dies auch der von
Quant 2 folgerichtig empfohlene Rang. Für die übrigen Analyten verbessern sich die
Validierungsergebnisse noch etwas mit zunehmendem Rang, sodass auch hier die Empfehlung
der Software für die späteren Analysen übernommen wurde.
3 Material und Methoden 29
Tabelle 5: Qualitätsparameter R² und RMSECV des chemometrischen Modells zur Analyse der Veresterungsreaktion für die Analyten W, ET, AS und EF in Abhängigkeit des Ranges.
Parameter Analyt Rang (von Quant 2 empfohlen fett)
1 2 3 4 5 6
𝑅2
W 0,7357 0,8979 0,9917 0,9959 0,9984 0,9987
ET 0,6753 0,4651 0,9822 0,9991 0,9991 0,9991
AS 0,6736 0,9343 0,9904 0,9980 0,9985 0,9989
EF 0,7353 0,8944 0,9821 0,9963 0,9985 0,9989
RMSECV in mol L-1
W 4,89 3,16 0,90 0,63 0,40 0,35
ET 2,50 1,61 0,59 0,13 0,13 0,13
AS 2,71 1,21 0,46 0,21 0,18 0,16
EF 1,65 1,05 0,43 0,19 0,13 0,11
Der RMSECV von Wasser ist mit 0,35 mol L-1 in etwa doppelt so groß wie bei den übrigen
Analyten. Beachtet man allerdings die resultierenden Kalibrationsbereiche der berück-
sichtigten 45 Kalibrationsproben (W: 0-32 mol L-1, ET: 0-15 mol L-1, AS: 0-16 mol L-1, EF: 0-
11 mol L-1), so beträgt der relative Fehler der Kreuzvalidierung stets circa 1% des Kalibrations-
bereiches für den jeweiligen Analyten. Für alle vier Analyten ist die Validierung des
chemometrischen Modells damit plausibel und zufriedenstellend. Die Werte des RMSECV sind
klein genug für einen Einsatz der Methode als Referenzanalytik im Veresterungsversuch.
3.2 Hefefermentation
3.2.1 Apparatur
Mit dem gebauten Prototyp des MIR-ATR-Sensors wird eine Hefefermentation als bio-
technologischer Musterprozess verfolgt. Der MIR-ATR-Sensor befindet sich hierzu zusammen
mit einem FT-MIR-ATR-Spektrometer (Gerät der Alpha-Serie der Firma Bruker) in einer
Probenschleife. Diese wird von einer Schlauchpumpe mit Fermentationsbrühe durchspült, wie
das Schema der Versuchsapparatur (Abbildung 11) zeigt. Da der Reaktorinhalt während der
gesamten Versuchsdauer auf 32 °C temperiert wird ist auch die Probentemperatur am
Spektrometer und am MIR-ATR-Sensor konstant. In Abbildung 11 ist ebenfalls die Aktorik,
Sensorik und Datenerfassung dargestellt, welche am 6 L-Laborfermenter vom Typ BIOSTAT E
der Firma Sartorius AG installiert ist. Den befüllten Fermenter mit Messsonden und Steuer-
einheit zeigt das Foto in Abbildung 12.
3 Material und Methoden 30
Säure, Lauge(pH-Regelung)
Begasung(Volumenstrom)
Rührer (Drehzahl)
Temperatur (PT100)pH-Wert (Elektrode)gelöst-O2 (Elektrode)Zelldichte (Streulicht)Abgas (O2, CO2, EtOH)
Schlauchpumpe
Daten-erfassung
Fermenter
MIR-ATR- Sensor
FT-MIR-ATR-Spektrometer
Daten
Probenschleife
Aktorik Sensorik
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Online-Messung in der Probenschleife sowie der Sensorik,
Aktorik und Datenerfassung bei der Hefefermentation
Fermenter
PT100,pO2- undpH-Elektrode
Abgaskühler,Überdruckventil,Streulichtsonde,Säure- und Laugezulauf
Thermostat,pH-Regler,
Drehzahlregler
Säure, Lauge, Schlauchpumpen
Streulichtdetektor
Ventil und Durchflussmesser
für Begasung
Probenschleife(rot markiert)
Abbildung 12: Foto des Fermenters mit Messsonden und Steuereinheit während der Fermentation
3 Material und Methoden 31
3.2.2 Kultivierungsbedingungen bei der Hefefermentation
Zusammensetzung des Fermentationsmediums
Die Backhefe der Firma Franz Xaver Wieniger GmbH, Passau wird im Batchverfahren mit einer
anfänglichen Glucosekonzentration von 100 g L-1 kultiviert. Die übrige Zusammensetzung des
vollsynthetischen Mediums nach Tabelle 25 im Anhang richtet sich nach der eingesetzten
Zuckermenge. Sie ist angelehnt an das Medium nach SCHATZMANN (SCHATZMANN, HERBERT, 1975)
mit zwei Modifikationen: Zum einen wird Ammoniumchlorid statt Di-Ammoniumsulfat als
Stickstoffquelle eingesetzt, da das gelöste Sulfat im MIR-Absorptionsspektrum eine starke
Bande bei 1100 cm-1 verursacht und damit eine Spektrenauswertung bezüglich Glucose und
Ethanol erschwert (EGLY, 2012). Zum Test vorab durchgeführte Fermentationen bestätigten,
dass diese Veränderung des Mediums das Wachstum der Hefe nicht beeinträchtigt. Zum
anderen werden die Spurenelemente Vitamin B1 und B6 nicht zugesetzt. Dies wurde über-
nommen aus früheren Versuchen zur Biofluoreszenz von Backhefe während der Fermentation
(KLUG, 2009). Einen negativen Einfluss der fehlenden B-Vitamine auf das Hefewachstum wurde
nicht beobachtet.
Kultivierungsbedingungen und Ablauf der Fermentation
Das Fermentationsvolumen beträgt 5 L. Die Bestandteile des Mediums für die gesamten 5 L
werden in 4,5 L Weichwasser gelöst und im Fermenter auf 32 °C temperiert. Das Inokulum
wird mit dem übrigen Volumen in einem Becherglas separat angesetzt. In 0,5 L Weichwasser
werden dafür 167 g Backhefe suspendiert.
Die Begasung des Fermenters mit Luft wird manuell an einem Ventil auf 5 SLPM, also 1 vvm,
eingestellt. Der Leitstand regelt elektronisch die Rührerdrehzahl auf 700 min-1. Mit dem FT-
MIR-ATR-Spektrometer und dem MIR-ATR-Sensor wird nach der Referenzmessung gegen Luft
zunächst Wasser vermessen, um die Signale aus der Fermentation mit der Wasserabsorption
verrechnen zu können. Danach wird an beiden Geräten jeweils ein Durchflussaufsatz installiert,
die Probenschleife geschlossen und diese von der Schlauchpumpe mit einer konstanten Rate
von 8 mL min-1 durchspült. Die Signale des Sensors werden einmal pro Sekunde, ein FT-MIR-
Spektrum alle 3 Minuten aufgezeichnet.
Vor dem Animpfen wird 1 mL Antischaummittel (Antifoam RD Emulsion von Dow Corning) in
den Fermenter gegeben. Nach der anschließenden Zugabe des Inokulums beträgt die Zell-
dichte ungefähr 2,7∙108 mL-1, da in 1 g Wieninger Backhefe ca. 8∙109 Zellen enthalten sind
(DRIXLER, 2015). Der pH-Wert wird ab Fermentationsbeginn durch automatisierte Zugabe von
5-molarer Natronlauge auf 5,2 gehalten. Im Abstand von 30 Minuten werden jeweils 10 mL
Probe für die spätere Analyse per HPLC gezogen. Zum Abtrennen der Biomasse vor dem
Einfrieren wird die Probe für 10 min bei 4500 min-1 zentrifugiert und der Überstand mit einem
Sterilfilter mit 0,45 µm Porengröße filtriert.
3 Material und Methoden 32
Die Hefe wird so lange im Fermenter kultiviert, bis die vorgelegte Glucose komplett verstoff-
wechselt ist. Dies ist nach ca. 5,5 Stunden der Fall, sodass der Versuch mit einem Nachlauf von
ca. 1 Stunde nach 6,5 Stunden beendet wird.
3.2.3 Referenzanalytik HPLC
Die Konzentrationen von Ethanol und Glucose in den eingefrorenen Fermentationsproben
werden offline per HPLC (High Performance Liquid Chromatography) bestimmt. Hierzu
werden die Proben im Verhältnis 1:7 verdünnt und 20 µL aus einer Probenschleife mit einer
auf 30 °C temperierten Ionenaustauschersäule (AT 300-6.5 Polyspher® OA HY, Merck KGaA,
Darmstadt) aufgetrennt. Als Detektor dient ein Differentialrefraktometer (Smartline RI
Detektor 2300, Knauer GmbH, Berlin). Die Flussrate von 0,5 mL min-1 wird an der Pumpe
eingestellt (880-PU, Jasco GmbH, Deutschland). Als Laufmittel wird 0,005 mol L-1 Schwefel-
säure eingesetzt. Diese Messapparatur kam bereits in früheren Arbeiten zum Einsatz (EGLY,
2012; KLUG, 2009). Zur Aufzeichnung und Auswertung der Chromatogramme wurde in diesen
Arbeiten ein Papierschreiber eingesetzt (HP 3394A Integrator, Hewlett Packard, USA). Dieser
wurde mittlerweile durch eine USB-Hardware (USB-6009, National Instruments, USA) und eine
unter LabVIEW entwickelte Software (siehe Abbildung 13) ersetzt. Diese nutzt die freie
netCDF-Bibliothek von UCAR Unidata, USA, um die Chromatogramme als AIA-Datei im ANDI-
Austauschformat abzuspeichern (ANDI: Analytical Data Interchange). Somit sind die
Chromatogramme nun digital archivierbar und können mit Hilfe moderner Chromatographie-
software ausgewertet werden. In dieser Arbeit wird dafür ChemStation von Agilent, USA
verwendet.
Abbildung 13: Bildschirmfoto der LabVIEW-basierten Datenerfassung für die HPLC-Analyse mit
Chromatogramm 1 h nach Fermentationsbeginn (Zeitformat hh:mm).
Glucose
Ethanol
Salze
3 Material und Methoden 33
Abbildung 14: Kalibration der HPLC anhand jeweils einer Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Glucose- und
der Ethanolkonzentration in den Fermentationsproben. Auswertung der Chromatogramme
mittels ChemStation (Agilent).
Die modernisierte Datenerfassung und –auswertung ermöglicht die Messung von höheren
Analytkonzentrationen als bei der früheren Auswertung per Schreiber. Dadurch müssen die
aus dem Fermenter gezogenen Proben nicht mehr so hoch verdünnt werden. Dies zeigen die
in Abbildung 14 dargestellten Kalibrationen für Ethanol und Glucose, welche anhand jeweils
einer Verdünnungsreihe erstellt wurden. Es ist zu erkennen, dass die per ChemStation
ermittelte Peakfläche bei 8,5 min bzw. 17,2 min Retentionszeit für den kalibrierten Bereich
von 0-15 g L-1 Glucose bzw. 0-5,5 g L-1 Ethanol linear zur Analytkonzentration ist (Bestimmt-
heitsmaß besser als 0,999). Es genügt daher eine Verdünnung der Fermentationsproben von
1:7, um die max. 100 g L-1 Glucose und max. 30 g L-1 Ethanol (siehe 6.1) zu bestimmen.
3.3 Simulation eines MIR-ATR-Sensors anhand von MIR-ATR-Spektren
3.3.1 Simulationsmethode
Die Optik eines MIR-ATR-Sensors und die eines FT-MIR-ATR-Spektrometers sind ähnlich
aufgebaut. Daher ist es möglich, das Ansprechverhalten eines MIR-ATR-Sensors auf Basis von
MIR-ATR-Spektren zu simulieren. Dabei werden von den MIR-ATR-Spektren nur die Durchlass-
bereiche der optischen Bandpassfilter verwendet. Durch spektrale Variation der Trans-
missionsbereiche können so optimale Filter für eine möglichst spezifische Analytbestimmung
gefunden werden.
Das spektrale Ansprechverhalten eines Sensorkanals 𝑖 ist abhängig von der Transmission
𝑇𝑖(𝜆) des verbauten optischen Filters. Nach LAMBERT-BEER ist die Extinktion der negative
dekadische Logarithmus des Verhältnisses von Proben- zu Referenzintensität (Formel 2-1). Bei
einem photometrischen Sensor – wie dem MIR-ATR-Sensor – muss berücksichtigt werden,
dass das von der Probe durchgelassene Licht vor der Detektion noch das optische Filter
y = 3,1679xR² = 0,9991
0
5
10
15
0 2 4
Glu
cose
kon
zen
trat
ion
/ g
L-1
Peakfläche bei 8,5 min
y = 7,3325xR² = 0,9994
0
2
4
6
0,0 0,4 0,8
Eth
ano
lko
nze
ntr
atio
n /
g L
-1
Peakfläche bei 17,2 min
3 Material und Methoden 34
passiert. Daher muss sowohl die Proben- (𝐼(𝜆)) als auch die Referenzintensität (𝐼0(𝜆)) mit
𝑇𝑖(𝜆) multipliziert und spektral integriert werden. Somit erhält man für die Extinktion 𝐸𝑖 in
den einzelnen Sensorkanälen:
𝐸𝑖 = − log10 (
∫ 𝐼(𝜆) ⋅ 𝑇𝑖(𝜆) 𝑑𝜆
∫ 𝐼0(𝜆) ⋅ 𝑇𝑖(𝜆) 𝑑𝜆) 3-1
Eine Simulationsrechnung auf Basis der Absorptionsspektren 𝐸(𝜆) ist allerdings einfacher
umzusetzen, da kommerzielle FT-MIR-Spektrometer meist diese ausgeben. Daher wurde die
Simulation auf Basis der 𝐸(𝜆) durchgeführt (siehe unten).
Häufig sind die optischen Filter bereits hermetisch dicht in einem Mehrkanaldetektor verbaut,
sodass deren Transmissionsspektrum nicht direkt vermessen werden kann. Seitens des
Herstellers werden in der Regel nur der maximale Transmissionsgrad, die Zentralwellenlänge
(CWL: central wavelength) 𝜆𝑐,𝑖 und die Halbwertsbreite (FWHM) Δ𝜆𝑖 beziehungsweise die
Halbwertsstellen 𝜆𝑎/𝑏,𝑖 = 𝜆𝑐,𝑖 ± 1
2Δ𝜆𝑖 angegeben. Die mittlere Extinktion eines Absorptions-
spektrums zwischen den Halbwertsstellen 𝜆𝑎 und 𝜆𝑏 eines optischen Bandpasses ist eine
geeignete Messgröße zur näherungsweisen Simulation der Extinktion 𝐸𝑖 , wie sie in einem
Photometerkanal gemessen werden würde. Vereinfachend wird dadurch ein idealer Bandpass
angenommen, welcher innerhalb des Durchlassbereiches zu 100 % transmittiert und außer-
halb vollständig blockt. Damit ist eine einfache Simulationsrechnung mit 𝐸𝑖 = 𝑓(𝐸(𝜆))
möglich:
𝐸𝑖 ≈1
𝜆𝑏,𝑖 − 𝜆𝑎,𝑖⋅ ∫ 𝐸(𝜆) 𝑑𝜆
𝜆𝑏,𝑖
𝜆𝑎,𝑖
= 𝐸(𝜆)𝜆𝑎,𝑖
𝜆𝑏,𝑖 3-2
Als Beispiel ist in Abbildung 15 die tatsächliche Transmission des Bandpasses NB-8690-215 von
Spectrogon der idealisierten Transmission gegenübergestellt. Dieses Filter wird im Prototyp
des MIR-ATR-Sensor in Kanal 4 eingesetzt. Im Datenblatt sind die beiden Halbwertsstellen mit
8,563 µm (entspricht 1168 cm-1) und 8,777 µm (entspricht 1139 cm-1) angegeben (SPECTROGON,
2011). Die Verwendung idealisierter Bandpässe stellt zwar eine gewisse Abweichung zu den
realen dar, vereinfacht allerdings die Simulationsrechnung deutlich und ermöglicht es, in
kürzester Zeit geeignete Durchlassbereiche für eine spezifische Analytdetektion zu finden. In
Abschnitt 4.2 wird am Beispiel der Veresterung mit anschließender Destillation gezeigt, dass
die zeitlichen Extinktionsverläufe anhand idealisierter Bandpassfilter gemäß Formel 3-2 quali-
tativ mit den Messwerten des MIR-ATR-Sensors übereinstimmen.
3 Material und Methoden 35
Abbildung 15: Realer Bandpass der Firma Spectrogon und entsprechende Näherung für die Simulation eines
MIR-ATR-Sensors.
Da die realisierten Schichtdicken 𝑑ATR in den ATR-Aufbau von Spektrometer und Sensor
unterschiedlich sein können, muss dies gemäß LAMBERT-BEER-Gesetz bei der Simulations-
rechnung nach Formel 3-3 korrigiert werden:
𝐸𝑖 ≈ 𝐸(𝜆)
𝜆𝑎,𝑖
𝜆𝑏,𝑖⋅
𝑑ATR,Sensor
𝑑ATR,Spek. 3-3
Im hier beschriebenen Fall besitzen sowohl der Diamant im ATR-Aufbau des FT-MIR-Spektro-
meters als auch das ZnSe-Prisma im MIR-ATR-Sensor denselben Brechungsindex von 𝑛𝑝 = 2,4.
Weiterhin verwenden beide Aufbauten nur eine Reflexionsstelle ( 𝑁 = 1 ) zur Probenver-
messung und denselben Einfallswinkel von 𝛽 = 45°. Daher sollten nach Formel 2-5 beide
Aufbauten ähnlichen Schichtdicken 𝑑ATR aufweisen.
3.3.2 Spektrenaufnahme und –konvertierung mit OPUS
Spektrenmessung während der Versuche zur Erprobung des MIR-ATR-Sensors
Die oben genannten Simulationsrechnungen werden auf Basis von Absorptionsspektren
durchgeführt, welche mit einem Alpha-Spektrometer mit ATR-Einheit (Bruker Optics GmbH,
Ettlingen) aufgenommen wurden. Die Messungen mit dem Spektrometer und dem MIR-ATR-
Sensor erfolgten gleichzeitig während der beiden Musterprozesse in einer Probenschleife
(Veresterung mit anschließender Destillation bzw. Hefefermentation, siehe 3.1 und 3.2),
damit die Simulation anhand der MIR-ATR-Spektren direkt mit dem MIR-ATR-Sensor
verglichen werden kann. In Abbildung 16 ist das Ablaufschema für die durchgeführte
Spektrenverarbeitung dargestellt. Die einzelnen Schritte zur Simulation der Photometerkanäle
nach Formel 3-2 werden im Folgenden näher erläutert.
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
108011001120114011601180120012201240
Tran
smis
sio
n
Wellenzahl / cm-1
Realer Bandpass SpectrogonNB-8690-215 nm
Näherung zur Simulation
3 Material und Methoden 36
OPUS-SpektrenSpektrum.0000
Spektrum.0999
JCAMP-DX-Spektren Spektrum.0xxx.dx und
Metadaten BatchConvert.txt
OPUS-MakroBatchConvert.mtx
Spektrenkonver-tieren
wiederholteMessung
Quant2.tdms(Chemometrie,
simulierte und reale Sensorsignale)
BatchConvert.txtMetadaten der Spektren
OPUS
LabVIEW
optional Konfiguration AuswertungSpektrenanalyse_Auswertung.ini
optional
*_Auswert.tdms
(simulierte Sensorsignale)
Konfiguration Auswertung
*_Specs.tdms(Alle Spektren
mit Zeitstempel)
Chemometrische AnalyseQuant 2
Quant2.txtAnalytkonzentrationen
3D-Spektren-
verlauf
Diagramm (Chemometrie,
simulierte und reale Sensorsignale)
MIR-ATR-Sensor
ATR_PM.tdms
Abbildung 16: Datenfluss der Spektrenverarbeitung für die Sensorsimulation, ①…⑦: Reiter im Programm
Spektrenanalyse.exe.
Während der Versuche werden mit der Funktion „wiederholte Messung“ der Spektroskopie-
software OPUS (Bruker) zyklisch Spektren aufgenommen und abgespeichert. Eine über die
Erfassung hinausgehende Verarbeitung findet dabei nicht statt. Die Aufnahme eines
Spektrums dauert mit den üblichen Parametern (Spektralbereich 4000 cm-1 bis 600 cm-1,
Auflösung 4 cm-1, 32 Scans) ca. 30 s. Die gesamte Verarbeitungskette ist für 1000 Spektren
ausgelegt (Spektrum.0000 … Spektrum.0999), sodass selbst bei der höchstmöglichen
Erfassungsrate (ein neues Spektrum alle 30 s) eine Versuchsdauer von über 8 h möglich ist.
Datenkonvertierung zur Spektrenverarbeitung außerhalb von OPUS
Unter OPUS ist zwar eine automatisierte Datenverarbeitung per Makrosprache möglich, diese
deckt jedoch neben den spezifischen Methoden der Spektroskopie nur grundlegende Ein-
/Ausgabefunktionen ab. Darüber hinaus ist die Ausführung vergleichsweise langsam und es
stehen nur rudimentäre Möglichkeiten zur Visualisierung zur Verfügung. In der OPUS Makro-
sprache wurde daher ein Makro erstellt (BatchConvert.mtx, siehe Anhang A), mit welchem die
atmosphärischen Störungen durch Schwankungen der Wasserdampf- und CO2-Konzentration
im Lichtweg innerhalb des Spektrometers kompensiert werden (Funktion H2Ocomp()), eine
Textdatei mit Metadaten angelegt wird (TextToFile()) und welches die Spektren im
3 Material und Methoden 37
Austauschformat JCAMP-DX abspeichert (SaveAs()). Die weitergehende Verarbeitung zur
Sensorsimulation wird anschließend unter LabVIEW durchgeführt (siehe 3.3.3).
Nach dem Ausführen des Makros öffnet sich der Dialog Load multiple files (Abbildung 17), in
welchem bei Path der Ordner mit den zu konvertierenden Spektren (Spektrum.0000 …
Spektrum.0999) angegeben werden muss. Da Spektren im OPUS-Format keine typbezeich-
nende Endung besitzen, dient die Angabe *.0* unter Name dazu, die auszuwertenden OPUS-
Spektren von anderen unter Path gespeicherten Dateien zu unterschieden. Dadurch ist das
Sammeln aller zu einem Versuch gehörenden Dateien in einem Ordner möglich 7 . Unter
Path_Destination wird der Zielordner für die konvertierten Spektren angegeben. Dies kann
derselbe wie der Quellordner unter Path sein oder ein anderer. Ein Klick auf Weiter startet die
Konvertierung.
Abbildung 17: Dateidialog des OPUS-Makros BatchConvert.mtx
Neben den konvertierten Spektren (Spektrum.0000.dx … Spektrum.0999.dx) wird unter dem
Zielordner Path_Destination ebenso die Textdatei BatchConvert.txt mit Metadaten der
Spektren angelegt (siehe Abbildung 18). In dieser sind eine laufende Nummer, der Zeitstempel
der Spektrenmessung und der Dateiname des konvertierten Spektrums abgelegt. Die Einträge
7 Soll das Makro zur Konvertierung von mehr als 1000 per wiederholter Messung aufgenommener Spektren oder für einzeln vermessene Spektren ohne führende 0 in der Endung eingesetzt werden, muss ein separater Quell-datenordner angelegt und *.* als Name eingetragen werden.
3 Material und Methoden 38
sind mit Leerzeichen getrennt. Im folgenden gekürzten Beispiel aus einem Veresterungs-
versuch wurden die Einträge 0…5 entfernt, da die entsprechenden Spektren vor dem eigent-
lichen Versuchsstart aufgenommen worden waren:
SpekNr. Date Time File
6 02/06/2014 10:52:55.460 (GMT+2) 20140602_Veresterung_Ethylformiat_2fach_Ac_01_Alpha.0006.dx
7 02/06/2014 10:54:35.600 (GMT+2) 20140602_Veresterung_Ethylformiat_2fach_Ac_01_Alpha.0007.dx
8 02/06/2014 10:56:15.770 (GMT+2) 20140602_Veresterung_Ethylformiat_2fach_Ac_01_Alpha.0008.dx
9 02/06/2014 10:57:55.940 (GMT+2) 20140602_Veresterung_Ethylformiat_2fach_Ac_01_Alpha.0009.dx
10 02/06/2014 10:59:33.180 (GMT+2) 20140602_Veresterung_Ethylformiat_2fach_Ac_01_Alpha.0010.dx
…
Abbildung 18: Vom OPUS-Makro BatchConvert.mtx erstellte Metadatendatei BatchConvert.txt (Ausschnitt).
Das separate Speichern der Metadaten ist notwendig, da OPUS in die JCAMP-DX-Daten zwar
das Datum der Spektrenaufnahme, nicht jedoch die Uhrzeit ablegt8. Zur Synchronisation der
Spektren mit den aufgezeichneten Signalen des MIR-ATR-Sensors wird jedoch ein exakter
Zeitstempel benötigt, der in den originalen Spektren im OPUS-Format auch enthalten ist. Im
Makro BatchConvert.mtx wird dafür das Datum und die Uhrzeit mit der Funktion
GetParameter() aus den Spektren abgerufen und in der Metadatendatei gespeichert.
3.3.3 Datenimport und Sensorsimulation mit LabVIEW
Funktionsübersicht des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse.exe
Mit LabVIEW von National Instruments ist es möglich, leistungsfähige Programme zur Daten-
und Signalverarbeitung zu entwickeln. Daher wurde für die weitere Spektrenverarbeitung das
Programm Spektrenanalyse.exe unter LabVIEW geschrieben. In sieben Reitern (siehe
Abbildung 19) führt das Programm von links nach rechts durch den in Abbildung 16 skizzierten
Datenfluss. Das Programm enthält Funktionen zum Import, der Spektrenauswertung und der
Darstellung der Spektren und Auswerteergebnisse. Weiterhin können die mit dem MIR-ATR-
Sensor aufgezeichneten Signale eingelesen und mit den MIR-ATR-Spektren über den Zeit-
stempel synchronisiert werden. Auch die mit der chemometrischen Quant2-Methode in OPUS
vorhergesagten Konzentrationsverläufe können importiert und in eine TDMS-Datei geschrie-
ben werden. Dieses Dateiformat kann z.B. in Excel mittels Add-In geöffnet werden (siehe
Abbildung 23).
8 Die Uhrzeit ist im Gegensatz zum Datum eine optionale Angabe im JCAMP-DX-Format (MCDONALD & WILKS, JR., 1988, S. 152).
3 Material und Methoden 39
Abbildung 19: 1. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse: „JCAMP-DX Daten einlesen“, Markierung:
Dateiauswahl für die vom OPUS-Makro BatchConvert.mtx erstellte Textdatei.
Import der JCAMP-DX-Spektren und Zeitstempel zur schnellen Spektrenverarbeitung
JCAMP-DX-Spektren und die zusätzlich erstellte Datei BatchConvert.txt sind Textdateien und
können aufgrund der vielen notwendigen Typumwandlungen und des zwingend seriellen
Zugriffs von einem digitalen Signalverarbeitungsprogramm wie Spektrenanalyse.exe nur
langsam verarbeitet werden. Einen effizienteren Datenzugriff ermöglichen Binärdateien.
Daher werden alle Spektren und Zeitstempel vor der Auswertung in einer Binärdatei
zusammengefasst. Hierzu wird im ersten Reiter die vom OPUS-Makro erstellte Textdatei
ausgewählt (siehe Abbildung 19). Im dargestellten Beispiel wurde die vom OPUS-Makro
erstellte Datei mit dem Standardnamen BatchConvert.txt zuvor in den Versuch mit
vorangestelltem Datum umbenannt (20140602_Veresterung_….txt). Die zusammengeführten
Daten werden in einer TDMS-Datei im selben Ordner wie die Textdatei abgelegt9. Dafür wird
deren Name verwendet und „_Specs“ angehängt. Auch die weitere Verarbeitung auf den
übrigen Reitern bezieht sich standardmäßig auf die hier ausgewählte Metadatendatei und die
mit ihrer Hilfe erstellte *_Specs.tdms. Nach Abschluss des Imports ist es auf dem zweiten
Reiter möglich, die Spektren als 3D-Verlauf zu betrachten (Abbildung 20). Anhand des 3D-
Verlaufs kann man erkennen, welche Absorptionsbanden bzw. funktionellen Gruppen im
Laufe der Reaktion auf- bzw. abgebaut werden.
