en klinisk studie av analysen csv- spektrofotometrispektrofotometri en jÄmfÖrelse av glas- och...
TRANSCRIPT
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö högskola 15 hp Hälsa och samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet 205 06 Malmö Institutionen för biomedicinsk vetenskap 2016
EN KLINISK STUDIE AV
ANALYSEN CSV-
SPEKTROFOTOMETRI
EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA
JONATAN CARLANDER
1
EN KLINISK STUDIE AV
ANALYSEN CSV-
SPEKTROFOTOMETRI
EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA
JONATAN CARLANDER Carlander, J. En klinisk studie av CSV-spektrofotometri. Materialjämförelse
mellan olika kyvetter samt en hållbarhetsstudie för cerebrospinalprover.
Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö
högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för biomedicinsk
vetenskap, 2016.
En subaraknoidalblödning (SAB) orsakas av ruptuerade aneurysmer mellan den
mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Symptomen för SAB är
allvarlig spontan huvudvärk, stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och
svimning. Vid erhållna symptom görs en datortomografi (CT) av hjärnan för
påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av fallen påvisar CT blod om
undersökning görs inom 12 timmar från uppvisat symtom. Sannolikheten att
påvisa blod med CT minskar dock med tiden. Efter en vecka kan blod påvisas i
drygt 50 % av fallen. Vid symptom för en SAB men där CT inte påvisar blod görs
en lumbalpunktion för analys av cerebrospinalvätska (CSV). Provtagning bör ske
minst 12 timmar efter uppvisat symptom för bilirubin ska ha hunnit bildats från
oxihemoglobin via enzymatiska reaktioner. Spektrofotometri används vid 415 nm
för detektion av oxihemoglobin och vid 476 nm för detektion av bilirubin. Denna
studie kommer undersöka huruvida det finns någon skillnad i uppmätt absorbans
vid 415 nm respektive 476 nm mellan glas- och plastkyvetter samt undersöka hur
ett dygns extra förvaring av CSV-prover påverkar absorbansen vid 476 nm.
Resultatet för 20 CSV-prover visade på att det inte fanns någon statistiskt
signifikant skillnad mellan glas- och plastkyvetter (p=0,825 för 476 nm, p=0,632
för 415 nm) samt att absorbansen för 9 CSV-prover signifikant förändrades vid
476 nm efter ett dygns extra förvaring (p=0,01).
Nyckelord: Bilirubin, Cerebrospinalvätska, Kyvett, Spektrofotometri,
Subaraknoidalblödning.
2
A CLINICAL STUDY OF THE
ANALYSIS CSF-
SPECTROPHOTOMETRY
A COMPARISION BETWEEN GLASS AND PLASTIC CUVETTES FOR SPECTROPHOTOMETRIC MESURMENT OF BILIRUBIN AND DEOXYHEMOGLOBIN IN CEREBRALSPINAL FLUID JONATAN CARLANDER
Carlander, J. A clinical study of CSF-spectrophotometry. Material comparison
between different cuvettes and a durability analysis of cerebrospinal samples.
Degree project in biomedical science 15 credits. Malmö University: Faculty of
health and society, Department of biomedical science, 2016.
A subarachnoid haemorrhage (SAH) is caused by ruptured aneurysms between the
soft meninges and arachnoid (arachnoid). Symptoms of an SAH is severe
spontaneous headaches, stiff neck, vomiting, confusion and fainting. A computed
tomography (CT) of the brain is used, on patients sustaining symptoms, to detect
blood in the subarachnoid space. CT detects blood in 98% of the cases if
examination is made within 12 hours from the shown symptoms. However, the
probability of detecting blood with CT decreases with time. After a week, only 50
% of the CT-scans identifies blood. If patients suffers from typical symptoms but
no detection of blood using CT-scan, a lumbar puncture is performed to analyse
the cerebrospinal fluid (CSF). Sampling should be made at least 12 hours after
presented symptoms because of the time-dependent creation of bilirubin from
oxyhemoglobin via enzymatic reactions. Spectrophotometry is used in the
wavelengths 415 nm for the detection of oxyhemoglobin and at 476 nm for
detection of bilirubin. This study will examine whether there is any difference in
the absorbance measured at 415 nm and 476 nm between glass-and plastic
cuvettes as well as examine how 24 hours of extra storage of samples affect the
absorbance at 476 nm. The result for 20 CSF-samples showed that there was no
statistically significant difference between the glass and plastic cuvettes (p =
0,825 of 476 nm, p = 0,632 for 415 nm), and absorbance for 9 CSF-samples
significantly changed at 476 nm after 24 hours of extra storage (p = 0.01).
