einfluss von zell- und bakterienkulturüberständen auf die ... · metritis, endometritis oder...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen

auf die In-vitro-Differenzierung

boviner Makrophagen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Christine Gesterding, geb. Schütz

Heidelberg

Hannover 2015

I

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth

Arbeitsgruppe Immunologie

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth

2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Ralph Goethe

Tag der mündlichen Prüfung: 13. Mai 2015

Gefördert mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (EMIDA ERA-Net: iPUD)

II

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Zielsetzung 1

2 Literaturübersicht 3

2.1 Mononukleäre Zellen und deren Rolle im Entzündungsgeschehen 3

2.1.1 Monozyten und Monozyten-Subpopulationen 3

2.1.2 Makrophagen und Makrophagenplastizität 4

2.1.3 Ausgewählte Oberflächenantigene von Monozyten und Makrophagen 6

2.1.4 Das Chemokin CCL5 8

2.2 Bildung Reaktiver Sauerstoffspezies 9

2.3 Die Transitperiode 10

2.3.1 Monozytäre Zellen im graviden Uterus 12

2.3.2 E.-coli-Infektionen des Uterus 14

2.3.3 E.-coli-Mastitis 15

2.4 Das E.-coli-Sekretom 17

3 Material und Methoden 20

3.1 Versuchstiere 20

3.2 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes 21

3.2.1 Gewinnung von mononukleären Zellen 21

3.2.2 Gewinnung von Monozyten 21

3.2.3 In-vitro-Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten 22

3.2.4 In-vitro-Stimulation boviner Makrophagen 22

3.3 Durchflusszytometrie 24

3.3.1 Phänotypisierung boviner Makrophagen mittels Membranimmunfluoreszenz 25

3.3.2 Messung reaktiver Sauerstoffspezies boviner Makrophagen 26

3.3.3 Intrazelluläre Kalziummessung 27

3.4 Quantitative real time Polymerasekettenreaktion 29

3.4.1 Aufbereitung von messengerRNA aus bovinen Makrophagen 29

III

3.4.2 Qualitative und quantitative Analyse der RNA mit dem Experion Automated Electrophoresis System 30

3.4.3 Synthese von komplementärer DNA durch Reverse Transkription 30

3.5 Prinzip der quantitativen real time Polymerasekettenreaktion 31

3.5.1 Probenmessung 32

3.6 Statistische Auswertung 34

4 Ergebnisse 36

4.1 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen auf Monozyten 36

4.1.1 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyten durch Überstände von uterinen Zellkulturen 36

4.1.2 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyten durch Überstände verschiedener E.-coli-Isolate 38

4.2 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen auf Phänotyp und Funktionalität in-vitro-differenzierter Makrophagen 40

4.2.1 Zellkulturüberstände 40

4.2.2 E.-coli-Kulturüberstände 42

4.3 Einflüsse auf das Genexpressionsmuster in-vitro-differenzierter Makrophagen 50

4.3.1 Reifung unter E.-coli-Kulturüberständen führte zu einer verstärkten Genexpession 50

4.3.2 Reifung unter CCL5 führte zu einer verminderten Genexpression 52

4.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der Transitperiode 53

4.4.1 Phänotypische Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen 53

4.4.2 Funktionelle Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen 56

5 Diskussion 59

5.1 Induktion eines Kalziumeinstroms in Monozyten durch Bakterien- und Zellkulturüberstände 59

5.2 Einfluss von Bakterien- und Zellkulturüberständen auf die In-vitro-Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen 62

IV

5.3 Einflüsse von CCL5 und E.-coli-Überständen auf die Genexpression in-vitro-differenzierter Makrophagen 66

5.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der Transitperiode 68

6 Zusammenfassung 73

7 Summary 76

8 Literaturverzeichnis 78

9 Anhang 96

9.1 Geräte 96

9.2 Material 97

9.2.1 Klinikbedarf 97

9.2.2 Laborbedarf 97

9.2.3 Reagenzien 98

9.2.4 Antikörper 100

9.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen 100

9.2.6 Genspezifische Primer für die qPCR 102

9.3 Verzeichnis der verwendeten Abbildungen 103

9.4 Verzeichnis der verwendeten Tabellen 105

VI

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

°C Grad Celsius µ Mikro (x 10-6)

