En qué consiste el proceso de elución de gradientes y cuáles son sus ventajas.

Cómo optimizar una separación de gradiente.

Consideraciones prácticas para establecer separaciones de gradientes.

2

Resolución defectuosa de los picos

que eluyen.

Aumento del ancho de pico y

descenso de la altura de pico en

los picos que eluyen más tarde.

Tiempos largos de análisis debido

a valores grandes de k'.

Contaminación de columnas con

componentes de fuerte retención.

3

.

La composición de la fase móvilcambia durante la separación.

Ventajas

◦ Resolución mejorada

◦ Mayor detección

◦ Capacidad para separarmuestras complejas

◦ Tiempos de análisis máscortos

◦ Disminución del deterioro de la columna debido a los componentes retenidos con fuerza

Otros usos

◦ Limpieza de la columna

◦ Análisis de exploración en el desarrollo de métodos

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Características del gradiente

Se utilizan dos disolventes para

desarrollar el gradiente

La fuerza de elución aumenta con el

tiempo

Tomar en cuenta la forma del gradiente

Tener en cuenta la pendiente del

gradiente

5

1

2 3

4

5

6

7 8

0 2 4 8 10 12 14 16 18 206

Tiempo (min.)

Columna: ZORBAX 300SB-C3

5 µm, 4,6 x 150 mm

Gradiente: 15-35% B en 19 min.

Fase móvil: A: 95:5 H2O:ACN

con 0,1% de TFA

B: 5:95 H2O:ACN

con 0,085% de TFA

1. Leucina Encefalina

2. Angiotensina

3. RNasa A

4. Insulina

5. Citocromo C

6. Lisozima

7. Mioglobina

8. Anihidrasa carbónica

6

% O

rg

0

25

50

75

100

0 10 20 30

Tiempo (min)

k'

Aumento del % de modificador

orgánico

Cambio de partición a fase móvil

Aumento de la velocidad del

compuesto

Se tendrá que determinar lo siguiente:

Disolventes orgánicos

Composición inicial Tiempo del gradiente Inclinación del gradiente

Forma del gradiente

Velocidad de flujo Longitud de la columna Tiempo de reequilibrio de la

columna

7

5%

Orgánico

100%

Orgánico

Comenzar con un análisis de exploración - gradiente largo

y poco profundo

8

100% B

100% B0% B

0% B

tG = 10

tG = 5

0 10 20 30 40min.

100% B

100% B

0% B

0% B

tG = 40

tG = 20

0 10

Muy pendiente

Poco profundo

9

%B

tiempo

Lineal Escalonado

Cóncavo Convexo

10

Gradiente lineal

Gradiente lineal

Gradiente lineal

11

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (min)

5%/min

1 ml/min

5%/min

2,5 ml/min

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16

4,6 x 50 mm

1. GLY-TYR

2. VAL-TYR-VAL

3. [GLU]-ß FRAGMENTO

AMILOIDE DE PROTEINA 1-16

4. [TYR8 ] BRADIQUININA

5. MET-ENK

6. LEU-ENK

7. ANGIOTENSINA II

8. KINETENSINA

9. RNASA

10. INS (EQUINO)

4,6 x 150 mm

12

3

4

5 67

8 9 10

min.

k* = 2,5 k* = 2,6

k* = 4,5

k* = 5,9

0 161284

300SB-C8, 3,5 µm Gradiente: 2-75% B en 30 min.

Fase móvil: A= 5:95, ACN:H2O, 0,1% TFA

B= 95:5, ACN:H2O, 0,085% TFA

Velocidad de flujo: 1 ml / min.

Inyección: 10 µl, 2,6 µg cada uno

Temp: 35 °C

UV: 215 nm

Separación máxima en un espacio de tiempo permitido:

Espacio de tiempo corto = columna cortay alta velocidad de flujo

Espacio de tiempo largo = columna largay velocidad de flujo normal

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Volumen de espera = volumen desde la formación del gradiente hasta la cabeza de la columna.

Si se aumenta la concentración inicial, se reduce el tiempo de separación, pero estohace que la separación dependa más del instrumento, debido al volumen de espera y la etapa isocrática que produce antes de que se lleve a cabo el gradiente.

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Volumen externo

a la columna

{Volumen de

espera

Fase móvil Dispositivo

de datos

Detector

Columna

Inyección de la muestra

Bomba

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Los disolventes deben ser

puros; de otro modo, se

producirán picos fantasmas.

Hay que cerciorarse de que el

tampón es soluble en la

composición final de la fase

móvil del gradiente.

Es necesario dejar pasar un

tiempo para que la columna

se vuelva a acondicionar

entre análisis.

Picos fantasma

0% MeOH 100%

La elución de gradientes podrá no resultar indicada para:

• Aplicaciones que utilicen aditivos de fuerte retención

• Aplicaciones de parejas de iones

• Cromatografía de líquidos de fase normal con sílice pura

Análisis en blanco que produce picos

fantasmas debido a la impureza del

agua.