Keywords: Bilirubin, Cerebrospinal fluid, Cuvettes, Spectrophotometry
Subarachnoid Haemorrhage.
3
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
INTRODUKTION .............................................................................................. 4
Cerebrospinalvätska (CSV) .............................................................................. 4
Subaraknoidalblödning (SAB).......................................................................... 4
Bilirubin .............................................................................................................. 5
Cellräkning av Erytrocyter i CSV .................................................................... 5
Spektrofotometrisk analys av CSV .................................................................. 5
Syfte ..................................................................................................................... 6
MATERIAL OCH METOD .............................................................................. 6
Urval och provhantering ................................................................................... 6
Etisk bedömning ................................................................................................ 7
Spektrofotometrisk analys ................................................................................ 7
Bearbetning av data ........................................................................................... 7
RESULTAT .......................................................................................................... 7
Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter ....................................................... 8
Hållbarhetsstudie ............................................................................................... 9
DISKUSSION ..................................................................................................... 9
Metoddiskussion ................................................................................................. 9
Resultatdiskussion ........................................................................................... 10
KONKLUSION ................................................................................................. 11
REFERENSER .................................................................................................. 13
4
INTRODUKTION
Cerebrospinalvätska (CSV)
I hjärnans ventriklar, kraniala- och subaraknoidala områden finns
cerebrospinalvätska, likvor, som omsluter hjärnan och ryggmärgen (Figur 1).
Vätskan, som är klar och färglös, bildas huvudsakligen av organet plexus
choroideus i hjärnans laterala ventriklar [1].
Figur 1: Anatomisk bild över hjärnan och det subaraknoidala området samt
plexus choroideus [2].
En mindre mängd CSV secerneras från ventriklarnas ependymala ytor,
interstitialvätskan, kärlnystan och hjärnparenkymet, i vilken det sker en filtration
av plasman likt den filtration som sker i glomeruli i njurarna.
CSVs huvuduppgifter är att agera som stötdämpare och skydd för hjärnan och
ryggmärgen samt eliminera restprodukter från hjärnans metabolism, t. ex
koldioxid och laktat. CSV har även en essentiell roll i homeostasen av cerebral
interstitialvätska genom att reglera elektrolytbalansen, transportera runt aktiva
molekyler och eliminera kataboliter [1, 3-4]. Subaraknoidalblödning (SAB)
Vid en subaraknoidalblödning är orsaken ruptuerade artärbråck (aneurysmer)
mellan den mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Enligt
definitionen är subaraknoidalblödning en hjärnblödning (hemoragi eller
hematom), vilket kan ge strokeliknande symptom [5]. Ett av tjugo strokefall beror
på blödning till subaraknoidalrummet. SAB är en skada som har liknande följder
som en hjärninfarkt, som orsakas intracerebral blödning eller emboli [6].
Blödningen kan inträffa i olika åldrar, med en dödlig utgång i 30-70 % av fallen.
De typiska symtomen brukar vara allvarlig huvudvärk som uppkommer plötsligt,
stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och förlust av medvetande. Riskfaktorer
för SAB är hypertoni, rökning och alkoholkonsumtion. Dessa faktorer kan dubbla
risken för en SAB. I två av tre fall föreligger riskfaktorerna som en del av
patientens anamnes medan genetiska faktorer enbart förklarar ett av tio fall [7-8].
Patienter som inkommer med symptom genomgår en skiktröntgen av hjärnan
datortomografi (CT), för påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av
fallen där patienter haft en subaraknoidalblödning påvisar en CT blod om
undersökningen görs inom 12 timmar från det att patienten uppvisat symptom [9].