9 Das binäre TDMS-Dateiformat ist prädestiniert für einen effizienten Zugriff auf zeitabhängige Signale und schützt vor Manipulation. Der TDMS-Standard wird zwar exklusiv von National Instruments definiert, liegt jedoch offen und unterstützt das Lesen außerhalb von NI-Software, beispielsweise durch Excel per Add-In oder mit einer C-Bibliothek (NATIONAL INSTRUMENTS, 2015a).
3 Material und Methoden 40
Abbildung 20: Im 2. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse erstellter 3D Spektrenverlauf.
Spektrenauswertung zur Simulation der Signale eines MIR-ATR-Sensors
Um das Ansprechverhalten eines MIR-ATR-Sensors bei Variation der optischen Bandpassfilter
simulieren zu können (vierter Reiter), werden im dritten Reiter die Einstellungen zur
Auswertung der Spektren aus der Konfigurationsdatei Spektrenanalyse_Auswertung.ini im
Programmordner eingelesen (siehe Abbildung 21). Optional kann auch eine andere Konfi-
gurationsdatei geöffnet werden. Dieser Reiter dient zum einen der Kontrolle, ob die durchzu-
führenden Auswertungen in der Konfigurationsdatei korrekt hinterlegt sind (Name, Methode,
Parameter soll) und zum anderen, ob in den importierten Spektren passende Daten für die
Auswertungen enthalten sind (Parameter ist). Die tatsächlich verwendeten Parameter werden
erst bei der Auswertung durch Wechsel auf den vierten Reiter eingetragen und sind dann nach
einem Zurückwechseln einsehbar.
3 Material und Methoden 41
Abbildung 21: Konfiguration der Auswertung im 3. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse.
In der Konfigurationsdatei kann eine beliebige Anzahl an Auswertungen definiert werden. Für
jede wird aus den Spektren ein separates zeitabhängiges Signal erstellt. Im Laufe der Arbeit
wurden fünf verschiedene Methoden für die Spektrenauswertung programmiert, deren
Syntax und Funktionsweise im Kopf der INI-Datei beschrieben sind (siehe Anhang A). Zur
Sensorsimulation wird die Methode Bereich ohne Bezug eingesetzt, welche die mittlere
Extinktion zwischen den zwei angegebenen Grenzen von und bis ermittelt (vergleiche Formel
3-2). Die in der Konfigurationsdatei angegebenen Parameter werden jeweils im Array
Parameter soll angezeigt. Beim Ausführen der Auswertung durch Wechsel auf den vierten
Reiter „Spektrenauswertung“ (Abbildung 22) werden die Wellenzahlen in den Spektren
gesucht, welche den geringsten Abstand zu den vorgegebenen Werten von Parameter soll
aufweisen. Diese erscheinen im dritten Reiter als Parameter ist. Es wird kein Signal erstellt,
falls die einstellbare Toleranz zwischen Soll und Ist überschritten wird (Voreinstellung: 0,1 %
der Soll-Parameterwerte). Alle Signale, die erstellt werden, können im vierten Reiter als
absoluter oder relativer Verlauf betrachtet und abgespeichert werden (siehe Abbildung 22).
Ein Klick auf den markierten Button speichert die Signale als TDMS-Datei (*_Auswert.tdms
nach dem Datenflussdiagramm in Abbildung 16). In dieser werden neben den Zeitreihen auch
die Auswertemethode und die zur Auswertung verwendeten Ist-Parameter (Wellenzahlen)
abgelegt. Dies zeigt der in Abbildung 23 abgebildete Ausschnitt der Kanalbeschreibung der
TDMS-Datei, nachdem diese in Excel mittels Add-In (NATIONAL INSTRUMENTS, 2015b) geöffnet
wurde.
3 Material und Methoden 42
Abbildung 22: Sensorsimulation im 4. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierung: Button
zum Speichern der Auswerteergebnisse als TDMS-Datei.
Abbildung 23: Signalbeschreibung in der TDMS-Datei *_Auswert.tdms nach Import mittels Excel-Add-In
(Ausschnitt).
3 Material und Methoden 43
Kombination und Synchronisation weiterer Messdaten mit der Sensorsimulation
Zusätzlich zur reinen Spektrenauswertung und Darstellung der Zeitsignale gestattet es das
Programm Spektrenanalyse.exe auf den Reitern fünf bis sieben weitere Messdaten zu
synchronisieren, abzuspeichern und darzustellen. Diese automatisierte Datenbearbeitung
ermöglicht den schnellen Vergleich einer Sensorsimulation mit den Signalen eines realen
Prototyps und erleichtert die Kalibration sowohl eines simulierten als auch eines realen MIR-
ATR-Sensors.
Durch Anklicken des in Abbildung 24 markierten Dateidialogs im fünften Reiter „ATR
Photometer“ können die mit der Software des MIR-ATR-Sensors (siehe 4.1.7) aufgezeichneten
Signale eingelesen werden. Zur Synchronisation wird der Zeitstempel des ersten Eintrags in
der Metadatendatei als Startzeitpunkt ( 𝑡 = 0 h ) angenommen. Bei der dargestellten
Veresterung mit anschließender Destillation war dies der Zeitpunkt der Zugabe der Ameisen-
säure zur Ethanolvorlage. Daher steigen die Sensorsignale bei 𝑡 = 0 h stark an.
Unter dem Reiter „ATR Photometer“ können für einen kalibrierten Sensor mittels der MLR-
Regressionskoeffizienten die Sensorsignale direkt in Konzentrationsverläufe der Analyten
umgerechnet werden. Dazu werden in der Konfigruationsdatei Spektrenanalyse_Kanalver-
rechnung.ini MLR-Kalibrationen hinterlegt. Diese Funktion befindet sich jedoch derzeit noch
im Test und sollte daher mit der aktuellen Programmversion noch nicht benutzt werden.
Abbildung 24: 5. Reiter „ATR Photometer“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierung: Auswahl
der Signalaufzeichung des MIR-ATR-Sensors.
3 Material und Methoden 44
Abbildung 25: Chemometrischen Analyse mittels OPUS-Funktion „Quant 2 Analyse / Dateiliste“.
Hervorgehoben: Button zum Markieren der Ergebnisse.
Unter dem sechsten Reiter „Quant 2 einlesen“ kann eine chemometrische Analyse aus der
OPUS-Funktion „Quant 2 Analyse / Dateiliste“ importiert werden. Dazu müssen die Ergebnisse
in OPUS kopiert (Markierung mit hervorgehobenem Button in Abbildung 25, anschließend
Strg+C) und in einer Textdatei abgespeichert werden. Danach kann diese mit dem in Abbildung
26 markierten Dateidialog geöffnet werden. Ein Klick auf „schreiben“ erstellt eine TDMS-Datei
unter demselben Namen wie die eingelesene Quant2-Textdatei. Damit ist es möglich Quant 2-
Analysen als Zeitreihen darzustellen, da OPUS diese Möglichkeit nicht bietet. Dazu werden
anhand der Dateinamen der Spektren diese in der Metadatendatei gesucht (erstellt mit dem
OPUS-Makro BatchConvert.mtx, siehe Anhang A) und der Zeitstempel ausgelesen. Bis auf die
Dateiendung und das Datenformat (JCAMP-DX für die Auswertung in Spektrenanalyse.exe und
OPUS-Format für Quant 2) muss daher dieselbe Dateiliste mit identisch benannten Spektren
verwendet werden. Unter Quant 2 Optionen sollte stets der Standard Alle Werte ausgewählt
bleiben.
In der Quant2.tdms werden zusätzlich die simulierten und realen Sensorsignale (vierter bzw.
fünfter Reiter) synchronisiert abgespeichert. Damit können die Zeitverläufe von MIR-ATR-
Sensor, simuliertem Sensor und Spektrometer in einem Diagramm z. B. in Excel gegen-
übergestellt werden. Da sämtliche Messdaten (Sensorsignale und Analytkonzentrationen) in
einer Datei synchronisiert sind, verringert sich der Aufwand für die MLR-Kalibration des
Prototypsensors deutlich.
3 Material und Methoden 45
Abbildung 26: 6. Reiter „Quant 2 einlesen“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierungen: Auswahl
der Textdatei mit der Quant2-Analyse und Speichern der synchronisierten Informationen als
TDMS.
Abbildung 27: 7. Reiter „Diagramm“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse.
3 Material und Methoden 46
Unter dem siebten Reiter „Diagramm“ ist es schließlich möglich, den Verlauf der verschie-
denen Messdaten gemeinsam darzustellen. Das Beispiel in Abbildung 27 zeigt den Kanal 1 des
Prototypsensors (rot) und dessen Simulation anhand einer Spektrenauswertung (blau). Man
erkennt, dass beim simulierten Sensor der zeitliche Verlauf der Extinktion gut mit der im
Sensorkanal 1 gemessenen Extinktion übereinstimmt. Die darzustellenden Daten können aus
separaten Listen für die Spektrenauswertung, die Quant 2-Analyse und die Sensorsignale in
beliebiger Kombination ausgewählt werden. Mehrere Einträge einer Liste können durch eine
gedrückte Strg-Taste beim Anklicken gleichzeitig markiert werden.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 47
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors
4.1 Auslegung des Sensors und Elektronik des Prototyps
4.1.1 Aufbau des MIR-ATR-Sensors
Bei der Entwicklung des MIR-ATR-Sensors wurde zunächst ein Konzept für die optische
Strahlführung erstellt. Der in Abbildung 28 als CAD-Zeichnung dargestellte optische und
mechanische Aufbau wurde bereits im Rahmen einer früheren Dissertation in derselben
Arbeitsgruppe beschrieben (EGLY, 2012, S. 137, 152–157). Der Schwerpunkt der vorliegenden
Arbeit bestand im Entwurf und der Optimierung einer geeigneten Elektronik und Signal-
verarbeitung, sowie in der erstmaligen Erprobung eines Prototyps bei der Verfolgung einer
chemischen Reaktion und eines biotechnologischen Prozesses (siehe Kapitel 5 und 6). Dafür
wurde der MIR-ATR-Sensor in ein Varivent®-Gehäuse eingebaut, welches durch einen
Hersteller von Prozessanalysentechnik für die Getränkeindustrie zur Verfügung gestellt wurde
(siehe Foto in Abbildung 29).
Die Optik des Prototyps besteht aus einem IR-Emitter als Lichtquelle, einem ZnSe ATR-Prisma
und einem Thermosäulendetektor, der mit optischen Bandpässen ausgestattet ist. Die
Lichtquelle (MIRL 17-900 CAF, 850 mW elektrisch, Laser Components GmbH, Olching) ist ein
Schwarzkörperstrahler mit einer Temperatur von ca. 750 °C. Folglich liegt deren maximale
Emission nach dem WIENschen Verschiebungsgesetz (TIPLER, 2000, S. 551) bei einer
Wellenlänge von 2,8 µm (3500 cm-1).
Flansche
Lichtquelle
HauptplatineMehrkanaldetektor mit optischen Bandpassfiltern
innen vergoldete Kupferrohre
Diamantplättchen (optional)
Gehäuse
ZnSe ATR-Prisma
Abbildung 28: CAD-Entwurf des MIR-ATR-Sensors (EGLY, 2012).
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 48
Als ATR-Material wird ZnSe eingesetzt, da es vergleichsweise preisgünstig ist und sowohl über
einen hohen Brechungsindex (𝑛𝑝 = 2,4) als auch über einen breiten Transmissionsbereich von
18500-620 cm-1 verfügt. Für den Einsatz in einer chemisch aggressiven oder mechanisch
abrasiven Umgebung kann das ZnSe-Prisma optional mit einem Diamantplättchen geschützt
werden. Da beide Materialien denselben Brechungsindex besitzen, wird der Einfallswinkel 𝛽
dadurch nicht verändert. Auch Diamant weist im gesamten MIR-Bereich eine gute Trans-
mission auf. Lediglich zwischen 2300 cm-1 und 1900 cm-1 besitzt Diamant eine geringe
Absorption. Die momentan am Markt verfügbaren MIR-ATR-Sensoren verwenden Saphir-
Prismen (siehe Stand der Technik unter 2.2.3), wodurch der verfügbare Spektralbereich auf
Wellenzahlen oberhalb von 2000 cm-1 eingeschränkt ist. Da die Schwingungsbanden wichtiger
funktioneller Gruppen unterhalb von 2000 cm-1 liegen (Carbonyle C=O 1800-1650 cm-1,
(Poly-)Alkohole C-O 1300-1000 cm-1, Fingerprintbereich 1500-600 cm-1), vergrößert sich die
zugängliche chemische Information erheblich durch die Wahl von ZnSe bzw. Diamant als ATR-
Material. Der gewählte optische Aufbau sollte daher eine spezifischere Analytbestimmung bei
gleichzeitig kleinerer Messunsicherheit gestatten.
ZnSe ATR-Prisma
Temperatur-sensor (NTC)
Abbildung 29: Foto des gebauten MIR-ATR-Sensors.
Für eine Inline-Installation ist der MIR-ATR-Sensor in ein Varivent®-Gehäuse integriert (siehe
Abbildung 29). Die Abmessungen sind: Außendurchmesser des Flansches 84 mm und des
Gehäuses 76 mm, O-Ring 60 x 3 mm aus Ethylen-Propylen-Dien-Gummi (EPDM, synthetischer
Kautschuk der DIN-Gruppe M). Das ATR-Prisma befindet sich hinter einem zentrischen Loch
im Flansch (Durchmesser 10 mm). Zusätzlich ist der MIR-ATR-Sensor zur Erfassung der Proben-
temperatur mit einem NTC-Widerstand ausgestattet. Die optische Absorptionsmessung findet
an der Stelle der totalen Reflexion zwischen dem ZnSe ATR-Prisma und der Probe statt (siehe
Abbildung 30). Der Lichtstrahl dringt bei einem Einfallswinkel von 𝛽 = 45° weniger als eine
Wellenlänge in die Probe ein (siehe MIR-ATR-Technik unter 2.1.2) und wird daher bei der
Totalreflexion zum Teil absorbiert. Die nicht absorbierte IR-Strahlung gelangt nach der
Reflexion auf die optischen Filter und die nachfolgenden Detektoren.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 49
ZnSe ATR-Prismaoptional mit
Diamantplättchen
F1 F2 F3 F4
D4D3D2D1
LichtquelleOptische Filter und
IR-Detektoren
Gehäuse
Probe
< λ
β np
ns
Abbildung 30: Schematischer Aufbau des MIR-ATR-Sensors und optischer Strahlengang.
Der Prototyp des MIR-ATR-Sensors weist vier photometrische Kanäle auf. Dabei ist das Signal
𝐼 jedes Detektors (D1-D4) das spektrale Integral des Produktes aus einfallender Intensität und
Transmission des entsprechenden Filters (F1-F4), welcher sich vor dem betreffenden Detektor
befindet (siehe Formel 3-1). 𝐼 hängt darüber hinaus von der Intensität der Lichtquelle und dem
Absorptionsspektrum der Probe ab. Über das LAMBERT-BEER-Gesetz (siehe Formel 2-1) besteht
ein proportionaler Zusammenhang zwischen der Extinktion 𝐸(𝜆) aufgrund der Lichtabsorp-
tion der Probe und der Konzentration des Analyten in der Probe. Damit kann die in einem
Sensorkanal gemessene Extinktion zur Quantifizierung des Analyten genutzt werden.
Auf dem Foto in Abbildung 31 ist zu sehen, wie das ZnSe ATR-Prisma und die Elektronik mit
vier M3-Standbolzen am Deckel des Prototyps gehaltert sind. Zwei Halteplatinen (Layout siehe
Anhang B) dienen dazu, das Prisma in Position zu halten und gegen eine O-Ring-Dichtung zu
pressen. Darunter ist die Elektronik zusammen mit dem Detektor und der Lichtquelle ebenfalls
mit vier M3-Standbolzen an denselben Verschraubungen am Deckel montiert. Im ursprüng-
lichen CAD-Entwurf (siehe Abbildung 28) war noch eine Elektronikhalterung am Gehäuse-
boden vorgesehen. Ein solcher Aufbau ist jedoch schwieriger zu justieren, was den Aufwand
bei der Montage und Demontage beträchtlich erhöht.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 50
Abbildung 31: Foto der Prismen- und Elektronikhalterung im MIR-ATR-Sensor.
Kupferrohre leiten den Lichtstrahl von der Lichtquelle zum ATR-Prisma und das total
reflektierte Licht vom Prisma zu den Detektoren. Darüber hinaus wird erreicht, dass kein
direkter Lichtweg von der Lichtquelle zum Detektor ohne Passieren der ATR-Optik besteht.
Mit einer Vergoldung der Rohrinnenwände könnte der Lichtdurchsatz maximiert werden. Dies
wurde beim Prototyp jedoch noch nicht umgesetzt, da die detektorseitige Intensität auch
ohne Beschichtung ausreichend ist. Von den Detektoren wird das auf sie einfallende Licht in
ein elektrisches Signal gewandelt. Details hierzu werden unter 4.1.5 zusammen mit der
Verstärkerschaltung beschrieben. Das Foto in Abbildung 32 zeigt die Oberseite der Elektronik
mit der Lichtquelle und dem vierkanaligen Detektor (HTS Q21, TO-39 Gehäuse, Heimann
Sensor GmbH, Dresden).
Abbildung 32: Foto der Elektronik (Oberseite) des MIR-ATR-Sensors mit Lichtquelle und Detektor.
Jedes Detektorelement ist mit einem optischen Bandpassfilter ausgestattet. Deren Trans-
missionsbereiche sind entscheidend dafür, wie sensitiv und spezifisch die einzelnen Analyten
mit dem MIR-ATR-Sensor detektiert werden können (siehe 2.2.1). Daher müssen für die
jeweilige Messaufgabe geeignete Filter verbaut werden. Die Auswahl für den Prototyp ist im
folgenden Abschnitt erläutert.
Elektronik (Unterseite)
Zwei Platinen zur Prismenhalterung
Kupferrohre zur Strahlführung
ZnSe ATR-Prisma
M3 Standbolzen
4-kanaliger Detektor HTS Q21 mit optischen Filtern im Deckel
Lichtquelle MIRL 17-900
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 51
4.1.2 Auswahl der optischen Bandpassfilter
Der Prototyp wurde zunächst im Hinblick auf den Nachweis von Zucker und Ethanol in der
Getränkeindustrie ausgelegt. Mögliche Transmissionsbereiche für die optischen Filter
konnten anhand von MIR-ATR-Spektren der in Wasser gelösten Analyten identifiziert werden
(EGLY, 2012, S. 139ff). Der im Prototyp verwendete Vierkanaldetektor (HTS Q21, Heimann
Sensor GmbH, Dresden) ist mit entsprechenden Filtern bestückt. In Tabelle 6 sind die Trans-
missionsbereiche der vier Filter sowie die jeweilige Funktion bei der Analyse aufgeführt. Zur
Bestimmung der Zucker Saccharose, Glucose und Fructose konnten lagerhaltige optische
Bandpässe von Spectrogon AB, Täby, Schweden in Kanal 2 und 4 verwendet werden. Der
Messkanal (Kanal 4) ist nur geringfügig breiter als der vorgeschlagene Bereich zwischen
1160 cm-1 und 1140 cm-1 (EGLY, 2012, S. 142, Bereich 4). Für alle drei Zucker ist nahezu die
gleiche Empfindlichkeit zu erwarten, da sich die Absorptionsspektren in diesem Bereich nur
minimal unterscheiden. Das Filter im Zucker-Referenzkanal (Kanal 2) transmittiert innerhalb
eines zur Untergrundkompensation vorgeschlagenen benachbarten Bereiches von 1290 cm-1
bis 1220 cm-1 (EGLY, 2012, S. 142, Bereich 3). Zur Ethanoldetektion werden Standardfilter aus
der IR-Gasanalytik in den Kanälen 1 und 3 eingesetzt. Der Messkanal 3 liegt am Rand und
teilweise außerhalb des dafür vorgeschlagenen Bereichs von 3000-2951 cm-1 (EGLY, 2012, Abb.
5.23). Dies führt zu einer erhöhten Querempfindlichkeit und verringert die Empfindlichkeit
des Kanals für Ethanol. Ein besser geeignetes Filter war jedoch nicht verfügbar. Zum
vorgeschlagenen Ethanol-Referenzbereich (3050-3006 cm-1) konnte kein lagerhaltiges Filter
gefunden werden. Aus Kostengründen war der Einsatz speziell angefertigter Filter Ethanol-
detektion nicht umsetzbar (ca. 5000 US$ pro Wafer)10. Da aus einem Wafer viele optische
Filter herausgesägt werden können, würden sich die Kosten pro MIR-ATR-Sensor selbst bei
einer kleinen Serie deutlich reduzieren (GEÖRG u. a., 2015, S. 4, 9f).
Tabelle 6: Transmissionsbereiche der im vierkanaligen Thermosäulendetektor Heimann Sensor HTS Q21 eingesetzten optischen Bandpässe.
Kanal Transmissionsbereich
Hersteller, Typ Funktion bei der Getränkeanalyse cm-1 nm
1 2558 ± 29 3910 ± 45 Heimann, Referenz Referenz Ethanol
2 1224 ± 19 8170 ± 125 Spectrogon, NB-8170-250 nm Referenz Zucker
3 2966 ± 18 3372 ± 20 Heimann, HC schmal Messung Ethanol
4 1151 ± 14 8690 ± 107,5 Spectrogon, NB-8690-215 nm Messung Zucker
Die geforderte Genauigkeit in der Getränkeindustrie (z. B. bei Ethanol 0,02 % m/m) ist mit den
gewählten optischen Filtern aufgrund des kleinen Messeffektes nur schwer erreichbar (siehe
4.4). Daher wurde der Prototyp in alternativen Einsatzgebieten wie die Verfolgung chemischer
10 Ein vierkanaliger Thermosäulendetektor kostet inklusive vier Standardfilter aus der IR-Gasanalytik selbst bei einzelner Abnahme weniger als 100 €. Die Filter werden als großflächige Wafer produziert und aus diesen anschließend viele Zuschnitte für einen Detektortyp gefertigt. Dadurch verteilen sich die Produktionskosten der optischen Bandpässe auf viele Detektoren.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 52
und biotechnologischer Prozesse erprobt (Veresterung mit anschließender Destillation; Hefe-
fermentation). Im Gegensatz zur Getränkeindustrie sind bei einer Prozessverfolgung geringere
absolute Genauigkeiten gefordert. Hier kommt es eher darauf an, den Reaktionsfortschritt
beurteilen zu können. Obwohl die vier eingebauten optischen Filter für den spezifischen
Nachweis von Ethanol und Gesamtzucker in der Getränkeindustrie ausgewählt wurden, ist ihr
spektraler Transmissionsbereich günstig für den Einsatz bei einer Vielzahl von chemischen
Reaktionen. So gelang es, die Veresterung von Ameisensäure mit Ethanol zu Ethylformiat plus
Wasser mit anschließender Destillation des Esters zu verfolgen, da die optischen Filter im
Bereich der Absorptionsbanden der einzelnen Analyten liegen (siehe Abbildung 45 in Kapitel
5). Wie in Kapitel 6 gezeigt wird, können mit den gewählten optischen Bandpassfiltern auch
biotechnologische Prozesse wie aerobe Hefefermentationen verfolgt werden. Bei diesem
Beispiel sind die Transmissionsbereiche der Filter geeignet (siehe Abbildung 53), um den
Abbau des Edukts Glucose und den Aufbau des Produkts Ethanol quantitativ zu erfassen.
4.1.3 Aufbau der Elektronik und Leitungsführung
Im Verkabelungsschema (siehe Abbildung 33) sind die Hardwarekomponenten des Proto-
typenaufbaus und deren Kabelverbindungen untereinander dargestellt. Diese Übersicht zeigt,
dass die Sensorsignale außerhalb des Sensorgehäuses mit einer USB-Datenerfassung (USB-
6351 von National Instruments) digitalisiert werden und auch die digitale Signalverarbeitung
extern auf einem PC unter LabVIEW stattfindet. Innerhalb des MIR-ATR-Sensors befinden sich
auf der Platinenversion 5 (Schaltplan und Platinenlayout siehe Anhang B) die Lichtquelle mit
Ansteuerschaltung und der Mehrkanaldetektor mit Signalverstärker. Eine detaillierte
Schaltungsbeschreibung folgt unter 4.1.4 und 4.1.5. Das Hauptaugenmerk der Elektronik-
entwicklung lag auf dem Verstärker für die Detektorsignale, da dessen Auslegung und Aufbau
entscheidend für die Signalqualität und folglich für die Genauigkeit des MIR-ATR-Sensors ist.
Ebenso gibt es – im Gegensatz zum Digitalteil – keinen zum optischen und mechanischen
Aufbau passenden zukaufbaren Analogteil. Dieser muss zwingend selbst entwickelt werden.
Die externe Signalwandlung und -verarbeitung gestattet zudem einen flexiblen und rück-
wirkungsfreien Test des Detektorsignalverstärkers. Bei bereits integriertem A/D-Wandler und
interner Signalverarbeitung auf einem Mikrocontroller wäre dies aufgrund der räumlichen
Nähe des störempfindlichen analogen zum hochfrequenten digitalen Schaltungsteil nur
schwer zu garantieren.
Die Verstärkerelektronik wird aus der Datenerfassung mit +5 V gespeist. Nach der Signal-
belegung in Tabelle 16 im Anhang B ist dies die braune Ader in der Steuerleitung (⑦ in
Abbildung 33 und Abbildung 34) und Pin 10 an den Steckverbindern (① und ⑥). Zum Betrieb
der Lichtquelle wird hingegen eine höhere Spannung und ein höherer Strom benötigt als ihn
die USB-Datenerfassung liefern kann. Daher ist zusätzlich ein +12 V-Netzteil (schwarze Ader,
Pin 1) über 4 mm-Laborbuchsen angeschlossen (⑨).
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 53
PCLabVIEW
Netzteil 12V Versorgung
der Lichtquelle
USB-Daten-erfassung
NI USB-6351
MIR-ATR-Sensor
USB
Platine V5mit Lichtquelle und Detektor
10-Pol Micromatch Federleiste auf der Platine, kabelseitig Schneidklemmstecker an 10-Pol Flachbandkabel Raster 1,27 mm von zu (Pins 1 bis 10) Zwillingsleitung mit 2-Pol Steckverbindung vom NTC zu (Pins 11 und 12) Einzelader mit M3 Kabelschuhen verbindet Sensorgehäuse mit Massefläche (V-) der Platine Schraubverbindung des Schirms aus mit Sensorgehäuse über M3 Kabelschuh 12-Pol Gehäusestecker und Kabelbuchse Binder Baureihe 720 Geschirmte Steuerleitung LiYCY, max. Ø 8 mm, 12 Adern je max. 0,25 mm² Kabel zugentlastet und mit Aderendhülsen auf Klemmblock aufgelegt, Schirm an Gehäuselasche 4mm Laborbuchse und -leitung zum Netzteil
NTC
Abbildung 33: Schema der Verkabelung des MIR-ATR-Sensors.
Abbildung 34: Foto der Verkabelung des MIR-ATR-Sensors am Klemmblock der USB-Datenerfassung.
Von großer Bedeutung für die Signalintegrität (Unverfälschtheit der übertragenen Signale)
erwies sich die Leitungsführung. Daher wird diese ausführlich erläutert. Von der Platine führt
das Flachbandkabel (②) die Analogsignale zum 12-poligen Rundsteckverbinder im Sensor-
boden (⑥). Das Sensorgehäuse schirmt äußere Störfelder ab, da es mit dem Schirm der
Steuerleitung verbunden ist (⑤). Eine 1,5 m lange Steuerleitung mit gemeinsamem Schirm
für alle Signaladern verbindet den MIR-ATR-Sensor mit der USB-Datenerfassung. An dieser ist
das Kabel fest montiert und die Adern am Klemmblock der Datenerfassung angeschlossen
(⑧). Die Eingangsimpedanz der USB-Datenerfassung ist mit > 10 GΩ parallel zu 100 pF sehr
⑨ Netzteilanschluss 4 mm Laborbuchsen
⑧ Klemmblock der Datenerfassung, Zugentlastung und Kabelschirm an Gehäuselasche
4x47 kΩ Abschluss der Analogeingänge
⑥ Sensoranschluss 12-Pol Kabelbuchse
⑤ Kabelschirm an M3-Öse
⑦ geschirmte Steuerleitung
Noch ungenutzte Adern (Temperaturmessung)
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 54
hoch (NATIONAL INSTRUMENTS, 2015, S. 1). Unsymmetrische Signale wie die Detektorsignale des
MIR-ATR-Sensors können durch die kapazitive Kopplung trotz des gemeinsamen Schirms der
Steuerleitung massiv gestört werden, da die Signale benachbarter Adern übersprechen. So
war zu den Ein- und Ausschaltzeitpunkten der Lichtquelle jeweils eine Störspitze in den
Detektorsignalen nach der Digitalisierung zu beobachten. Diese konnte beseitigt werden
durch Absenken der Eingangsimpedanz der Datenerfassung auf 47 kΩ, indem entsprechende
Widerstände an den Analogeingängen eingebaut wurden (siehe Abbildung 34). Aufgrund des
niedrigen Ausgangswiderstandes von nur wenigen Ohm des zur Detektorsignalverstärkung
eingesetzten Operationsverstärkers AD8606 (ANALOG DEVICES, 2013, Abb. 17) ist dies ohne
weiteres möglich.
