embriogÉnesis somÁtica de swietenia macrophylla king

Referencias Bibliográfícas

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TESIS EN OPCION AL TITULO ACADEMICO DE

MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL

EEMMBBRRIIOOGGÉÉNNEESSIISS SSOOMMÁÁTTIICCAA DDEE SSwwiieetteenniiaa mmaaccrroopphhyyllllaa KKiinngg

EENN MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO SSEEMMIISSÓÓLLIIDDOOSS

ASPIRANTE: Ing. Raúl Collado López.

TUTOR : DrC. Raúl Barbón Rodríguez.

Santa Clara, CUBA

2006

IINNSSTTIITTUUTTOO DDEE BBIIOOTTEECCNNOOLLOOGGIIAA DDEE LLAASS LLAANNTTAASS


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Agradecimientos


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A mi tutor DrC Raúl Barbón Rodríguez mi agradecimiento especial por todos los conocimientos transferidos durante estos dos años de trabajo conjunto. A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Propagación Masiva Felipe Jiménez, Raúl Barbón, Martha Pérez, Odalys Gutiérrez y Daniel Agramante por haber contribuido a mi formación y brindado una ayuda incondicional para el desarrollo de la investigación. A la compañera Lourdes García por la rigurosa revisión del documento de tesis elaborado. A la institución por aportar todos los recursos necesarios y condiciones de trabajo para el desarrollo de la investigación. A los compañeros Nydia del Rivero, Enrrique Salas y Apolonio Valdez por su apoyo brindado en la toma de fotos para el desarrollo de la investigación. A todos los que de una forma o de otra hallan brindado su apoyo para el desarrollo de este trabajo de tesis.


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SÍNTESIS En la caoba especie agroforestal de gran importancia, la propagación por vías tradicionales

no resuelven la necesidad de material vegetal para fomentar plantaciones ya sea con el

objetivo de reforestar o para la producción comercial de madera. Se ha demostrado que

esta especie es difícil de propagar mediante el cultivo de tejidos y no se cuenta con un

sistema vía organogénesis repetible, debido básicamente a problemas de contaminación

microbiana, oxidación fenólica y muerte de los tejidos en la fase de establecimiento de los

explantes in vitro. Se hace necesario la búsqueda de un nuevo método de propagación

para dar solución a los problemas antes mencionados. La presente investigación se realizó

con el objetivo de establecer la embriogénesis somática directa e indirecta en Swietenia

macrophylla King en medios de cultivo semisólidos para lo cual se emplearon como

material inicial embriones cigóticos y secciones cotiledonales. Los resultados demostraron

que en un medio de cultivo compuesto por las sales MS con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0

mg.L-1 de kinetina se logra el desarrollo de la embriogénesis somática directa a partir de

embriones cigóticos inmaduros. En el desarrollo de los embriones somáticos en etapa

globular, con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP se obtienen porcentajes de embriones somáticos en

etapas de torpedo y cotiledonal (7.4 y 91.7 %) superiores al resto de los tratamientos. Los

mayores porcentajes de formación de callo a partir de secciones cotiledonales se

obtuvieron con concentraciones de 4.0 y 6.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de

kinetina (96.98 y 97.02%). La formación y diferenciación de embriones somáticos a partir

de callos, se favoreció con la adición de 6-BAP al medio de cultivo. Con 1.0 mg.L-1 de 6-

BAP se obtienen los mayores porcentajes de ESAF y ESBF (53.01 y 33.92 %), así como el

mayor número de embriones somáticos por callo (43.35 ES/callo) y embriones somáticos

que alcanzaron la etapa cotiledonal. La maduración de los embriones somáticos se afectó

con el proceso de deshidratación, en los tres tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0

horas de deshidratación) los porcentajes de germinación obtenidos fueron inferiores a los

logrados con el control. Mientras que, con 6 % de sacarosa no se afectó la supervivencia

de los embriones somáticos, se obtiene el mayor porcentaje de germinación completa de

los embriones somáticos (76.17%) y bajos niveles de embriogénesis somática secundaria.

Los mayores porcentajes de germinación parcial y completa de los embriones somáticos

(13.35 y 77.62 %) se obtuvieron en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento; sin

embargo, con el 6-BAP disminuyó la germinación y se incrementó la embriogénesis

somática secundaria. La adición de AG3 al medio de cultivo provocó solo germinación

parcial de los embriones somáticos.


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Índice


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ÍNDICE 1. Introducción 1 2. Revisión bibliográfica 4 2.1. La caoba. Sistemática, botánica, origen y características de la especie Swietenia macrophylla King

4

2.2. Importancia del cultivo 6 2.3. Propagación 7 2.3.1. Propagación in vitro 8 2.4. Mejoramiento genético 9 2.5. Embriogénesis somática 10 2.5.1. Factores que afectan la embriogénesis somática 12 2.5.1.1. Genotipo 12 2.5.1.2. Explante 13 2.5.1.3 Medio de cultivo 13 2.5.1.4. Reguladores de crecimiento 15 2.5.1.5 Condiciones de cultivo 16 2.6. Embriogénesis secundaria o repetitiva 17 2.6.1. Aplicación de la embriogénesis somática repetitiva 18 2.7. Fases de la embriogénesis somática 19 2.7.1. Inducción de los embriones somáticos 19 2.7.2. Desarrollo de los embriones somáticos 20 2.7.3. Proliferación de los embriones somáticos 21 2.7.4 Maduración de los embriones somáticos 21 2.7.5. Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas 22 3. Materiales y métodos 24 3.0 Técnicas y procedimientos generales 24 3.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla King

26

3.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa 26 3.1.2. Histodiferenciación de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia macrophylla King

27

3.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King

28

3.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta 28 3.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

28

3.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King 29 3.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

29

3.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

30

3.4. Germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

31

3.4.1. Efecto del 6-BAP y el ácido giberélico sobre la germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

31


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4. Resultado y discusión 33 4.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla King

33

4.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa 33 4.1.2. Histodiferenciación de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia macrophylla King

36

4.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King

38

4.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta 38 4.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos a partir de callos de Swietenia macrophylla king.

40

4.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King 44 4.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

44

4.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

46


52

4.4.1 Efecto del 6-BAP y el AG3 sobre la germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

52

5. Conclusiones 56 6. Recomendaciones 57 7. Revisión bibliográfica 58


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Introducción


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1. INTRODUCCIÓN La caoba (Swietenia macrophylla King), especie agroforestal de gran importancia

está muy amenazada por la extracción intensiva e ilegal que se realiza en las áreas

tropicales, en parte por la gran demanda de su valiosa madera. Esta considerada

como la especie arbórea más comercial del Neotrópico. La creciente demanda de

madera de caoba sobrepasa la oferta disponible y aumenta la presión sobre esta

especie, ocasionando una disminución de las poblaciones naturales y provocando

su extinción comercial a lo largo de su área de distribución (Reynel et al., 2003).

El uso de la biotecnología como un apoyo a los programas de reforestación es una

posibilidad actual que aliviaría la presión de deforestación que tienen las

poblaciones naturales y de esta manera evitaría su extinción (Verdeil et al., 1999).

En la caoba, la propagación por vías tradicionales no resuelven los problemas de

déficit de material vegetal para fomentar plantaciones ya sea con el objetivo de

reforestar o para la producción comercial de madera. El mejoramiento genético

resulta difícil de desarrollar utilizando los métodos tradicionales de propagación

debido al extenso ciclo del cultivo.

Esta especie ha demostrado ser difícil de propagar mediante el cultivo de tejidos.

No se cuenta con un sistema de regeneración de plantas vía organogénesis

repetible, debido básicamente a problemas de contaminación microbiana y por

oxidación fenólica y muerte de los tejidos en la fase de establecimiento de los

explantes in vitro. Se hace necesario entonces la búsqueda de un nuevo método de


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propagación para dar solución a los problemas antes mencionados (Rodríguez et

al., 2003).

La embriogénesis somática es un método de micropropagación utilizado en la

industria forestal principalmente para regenerar especies de crecimiento rápido tales

como Eucalyptus nitens, E. globulus, Picea abies, Pinus taeda y Pinus radiata. El

proceso de embriogénesis somática tiene la ventaja de ser sensible a la

automatización y mecanización, generando una alta producción de plantas iniciales

para el establecimiento de plantaciones. Además, dado el interés que existe en el

país de un programa de mejoramiento genético con el empleo de la ingeniería

genética como una herramienta de apoyo, es necesario contar con un sistema de

regeneración eficiente para la obtención de plantas de calidad (Peña y Lezcano,

2001).

El desarrollo de tecnologías de gran eficiencia desde el punto de vista biológico,

cuantitativo y económico, que faciliten un mayor grado de automatización en los

procesos de almacenamiento y multiplicación de germoplasma valioso, permitirán a

su vez disminuir los costos en la producción de plantas in vitro, lo que resulta

altamente beneficioso para especies de interés agroforestal como la caoba (Medina

y Sotolongo, 2004).

Basados en la necesidad de desarrollar protocolos de propagación in vitro para esta

especie se planteó como hipótesis de trabajo que “es posible establecer la

embriogénesis somática por vía directa e indirecta en caoba hondureña

(Swietenia macrophylla King) en medios de cultivo semisólidos ”.


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A partir de esta hipótesis se definieron los siguientes objetivos:

• Determinar la influencia de diferentes concentraciones de reguladores del

crecimiento en la embriogénesis somática directa a partir de embriones

cigóticos como explante inicial.

• Evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento en la

embriogénesis somática indirecta a partir de secciones cotiledónales como

explante inicial.

• Lograr la maduración y germinación de los embriones somáticos.


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Revisión Bibliográfica

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. La caoba. Sistemática, botánica, origen y características de la especie

Swietenia macrophylla King

La Caoba hondureña pertenece al género Swietenia el cual se encuentra ubicado

dentro de la familia Meliaceae. Según Snook y Negreros-Castillo (2004) la posición

filogenética de la especie es:

Reino : Plantae

Clase : Magnoliopsida

Orden : Sapindales

Familia : Meliaceae

Género : Swietenia

Especie : Swietenia macrophylla King.

Nombres comunes:

Caoba, mara, mogno, caoba de hojas grandes, caoba brasileña, caoba hondureña

(Grogan et al., 2003).