µm Mikrometer A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) AE-Läsionen Attaching-and-effacing-Läsionen (typische, durch Anheftung

verschiedener Escherichia-coli-Bakterien verursachte Läsionen des Darmepithels)

APC Antigen Presenting Cell (Antigenpräsentierende Zelle) APEC Aviär-pathogene Escherichia coli Arg 1 Arginase 1 A. tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) ANOVA Analysis of Variance (Varianzanalyse) BCS Body Condition Score (Körperkonditionsindex) bo Bovin B. pertussis Bordetella pertussis BSA Bovines Serumalbumin bzw. Beziehungsweise ca. Circa Ca2+ Kalzium CCL β-Chemokinligand mit zwei Cysteinmolekülen in Folge CCR CC-Chemokinrezeptor CD Cluster of Differentiation (Unterscheidungsgruppen) cDNA Complementary Desoxyribonucleic Acid (komplementäre

Desoxyribonukleinsäure) cm Zentimeter cM Klassische Monozyten CMT California Mastitis Test CO2 Kohlenstoffdioxid CR Complement Receptor (Komplementrezeptor) Ct Cycle threshold, Beginn des exponentiellen Wachstums CXCL α-Chemokinligand mit zwei Cysteinmolekülen, die durch eine

beliebige Aminosäure getrennt werden DAEC Diffus-adhärente Escherichia coli DAMP Damage-Associated Molecular Patterns (Zellschaden-assoziierte

molekulare Muster) DHR Dihydrorhodamin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTPs Desoxynucleotide Triphosphates (Desoxyribonukleotid-

Triphosphate) DTT Dithiothreitol EAEC Enteroaggregative Escherichia coli E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli

VII

EIEC Enteroinvasive Escherichia coli EnPEC Endometrium-pathogene Escherichia coli Epi. Epithelzellüberstände Epi. LPS LPS-stimulierte Epithelzellüberstände Et al. Et alii (lateinisch: und andere) ETEC Enterotoxische Escherichia coli ExPEC Extraintestinal-pathogene Escherichia coli FcR Fragment crystallisable Receptor (Immunglobulinrezeptor) FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum) FFS Freie Fettsäuren FITC Fluoresceinisothiocyanat FL1, 2, 3, 4 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz

FL1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm FL2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 20 nm, FL3 = Rotfluoreszenz, > 650 nm FL4 = Violettfluoreszenz, 675 ± 12,5 nm

Fluo-4 Acetoxymethyl Ester Kalzium Indikator FMLP N-formyl-methionyl-leucyl-methionin FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des

Accuri C6® g Gramm GCSF Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor gDNA Genomic DNA (genomische DNA) GH Growth Hormone (Wachstumshormon) GMCSF Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor h Hora (Stunde) HBSS Hank’s Balanced Salt Solution hCG Humanes Choriongonadotropin hlyA Hämolysin α HO- Hydroxylradikal H2O2 Hydrogenperoxid hu Human IFN Interferon Ig Immunglobulin IGF Insulin-like Growth Factor (Insulinähnlicher Wachstumsfaktor) IL Interleukin intM Intermediäre Monozyten ITGAM Integrin alpha M kDa Kilodalton, Einheit der Molekülmasse L Liter LEE Locus of Enterocyte Effacement, Pathogenitätsinsel LPS Lipopolysaccharid m Milli (x 10-3) MACS Magnetic Cell Separation (magnetische Zellseparation) MdM Monocyte derived Macrophages (Monozyten-gereifte