Die Führung des Nullpotenzials erwies sich ebenfalls von entscheidender Bedeutung für die
Störfestigkeit gegen äußere elektromagnetische Felder, welche durch startende Leuchtstoff-
röhren oder das Schalten von Lichtschaltern bzw. Relais hervorgerufen werden. Üblicherweise
werden die Bezugspotenziale getrennt voneinander zum A/D-Wandler geführt und dort an
nur einem Punkt verbunden, damit keine ringförmige Strukturen entstehen (wirkt als Ring-
antenne), über die Störfelder eingekoppelt werden können. Die hier realisierte Verbindung
④ zwischen der Massefläche der Platine und dem Sensorgehäuse sollte daher eigentlich
vermieden werden. Allerdings nimmt die Störfestigkeit mit dieser Verbindung signifikant zu.
Dies ist der Fall, weil die 0 V auf der violetten Signalader (Pin 4) nie außerhalb des Schirmes
verläuft und dadurch keine wirksame Ringantenne entsteht. Da der Gehäusestecker aus
Kunststoff das Sensorgehäuse vom Kabelschirm isoliert, muss dieser über eine M3-Öse ⑤ mit
dem Sensorgehäuse verbunden werden. Ebenso muss der Kabelschirm mit dem Gehäuse der
Datenerfassung verbunden sein (⑧). Ohne die durchgängige Schirmung über ④, ⑤ und ⑧
kann der Sensor nicht am Fermenter (siehe Kapitel 6) eingesetzt werden, da an diesem häufig
Relais schalten, deren Abreißfunken erhebliche Störfelder verursachen.
Über die türkise und rosa Ader (Pins 11 und 12) ist die Erfassung der Probentemperatur mit
dem Thermistor (NTC) im Gehäusedeckel sensorseitig vorbereitet. Bei den hier beschriebenen
Anwendungen war die Probentemperatur während der Versuchsdauer konstant und musste
daher nicht zur Driftkompensation erfasst werden. Um mögliche zusätzliche Störpfade zu
vermeiden, wurde daher die Temperaturmessung noch nicht umgesetzt und diese beiden
Adern noch nicht angeschlossen. Aus demselben Grund liegt auch die weiße Ader (Pin 2) frei,
welche zusammen mit dem gemeinsamen Anschluss aller Detektorelemente (Pin 9, rote Ader)
einen NTC im Mehrkanaldetektor kontaktiert. Mit diesem könnte optional die detektorinterne
Temperatur gemessen werden.
4.1.4 Elektronik zur Ansteuerung der Lichtquelle
Die abgestrahlte Intensität der Lichtquelle wird mit 1 Hz moduliert, um mittels FFT (Fast
Fourier Transform) Rauschen, elektromagnetische Einkopplungen und thermisch bedingte
Drifte in den Detektorsignalen kompensieren zu können (siehe 4.1.7). Das Modulationssignal
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 55
wird von der USB-Datenerfassung erzeugt und über die graue Signalader/Pin 3 zur Platine
Version 5 als Signal MOD übertragen (siehe Signalbelegung in Tabelle 16 in Anhang B).
Abbildung 35 zeigt den Schaltplan der eingesetzten Ansteuerschaltung (kompletter Schaltplan
und Layout siehe Anhang B).
Abbildung 35: Schaltplan der Lichtquellenansteuerung, IC1: Lichtquelle Typ MIRL17-900 (Vertrieb durch Laser
Components, Olching).
Die Betriebsspannung der Lichtquelle IC1 bei der Nenntemperatur von 750 °C ist abhängig von
der Produktionscharge. Hier sind es 6,1 V bei einer Stromaufnahme von ca. 140 mA. Die
Widerstände R9 und R10 sind so gewählt11, dass der einstellbare Linearregler LD1117ASTR
(IC4) an seinem Ausgang die geforderte Spannung in einem Bereich von 6,125±0,058 V
bereitstellt (STMICROELECTRONICS, 2013, S. 24). Diese mit dem Kondensator C5 gepufferte
Versorgungsspannung wurde etwas oberhalb des Nennwertes der Lichtquelle gewählt, da am
schaltenden Transistor Q1 im leitenden Zustand, also bei eingeschalteter Lichtquelle,
zwischen Drain und Source ca. 35 mV abfallen (FAIRCHILD, 2003, Abb. 1). Sollte die Lichtquelle
erneuert werden, kann durch Verändern von R9 bzw. R10 die Betriebsspannung zwischen
1,25 V und 10 V nach Formel 4-1 angepasst werden (URef = 1,25±0,012 V).
𝑈(C5) = 𝑈Ref ⋅ (1 +
𝑅10
𝑅9) 4-1
Der zum Schalten der Lichtquelle verwendete N-Kanal MOSFET FDV305N (Anreicherungstyp)
besitzt eine Gate-Schwellspannung von ca. 1V und nur ca. 100 pF Gatekapazität. Damit kann
er direkt von einem Push-Pull-Digitalausgang (Mikrocontroller oder Datenerfassung mit 5 V-
oder 3,3 V-High-Pegel) geschaltet werden. R12 sorgt für ein störungsfreies Modulationssignal
am Gate und schützt dieses bei offener MOD-Leitung (graue Ader, Pin 3).
11 Wie alle auf der Platine eingesetzten Widerstände sind es Werte der E12-Reihe im SMD-Gehäuse 0805 in Dickschichttechnologie mit einer Nennleistung von 125 mW.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 56
4.1.5 Elektronik zur Detektorsignalverstärkung
Auswahl des Detektors
Im MIR-ATR-Sensor wird ein miniaturisierter Mehrkanaldetektor mit integrierten optischen
Filtern eingesetzt. Die einzelnen Detektorelemente solcher Detektoren liegen nahe bei-
einander. Somit können alle Kanäle von der MIR-ATR-Optik (siehe 4.1.1) bestrahlt werden,
obwohl der gewählte Aufbau der Optik ohne Spiegel und Linsen detektorseitig nur eine kleine
Fläche ausleuchtet. Miniaturisierte thermische Mehrkanaldetektoren werden von InfraTec
GmbH (Dresden), Micro Hybrid Electronic GmbH (Hermsdorf), Heimann Sensor GmbH
(Dresden), Excelitas Technologies Corp. (Waltham, USA) und anderen Herstellern im TO-5,
TO-8 oder TO-39-Gehäuse angeboten. Bei einer Marktrecherche zu Beginn der Elektronik-
entwicklung bot die Heimann Sensor GmbH insgesamt die besten Konditionen (kurze Liefer-
zeiten, mögliches Zuschneiden und Einbau beigestellter optischer Filter sowie gutes Preis-
Leistungs-Verhältnis). Daher wird im Prototyp der vierkanalige Thermosäulendetektor
HTS Q21 der Heimann Sensor GmbH eingesetzt (HEIMANN SENSOR, 2008b).
Ersatzschaltbild des Thermosäulendetektors und Abschätzung der Signalstärke
Das einfallende Licht wird jeweils von einer auf den Detektorelementen aufgebrachten
„Schwarzschicht“ absorbiert und die Temperaturdifferenz dieser Oberfläche zur Temperatur
des Detektorgehäuses in ein elektrisches Signal gewandelt. Der hierfür genutzte thermo-
elektrische Effekt ist vergleichsweise klein (siehe 2.2.1). Daher werden viele Thermoelemente
zu einer Thermosäule (engl. thermopile) in Reihe geschaltet. Die Spannungen der einzelnen
Thermoelemente summieren sich dadurch zu einer höheren Gesamt-Thermospannung. Zur
Entwicklung eines passenden Signalverstärkers kann das elektrotechnische Ersatzschaltbild
einer realen Spannungsquelle (ideale Spannungsquelle mit Widerstand in Reihe) verwendet
werden, wie der Ausschnitt aus dem Datenblatt des verwendeten vierkanaligen Detektors
HTS Q21 in Abbildung 36 zeigt.
Abbildung 36: Ersatzschaltbild und Pinbelegung des Vierkanaldetektors HTS Q21 mit internem NTC-
Temperatursensor (Thermistor) (HEIMANN SENSOR, 2008b).
Dabei entspricht der Widerstand dem Innenwiderstand der Thermosäule (hier 84 kΩ (HEIMANN
SENSOR, 2008b)) und die Spannungsquelle der zu erwartenden Thermospannung über der
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 57
Thermosäule. Diese ergibt sich aus der Empfindlichkeit des Detektorelements (siehe Daten-
blatt) und der einfallenden Lichtintensität. Letztere hängt von vielen Faktoren ab12 und ist
daher nicht ohne Weiteres aus dem optischen und mechanischen Aufbau ableitbar. Die zu
erwartende Thermospannung wurde deshalb nicht anhand des Sensoraufbaus theoretisch
ermittelt, sondern auf anderem Weg abgeschätzt: In IR-Gasanalysatoren werden die gleichen
Detektoren und Lichtquellen an einer Transmissionsküvette verbaut. Üblicherweise beträgt
der Verstärkungsfaktor des Signalverstärkers in diesen Geräten ca. 1000 V/V (LASER
COMPONENTS, 2016; MICRO-HYBRID, 2013). Die auftretende Thermospannung dürfte daher im
Bereich von 100 µV bis 1 mV liegen, damit nach dem Verstärker ein zur weiteren Signal-
verarbeitung geeigneter Pegel von 0,1-1,0 V zur Verfügung steht13. Beim MIR-ATR-Sensor
bestehen Verlustfaktoren in der Optik, die bei einer Transmissionsküvette nicht auftreten (z. B.
Reflexionsverluste an den Grenzflächen zum ATR-Prisma). Im Vergleich zu einer Trans-
missionsküvette in einem IR-Gasanalysator sollte sich daher beim MIR-ATR-Sensor am
Detektor eine um bis zu einer Größenordnung kleinere Lichtintensität einstellen. Folglich sind
Thermospannungen von 10-100 µV zu erwarten. Für die Entwicklung der Verstärkerschaltung
wurde der nach den vorigen Annahmen ungünstigste Fall von 10 µV Thermospannung
verwendet. Demnach muss ein Verstärkungsfaktor von ca. 104 V/V realisiert werden, um am
Ausgang des Signalverstärkers einen Pegel von ca. 100 mV zu erhalten.
Aufbau der Signalverstärkerschaltung als stromgesteuerte Spannungsquelle
Zur Signalverstärkung der Thermospannung eines Thermosäulendetektors werden in der
Regel Verstärkerschaltungen mit einer hohen Spannungsverstärkung eingesetzt (siehe oben).
Dieses Konzept ist jedoch mit vielen Nachteilen verbunden (Details hierzu unter 4.1.6
Bewertung herkömmlicher Detektorsignalverstärker). Für den MIR-ATR-Sensor wurde daher
ein vom üblichen Aufbau abweichender Signalverstärker (Transimpedanzverstärker)
entwickelt, der auf der Platinenversion 5 im Prototypsensor eingesetzt wird (Schaltplan und
Layout siehe Anhang B).
Bei der Inbetriebnahme erster Testschaltungen (Versionen 1…3, ohne Abbildung) zeigte sich,
dass eine störfeste Anbindung des Detektors an den Signalverstärker von besonders hoher
12 Unter anderem müssen der durch die Geometrie der Optik bedingte Strahlengang, die Temperatur, Fläche und Abstrahlcharakteristik der Lichtquelle, die Transmission der im Gehäusedeckel des Mehrkanaldetektors eingebauten optischen Filter und die Transmission und die Reflexionsverluste des ATR-Prismas berücksichtigt werden. 13 Die Thermospannung liegt auch bei der berührungslosen Temperaturmessung mittels Thermosäulendetektor in der hier angenommenen Größenordnung (ANALOG DEVICES, 2014, S. 18). Die zu bestimmende Objekttemperatur ist zwar üblicherweise niedriger als die der Lichtquelle in einem IR-Gasanalysator. Dafür werden spektral breit-bandige Fenster anstatt schmaler optischer Bandpässe in den Detektoren eingesetzt. Die IR-Strahlung dürfte daher bei beiden Anwendungen am Detektorelement eine vergleichbare Intensität besitzen. Folglich sollten die Thermospannungen ebenfalls ähnlich groß sein. Dies bestätigt die Annahme einer Thermospannung von 0,1-1,0 mV bei IR-Gasanalysatoren.
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 58
Bedeutung ist, damit das äußerst kleine Detektorsignal unverfälscht erfasst wird. Per Strom-
pegel übertragene Signale sind deutlich weniger anfällig für Einkopplungen als Spannungs-
signale. Vom Signalverstärker wird daher nicht die Thermospannung 𝑈therm hochohmig
abgegriffen, sondern der Thermostrom 𝐼therm des Detektors von einem Transimpedanz-
verstärker (TIA: Transimpedance Amplifier) im Kurzschluss erfasst. Da der Detektor im elektro-
technischen Ersatzschaltbild (siehe Abbildung 36) als reale Spannungsquelle mit der Leerlauf-
spannung 𝑈therm ≈ 10 µV und dem Innenwiderstand 𝑅therm = 84 kΩ dargestellt wird (siehe
voriger Abschnitt), kann er äquivalent auch als reale Stromquelle mit dem Kurzschlussstrom
𝐼therm =𝑈therm
𝑅therm≈ 120 pA beschrieben werden (TIETZE & SCHENK, 2002, S. 1546). Die Grund-
schaltung eines TIAs (auch Strom-Spannungs-Konverter oder stromgesteuerte Spannungs-
quelle) ist in Abbildung 37 dargestellt. Die (ideale) Übertragungsfunktion beschreibt Formel
4-2 (SIEGL & ZOCHER, 2014, S. 512f; TIETZE & SCHENK, 2002, S. 794f, 1170f):
𝑈𝑎 = −𝑅1 ⋅ 𝐼in 4-2
In Verstärkerschaltungen regelt der Operationsverstärker (OPV) die Spannung zwischen dem
invertierenden und nicht invertierenden Eingang zu Null (ideal betrachtet). Die Stromquelle
𝐼in nimmt daher ebenfalls 0 V an und treibt ihren Strom gegen einen Kurzschluss.
Abbildung 37: Grundschaltung eines Transimpedanzverstärkers.
Die Verstärkung eines TIAs wird bestimmt durch den zur Rückkopplung verwendeten
Widerstand 𝑅1. Es soll eine Ausgangsspannung von 𝑈𝑎 = 100 mV aus den 𝐼therm ≈ 120 pA
Thermostrom resultieren. Dies entspricht der im vorigen Abschnitt als notwendig
abgeschätzten Thermospannungsverstärkung von 104 V/V. Der Rückkoppelwiderstand muss
daher 𝑅1 =𝑈𝑎
𝐼therm≈ 840 MΩ betragen. Solch große Widerstandswerte sind z. B. als SMD-
Chipwiderstände (z. B. HVF2512T1007FE 1 GΩ im Gehäuse 2512 von OHMITE (Warrenville, IL,
USA), Vertrieb Farnell (Aschheim)) erhältlich. Es wäre demnach möglich, den TIA nach
Abbildung 37 kompakt als Grundschaltung aufzubauen. Die Rückkopplung wäre dann
aufgrund des sehr hohen Widerstandswertes jedoch ein störempfindlicher Pfad. Dies sollte
mit dem Aufbau des Signalverstärkers als TIA eigentlich vermieden werden.
Verbesserung der Störfestigkeit durch sternförmiges Rückkoppelnetzwerk
Mit Hilfe eines sternförmiges Rückkoppelnetzwerkes (siehe Abbildung 38 links) anstatt eines
einzelnen Widerstandes können um Größenordnungen kleinere Widerstandswerte
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 59
verwendet werden, ohne den Verstärkungsfaktor (Transimpedanz) zu reduzieren. Die Über-
tragungsfunktion ist nicht direkt aus dem Schaltplan ersichtlich. Mittels Stern-Dreieck-
Transformation (WEIßGERBER, 2015, S. 15) kann jedoch eine äquivalente Schaltung gezeichnet
werden, die einfacher zu interpretieren ist (Abbildung 38 rechts).
Abbildung 38: Transimpedanzverstärker mit sternförmigem Rückkoppelnetzwerk (links) und dazu äquivalente
Dreieckschaltung (rechts).
Der Widerstand 𝑅𝑏𝑐 der transformierten Schaltung belastet lediglich den OPV-Ausgang und
hat daher (ideal betrachtet) keinen Einfluss auf die Übertragungsfunktion der Schaltung. 𝑅𝑎𝑐
liegt parallel zum Sensor am Verstärkereingang. Da der OPV die Eingangsspannung jedoch zu
Null regelt, ist 𝑅𝑎𝑐 ebenfalls irrelevant. 𝑅𝑎𝑐 und 𝑅𝑏𝑐 können daher ohne Änderung der
Funktion der Schaltung entfernt bzw. zu unendlich angenommen werden. 𝑅𝑎𝑏 hingegen
befindet sich im Rückkoppelpfad und stellt die Transimpedanz der Verstärkerschaltung dar.
Zur Auslegung des ursprünglich sternförmigen Rückkoppelnetzwerkes muss daher lediglich
𝑅𝑎𝑏 gemäß Stern-Dreieck-Transformation nach Formel 4-3 berücksichtigt werden.
𝑅𝑎𝑏 =
𝑅𝑎𝑅𝑏 + 𝑅𝑏𝑅𝑐 + 𝑅𝑐𝑅𝑎
𝑅𝑐 4-3
Mit 𝑅𝑎 = 𝑅𝑏 = 10 MΩ und 𝑅𝑐 = 100 kΩ ergibt sich 𝑅𝑎𝑏 = 1,02 GΩ . Die benötigte Trans-
impedanz von ca. 840 MΩ kann folglich mit einem um zwei Größenordnungen nieder-
ohmigeren Rückkoppelnetzwerk realisiert werden. Dies erhöht die Störfestigkeit des
Detektorsignalverstärkers deutlich.
Einsatz der Verstärkerschaltung im MIR-ATR-Sensor
Auf der im Prototypsensor verwendeten Platinenversion 5 wird eine nach der obigen
Auslegung erstellte Verstärkerschaltung zur Detektorsignalverstärkung eingesetzt (Simulation,
Schaltplan und Layout siehe Anhang B). Der OPV AD8606 von Analog Devices (Norwood, MA,
USA) wird verwendet, da er eine niedrige Offset-Spannung, kleine Eingangsströme und ein
kleines Eingangsstromrauschen besitzt und somit die für einen TIA notwendigen Parameter
bietet (ANALOG DEVICES, 2013, S. 19). Mit der realisierten Transimpedanz von 1,02 GOhm
konnte ein einstufiger Verstärker realisiert werden, der einem Spannungsverstärker mit
Verstärkungsfaktor 𝑅𝑎𝑏
𝑅therm= 1,21 ⋅ 104 V/V entspricht (vgl. Abbildung 38 rechts). Diesen
Verstärkungsfaktor ermittelte ebenso die AC-Kleinsignalsimulation des TIAs (siehe Abbildung
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 60
57 in Anhang B). Die obige Analyse der idealisierten Schaltung ist demnach auch für die reale
Schaltung gültig. Im Vergleich zu einer Testschaltung, welche das Detektorsignal auf die
herkömmliche Weise verstärkt (siehe folgendes Kapitel), konnte eine deutlich bessere Signal-
qualität erreicht werden.
4.1.6 Bewertung herkömmlicher Detektorsignalverstärker
Zur Verstärkung des Signals eines Thermosäulendetektors wird üblicherweise ein Spannungs-
verstärker eingesetzt (LASER COMPONENTS, 2016; MICRO-HYBRID, 2013). Die kleine Thermo-
spannung von unter 1 mV (siehe vorheriger Abschnitt) bedingt einen hohen Verstärkungs-
faktor. Geeignete Operationsverstärker (OPVs) müssen daher einen sehr kleinen Offset-Fehler
und eine minimale Offset-Drift aufweisen. Entsprechende Typen werden von den Halbleiter-
herstellern unter den Marketingbezeichnungen „Auto-Zero“, „Zero-Drift“ oder „Chopper
stabilized“ angeboten, z. B. LTC2050 von Linear Technologies (Milpitas, CA, USA), AD8628 von
Analog Devices (Norwood, MA, USA) oder OPA335 von Texas Instruments (Dallas, TX, USA).
Typischerweise beträgt deren Offsetspannung deutlich weniger als 10 µV und die Offset-Drift
liegt unter 0,05 µV K-1. Dieser minimale Offset-Fehler wird durch einen automatischen
internen Nullabgleich ermöglicht. Das 1 𝑓⁄ -Rauschen von OPVs, welches in der Regel die
Genauigkeit von Verstärkerschaltungen unterhalb von 10 Hz begrenzt, wird dadurch ebenfalls
unterdrückt. Für die Verstärkung der sich nur langsamen ändernden Thermospannungen ist
dies von Vorteil. Die Minimierung des Offsetfehlers führt zu einem relativ niedrigen
Verstärkungsfaktor-Bandbreite-Produkt (GBW: Gain-Bandwidth-Product) des OPVs von
ca. 1-3 MHz. Eine 1000-fache Spannungsverstärkung kann dadurch lediglich mit einer
Bandbreite von 1-3 kHz realisiert werden. Dies genügt jedoch für die – wegen der thermischen
Strahlungsdetektion (siehe 2.2.1) – trägen Thermosäulendetektoren.
Abbildung 39: Beispielschaltung eines Verstärkers für einen Thermosäulendetektor mit 1001-facher
Vorverstärkung und 11-facher Nachverstärkung des Wechselanteils (ANALOG DEVICES, 2014, S.
18).
Die Verstärkung der Thermospannung einer Thermosäule ist für Zero-Drift-OPVs eine typische
Anwendung, daher sind in den Datenblättern entsprechende Beispielschaltungen enthalten.
Abbildung 39 zeigt einen solchen vorgeschlagenen zweistufigen Verstärker mit einer Gesamt-
verstärkung von ca. 11.000 V/V. Eine Testschaltung für den verwendeten Vierkanaldetektor
HTS Q21 wurde in dieser herkömmlichen Topologie realisiert (Simulation, Schaltplan und
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 61
Layout Version 6 in Anhang B)14. Folgende Schaltungseigenschaften fielen beim Erstellen des
Layouts und der Inbetriebnahme nachteilig (gegenüber der Version 5) im Hinblick auf den
Einsatz im MIR-ATR-Sensor auf:
- Die Spannungsverstärkung der ersten Stufe ist mit 1001 V/V trotz des minimalen
Offset-Fehlers des Zero-Drift-OPVs bereits grenzwertig hoch für den unsymmetrischen
Schaltungsaufbau. Bei höherer Vorverstärkung würde das Verhalten der Schaltung
maßgeblich von den Fehlern des OPVs und damit von dessen Produktionscharge
abhängen. Um den notwendigen Verstärkungsfaktor von ca. 104 V/V zu erreichen
(siehe 4.1.5), ist der zweistufige Aufbau mit Nachverstärkung des Wechselanteils
notwendig. Aufgrund des begrenzten Bauraums im Sensorgehäuse wäre eine
einstufige Lösung jedoch wünschenswert.
- Wegen der kleinen Signalfrequenzen ist eine relativ große Koppelkapazität zwischen
den Verstärkerstufen notwendig. Kompakte SMD-Keramikkondensatoren (SMD:
Surface Mounted Device) in MLCC-Technologie (MLCC: Multi Layer Chip Capacitor)
können dafür nicht eingesetzt werden, da deren Kapazitätswerte stark alters-,
spannungs-, frequenz- und temperaturabhängig sind. Andere geeignete Kondensator-
typen wie der in der Testschaltung eingesetzte 6,8 µF THT-Folienkondesator
MKS2B046801M00 der Wima GmbH, Mannheim (THT: Through Hole Technology)
bieten zwar die benötigte Stabilität der Kapazität, stehen jedoch durch ihr großes
Volumen (hier LxBxH 7,2x16x11 mm) einer Miniaturisierung der Verstärkerelektronik
im Weg.
- Der Abgriff der Thermospannung erfolgt sehr hochohmig mit dem nicht invertierenden
Eingang des OPVs. Aufgrund des kleinen Signals sollte die Leitungslänge daher nur
wenige Millimeter betragen, um Einkoppelpfade zu minimieren. Bei dem gewählten
Vierkanaldetektor ist dies aus Platzgründen allerdings kaum zu gewährleisten (siehe
Layout der Detektorschaltung in Abbildung 65 im Anhang B). Der Verstärker ist
dadurch störanfällig.
- Die Störfestigkeit wäre höher bei einem symmetrischen Signalabgriff und dem dazu
passenden Aufbau der Verstärkerschaltung als Differenzverstärker. Der gewählte
Mehrkanaldetektor führt jedoch jeweils einen Anschluss der Detektorelemente und
einen Anschluss des internen Thermistors am Gehäusepin zusammen (siehe Abbildung
35). Dadurch ist keine symmetrische Leitungsführung möglich. Ein Differenzverstärker
wäre dadurch nur unnötig komplex ohne Gewinn an Signalqualität.
Insgesamt war die Signalqualität der Testschaltung Version 6 nicht zufriedenstellend. Daher
wurde für den MIR-ATR-Sensor das im vorigen Abschnitt 4.1.5 beschriebene alternative
Verstärkerkonzept entworfen und umgesetzt.
14 Der OPV AD8629 mit 100 pA Eingangs-Bias-Strom wurde ersetzt durch den AD8554 mit 20 pA Eingangs-Bias-Strom und sonst nahezu identischen Parametern (ANALOG DEVICES, 2015).
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 62
4.1.7 Software, Datenerfassung und Signalverarbeitung
Die analogen Ausgangssignale des MIR-ATR-Sensors werden mit einer USB-Datenerfassung
(NI-6351) digitalisiert und anschließend unter LabVIEW verarbeitet (siehe Aufbau der Sensor-
elektronik unter 4.1.3 und Signalbelegung in Tabelle 16 im Anhang B). Das hierfür entwickelte
Programm ATR_Photometer (siehe Abbildung 40) zeigt die gemessenen Intensitäten und
Extinktionen in den Sensorkanälen an. Der Verlauf der Extinktion kann zudem in einer TDMS-
Datei aufgezeichnet werden (zum TDMS-Dateiformat siehe 3.3.3). Darüber hinaus wird das
Modulationssignal für die Lichtquelle (graue Ader im Kabel zum Sensor) und die am
gemeinsamen Pin des Detektors angelegte Gleichtaktspannung (rote Ader) erzeugt.
Abbildung 40: Bildschirmfoto des LabVIEW-Programms ATR_Photometer.
Vor dem Start des VIs15 muss die Länge des als FIFO (first in, first out) organisierten Signal-
puffers in Sekunden gewählt werden. Sie legt die Ansprechzeit des Sensors fest. 10 s sollten
nicht unter- und 1000 s nicht überschritten werden. Beim Einsatz des Sensors zur Verfolgung
der Veresterung mit anschließender Destillation (siehe Kapitel 5) erwies sich eine Pufferlänge
von 30 s als adäquat. Dagegen mussten bei der Hefefermentation (siehe Kapitel 6) mussten
wegen der kleinen Signale (Absorptionen) 300 s gewählt werden. Ein längerer Signalpuffer
erhöht die Trägheit des MIR-ATR-Sensors, führt jedoch im Gegenzug zu einer besseren Rausch-
und Störunterdrückung und damit zu einer höheren Genauigkeit des Sensors.
Nach dem Ausführen des VIs startet zunächst die Ausgabe des 1 Hz-Modulationssignals.
Hierfür wird der Ausgang des Timers 0 der Datenerfassung verwendet (CTR 0 OUT), der
standardmäßig dem Digitalpin PFI 12 (Pin 89 am Klemmblock der USB-6351) zugewiesen ist
15 Unter der LabVIEW-Entwicklungsumgebung in der grafischen Programmiersprache „G“ erstellte Programme werden als Virtuelle Instrumente (VIs) bezeichnet. Sie enthalten eine Bedienoberfläche (Frontpanel) und den grafischen Programmcode in einem Blockdiagramm.