La caoba es un árbol grande con una altura de 20 a 35 m. El diámetro del fuste

alcanza los dos metros, es cilíndrico y tiene usualmente raíces tablares de hasta un


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metro y cincuenta cm de alto. La copa es abierta y redondeada. La especie es

marcadamente caducifolia, lo cual significa que bota o se desprende de su follaje

durante la estación seca, y el árbol se mantiene así completamente desnudo

durante tres ó cuatro meses. El nuevo follaje aparece masiva y repentinamente no

al inicio de la estación lluviosa como sería lógico suponer, sino más bien unas

semanas antes justo en la época más seca y más caliente de la estación estival. La

corteza es de color gris muy oscuro, a veces casi negra, de textura muy áspera y en

los árboles más viejos se desprende en flecos grandes (Negreros-Castillo et al.,

2003).

Las hojas son de apariencia muy agradable: alternas, compuestas paripinadas (a

veces imparipinadas) con tres a seis pares de folíolos grandes con relación al

tamaño total de la hoja. En las plántulas la hoja puede llegar a medir hasta 40 cm de

longitud, pero en los árboles adultos el tamaño de la hoja se reduce a menos de la

mitad (Grogan et al., 2003).

Las flores son muy pequeñas y sencillas, y se desarrollan en unas estructuras o

inflorescencias alargadas y en forma de cono llamadas panículas o panojas.

Aparecen exactamente al mismo tiempo que las hojas nuevas, justo cuando la

estación veraniega se encuentra en su momento de mayor sequía y más altas

temperaturas (febrero y marzo).

Cada flor es "imperfecta" o unisexual o sea, que sólo posee pistilo (órganos

femeninos) o estambres (órganos masculinos). Cada panícula posee flores hembra

o pistiladas y flores macho o estaminadas en mucho mayor cantidad estas últimas

(Snook y Negreros-Castillo, 2004).


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Los frutos son probablemente la característica más notable de esta especie de

árbol. Una vez polinizadas las flores, los frutos tardan entre ocho y nueve meses en

desarrollarse y madurar (de febrero - marzo hasta octubre - noviembre). Son secos

del tipo cápsulas, que cuando maduran son grandes, de hasta 15 cm de largo, en

forma de pera, y de color café muy claro, formados por un tejido leñoso. Cuando

están con frutos los árboles de caoba hondureña son muy fáciles de reconocer

desde grandes distancias pues prácticamente en la punta de cada rama hay un

fruto siempre apuntando hacia arriba (Grogan et al., 2003).

La semilla es aplastada, de aproximadamente 2 cm de largo, con la forma de un

frijol, y de color blanco con un largo hilum de color negro (Negreros-Castillo et al.,

2003).

Estudios realizados acerca del rendimiento en madera de la caoba señalan que se

obtienen volúmenes promedio de 7 a 11 m³/ha/año (Alvarez, 2000).

2.2. Importancia del cultivo

La Caoba es muy utilizada para la reforestación, se planta de manera extensa tanto

como un árbol ornamental como de sombra. Tiene las ventajas de un rápido

crecimiento, alta tolerancia a la sequía y a los suelos pobres (Medina y Sotolongo,

2004).

La madera de esta especie debido a su belleza, alta durabilidad natural, fácil

aserrado y alta estabilidad dimensional corresponde al grupo de maderas

denominadas de utilidad general y se emplea en: construcciones livianas y

molduras, embarcaciones (cobertura, pisos); parquet doméstico, acabados y


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divisiones interiores, muebles de lujo, gabinetes de primera clase, chapa plana

decorativa, contrachapados, artículos torneados, cajas para joyas, instrumentos

musicales (o parte de estos), instrumentos científicos, fósforos, palillos y lápices

(Alvarez y Ponce, 1995).

Es utilizada también en la medicina tradicional. La corteza tiene propiedades

astringentes, tónicas y febrífugas. El té de sus semillas es recomendado para el

dolor de pecho (Alvarez y Ponce, 1995).

2.3. Propagación

La caoba es la especie maderable más importante comercialmente en el neotrópico,

es propagada comúnmente por semilla sexual, pero no regenera a menudo con

éxito debido a la baja eficacia de los métodos de propagación convencionales. Se

han realizado estudios donde se han evaluado diferentes profundidades de siembra

y diversas formas de preparación del área y los porcentajes de arbolillos

establecidos son inferiores al 20 % después de los diez meses (Negreros-Castillo et

al., 2003).

La necesidad de multiplicar íntegramente individuos de caoba seleccionados a

despertado interés por los métodos de propagación vegetativa (Grogan et al., 2003).

Patiño (1997) planteó que la propagación asexual con la aplicación de técnicas

convencionales (injertos, estacas y margullos) es posible; pero las plantas

resultantes pierden rápidamente su valor comercial debido a múltiples

ramificaciones causadas por efectos topofíticos. Aparentemente la vía más


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apropiada para la reproducción artificial de esta especie en cantidades comerciales

es la micropropagación (Rodríguez et al., 2003).

La propagación "in vitro", es una tecnología bien conocida y manejada con

experiencia por más de tres décadas en muchos países del mundo. Se conoce que

esta técnica ha sido aplicada con diversos objetivos: producción masiva,

mejoramiento genético y en la obtención de plantas libres de patógenos (Ashmore y

Engelman, 1997).

La propagación vegetativa representa una vía más directa para mantener

características genéticas de un árbol elite. Dentro de este tipo de propagación, el

cultivo de tejidos ofrece un gran potencial de apoyo a los métodos tradicionales, al

incrementar la producción de variedades genéticamente superiores, proveniente de

la selección de poblaciones, del mejoramiento convencional o de un número

limitado de semillas de polinización controlada (Altman y Loberant, 1998).

La mayoría de los estudios sobre micropropagación se han realizado en más de

50.000 variedades de más de 1.000 especies de plantas ornamentales, agrícolas,

forestales y en especies de interés industrial. Sin embargo, el empleo de esta

tecnología en especies nativas de diversos ecosistemas, ha resultado un proceso

complejo en muchas especies que han sido estudiadas (Pérez, 1998).

2.3.1. Propagación in vitro

La propagación in vitro de caoba tiene pocos antecedentes, debido posiblemente a

lo recalcitrante de la especie. Lee y Rao (1988) obtuvieron vástagos adventicios a

partir de callos originados de segmentos nodales de plantas de diferentes edades,


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cultivados en un medio de cultivo modificado de Murashige y Skoog (1962) (MS),

suplementado con benciladenina (BA) a concentraciones de 2.0 mg.l-1 y 5.0 mg.l-1.

Sarasan et al. (2002) encontró que los explantes de mayor potencial para lograr

brotes eran también los segmentos nodales de 0.5 cm, obtenidos de plantas

germinadas in vitro y cultivados en un medio de cultivo MS modificado con

diferentes relaciones de la auxina ácido indol-3-acético (AIA) y la citoquinina (BA).

Tacoronte et al. (2004) lograron la propagación in vitro de la caoba, para lo cual

utilizaron como explante inicial segmentos nodales de plantas germinadas in vitro a

partir de semillas con cuatro semanas de edad. Para el desarrollo y alargamiento de

las yemas axilares, fue necesaria una relación de ANA/BA en el rango de 0 a 1.94

mg.l-1 de cada regulador de crecimiento. La formación de raíces se presentó en

medio de cultivo MS/2, suplementado con tiamina 9.9 mg.l-1, ácido indolbutírico

(AIB) 0.5 mg.l-1, ANA 0.3 mg.l-1, sacarosa 40 g.l-1, gelrite 2.0 g.l-1 y pH de 5.7.

Existen pocos trabajos publicados sobre la regeneración de plantas mediante el

cultivo in vitro en especies del género Swietenia y los resultados presentados se

han obtenido a partir de plantas asépticas (Sotolongo et al., 2002).

La micropropagación vía organogénesis de la caoba ha tenido poco o ningún

desarrollo, debido a los grandes problemas de contaminación y a los bajos índices

de regeneración de plantas in vitro (Medina y Sotolongo, 2004).

2.4. Mejoramiento genético

La aplicación de Biotecnología en el área de mejoramiento vegetal, de forma

paralela a la aplicación de programas de mejoramiento convencional, contribuyen


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de forma efectiva a incrementar la producción agrícola e industrial, ya que permite

obtener plantas con características más compatibles a su medio ambiente. Los

métodos biotecnológicos permiten explorar más ampliamente la gran variabilidad

genética existente en las plantas, ya que aunque se han obtenido variedades

mejoradas mediante hibridación y selección continua, existen restricciones que

limitan el proceso de mejoramiento (Tang y Tian, 2003).

Aplicando técnicas biotecnológicas podemos micropropagar en forma rápida un

individuo elite con características deseables conocidas, y clonar los genes

responsables de dichas características, y posteriormente introducir dichos genes en

plantas de diferentes especies, lo cual es imposible de realizar por métodos

convencionales. Debido a todas las ventajas señaladas anteriormente, la

biotecnología vegetal permite el desarrollo de una nueva agricultura sustentada en

el uso reducido de fertilizantes químicos, en el biocontrol de plagas y en el cultivo de

plantas que expresan características de tolerancia o resistencia, ya sea a factores

de estrés biótico (microorganismos e insectos), o factores abióticos (altas o bajas

temperaturas, concentraciones salinas y suelos áridos) (Salvi et al., 2001).

2.5. Embriogénesis somática

Parrott (2002) describió al embrión somático como un individuo que es originado

por una o varias células somáticas y que no tiene conexiones vasculares con el

tejido materno. Este autor define que el proceso de formación de un embrión

somático se conoce como embriogénesis somática.


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En los últimos 40 años se han desarrollado tecnologías para obtener embriones

somáticos de un número cada vez más grande de especies. La embriogénesis

somática ha sido utilizada en los programas de mejoramiento genético y en la

propagación a gran escala de genotipos superiores, especialmente cultivos

perennes de alto valor (Viana y Mantell, 1999).

La aplicación de la embriogénesis somática para la propagación se incrementará

con la existencia de protocolos más avanzados y capaces de lograr la producción

de embriones somáticos morfológicamente normales, sin variación somaclonal y

con habilidad de germinar y convertirse rápida y eficazmente en plantas

(Mascarenhas y Muralidharan, 1995).

Haines y Martin (1997), informaron que el proceso de embriogénesis somática tiene

lugar a partir de dos tipos de células: Células Embriogénicas predeterminadas

(CEPDs) y Células Embriogénicas Determinadas Inducidas (CEDIs), estas se

encuentran en tejidos somáticos.

Existen dos vías de desarrollo de la embriogénesis somática: directa e indirecta. De

acuerdo a esto en la embriogénesis somática directa las células pre-existentes

(CEPDs) se dividen directamente para formar un embrión somático. En el caso de la

embriogénesis somática indirecta las células pre-existentes (CEDIs) se dividen para

formar un callo y el callo a su vez adquiere embriogenicidad (Agustine, 1999).