Dock minskar sannolikheten att påvisa blod med tiden och efter drygt en veckas
tid är det enbart 50 % av fallen där påvisning av blod kan ske. För de patienter
som erhåller symptom i vad som skulle kunna vara en subaraknoidalblödning men
5
att CT visar negativt resultat tas en lumbalpunktion för analys av CSV. Vid
lumbalpunktion förs en nål in mellan spinalutskotten L4/L5 eller L3/L4. Ibland
kan en stickblödning förekomma vid provtagning, vilket betyder att det uppstått
en kärlskada orsakad av nålen. Spektrofotometrisk analys av CSV ingår som
rutinanalys vid utredning av SAB eftersom den kan ge värdefull information för
att skilja blod i CSV-provet från stickblödning från provtagningen eller från en
SAB. Om CSV-provet centrifugeras inom 30 min från provtagningen och
supernatanten avskiljs elimineras förekomsten av hemoglobin från en
stickblödning, eftersom erytocyterna då inte har hunnit att hemolyseras [1, 3-8].
Bilirubin
Provtagning bör ske tidigast 12 timmar efter att patient uppvisat karaktäristiska
symptom. Efter 6-12 timmar bildas bilirubin av oxihemoglobin. Oxihemoglobin
bryts ned via enzymatiska reaktioner via makrofager till bilirubin. Vid SAB ses
således en ökning av bilirubin i CSV. Vid stickblödning ses dock ingen ökning av
bilirubin eftersom nedbrytningen av hemoglobin endast sker in vivo. Därför är det
viktigt att provtagningen inte sker tidigare än 12 timmar efter att patienten
uppvisat karakteristika symtom för en SAB.
CSV kan efter provtagning inspekteras visuellt för en karaktäristisk gul-orange
färg (xantochromia = grekiska för gul färg). Visuell analys anses dock vara
mindre känslig metod än spektrofotometrisk analys [9-10]. Ökad
bilirubinkoncentration i CSV kan även detekteras vid i blodet vid skada på blod-
hjärnbarriären då det föreligger ökad bilirubinkoncentration i blodet [9-11, 13].
Cellräkning av Erytrocyter i CSV
Erytrocyter finns normalt inte närvarande i CSV. Förekomst av erytrocyter kan
bero på intrakraniell blödning, vanligen subaraknoidalblödning. Cellräkning av
erytrocyter i CSV är en del i utredningen av SAB, men kan inte enbart användas
som ett underlag för att bekräfta eller utesluta SAB. I en studie av Perry et al [12]
beskrivs det att kärlskador inträffar i 10-30% av lumbalpunktioner. Studien tar
även upp en alternativ metod för utredning av SAB genom att via cellräkning av
erytrocyter kunna utesluta SAB om antalet erytrocyter är mindre än 2000*106/L
och ingen xantochromi är närvarande i CSV [9-10, 12].
Spektrofotometrisk analys av CSV
Vid den spektrofotometriska analysen mäts CSVs absorption av ljus vid
våglängder mellan 350-600 nm. Oxihemoglobin har en absorptionstopp vid 415
nm och bilirubin har en absorptionstopp vid 455 nm. Enligt reviderade brittiska
riktlinjer [11] mäts bilirubin dock vid 476 nm istället för 455 nm för att minska
eventuellt bidrag från oxihemoglobin. Enligt riktlinjerna som Region Skåne följer
används Chalmers metod [11] där en baslinje ritas mellan två punkter på kurvan i
våglängdsområdet 350-600 nm. Den första punkten är lokaliserad mellan 350-400
nm, beroende på vilket område som erhåller lägst absorbans. Punkt två är
lokaliserad mellan 430-530 nm på samma premisser som punkt ett. Vid
våglängderna 415 nm respektive 476 nm räknas nettoabsorbansen ut genom att
baslinjen subtraheras från bruttoabsorbansen för 415 nm respektive 476 nm (se
figur 2). Absorbansen beräknad vid 415 nm kallas Net oxyhaemoglobin
absorbance, NOA. Absorbansen vid 476 nm kallas Net bilirubin absorbance,
NBA, [10-11, 13].
6
Figur 2: Spektrofotometrisk analys av CSV i området 350-600 nm. Net
oxyhaemoglobin absorbance (NOA) och Net bilirubin absorbance (NBA) mäts i
absorbans (A) vid 415 nm respektive 476 nm. Hemoglobin (Hb) detekteras vid
415 nm [14].