Extinktionsverlauf
Intensitätsverlauf
Aktuelle Extinktion und Intensität sowie Referenzintensität
Programmende
Gleichtakt-spannung
Länge des Signalpuffers
Gepufferte Sensorsignale
Referenzintensität messen,
Aufzeichung starten
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 63
(NATIONAL INSTRUMENTS, 2015, S. 171). Bei dieser Art der Frequenzerzeugung wird der Timer
einmal zum Programmstart konfiguriert und erzeugt das Modulationssignal anschließend
selbstständig, ohne dass Eingriffe des Host-PCs nötig sind. Die Bus-Kapazität zur USB-
Datenerfassung und die Rechenleistung des PCs stehen damit komplett zur Signal-
erfassung, -verarbeitung und für die Bedienoberfläche zur Verfügung. Die Modulations-
frequenz von 1 Hz wurde gewählt, um die volle Modulationstiefe der Lichtquelle nutzen zu
können und Signale oberhalb der Grenzfrequenz des Detektors von 8,8 Hz zu vermeiden.
Der Eingangsspannungsbereich des 16 Bit A/D-Wandlers wurde mit -5 V bis +5 V passend zur
Verstärkerelektronik gewählt. Die Rate der kontinuierlichen Signalabtastung wird abhängig
von der gewählten Signalpufferlänge so eingestellt, dass pro Detektorkanal 300.000 Abtast-
werte gepuffert werden. Bei einer Pufferlänge von 30 s beträgt die Abtastrate daher 10 kHz,
bei 300 s langem Zwischenspeichern 1 kHz. Insgesamt werden 1,2 Millionen 16 Bit-Werte für
alle vier Kanäle zur Weiterverarbeitung vorgehalten. Der FIFO-Puffer wird jede Sekunde
aktualisiert und die Signalintensität in den vier Kanälen per FFT (Fast Fourier Transform)
ermittelt. Die hierfür benötigte Rechenzeit steigt mit der Anzahl der verrechneten Abtast-
werte. Das Festlegen des Signalpuffers auf 300.000 Abtastwerte pro Kanal stellt sicher, dass
die Demodulation auch ohne High-End-PC in maximal 0,5 s erfolgen kann – unabhängig von
der zeitlichen Länge des Signalpuffers. Dies beugt Timingproblemen vor und führt zu einem
möglichst hohen Oversamplingfaktor bei konfigurationsunabhängiger Rechenlast.
Die gepufferten Detektorsignale werden auf dem Frontpanel angezeigt (siehe Abbildung 40).
Mit der einstellbaren Gleichtaktspannung kann der Offset der Detektorsignale verändert
werden, wenn ein Signal die Stellgrenzen der Verstärkerschaltung von 0 V oder +5 V erreicht.
Während der gesamten Erprobung des MIR-ATR-Sensors war es allerdings nicht erforderlich,
einen anderen Wert als +3,0 V einzustellen. Die Ausgabe über den Analogausgang 0 (AO 0,
Klemmblockpin 15) erfolgt asynchron nach Anforderung (bei Programmstart und nach einer
Wertänderung), um den Bus zur Datenerfassung nicht unnötig zu belegen.
Die Extinktionen und deren Verlauf werden berechnet, sobald die Referenzintensität durch
Klick auf einen der beiden dafür vorgesehenen Buttons gemessen wurde. Der untere Button
startet mit der Referenzmessung auch die Aufzeichnung in eine TDMS-Datei, deren Dateiname
im Anzeigeelement LogFile eingetragen wird. Eine erneute Referenzmessung wird bei Start
der Aufzeichnung durch Deaktivierung beider Buttons verhindert. Mit Klick auf den STOPP-
Button endet das Programm.
4.2 Vergleich der Sensorsignale während einer Veresterung mit
anschließender Destillation mit einer Simulation
Auf Basis der MIR-ATR-Spektren des Referenzgerätes (FT-MIR-ATR-Spektrometer Alpha von
Bruker Optik GmbH, Ettlingen) können die Signale des MIR-ATR-Sensors simuliert werden,
wenn mit beiden Geräten dieselben Proben vermessen werden. Ein anschließender Vergleich
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 64
von simulierten und realen Sensorsignalen sollte die erwartungsgemäße Funktion des Sensors
bestätigen. Die zur Sensorsignalsimulation ausgearbeitete Methode und programmierte
Software ist unter Kapitel 3.3 beschrieben.
Die ATR-Messzellen beider Geräte besitzen dieselben für die Eindringtiefe (siehe Formel 2-4)
maßgeblichen Parameter (𝑁 = 1 Reflexionsstelle an der Grenzfläche zur Probe, Einfallswinkel
𝛽 = 45°, Brechungsindex des ZnSe- bzw. Diamant-Prismas 𝑛𝑝 = 2,4). Daraus ergibt sich die
gleiche optische Schichtdicke (siehe Formel 2-5). Nach Formel 3-2 kann damit das Signal eines
Sensorkanals anhand der mittleren Extinktion von MIR-ATR-Spektren im Transmissionsbereich
des im Sensorkanal eingesetzten optischen Filters näherungsweise simuliert werden. Eine
Schichtdickenkorrektur (siehe Formel 3-3) ist nicht erforderlich.
Abbildung 41 zeigt die Signale des MIR-ATR-Sensors (durchgezogene Linie) während Lauf 7 der
Veresterung mit anschließender Destillation (siehe Kapitel 5). Darüber hinaus sind die
simulierten Sensorsignale (gestrichelte Linie) eingezeichnet, welche auf die oben
beschriebene Weise erstellt wurden. Beide Geräte erfassten in einer Probenschleife simultan
dieselben Proben im Durchfluss.
Abbildung 41: Signale des MIR-ATR-Sensors und zugehörige Simulation auf Basis der MIR-ATR-Spektren
während Lauf 7 der Veresterung und Destillation.
Anhand der dargestellten Verläufe ist zu erkennen, dass für alle vier Kanäle die simulierten
Signale qualitativ den realen Sensorsignalen entsprechen:
0,0
0,1
0,2
0,3
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4
Exti
nkt
ion
Sen
sor/
Sim
. Sen
sor
Lau
f 7
Versuchsdauer / h
Kanal 1 Kanal 2 Kanal 3 Kanal 4
Sim Kanal 1 Sim Kanal 2 Sim Kanal 3 Sim Kanal 4
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 65
- Die Extinktion nimmt in allen Kanälen bei der Zugabe der Ameisensäure zum
Versuchsstart (𝑡 = 0 h) stark zu.
- Während der Veresterung (0-1,8 h) fallen Kanal 1 und Kanal 3 deutlich ab, Kanal 2
steigt leicht an, Kanal 4 steigt deutlich an.
- Während der Destillation (ab 1,8 h) steigen die Kanäle 1-3 deutlich an, Kanal 4 fällt
leicht ab.
Damit spiegelt die Simulation das Sensorverhalten qualitativ wider. Dies bestätigt die korrekte
Funktion des Sensorprototyps, obgleich die absolute Höhe der einzelnen Kanäle z. T. erheblich
von der Simulation abweicht. Zurückzuführen ist dies u. a. auf die nicht berücksichtigten
Unterschiede in der Elektronik und Signalverarbeitung einerseits und auf die nur näherungs-
weise Simulation der Sensorsignale andererseits. Dies liegt z. B. daran, dass die spektrale
Verteilung der Transmission der optischen Bandpässe in den Sensorkanälen bei der
Simulationsrechnung nicht exakt berücksichtigt (siehe Abbildung 15) wird. Dadurch ergeben
sich für die Kanäle 2 und 4, welche im Bereich steiler Flanken der Absorptionsbanden von
Ethylformiat und Ameisensäure liegen (siehe Abbildung 45 und Abbildung 10), deutlich
größere Abweichungen zwischen der Simulation und dem realen Sensorverhalten als für die
Kanäle 1 und 3, bei denen die Probenabsorption innerhalb der Filtertransmission flacher
verläuft.
Über den Nachweis der korrekten Funktionsweise des Sensorprotyps hinaus bestätigt der
vorige Vergleich die entwickelte Simulation auf Basis von MIR-ATR-Spektren zudem als
qualitativ begründet. Somit können optische Bandpässe schon vor dem Bau eines Prototyps
auf ihre Eignung für eine bestimmte Messaufgabe hin überprüft werden. Im Rahmen der
beiden Prozessverfolgungen (siehe Kapitel 5 und 6) konnten somit jeweils optimale Filter-
transmissionsbereiche zur weiteren Verbesserung des MIR-ATR-Sensors gefunden werden
(siehe 5.3 und 6.3).
4.3 Wiederholbarkeit der Sensorsignale
Die korrekte Funktionsweise des Prototyps wurde im vorigen Kapitel anhand der Verfolgung
der Veresterung mit anschließender Destillation gezeigt. Dafür wurden die gemessenen
Sensorsignale aus lediglich einem Versuchsdurchlauf herangezogen. Es ist jedoch ebenso von
großer Wichtigkeit, dass sich das Ansprechverhalten des MIR-ATR-Sensors über einen langen
Zeitraum und viele Prozessdurchgänge hinweg nicht ändert. Daher wird im Folgenden die
Wiederholbarkeit der Sensorsignale anhand aller sieben durchgeführten Veresterungen mit
anschließender Destillation überprüft.
Der Sensorkanal 3 verfügt aufgrund des schmalen Transmissionsbereiches des optischen
Bandpasses von nur 40 nm (siehe Tabelle 6) über den geringsten Störabstand der vier
Sensorkanäle. Eine eingeschränkte Reproduzierbarkeit der Signale des MIR-ATR-Sensors
aufgrund von Drifts oder äußeren Störeinflüssen ließe sich in diesem Kanal daher zuerst
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 66
beobachten. Deshalb sind die Signale von Kanal 3 aus allen sieben Läufen der Veresterung mit
anschließender Destillation in Abbildung 42 dargestellt.
Abbildung 42: Signalverläufe des Kanals 3 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und Destillation.
Die gute Reproduzierbarkeit der Sensorsignale lässt sich anhand vieler Ähnlichkeiten zwischen
den Läufen belegen:
- Vor Versuchsbeginn (𝑡 < 0 h) befindet sich lediglich Ethanol 96% V/V in der Apparatur.
Bei allen Läufen beträgt die Signalhöhe in Kanal 3 hierbei 60-65 Milliextinktionen
(mExt).
- Die Zugabe der Ameisensäure (𝑡 = 0 h) führt zu einem reproduzierbaren sprunghaften
Anstieg auf 90-92 mExt.
- Während der anschließenden Veresterungsreaktion bis ins Gleichgewicht fällt Kanal 3
wiederum auf 62-65 mExt ab. Die Reaktionsgeschwindigkeit variiert zwischen den
Durchgängen, weshalb dieser Wert zu unterschiedlichen Zeiten erreicht wird (nach
1,0-2,5 h).
- Mit der Destillation wurde daher zu unterschiedlichen Zeitpunkten begonnen. Dies hat
zur Folge, dass der durch die Destillation des Esters verursachte erneute Signalanstieg
zwischen den Läufen zeitlich verschoben ist. Nach der Destillation werden stets
90-92 mExt erreicht.
Die Unterschiede in der absoluten Signalhöhe zwischen den Läufen betragen damit maximal
0,005 Extinktionen. Dies gilt auch für die übrigen Kanäle 1, 2 und 4 (siehe Abbildung 66 und
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Sen
sor
Exti
nkt
ion
Kan
al 3
Versuchsdauer / h
Kanal 3 Lauf 1
Kanal 3 Lauf 2
Kanal 3 Lauf 3
Kanal 3 Lauf 4
Kanal 3 Lauf 5
Kanal 3 Lauf 6
Kanal 3 Lauf 7
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 67
Abbildung 67 in Anhang C). Dahingegen beträgt die Signaländerung aufgrund von Konzen-
trationsänderungen ca. 0,06 in Kanal 1, ca. 0,03 in Kanal 3 und ca. 0,19 in Kanal 2 und 4. Selbst
im Kanal mit dem kleinsten Messeffekt (Kanal 3) liegt damit die Unsicherheit zwischen den
Läufen etwa eine Größenordnung unterhalb der wiederholbaren Signaländerung während des
Versuchs. Auch bei Messungen mit dem MIR-ATR-Spektrometer schwankt die Basislinie
üblicherweise um einige Milliextinktionen zwischen den Versuchsdurchgängen. Die
Reproduzierbarkeit der Signale des MIR-ATR-Sensors ist damit ähnlich gut wie die des
Referenzgerätes.
4.4 Vergleich des Messeffektes für Glucose und Ethanol mit einer Simulation
Unter 4.2 wurde das Ansprechverhalten des MIR-ATR-Sensors für Gemische aus Ethanol,
Ameisensäure, Ethylformiat und Wasser bereits qualitativ bestätigt. Hierbei wurden Mess-
daten aus der Prozessverfolgung der Veresterung mit anschließender Destillation verwendet,
da Mischungen aus den Analyten reaktiv sind und die Präparation von definierten Konzen-
trationen daher schwierig ist (siehe 3.1.3). Die zur Verfolgung der Hefefermentation
relevanten Analyten Ethanol und Glucose reagieren nicht miteinander und können daher
problemlos in Wasser als Matrix vermessen werden. Hierzu wurde jeweils eine Verdünnungs-
reihe von Glucose bzw. Ethanol im zur Prozessverfolgung relevanten Konzentrationsbereich
(0-50 g L-1 Ethanol, 0-150 g L-1 Glucose) vom MIR-ATR-Sensor und vom Referenzgerät (FT-MIR-
ATR-Spektrometer) vermessen. Anhand der Spektren wurden die Sensorsignale simuliert (vgl.
4.2). Diese sind in Abhängigkeit der eingewogenen Analytkonzentration in Abbildung 43
dargestellt, wobei der Wasseroffset (mehrere 10 Milliextinktionen) in jedem Kanal subtrahiert
wurde, damit der kleine Messeffekt deutlicher zu erkennen ist. Bis auf einen Ausreißer bei
35 g L-1 Ethanol liegen alle Messpunkte nahe bei einer Regressionsgeraden durch den
Ursprung. Somit folgt die simulierte photometrische Absorptionsmessung erwartungsgemäß
dem LAMBERT-BEERschen Gesetz (siehe Formel 2-1). Die Steigung der Ausgleichsgeraden ist der
beim Sensor zu erwartende Messeffekt.
Gemäß der Simulation spricht auf Ethanol lediglich Kanal 3 mit 69 µExt / g L-1 an, welcher die
Absorptionsbande der CH-Streckschwingung erfasst (siehe Abbildung 53). Die Kanäle 1, 2 und
4 fallen mit zunehmender Alkoholkonzentration leicht ab, da Ethanol innerhalb der
Transmissionsbereiche der optischen Bandpässe in diesen Kanälen eine geringfügig kleinere
Absorption aufweist als Wasser. Selbst der größte sich nach der Simulation ergebende
Messeffekt, der in Kanal 4 bezüglich Glucose auftritt, ist kleiner als 0,1 Milliextinktionen pro
g L-1 und damit sehr klein. Kanal 3 spricht auf Glucose ähnlich stark an wie auf Ethanol. In
beiden Molekülen sind mehrere C-H-Bindungen (5 bei Ethanol und 7 bei Glucose), deren
Valenzschwingungen im Spektralbereich von Filter 3 liegen. Die als Referenz vorgesehenen
Kanäle 1 und 2 (siehe Tabelle 6) sollten auf Glucose mit einer niedrigeren Steigung (Mess-
empfindlichkeit) reagieren als die Messkanäle 3 und 4 (siehe Abbildung 52).
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 68
Abbildung 43: Simuliertes Ansprechverhalten der vier Kanäle des MIR-ATR-Sensors bzgl. Ethanol (oben) und
Glucose (unten), Extinktionsänderung bezogen auf Wasser in Abhängigkeit der
Analytkonzentration.
Tabelle 7: Messeffekt der vier Kanäle des MIR-ATR-Sensors bezüglich Glucose in Mikroextinktionen pro g L-1.
Sensorkanal Steigung bezüglich Glucose
Sensor / 10-6 L g-1 (STAUBACH, JENS, 2015, S. 36)
Simulation / 10-6 L g-1 (Abbildung 43 Anhang B)
Verhältnis Sensor zu Simulation
1 13,5 11,4 1,18
2 33,8 39,5 0,86
3 45,3 53,0 0,85
4 52,8 93,2 0,57
In Tabelle 7 ist exemplarisch der Messeffekt des Sensorprototyps bzgl. Glucose dem
simulierten Sensor gegenübergestellt. In den Kanälen 1, 2 und 3 stimmt der simulierte
Messeffekt bezüglich Glucose mit dem des Protoyps gut überein. Das Verhältnis der Signale
y = 4,75E-06x
y = -8,80E-06x
y = 6,88E-05x
y = -4,99E-06x
-0,001
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0 10 20 30 40 50
Exti
nkt
ion
sän
der
un
g d
er s
imu
liert
en
Kan
äle
(au
f W
asse
r b
ezo
gen
)
Ethanolkonzentration / g L-1
Simulation Kanal 1
Simulation Kanal 2
Simulation Kanal 3
Simulation Kanal 4
y = 1,14E-05x
y = 3,95E-05x
y = 5,30E-05x
y = 9,32E-05x
0,000
0,005
0,010
0,015
0 25 50 75 100 125 150
Exti
nkt
ion
sän
der
un
g d
er s
imu
liert
en
Kan
äle
(au
f W
asse
r b
ezo
gen
)
Glucosekonzentration / g L-1
Simulation Kanal 1
Simulation Kanal 2
Simulation Kanal 3
Simulation Kanal 4
4 Entwicklung eines Inline MIR-ATR-Sensors 69
liegt im Bereich von 0,85 bis 1,18. Dies ist auf die nur näherungsweise Simulation der
Sensorsignale zurückzuführen. Kanal 4 erreicht hingehen nur 57 % des simulierten Mess-
effektes. Solch eine große Abweichung kann nicht allein auf die Simulationsmethode
zurückgeführt werden. Im Rahmen der Weiterentwicklung des Sensors sollte für diesen Kanal
daher eine genauere Simulationsrechnung und Berücksichtigung der exakten spektralen
Verteilung der Filtertransmission durchgeführt werden, um den Simulationsfehler zu
minimieren. Wenn diese genauere Simulation sich nicht deutlich dem Verhalten des Prototyps
annähert, ist es sinnvoll, ein anderes optisches Bandpassfilter für diesen Kanal einzusetzen,
dessen Durchlassbereich stark mit einer Absorptionsbande von Glucose überlappt.
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 70
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation
5.1 Versuchsdurchführung
5.1.1 Zeitlicher Verlauf der sieben Versuchsdurchgänge
Die verschiedenen Phasen der Veresterung mit anschließender Destillation können anhand
des Temperaturverlaufs im Reaktionsgemisch nachvollzogen werden (Abbildung 44). Bei 𝑡 =
0 h wurde zur Ethanolvorlage die Ameisensäure zugegeben und damit die Veresterungs-
reaktion gestartet. Nach 1,3-1,5 h stellte sich jeweils das Gleichgewicht ein. Dies ließ sich
sowohl an konstanten Signalen des MIR-ATR-Sensors als auch an konstanten Messergebnissen
der Referenzanalytik erkennen (siehe Anhang A). Bei den Läufen 2, 4 und 6 (Lauf 2 ist in
Abbildung 44 nicht dargestellt) wurde das Gleichgewicht bis zu einer Stunde lang beobachtet,
um zu testen, ob dieses tatsächlich erreicht ist und sicher erkannt werden kann. Im Anschluss
an die Veresterung wurde die Apparatur jeweils für die Destillation umgebaut (siehe
Abbildung 9) und mit dem Erhitzen des Reaktors im Wasserbad begonnen. Ab einer
Temperatur von 70 °C im Reaktor begann die Kondensation im Destillationsaufsatz, sodass die
Temperatur durch das intensivere Verdampfen des Reaktionsgemisches langsamer anstieg. Es
konnte bei maximaler Heizleistung eine Temperatur von 88 °C im Reaktor erreicht werden.
Die Destillation stoppte jedoch bereits bei 80-85 °C. Die Gesamtdauer eines Laufes betrug 1,9-
2,9 h.
Abbildung 44: Temperatur des Reaktionsgemisches während der Veresterung und Destillation bei den Läufen
3, 4, 5, 6 und 7.
10
30
50
70
90
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Tem
per
atu
r /
°C
Versuchsdauer / h
Temperatur Lauf 3
Temperatur Lauf 4
Temperatur Lauf 5
Temperatur Lauf 6
Temperatur Lauf 7
Vorlage Ethanol
Zugabe Ameisensäure
V e r e s t e r u n g
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 71
Die Läufe 1 und 2 sind in Abbildung 44 nicht dargestellt, da hier der Temperatursensor nicht
zur Verfügung stand. Abweichend von der Versuchsbeschreibung unter 3.1.2 wurde er zur
Temperierung mittels PID-Regler verwendet. In Lauf 1 wurde das Reaktionsgemisch während
der Veresterung auf 50 °C, in Lauf 2 auf 40 °C temperiert. Für die Destillation wurde in diesen
beiden Läufen der Sollwert des Reglers auf 90 °C erhöht, um dem Zersetzen der Ameisensäure
und einem hohen Wasserdampfdruck im Gasraum des Reaktors vorzubeugen. Mit dem
siedenden Wasserbad konnten jedoch lediglich 88 °C bei voller Heizleistung erreicht werden,
sodass in den Läufen 3-7 auf den Einsatz des Reglers verzichtet wurde. In Lauf 3 war von 1,9-
2,0 h die Schlauchpumpe blockiert, sodass die Probenschleife nicht durchspült und folglich
keine Wärme durch den Probenkühler entzogen wurde. In Kombination mit der sich bereits
verringernden Kondensation im Destillationsaufsatz führte dies zu einem deutlich schnelleren
Temperaturanstieg nach 1,9 h. Zur Kalibration des MIR-ATR-Sensors (siehe 5.2.2) konnte
Lauf 3 trotz dieser Abweichungen von den übrigen Läufen herangezogen werden. In allen
Läufen siedete und verdampfte das Reaktionsgemisch zum Ende der Destillation nach wie vor
stark, kondensierte jedoch an der Reaktorwand bzw. im vorderen Teil des Destillationsauf-
satzes und floss zurück. Der Ester und die eventuell mit destillierte kleine Menge Alkohol
wurden demnach nicht vollständig abgezogen. Anhand einer Stoffmengenbilanz konnte dies
bestätigt und quantifiziert werden:
5.1.2 Stoffmengenbilanz und Überprüfen der Versuchsauslegung mit Hilfe der Referenz-
analytik
Das Destillat roch wie reines Ethylformiat nach Arrak (Rum), dies bestätigt den deutlich
überwiegenden Anteil des Esters. In allen Chargen betrug das Volumen des Destillats über
100 mL (105-110 mL), was unter der näherungsweisen Annahme, das Destillat bestünde aus
reinem Ethylformiat, etwa 1,34 mol entspricht. Somit finden sich ca. 81 % der vorgelegten
1,65 mol Ethanol im Destillat als Ester wieder. Nach Ende der Destillation verbleiben damit
noch 0,31 mol der Ethanolvorlage entweder als Alkohol oder als Ester im Reaktor. Mit dem
durch die Destillation von 224 mL auf 117 mL reduzierten Volumen entspricht dies einer
Konzentration von 2,7 mol L-1. Die Referenzanalytik ermittelt zu Versuchsende ca. 2,0 mol L-1
Ethylformiat und ca. 0,5 mol L-1 Ethanol (siehe Abbildung 68 und Abbildung 69 im Anhang).
Die gemessene Summe von 2,5 mol L-1 Alkohol und Ester im Destillationssumpf steht im
Rahmen der Mess- und Schätzgenauigkeit in Einklang mit den aus der Stoffbilanz ermittelten
2,7 mol L-1.
Anhand der Referenzanalytik kann zusätzlich überprüft werden, ob die Veresterung bis zum
Gleichgewicht gemäß der Auslegung verläuft (siehe 3.1.2.). Für eine produktfreie Vorlage
wurde darin ein Umsatz von 6,7 mol L-1 abgeschätzt. Das tatsächliche Gleichgewicht stellte
sich aufgrund des in der Vorlage enthaltenen Wassers erwartungsgemäß bei einem etwas
kleineren Umsatz von ca. 6,0 mol L-1 ein (siehe Tabelle 8). Dies ist der Mittelwert der Konzen-
trationsänderungen für Ethanol, Ameisensäure und Ethylformiat. Die Veresterung wird
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 72
demzufolge bis ins Gleichgewicht geführt und die gemäß Versuchsauslegung erwarteten
Verhältnisse erreicht. Aufgrund des höheren Fehlers bei der Wasserbestimmung (siehe
Tabelle 5) wird für diesen Analyten lediglich ein Umsatz von 5,1 mol L-1 ermittelt.
Tabelle 8: Bis zum Gleichgewicht umgesetzter Anteil von W, ET, AS und EF nach der chemometrischen Analyse der MIR-ATR-Spektren beim Veresterungsversuch. Aufgeführt sind die Mittelwerte und Standardabweichung anhand der 7 Läufe.
Stoff Umsatz bis zum Gleichgewicht
mol L-1
Standardabweichung mol L-1
Wasser (W) 5,1 0,24
Ethanol (ET) -6,1 0,16
Ameisensäure (AS) -5,9 0,22
Ethylformiat (EF) 6,0 0,10
Der Umsatz wurde für jeden Analyten als Differenz zwischen der berechneten Ausgangs-
konzentration (Tabelle 3) und der mittleren per Referenzanalytik gemessenen Gleichgewichts-
konzentration (Tabelle 20 im Anhang) ermittelt. Die Ausgangskonzentrationen können
aufgrund der rapiden Konzentrationsänderung zu Versuchsbeginn mit der Referenzanalytik
nicht sicher bestimmt werden. Daher werden die berechneten Ausgangswerte verwendet.
Neben den mittleren Gleichgewichtskonzentrationen wurden über die 7 Läufe zusätzlich die
Standardabweichungen als Maß für die Unsicherheit des Umsatzes ermittelt. Diese liegen mit
0,1-0,2 mol L-1 im Bereich des Validierungsfehlers (RMSECV) des chemometrischen Modells
der Referenzanalytik (siehe Tabelle 5). Daraus kann gefolgert werden, dass die Varianz in der
Versuchsdurchführung in der Größenordnung des Bestimmungsfehlers liegt.
5.2 MIR-ATR-Sensor ausgestattet mit optischen Standardfiltern
5.2.1 MIR-ATR-Spektren
Die Eigenschaften des MIR-ATR-Sensors, seine Spezifität, Selektivität und Sensitivität, werden
maßgeblich bestimmt durch die spektrale Lage der eingesetzten optischen Bandpassfilter. Es
ist daher sinnvoll, die Eignung des bereits mit Standardfiltern konfektionierten 4-Kanal
Detektors im Hinblick auf die Messaufgabe zu bewerten. Die Änderung der Absorption
während des Versuchs sind hierzu zusammen mit den Transmissionsbereichen der Standard-
filter F1-F4 in Abbildung 45 dargestellt. Dabei wurden die Banden anhand der Reinstoff-
spektren (Abbildung 10) den jeweiligen Analyten zugeordnet.
Anhand Abbildung 45 ist zu erkennen, dass zu Beginn der Veresterung das MIR-ATR-Spektrum
maßgeblich durch die überlagerten Absorptionen von Ethanol- und Ameisensäure geprägt ist.
Zum Ende der Veresterung und dem Start der Destillation dominieren Ethylformiat, Ameisen-
säure und Wasser. Der Alkohol wurde fast vollständig verestert, die entsprechenden Absorp-
tionsbanden sind nur noch schwach ausgeprägt. Nach der Destillation verbleiben Ameisen-
säure und Wasser. Aufgrund der Volumenreduktion durch den Entzug des Esters steigen deren
Konzentrationen an.
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 73
Abbildung 45: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Veresterung (oben) und der Destillation
(unten), exemplarisch für Lauf 7 dargestellt.
Abbildung 45 zeigt, dass die im Prototyp des MIR-ATR-Sensors verbauten optischen Standard-
filter F1-F4 im Spektralbereichen liegen, wo die Analyten Absorptionsbanden aufweisen. Filter
F1 liegt spektral innerhalb einer breiten O-H Absorptionsbande von organischen Säuren (z .B.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
3800 3400 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Beginn der Veresterung (0 h)
Ende der Veresterung (1,7 h)
F1 F2F3 F4
W
EF
ET
AS
EFAS
ET AS
W
EF AS
AS
AS EF
EF ET
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
3800 3400 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Beginn der Destillation (1,7 h)
Ende der Destillation (2,3 h)
F1 F2F3 F4
W
AS
ET
ASAS
ET, EF
EF
EFET
EF
W
AS
ASEF
AS
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 74
Ameisensäure), welche durch Wasserstoffbrückenbindungen verursacht wird. Diese Bande ist
überlagert von Oberton- und Kombinationsschwingungen (GÜNZLER, 2003). Die Transmissions-
bereiche von Filter F2 und F4 überlappen mit den C-O Streckschwingungen von Carbonsäuren
und Estern wie Ethylformiat. Filter F3 liegt im Wellenzahlbereich von C-H Streckschwingungen,
welche charakteristisch sind für aliphatische Kohlenwasserstoffe. Der mit den optischen
Standardfiltern F1-F4 ausgestattete MIR-ATR-Sensor ist damit gut geeignet, um die Analyten
Ameisensäure und Ethylformiat zu erfassen. Ethanol und insbesondere Wasser können
weniger sicher bestimmt werden, da für diese beiden Analyten keine Filter im Bereich
spezifischer Absorptionsbanden liegen.