En cultivos como Coffea arabica L y Cedrela odorata se ha demostrado que existen

dos tipos de embriogénesis indirecta: una conocida como embriogénesis somática

de baja frecuencia y otra denominada embriogénesis somática de alta frecuencia


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(Barbón, 2001; Muños, 2003). En la primera se forman pocos embriones somáticos

por callo, de forma asincrónica, pasando por las diferentes etapas de desarrollo. En

la segunda un callo compuesto de proembriones y embriones globulares que

mantienen un desarrollo sincrónico. Estos tipos de embriogénesis indirecta son

típicas también en algunas especies del género Swietenia.

El tejido embriogénico se caracteriza por estar formado por células pequeñas, ricas

en citoplasma, y asimétricas (Parrott, 2002). Viana y Mantell (1999) señalaron que

las células dentro de los tejidos embriogénicos pueden dividirse y mantener su

estado embriogénico mientras estén expuestas a suficiente auxina.

La embriogénesis somática ofrece la posibilidad de regenerar una mayor cantidad

de material vegetal uniforme y permite la obtención de poblaciones puras (Peña y

Lezcano, 2001).

Teniendo en cuenta las ventajas de la embriogénesis somática y su aplicación en la

propagación masiva de plantas, esta vía brinda la posibilidad de micropropagar

clonalmente la Swietenia macrophylla (Medina y Sotolongo 2004).

2.5.1. Factores que afectan la embriogénesis somática

2.5.1.1. Genotipo

Se ha observado que genotipos provenientes de una misma especie, pueden diferir

en cuanto a su capacidad para formar embriones somáticos, lo cual esta dado por

las diferentes habilidades para activar las rutas embriogénicas (Parrott, 2002). Esto

es especialmente evidente en cultivos de árboles tropicales donde se manifiesta un


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fuerte efecto del genotipo en el patrón de mantenimiento de los cultivos

embriogénicos. Existe un tipo de genotipo que en presencia de una auxina fuerte

forman embriones somáticos que alcanzan la etapa cotiledonal; mientras que, otro

tipo conducen a una proliferación de masas proembriogénicas (Vilchez, 2001).

2.5.1.2. Explante

La respuesta embriogénica depende del explante, del estado fisiológico y la edad de

la planta donadora (Barbón, 2001).

Todos los tejidos tienen la capacidad de formar callos in vitro, pero no todos son

embriogénicos (Barbón, 2001). Por lo general se han utilizado diversos explantes y

se han obtenido con éxito callos embriogénicos en varias familias de plantas, como

cotiledones de embriones cigóticos (Canhoto et al., 1999), cotiledones de semillas

de frutos inmaduros (Da Costa et al., 2002), hipocótilos y embriones cigóticos (Parra

y Amo-Marco, 1998), ápices caulinares, segmentos de tallos y hojas (Cramer y

Briggen, 1997), inflorescencias maduras, óvulos (Cabasson et al., 1997),

microsporas (Nitta et al., 1997) y protoplastos (Bang et al., 1999). Aunque se

plantea que los tejidos embrionarios y tejidos muy jóvenes son los que poseen una

respuesta embriogénica activa (Bandyopadhvay y Hamill, 2000).

Varios autores informan la formación de callos en la especie Swietenia macrophylla

King a partir de diferentes explantes, plantas germinadas in vitro (Maruyama e Ishii,

1999), meristemos apicales (Peña y Lezcano, 2001), hojas (Sotolongo y Medina,

2002), sin lograr inducir embriogénesis somática. Collado et al. (2005) señalaron


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que con el empleo de cotiledones de semillas de frutos inmaduros como explante se

logra la formación y diferenciación de embriones somáticos en esta especie.

2.5.1.3 Medio de cultivo

Para el desarrollo de la embriogénesis somática generalmente se ha empleado el

medio de cultivo MS con algunas modificaciones del mismo.

En trabajos publicados sobre la embriogénesis somática en Meliaceas como

Cedrela fissilis Vellozo y Cedrela odorata utilizan las sales MS en los medios de

cultivo para la inducción y formación de embriones somáticos (Da Costa et al.,

2002; Muños, 2003).

La adición de nitrógeno en el medio de cultivo ha tenido un marcado efecto sobre la

embriogénesis somática en varias especies. En particular la relación nitrato –

amonio y la adición de nitrógeno reducido en forma de aminoácidos influyen en la

aparición de la embriogénesis somática (Nuutila et al., 2002).

En estudios realizados sobre el efecto de fuentes nitrogenadas orgánicas en la

embriogénesis somática en especies como Eucalyptus globulus y Gossypium

hirsutum, se ha demostrado que la adición de extracto de malta al medio de cultivo

incrementa la formación de embriones somáticos (Pinto et al., 2002; Kumria et al.,

2003).

Otras fuentes de nitrógeno utilizadas para el desarrollo de la embriogénesis

somática la constituyen los aminoácidos, entre estos tiene un papel importante el

aminoácido L-Glutamina que ha sido empleado para incrementar la formación de

estructuras embriogénicas en varias especies leñosas como Quercus suber


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(Hernández et al., 2003), Eucalyptus globulus (Pinto et al., 2002) y Pinus taeda

(Pullman et al., 2005).

En algunas especies se ha determinado la influencia de la concentración de

sacarosa sobre la formación de callo con estructuras embriogénicas y embriones

somáticos, ya que altas concentraciones de sacarosa (> 40 g.l-1) actúan como un

factor estresante que induce el proceso de la embriogénesis somática (Nuutila et al.,

2002; Zheng et al., 2002; Choi y Jeong, 2003).

2.5.1.4. Reguladores de crecimiento

La combinación de reguladores de crecimiento necesaria para obtener embriones

somáticos depende del tipo de células que formen el explante, ya sean CEPDs o

CEDIs. En el caso de las CEPDs, la adición de una citoquinina al medio de cultivo

es suficiente, porque las células ya son embriogénicas y simplemente necesitan

dividirse; pero al utilizar tejidos con CEDIs, es necesario el empleo de auxinas para

inducir el estado embriogénico (Parrott, 2002).

Las auxinas desempeñan un importante papel en el proceso de embriogénesis

somática. La acción auxínica produce severos cambios, lo cual reprograma a la

célula para un estado embriogénico. Uno de los eventos iniciales es la terminación

del patrón genético general, que puede variar y permitir la expresión de un

programa embriogénico. Un posible mecanismo para la baja regulación de la

expresión génica es la metilación del ácido desoxirribonucleico (ADN), lo cual esta

correlacionado con la cantidad de auxina exógena (Barbón, 2001; Kintzios et al.,

2002).


- 82 -

En los escasos informes de embriogénesis somática en Meliaceas han utilizado el

ácido 2,4-diclorofenoxiácetico, como regulador de crecimiento para inducir la

embriogénesis somática, en concentraciones que se encuentran en el rango de 1.0

a 5.0 mg.l-1 (Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y

Quoirin, 2004; Medina y Sotolongo 2004).

El papel de las citoquininas en el medio de cultivo primario o inductor no ha sido

bien definido, aunque normalmente este medio de cultivo incluye en su composición

alguna de ellas como es el 6-bencilaminopurina (6-BAP) o la Kinetina. Las

citoquininas pueden ser esenciales para la maduración y germinación de embriones

somáticos. La incorporación de estas durante la fase de histodiferenciación

compensa el efecto negativo inducido por la auxina sobre el desarrollo del

meristemo (Barbón, 2001).

Parrott (2002), informó que la histodiferenciación, maduración, germinación y

conversión de los embriones somáticos de angiospermas ocurre sin la presencia de

reguladores de crecimiento exógenos. Este mismo autor señaló que aún así,

muchos de los protocolos para la embriogénesis somática omiten una o más

etapas, usan reguladores de crecimiento innecesarios, o condiciones subóptimas de

cultivo. Lo que provoca que los embriones somáticos requieran el empleo de

reguladores de crecimiento (generalmente citoquinina o giberelina) antes de

germinar y convertirse en plantas.

2.5.1.5 Condiciones de cultivo


- 83 -

Se ha demostrado que para algunas especies leñosas es fundamental la inducción

de la embriogénesis somática en presencia de luz. Shaji et al. (1997), señalaron que

callos de Naregamia alata mostraron más actividad embriogénica a la luz que en

condiciones de oscuridad. D´Onorio et al. (1998), mencionan que la competencia

embriogénica de hojas de Cydonia oblonga mostró una correlación con el

fotoequilibrio, de manera que callos cultivados bajo luz azul presentaron un bajo

fotoequilibrio, que influyó negativamente en la embriogénesis somática. Mientras

que en algunas Meliaceas como Azadirachta excelsa, Azadirachta indica, Cedrela

fissilis y Cedrela odorata, es necesaria la oscuridad para desarrollar el proceso de

embriogénesis somática (Lorenzi, 1996; Salvi et al., 2001; Da Costa et al., 2002;

Muños, 2003)

En términos de la atmósfera gaseosa, la adición de inhibidores de etileno, tales

como cobalto, níquel y ácido salicílico incrementaron la embriogénesis en zanahoria

(Roustan et al., 1990). Grapin et al. (1994) informan la importancia de la atmósfera

gaseosa en el proceso de regeneración de embriones somáticos, donde la calidad

de la atmósfera influyó en el proceso de diferenciación y se observó una reducción

del número de embriones somáticos por explante en atmósferas con bajas

concentraciones de oxígeno.

En estudios realizados con respecto al efecto del dióxido de carbono (CO2) en las

especies Coffea arabica L. y Clematis tangutica K., Barbón (2001) demostró que el

gaseado con CO2 a concentraciones de 2.5 y 5.0 % estimuló la formación de

embriones somáticos en comparación con los controles de intercambio pasivo, este

efecto positivo del dióxido de carbono y el oxígeno no solo estuvo relacionado con


- 84 -

la mayor producción de embriones somáticos sino con una mejor proporción de

embriones somáticos en etapa de torpedo.

2.6. Embriogénesis secundaria o repetitiva

En ausencia de auxinas exógenas, la histodiferenciación procede normalmente. Si

hay auxinas dentro del umbral que permite la histodiferenciación, ésta procederá,

pero anormalmente. Al aumentar el nivel de auxinas exógenas, se llega a un punto

en que la histodiferenciación no pasa más halla de la etapa globular. En este caso,

nuevos embriones somáticos se forman del embrión original, y se desarrollaron

hasta la etapa globular, donde se multiplican. Este proceso se repite mientras el

nivel de auxinas exógenas sea suficientemente alto. Este fenómeno se conoce

como embriogénesis somática recurrente, repetitiva, o secundaria (Parrott, 2002).