Makrophagen) MFI Mittlere Fluoreszenzintensität

VIII

MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)

MIF Membranimmunfluoreszenz Min. Minute(n) MLEE Multi-Locus-Enzyme-Elektrophoresis MLST Multilokus-Sequenztypisierung mm Millimeter MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) mol Mol MPS Mononukleäres Phagozytosesystem mrc1 Mannose Rezeptor C Typ 1 mRNA Messenger Ribonucleic Acid (Boten-Ribonukleinsäure) mu Murin n Nano (x 10-9) n = Fallzahl, Anzahl der Einzelbeobachtungen bei der Berechnung

des Mittelwertes NaCl Natriumchlorid NADPH Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat ncM Nicht-klassische Monozyten NEB Negative Energiebilanz NEFA Nonesterified Fatty Acids (unveresterte Fettsäuren) NK-Zelle Natürliche Killerzelle NMEC Neugeborenenmeningitis-assoziierte E. coli NO Stickstoffmonoxid NOS Nitric Oxide Synthase (Stickstoffmonoxid Synthase) O2 Sauerstoff O2

2- Peroxid-Anion O2

- Superoxid-Anion p (-Wert) Probability Value, Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der

Ähnlichkeit zweier Datengruppen PAI Pathogenitätsinsel PAF Plättchenaktivierender Faktor PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (Pathogen-assoziierte

molekulare Muster) PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PJ Propidiumjodid PMN Polymorphonuclear Leukocytes (polymorphkernige Leukozyten) po Porzin p.p. Post partum (nach der Geburt) PRR Pattern Recognition Receptor (Mustererkennender Rezeptor) qPCR Quantitative real time PCR (quantitative Echtzeit-PCR) R2 Determinationskoeffizient

RANTES Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted (reguliert durch Aktivierung, von normalen T-Zellen exprimiert und sezerniert)

RNA Ribonucleic Acid (Ribonukleinsäure)

IX

RNase Ribonuklease ROS Reactive Oxygen Species (reaktive Sauerstoffspezies) S. aureus Staphylococcus aureus S. uberis Streptococcus uberis Sec Secretory Pathway (sekretorischer Weg) Sek. Sekunde(n) SepEC Sepsis-assoziierte Escherichia coli SEM Standard Error ot the Mean, Standardfehler, errechnet sich aus

der Standardabweichung geteilt durch die Quadratwurzel der Fallzahl (n) der Stichprobe

SN Supernatant (Überstand) SOD Superoxiddismutase sog. Sogenannt SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des

Accuri C6® STB Eschrichia-coli-Enterotoxin B Str. Stromazellüberstände Str. LPS LPS-stimulierte Stromazellüberstände TLR Toll-like Receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor) Th-Zelle T-Helferzelle TNF Tumornekrosefaktor T. pyogenes Trueperella pyogenes uNK-Zelle Uterine natürliche Killerzelle UPEC Uropathogene Escherichia coli UXT Ubiquitously Expressed Transcript Protein (ubiquitär exprimiertes

Transkriptionsprotein) VF Virulenzfaktor x g Multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s2) z.B. Zum Beispiel