5.2.2 Kalibration des MIR-ATR-Sensors
Der MIR-ATR-Sensor ermöglicht die quantitative Online-Analyse von Proben nach einer
Kalibration auf die zu erfassenden Analyten. Bei dieser wird der Zusammenhang zwischen den
Extinktionen in den Sensorkanälen und den Analytkonzentrationen mittels multilinearer
Regression (MLR, siehe 2.2.2) ermittelt. Für die Erprobung des MIR-ATR-Sensors ist es sinnvoll
diesen auf dieselbe Weise zu kalibrieren wie die Referenzanalytik. Daher wurden analog zur
Referenzanalytik eingewogene Kalibrationsproben mit dem Sensor vermessen (siehe 3.1.3).
Zwischen dem Vermessen der verschiedenen Kalibrationsproben wurde die ATR-Messfläche
jeweils mit Ethanol gereinigt und anschließend getestet, ob die Referenzintensität an Luft
wieder erreicht wird. Dies konnte jedoch nicht in genügendem Maß sichergestellt werden. Mit
jedem Reinigungsvorgang änderte sich die Referenzintensität, sodass kein zuverlässiges
Vermessen der eingewogenen Kalibrationsproben möglich war. Die vermutliche Ursache
hierfür waren drei kleine Öffnungen am Boden des Sensors, durch die Dämpfe des Ethanols
aus der Reinigung in den inneren Lichtweg des Sensors dringen konnte und so keine stabile
Referenzmessung möglich war. Im Rahmen der Kalibration für die Prozessverfolgung des
biotechnologischen Musterprozesses (Fermentation von Bäckerhefe, siehe Kap. 6) konnte
nach dem Abdichten des Sensorgehäuses mittlerweile eine geeignete Präparation zur
externen Kalibration mittels eingewogener Proben gefunden werden (STAUBACH, JENS, 2015).
Für den Einsatz während der Veresterung und Destillation wurde der MIR-ATR-Sensor
stattdessen auf Daten aus den Läufen 1-6 kalibriert. Lediglich der siebte Lauf wurde analysiert.
Insgesamt 30 Kalibrationsdatensätze wurden zu je 5 Zeitpunkten den Läufen 1-6 entnommen.
Die vollständigen Kalibrationsdaten sind in Tabelle 21 und Tabelle 22 im Anhang verzeichnet.
Die 5 Zeitpunkte wurden so gewählt, dass die Kalibration gleichmäßig über einen möglichst
großen Konzentrationsbereich erfolgt. In Abbildung 46 sind die entsprechenden Zeitpunkte
beispielhaft für Lauf 5 markiert:
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 75
- 𝑡1 Start: Erste sichere Messung nach Zugabe der Ameisensäure
- 𝑡2 halbe Veresterung: Zum Zeitpunkt des halben Stoffumsatzes
- 𝑡3 Gleichgewicht: Nach Erreichen des Gleichgewichtes und vorm Erhitzen des Reaktors
- 𝑡4 halbe Destillation: Nach Destillation der halben Stoffmenge
- 𝑡5 Versuchsende
Abbildung 46: Referenzanalytik während Lauf 5 der Veresterung und Destillation. Auswahl der
Kalibrationspunkte.
Für jeden der vier Analyten wurde aus den Kalibrationsdaten ein separates vierdimensionales
MLR-Modell mit der Excelfunktion RGP erstellt. Dabei erhält man jeweils die Koeffizienten 𝛼
und 𝛽F1 … 𝛽F4 der Kalibrationsfunktion nach Formel 5-1. Mit diesen können Proben
unbekannter Zusammensetzung anhand der Extinktionen in den vier Kanälen des MIR-ATR-
Sensors 𝐸F1 … 𝐸F4 bestimmt werden:
𝑐 = 𝛼 + 𝛽F1 ⋅ 𝐸F1 + 𝛽F2 ⋅ 𝐸F2 + 𝛽F3 ⋅ 𝐸F3 + 𝛽F4 ⋅ 𝐸F4 5-1
In Tabelle 9 sind neben den o. g. Koeffizienten auch jeweils das Bestimmtheitsmaß 𝑅2 und der
Standardfehler der Kalibration und Validierung angegeben (Formeln 2-9 und 2-10). Zur
Validierung wurden die von der Kalibration unabhängigen Messdaten aus dem 7. Lauf
verwendet (134 Datenpunkte im Abstand von 1 Min.).
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Ko
nze
ntr
atio
n /
mo
l L-1
Versuchsdauer / h
Quant2 W in mol/L
Quant2 ET in mol/L
Quant2 AS in mol/L
Quant2 EF in mol/L
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 76
Tabelle 9: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 mol L-1
𝛽F1 mol L-1
𝛽F2 mol L-1
𝛽F3 mol L-1
𝛽F4 mol L-1
𝑅2 SEC
mol L-1 𝑅2
SEP mol L-1
AS 5,9 210,8 31,0 -29,6 -50,3 0,9370 0,58 0,9942 0,36
ET 17,1 -111,4 -163,7 242,1 22,3 0,9453 0,54 0,9282 0,43
W -20,7 416,7 338,6 -493,7 -111,5 0,8987 1,51 0,9386 0,68
EF 2,0 -120,8 30,4 -48,3 31,4 0,9608 0,36 0,9888 0,38
Für die Analyten Ameisensäure, Ethanol und Ethylformiat ist das Ergebnis der Kalibration gut:
Der Standardkalibrationsfehler liegt deutlich unterhalb 1 mol L-1 und das Bestimmtheitsmaß
ist nahe bei 1. Bei Ameisensäure und Ethylformiat sind zusätzlich die Beträge der Koeffizienten
vergleichsweise klein, was auf die hohe Spezifität der eingesetzten Filter für diese Analyten
zurückzuführen ist (siehe 5.2.1). Die Kalibration des Sensors zur Wasserbestimmung ist
zufriedenstellend, jedoch deutlich unsicherer. Ursachen hierfür sind die unspezifischen Filter
und die weniger gesicherte Referenzanalytik für diesen Analyten (siehe 5.1.2). Für alle
Analyten ist der Standardkalibrationsfehler gleichmäßig um Faktor 3-4 größer als der Kreuz-
validierungsfehler der Referenzanalytik (siehe Tabelle 5). Diese Zunahme ist durch die
verschiedenen Messprinzipien bedingt. Die vier photometrischen Kanäle des MIR-ATR-
Sensors enthalten wesentlich weniger spektrale Informationen als das vom Referenzgerät (FT-
Spektrometer) erfasste komplette MIR-ATR-Spektrum.
5.2.3 Prozessverfolgung
Der Prototyp des MIR-ATR-Sensors wurde bei 7 Veresterungen von Ethanol und Ameisensäure
zu Ethylformiat und Wasser mit anschließender Destillation des Esters erprobt. Die Reaktion
wurde online in einer Probenschleife vom MIR-ATR-Sensor und von einem FT-MIR-ATR-
Spektrometer als Referenzgerät verfolgt. Die Läufe 1-6 dienten der Kalibration des MIR-ATR-
Sensors per MLR (siehe 5.2.2), der siebte Lauf wurde von beiden Geräten analysiert. Zum
Vergleich des MIR-ATR-Sensors mit dem Referenzgerät sind die Konzentrationsverläufe des
siebten Laufs in Abbildung 47 dargestellt.
Für sämtliche Analyten weichen die Konzentrationsverläufe von Sensor und Spektrometer
weniger als 1 mol L-1 voneinander ab, sowohl bei der Veresterung (0-1,7 h) als auch während
der Destillation (1,7-2,3 h). Für Ameisensäure und Ethylformiat sind die Messungen des MIR-
ATR-Sensors gleichwertig zu denen des FT-Spektrometers, da die im MIR-ATR-Sensor
verbauten optischen Standardfilter F1-F4 für diese Analyten spezifisch sind (siehe 5.2.1 und
5.2.2). Ethanol und insbesondere Wasser werden hingegen mit deutlich größeren
Schwankungen im Vergleich zur Referenz bestimmt.
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 77
Abbildung 47: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure (oben) und der Produkte
Ethylformiat und Wasser (unten) während der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h)
in Lauf 7. Referenz (FT-Spektrometer) kalibriert mittels PLS-Regression auf eingewogene Proben
und MIR-ATR-Sensor kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Läufe 1-6.
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Kon
zen
trat
ion
/ m
ol L
-1
Versuchsdauer / h
c(AS) Lauf 7 MIR-ATR-Sensor
c(AS) Lauf 7 Referenz
c(ET) Lauf 7 MIR-ATR-Sensor
c(ET) Lauf 7 Referenz
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Kon
zen
trat
ion
/ m
ol L
-1
Versuchsdauer / h
c(W) Lauf 7 MIR-ATR-Sensor
c(W) Lauf 7 Referenz
c(EF) Lauf 7 MIR-ATR-Sensor
c(EF) Lauf 7 Referenz
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 78
5.3 Sensoroptimierung durch analytspezifische Filter
5.3.1 Filterwahl
Der mit den Standardfiltern F1-F4 ausgestattete Sensorprototyp ist bereits gut geeignet, um
den Abbau eines Edukts (Ameisensäure) und den Aufbau eines Produkts (Ethylformiat) des
chemischen Musterprozesses, der Veresterung mit anschließender Destillation, quantitativ zu
verfolgen. Die Leistungsfähigkeit des MIR-ATR-Sensors lässt sich weiter erhöhen durch den
Einsatz auf die Messaufgabe optimierter optischer Bandpässe. Geeignete spektrale Bereiche
können anhand der FT-MIR-ATR-Onlinespektren gefunden werden. Hierfür sind diese aus
Lauf 7 in Abbildung 48 im 3D-Plot dargestellt. Die ebenfalls eingezeichneten Transmissions-
bereiche der Standardfilter F1-F4 liegen im oberen Wellenzahlbereich des MIR-Spektrums
(3600-1100 cm-1, links dargestellt). Dieser ist geprägt durch vergleichsweise unspezifische und
überlagerte Banden. Die Filter F2 und F4 erfassen zwar einen Bereich intensiver Absorption,
dieser setzt sich jedoch aus Absorptionsbanden von Ameisensäure und Ethylformiat
zusammen (siehe Abbildung 10). Deutlich spezifischer sind die etwas weniger intensiven,
dafür gut getrennten Absorptionsbanden im unteren Wellenzahlbereich (1100-600 cm-1,
rechts dargestellt). Der qualitative Versuchsverlauf, der Abbau der Eduktabsorption und
Aufbau der Produktabsorption während der Veresterung (0-1,7 h) sind gut zu erkennen. Auch
der Abzug des Esters und das Aufkonzentrieren von Wasser und Ameisensäure im Reaktor
während der Destillation (1,7-2,3 h) lassen sich anhand zugehöriger Banden (siehe Tabelle 10
oder Abbildung 45) leicht nachvollziehen.
Abbildung 48: 3D-Plot der MIR-ATR-Spektren von 3600-1100 cm-1 (links) und 1100-600 cm-1 (rechts) während
Lauf 7 der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h).
F1 F2 F4
F3
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 79
Tabelle 10: Spezifische Analytbanden im „Fingerprint“-Bereich und Technische Daten der analytspezifischen Filter S1-S4 im simulierten MIR-ATR-Sensor für die Veresterung und anschließende Destillation.
Filter Transmission
cm-1
Analytbande cm-1 Analyt
CWL µm
FWHM µm
FWHM/CWL %
S1 1053-1033 1043 Ethanol 9,59 0,184 1,9
1004 Ethylformiat
880 Ethanol
S2 850-830 840 Ethylformiat 11,91 0,283 2,4
S3 681-661 671 Ameisensäure 14,91 0,444 3,0
S4 640-620 630 Wasser
(H-Brücken) 15,88 0,505
3,2
Zu ausgewählten Analytbanden sind in Tabelle 10 passende Transmissionsbereiche für analyt-
spezifische optische Bandpässe (S1-S4) angegeben. Ein mit diesen Filtern ausgestatteter MIR-
ATR-Sensor wurde anhand der MIR-ATR-Spektren des Referenzgerätes (FT-Spektrometer)
simuliert (Simulationsmethode siehe 3.3). Die Transmissionsbereiche sind zusammen mit den
Absorptionsspektren der konzentrierten Analyten in Abbildung 49 dargestellt. Die darge-
stellten spezifischen Banden wurden ebenfalls während der Reaktionsverfolgung beobachtet
(siehe Abbildung 45). Für die Optimierung des MIR-ATR-Sensor auf die Prozessverfolgung der
Veresterung und Destillation sind sie daher gut geeignet. Eine Ausnahme ist die breite Bande
der Ameisensäure von 950 cm-1 bis 730 cm-1. Diese wird durch Dimere verursacht, welche sich
nur bei hoher Säurekonzentration bilden. Aufgrund der Verdünnung tritt diese Bande im
Prozess nicht auf. Bei der Wahl der analytspezifischen Filter S1-S4 wurde diese Bande daher
ignoriert.
Abbildung 49: Ausschnitt der MIR-ATR-Spektren von 1100-600 cm-1 der reinen Analyten Wasser, Ameisensäure,
Ethanol und Ethylformiat und Transmissionsbereiche der simulierten analytspezifischen Filter S1-
S4 zur Optimierung des Sensors.
-0,05
0,10
0,25
0,40
0,55
60070080090010001100
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Wasser, vollentsalzt
Ameisensäure 99 % m/m
Ethanol 94 % m/m
Ethylformiat 99 % m/m
S1 S2 S3 S4
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 80
Die in Abbildung 49 dargestellte Wahl der Filter S1-S4 ist eine von mehreren möglichen
Kombinationen. So könnte S1 zur Detektion von Ethanol auch bei 880 cm-1 liegen oder S2 für
Ethylformiat bei 1007 cm-1. Vor dem Bau neuer Prototypen sollten weitere analytspezifische
Filterkombinationen evaluiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit genügt die exemplarische
Simulation einer einzelnen Variante.
Wie unter 2.2.1 ausgeführt, ist eine Breite von 20 cm-1 für die optischen Filter als Auslegungs-
größe unterhalb von 1500 cm-1 sinnvoll. Zusätzlich zum Transmissionsbereich in Wellenzahlen
sind die Zentralwellenlänge (CWL) und die volle Halbwertsbreite (FWHM) in Mikrometer
sowie deren Verhältnis zueinander angegeben. Anhand dieser Größen lässt sich feststellen ob
ein entsprechendes Filter produziert werden könnte. Schmale Bandpässe mit FWHM/CWL >
0,9 % und 0,2 µm < CWL < 20 µm sind kommerziell verfügbar (NORTHUMBRIA OPTICAL COATINGS
LTD; SPECTROGON, 2015). Der simulierte MIR-ATR-Sensor mit den analytspezifischen Filtern S1-
S4 könnte demnach gebaut werden.
5.3.2 Kalibration des simulierten MIR-ATR-Sensors
Kalibriert wurde der simulierte MIR-ATR-Sensor wie der reale Sensor mit Standardfiltern
(siehe 5.2.2) per vierdimensionaler multilinearer Regression auf einen Kalibrationsdatensatz
aus den Läufen 1-6. Die entsprechenden Messwerte der Referenzanalytik und die Signale des
simulierten Sensors enthalten Tabelle 21 und Tabelle 24 im Anhang. Das Ergebnis der
Ausgleichsrechnung, die Koeffizienten und Standardfehler zeigt Tabelle 11. Eine sinnvolle
Wahl der analytspezifischen Filter S1-S4, die den MIR-ATR-Sensor für die Analyse der
Veresterung und Destillation optimiert, sollte sich bereits an der Kalibration erkennen lassen.
Der Vergleich mit der Kalibration des realen, mit den Standardfiltern F1-F4 ausgestatteten
MIR-ATR-Sensors ist jedoch nicht zweckmäßig, da hier zusätzlich Unterschiede in der Optik
und Elektronik bestehen. Zielführender ist ein Vergleich des simulierten optimierten Sensors
mit einer Simulation des mit Standardfiltern ausgestatteten MIR-ATR-Sensors, sodass
Unterschiede in der Kalibration eindeutig auf die veränderten optischen Bandpässe
zurückzuführen sind. Die Signale dieser Simulation enthält Tabelle 23 im Anhang, das Ergebnis
der MLR-Kalibration Tabelle 12.
Tabelle 11: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den hochspezifischen Filtern S1, S2, S3 und S4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 𝛽S1 𝛽S2 𝛽S3 𝛽S4 𝑅2 SEC
mol L-1 𝑅2
SEP mol L-1
AS -10,3 17,8 94,5 24,9 3,8 0,9987 0,08 0,9995 0,13
ET 6,7 22,5 -80,8 33,1 -21,9 0,9998 0,04 0,9992 0,11
W -16,9 15,0 167,0 -122,0 162,8 0,9980 0,21 0,9970 0,26
EF 16,6 -28,2 -24,1 -9,9 -21,7 0,9992 0,05 0,9998 0,04
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 81
Tabelle 12: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 𝛽F1 𝛽F2 𝛽F3 𝛽F4 𝑅2 SEC
mol L-1 𝑅2
SEP mol L-1
AS 4,3 93,6 18,3 60,0 -27,2 0,9974 0,12 0,9991 0,07
ET 18,1 -217,4 -68,4 228,2 -27,3 0,9828 0,30 0,9937 0,30
W -21,8 630,1 100,6 -463,2 42,6 0,9822 0,63 0,9963 0,57
EF 1,9 -34,5 19,5 -86,9 23,6 0,9984 0,07 0,9997 0,06
Die angestrebte Steigerung der Spezifität der Sensorsignale wird durch die veränderten
Transmissionsbereiche der optischen Bandpässe erreicht. Für alle Analyten steigt das
Bestimmtheitsmaß und sinkt der Standardfehler der Kalibration. Ebenso müssen die Signale
der S1-S4-Kanäle in geringerem Maß kompensiert werden als Signale der F1-F4-Kanäle. Zu
erkennen ist dies an betragsmäßig kleineren 𝛽-Koeffizienten. Am deutlichsten zeigt sich dies
bei den mit Standardfiltern nur unspezifisch erfassten Analyten Wasser und Ethanol. Der
betragsmäßig größte Koeffizient wird um den Faktor 4 beziehungsweise 3 reduziert. Für diese
Analyten ist eine deutliche Qualitätssteigerung der Prozessverfolgung zu erwarten.
5.3.3 Prozessverfolgung
Die Prozessverfolgung von Lauf 7 mit den zwei simulierten MIR-ATR-Sensoren, dargestellt
zusammen mit der Referenzanalytik in Abbildung 50, zeigt, dass die Analyse des mit
Standardfiltern F1-F4 ausgestatteten simulierten Sensors bezüglich Ameisensäure und
Ethylformiat bereits so gut ist, dass durch die spezifischeren Filter S1-S4 keine weitere
Verbesserung zu erzielen ist. Bei Ethanol und Wasser hingegen zeigt sich durch den Tausch
von F1-F4 gegen S1-S4 eine deutliche Annäherung an die Referenzanalytik. Besonders
stichhaltig ist die Verbesserung hinsichtlich der Ethanolbestimmung während der Destillation
(1,7-2,3 h). Hier zeigt die Abweichung des simulierten Sensors mit den Filtern F1-F4 dieselbe
Abweichung wie der reale Sensorprototyp (siehe Abbildung 47). Diese Abweichungen sind
daher weder zufällig noch stammen sie aus einem Artefakt der Kalibration. Sie sind das
Ergebnis einer real aufgetretenen Störgröße, welche die Probenabsorption und damit
gleichermaßen die Simulation und den Prototyp des MIR-ATR-Sensors beeinflusst haben.
Diese Störung wurde bisher nicht identifiziert. Sie zeigt, dass die Simulation den realen Sensor
gut nachbildet und sieh daher geeignet ist um Filterkombinationen vor dem Bau eines
Prototyps zu erproben. Umgekehrt ist das Ausbleiben der Störung in der Ethanolbestimmung
während der Destillation ein Beleg für die gestiegene Störfestigkeit des optimierten Sensors
gegenüber systematischen Störgrößen.
5 Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation 82
Abbildung 50: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure (oben) und der Produkte
Ethylformiat und Wasser (unten) während der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h)
in Lauf 7. Referenz (FT-Spektrometer) kalibriert mittels PLS-Regression auf eingewogene Proben
und zwei simulierte MIR-ATR-Sensoren (mit Standardfiltern F1-F4 sowie mit analytspezifischen
Filtern S1-S4) kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Läufe 1-6.
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Ko
nze
ntr
atio
n /
mo
l L-1
Versuchsdauer / h
c(AS) Lauf 7 Referenz c(ET) Lauf 7 Referenz
c(AS) Lauf 7 Simulation F1-F4 c(ET) Lauf 7 Simulation F1-F4
c(AS) Lauf 7 Simulation S1-S4 c(ET) Lauf 7 Simulation S1-S4
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Ko
nze
ntr
atio
n /
mo
l L-1
Versuchsdauer / h
c(W) Lauf 7 Referenz c(EF) Lauf 7 Referenz
c(W) Lauf 7 Simulation F1-F4 c(EF) Lauf 7 Simulation F1-F4
c(W) Lauf 7 Simulation S1-S4 c(EF) Lauf 7 Simulation S1-S4
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 83
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation
6.1 Versuchsdurchführung
Zur Erprobung des MIR-ATR-Sensors in einem biotechnologischen Prozess wurden 4
Fermentationen von Bäckerhefe durchgeführt, wie sie unter 3.2 beschrieben sind. Die in 5 L
vollsynthetischem Medium (modifiziertes Schatzmann-Medium, siehe Anhang D) vorgelegten
100 g L-1 Glucose wurden innerhalb von 5,5 h zu Biomasse, Ethanol und CO2 umgesetzt. Der
Versuch war gut reproduzierbar, wie die Messergebnisse der Referenzanalytik für Ethanol und
Glucose zeigen (siehe Abbildung 51). Ab Zugabe des Inokulums (𝑡 = 0 h) wurden im Abstand
von 30 Minuten Proben der Fermentationsbrühe gezogen und zur späteren HPLC-Analyse
eingefroren. Man erkennt, dass aus 100 g L-1 vorgelegter Glucose ca. 30 g L-1 Ethanol gebildet
werden.
Abbildung 51: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der vier Fermentationen. Ermittelt
anhand von Proben der Fermentationsbrühe per offline-HPLC (Referenzanalytik).
6.2 MIR-ATR-Sensor ausgestattet mit optischen Standardfiltern
6.2.1 MIR-ATR-Spektren
Der zu erwartende Messeffekt des mit optischen Standardfiltern ausgestatteten Sensor-
prototyps kann mit Hilfe von MIR-ATR-Spektren abgeschätzt werden. Hierzu sind in Abbildung
52 die online gemessenen Spektren zu Beginn und zum Ende der vierten Hefefermentation
dargestellt. Die wesentlichen Absorptionsbanden sind mit den zugehörigen Analyten
beschriftet. Zudem sind die Transmissionsbereiche der optischen Standardfilter F1-F4
0
10
20
30
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Eth
ano
lko
nze
ntr
atio
n /
g L
-1
Glu
cose
kon
zen
trat
ion
/ g
L-1
Fermentationsdauer / h
Ferm 1 Glucose
Ferm 2 Glucose
Ferm 3 Glucose
Ferm 4 Glucose
Ferm 1 Ethanol
Ferm 2 Ethanol
Ferm 3 Ethanol
Ferm 4 Ethanol
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 84
eingezeichnet. Das Absorptionsspektrum wird von Wasserbanden während der gesamten
Versuchsdauer dominiert, da die Fermentationsbrühe stets zu ca. 90 % m/m aus Wasser
besteht. Die für eine Prozessverfolgung relevanten Analyten Glucose und Ethanol liegen in
wesentlich kleineren Konzentrationen vor, weshalb deren Banden deutlich schwächer
ausgeprägt sind.
Abbildung 52: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Hefefermentation (exemplarisch für
Fermentation 4 dargestellt).
Nach Subtraktion des Wasserspektrums von den Fermentationsspektren kommen die
spektralen Veränderungen deutlicher heraus (siehe Abbildung 53). Man erkennt, dass sich die
Spektren zu Beginn und zum Ende der Fermentation in den Transmissionsbereichen der
optischen Standardfilter F1-F4 lediglich um wenige Milliextinktionen unterscheiden. Neben
der geringen Analytkonzentration ist dies bedingt durch eine relativ ungünstige spektrale Lage
der optischen Filter zur Detektion der Analyten: F3 liegt in der abfallenden Flanke der nur
schwach ausgeprägten CH-Streckschwingung von Ethanol und trifft diese daher nicht ideal.
Zudem ist der für die Ethanolbestimmung als Referenz vorgesehene Kanal F1 spektral relativ
weit entfernt, um einen sich ggfs. stark verändernden Untergrund zu kompensieren. F4
hingegen erfasst Glucose selektiv. Auch der zugehörige Referenzkanal F2 erscheint zur
Untergrund- und Driftkompensation gut geeignet. Zwar wäre im Bereich stärkerer Glucose-
absorption bei kleineren Wellenzahlen die Sensitivität höher, allerdings würde eine Quer-
empfindlichkeit zu Ethanol bestehen.
0,0
0,1
0,2
0,3
3800 3400 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 800
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Beginn der Fermentation (0 h)
Ende der Fermentation (6,5 h)
F1 F2F3 F4
Wasser Wasser
Wasser
Ammonium
Glucose
Ethanol
Ethanol
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 85
Abbildung 53: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Hefefermentation nach Abzug des Wasser-
Spektrums (exemplarisch für Fermentation 4 dargestellt).
Somit sollte der Sensorprototyp spezifisch den Analyten Glucose erfassen, jedoch mit einem
Messeffekt von nur wenigen Milliextinktionen über die gesamte Versuchsdauer hinweg. Eine
stabile quantitative Analyse erfordert daher sehr rausch- und driftarme Sensorsignale.
6.2.2 Kalibration des MIR-ATR-Sensors
Der MIR-ATR-Sensor kann anhand einer Verdünnungsreihe von Glucose im Fermentations-
medium (ohne Hefe) kalibriert werden (STAUBACH, JENS, 2015). Der Messeffekt beträgt, wie
unter 6.2.1 abgeschätzt, wenige Milliextinktionen für den zur Prozessverfolgung relevanten
Konzentrationsbereich von 0-100 g L-1 Glucose. Ethanol kann hingegen nicht detektiert
werden. Beim Vermessen einer Verdünnungsreihe ändern sich die Sensorsignale in den
Messkanälen mit Standardfiltern F1-F4 nicht signifikant. Eine externe Kalibration des
Sensorprototyps auf den Analyten Ethanol ist daher nicht möglich.
Ein anderer Weg, um Ethanol dennoch bei der Fermentation erfassen zu können, ist die MLR-
Kalibration des MIR-ATR-Sensors anhand von Proben aus den Fermentationen 1-3 (42
Datenpunkte) mit den Konzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik. Zur externen
Validierung wurden die von der Kalibration unabhängigen Messdaten aus der vierten
Fermentation verwendet (14 Datenpunkte). Wie unten gezeigt wird, wird damit Glucose direkt
und Ethanol indirekt über den Abbau der Glucose erfasst. Die zur Kalibration und Validierung
verwendeten Daten der Referenzanalytik und Sensorsignale sind in Tabelle 26 im Anhang
aufgeführt. Als Bezug der dort aufgeführten Extinktion in den Sensorkanälen wurde Wasser
gewählt. Bei Luft als Referenz bestünde ein großer Offset in den Sensorsignalen durch den
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
3800 3400 3000 2600 1800 1600 1400 1200 1000 800
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Beginn der Fermentation (0 h)
Ende der Fermentation (6,5 h)
F1 F2F3 F4
Ethanol
Glucose
Ethanol
Ammonium
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 86
überwiegenden Wasseranteil in der Fermentationsbrühe. Dies würde bei der MLR zu wenig
analytspezifischen Kalibrationskoeffizienten führen. Daher wurde von der üblichen
Bezugsmessung gegen Luft abgewichen.
Für Glucose und Ethanol wurde jeweils ein eigenes vierdimensionales MLR-Modell erstellt.