Cuando el nivel de auxinas externas esta por de bajo del punto necesario para

mantener la embriogénesis somática repetitiva, el ciclo de esta se rompe, y los

embriones somáticos terminan su histodiferenciación para desarrollarse en

embriones somáticos maduros. En algunas especies, los embriones somáticos

alcanzan las etapas de corazón, torpedo, o cotiledonal, o incluso pueden germinar,

antes de empezar el proceso repetitivo (Merkle et al., 1991).

En otras especies, la embriogénesis repetitiva puede ocurrir en ausencia de toda

auxina externa, en cuyo caso puede ser difícil o imposible de romper el ciclo de la

embriogénesis somática repetitiva. Este proceso recibe el nombre de autoembrionia

(Thorpe, 1995).

2.6.1. Aplicación de la embriogénesis somática repetitiva


- 85 -

La habilidad que tienen los tejidos embriogénicos y los embriones somáticos

facilitan su utilización para la multiplicación a gran escala. Ya que la embriogénesis

somática puede producir un número ilimitado de propágulos con la capacidad de

germinar y producir plantas completas sin necesidad de etapas adicionales para el

enraizamiento, esta tecnología puede ser especialmente útil para la propagación

masiva de plantas (Hernández et al., 2003).

La embriogénesis somática es una de las vías de propagación más utilizada para el

mejoramiento genético, ya que aporta un mecanismo para la transformación

genética de aquellas especies que no son regenerables por organogénesis. Las

células embriogénicas se han empleado como material vegetal en varios métodos

de transformación; pero son particularmente útiles para la transformación por medio

de biobalística debido a que carecen de vacuolas grandes (Silveira et al., 2004).

2.7. Fases de la embriogénesis somática

El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración de plantas vía

embriogénesis somática incluye los siguientes pasos:

• Inducción de los embriones somáticos.

• Desarrollo de los embriones somáticos.

• Proliferación de los embriones somáticos.

• Maduración de los embriones somáticos.

• Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas.

2.7.1. Inducción de los embriones somáticos


- 86 -

La Inducción del proceso consiste en la terminación del patrón de expresión de los

genes presentes en el tejido del explante; siendo reemplazado por un programa de

expresión del gen o genes de la embriogénesis en aquellas células del tejido del

explante, los cuales pudieran dar lugar a embriones somáticos (Gómez, 1998).

Según, Parrot (2002), la inducción del estado embriogénico incluye la inducción de

los mismos mecanismos genéticos que conllevan a la embriogénesis cigótica.

Contrariamente a los embriones cigóticos los embriones somáticos no contienen un

nuevo grupo de genes sino que poseen la misma combinación genética de la planta

fuente del explante.

El empleo de la auxina es la mejor manera de inducir la formación de células

embriogénicas a partir de células somáticas. La inducción de la división celular

como una respuesta a esta auxina puede resultar en un callo con crecimiento

desorganizado o bien en un crecimiento polarizado coordinado para la formación de

un embrión somático (Gómez, 1998).

La combinación de reguladores de crecimiento (2,4-D, AIB y kinetina) en el medio

de cultivo, utilizada para la inducción de la embriogénesis somática en el híbrido de

caoba (Swietenia macrophylla King X Swietenia mahogani Jacq), permitió la

formación de callos que por sus características macromorfológicas y citológicas

fueron los más promisorios para una posible embriogénesis somática (Medina y

Sotolongo, 2004).

2.7.2. Desarrollo de los embriones somáticos


- 87 -

La etapa temprana o pre-globular de los embriones somáticos son fácilmente

reconocidos generalmente por el contenido de citoplasma denso y la ausencia

general de vacuolas (Krikorian, 1995). Durante esta fase las auxinas son inhibitorias

para el desarrollo de los agregados celulares embriogénicos a embriones somáticos

(Halperin, 1995).

2.7.3. Proliferación de los embriones somáticos

Uno de los aspectos más importantes de la embriogénesis somática que permite su

aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes es la habilidad de

los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o

multiplicarse indefinidamente (Merkle et al., 1995).

El factor más fuerte asociado con la proliferación continua de las células

embriogénicas es la auxina. Sin embargo, parece que el efecto de este regulador de

crecimiento no puede ser considerado independiente a la reducción de la

concentración de nitrógeno, ya que existen evidencias de la interacción entre ambos

(Gómez, 1998). Además el nivel de auxina necesario para mantener la

embriogénesis somática repetitiva varia de acuerdo a la especie (Merkle et al.,

1995).

2.7.4 Maduración de los embriones somáticos

La maduración es el período en el cual el embrión somático sufre expansión de sus

células, y la acumulación de sustancias de reserva (Gómez, 1998). En esta etapa

juega un papel fundamental la presencia de nitrógeno en el medio de cultivo, siendo

necesario el suplemento con nitratos, amonio, aminoácidos y caseína hidrolizada.


- 88 -

Los carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de 3 - 6 % son

esenciales, junto a bajas concentraciones de oxígeno en la atmósfera gaseosa en el

frasco de cultivo, lo cual permite una maduración total y evita la germinación precoz

(Merkle et al., 1995).

Al respecto Gómez (1998), menciona que un tratamiento de deshidratación parcial o

total del embrión somático aumenta su posterior germinación y crecimiento, además

de facilitar el crecimiento simultáneo de la raíz y el brote.

En el caso de Eucaliptus dunii, con la adición de agua de coco 10.0 % (v/v) o 1.0 g.l-

1 de caseína hidrolizada a un medio libre de reguladores de crecimiento se logró la

maduración de los embriones somáticos (Termignoni et al., 1996).

2.7.5. Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas

Al proceso mediante el cual los embriones somáticos emiten brote y raíz se le

denomina germinación y al desarrollo de plantas completas en condiciones ex vitro

a partir de embriones somáticos germinados se le denomina conversión (Barbón,

2001).

Dentro del proceso de la embriogénesis somática los pasos finales lo constituyen la

germinación y la conversión en plantas. Las primeras señales de la germinación de

los embriones somáticos lo constituyen la elongación del hipocótilo, desarrollo del

color verde de los cotiledones y la elongación de la radícula (Alemano et al., 1997;

Canhoto et al., 1999).

Aunque en la mayoría de los trabajos de embriogénesis somática de especies

leñosas no se da mucha información sobre estos procesos, se sabe que la baja tasa


- 89 -

de regeneración de plantas es causada por problemas en la germinación y

conversión de los embriones somáticos (Vilchez, 2001).

Muchos trabajos realizados para mejorar la fase de germinación en especies

leñosas señalan la necesidad de cambiar los embriones somáticos a medio de

cultivo fresco durante el este proceso (Danso y Ford-Lloyd, 2002; Zheng et al.,

2002; Montoro et al., 2003).

Se ha informado que los embriones somáticos de especies Meliáceas germinan

bien en medios de cultivo simples, por lo general a la mitad de las sales MS y sin

reguladores de crecimiento (Da Costa et al., 2002; Muños, 2003).


- 90 -

Materiales y Métodos


- 91 -

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se realizó en el laboratorio de Propagación Masiva del

Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), adscrito a la Universidad Central

“Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), Santa Clara, (Cuba), durante el período

comprendido entre enero de 2004 y noviembre de 2005.

3.0. Técnicas y procedimientos generales

Material vegetal

Como material vegetal inicial se emplearon embriones cigóticos y secciones de

cotiledones de semillas de frutos inmaduros recolectados de plantas adultas de

Swietenia macrophylla King seleccionadas por sus características agromorfológicas

en el Jardín Botánico de la UCLV.

Procedimientos generales

Se utilizaron tubos de vidrio de 150 mm de longitud por 25 mm de diámetro y

frascos de vidrio de 250 ml de capacidad. El pH de los diferentes medios de cultivo

fue ajustado a 5.8 con NaOH 0.1N y HCl 0.1N antes de la esterilización en

autoclave a una temperatura de 121oC y 1.2 Kg.cm-2 de presión durante 20 min.

Como agente gelificante de los diferentes medios de cultivo empleados para los

experimentos se utilizó 3.0 g.L-1de Gelrite® (SIGMA). Se añadieron 10 ml de medio

de cultivo en los tubos y 30 ml en los frascos.


- 92 -

La manipulación de los explantes se realizó en condiciones de asepsia en una

cámara de flujo laminar horizontal. El instrumental (pinzas y bisturíes) fueron

desinfectados con una solución de NaClO al 1.0 % (v/v) durante 15 minutos.

En las fases de inducción y diferenciación de embriones somáticos los

experimentos se desarrollaron en condiciones de oscuridad constante y a una

temperatura de 27.0 ± 2.0○C. Para la fase de germinación de los embriones

somáticos se utilizó una cámara de crecimiento de luz solar con una densidad de

flujo de fotones fotosintéticos de 48.0-62.5 µmolm-2s-1 con una duración del período

luminoso máximo y mínimo de 13 h, 34 min y 10 h, 41 min y una temperatura de

25.0 ± 2.0○C.

Preparación del material vegetal

Frutos inmaduros de caoba (Swietenia macrophylla King.) desarrollados a los cinco

meses después de la antésis, con un largo de 7.0 – 10.0 cm y un diámetro de 5.0 –

7.0 cm, fueron lavados con agua y detergente. Los frutos se desinfectaron con una

solución de NaClO al 3 % y 2 gotas de Tween-80 por cada 1000 ml de solución,

durante 30 minutos en agitación. Posteriormente, en condiciones asépticas, los

frutos se enjuagaron dos veces con agua desionizada estéril y se seccionaron en

cuatro partes de las cuales se separó la masa de semillas del endocarpo. A las

semillas se les eliminó la testa, se separaron los cotiledones y se extrajo el embrión

cigótico (Figura 1A).

Los embriones cigóticos se emplearon como explante para la obtención de la

embriogénesis somática directa. Los cotiledones fueron seccionados a la mitad y


- 93 -

cortados por los bordes. De cada cotiledón se obtuvieron dos secciones de

aproximadamente 0.25 cm2 de área, las cuales se utilizaron como material vegetal

de partida para el desarrollo de la embriogénesis somática indirecta (Figura 1B).

Figura 1. Explantes de Swietenia macrophylla King procedentes de una semilla de un fruto inmaduro de cinco meses posterior a la antésis. A.) Embrión cigótico B.) Secciones cotiledonales.

Procesamiento estadístico

Los datos experimentales se procesaron estadísticamente mediante un análisis de

varianza de clasificación simple y la diferencia entre los tratamientos se determinó

con la aplicación de la prueba de rangos múltiples de Duncan. El paquete

estadístico empleado fue Statgraphics Plus versión 5.0 para Windows.