Det är främst närvaron av bilirubin som är intressant för att skilja en SAB från
stickblödning. Stickblödning kan vid absorbansmätning ge en topp vid 415 nm
men ingen topp kan detekteras vid 476 nm. CSV-prover som tas vid misstänkt
SAB skall alltid ljusskyddas, helst skall folie lindas runt om provröret. Detta på
grund av att bilirubin är ljuskänsligt mot UV-strålarna i vanligt dagsljus som kan
bryta ned bilirubinet och orsaka falskt negativa resultat [10-11, 13].
Anledningen till att plast jämfördes mot glas var för att glaskyvetten är
rekommenderad att använda. Plastkyvetten är däremot lättare att använda,
tidsmässigt sparar den tid då det inte sker någon tvätt mellan analyser den och
risken för carry over-effekter minskar, vilket är när en volym från ett tidigare
CSV-prov är kvar i glaskyvetten på grund av otillräcklig tvätt. Detta kan ge
störningar av absorbansnivåer vid mätning av andra CSV-prover. Syfte
Syftet med undersökningen är att avgöra huruvida det finns någon signifikant
skillnad i uppmätta absorbansenheter (AU), vid våglängderna 415 nm respektive
476 nm, beroende på om användandet av glas- eller plastkyvetter samt att avgöra
huruvida ett extra dygns förvaring av CSV påverkar absorbansen vid 476 nm.
MATERIAL OCH METOD
I denna studie undersöktes huruvida det fanns skillnader i uppmätt absorbans, AU,
beroende på kyvettmaterialet samt vilken inverkan ett extra dygns förvaring av
CSV-prover har på absorbansen vid 476 nm.
Urval och provhantering
Provmaterialet bestod av 29 st CSV-prover som samlats, oberoende av patientens
anamnes eller kön, kontinuerligt under vecka 5-7 2016 på Klinisk kemi, Skånes
universitetssjukhus Lund.
CSV-provernas provtagningstid lagrades i ett datorsystem som Klinisk Kemi
Lund använder. Genom att utnyttja provrörets unika kombinationskod kunde
provtagningstiden erhållas. Enbart provtagningstid och CSV-provets autentiska
kombinationskod sparades. Inga personuppgifter behandlades i studien.
7
Urvalet av prover bestämdes efter hur stort utbud det fanns av färska prover samt
om de erhöll en volym som översteg 800 μl, då minsta provvolym var 800 μl.
CSV-proverna erhölls centrifugerade. Provmaterialet delades in i två grupper. En
grupp med 20 CSV-prover som användes i jämförelsen mellan glas- och
plastkyvetter och en grupp med 9 prover som utnyttjades i hållbarhetsstudien. I
jämförelsen mellan plast- och glaskyvetter inkluderades alla prov som hade en
uppmätt absorbans vid 415 nm på som mest 100 mAU då detta bedömdes vara
kliniskt relevant nivå. Resterande prover inkluderades i hållbarhetsstudien.
Etisk bedömning
CSV-prover samlats oberoende av patients anamnes, kön eller ålder samt att inga
personuppgifter sparades eller utnyttjades i undersökningen.
Spektrofotometrisk analys
Absorbansmätningarna utfördes i våglängdsområdet 350-600 nm med
spektrofotometern Aglient Cary 60 (Aglient Technologies, USA)CSV-Proverna
togs ut ur dess ljusskyddade behållare, som stått förvarad i kyl.
Alla 20 CSV-proverna analyserades först i glaskyvett (Hellma, Tyskland) och
därefter i plastkyvett (Sarstedt, Tyskland). Som blank användes NaCl, med en
koncentration 9 mg/ml (Fresenius Kabi, Norge). Vid absorbansmätning i
glaskyvett användes samma kyvett för alla mätningar, kyvetten tvättades med
ddH2O mellan varje mätning. Efter att alla prover analyserats en gång i glaskyvett
genomgick de samma analysprincip fast i plastkyvett där varje prov analyserades i
separat plastkyvett.
För de 9 prover som skulle genomgå en hållbarhetsanalys sparades de uppmätta
absorbansvärdena efter mätning i plastkyvett som tidpunkt t1. Därefter fortsatte
hållbarhetsanalysen då de 9 CSV-proverna analyserades i plastkyvett, efter
blankning, 24±2 timmar efter analys vid tidpunkten t1. Uppmätt absorbans
sparades som tidpunkt t2.