Dabei wurden für jeden dieser Analyten die Koeffizienten 𝛼 und 𝛽F1 … 𝛽F4 der Kalibrations-
funktion nach Formel 5-1 in Excel ermittelt, analog zur Kalibration für die Verfolgung der
Veresterung und Destillation in Kapitel 5. In Tabelle 13 sind neben den o. g. Koeffizienten auch
jeweils das Bestimmtheitsmaß 𝑅2 und der Standardfehler der Kalibration (SEC) und der
externen Validierung (SEP) angegeben (Formel 2-9 und 2-10).
Tabelle 13: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Fermentation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 g L-1
𝛽F1 g L-1
𝛽F2 g L-1
𝛽F3 g L-1
𝛽F4 g L-1
𝑅2 SEC g L-1
𝑅2 SEP g L-1
Glucose -1450,0 9080,4 21733,2 5833,6 -3242,7 0,9881 4,01 0,9941 6,15
Ethanol 469,4 -1903,5 -6534,0 -2258,1 1046,6 0,9794 1,62 0,9946 1,36
Sowohl für Ethanol als auch für Glucose ist das Ergebnis der Kalibration gut: Das
Bestimmtheitsmaß ist nahe bei 1 und der Standardkalibrationsfehler liegt bei jeweils 4-5 %
des Messbereichs, der für die Prozessverfolgung relevant ist (0-100 g L-1 für Glucose und
0-30 g L-1 für Ethanol). Die Verhältnisse zwischen den Kalibrationskoeffizienten bezüglich
Glucose und den jeweils entsprechenden Koeffizienten bezüglich Ethanol, also 𝛼(Glucose)
𝛼(Ethanol),
𝛽F1(Glucose)
𝛽F1(Ethanol)… betragen -2,6 bis -4,8. Daraus folgt, dass die Koeffizienten für die Ethanolbe-
stimmung gegenüber denen der Glucosekalibration invertiert sind und die Verhältnisse stets
in der gleichen Größenordnung liegen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Ethanolbe-
stimmung nicht auf einem spezifischen Nachweis diese Analyten basiert, sondern mit dem
Abbau der Glucose korreliert wurde. Insbesondere für die drei Koeffizienten 𝛼, 𝛽F1 und 𝛽F2
liegen die Verhältnisse zwischen -3,1 und -3,3, was in sehr guter Übereinstimmung mit dem
bekannten Zusammenhang von ca. 1 g L-1 gebildetem Ethanol pro 3 g L-1 eingesetzter Glucose
(siehe Abbildung 51) ist.
6.2.3 Prozessverfolgung
Der Fermentationsprozess wurde mit dem MIR-ATR-Sensor in einer Probenschleife online
verfolgt. Als Referenz wurden im Abstand von 30 Minuten Proben der Fermentationsbrühe
gezogen und offline per HPLC analysiert. Die Läufe 1-3 dienten der Kalibration des MIR-ATR-
Sensors per MLR, der vierte Lauf wurde anschließend mit dem kalibrierten Sensor analysiert.
Zum Vergleich des MIR-ATR-Sensors mit der HPLC-Referenz sind die Konzentrationsverläufe
des vierten Laufs in Abbildung 54 dargestellt.
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 87
Es ist zu erkennen, dass die Fermentation mit dem MIR-ATR-Sensor gut online verfolgt werden
kann. Sowohl für Glucose als auch für Ethanol stimmen die Messungen mit der Referenz
weitgehend überein. Die größte Abweichung von ca. 10 % des relevanten Messbereichs
(ca. 10 g L-1 für Glucose bzw. ca. 3 g L-1 für Ethanol) besteht jeweils zu Beginn des Versuchs.
Spätestens nach der halben Versuchsdauer ist der MIR-ATR-Sensor jedoch nahezu
deckungsgleich mit der Referenz.
Abbildung 54: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der 4. Hefefermentation. Messung
per HPLC (Referenz) und MIR-ATR-Sensor. Der MIR-ATR-Sensor wurde mittels MLR-Modell
anhand der Fermentationen 1-3 kalibriert.
6.3 Sensoroptimierung durch analytspezifische Filter
6.3.1 Filterwahl
Die im Prototyp des MIR-ATR-Sensors verwendeten Standardfilter F1-F4 aus der MIR-
Gasanalytik besitzen eine ausreichende Spezifität für den Nachweis von Glucose, aber nicht
für Ethanol (siehe 6.2.1). Eine höhere Spezifität ist zu erwarten, wenn man optische Bandpass-
filter einsetzt, welche eine hohe Transmission dort aufweisen, wo die betreffenden Analyten
stark absorbieren und gleichzeitig keine Querempfindlichkeit zu anderen Analyten besteht.
Der MIR-ATR-Sensor kann folglich durch den Einsatz analytspezifischer optischer Filter
verbessert werden. Eine Möglichkeit hierfür ist die Standardfilter F2 und F4 beizubehalten, da
diese bereits Glucose spezifisch erfassen und die vergleichsweise unspezifischen Filter F1 und
F3 zu ersetzen. Wie der in Abbildung 55 dargestellte Ausschnitt (1600-900 cm-1) der MIR-ATR-
Spektren von 100 g L-1 Glucose bzw. 30 g L-1 Ethanol in Wasser zeigt, liegen in der Nähe der
Transmissionsbereiche von F2 und F4, zwischen 1170 cm-1 und 970 cm-1, zwei noch nicht
0
10
20
30
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Eth
ano
lko
nze
ntr
atio
n /
g L
-1
Glu
cose
kon
zen
trat
ion
/ g
L-1
Fermentationsdauer / h
Glucose HPLC (Referenz)
Glucose MIR-ATR-Sensor
Ethanol HPLC (Referenz)
Ethanol MIR-ATR-Sensor
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 88
erfasste intensive Ethanolbanden – auch wenn diese von der Glucoseabsorption überlagert
sind. Eine mögliche Querempfindlichkeit wird daher in Kauf genommen und kann bei der
Kalibration berücksichtigt werden. Auch ein Einfluss der Matrix auf die Messung ist möglich,
denn das in Abbildung 55 zusätzlich dargestellte Spektrum des Fermentationsmediums ohne
Glucose, Hefe und Ethanol zeigt in diesem Bereich ebenfalls schwache Absorptionen von
Matrixkomponenten. Um die Spezifität des Sensors für den Nachweis von Ethanol zu
verbessern, wurden zusätzlich zu F2 und F4 zwei optische Filter mit den Transmissions-
bereichen 1075-1055 cm-1 (S5: Referenzkanal) und 1055-1035 cm-1 (S6: Ethanolkanal)
simuliert (Simulationsmethode siehe 3.3). Bei der im Folgenden durchgeführten Simulations-
rechnung wird ein MIR-ATR-Sensor mit den Filtern F2, F4, S5, S6 „bestückt“ und die während
der Fermentationen aufgenommenen MIR-ATR-Spektren mit den entsprechenden MLR-
Modellen analysiert.
Abbildung 55: Ausschnitt der MIR-ATR-Spektren von 1600-900 cm-1 von Glucose und Ethanol in wässriger
Verdünnung sowie der Matrix der Fermentationsbrühe. Ebenso die Transmissionsbereiche der
simulierten Filter des optimierten Sensors F2, F4, S5, S6.
6.3.2 Kalibration des simulierten MIR-ATR-Sensors
Der simulierte MIR-ATR-Sensors mit den Filtern F2, F4, S5 und S6 wurde mit derselben
Vorgehensweise kalibriert wie der Prototyp mit den Standardfiltern F1-F4 (siehe 6.2.2). Auf
die HPLC-Referenzanalyse von jeweils 14 Proben aus den Fermentationen 1-3 wurde eine vier-
dimensionalen Regression der Extinktionen in den Sensorkanälen durchgeführt. Als Bezug
diente wiederum Wasser. Die entsprechenden Konzentrationswerte und Extinktionen sind in
Tabelle 26 und Tabelle 27 im Anhang aufgelistet. Die bei der MLR errechneten Größen sowie
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
9001000110012001300140015001600
Exti
nkt
ion
Wellenzahl / cm-1
Matrix (Fermentationsmedium ohne Glucose, Hefe und Ethanol)
Glucose 100 g/L in VE-Wasser
Ethanol 30 g/L in VE-Wasser
F2 F4 S5
S6
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 89
das Ergebnis der Validierung anhand Fermentation 4 sind in Tabelle 14 enthalten. Der Proto-
typ des MIR-ATR-Sensors mit den Standardfiltern F1-F4 wurde ebenfalls simuliert (Tabelle 15),
damit bei der Variation der optischen Filter auf dasselbe Geräte und die identischen Spektren
zugegriffen wird und so die Vergleichbarkeit gewährleistet ist.
Tabelle 14: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den analytspezifischen Filtern F2, F4, S5 und S6 für die Prozessverfolgung der Fermentation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 g L-1
𝛽F2 g L-1
𝛽F4 g L-1
𝛽S5 g L-1
𝛽S6 g L-1
𝑅2 SEC g L-1
𝑅2 SEP g L-1
Glucose 84,3 -21550,1 22968,8 -5379,0 3016,2 0,9953 2,52 0,9969 4,06
Ethanol 12,1 4419,2 -5164,9 2896,8 -2350,2 0,9942 0,86 0,9984 0,43
Tabelle 15: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Fermentation.
Analyt Kalibration Validierung
𝛼 g L-1
𝛽F1 g L-1
𝛽F2 g L-1
𝛽F3 g L-1
𝛽F4 g L-1
𝑅2 SEC g L-1
𝑅2 SEP g L-1
Glucose 99,4 2085,1 -16397,0 -6620,3 20251,9 0,9924 3,20 0,9983 4,34
Ethanol 76,4 1692,6 3540,4 566,8 -5148,6 0,9880 1,24 0,9967 0,61
Sowohl für den simulierten MIR-ATR-Sensor mit analytspezifischen Filtern (Tabelle 14) als
auch für den mit Standardfilter ausgestatteten Sensor (Tabelle 15) ist die Kalibration mit
hohem Bestimmtheitsmaß möglich. Die Standardkalibrationsfehler liegen unter denen des
gebauten Prototyps aufgrund des größeren Störabstandes des Spektrometers. Man erkennt,
dass der simulierte optimierte MIR-ATR-Sensor eine leichte Verbesserung gegenüber der
Simulation des aktuellen Sensors darstellt.
Die Simulation des MIR-ATR-Sensors mit den Filtern F1-F4 spiegelt den realen Prototyp
allerdings nur schlecht wieder. Beim Sensorprototyp war die indirekte Messung von Ethanol
anhand des Abbaus von Glucose anhand der Kalibrationskoeffizienten zu erkennen: Zwischen
den sich entsprechenden Koeffizienten für Glucose und denen für Ethanol bestand das
Verhältnis von ungefähr -3 (siehe 6.2.2). In der Simulation ist weder ein konstantes Verhältnis
noch ein einheitlicher Vorzeichenwechsel erkennbar. Die Ethanolmessung ist demnach nicht
invers auf denselben Messeffekt kalibriert wie die Glucosemessung. Daher ist eine mögliche
Verbesserung gegenüber dem aktuellen Prototyp anhand der Simulationsrechnung nicht
eindeutig abschätzbar.
6.3.3 Prozessverfolgung
Die von den zwei simulierten MIR-ATR-Sensoren ermittelten Konzentrationsverläufe während
der vierten Fermentation sind in Abbildung 56 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass beide
Messungen mit der Referenz gut übereinstimmen. Im Vergleich zum realen Prototyp sind die
Messwerte der simulierten MIR-ATR-Sensoren deutlich stabiler und weichen nur geringfügig
6 Prozessverfolgung einer Hefefermentation 90
von der HPLC-Analyse ab (vgl. Abbildung 54). Zu Beginn (0-1,5 h) und gegen Ende des Versuchs
(5,5-6,5 h) liegt der optimierte simulierte MIR-ATR-Sensor etwas näher bei der Referenz als
die Simulation mit den Standardfiltern. Dies zeigt, dass durch die veränderten optischen Filter
der MIR-ATR-Sensor verbessert werden kann. Der Unterschied zwischen beiden Simulationen
ist jedoch nur gering.
Abbildung 56: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der 4. Hefefermentation. Referenz
(HPLC) jeweils kalibriert per einfacher Regression auf eine eingewogene Verdünnungsreihe und
zwei simulierte MIR-ATR-Sensoren (mit Standardfiltern F1-F4 sowie mit analytspezifischen
Filtern F2 F4 S5 S6) kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Fermentationen 1-3.
0
10
20
30
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Eth
ano
lko
nze
ntr
atio
n /
g L
-1
Glu
cose
kon
zen
trat
ion
/ g
L-1
Fermentationsdauer / h
Glucose HPLC (Referenz)
Glucose F1 F2 F3 F4
Glucose F2 F4 S5 S6
Ethanol HPLC (Referenz)
Ethanol F1 F2 F3 F4
Ethanol F2 F4 S5 S6
7 Diskussion 91
7 Diskussion
7.1 Entwicklung des MIR-ATR-Sensors
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein photometrischer MIR-ATR-Sensor entwickelt und ein ent-
sprechender Prototyp gebaut und getestet. Dazu wurden zum bereits bestehenden Entwurf
der Optik und Mechanik (EGLY, 2012) passende Komponenten ausgewählt (Detektor, Licht-
quelle, optische Bandpässe) und die Elektronik zur Verstärkung der Detektorsignale und zur
Ansteuerung der Lichtquelle ausgelegt. Hierbei wurde der Signalverstärker als Transimpedanz-
verstärker aufgebaut, um eine hohe Störfestigkeit zu gewährleisten. Der Vergleich mit einer
Testschaltung in der üblichen Bauweise als Spannungsverstärker bestätigte neben der
höheren Signalintegrität ebenso die bessere Miniaturisierbarkeit.
Die optischen Bandpassfilter des Prototyps waren ursprünglich für die Bestimmung von
Ethanol und Zucker in Getränken ausgewählt worden. Es zeigte sich, dass mit den eingebauten
Filtern der Analyt Glucose erwartungsgemäß direkt ermittelt werden kann. Durch die
Verwendung von Standardfiltern basiert jedoch die Bestimmung von Ethanol nicht auf einem
für diesen Analyten spezifischen Spektralbereich, sondern auf einer Korrelation mit dem
Abbau von Glucose. Für einen Einsatz in der Getränkeindustrie ist es daher nötig, die optischen
Bandpässe hinsichtlich Selektivität und Sensitivität zu optimieren.
Verbesserungspotenzial besteht ebenfalls in der Anpassung des statistischen Verfahrens zur
Kalibration des Sensors. Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der Hardwareentwicklung und
einer ersten Erprobung. Daher wurde mit der RGP-Funktion in Microsoft Excel (multilineare
Regression) eine weit verbreitete Standardsoftware anstatt eines speziellen Berechnungs-
skriptes für die Kalibration eingesetzt. Andere Softwarepakete wie LabVIEW, Origin, Matlab,
R oder SPSS bieten zur Ausgleichsrechnung eine umfangreichere Funktionalität an. Durch
Einschränkung der Parameter (z.B. Regressionskoeffizienten) auf einen plausiblen Werte-
bereich, ein anderes Anpassungsverfahren (biquadrat oder bikubisch statt kleinste Quadrate)
oder den Einsatz eines größeren Kalibrationsdatensatzes sollte sich die Stabilität der
Kalibration gegenüber veränderten Umgebungsbedingungen oder Variationen des verfolgten
Prozesses deutlich verbessern lassen.
Der gebaute Prototyp erwies sich jedoch bereits als gut geeignet, um eine chemische Reaktion
(Veresterung mit anschließender Destillation (GEÖRG u. a., 2015)) und einen biotechno-
logischen Prozess (Hefefermentation (SCHALK u. a., 2017)) zu verfolgen. Der Auf- und Abbau
der relevanten Analyten konnte in beiden Fällen quantitativ erfasst werden. Die Versuche mit
dem Prototyp bestätigten das erwartete Ansprechverhalten in den einzelnen Messkanälen.
Damit wurde erstmals die quantitative Prozessverfolgung mit einem MIR-ATR-Sensor unter
Angabe von Qualitätsparametern (Kalibrationsfehler SEC, Vorhersagefehler SEP, Bestimmt-
heitsmaß R2) in Peer-reviewed Journals beschrieben. Andere Arbeitsgruppen bzw.
7 Diskussion 92
Forschungseinrichtungen und Firmen, welche einen ähnlichen Sensor entwickelt haben,
publizierten bisher entweder nur unkalibrierte Signale (THEUER u. a., 2015) oder erfassten
aufgrund des verwendeten Saphir-Prismas lediglich einen für die zu bestimmenden Analyten
unspezifischen Spektralbereich (siehe 2.2.3). Vor diesem Hintergrund erscheint die
angegebene Genauigkeit des Messsystems von Vital Sensors bzgl. Ethanol von 160 ppm
(VITALSENSORS, 2012) ambitioniert. Mit einem spektrometrischen Messaufbau würde sich diese
zwar durchaus erzielen lassen (KESSLER, 2013), für den photometrisch arbeitenden Sensor mit
wenigen vergleichsweise breiten optischen Kanälen, welche zudem in einem unspezifischen
Spektralbereich liegen, scheint eine solch hohe Genauigkeit jedoch schwer erreichbar.
Im hier beschriebenen MIR-ATR-Sensor wird hingegen Zinkselenid (optional mit Diamant-
plättchen als Kontaktfläche zum Prozess) als ATR-Material eingesetzt. Daher können erstmals
mit einem photometrischen MIR-Sensor Analyten auch im hochspezifischen Fingerprint-
bereich (1500-600 cm-1) erfasst und quantitativ bestimmt werden (siehe 4.1.1). Für den
entwickelten Sensor besteht daher ein großes Einsatzpotenzial in der chemischen Industrie
und Biotechnologie.
Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich das Ansprechverhalten des Sensors simulieren
lässt, wenn man aus MIR-ATR-Spektren, welche mit einem kommerziellen FT-IR-Spektrometer
gemessen werden, selektiv Spektralbereiche für die Analyse auswählt. Dieses Vorgehen
ermöglicht es, optimale Spektralbereiche für die optischen Bandpassfilter bei einer gegebenen
Messaufgabe zu identifizieren und das Verbesserungspotenzial durch einen Filtertausch
abzuschätzen. Sowohl bei der Veresterung mit anschließender Destillation als auch bei der
Hefefermentation wurde simuliert, inwieweit der MIR-ATR-Sensor durch einen Filtertausch
verbessert werden kann. In beiden Fällen wurde eine deutliche Reduktion der Standardfehler
erreicht.
7.2 Prozessverfolgung einer Veresterung und Destillation
Die Tauglichkeit des MIR-ATR-Sensors für die chemische Prozessverfolgung wurde während
der Veresterung von Ethanol und Ameisensäure zu Ethylformiat und Wasser getestet. Diese
chemische Modellreaktion mit anschließender Destillation des Esters zeigt das Potenzial des
Sensors für die chemische Prozessanalysentechnik. Es konnten die zeitlichen Konzentrations-
verläufe sämtlicher vier Analyten aufgezeichnet werden.
Der Sensor wurde anhand von Daten aus sechs Kalibrationsläufen per multilinearer Regression
auf die Analyten kalibriert. Während des siebten vorhergesagten Laufes konnten sämtliche
vier an der Veresterung und Destillation beteiligten chemischen Substanzen simultan in
Echtzeit verfolgt werden. Die zeitlichen Verläufe der Sensorsignale sind in guter Überein-
stimmung mit den Konzentrationen, welche mit einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer
ermittelt wurden. Die erreichte Genauigkeit (Vorhersagefehler SEP) des mit Standardfiltern
7 Diskussion 93
ausgerüsteten MIR-ATR-Sensors ist für alle Analyten besser als 1 mol L-1 und somit aus-
reichend zur Verfolgung dieses chemischen Prozesses. Diese instabile Gleichgewichtsreaktion
hätte mit einer etablierten Analysenmethode wie HPLC nicht aufgezeichnet werden können,
weil sich die Konzentrationsverhältnisse während der Analyse verändern würden.
Bei dieser Anwendung war es mit dem Vierkanal-Sensor möglich, die maximale Anzahl von
vier verschiedenen chemischen Spezies gleichzeitig nachzuweisen. Dies ist darauf zurück zu
führen, dass die Analyten in den Messkanälen jeweils linear unabhängige Signale (keine
Kollinearitäten) hervorriefen.
Somit wurde gezeigt, dass der MIR-ATR-Sensor einen Spektrometeraufbau in einer
chemischen Prozessverfolgung ersetzen kann. Die Einbindung in eine Prozessumgebung ist
jedoch wesentlich einfacher, da der kompakte Sensor direkt am Messort angebracht wird und
ohne Lichtleiter und bewegte Teile auskommt. Durch den Verzicht auf Lichtleiter wird somit
ein wesentlicher Nachteil des MIR-Bereichs (kurze fragile Lichtleiter aus Silberhalogenid bzw.
Chalcogenid) gegenüber dem NIR-Bereich (lange Quarzlichtleiter dank hoher Transmission)
umgangen. Gleichzeitig wird durch diese neue Technologie der spezifischere und
informationsreichere MIR-Bereich für die Prozessanalytik erschlossen.
7.3 Prozessverfolgung einer Hefefermentation
Die Eignung des MIR-ATR-Sensors zur Verfolgung eines biotechnologischen Prozesses wurde
am Beispiel einer Batch-Fermentation von Bäckerhefe erprobt (SCHALK u. a., 2017). Der Sensor
wurde anhand von drei Kalibrationsläufen auf die Referenzanalytik kalibriert (offline HPLC-
Analyse gezogener Proben). Sowohl der Abbau des Substrats Glucose als auch der Aufbau des
Produkts Ethanol konnten anschließend während der vierten Fermentation online verfolgt
werden. Die mit dem Sensor ermittelten Konzentrationsverläufe stimmten gut mit der
Referenzanalytik überein. Der Vorhersagefehler betrug 6,15 g L-1 für Glucose und 1,36 g L-1 für
Ethanol (siehe Tabelle 13).
In Bezug auf die Maximalkonzentration dieser beiden Analyten liegt der relative Fehler für die
Bestimmung von Glucose bei 6% und Ethanol bei 5%. Um die erreichte Genauigkeit des
Sensors bewerten zu können, wurden die Fermentationen zusätzlich mit dem kommerziellen
MIR-ATR-Aufbau der Firma Bruker analysiert. Die während der Fermentation aufge-
nommenen IR-Spektren wurden ebenfalls mittels multilinearer Regression (MLR) in denselben
Spektralbereichen (Durchlassbereiche der im MIR-ATR-Sensor eingebauten optischen Filter)
ausgewertet. Die dabei erzielten SEP-Werte betrugen 4,34 g L-1 für Glucose und 0,61 g L-1 für
Ethanol (siehe Tabelle 15). Damit liegt der Vorhersagefehler des MIR-ATR-Sensors etwa
doppelt so hoch wie bei dem kommerziellen Spektrometer. Vergleicht man die Standardfehler
der Kalibration in beiden Tabellen, dann sind die SEC-Werte des Prototypsensors sogar nur um
den Faktor 1,3 höher.
7 Diskussion 94
Im Gegensatz zum MIR-ATR-Sensor, bei dem die Absorptionen in den vier Kanälen für die MLR-
Modellerstellung verwendet werden, kann bei FT-MIR-Spektrometern das gesamte Spektrum
für die Modellerstellung herangezogen werden. Aufgrund der vielen spektralen Datenpunkte
sind in der Regel PLS-Modelle besser als MLR-Modelle. Daher werden in den meisten
Publikationen, bei denen Fermentationen mit kommerziellen Spektrometeraufbauten
verfolgt werden, PLS-Modelle für die Spektrenauswertung eingesetzt. Zum Beispiel haben
Veale et. al (VEALE u. a., 2007) eine Ethanolfermentation mit einem kommerziellen FT-MIR-
Spektrometeraufbau verfolgt und dabei die beiden Analyten Glucose und Ethanol mittels PLS-
Modellen bestimmt. Während der Fermenationen wurden 75 g L-1 Glucose in eine Ethanol-
konzentration von ca. 30 g L-1 umgewandelt. Die dabei erhaltenen optimalen SEP-Werte für
Glucose lagen bei 1,386 g L-1 (relativer Fehler 2%) und für Ethanol bei 0,985 g L-1 (3%). Im Fall
von Glucose liefert die dort beschriebene PLS-Analyse bessere Werte und bei Ethanol etwas
schlechtere Werte als das hier verwendete MLR-Modell.
Die mit dem MIR-ATR-Sensor erreichte Genauigkeit war ausreichend, um bei den im Rahmen
dieser Arbeit durchgeführten Fermentationen den Abbau der vorgelegten 100 g L-1 Glucose
und die Bildung von 30 g L-1 Ethanol zeitlich zu verfolgen. Ob dieser Sensor auch bei
Bioprozessen mit kleineren Analytkonzentrationen erfolgreich eingesetzt werden kann, hängt
davon ab, ob sich mit den Analytkonzentrationen auch die Standardfehler (SEC, SEP)
entsprechend verringern. Im Gegensatz zur HPLC-Referenzmethode hat der Sensor den
Vorteil, dass mit ihm die Fermentationsbrühe direkt in Echtzeit und ohne Verdünnung bzw.
Abtrennung der Hefe vermessen werden kann. Somit können mit den Messdaten des Sensors
die wichtigsten Edukte und Produkte direkt gemessen und so in einem Prozess geregelt
werden.
8 Ausblick 95
8 Ausblick
Im Prototyp des MIR-ATR-Sensors wurden optische Standardfilter aus der IR-Gasanalytik
eingesetzt, da maßgefertigte Bandpässe die Herstellkosten zumindest verdoppelt hätten. Im
Detektor wird pro Kanal zwar nur ein Filter mit kleinen Abmessungen benötigt, dennoch muss
für ein spezielles Filter mindestens ein kompletter Wafer produziert und zugeschnitten
werden. Bei Fertigung eines MIR-ATR-Sensors in größerer Stückzahl ist es hingegen ohne
nennenswerte Mehrkosten möglich, spezielle (d.h. für eine bestimmte Messaufgabe optimale)
Filter einzusetzen. Es ist davon auszugehen, dass die Detektorhersteller mit steigendem
Einsatz von MIR-ATR-Sensoren zur Prozesskontrolle in der Flüssigphase auch Standardfilter für
die wichtigsten funktionellen chemischen Gruppen anbieten werden.
In einer stark abrasiven oder chemisch aggressiven Umgebung muss das ZnSe-Prisma des MIR-
ATR-Sensors geschützt werden. Unter anderem ist dies mit einem Diamantplättchen möglich
dank des gleichen Brechungsindex wie ZnSe und der guten Transmission im relevanten
Spektralbereich. Es besteht hierbei allerdings die Gefahr störender optischer Interferenzen
durch einen möglichen Luftspalt an der Kontaktfläche vom Diamantplättchen zum ZnSe-
Prisma. Dies könnte mit einer DLC-Beschichtung (DLC: Diamond Like Carbon) umgangen
werden, wie sie für Silizium- oder Germaniumlinsen bereits standardmäßig als Antireflexbe-
schichtung angeboten wird (JENOPTIK, 2008, S. 5). Für ZnSe ist eine solche Beschichtung bislang
jedoch nicht verfügbar.
Alternativ könnte bei einem Redesign des MIR-ATR-Sensors auf das ZnSe-Prisma verzichtet
und an Stelle dessen ein Diamant-ATR-Prisma mit sägezahnförmiger Ein- und Auskoppel-
struktur für das Licht verwendet werden (DIAMOND MATERIALS, 2016). Durch den Tausch des
Detektors gegen einen Typ mit internem Strahlteiler (INFRATEC, 2012) könnten in diesem Fall
auch mit der wesentlich kleineren ATR-Fläche vier photometrische Kanäle realisiert werden.
Mittelfristig ist zu erwarten, dass schmalbandige und zum Teil durchstimmbare Quanten-
kaskadenlaser (QCL) den Schwarzkörperstrahler ersetzen können. Die optischen Filter wären
dann obsolet. Die Anpassung an die Messaufgabe würde durch Tausch der Laserwellenlängen
bewerkstelligt. Aktuell gibt es erste industrielle Installationen mit dieser Technik als spezielle
Spurengasanalysatoren (OPTOPRECISION, 2016). QCL-Dioden mit einer Wellenlänge oberhalb
von 5 µm sind mit über 10 000 € (ROITHNER, 2016, S. 9) jedoch noch ca. 500 mal teurer als ein
elektrisch modulierbarer Schwarzkörperstrahler und 2-4 mal teurer als die Herstellkosten des
jetzigen Prototyps. Der Einsatz in einem preisgünstigen MIR-ATR-Sensor kommt daher aktuell
noch nicht in Frage.
