Espectroscopía electrónica de biomoléculas en el UV cercano

Siempre subestimada

¿Quiénes absorben en el UV cercano?

• Transiciones electrónicas de baja energía → ”espacio” para los electrones (caja grande)

• Aromáticos!

En biomoléculas tenemos a varios fragmentos aromáticos

En proteínas En ácidos nucleicos

Genial… ¿sirve para algo?

• Todos absorben en el UV cercano (entre 240 y 300 nm)• Los coeficientes de extinción son relativamente altos• ¡Cuantificación!: Proteínas A280; ácidos nucleicos A260

Cuantificación de ácidos nucleicos

• Todos los monómeros absorben →Absorción intensa a 260• RNA con A260 = 0.1 tiene ≈ 3 µg/ml

• Coeficientes de extinción similares• En ácidos nucleicos de composición al azar

estimación precisa

• DNA ≠ RNA (T vs. U)

• ¡Depende de la hibridación! (efecto hipocrómico por apliamiento de bases)

Cuantificación de proteínas

• Solamente aromáticos absorben →absorptividad dependiente de composición

• Se puede calcular con bastante precisión• EXPASY protparam• ε280 ≈ 5500 NTrp + 1400 NTyr

• Por abundancia promedio, 1 mg/ml≈ 1 OD280 (¡mucho menos que NA!)

Cuantificación, de acuerdo. ¿Algo más?

• En ácidos nucleicos, la hibridación cambia la absorptividad

• En proteínas, el entorno de las cadenas laterales aromáticas desplazan el espectro

• Ionización/pte H

• Polaridad

Cuantificación, de acuerdo. ¿Algo más?

• En ácidos nucleicos, la hibridación cambia la absorptividad

• En proteínas, el entorno de las cadenas laterales aromáticas desplazan el espectro• Ionización/pte H• Equilibrio Tyr-OH ⇌ Tyr-

O- (pKa ≈ 10.5)• Polaridad

El espectro UV cercano de proteínas NOes la suma de los espectros de los aminoácidos(!)Hay info… ¿se puede usar?

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

250 260 270 280 290 300 310 320

Ab

s

Long. de onda (nm)

BSA Mezcla equimolar Tyr + Trp

Transiciones en el benceno prohibida por simetría

a2u

b2g

e2u

e1g

→ (e1g)3(e2u)

1h𝜈

La transición de menor energía en el benceno está “prohibida por simetría (!)• La transición

electrónica “pura” tiene muy poca intensidad

• Se magnifican las transiciones vibriónicas(vibracionales + electrónicas)

• La estructura fina de la banda tiene info de vibraciones (!)

Buscando información bajo el espectro

• “Estructura fina” → variaciones rápidas sobre una envolvente suave

• Se pueden magnificar aplicando derivadas

• Las derivadas pares dan máximos en los máximos de las bandas finas

Las derivadas también ayudan a sacarse de encima las líneas de base

• Dispersión

• Ácidos nucleicos(!)

In real life

• Espectros de BSA y de mezcla equimolar

• Se independiza de línea de base

• BSA → Tyr y Trp en ambientes varios

• Corrimiento de los máximos al rojo

• Dispersión de las bandas de estructura fina

In real life• Complejo de proteínas

• Espectro aburrido

• Las fenilalaninas saludan desde la derivada segunda

Para recordar

• Los cromóforos aromáticos de las biomoléculas tienen bandas de absorción en el UV cercano (240 nm - 340 nm)• Ácidos nucleicos → bases nitrogenadas (¡las 5!)• Proteínas → AA aromáticos: Phe, Tyr, Trp (F, Y W)

• La absorción se puede utilizar para cuantificar en forma directa y con precisión la concentración de prots y ácidos nucleicos

• Los espectros tienen info estructural• Hibridación en ácidos nucleicos• Entorno de aromáticos en proteínas

• Si van a usar espectrofotometría UV para cuantificar proteínas o ácidos nucleicos, no se limiten a medir A260 o A280… ¡HAGAN ESPECTROS!• Verifiquen que lo que absorbe a 280 o 260 es proteína o ácido nucleico (forma del espectro) y

no otra cosa (dispersión, contaminantes)• En proteínas, espectros de derivada → huella dactilar