Bearbetning av data
Rådata från analysmomentet bearbetades i Microsoft Excel 2013 (Microsoft
Corporation, Redmond, Washington, USA). Boxplot (låddiagram där median,
kvartiler och outliers visas)- och Bland-Altman diagram (B & A-diagram, där
differens plottas mot medelvärde för att ta reda på mätfelet (bias) och påvisa
trender mellan olika variabler) gjordes i SPSS Statistics version 22 (IBM
Corporation, New York, USA). De olika gruppernas absorbansspridning
redovisades i form av Boxplot-diagram, en plot för plastkyvetter och en för
glaskyvetter. En del av jämförelsestudien mellan plast- och glaskyvetter för
respektive grupp visas med B & A-diagram diagram för att åskådliggöra
eventuella differenser mellan metoderna. Slutligen gjordes ett statistiskt One
sample t-test för jämförelse av medelvärden vid respektive våglängd. Även i
hållbarhetsstudien presenteras resultatet i B & A-diagram samt efterföljande t-test.
RESULTAT
Resultatet för undersökningen presenteras nedan i en jämförelse mellan glas- och
plastkyvetter vid 476 nm respektive 415 nm samt hållbarhetsstudien vid 476 nm.
8
Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter
Resultatet grundar sig på 20 CSV-prover som analyserats med spektrofotometrisk
analys. Resultatet presenteras i en visualisering av provernas olika
absorbansspridning, i form av Boxplot-diagram samt B & A-diagram, vid 415 nm
respektive 476 nm. Dessutom presenteras ett statistiskt t-test för
medelabsorbansdata vid 415 nm respektive 476 nm.
Figur 3: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 476 nm för glas- respektive
plastkyvett (N=20) Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram diagram där differensen
plast-glas plottas mot medelvärdet plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0.
Medelabsorbansen vid 476 nm (se figur 3A) var vid mätning med plastkyvett
något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0077 AU respektive 0,0075 AU)
men skillnaden var inte statistisk signifikant vid t-test (medeldifferens 0,00023
AU (se figur 3B), p=0,825).
Figur 4: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 415 nm för glas- respektive
plastkyvett (N=20). Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram där differensen mellan
plast och glas plottas mot medelvärdet för plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0.
Medelabsorbansen vid 415 nm (se figur 4A) var vid mätning med plastkyvetten
något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0150 AU respektive 0,0145 AU)
men skillnaden var inte statistiskt signifikant vid t-test (medeldifferensen 0,00051
AU (se figur 4B), p=0,632).
3A 3B
4A 4B
9
Hållbarhetsstudie
Hållbarhetsstudien presenteras i ett B & A-diagram och ett statistiskt t-test av
medelabsorbansen vid 476 nm beräknas sedan.
Figur 5: Hållbarhetsstudien presenterad i form av ett B & A-diagram (N=9), där differensen är
uträknad genom absorbansvärden vid tidpunkten t2 – absorbansvärden vid tidpunkten t1.
Absorbansvärdena uppmättes vid 476 nm. Skillnaden mellan t1 och t2 är att t2 är analyserade
24±2 timmar efter t1. Samtliga prover är analyserade i plastkyvett.
Medelabsorbansen vid 476 nm var vid tidpunkten t2 högre än vid tidpunkten t1
(0,336 AU respektive 0,328 AU). Skillnaden var statistiskt signifikant vid t-test
(medeldifferensen = 0,0079 AU (se figur 5), p<0,05).
DISKUSSION
Diskussionen delas in i en separat metoddiskussion där arbetssättet och
handhavandet av CSV-prover utvärderas samt en resultatdiskussion bestående av
en del för jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter samt en del tillhörande
hållbarhetsstudien.
Metoddiskussion
Proverna analyserades i två olika analysflöden, i serie och separat. Analysflödet i
serie inleddes med att ett blankprov analyserades i glaskyvett och en påföljande
tvättning av kyvetten i ddH2O. Efter tvättningen kördes första provet och därefter
tvättades kyvetten igen innan analys av nästa prov. Flödet byggde på tanken att
exempelvis 5 prover skulle körts i ordning först i en glaskyvett och sedan
analyserats i plastkyvett. Tanken var att det inte skulle vara för stora tidsintervall
mellan de olika analyserna. Provrören innehållande CSV stod ljusskyddat i en
behållare och togs ut när de skulle köras. Eventuell störning av omgivningens ljus
skulle ha varit då CSV-prov befann sig i kyvetten stående på bänken innan analys,
vilket inte borde varit mer än någon minut innan det pipetterades ner i dess
provrör igen. Endast ett fåtal prover analyserades via ett separat analysflöde. Det
separata analysflödet var tillskillnad från analys i serie en metod där varje prov
först genomgick analys i glaskyvett, efter blankning och tvätt av kyvett, och sedan
blankning samt analys i plastkyvett. Tyvärr fanns det inte tillräckligt med
underlag för en jämförelse mellan de två arbetsflödena för att se en eventuell
signifikant skillnad.