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(EGLY u. a., 2012) EGLY, DOMINIK ; GEÖRG, DANIEL ; RÄDLE, MATTHIAS ; BEUERMANN, THOMAS: A compact multi-channel fluorescence sensor with ambient light suppression. In: Measurement Science and Technology Bd. 23 (2012), Nr. 3, S. 35702
(BEUERMANN u. a., 2012) BEUERMANN, THOMAS ; EGLY, DOMINIK ; GEOERG, DANIEL ; KLUG, KERRIS ISOLDE ; STORHAS, WINFRIED ; METHNER, FRANK-JUERGEN: On-line carbon balance of yeast fermentations using miniaturized optical sensors. In: Journal of Bioscience and Bioengineering Bd. 113 (2012), Nr. 3, S. 399–405
Konferenzbeiträge
(GEÖRG u. a., 2013) GEÖRG, D. ; GORNICKI, M. ; EGLY, D. ; METHNER, F.-J. ; BEUERMANN, T.: L11 - Photometrischer MIR-ATR-Sensor für die Prozessanalyse. In: 11. Dresdner Sensor-Symposium. Dresden, 2013 — ISBN 978-3-9813484-5-3, S. 439–443
(BRAUN u. a., 2015a) BRAUN, F. ; SCHALK, R. ; GEÖRG, D. ; RÄDLE, M. ; ECKARDT, H.S. ; BEUERMANN, T.: Prozess-Raman-Spektroskopie zur in-line Verfolgung einer aeroben Fermentation von Saccharomyces cerevisiae. In: GDCh-Wissenschaftsforum Chemie. Dresden, 2015a
(BRAUN u. a., 2015b) BRAUN, F. ; SCHWOLOW, S. ; SCHALK, R. ; SELTENREICH, J. ; NACHTMANN, M. ; GEÖRG, D. ; RÖDER, T. ; BEUERMANN, T. ; GRETZ, N. ; U. A.: Prozesstaugliche Ramanspektroskopie mit hoher optischer Sammeleffizienz für die In-line-Analytik. In: 11. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien, 2015b
(SCHALK u. a., 2015b) SCHALK, R. ; GEÖRG, D. ; BRAUN, F. ; METHNER, F.-J. ; RÄDLE, M. ; BEUERMANN, T.: MIR-ATR-Sensor zur Online-Überwachung von chemischen Reaktionen. In: 11. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien, 2015b
(SCHALK u. a., 2015a) SCHALK, R. ; BRAUN, F. ; GEÖRG, D. ; BRUNNER, J. ; SELTENREICH, J. ; THEUER, M. ; METHNER, F.-J. ; RÄDLE, M. ; BEUERMANN, T.: On-line Raman-Spektroskopie zur Verfolgung einer aeroben Hefe-Fermentation. In: 11. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien, 2015a
Verzeichnisse 103
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Optik einer ATR-Messzelle mit drei Reflexionsstellen zwischen Probe und Prisma. .......................................................................................... 6
Abbildung 2: Aufbauschema eine FT-MIR-Spektrometers (BEUERMANN, 2016). ................................. 7
Abbildung 3: Ablaufschema zum Erstellen einer chemometrischen PCR- oder PLSR-Methode. ....... 9
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines MIR-ATR-Sensors. .................................................... 12
Abbildung 5: Reaktionsmechanismus zur Veresterung bzw. Hydrolyse von Carbonsäureestern (LATSCHA u. a., 2008). .................................................................................................... 16
Abbildung 6: Gleichgewichtskonstante der Veresterung abhängig vom Anteil der Ameisensäure in der Vorlage nach (KUHNERT, 2004, Abb. 38). ................................................................ 18
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Online-Messungen in der Probenschleife sowie der Sensorik und Datenerfassung bei der Veresterung. .................................................... 22
Abbildung 8: Bild des Versuchsaufbaus zur chemischen Prozessverfolgung während der Veresterung. ................................................................................................................ 23
Abbildung 9: Bild des Versuchsaufbaus zur chemischen Prozessverfolgung während der Destillation. .................................................................................................................. 24
Abbildung 10: MIR-ATR-Spektren der am chemischen Musterprozess beteiligten Analyten Wasser, Ameisensäure, Ethanol und Ethylformiat. ................................................................... 26
Abbildung 11: Schematische Darstellung der Online-Messung in der Probenschleife sowie der Sensorik, Aktorik und Datenerfassung bei der Hefefermentation .............................. 30
Abbildung 12: Foto des Fermenters mit Messsonden und Steuereinheit während der Fermentation ..................................................................................................................................... 30
Abbildung 13: Bildschirmfoto der LabVIEW-basierten Datenerfassung für die HPLC-Analyse mit Chromatogramm 1 h nach Fermentationsbeginn (Zeitformat hh:mm). ..................... 32
Abbildung 14: Kalibration der HPLC anhand jeweils einer Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Glucose- und der Ethanolkonzentration in den Fermentationsproben. Auswertung der Chromatogramme mittels ChemStation (Agilent). ............................................... 33
Abbildung 15: Realer Bandpass der Firma Spectrogon und entsprechende Näherung für die Simulation eines MIR-ATR-Sensors. ............................................................................. 35
Abbildung 16: Datenfluss der Spektrenverarbeitung für die Sensorsimulation, ①…⑦: Reiter im Programm Spektrenanalyse.exe. ................................................................................. 36
Abbildung 17: Dateidialog des OPUS-Makros BatchConvert.mtx ....................................................... 37
Abbildung 18: Vom OPUS-Makro BatchConvert.mtx erstellte Metadatendatei BatchConvert.txt (Ausschnitt). ................................................................................................................. 38
Abbildung 19: 1. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse: „JCAMP-DX Daten einlesen“, Markierung: Dateiauswahl für die vom OPUS-Makro BatchConvert.mtx erstellte Textdatei. ..................................................................................................................... 39
Abbildung 20: Im 2. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse erstellter 3D Spektrenverlauf. ..................................................................................................................................... 40
Abbildung 21: Konfiguration der Auswertung im 3. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse. ......................................................................................................... 41
Abbildung 22: Sensorsimulation im 4. Reiter des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierung: Button zum Speichern der Auswerteergebnisse als TDMS-Datei. .......... 42
Abbildung 23: Signalbeschreibung in der TDMS-Datei *_Auswert.tdms nach Import mittels Excel-Add-In (Ausschnitt). ..................................................................................................... 42
Abbildung 24: 5. Reiter „ATR Photometer“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierung: Auswahl der Signalaufzeichung des MIR-ATR-Sensors. ............................................... 43
Verzeichnisse 104
Abbildung 25: Chemometrischen Analyse mittels OPUS-Funktion „Quant 2 Analyse / Dateiliste“. Hervorgehoben: Button zum Markieren der Ergebnisse. ........................................... 44
Abbildung 26: 6. Reiter „Quant 2 einlesen“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse, Markierungen: Auswahl der Textdatei mit der Quant2-Analyse und Speichern der synchronisierten Informationen als TDMS. ................................................................. 45
Abbildung 27: 7. Reiter „Diagramm“ des LabVIEW-Programms Spektrenanalyse. ............................ 45
Abbildung 28: CAD-Entwurf des MIR-ATR-Sensors (EGLY, 2012). ....................................................... 47
Abbildung 29: Foto des gebauten MIR-ATR-Sensors. ......................................................................... 48
Abbildung 30: Schematischer Aufbau des MIR-ATR-Sensors und optischer Strahlengang. ............... 49
Abbildung 31: Foto der Prismen- und Elektronikhalterung im MIR-ATR-Sensor. ............................... 50
Abbildung 32: Foto der Elektronik (Oberseite) des MIR-ATR-Sensors mit Lichtquelle und Detektor. 50
Abbildung 33: Schema der Verkabelung des MIR-ATR-Sensors. ........................................................ 53
Abbildung 34: Foto der Verkabelung des MIR-ATR-Sensors am Klemmblock der USB-Datenerfassung. ........................................................................................................... 53
Abbildung 35: Schaltplan der Lichtquellenansteuerung, IC1: Lichtquelle Typ MIRL17-900 (Vertrieb durch Laser Components, Olching). ............................................................................ 55
Abbildung 36: Ersatzschaltbild und Pinbelegung des Vierkanaldetektors HTS Q21 mit internem NTC-Temperatursensor (Thermistor) (HEIMANN SENSOR, 2008b). ........................................ 56
Abbildung 37: Grundschaltung eines Transimpedanzverstärkers. ..................................................... 58
Abbildung 38: Transimpedanzverstärker mit sternförmigem Rückkoppelnetzwerk (links) und dazu äquivalente Dreieckschaltung (rechts). ....................................................................... 59
Abbildung 39: Beispielschaltung eines Verstärkers für einen Thermosäulendetektor mit 1001-facher Vorverstärkung und 11-facher Nachverstärkung des Wechselanteils (ANALOG DEVICES, 2014, S. 18). ................................................................................................................. 60
Abbildung 40: Bildschirmfoto des LabVIEW-Programms ATR_Photometer. ...................................... 62
Abbildung 41: Signale des MIR-ATR-Sensors und zugehörige Simulation auf Basis der MIR-ATR-Spektren während Lauf 7 der Veresterung und Destillation. ...................................... 64
Abbildung 42: Signalverläufe des Kanals 3 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und Destillation. .................................................................................................................. 66
Abbildung 43: Simuliertes Ansprechverhalten der vier Kanäle des MIR-ATR-Sensors bzgl. Ethanol (oben) und Glucose (unten), Extinktionsänderung bezogen auf Wasser in Abhängigkeit der Analytkonzentration. ....................................................................... 68
Abbildung 44: Temperatur des Reaktionsgemisches während der Veresterung und Destillation bei den Läufen 3, 4, 5, 6 und 7. ......................................................................................... 70
Abbildung 45: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Veresterung (oben) und der Destillation (unten), exemplarisch für Lauf 7 dargestellt. ........................................... 73
Abbildung 46: Referenzanalytik während Lauf 5 der Veresterung und Destillation. Auswahl der Kalibrationspunkte. ...................................................................................................... 75
Abbildung 47: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure (oben) und der Produkte Ethylformiat und Wasser (unten) während der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h) in Lauf 7. Referenz (FT-Spektrometer) kalibriert mittels PLS-Regression auf eingewogene Proben und MIR-ATR-Sensor kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Läufe 1-6. ..................................................................................... 77
Abbildung 48: 3D-Plot der MIR-ATR-Spektren von 3600-1100 cm-1 (links) und 1100-600 cm-1 (rechts) während Lauf 7 der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h). ..................... 78
Verzeichnisse 105
Abbildung 49: Ausschnitt der MIR-ATR-Spektren von 1100-600 cm-1 der reinen Analyten Wasser, Ameisensäure, Ethanol und Ethylformiat und Transmissionsbereiche der simulierten analytspezifischen Filter S1-S4 zur Optimierung des Sensors. .................................... 79
Abbildung 50: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure (oben) und der Produkte Ethylformiat und Wasser (unten) während der Veresterung (0-1,7 h) und Destillation (1,7-2,3 h) in Lauf 7. Referenz (FT-Spektrometer) kalibriert mittels PLS-Regression auf eingewogene Proben und zwei simulierte MIR-ATR-Sensoren (mit Standardfiltern F1-F4 sowie mit analytspezifischen Filtern S1-S4) kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Läufe 1-6. ............................................................................. 82
Abbildung 51: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der vier Fermentationen. Ermittelt anhand von Proben der Fermentationsbrühe per offline-HPLC (Referenzanalytik). ....................................................................................................... 83
Abbildung 52: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Hefefermentation (exemplarisch für Fermentation 4 dargestellt). .................................................................................. 84
Abbildung 53: Veränderung der MIR-ATR-Spektren während der Hefefermentation nach Abzug des Wasser-Spektrums (exemplarisch für Fermentation 4 dargestellt). ........................... 85
Abbildung 54: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der 4. Hefefermentation. Messung per HPLC (Referenz) und MIR-ATR-Sensor. Der MIR-ATR-Sensor wurde mittels MLR-Modell anhand der Fermentationen 1-3 kalibriert. ................................ 87
Abbildung 55: Ausschnitt der MIR-ATR-Spektren von 1600-900 cm-1 von Glucose und Ethanol in wässriger Verdünnung sowie der Matrix der Fermentationsbrühe. Ebenso die Transmissionsbereiche der simulierten Filter des optimierten Sensors F2, F4, S5, S6. ..................................................................................................................................... 88
Abbildung 56: Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während der 4. Hefefermentation. Referenz (HPLC) jeweils kalibriert per einfacher Regression auf eine eingewogene Verdünnungsreihe und zwei simulierte MIR-ATR-Sensoren (mit Standardfiltern F1-F4 sowie mit analytspezifischen Filtern F2 F4 S5 S6) kalibriert mittels MLR-Modell anhand der Fermentationen 1-3. ................................................................................ 90
Abbildung 57: AC-Simulation der Verstärkschaltung Version 5 (Transimpedanzverstärker) mit LTspice IV. .................................................................................................................. 111
Abbildung 58: Schaltplan Version 5 mit Lichtquelle, Detektor und Vorverstärker ........................... 112
Abbildung 59: Layout Version 5 mit Lichtquelle, Detektor und Vorverstärker, Ø 54 mm. ............... 113
Abbildung 60: Layout Version 5 der Halteplatinen für Prisma und Strahlführungsrohre, Ø 54 mm.113
Abbildung 61: AC-Simulation der Verstärkerschaltung Version 6 (Spannungsverstärker) mit LTspice IV. ............................................................................................................................... 114
Abbildung 62: Schaltplan Lichtquelle Version 6 ................................................................................ 115
Abbildung 63: Schaltplan Versorgung Version 6 ............................................................................... 116
Abbildung 64: Schaltplan Detektor und Vorverstärker Version 6 ..................................................... 117
Abbildung 65: Layouts Version 6 der Versorgung (oben, 60x60 mm), Lichtquelle (mitte, 50x50 mm) und Detektor mit Vorverstärker (unten, 50x50 mm) ................................................ 118
Abbildung 66: Signalverläufe der Kanäle 1 und 3 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und Destillation. ......................................................................................................... 125
Abbildung 67: Signalverläufe der Kanäle 2 und 4 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und Destillation. ......................................................................................................... 126
Abbildung 68: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure während der Veresterung und Destillation. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren. ............................................................................................................ 127
Verzeichnisse 106
Abbildung 69: Konzentrationsverläufe der Produkte Wasser und Ethylformtiat während der Veresterung und Destillation. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren. ............................................................................................................ 128
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vergleich von MIR-Detektoren nach Prinzip und Spektralbereich. Aufsteigend sortiert nach spezifischer Detektivität. .................................................................................... 14
Tabelle 2: Zusammenfassung der Veratmung und Vergärung von Glucose durch Hefe und deren theoretische Energieausbeuten (ANNEMULLER u. a., 2008). ......................................... 20
Tabelle 3: Veresterung: Zusammensetzung der Vorlage bestehend aus 100 mL Ethanol 96 % V/V und 124 mL Ameisensäure 99 % m/m. ........................................................................ 25
Tabelle 4: Korrelation (Bestimmtheitsmaß R²) der Komponenten in den Kalibrationsproben der Chemometrie zur Veresterung. ................................................................................... 28
Tabelle 5: Qualitätsparameter R² und RMSECV des chemometrischen Modells zur Analyse der Veresterungsreaktion für die Analyten W, ET, AS und EF in Abhängigkeit des Ranges. ..................................................................................................................................... 29
Tabelle 6: Transmissionsbereiche der im vierkanaligen Thermosäulendetektor Heimann Sensor HTS Q21 eingesetzten optischen Bandpässe. .............................................................. 51
Tabelle 7: Messeffekt der vier Kanäle des MIR-ATR-Sensors bezüglich Glucose in Mikroextinktionen pro g L-1. ........................................................................................ 68
Tabelle 8: Bis zum Gleichgewicht umgesetzter Anteil von W, ET, AS und EF nach der chemometrischen Analyse der MIR-ATR-Spektren beim Veresterungsversuch. Aufgeführt sind die Mittelwerte und Standardabweichung anhand der 7 Läufe. ...... 72
Tabelle 9: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation. ...................................................................................... 76
Tabelle 10: Spezifische Analytbanden im „Fingerprint“-Bereich und Technische Daten der analytspezifischen Filter S1-S4 im simulierten MIR-ATR-Sensor für die Veresterung und anschließende Destillation. .................................................................................. 79
Tabelle 11: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den hochspezifischen Filtern S1, S2, S3 und S4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation. ................................................. 80
Tabelle 12: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Veresterung und Destillation. ................................................. 81
Tabelle 13: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Fermentation. .............................................................................................................. 86
Tabelle 14: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den analytspezifischen Filtern F2, F4, S5 und S6 für die Prozessverfolgung der Fermentation. ......................................................................... 89
Tabelle 15: Ergebnis der Kalibration (4D-MLR) und der Validierung des simulierten MIR-ATR-Sensors, ausgestattet mit den Standardfiltern F1, F2, F3 und F4 für die Prozessverfolgung der Fermentation. ......................................................................... 89
Tabelle 16: Belegung der Signalverkabelung in Version 5 des MIR-ATR-Sensors. ....................... 110
Tabelle 17: Daten der für die Veresterung eingesetzten Chemikalien. ....................................... 119
Verzeichnisse 107
Tabelle 18: Stammlösungen aus zwei Komponenten für die Kalibration der chemometrischen Analyse von MIR-ATR-Spektren aus dem Veresterungsversuch (HÄFFNER, 2015). .... 119
Tabelle 19: Kalibrationsproben für die chemometrische Analyse der MIR-ATR-Spektren aus dem Veresterungsversuch, gemischt aus zwei Stammlösungen nach Tabelle 18 (HÄFFNER, 2015). ......................................................................................................................... 120
Tabelle 20: Konzentration der 4 Analyten W, ET, AS und EF im Gleichgewicht der Veresterung. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren (Referenzanalytik). ..................................................................................................... 121
Tabelle 21: Referenzanalytik zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 der Veresterung und Destillation zur Kalibration des MIR-ATR-Sensors (Sensorsignale siehe Tabelle 22). ............................................................................................................................. 121
Tabelle 22: Sensorsignale des MIR-ATR-Sensors zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration des Sensors (Referenzanalytik siehe Tabelle 21). .......................... 122
Tabelle 23: Signale des simulierten MIR-ATR-Sensors mit den Filtern F1-F4 zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration der Simulation (Referenzanalytik siehe Tabelle 21). ....................................................................................................... 123
Tabelle 24: Signale des simulierten MIR-ATR-Sensors mit den Filtern S1-S4 zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration der Simulation (Referenzanalytik siehe Tabelle 21). ....................................................................................................... 124
Tabelle 25: Vollsynthetisches Fermentationsmedium für aerobe Hefezucht, nach (SCHATZMANN, HERBERT, 1975). .......................................................................................................... 129
Tabelle 26: Referenzanalytik (HPLC) und korrigierte Sensorsignale ............................................ 129
Tabelle 27: Signale der simulierten Sensoren (F1 F2 F3 F4 und F2 F4 S5 S6) .............................. 131
Anhang 108
Anhang
A Anhang zur Sensorsimulation
OPUS-Makro BatchConvert.mtx
VARIABLES SECTION
STRING <File List> = '';
STRING <Path> = '?';
STRING <Path_Destination> = '?';
STRING <Name> = '*.0*';
STRING <FileName> = '';
NUMERIC <Count> = 0;
NUMERIC <Index> = 0;
FILE <$ResultFile> = Spec;
STRING <LineToWrite> = '';
STRING <Date> = '';
STRING <Time> = '';
PROGRAM SECTION
UserDialog ('Load multiple files', STANDARD, EDIT:'<Path>', EDIT:'<Name>',
EDIT:'<Path_Destination>', BLANK, BLANK, BLANK, BLANK, BLANK, BLANK, BLANK, BLANK,
BLANK, BLANK, BLANK);
<File List> = ScanPath ('<Path>\<Name>');
<Count> = GetArrayCount (<File List>);
TextToFile ('<Path_Destination>', 'BatchConvert.txt', 'SpekNr. Date Time File', REPLACE_TEXT);
StartLoop (<Count>, 0);
<FileName> = '<File List>[<Index>]';
<$ResultFile> = Load (0, {DAP='<Path>', DAF='<FileName>'});
<Date> = GetParameter ([<$ResultFile>:Spec], DAT);
H2Ocomp ([<$ResultFile>:Spec], [<$ResultFile>:Spec], {H2O=7});
<Time> = GetParameter ([<$ResultFile>:Spec], TIM);
<LineToWrite> = '<Index> <Date> <Time> <FileName>.dx';
TextToFile ('<Path_Destination>', 'BatchConvert.txt', '<LineToWrite>', APPEND_TEXT);
<Index> = <Index> + 1;
SaveAs ([<$ResultFile>:Spec], {DAP='<Path_Destination>', OEX='0', SAN='<FileName>.dx', COF=32,
INP='C:\OPUS_7.0.129\METHODS', IFP='C:\OPUS_7.0.129\METHODS', INM='DEFAULT',
IFN='DEFAULT'});
Unload ([<$ResultFile>:Spec], {});
EndLoop (0);
PARAMETER SECTION
SEP=,;
DPO=5;
DPA=5;
COF=64;
INP=C:\OPUS_7.0.129\METHODS;
IFP=C:\OPUS_7.0.129\METHODS;
INM=DEFAULT;
IFN=DEFAULT;
Anhang 109
Beispiel zur Konfigurationsdatei Spektrenanalyse_Auswertung.ini (gekürzt)
[Meta]
Autor = Daniel Geörg
Datum = 13.06.2014
Version = 0000
Versuch = Test
;
; Konfigurationsdatei für die Spektrenauswertung
; ----------------------------------------------
;
; Aufbau der Datei:
; -----------------
; - Es gibt den Abschnitt [Meta] mit den Text-Schlüsseln Autor, Datum, Version und Versuch
; - Alle weiteren Abschnitte werden als Bandenauswertung aufgefasst und müssen die
; entsprechenden Informationen enthalten.
; Beispiel: Neben [Meta] existieren 3 weitere Abschnitte, die gültige Auswerteparameter
; enthalten --> Es werden 3 Signale bei der Auswertung erstellt.
;
; Für eine Auswertung muss eine Methode gewählt und die zugehörigen Parameter gesetzt werden.
; Methode = Bereich ohne Bezug
; Bereich mit Bereich als Bezug
; Punkt ohne Bezug
; Punkt mit Punkt als Bezug
; Punkt mit Basislinie
;
; Beispiel:
; [Photometer 1550]
; Methode = Bereich ohne Bezug
; von = 1600
; bis = 1500
; Es wird ein Signal mit dem Namen "Photometer 1550" erstellt,
; das die mittlere Extinktion des Bereichs von 1600 cm^-1 bis 1500 cm^-1 enthält.
;
; Angabe numerischer Parameter
; ----------------------------
; Alle numerischen Parameter sind Wellenzahlen mit der Einheit cm^-1.
; Die Einheit wird bei den Parametern weggelassen.
; "von"-Parameter beschreiben die Grenze mit der höheren Wellenzahl,
; "bis"-Parameter die Grenze mit der kleineren Wellenzahl.
; Nicht ganze Zahlen werden mit Komma geschrieben. Beispiel: 1234,5
;
; Beschreibung der verschiedenen Methoden:
; ----------------------------------------
; Methode = Bereich ohne Bezug
; von = x
; bis = y
; Es wird die mittlere Extinktion im Wellenzahlbereich von x bis y ermittelt.
; --> Photometerkanal im angegebenen Bereich
;
; Methode = Bereich mit Bereich als Bezug
; Mess von = x
; Mess bis = y
; Bezug von = u
; Bezug bis = v
; Es wird die mittlere Extinktion im Bereich von x bis y ermittelt und von dieser
; die mittlere Extinktion im Bereich von u bis v subtrahiert.
; --> photometrische Messung mit Mess- und Bezugskanal
;
; Methode = Punkt ohne Bezug
; bei = x
; Es wird die Extinktion bei der angegebenen Wellenzahl ermittelt.
; --> spektrometrische Absorptionsmessung ohne Bezug
;
; Methode = Punkt mit Punkt als Bezug
; Mess = x
; Bezug = y
; Von der Extinktion bei x wird die Extinktion bei y subtrahiert.
; --> spektrometrische Absorptionsmessung mit Bezug bei einer benachbarten Wellenzahl
;
; Methode = Punkt mit Basislinie
; Mess = x
; Basis von = u
; Basis bis = v
; Von der Extinktion bei x wird der Wert einer Basislinie (ebenfalls bei x) subtrahiert.
; Die Basislinie ist eine lineare Funktion zwischen den Punkten bei u und v.
Anhang 110
; --> spektrometrische Absorptionsmessung mit Basislinie zwischen den Fußpunkten.
;
[SIM K1 Ref EtOH 3910nm 90nm]
Methode = Bereich ohne Bezug
von = 2587,3
bis = 2528,4
[SIM K2 Ref Zucker 8170nm 250nm]
Methode = Bereich ohne Bezug
von = 1243
bis = 1205,5
[SIM K3 Mess EtOH 3372nm 40nm]
Methode = Bereich ohne Bezug
von = 2983,3
bis = 2948,1
[SIM K4 Mess Zucker 8690nm 215nm]
Methode = Bereich ohne Bezug
von = 1165,2
bis = 1136,7
…
B Anhang zur Sensorentwicklung
Tabelle 16: Belegung der Signalverkabelung in Version 5 des MIR-ATR-Sensors.
Signal Platine V5
Pin Gehäuse-
stecker
Ader Steuer-leitung
Klemmblock NI USB-6351
Pin Name Pin Name
+12 V (Netzteil) Versorgung Lichtquelle
1 PWR+ 1 Schwarz
NTC+ Detektor 2 TH 2 Weiß
Modulation Lichtquelle 3 MOD 3 Grau 89 PFI 12
0 V (Platine/Ader) 4 V- 4 Violett * GND
Signal Kanal 1 5 CH1 5 Blau 1 ** AI 0+
Signal Kanal 2 6 CH2 6 Grün 4 ** AI 1+
Signal Kanal 3 7 CH3 7 Gelb 7 ** AI 2+
Signal Kanal 4 8 CH4 8 Orange 10 ** AI 3+
Gleichtaktspannung Detektor und Verstärker,
NTC- Detektor 9 UCM 9 Rot 15 AO 0
+5 V Versorgung Verstärker
10 V+ 10 Braun 96 +5V
NTC+ Probe 11 Türkis
NTC- Probe 12 Rosa
0 V (Gehäuse/Schirm) Schirm * GND
* Auf dem Klemmblock der Datenerfassung werden die 0V-Potenziale zusammengeführt.
Folgende Pins sind untereinander und mit dem Gehäuse der Datenerfassung verbunden: 3,
6, 9, 12, 14, 19, 22, 25, 28, 30 (AI GND), 13 (AI SENSE), 16, 32 (AO GND), 82, 84, 86, 88, 90,
92, 94, (D GND), 2 (AI 0-), 5 (AI 1-), 8 (AI 2-), 11 (AI 3-).
** An den positiven Analogeingängen ist jeweils ein 47 kΩ-Widerstand gegen GND ange-
schlossen, um den Eingangswiderstand der Datenerfassung zu senken.
Anhang 111
Simulation, Schaltplan und Layout Version 5
Abbildung 57: AC-Simulation der Verstärkschaltung Version 5 (Transimpedanzverstärker) mit LTspice IV.
Anhang 112
Abbildung 58: Schaltplan Version 5 mit Lichtquelle, Detektor und Vorverstärker
Anhang 113
Abbildung 59: Layout Version 5 mit Lichtquelle, Detektor und Vorverstärker, Ø 54 mm.
Abbildung 60: Layout Version 5 der Halteplatinen für Prisma und Strahlführungsrohre, Ø 54 mm.
Anhang 114
Simulation, Schaltplan und Layout Version 6
Abbildung 61: AC-Simulation der Verstärkerschaltung Version 6 (Spannungsverstärker) mit LTspice IV.
Anhang 115
Abbildung 62: Schaltplan Lichtquelle Version 6
Anhang 116
Abbildung 63: Schaltplan Versorgung Version 6
Anhang 117
Abbildung 64: Schaltplan Detektor und Vorverstärker Version 6
Anhang 118
Abbildung 65: Layouts Version 6 der Versorgung (oben, 60x60 mm), Lichtquelle (mitte, 50x50 mm) und
Detektor mit Vorverstärker (unten, 50x50 mm)
Anhang 119
C Anhang zur Veresterung und Destillation
Tabelle 17: Daten der für die Veresterung eingesetzten Chemikalien.