3.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla

King

3.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa

En este experimento se estudió la combinación de diferentes concentraciones de

2,4-D y una concentración de kinetina con el objetivo de lograr la formación de

embriones somáticos a partir de embriones cigóticos inmaduros.

A B


- 94 -

El medio de cultivo utilizado estuvo compuesto por las sales de Murashige y Skoog

(1962) (MS), suplementado con 200.0 mg.L-1 de L-glutamina, 1.0 mg.L-1 de tiamina,

1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0 mg.L-1 de extracto de

malta y 4 % de sacarosa. Se estudiaron tres concentraciones de 2,4–D (2.0, 4.0 y

6.0 mg.L-1) combinado con 1.0 mg.L-1 de kinetina.

Se colocó un embrión cigótico por tubo de cultivo y se realizaron 80 repeticiones. El

experimento se realizó tres veces en el tiempo. Se realizaron observaciones cada

siete días para describir los cambios morfológicos presentados por los explantes y

el momento de aparición de la embriogénesis somática directa, así como su

caracterización. Se determinó al final del experimento (a las seis semanas de

cultivo), el número de explantes con embriogénesis somática de alta frecuencia

(ESAF) y embriogénesis somática de baja frecuencia (ESBF).

3.1.2. Desarrollo de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia

macrophylla King

Este experimento se realizó con el objetivo de lograr el desarrollo de los embriones

somáticos en etapa globular a las etapas finales de torpedo y cotiledonal, para ello

se tomaron los embriones somáticos obtenidos en la mejor variante de inducción de

la embriogénesis somática directa. Los embriones somáticos se colocaron en tres

tratamientos con 6-BAP (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1) y un control sin reguladores de

crecimiento.

El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por las sales MS suplementado

con 250.0 mg.L-1 de L-glutamina, 10 ml.L-1 de las vitaminas MS y 3% de sacarosa.


- 95 -

Se colocaron diez embriones somáticos en etapa globular por frasco de cultivo y se

realizaron 20 repeticiones por tratamiento. El experimento se realizó dos veces en el

tiempo. Se efectuaron observaciones periódicas de los cambios morfológicos en los

explantes cada 10 días y se evaluaron las siguientes variables a los 30 días de

cultivo, número de embriones somáticos que alcanzaron la etapa de torpedo y

cotiledonal.

3.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia

macrophylla King

3.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta

Con el objetivo de evaluar el efecto de la combinación auxina - citoquinina en la

inducción de la embriogénesis somática indirecta. Se emplearon como explante

inicial secciones de cotiledones, las cuales se colocaron en un medio de cultivo

compuesto por las sales MS, al que se le adicionaron 200.0 mg.L-1 de L-glutamina,

1.0 mg.L-1 de tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0

mg.L-1 de extracto de malta y 4 % de sacarosa. Se estudiaron tres concentraciones

de 2,4–D (2.0, 4.0 y 6.0 mg.L-1) combinadas con 1.0 mg.L-1 de kinetina.

Se colocaron cuatro secciones de cotiledones por frasco de cultivo y se realizaron

80 repeticiones por tratamiento. Se efectuaron observaciones para describir las

características y color de los callos formados cada siete días y a las seis semanas

de cultivo se evaluó el número de explantes que formaron callo. El experimento se

realizó tres veces en el tiempo.

3.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos


- 96 -

Para lograr la formación y diferenciación de los embriones somáticos, los callos

obtenidos con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0 mg.L-1 de kinetina se cultivaron en un medio

de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS suplementado con 10.0 mg.L-1 de

tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de pirídoxina, 250.0 mg.L-1 de

L-glutamina, 50.0 mg.L-1 de L-cisteína y 3 % de sacarosa. Se estudiaron tres

concentraciones de 6-BAP (0.5, 1.0 y 2.0 mg.L-1) y un control sin reguladores del

crecimiento.

Se colocaron seis callos por frasco de cultivo y se realizaron 10 repeticiones para un

total de 60 callos por tratamiento. Se efectuaron observaciones cada 10 días para

detectar el momento de aparición de la embriogénesis somática indirecta y su

caracterización morfológica. A los 60 días de cultivo se evaluaron las variables

número de callos con ESAF y callos con ESBF. Transcurrido 80 días de cultivo se

evaluó el número de embriones somáticos por callo y el número de embriones

somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal.

3.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

3.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones

somáticos

Embriones somáticos en etapa cotiledonal obtenidos en la mejor variante del

acápite 3.2.2 fueron sometidos a un proceso de deshidratación con el objetivo de

lograr una correcta maduración. Para lo cual se empleó el método propuesto por

Choi y Jeong (2002), que consistió en colocar 20 embriones somáticos sobre la


- 97 -

superficie de un papel de filtro estéril dentro de un frasco de cultivo en condiciones

de oscuridad constante y a una temperatura de 27.0 ± 2.0○C.

Se conformaron tres tratamientos:

1. Embriones somáticos expuestos a 24 horas de deshidratación.



Posteriormente los embriones somáticos deshidratados fueron colocados en un

medio de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS, suplementado con las

vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa. Como control se emplearon embriones

somáticos en etapa cotiledonal sin aplicación del proceso de deshidratación. Se

colocaron 20 embriones somáticos por frasco de cultivo y se realizaron 10

repeticiones para un total de 200 explantes por tratamiento.

A los 60 días de cultivo se evaluaron las variables: supervivencia, germinación

completa y embriogénesis somática secundaria.

3.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de

los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

Con el objetivo de lograr la maduración, embriones somáticos en etapa cotiledonal,

fueron cultivados durante un período de 30 días con diferentes concentraciones de

sacarosa (4.0, 6.0 y 8.0 %). El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por

las sales MS y las vitaminas MS. Se colocaron 10 embriones somáticos por frasco

de cultivo y se realizaron 10 repeticiones, para un total de 100 explantes por


- 98 -

tratamiento, los cuales fueron situados en condiciones de oscuridad constante y a

una temperatura de 27.0 ± 2.0○C.

Los explantes cultivados en las tres concentraciones de sacarosa, a los 30 días

fueron transferidos a un medio de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS,

suplementado con las vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa. como control se utilizaron

embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes

concentraciones de sacarosa. Se ubicaron siete embriones somáticos por frasco de

cultivo y se realizaron 10 repeticiones para un total de 70 explantes por tratamiento.

El experimento se realizó tres veces en el tiempo.

Se realizaron observaciones a intervalos de 10 días para apreciar algunos cambios

morfológicos ( incremento de tamaño, cambio de coloración y pronunciación del

polo radicular) en los embriones somáticos. A los 60 días de cultivo se evaluaron las

siguientes variables: supervivencia, germinación completa y embriones somáticos

deformados.


3.4.1. Efecto del 6-BAP y el ácido giberélico sobre la germinación de

embriones somáticos

Para lograr la germinación se emplearon como explante embriones somáticos en

etapa cotiledonal cultivados durante 30 días en el medio de cultivo para la

maduración (MS) con 6.0 % de sacarosa. Estos fueron colocados en un medio de

cultivo compuesto por la mitad de las sales MS, al cual se le añadieron las

vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa.


- 99 -

Se estudiaron tres concentraciones de 6-BAP (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1), dos

concentraciones de giberelina A3 (AG3) (1.0 y 2.0 mg.L-1) y un medio de cultivo

control sin reguladores de crecimiento. Se colocaron siete embriones somáticos por

frasco de cultivo y se realizaron 20 repeticiones para un total de 140 explantes por

tratamiento. El experimento se realizó dos veces en el tiempo.

A los 60 días de cultivo se determinó la altura de los embriones somáticos

germinados, a los cuales se le cuantificó el número de hojas verdaderas y fueron

evaluadas las siguientes variables:

• Número de embriones somáticos con germinación completa.

• Número de embriones somáticos con germinación parcial (el embrión

desarrolla la parte radicular o apical).

• Número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria asociada.


- 100 -


- 101 -

Resultados y Discusión

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla

King

4.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa

Durante las dos primeras semanas de cultivo se observaron cambios de coloración

y morfológicos en los embriones cigóticos, estos se tornaron de un color pardo y

comenzaron a tener un ligero engrosamiento.

A las seis semanas de colocados los explantes en el medio de cultivo para la

inducción de la embriogénesis somática se observó la presencia de embriogénesis

somática directa de alta frecuencia y de baja frecuencia en todos los tratamientos

(Figura 2).

Figura 2. Embriogénesis somática directa desarrolladas a partir de embriones cigóticos de Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo (A- Embriogénesis somática de alta frecuencia y B- Embriogénesis somática de baja frecuencia).

A B


- 102 -

La embriogénesis somática directa de alta frecuencia se caracterizó por la

presencia de grupos con un gran número de proembriones y embriones somáticos

en etapa globular de color blanco amarillento. Sin embargo, la embriogénesis

somática de baja frecuencia estuvo formada por embriones somáticos aislados y en

diferentes etapas de desarrollo. Estos se caracterizaban también por poseer una

coloración blanca.

Con las combinaciones de diferentes concentraciones de 2,4-D con kinetina se

indujo el proceso de la embriogénesis somática en Swietenia macrophylla King. En

dependencia de estas concentraciones variaron significativamente los porcentajes

de explantes con embriogénesis somática de alta frecuencia y embriogénesis

somática de baja frecuencia.

Los mayores valores de número de embriones cigóticos que desarrollaron

embriogénesis somática de alta frecuencia y embriogénesis somática de baja

frecuencia, se obtuvieron en el medio de cultivo suplementado con 4.0 mg.L-1 de

2,4–D y 1.0 mg.L-1 de kinetina (Tabla 1). Este tratamiento mostró diferencias

estadísticas con el resto de las combinaciones de los reguladores de crecimiento

estudiados.

Tabla 1. Efecto de diferentes combinaciones de 2,4-D y kinetina en la inducción de la embriogénesis somática directa a partir de embriones cigóticos en Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo

Tratamientos

No. de explantes con

ESAF

Porcentaje de explantes con

ESAF (%)

No. de explantes con

ESBF

Porcentaje de explantes con

ESBF (%) 1 24.20 c 30.25 12.30 c 15.38 2 32.82 a 41.02 16.41 a 20.51 3 27.42 b 34.28 14.17 b 17.71

E. E. ± 0.45 ± 0.38 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente según la prueba de rangos múltiple de Duncan (p< 0.05).


- 103 -

Tratamientos. 1) 2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 2) 4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 3) 6.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina.

Los resultados presentados en este experimento demostraron el efecto positivo del

2,4-D combinado con la kinetina en la inducción de la embriogénesis somática

directa en la especie Swietenia macrophylla King a partir de embriones cigóticos

como explante inicial.