Under praktiska utförandet upptäcktes det att 800 μl var den minsta volym som
behövdes i kyvetten för att spektrofotometern skulle kunna analysera provet
tillförlitligt. Detta bestämdes genom att köra en känd kontroll vid olika volymer
för att se vilken volym som gav utslag. En annan sak som upptäcktes var att
10
instrumentet Agilent Cary 60 inte mäter linjärt vid absorbanser som överstiger ca
2300 mAbs, vilket gör att överstigna värden inte är pålitliga då de inte är linjärt
mätta.
Resultatdiskussion
Figur 3A visar distributionen för de 20 olika provernas absorbansvärde vid 476
nm. Medelabsorbansen för glas var 7,5 mAU och för plast 7,7 mAU (median 7,6
mAU resp. 5,7 mAU). Skillnaden i medelabsorbans (bias) var inte statistisk
signifikant (p=0,825) vilket betyder att slutsatsen inte kan vara att analys med en
plastkyvett generellt ger högre absorbansvärden än analys med glaskyvett. Hade
statistisk signifikans uppnåtts hade en skillnad på bråkdelar av en
milliabsorbansenhet ändå inte tolkats som kliniskt relevant. Spridningen av värden
för glas- respektive plastkyvetter är relativt lik. I figur 4A syns det att
absorbansvärdena har en liknande distribution. Medelabsorbansen för glas var
14,5 mAU och för plast 15,0 mAU (median 12,7 mAU resp. 11,8 mAU). Det
kunde inte heller påvisas någon signifikant skillnad i medelabsorbans vid 415 nm.
Trots uppmätta minimala skillnader mellan glas- och plastkyvetter blir slutsatsen
ändå att absorbansmätning vid 415 nm respektive 476 nm är oberoende av
kyvettmaterialet.
För jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter plottades två olika variabler mot
varandra, den ena var differensen mellan glas- och plastkyvetter mot respektive
provs medelvärde. Absorbansdifferensen mellan glas- och plastkyvetter för de 20
proverna vid 476 nm respektive 415 nm beräknades genom att subtrahera
respektive provs absorbansdata för plast med respektive provs absorbansdata för
glas, då glaskyvetten är referensmaterialet. Differensen sattes mot medelvärdet för
respektive provs absorbansdata för glas- och plastkyvetten i ett B & A-diagram
[15].
Som ett resultat av den uträknade differensen plottad mot medelvärdet är den
första tolkningen av B & A-diagrammet hur stort bias, mätfelet, är. Anledningen
till att bias bestäms är på grund av att alla variabler indikerar alltid ett visst fel vid
mätningar. Bias, som är detsamma som medeldifferensen, för B & A-diagrammet
vid 476 nm var 0,2 mAU. Vid 415 nm låg bias på 0,5 mAU. Bias tolkas i
respektive fall som kliniskt accepterat mätfel. Bedömningen av huruvida något är
klinisk accepterat eller inte bestäms av någon som är medicinskt ansvarig. Även
om medeldifferensen mellan glas-respektive plastkyvetter är låg finns det enskilda
prover som uppvisat differenser som ligger runt 10 mAU, både vid 415 nm och
476 nm. Anledningen till detta tycks inte vara systematiskt relaterad till
kyvettmaterialet, utan är snarare slumpmässiga resultat (imprecision). Vad gäller
variationen i respektive diagram tycks det inte vara någon trend, differensen tycks
varken öka eller minska vid högre nivå utan sprids oberoende av nivå.