Chemikalie Reinheit Hersteller, Artikel- &
Batchnummer
Dichte g cm-3
Für Reinstoffe
Dichte g cm-3
Molekulargewicht g mol-1
Ethanol
96,3 % V/V ≙ 94 % m/m (MERCK, 1981) Rest Wasser
VWR 20905.365 14F12025
0,808 0,789 46,07
Ameisensäure 98,6 % m/m Rest Wasser
AppliChem A0748,1000 4D011132
k.A. 1,22 46,03
Vollentsalztes Wasser
100 % Hochschule Mannheim
1 1 18,02
Ethylformiat 99,4 % m/m Rest Ethanol
Merck 8.00891.1000 S6772791
0,922 0,921 74,08
Schwefelsäure 25 % m/m Rest Wasser
Carl Roth 0967.1
1,18
Tabelle 18: Stammlösungen aus zwei Komponenten für die Kalibration der chemometrischen Analyse von MIR-ATR-Spektren aus dem Veresterungsversuch (HÄFFNER, 2015).
Die Unreinheiten der Chemikalien nach Tabelle 17 wurde berücksichtigt.
Nr. Wasser mol L-1
Ethanol mol L-1
Ameisensäure mol L-1
Ethylformiat mol L-1
1 18,60 11,52 0,00 0,00
2 8,03 14,89 0,00 0,00
3 44,94 3,25 0,00 0,00
4 0,22 0,13 8,61 8,16
5 0,06 0,18 2,17 11,21
6 0,50 0,05 19,36 3,13
Anhang 120
Tabelle 19: Kalibrationsproben für die chemometrische Analyse der MIR-ATR-Spektren aus dem Veresterungsversuch, gemischt aus zwei Stammlösungen nach Tabelle 18 (HÄFFNER, 2015).
Die Kalibrationsproben 1-6 sind die Stammlösungen 1-6 aus Tabelle 18.
Nr. Gemischte Stammlösungen
Misch-verhältnis
Wasser mol L-1
Ethanol mol L-1
Ameisensäure mol L-1
Ethylformiat mol L-1
7 1 2
1:1
13,31 13,21 0,00 0,00
8 1 3 31,77 7,39 0,00 0,00
9 1 4 9,41 5,83 4,31 4,08
10 1 5 9,33 5,85 1,08 5,61
11 1 6 9,55 5,79 9,68 1,57
12 2 3 26,49 9,07 0,00 0,00
13 2 4 4,13 7,51 4,31 4,08
14 2 5 4,04 7,54 1,08 5,61
15 2 6 4,27 7,47 9,68 1,57
16 3 4 22,58 1,69 4,31 4,08
17 3 5 22,50 1,72 1,08 5,61
18 3 6 22,72 1,65 9,68 1,57
19 4 5 0,14 0,16 5,39 9,69
20 4 6 0,36 0,09 13,99 5,65
21 5 6 0,28 0,12 10,77 7,17
22 1 2
1:2
11,52 13,78 0,00 0,00
23 1 3 36,25 5,98 0,00 0,00
24 1 4 6,29 3,89 5,77 5,47
25 1 5 6,17 3,93 1,45 7,51
26 1 6 6,47 3,84 12,97 2,10
27 2 3 32,76 7,09 0,00 0,00
28 2 4 2,80 5,00 5,77 5,47
29 2 5 2,69 5,04 1,45 7,51
30 2 6 2,98 4,95 12,97 2,10
31 3 4 14,98 1,16 5,77 5,47
32 3 5 14,87 1,19 1,45 7,51
33 3 6 15,17 1,11 12,97 2,10
34 4 5 0,11 0,17 4,29 10,21
35 4 6 0,41 0,08 15,82 4,79
36 5 6 0,35 0,09 13,69 5,80
37 1 2
2:1
15,11 12,64 0,00 0,00
38 1 3 27,29 8,79 0,00 0,00
39 1 4 12,53 7,77 2,84 2,69
40 1 5 12,48 7,78 0,72 3,70
41 1 6 12,63 7,74 6,39 1,03
42 2 3 20,21 11,05 0,00 0,00
43 2 4 5,45 10,02 2,84 2,69
44 2 5 5,40 10,04 0,72 3,70
45 2 6 5,55 9,99 6,39 1,03
46 3 4 30,19 2,22 2,84 2,69
47 3 5 30,13 2,24 0,72 3,70
48 3 6 30,28 2,19 6,39 1,03
49 4 5 0,17 0,15 6,49 9,17
50 4 6 0,31 0,11 12,16 6,50
51 5 6 0,20 0,14 7,84 8,55
Anhang 121
Tabelle 20: Konzentration der 4 Analyten W, ET, AS und EF im Gleichgewicht der Veresterung. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren (Referenzanalytik).
Lauf Zeit (Gleichgewicht)
h Wasser mol L-1
Ethanol mol L-1
Ameisensäure mol L-1
Ethylformiat mol L-1
1 1,39 7,27 0,94 8,91 5,98
2 2,11 6,98 1,19 8,19 6,20
3 1,56 6,35 1,56 8,42 5,98
4 2,31 6,69 1,31 8,46 6,07
5 1,42 6,48 1,50 8,94 5,74
6 1,93 6,65 1,35 8,65 5,95
7 1,63 6,48 1,50 8,72 5,84
Mittelwert 6,70 1,33 8,61 5,97
Standardabweichung 0,24 0,16 0,22 0,10
Tabelle 21: Referenzanalytik zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 der Veresterung und Destillation zur Kalibration des MIR-ATR-Sensors (Sensorsignale siehe Tabelle 22).
Lauf Zeitpunkt Zeit
h Wasser mol L-1
Ethanol mol L-1
Ameisensäure mol L-1
Ethylformiat mol L-1
1 Start 0,03 2,93 5,73 13,48 1,23
1 halbe Veresterung 0,17 5,51 2,90 10,61 4,13
1 Gleichgewicht 1,28 6,92 1,07 8,60 6,11
1 halbe Destillation 1,56 10,39 0,90 12,02 3,80
1 Ende 1,75 14,34 0,40 15,14 1,71
2 Start 0,06 3,26 5,81 13,48 1,09
2 halbe Veresterung 0,25 5,67 3,39 10,84 3,63
2 Gleichgewicht 2,11 9,11 0,81 9,51 5,36
2 halbe Destillation 2,44 12,32 0,59 12,38 3,42
2 Ende 2,78 16,30 0,12 15,45 1,35
3 Start 0,05 3,29 5,77 12,79 1,46
3 halbe Veresterung 0,25 4,96 3,79 10,87 3,48
3 Gleichgewicht 1,64 7,65 1,27 9,11 5,56
3 halbe Destillation 1,97 10,83 0,86 11,64 3,92
3 Ende 2,08 14,55 0,40 14,75 1,88
4 Start 0,04 2,95 6,30 13,59 0,76
4 halbe Veresterung 0,32 5,45 3,50 11,14 3,45
4 Gleichgewicht 2,31 9,90 0,76 10,43 4,79
4 halbe Destillation 2,64 13,63 0,43 13,72 2,60
4 Ende 2,88 16,45 0,11 15,93 1,08
5 Start 0,05 2,82 6,05 13,30 1,11
5 halbe Veresterung 0,27 4,43 3,73 10,90 3,63
5 Gleichgewicht 1,30 5,53 1,79 8,43 5,98
5 halbe Destillation 1,70 9,09 1,14 11,03 4,40
5 Ende 1,97 13,06 0,69 14,23 2,24
6 Start 0,03 2,88 6,17 13,66 0,83
6 halbe Veresterung 0,30 5,07 3,47 10,82 3,72
6 Gleichgewicht 1,97 6,53 1,39 8,47 6,02
6 halbe Destillation 2,22 10,11 1,01 11,52 4,03
6 Ende 2,52 14,05 0,52 14,63 1,95
Anhang 122
Tabelle 22: Sensorsignale des MIR-ATR-Sensors zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration des Sensors (Referenzanalytik siehe Tabelle 21).
Lauf Zeitpunkt Zeit
h Extinktion
Kanal 1 Extinktion
Kanal 2 Extinktion
Kanal 3 Extinktion
Kanal 4
1 Start 0,03 0,070 0,191 0,093 0,201
1 halbe Veresterung 0,17 0,058 0,196 0,081 0,213
1 Gleichgewicht 1,28 0,051 0,196 0,070 0,222
1 halbe Destillation 1,56 0,067 0,213 0,086 0,216
1 Ende 1,75 0,082 0,221 0,098 0,217
2 Start 0,06 0,072 0,182 0,094 0,179
2 halbe Veresterung 0,25 0,063 0,197 0,083 0,208
2 Gleichgewicht 2,11 0,055 0,199 0,072 0,219
2 halbe Destillation 2,44 0,067 0,212 0,085 0,213
2 Ende 2,78 0,082 0,221 0,097 0,213
3 Start 0,05 0,066 0,184 0,090 0,188
3 halbe Veresterung 0,25 0,056 0,188 0,080 0,201
3 Gleichgewicht 1,64 0,048 0,190 0,068 0,211
3 halbe Destillation 1,97 0,059 0,204 0,078 0,207
3 Ende 2,08 0,073 0,213 0,092 0,207
4 Start 0,04 0,066 0,178 0,090 0,185
4 halbe Veresterung 0,32 0,055 0,186 0,077 0,201
4 Gleichgewicht 2,31 0,047 0,187 0,066 0,210
4 halbe Destillation 2,64 0,062 0,204 0,079 0,205
4 Ende 2,88 0,074 0,210 0,090 0,205
5 Start 0,05 0,075 0,192 0,096 0,199
5 halbe Veresterung 0,27 0,064 0,197 0,084 0,211
5 Gleichgewicht 1,30 0,056 0,197 0,074 0,220
5 halbe Destillation 1,70 0,066 0,212 0,083 0,217
5 Ende 1,97 0,081 0,220 0,097 0,216
6 Start 0,03 0,066 0,179 0,092 0,183
6 halbe Veresterung 0,30 0,054 0,188 0,077 0,202
6 Gleichgewicht 1,97 0,046 0,189 0,066 0,211
6 halbe Destillation 2,22 0,058 0,202 0,078 0,208
6 Ende 2,52 0,074 0,212 0,092 0,207
Anhang 123
Tabelle 23: Signale des simulierten MIR-ATR-Sensors mit den Filtern F1-F4 zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration der Simulation (Referenzanalytik siehe Tabelle 21).
Lauf Zeitpunkt Zeit h
Extinktion Kanal 1
Extinktion Kanal 2
Extinktion Kanal 3
Extinktion Kanal 4
1 Start 0,03 0,064 0,225 0,106 0,275
1 halbe Veresterung 0,17 0,050 0,238 0,088 0,300
1 Gleichgewicht 1,28 0,042 0,243 0,076 0,315
1 halbe Destillation 1,56 0,059 0,260 0,093 0,298
1 Ende 1,75 0,077 0,263 0,111 0,293
2 Start 0,06 0,065 0,221 0,106 0,275
2 halbe Veresterung 0,25 0,053 0,232 0,090 0,293
2 Gleichgewicht 2,11 0,049 0,243 0,080 0,315
2 halbe Destillation 2,44 0,064 0,259 0,095 0,301
2 Ende 2,78 0,081 0,265 0,113 0,295
3 Start 0,05 0,062 0,218 0,104 0,272
3 halbe Veresterung 0,25 0,052 0,229 0,091 0,291
3 Gleichgewicht 1,64 0,044 0,238 0,079 0,313
3 halbe Destillation 1,97 0,057 0,253 0,091 0,301
3 Ende 2,08 0,075 0,260 0,109 0,296
4 Start 0,04 0,066 0,218 0,109 0,267
4 halbe Veresterung 0,32 0,054 0,234 0,093 0,295
4 Gleichgewicht 2,31 0,055 0,249 0,089 0,323
4 halbe Destillation 2,64 0,071 0,266 0,105 0,304
4 Ende 2,88 0,084 0,268 0,118 0,300
5 Start 0,05 0,064 0,219 0,106 0,270
5 halbe Veresterung 0,27 0,051 0,232 0,090 0,292
5 Gleichgewicht 1,30 0,039 0,234 0,074 0,307
5 halbe Destillation 1,70 0,053 0,252 0,087 0,295
5 Ende 1,97 0,071 0,257 0,105 0,289
6 Start 0,03 0,066 0,219 0,108 0,270
6 halbe Veresterung 0,30 0,052 0,233 0,090 0,294
6 Gleichgewicht 1,97 0,040 0,237 0,075 0,309
6 halbe Destillation 2,22 0,056 0,254 0,090 0,294
6 Ende 2,52 0,074 0,259 0,108 0,289
Anhang 124
Tabelle 24: Signale des simulierten MIR-ATR-Sensors mit den Filtern S1-S4 zu 5 ausgewählten Zeitpunkten aus den Läufen 1-6 zur Kalibration der Simulation (Referenzanalytik siehe Tabelle 21).
Lauf Zeitpunkt Zeit h
Extinktion Kanal 1
Extinktion Kanal 2
Extinktion Kanal 3
Extinktion Kanal 4
1 Start 0,03 0,252 0,141 0,225 0,125
1 halbe Veresterung 0,17 0,159 0,135 0,192 0,131
1 Gleichgewicht 1,28 0,093 0,132 0,179 0,137
1 halbe Destillation 1,56 0,100 0,148 0,240 0,189
1 Ende 1,75 0,101 0,163 0,296 0,240
2 Start 0,06 0,254 0,140 0,226 0,126
2 halbe Veresterung 0,25 0,175 0,134 0,195 0,132
2 Gleichgewicht 2,11 0,104 0,137 0,185 0,149
2 halbe Destillation 2,44 0,110 0,151 0,235 0,192
2 Ende 2,78 0,112 0,166 0,291 0,242
3 Start 0,05 0,248 0,136 0,217 0,123
3 halbe Veresterung 0,25 0,184 0,134 0,196 0,128
3 Gleichgewicht 1,64 0,107 0,133 0,179 0,139
3 halbe Destillation 1,97 0,104 0,146 0,228 0,182
3 Ende 2,08 0,105 0,161 0,285 0,230
4 Start 0,04 0,269 0,138 0,225 0,123
4 halbe Veresterung 0,32 0,180 0,136 0,197 0,130
4 Gleichgewicht 2,31 0,112 0,141 0,189 0,149
4 halbe Destillation 2,64 0,112 0,158 0,254 0,205
4 Ende 2,88 0,112 0,168 0,297 0,244
5 Start 0,05 0,259 0,138 0,223 0,123
5 halbe Veresterung 0,27 0,180 0,133 0,196 0,125
5 Gleichgewicht 1,30 0,106 0,127 0,175 0,128
5 halbe Destillation 1,70 0,096 0,141 0,226 0,175
5 Ende 1,97 0,097 0,157 0,286 0,228
6 Start 0,03 0,265 0,140 0,226 0,123
6 halbe Veresterung 0,30 0,174 0,133 0,194 0,128
6 Gleichgewicht 1,97 0,099 0,129 0,175 0,134
6 halbe Destillation 2,22 0,099 0,144 0,233 0,184
6 Ende 2,52 0,100 0,159 0,289 0,234
Anhang 125
Abbildung 66: Signalverläufe der Kanäle 1 und 3 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und
Destillation.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Sen
sor
Exti
nkt
ion
Kan
al 1
Versuchsdauer / h
Kanal 1 Lauf 1
Kanal 1 Lauf 2
Kanal 1 Lauf 3
Kanal 1 Lauf 4
Kanal 1 Lauf 5
Kanal 1 Lauf 6
Kanal 1 Lauf 7
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Sen
sor
Exti
nkt
ion
Kan
al 3
Versuchsdauer / h
Kanal 3 Lauf 1
Kanal 3 Lauf 2
Kanal 3 Lauf 3
Kanal 3 Lauf 4
Kanal 3 Lauf 5
Kanal 3 Lauf 6
Kanal 3 Lauf 7
Anhang 126
Abbildung 67: Signalverläufe der Kanäle 2 und 4 des MIR-ATR-Sensors während der Veresterung und
Destillation.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Sen
sor
Exti
nkt
ion
Kan
al 2
Versuchsdauer / h
Kanal 2 Lauf 1
Kanal 2 Lauf 2
Kanal 2 Lauf 3
Kanal 2 Lauf 4
Kanal 2 Lauf 5
Kanal 2 Lauf 6
Kanal 2 Lauf 7
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 2,9
Sen
sor
Exti
nkt
ion
Kan
al 4
Versuchsdauer / h
Kanal 4 Lauf 1
Kanal 4 Lauf 2
Kanal 4 Lauf 3
Kanal 4 Lauf 4
Kanal 4 Lauf 5
Kanal 4 Lauf 6
Kanal 4 Lauf 7
Anhang 127
Abbildung 68: Konzentrationsverläufe der Edukte Ethanol und Ameisensäure während der Veresterung und
Destillation. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren.
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Kon
zen
trat
ion
Eth
ano
l / m
ol L
-1
Versuchsdauer / h
c(ET) Lauf 1
c(ET) Lauf 2
c(ET) Lauf 3
c(ET) Lauf 4
c(ET) Lauf 5
c(ET) Lauf 6
c(ET) Lauf 7
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Kon
zen
trat
ion
Am
eis
ensä
ure
/ m
ol L
-1
Versuchsdauer / h
c(AS) Lauf 1
c(AS) Lauf 2
c(AS) Lauf 3
c(AS) Lauf 4
c(AS) Lauf 5
c(AS) Lauf 6
c(AS) Lauf 7
Anhang 128
Abbildung 69: Konzentrationsverläufe der Produkte Wasser und Ethylformtiat während der Veresterung und
Destillation. Analyse mittels chemometrischer Auswertung von MIR-ATR-Spektren.
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Ko
nze
ntr
atio
n W
asse
r /
mo
l L-1
Versuchsdauer / h
c(W) Lauf 1
c(W) Lauf 2
c(W) Lauf 3
c(W) Lauf 4
c(W) Lauf 5
c(W) Lauf 6
c(W) Lauf 7
0
3
6
9
12
15
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Kon
zen
trat
ion
Eth
ylfo
rmia
t /
mo
l L-1
Versuchsdauer / h
c(EF) Lauf 1
c(EF) Lauf 2
c(EF) Lauf 3
c(EF) Lauf 4
c(EF) Lauf 5
c(EF) Lauf 6
c(EF) Lauf 7
Anhang 129
D Anhang zur Hefefermentation
Tabelle 25: Vollsynthetisches Fermentationsmedium für aerobe Hefezucht, nach (SCHATZMANN, HERBERT, 1975).
Schatzmann Vorliegende Arbeit
Stoff Konzentration mg g-1 Glucose
Stoff Konzentration mg g-1 Glucose
Glucose 1000 Glucosemonohydrat 1100
(NH4)2SO4 200 NH4Cl 162
(NH4)2HPO4 64
Wie Schatzmann KCl 30
MgSO4.7H2O 15
CaCl.4H2O 10 CaCl.2H2O 8
FeCl.6H2O 0,5
Wie Schatzmann
ZnSO4.7H2O 0,3
MnSO4.2H2O 0,6
CuSO4.5H2O 0,08
m-Inosit 2
Ca-Pentothenat 1
Vitamin B1 0,2 Entfällt
Vitamin B6 0,05 Entfällt
Biotin 0,001 Wie Schatzmann
Tabelle 26: Referenzanalytik (HPLC) und korrigierte Sensorsignale
Fermentation Nr., Datum
Dauer h
HPLC MIR-ATR-Sensor (Wasser als Bezug)
Glucose g L-1
Ethanol g L-1 F1 F2 F3 F4
- 1 -
02.10.2015
0,0 97,7 0,8 0,02203 0,05575 0,04987 0,04717
0,5 94,6 2,3 0,02187 0,05510 0,04933 0,04665
1,0 88,1 4,2 0,02183 0,05532 0,04915 0,04618
1,5 79,2 5,7 0,02172 0,05485 0,04871 0,04593
2,0 71,3 7,6 0,02174 0,05485 0,04842 0,04572
2,5 64,4 10,8 0,02159 0,05449 0,04869 0,04520
3,0 54,7 14,0 0,02151 0,05411 0,04826 0,04473
3,5 46,6 16,8 0,02135 0,05368 0,04755 0,04401
4,0 34,9 20,5 0,02110 0,05327 0,04739 0,04339
4,5 21,2 24,0 0,02103 0,05300 0,04634 0,04252
5,0 8,8 29,7 0,02078 0,05270 0,04580 0,04157
5,5 3,5 31,6 0,02072 0,05209 0,04560 0,04112
6,0 2,4 30,1 0,02068 0,05218 0,04551 0,04121
6,5 2,1 28,6 0,02063 0,05218 0,04572 0,04111
- 2 -
08.10.2015
0,0 96,1 0,9 0,02197 0,05525 0,05011 0,04592
0,5 88,6 2,4 0,02189 0,05531 0,04882 0,04544
1,0 80,3 3,9 0,02184 0,05496 0,04918 0,04522
1,5 74,1 5,8 0,02168 0,05457 0,04874 0,04480
2,0 69,4 8,7 0,02158 0,05455 0,04852 0,04477
2,5 61,9 11,8 0,02161 0,05402 0,04804 0,04396
Anhang 130
3,0 54,1 15,4 0,02145 0,05391 0,04788 0,04315
3,5 41,0 18,5 0,02118 0,05340 0,04713 0,04265
4,0 28,9 22,4 0,02097 0,05280 0,04652 0,04185
4,5 16,9 26,7 0,02077 0,05247 0,04645 0,04100
5,0 5,6 29,1 0,02062 0,05204 0,04585 0,04037
5,5 2,5 29,4 0,02056 0,05182 0,04565 0,04016
6,0 2,3 28,6 0,02046 0,05155 0,04546 0,03985
6,5 2,2 27,4 0,02046 0,05183 0,04572 0,03984
- 3 -
13.10.2015
0,0 102,9 0,3 0,02206 0,05534 0,05082 0,04614
0,5 93,4 2,3 0,02196 0,05524 0,05028 0,04602
1,0 84,6 4,5 0,02179 0,05500 0,05008 0,04572
1,5 75,8 5,8 0,02161 0,05456 0,04957 0,04570
2,0 67,3 8,0 0,02167 0,05449 0,04928 0,04504
2,5 60,2 11,1 0,02154 0,05438 0,04850 0,04458
3,0 51,6 13,7 0,02144 0,05379 0,04860 0,04386
3,5 42,3 18,0 0,02132 0,05331 0,04851 0,04362
4,0 27,8 21,8 0,02116 0,05288 0,04769 0,04284
4,5 14,3 25,8 0,02095 0,05237 0,04706 0,04191
5,0 3,1 28,8 0,02086 0,05194 0,04636 0,04120
5,5 2,6 29,4 0,02073 0,05183 0,04646 0,04115
6,0 2,2 28,9 0,02079 0,05185 0,04632 0,04144
6,5 2,0 27,9 0,02075 0,05194 0,04638 0,04102
- 4 -
15.10.2015
0,0 99,7 0,6 0,02189 0,05544 0,04930 0,04631
0,5 94,0 2,5 0,02170 0,05517 0,04884 0,04576
1,0 85,9 4,3 0,02158 0,05527 0,04849 0,04567
1,5 81,9 6,5 0,02155 0,05479 0,04868 0,04503
2,0 72,3 8,5 0,02126 0,05445 0,04838 0,04508
2,5 65,6 12,3 0,02122 0,05430 0,04755 0,04460
3,0 54,4 15,3 0,02108 0,05406 0,04755 0,04395
3,5 40,9 17,6 0,02111 0,05351 0,04710 0,04341
4,0 30,5 21,7 0,02089 0,05324 0,04637 0,04265
4,5 15,2 25,4 0,02074 0,05269 0,04589 0,04194
5,0 4,2 29,1 0,02064 0,05222 0,04519 0,04120
5,5 2,7 30,1 0,02053 0,05209 0,04518 0,04092
6,0 2,3 29,2 0,02059 0,05236 0,04526 0,04119
6,5 2,0 28,5 0,02053 0,05221 0,04533 0,04091
Anhang 131
Tabelle 27: Signale der simulierten Sensoren (F1 F2 F3 F4 und F2 F4 S5 S6)
Fermentation Dauer
h
Simulierter MIR-ATR-Sensor (Wasser als Bezug)
F1 F2 F3 F4 S5 S6
- 1 -
02.10.2015
0,0 0,00550 0,04793 0,05140 0,05481 0,08224 0,07597
0,5 0,00487 0,04753 0,05092 0,05411 0,08146 0,07494
1,0 0,00468 0,04732 0,05072 0,05365 0,08067 0,07374
1,5 0,00466 0,04704 0,05044 0,05308 0,07952 0,07228
2,0 0,00464 0,04698 0,05014 0,05255 0,07838 0,07064
2,5 0,00497 0,04707 0,05009 0,05219 0,07704 0,06898
3,0 0,00438 0,04626 0,04909 0,05092 0,07488 0,06626
3,5 0,00439 0,04519 0,04858 0,04975 0,07428 0,06554
4,0 0,00410 0,04499 0,04767 0,04824 0,06928 0,05985
4,5 0,00402 0,04442 0,04726 0,04716 0,06704 0,05738
5,0 0,00399 0,04405 0,04658 0,04599 0,06387 0,05386
5,5 0,00380 0,04407 0,04612 0,04549 0,06224 0,05163
6,0 0,00400 0,04431 0,04628 0,04580 0,06246 0,05198
6,5 0,00391 0,04421 0,04616 0,04559 0,06188 0,05164
- 2 -
08.10.2015
0,0 0,00467 0,04746 0,05078 0,05430 0,08206 0,07606
0,5 0,00480 0,04758 0,05083 0,05418 0,08181 0,07554
1,0 0,00485 0,04756 0,05074 0,05387 0,08128 0,07462
1,5 0,00469 0,04748 0,05047 0,05340 0,08088 0,07394
2,0 0,00478 0,04722 0,05031 0,05284 0,07958 0,07215
2,5 0,00463 0,04682 0,04985 0,05195 0,07813 0,07026
3,0 0,00468 0,04680 0,04955 0,05143 0,07692 0,06859
3,5 0,00457 0,04629 0,04905 0,05027 0,07452 0,06572
4,0 0,00436 0,04575 0,04845 0,04905 0,07180 0,06262
4,5 0,00434 0,04533 0,04798 0,04794 0,06907 0,05936
5,0 0,00413 0,04477 0,04725 0,04660 0,06616 0,05596
5,5 0,00417 0,04460 0,04722 0,04634 0,06531 0,05518
6,0 0,00413 0,04462 0,04733 0,04621 0,06449 0,05466
6,5 0,00393 0,04444 0,04717 0,04601 0,06406 0,05421
- 3 -
13.10.2015
0,0 0,00488 0,04793 0,05150 0,05492 0,08283 0,07690
0,5 0,00601 0,04897 0,05241 0,05573 0,08334 0,07700
1,0 0,00509 0,04797 0,05130 0,05428 0,08150 0,07475
1,5 0,00516 0,04789 0,05122 0,05402 0,08056 0,07352
2,0 0,00490 0,04752 0,05067 0,05304 0,07932 0,07169
2,5 0,00471 0,04709 0,05014 0,05221 0,07761 0,06968
3,0 0,00447 0,04651 0,04956 0,05108 0,07559 0,06733
3,5 0,00439 0,04610 0,04896 0,05007 0,07334 0,06439
4,0 0,00462 0,04616 0,04900 0,04953 0,07147 0,06221
4,5 0,00434 0,04553 0,04833 0,04810 0,06890 0,05909
5,0 0,00429 0,04509 0,04775 0,04717 0,06661 0,05643
5,5 0,00421 0,04487 0,04757 0,04669 0,06508 0,05488
6,0 0,00422 0,04508 0,04739 0,04672 0,06492 0,05500
6,5 0,00418 0,04498 0,04738 0,04645 0,06393 0,05418
- 4 - 0,0 0,00487 0,04812 0,05151 0,05503 0,08279 0,07658
Anhang 132
15.10.2015
0,5 0,00496 0,04837 0,05150 0,05486 0,08218 0,07590
1,0 0,00488 0,04807 0,05118 0,05429 0,08120 0,07461
1,5 0,00492 0,04790 0,05098 0,05372 0,08039 0,07341
2,0 0,00496 0,04772 0,05072 0,05318 0,07920 0,07186
2,5 0,00488 0,04741 0,05043 0,05239 0,07787 0,07003
3,0 0,00488 0,04716 0,05005 0,05165 0,07610 0,06776
3,5 0,00476 0,04687 0,04962 0,05070 0,07416 0,06539
4,0 0,00469 0,04637 0,04910 0,04955 0,07172 0,06248
4,5 0,00454 0,04583 0,04855 0,04837 0,06896 0,05914
5,0 0,00443 0,04546 0,04798 0,04723 0,06622 0,05609
5,5 0,00428 0,04525 0,04775 0,04689 0,06548 0,05541
6,0 0,00424 0,04508 0,04773 0,04679 0,06512 0,05522
6,5 0,00427 0,04524 0,04773 0,04680 0,06483 0,05513