En los escasos estudios sobre la inducción de la embriogénesis somática en el

género Swietenia, se ha investigado el efecto del 2,4-D (1.0 – 5.0 mg.L-1)

combinado con la kinetina (0.5 – 2.0 mg.L-1), en diferentes tipos de explantes como

discos de hoja, ápices y segmentos nodales de plantas germinadas in vitro. Sin

embargo no se obtuvieron resultados alentadores en cuanto a la respuesta

embriogénica (Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y

Quoirin, 2004; Medina y Sotolongo, 2004).

Con los resultados obtenidos se describe por vez primera la embriogénesis

somática directa a partir de embriones cigóticos en Swietenia macrophylla King. El

efecto de la combinación del 2,4-D con la kinetina sobre la inducción de la

embriogénesis somática, difiere con los resultados señalados por Shaji et al. (1997)

en la meliácea Naregamia alata, en la cual no lograron una respuesta embriogénica.

Sin embargo, Zhang (2000), planteó que con el empleo de 2,4–D en combinación

con Kinetina (0.5–1.0 mg.L-1) en la inducción de embriogénesis somática en

Gossypium hirsutum, se logró la embriogénesis somática directa y los mayores

valores de embriogénesis somática de alta frecuencia se manifestaron en los


- 104 -

tratamientos donde el medio de cultivo fue suplementado con concentraciones de

3.0 – 5.0 mg.L-1 de dicha auxina.

En especies Meliáceas como Azadirachta excelsa y Azadirachta indica, Giagnacovo

et al. (2001) y Salvi et al. (2001) señalaron que el empleo de embriones cigóticos

inmaduros como explante inicial, en un medio de cultivo MS al que le adicionaron

como reguladores de crecimiento el 2,4-D (2.0 – 8.0 mg.L-1) combinado con kinetina

(1.0 mg.L-1), lograron la embriogénesis somática directa.

Los porcentajes de embriogénesis somática de alta frecuencia (30.25, 34.28, 41.02

%) y embriogénesis somática de baja frecuencia (15.38, 17.71, 20.51%), obtenidos

en el presente trabajo con todas las combinaciones de 2,4-D y kinetina estudiadas

fueron superiores a los logrados por Giagnacovo et al. (2001), 8.0 y 10.3 %, en la

especie Azadirachta excelsa.

En el presente experimento se evidenció que con el empleo de un medio de cultivo

compuesto por las sales MS suplementado con 200.0 mg.L-1 de L-glutamina, 1.0

mg.L-1 de tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0

mg.L-1 de extracto de malta y 4 % de sacarosa, con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado

con 1.0 mg.L-1 de kinetina se logró el desarrollo de la embriogénesis somática

directa en Swietenia macrophylla King a partir de embriones cigóticos inmaduros.

4.1.2. Desarrollo de embriones somáticos en etapa globular

En el medio de cultivo para la diferenciación de embriones somáticos con 0.4 mg.L-1

de 6-BAP, se observaron desde los diez días de cultivo embriones somáticos en

etapas de torpedo y cotiledonal. Sin embargo, a los 30 días en todos los


- 105 -

tratamientos estudiados un alto porcentaje de embriones somáticos alcanzaron

estas etapas de desarrollo, los cuales presentaron una coloración blanca, con

cotiledones definidos y presencia de embriogénesis somática secundaria asociada

(Figura 3).

Figura 3. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King que alcanzaron las etapas de torpedo y cotiledonal en el medio de cultivo para la diferenciación con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP a los 30 días de cultivo. Al comparar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo

de los embriones somáticos (Tabla 2), se observó que en todos los tratamientos

estudiados los embriones somáticos alcanzaron las etapas torpedo y cotiledonal.

Los valores más altos de embriones somáticos en estas etapas de desarrollo, se

presentaron cuando se añadió al medio de cultivo 0.4 mg.L-1 de 6-BAP con

diferencias con respecto a los demás tratamientos.

Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 30 días de cultivo

Embriones somáticos en etapa torpedo

Embriones somáticos en etapa cotiledonal

Concentraciones de 6-BAP (mg.L-1).

No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%) 0.0 0.56 c 5.60 7.52 d 75.20 0.2 0.67 b 6.70 7.98 c 79.80 0.4 0.74 a 7.40 9.17 a 91.70 0.6 0.71 ab 7.10 8.63 b 86.30

E. E. ± 0.02 ± 0.11 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.


- 106 -

La adición de bajas concentraciones de citoquinina al medio de cultivo favorece el

desarrollo de los embriones somáticos, ya que estos durante el proceso de

histodiferenciación se desarrollan debido a la división celular (Parrott , 2002).

Los resultados obtenidos demuestran el efecto del 6-BAP en el desarrollo de los

embriones somáticos en Swietenia macrophylla King. En los tratamientos donde se

adicionaron concentraciones de este regulador de crecimiento al medio de cultivo,

se obtuvieron resultados superiores con respecto al control. Resultados similares

relacionado con el empleo de bajas concentraciones de 6-BAP (0.2-0.5 mg.L-1) en

la histodiferenciación de los embriones somáticos fueron obtenidos en otras

especies de meliaceas como Cedrela fissilis y Cedrela odorata (Da costa et al.,

2002; Muños et al., 2003). Esta citoquinina también fue utilizada para el desarrollo

de embriones somáticos en Pinus taeda (Pullman et al., 2005).

El proceso de desarrollo de los embriones somáticos fue estimulado con las

diferentes concentraciones de 6-BAP empleadas (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1) y fue en el

tratamiento con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP donde obtienen los mayores porcentajes de

embriones somáticos en etapas de torpedo y cotiledonal.

4.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia

macrophylla King

4.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta

A partir de la tercera semana los cotiledones colocados en el medio de cultivo para

la inducción de la embriogénesis somática indirecta comenzaron a mostrar cambios

morfológicos. Se observó inicialmente un engrosamiento del borde de los

explantes. En la octava semana de cultivo, un alto porcentaje de los explantes


- 107 -

presentaron formación de callo en las tres combinaciones de 2,4–D con kinetina

estudiadas con diferencias entre estos tratamientos.

Los callos formados cubrieron la totalidad del explante, presentaron color pardo

oscuro y características nodulares, en todos los tratamientos evaluados (Figura 4).

Figura 4. Callo formado a partir de una sección cotiledonal de semilla de fruto inmaduro de Swietenia macrophylla King a las ocho semanas de cultivo. Los resultados presentados demostraron el efecto positivo del 2,4-D combinado con

la kinetina en la formación de callo en la especie Swietenia macrophylla King. Los

mayores valores del número de explantes con callo se presentaron en los

tratamientos dos (4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) y tres (6.0 mg.L-1 de

2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) con diferencias significativas con el tratamiento uno

(2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) (Tabla 3).

Tabla 3. Efecto de diferentes combinaciones de 2,4-D y kinetina en la formación de callo a partir de secciones cotiledonales en Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo

Tratamientos No. de explantes con callo/frasco Porcentaje (%) 1 3.75 b 93.70 2 3.87 a 96.98 3 3.88 a 97.02

E. E. ± 0.03 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Tratamientos.


- 108 -

1) 2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 2) 4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 3) 6.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina.

Resultados similares fueron obtenidos en el híbrido (Swietenia macrophylla King X

Swietenia mahogani Jacq) por Medina y Sotolongo (2004), quienes señalaron que

cuando se combinaron en el medio de cultivo los reguladores de crecimiento 2,4-D

(4.0 – 6.0 mg.L-1) y kinetina (1.0 mg.L-1 ), se logró el mayor número de explantes

con callo.

En los estudios realizados sobre la inducción de la embriogénesis somática

indirecta en el género Swietenia, han sido utilizado con éxito para la formación de

callos el 2,4-D (1.0 – 5.0 mg.L-1) combinado con la kinetina (0.5 – 2.0 mg.L-1)

(Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y Quoirin, 2004).

Se puede concluir con estos resultados que con concentraciones de 4.0 y 6.0 mg.L-1

de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de kinetina se obtienen los mayores porcentajes

de formación de callo en Swietenia macrophylla King.

4.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos a partir de callos

En los explantes colocados en el medio de cultivo para la formación y

diferenciación de los embriones somáticos, a partir de los 40 días de cultivo se

observaron pequeñas estructuras de coloración amarillo intenso sobre los callos

cultivados con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP y a los 50 días de cultivo en un gran número de

callos se observó la presencia de ESAF y ESBF (Figura 5).


- 109 -

Figura 5. Embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King obtenida con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP a los 50 días de cultivo (A. Callo con ESAF y B. Callo con ESBF).

La embriogénesis somática de alta frecuencia se caracterizó por la presencia de

grupos de un gran número de proembriones y también de embriones somáticos en

etapa globular de color blanco amarillento; sin embargo, en la embriogénesis

somática de baja frecuencia se observaron embriones somáticos aislados en

diferentes etapas de desarrollo.

A los 60 días se observó que algunos de los embriones somáticos formados a partir

de los callos, en el medio de cultivo para la formación y diferenciación con 1.0 mg.L-

1 de 6-BAP, se encontraban en la etapa de torpedo (Figura 6 A). En todos los

tratamientos se observó a los 80 días de cultivo un alto porcentaje de embriones

somáticos en etapa cotiledonal (Figura 6 B).

Figura 6. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla king formados a partir de callos con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP (A. Embriones somáticos a los 60 días de cultivo y B. Embriones somáticos en etapa cotiledonal a los 80 días de cultivo).

A

B

A B

A B


- 110 -

Al comparar el efecto del 6-BAP sobre la embriogénesis somática indirecta (Tabla

4),

se encontró que en los tratamientos donde se adicionaron las concentraciones de

esta citoquinina al medio de cultivo los porcentajes de ESAF y ESBF fueron

superiores a los obtenidos en el control.

Los valores más altos del número de callo con ESAF y ESBF se presentaron en los

callos que fueron cultivados en el medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP, este

tratamiento manifestó diferencias significativas con el resto de los tratamientos.

Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo

Callo con Embriogénesis somática de alta frecuencia

Callo con Embriogénesis somática de baja frecuencia

Concentraciones de 6-BAP (mg.L-1)

No. callo/frasco Porcentaje No. callo/frasco Porcentaje 0.0 1.43 c 23.81 % 0.67 d 11.13 % 0.5 2.77 b 46.15 % 1.71 c 28.56 % 1.0 3.18 a 53.01 % 2.04 a 33.92 % 2.0 2.82 b 47.00 % 1.83 b 30.61 %


Los resultados demuestran que la adición de 6-BAP al medio de cultivo incrementa

significativamente la formación de embriones somáticos en los callos originados a

partir de secciones de cotiledones. Nos muestran también que este proceso se

logra sin la presencia de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo.