Det fanns inga signifikanta skillnader mellan glas- och plastkyvetter vid
absorbansmätning av bilirubin (vid 476 nm) och oxihemoglobin (vid 415 nm) i
CSV. Detta eftersom p–värdet var större än 0,05, vilket gjorde att nollhypotesen
inte kunde förkastas. Nollhypotesen formulerades till att ingen skillnad i
medelabsorbans mellan glas- och plastkyvetter skulle föreligga. Vad som skall
finnas i åtanke är att p-värdet för 476 nm respektive 415 nm (0,825 respektive
0,632) var långt över 0,05, vilket innebär att risken är väldigt stor för fel om vid
påstående om att det finns en skillnad mellan glas- och plastkyvetter. Det ideala
11
hade varit ett p-värde som i respektive fall närmat sig 0,05 för att kunna erhålla en
stor statistisk säkerhet.
Följaktligen hade en eventuell spekulering kunnat göras om hur spridningen av
uppmätt absorbans sett ut ifall urvalet av prover varit större. I studien användes
som sagt 20 CSV-prover men hade urvalet istället legat på 100 eller 500 CSV-
prover hade det vid beräknat statistiskt t-test kunnat vara möjligt uppnå statistisk
signifikans.
De 9 prover som testades i hållbarhetsanalysen vid 476 nm presenterades i B & A-
diagram där medeldifferensen, bias, var 7,9 mAU. Differensen beräknades mellan
tidpunkten t2 och tidpunkten t1 och plottades mot medelvärdet beräknat för
respektive prov vid tidpunkt t2 och t1. Differensen tycks öka ju högre
medelvärdet (nivån) är. T-test visade på att en signifikant differens (p=0,01)
mellan tidpunkterna t2 och t1 fanns. Nollhypotesen formulerades till att det inte
skulle vara någon statistisk skillnad för uppmätt absorbans mellan tidpunkt t1 och
t2. Det som dock var oväntat i sammanhanget var att 8 av 9 prover ökade i
absorbans vid tidpunkten t2, vilket var ca 24 timmar efter tidpunkten t1. Den
statistiska skillnaden visade alltså att prover analyserade vid tidpunkt t2 erhöll
högre absorbans än vid tidpunkt t1 (p=0,01).
Analys av bilirubin i CSV är tidsberoende på grund av att bilirubin bryts ned över
tiden, även ljusskyddat. Förklaring till varför istället bilirubinabsorbansen vid 476
nm ökade kunde lättare ha förklarats om fler mätningar gjorts mellan tidpunkterna
t1 och t2, även förlängt observationstiden och introducerat en ny tidpunkt för att
se den eventuella utvecklingen [16].
Slutligen inför framtida studier kan en idé vara att utföra flera mätningar av ett
CSV-prov flera gånger i respektive kyvett. Detta för att se hur pass stor
spridningen på absorbansdatan blir. Eventuellt kan ett medelvärde beräknas som
sedan jämförs i liknande diagram som presenterats ovan. För att säkerställa att det
laborativa utförandet går korrekt till kan man eventuellt använda sig av kontroller
med känd koncentration. Eftersom mätningarna utförs vid olika tidpunkter finns
möjligheten att ha kontroller för respektive mätning. Jämförelsen mellan plast-
och glaskyvetter hade kunnat byggas på genom att jämföra värdena för NOA och
NBA för respektive kyvett för att finna möjlig signifikant skillnad där. För
hållbarhetsanalysen kan det vara lämpligt att erhålla fler mätningar för att kunna
göra ett eventuellt diagram där absorbansen är på y-axeln och tiden på x-axeln.
Det hade även varit intressant att utföra en hållbarhetsstudie på fler våglängder,
t.ex. 455 nm.
KONKLUSION
Konklusionen kan initieras med att redogöra att ingen signifikant skillnad, baserat
på det resultat som erhölls, finns mellan användandet av glas- och plastkyvetter
vid utförandet av analysen CSV-spektrofotometri. Det är dock rekommenderat att
göra vidare studier med större urval av prover för att erhålla en större statistisk
säkerhet.
Glaskyvetten är ett gold-standard alternativ, ekonomisk och mer positiv ur
miljösynvinkel, dock är det någorlunda tidskrävande att konstant behöva rengöra
kyvetten efter respektive körning. Plastkyvetten har fördelen att den enbart är en
12
engångskyvett, vilket gör att analysprocessen blir mindre kostsamt ur en
tidssynpunkt. Valet mellan glas och plast är troligtvis ett subjektivt val.