Resultados similares fueron descrito en otras especies Meliaceas como:

Azadirachta excelsa y Azadirachta indica, donde se señala que los callos cultivados

con 1.0 mg.L-1 de esta citoquinina presentaron una formación de embriones


- 111 -

somáticos superior con respecto a los que se cultivaron en el medio de cultivo sin

reguladores de crecimiento (Giagnacovo et al., 2001; Salvi et al., 2001).

En cuanto al número de embriones somáticos por callo, los valores máximos se

obtuvieron en los callos que se cultivaron en un medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de

6-BAP, con diferencias con respecto a los demás tratamientos (Tabla 5). La

presencia de los embriones somáticos en los callos cultivados con esta citoquinina,

demostró el efecto de la misma en la formación de embriones somáticos en

Swietenia macrophylla King.

Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el número de embriones somáticos por callo y el desarrollo de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 80 días de cultivo

Concentraciones de 6-BAP (mg.L -1)

No. de ES por callo

No. de ES por callo en etapa cotiledonal

Porcentaje de ES en etapa cotiledonal

0.0 18.73 d 15.58 d 83.21 % 0.5 31.62 c 27.58 c 87.23 % 1.0 43.35 a 40.37 a 93.12 % 2.0 36.18 b 32.83 b 90.74 %


En la embriogénesis somática en Meliaceas como Cedrela fissilis Vellozo y Cedrela

odorata utilizan el 6-BAP en los medios de cultivo para la formación y

diferenciación de embriones somáticos. En estas especies los valores más altos del

número de embriones somáticos por callo fueron obtenidos con 1.0 mg.L-1de 6-BAP

(Da Costa et al., 2002; Muños, 2003).

Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo de

los embriones somáticos formados a partir de callos a los 80 días de cultivo, se

observó que un alto porcentaje de embriones somáticos alcanzaron la etapa


- 112 -

cotiledonal en todos los tratamientos. El valor más alto del número de embriones

somáticos por callo en esta etapa de desarrollo, se presentó cuando se añadió al

medio de cultivo 1.0 mg.L-1 de esta citoquinina, con diferencias significativas con

respecto a los otros tratamientos.

Con los resultados obtenidos se demostró el efecto del 6-BAP en el desarrollo de

los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King formados a partir de callos.

En especies leñosas como Eucalyptus globulus Labill y Quercus suber L, la adición

de concentraciones de 6-BAP en el rango de 0.5–1.5 mg.L-1 al medio de cultivo

incrementó los valores de embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal

(Pinto et al., 2002; Hernández et al., 2003).

Resultados similares respecto a la utilización de bajas concentraciones de 6-BAP

(0.5 - 1.0 mg.L-1) para la diferenciación de embriones somáticos fueron obtenidos

en otras especies leñosas como Psidium guajava L. cv. EEA 18-40 y Coffea arabica

L. cv. Caturra rojo (Vilches et al., 2001; Barbón et al., 2002).

Estos resultados demostraron que la formación y diferenciación de embriones

somáticos a partir de callos en Swietenia macrophylla King se favoreció con la

adición de 6-BAP al medio de cultivo. Con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP se obtienen los

mayores porcentajes de ESAF y ESBF, así como el mayor número de embriones

somáticos por callo y embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal.

4.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King

4.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones

somáticos


- 113 -

Al evaluar el efecto de los diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de

los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King a los 60 días de

transferidos al medio de cultivo MS modificado, observamos que en los explantes

que fueron deshidratados durante 72 y 96 horas el porcentaje de supervivencia

disminuyó. Los valores más bajos de esta variable se presentaron en el tratamiento

donde los embriones somáticos fueron expuesto al mayor tiempo de deshidratación

(Tabla 6). Resultados similares fueron obtenidos por Chand y Kumar (2001), los

cuales realizaron estudios sobre la deshidratación de los embriones somáticos en la

fase de maduración en la especie Hardwickia binata Roxb y demostraron que los

explantes expuestos a este proceso durante 72 o más horas posteriormente

presentaron afectaciones en la supervivencia.

Tabla 6. Efecto de diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo

Supervivencia de los

ES

Germinación completa

Embriogénesis somática secundaria

Tiempo de

deshidratación (horas). No.

ES/frasco Porcentaje

(%) No.


(%) No.


(%) 0.0 20.00 a 100.00 11.14 a 55.72 8.06 40.31

24.0 20.00 a 100.00 10.24 b 51.18 7.96 39.81 72.0 18.20 b 91.00 7.27 c 36.37 8.12 40.63 96.0 15.17 c 75.86 4.28 d 21.43 8.23 41.19 E. E. ± 0.21 ± 0.22 N.S

Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Cuando los embriones somáticos fueron expuestos a diferentes tiempos de

deshidratación los porcentajes de germinación disminuyeron. El mayor valor de esta

variable lo presentó el control y mostró diferencias significativas con el resto de los

tratamientos. Con este resultado se demostró que en la especie Swietenia

macrophylla King, la deshidratación de los embriones somáticos por el método


- 114 -

empleado y en los tiempos probados, influyó negativamente en la germinación. Este

resultado no coincide con los obtenidos por Choi y Jeong (2003) los cuales plantean

que en la especie Siberian ginseng se incrementaron los porcentajes de

germinación después de haber expuesto los embriones somáticos a 72 horas de

deshidratación. Sin embargo, coincide con Kumria et al. (2003) quienes plantearon

que la deshidratación de los embriones somáticos en Gossypium hirsutum no indujo

respuesta positiva en la germinación.

Algunos autores han encontrado que con la exposición de los embriones somáticos

a tiempos de deshidratación en el rango de 48–96 horas se reduce la

embriogénesis somática secundaria asociada a los mismos en especies como en

Populus spp (Lakshmi, 1999) y Acacia caven (Marinucci et al., 2004). Sin embargo,

estos resultados difieren de los resultados obtenidos ya que con ninguno de los tres

tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se obtuvieron

porcentajes de embriogénesis secundaria significativamente inferiores al control.

Los resultados obtenidos demostraron que la deshidratación afectó la maduración

de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King, ya que con los tres

tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se lograron

porcentajes de germinación inferiores al control.

4.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de

los embriones somáticos

A los 30 días de cultivo los embriones somáticos mostraron una apariencia diferente

en los medios de cultivo con seis y ocho porciento de sacarosa, estos presentaron

un incremento de tamaño, así como una coloración blanca opaca y pronunciación


- 115 -

del polo radicular. Mientras que, los explantes cultivados en el tratamiento uno (4.0

% de sacarosa) mantuvieron el color blanco traslúcido, aunque también con un

aumento de tamaño (Figura 7).

Figura 7. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King en el medio de cultivo de maduración a los 30 días de cultivo (A. 4.0 % de sacarosa; B. 6.0 % de sacarosa; C. 8.0 % de sacarosa). Se ha demostrado que los agentes osmóticos activos como la sacarosa pueden

inhibir el proceso de germinación precoz y en algunos casos es más efectivo el

establecimiento de alta presión osmótica en el medio de cultivo que el aporte

exógeno de ABA (Perán-Quesada, 2001).

El cambio de coloración de blanco-traslucido a blanco-opaco en los embriones

somáticos de Swietenia macrophylla King debido al incremento de las

concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo para la maduración, puede ser

un indicador del aumento de almacenamiento de sustancias de reserva y de

maduración.

En la especie Persea americana L. Márquez et al. (2003), demostraron que el

cambio de color de blanco-traslucido a blanco-opaco en los embriones somáticos,

era una respuesta al incremento de sustancias de reserva, lo cual mejoró la

A B C


- 116 -

maduración. Estos autores obtuvieron la mayor cantidad de embriones blancos–

opacos cuando adicionaron al medio de cultivo de 5.0 a 7.0 % de sacarosa.

Cuando evaluamos el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la

supervivencia y la germinación completa de los embriones somáticos de Swietenia

macrophylla King. A los 60 días de transferidos al medio de cultivo compuesto por la

mitad de las sales MS, vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa, observamos que la

supervivencia se afectó con el empleo de explantes provenientes del medio de

cultivo con 8.0 % de sacarosa, que fue significativamente inferior al resto de los

tratamientos (Tabla 7). Resultados similares fueron obtenidos por Márquez et al.

(2003), los cuales realizaron estudios sobre la influencia de agentes osmóticos

activos en la fase de maduración de los embriones somáticos en la especie Persea

americana L y demostraron que los explantes cultivados durante períodos de 15 y

30 días con concentraciones de sacarosa superiores a 7.5 % posteriormente

presentaron afectaciones en la supervivencia.

Tabla 7. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la supervivencia y la germinación completa de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo

Supervivencia de los ES Germinación completa de los ES Tratamientos No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%)

Control 7.00 a 100.00 2.74 d 39.14 1 7.00 a 100.00 4.59 b 65.64 2 7.00 a 100.00 5.33 a 76.17 3 6.51 b 93.00 3.77 c 53.83

E. E. ± 0.08 ± 0.11 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05 según la prueba de Duncan. Tratamientos

1. Embriones somáticos cultivados en 4.0 % de sacarosa. 2. Embriones somáticos cultivados en 6.0 % de sacarosa. 3. Embriones somáticos cultivados en 8.0 % de sacarosa.

Control. Embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones de sacarosa.


- 117 -

La adición de sacarosa en el rango de 4.0 a 8.0 % al medio de cultivo incrementó

significativamente la maduración de los embriones somáticos. Los explantes

provenientes de los medios de cultivo con las diferentes concentraciones de este

agente osmótico, después de cultivados durante 60 días en el medio de cultivo MS

modificado presentaron un mayor porcentaje de germinación que el control, los

mejores resultados se obtuvieron en el tratamiento dos.

Al analizar los resultados se observó, que con el empleo de embriones somáticos

madurados con la mayor concentración de sacarosa (8.0 %), se presentó una

disminución de la germinación. Resultados similares fueron obtenidos por Abedini et

al. (2000), los cuales señalaron que en la especie Acacia caven la maduración de

los embriones somáticos con concentraciones de sacarosa superiores al 7.5 %

produjo una afectación de la germinación. Estos mismos autores atribuyeron la

causa de la disminución de los valores de esta variable a las altas concentraciones

de este agente osmótico, el cual está correlacionado con la mortalidad celular.