För hållbarhetsstudien behövs det ytterligare undersökningar, med större urval av
CSV-prover och fler analystidpunkter. Enligt undersökningen så fanns det en
signifikant ökning (p=0,01) av bilirubin efter 24 timmars förvaring av CSV
ljusskyddat i kyl. Dock, stämmer inte resultatet med teorin, då bilirubin bör
minska över tiden.
13
REFERENSER
1. Blennow K, Zetterberg H (2012) Sjukdomar i centrala nervsystemet. I:
Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E (Red) Laurells
Klinisk kemi i praktisk medicin (9:e upplagan) Lund: Studentlitteratur, s
555-560
2. Dr. Mohamed Baranek (2012) Brain ventricular system
>http://abcradiology.blogspot.se/2012/01/brain-ventricular-system.html<
(160316)
3. L Sakka, G Coll, J Chazal. Anatomie et physiologie du liquid
cerebrospinal. Annales françaises d’Oto-rhino-laryngologie et de
Pathologie Cervico-faciale. 2011;128(6):359-66
4. Van Gijn J, Rinkel GJ E, Kerr S R. Subarachnoid haemorrhage. Lancet
2007; 369: 306-18.
5. Veronica Murray (2012) Stroke: en skrift om slaganfall och TIA
>https://www.hjart-lungfonden.se/Sjukdomar/Hjartsjukdomar/Stroke/<
(160316)
6. Johnston SC, Selvin S, Gress DR. The burden, trends, and demographics
of mortality from subarachnoid haemorrhage. Neurology 1998; 50: 1413-
18
7. Feigin VL, Rinkel GJE, Lawes CM, Algra A, Bennett D, Van Gijn J,
Anderson C S. Risk factors for subarachnoid hemorrhage: an updated
systematic review of epidemiological studies. Stroke 2005; 36:2773-80
8. Ruigrok YM, Buskens E, Rinkel GJ E. Attributable risk of common and
rare determinants of subarachnoid hemorrhage. Stroke 2001; 32: 1173-75
9. Nagy K, Skagervik I, Tumani H, Brettschnneider J, Otto M, Petzold A,
Wick M, Kühn H-J, Uhr M, Regeniter A, Kraus J, Deisenhammer F,
Lautner R, Blennow K, Zetterberg H, Mattsson N, Shaw L. Cerebrospinal
fluid analyses for the diagnosis of subarachnoid haemorrhage and
experience from a Swedish study. What method is preferable when
diagnosing a subarachnoid haemorrage? Clin Chem Lab Med 2013;
51(11): 2073-2086.
10. Chalmers AH, Kiley M. Detection of xanthochromia in cerebrospinal
fluid. Clin Chem Lab Med 1998;44:1740-2
11. Cruickshank A, Auld P, Beetham R, Burrows G, Egner W, Holbrook I,
Keir G, Lewis E, Patel D, Watson I, White P. Revised national guidelines
for analysis of cerebrospinal fluid in suspected subarachnoid haemorrhage.
Annals of Clinical Biochemistry 2008; 45: 238-244.
12. Perry J J, Alyahya B, Sivilotti LA M, Bullard J M, Émond M, Sutherland
J, Worster A, Hohl C, Lee S J, Eisenhauer A M, Paulus M, Lesiuh H,
14
Wells A G, Stiell G I. Differentiation between traumatic tap and
aneurysmal subarachnoid hemorrhage: prospective cohort study. BMJ
2015; 350: h568
13. Beetham R. CSF spectrophotometry for bilirubin – why and how? The
Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. 2009; 69:1-
7
14. Labmedicin Skåne, klinisk kemi (2016). Metodbeskrivning: CSV-
spektrofotometri
>http://www.skane.se/Upload/Webbplatser/Labmedicin/Verksamhetsomr
%C3%A5den/Klinisk%20kemi/Analyser/Skane/Csv-
Spektrofotometri.pdf< (160316)
15. Giavarina D. Understandning Bland Altman analysis. Biochemia Medica
2015;25(2):141-51
16. Foroughi M, Parikh D, Wassell J, Hatfield R. Influence of light and time
on bilirubin degradiation in CSF spectrophotometry for subarachnoid
haemorrhage. British Journal of Neurosurgery. 2010; 24(4): 401-404