Con respecto a la embriogénesis somática secundaria, se presentaron porcentajes

inferiores al control. Los valores más bajos de esta variable se obtuvieron en los

embriones somáticos madurados con las mayores concentraciones de sacarosa

(6.0 y 8.0 %) con diferencias significativas con el tratamiento uno (4.0 % de

sacarosa) (Tabla 8).

Tabla 8. Número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria y malformados bajo el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa a los 60 días de cultivo en Swietenia macrophylla King

ES con Embriogénesis secundaria ES malformados Tratamientos No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%)

Control 2.88 a 41.12 0.09 d 1.28 1 1.83 b 26.18 0.30 c 4.32 2 1.69 c 24.12 0.67 b 9.54 3 1.65 c 23.63 1.24 a 17.65



- 118 -

Tratamientos

1. Embriones somáticos cultivados en 4.0 % de sacarosa. 2. Embriones somáticos cultivados en 6.0 % de sacarosa. 3. Embriones somáticos cultivados en 8.0 % de sacarosa. Control. Embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones de sacarosa. ES: Embriones somáticos.

Los porcentajes inferiores de embriogénesis somática secundaria en Swietenia

macrophylla King presentados en los tratamientos en los cuales los explantes

fueron cultivados con las más altas concentraciones de sacarosa estudiadas, nos

demuestra que los embriones somáticos sometidos a un proceso de maduración

con este agente osmótico alcanzaron una etapa de desarrollo más avanzada que

los embriones somáticos que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones

de sacarosa. Estos resultados coinciden con Fernández et al. (1995), los mismos

señalaron que en la especie Quercus suber L, los embriones somáticos cultivados

en un medio de cultivo MS con concentraciones de sacarosa en el rango

comprendido entre 6.0 y 9.0 %, presentaron porcentajes de embriogénesis somática

secundaria inferiores con respecto a los embriones somáticos que no recibieron un

tratamiento de maduración.

En otra especie leñosa como Quercus robur L, Cuenca et al. (1999) y Zegzouti et al.

(2001), demostraron que con el aumento del estado de madurez de los embriones

somáticos, disminuyó la embriogénesis somática secundaria. Estos autores

demostraron con el empleo de técnicas de cortes histológicos, en la especie

anteriormente mencionada, que los embriones somáticos cultivados durante 30 días

con altas concentraciones (6.0 – 9.0 %) de sacarosa, presentaron un número de


- 119 -

células embriogénicas predeterminada muy bajo al ser comparados con embriones

somáticos inmaduros.

El incremento o la disminución de la embriogénesis somática secundaria tiene una

alta dependencia de la presencia o no de células embriogénicas predeterminadas

en los tejidos epidérmicos de los embriones somáticos y en la medida que estos son

más diferenciados desciende su carácter embriogénico (Parrott, 2002).

Con el aumento de las concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo para la

maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King, se

incrementaron los porcentajes de embriones somáticos malformados estos

explantes aumentaron aproximadamente tres veces su tamaño inicial y adquirieron

una forma redondeada con aspecto hiperhídrico. Los valores más altos de esta

variable se presentaron en el tratamiento donde los explantes fueron cultivados con

la mayor concentración (8.0 %) de este agente osmótico.

Varios autores han señalado que la adición de altas concentraciones (5.0 – 10.0 %)

de sacarosa al medio de cultivo en la fase de maduración es una de las causas que

aumenta la malformación de los embriones somáticos (Fernández et al. 1995;

Cuenca et al., 1999; Svobodova et al., 1999). Comportamientos similares en el

porcentaje de embriones somáticos deformados han sido descrito por Zegzouti et al.

(2001), para la fase de maduración en Quercus robur L.

Sobre la base de estos resultados se puede concluir que con la adición de altas

concentraciones de sacarosa al medio de cultivo se estimula la maduración de los


- 120 -

embriones somáticos en Swietenia macrophylla King, pues en el tratamiento con 6%

de este agente osmótico no se afectó la supervivencia de los embriones somáticos,

se obtiene el mayor porcentaje de germinación completa de los embriones

somáticos y bajos niveles de embriogénesis somática secundaria.


4.4.1 Efecto del 6-BAP y el AG3 sobre la germinación de embriones somáticos

Cuando evaluamos el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 en la

germinación de embriones somáticos en Swietenia macrophylla King se puede

observar que el mayor porcentaje de embriones somáticos con germinación

completa se obtuvo en el medio de cultivo control con diferencias significativas con

el resto de los tratamientos (Tabla 9). Los valores de esta variable disminuyeron con

el incremento de las concentraciones de 6-BAP y no se observó respuesta cuando

se le añadió al medio de cultivo AG3 .

Tabla 9. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 en la germinación de embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo

Germinación completa de los ES

Germinación parcial de los ES

Tratamientos

No. ES/frasco Porcentaje No. ES/frasco Porcentaje Control 5.43 a 77.62 % 0.93 a 13.35 % 0.2 mg.l-1 de 6-BAP 2.75 b 39.34 % 0.81 b 11.54 % 0.4 mg.l-1 de 6-BAP 2.53 c 36.19 % 0.44 c 6.26 % 0.6 mg.l-1 de 6-BAP 1.76 d 25.16 % 0.18 d 2.58 % 1.0 mg.l-1 de AG3 0.00 e 0.0 % 0.13 de 1.83 % 2.0 mg.l-1 de AG3 0.00 e 0.0 % 0.08 e 1.12 % E. E. ± 0.06 ± 0.02

Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Algunos autores han señalado que la adición de 6-BAP al medio de cultivo

incrementa la germinación de los embriones somáticos (Barbón et al., 2002; Vilchez


- 121 -

et al., 2004). Sin embargo, en la Swietenia macrophylla King, los resultados

obtenidos indicaron que las concentraciones de 6-BAP añadidas al medio de cultivo

influyeron negativamente en la germinación de los embriones somáticos y se

demostró que los mejores resultados en esta etapa se presentaron en el medio de

cultivo sin reguladores de crecimiento.

El porcentaje de embriones somáticos con germinación parcial disminuyó con el

incremento de las concentraciones de 6-BAP. En los tratamientos donde se

adicionó al medio de cultivo AG3 los embriones somáticos solamente emitieron el

brote apical; mientras que, en los otros tratamientos se produjo la formación y

desarrollo del brote apical y radical.

Varios autores han mencionado que con el empleo de bajas concentraciones (1.0 –

2.0 mg.L-1) de AG3 lograron romper el estado de dormancia de los embriones

somáticos e incrementaron la germinación de los mismos en especies como:

Hyophorbe lagenicaulis (Sarasan et al., 2002), Siberian ginseng (Choi y Jeong,

2003) y Gossipyum hirsutum (Kumria et al., 2003). Dicho criterio no coincide con

los resultados obtenidos ya que las dos concentraciones de AG3 probadas (1.0 y 2.0

mg.L-1) solo estimularon el desarrollo de brote apical en los embriones somáticos e

inhibieron la emisión de raíz. Sin embargo, los embriones somáticos germinados a

los 60 días en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento presentaron las

características típicas de planta y alcanzaron una altura de tres a cinco cm,

presencia de raíz definida y de tres a cinco hojas verdaderas (Figura 8). Los

resultados mencionados anteriormente confirma lo planteado por Parrott (2002)


- 122 -

relacionado con que la germinación de los embriones somáticos puede ocurrir sin

la presencia de reguladores de crecimiento.

Figura 8. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King germinados después de 60 días en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento.

Fueron observados valores altos para el porcentaje de embriones somáticos con

embriogénesis secundaria en todos los tratamientos, pero el mayor valor de esta

variable se alcanzó cuando se le adicionó al medio de cultivo 0.6 mg.L-1 de 6-BAP

(Tabla 10). Con este resultado se demostró que en la especie Swietenia

macrophylla King la embriogénesis somática repetitiva puede ocurrir en ausencia de

auxinas exógena, de acuerdo a las condiciones de cultivo desarrolladas.

Tabla 10. Número de embriones somáticos que desarrollaron embriogénesis secundaria en Swietenia macrophylla King bajo el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 a los 60 días de cultivo

Embriones somáticos con embriogénesis secundaria Tratamientos No. de ES por frasco Porcentaje (%)

Control 2.81 d 40.17 0.2 mg.l-1 de 6-BAP 3.19 c 45.53 0.4 mg.l-1 de 6-BAP 3.74 b 53.43 0.6 mg.l-1 de 6-BAP 4.16 a 59.36 1.0 mg.l-1 de AG3 2.68 e 38.33


- 123 -

2.0 mg.l-1 de AG3 2.60 f 37.15 E. E. 0.02

Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.

Con el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento se obtuvieron los mayores

porcentajes de germinación completa y parcial de los embriones somáticos,

mientras que, con el 6-BAP se produce una disminución de la germinación e

incremento de la embriogénesis somática secundaria y el AG3 provoca inhibición de

la germinación completa con los mas bajos valores de germinación parcial.


- 124 -

Conclusiones


- 125 -

5. CONCLUSIONES

1. Con el empleo de un medio de cultivo MS con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0 mg.L-1 de

kinetina se desarrolló la embriogénesis somática directa a partir de embriones

cigóticos inmaduros.

2. Los mayores porcentajes de embriones somáticos en etapas de torpedo y

cotiledonal se alcanzaron con una concentración de 0.4 mg.L-1 de 6-BAP en el

medio de cultivo.

3. Con una concentración de 4.0 y 6.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de

kinetina se obtuvieron los mayores porcentajes de formación de callo, 96.98% y

97.02% respectivamente.

4. Se lograron los mayores porcentajes (53.01 % y 33.92 %) de ESAF y ESBF, el

mayor número (43.35) de embriones somáticos por callo y embriones somáticos

en etapa cotiledonal con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP.

5. El proceso de deshidratación afectó la maduración de los embriones somáticos,

con los tratamientos aplicados, los porcentajes de germinación obtenidos fueron

inferiores a los logrados con el control

6. Con un 6.0 % de sacarosa se obtuvo el mayor porcentaje (76.17 %) de

germinación completa de los embriones somáticos y bajos niveles de

embriogénesis somática secundaria.


- 126 -

7. Los mayores valores (77.62 % y 13.35 %) de germinación completa y parcial de

los embriones somáticos se lograron en un medio de cultivo sin reguladores del

crecimiento.

Recomendaciones


- 127 -

6. RECOMENDACIONES

- Realizar otros estudios para mejorar la fase de maduración de los embriones

somáticos.

- Estudiar la fase de conversión de los embriones somáticos germinados in vitro.

- Emplear otros tipos de explantes para el proceso de embriogénesis.

- Determinar marcadores bioquímicos que caractericen el proceso de embriogénesis

somática.


- 128 -

Referencias Bibliográficas


- 129 -

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