Einleitung und Zielsetzung

1

1 Einleitung und Zielsetzung

Nach der Geburt eines Kalbes entwickelt ein nicht unerheblicher Teil der Kühe eine Metritis, Endometritis oder Mastitis. Das Auftreten dieser klinisch oder subklinisch verlaufenden Entzündungserkrankungen korreliert mit diversen Faktoren wie Geburtsstress, einer Energieunterversorgung nach Einsetzen der Milchleistung und genetischen Dispositionen. Zudem wird angenommen, dass die für die Trächtigkeit erforderliche anti-inflammatorische Ausrichtung des Immunsystems einer adäquaten Antwort auf Pathogene, die post partum (p.p.) in die geöffnete Cervix und Strichkanäle einwandern können, im Wege steht. Die Folgen sind großzügige Antibiotikaeinsätze und Behandlungskosten sowie Begleitschäden wie verminderte Fruchtbarkeit, reduzierte Milchleistung und ein herabgesetztes Tierwohl. Die kritische Zeit, in der viele Faktoren zusammenspielen, die für die Entstehung postpartaler Infektionserkrankungen verantwortlich sind, nennt sich Transitperiode und wird zumeist definiert als die Zeitspanne von 21 Tagen vor bis 21 Tagen nach der Geburt. Sind bakterielle Erreger in das Uterus- oder Euterlumen eingedrungen, erkennen Toll-like Rezeptoren (TLRs) auf den Gewebezellen des Wirtstieres pathogen-assoziierte Bestandteile wie bakterielle Desoxyribonukleinsäure (DNA), Lipide und Lipopolysaccharide (LPS) und sezernieren daraufhin Zytokine, die Entzündungszellen anlocken (SHELDON et al. 2009). Neben den neutrophilen Granulozyten sind Monozyten die ersten Zellen am Entzündungsort. Nach ihrer Bildung im Knochenmark zirkulieren sie einige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe einwandern und dort zu Makrophagen oder dendritischen Zellen reifen. Makrophagen nehmen Schlüsselrollen in der Initialphase einer Entzündung aber auch für die Beendigung von Entzündungsreaktionen ein und sind für die Feinregulation des Entzündungsverlaufs verantwortlich. Je nach Stimulation können morphologisch und funktionell unterschiedliche Makrophagen entstehen, wobei über die genauen Mechanismen der Aktivierung und Steuerung der Differenzierung noch Unklarheit herrscht. Es ist bereits bekannt, dass die Einwanderung ins Gewebe sowie die Differenzierung in Makrophagen von Chemokinen gesteuert wird.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu prüfen, welchen Einfluss das umliegende Gewebe sowie bakterielle Erreger auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung ausüben. So soll die unmittelbare Reaktion von Monozyten auf Überstände von Stromazell-Kulturen sowie von Escherichia coli (E. coli) in vitro erfasst werden. Außerdem sollen unter diesen Überständen gereifte Makrophagen auf ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften sowie ihre Genexpression untersucht werden. Ein Teilaspekt dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Zusammensetzung myeloider Zellen bei Kühen in der Transitperiode. Es wird analysiert, ob die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Transitperiode isolierten Monozyten zu phänotypisch und funktionell unterschiedlichen Makrophagen

Einleitung und Zielsetzung

2

heranreifen oder ob die Zellen eine unterschiedliche Reaktivität auf verschiedene E.-coli-Kulturüberstände aufweisen. Eine Analyse nach Zeitpunkt in der Transitperiode, dem Body Condition Score (BCS) der Tiere, der Laktationszahl und dem postpartalen Gesundheitsstatus sollen zeigen, ob diese Parameter einen prädiktiven Charakter für die Entstehung postpartaler Infektionserkrankungen darstellen. Langfristig soll diese Studie zu neuen Ansätzen der Metritis- und Mastitisprävention durch eine gezielte Modulation der Monozyten-Makrophagen-Differenzierung führen.

Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

2.1 Mononukleäre Zellen und deren Rolle im Entzündu ngsgeschehen

2.1.1 Monozyten und Monozyten-Subpopulationen

Monozyten sind Vorläuferzellen von Makrophagen und entstehen im Knochenmark, wo sie aus Monoblasten über die Zwischenstufe der Promonozyten zu Monozyten reifen und anschließend in den Blutstrom gelangen. Dort zirkulieren sie für einige Tage und machen etwa 5 % der Leukozyten-Gesamtpopulation aus. Sie spielen eine wichtige Rolle als Effektorzellen, die Zelldebris und einwandernde Pathogene phagozytieren sowie als regulatorische Zellen, da sie die Fähigkeit besitzen Antigen zu präsentieren und die Immunantwort durch die Sekretion von Zytokinen (Interleukin (IL) 6, CXCL8, IL1β, Tumornekrosefaktor (TNF) α, Interferon (IFN) α, β) zu modulieren. Neben den neutrophilen Granulozyten sind auch Monozyten in der Lage, ganz früh im Rahmen einer Infektion ins Gewebe auszuwandern, wo sie unter dem Einfluss von Erregerbestandteilen und Zytokinen zu Makrophagen reifen (AUFFRAY et al. 2009). Anhand der Expressionsstärke der Oberflächenmarker Cluster of Differentiation (CD) 14 und 16 lassen sich humane (ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010; WONG et al. 2012) sowie bovine Monozyten in klassische (cM, CD14++/CD16), intermediäre (intM, CD14++/CD16+) und nicht-klassische (ncM, CD14+/CD16++) Subpopulationen unterteilen, wobei cM die größte Subpopulation darstellen (89 %). Da bovine ncM eine reduzierte Phagozytosekapazität, eine geringere Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie eine verminderte messengerRNA (mRNA) -Expression von CXCL8, CXCL1 und IL1B nach LPS-Stimulation aufweisen, werden ihnen überwiegend anti-inflammatorische Eigenschaften zugesprochen (HUSSEN et al. 2013).

Bei Menschen wurden bei vielen Erkrankungen wie Sepsis, Tuberkulose, Hepatitis, Rheuma und Asthma erhöhte Zahlen intermediärer und nicht-klassischer Monozyten im Blut festgestellt (SKRZECZYÑSKA et al. 2002; MONIUSZKOA et al. 2009; CASTAÑO et al. 2011; ZHANG et al. 2011; ROSSOL et al. 2012). Zudem wiesen klinisch erkrankte Patienten besonders häufig erhöhte Konzentrationen nicht-klassischer Monozyten auf, während bei subklinisch erkrankten Patienten der Anteil intermediärer Monozyten erhöht war. Dies ließ WONG et al. (2012) vermuten, dass die Subpopulationen unterschiedliche Aufgaben erfüllen und dass humane intM möglicherweise Entzündungsreaktionen vorantreiben, während ncM an deren Regulation beteiligt sind. Bisher wurden nur wenige Studien an bovinen Zellen durchgeführt, jedoch wurden bei subklinisch an Endometritis erkrankten Kühen keine Unterschiede in der Zusammensetzung der Subpopulationen festgestellt (MAASS 2013).

Literaturübersicht

4

2.1.2 Makrophagen und Makrophagenplastizität

Grundsätzlich beginnen Entzündungsreaktionen mit dem Erkennen molekularer Gefahrensignale. Dies können zum einen Zellkern- und Zytoplasmabestandteile sein, die bei Gewebeschäden aus nekrotischen Zellen freigesetzt werden und als Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs) bezeichnet werden; zum anderen können es Erreger sowie deren Bestandteile (z.B. LPS), sogenannte (sog.) Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), sein. Die Gefahrensignale können das Komplementsystem direkt aktivieren oder von Pattern Recognition Receptors (PRRs) (u.a. Scavenger Rezeptoren, TLRs), die sich auf Makrophagen und vielen anderen Körperzellen befinden, erkannt werden. Eine Erkennung führt zur Freisetzung inflammatorischer Zytokine und dem Anstoß von Entzündungskaskaden. Angelockt von Pathogenen und Entzündungsmediatoren wandern Monozyten ins Gewebe aus und differenzieren dort zu Makrophagen. Diese sind circa (ca.) 15 µm große, runde Zellen mit einem zentralen, runden bis bohnenförmigen Kern, einem hohen Zytoplasmagehalt sowie vielen Mitochondrien und Lysosomen. Häufig bilden sie Dendriten-ähnliche Zytoplasmaausläufer aus.

Als Bestandteile des Mononukleären Phagozytosesystems (MPS) haben Makrophagen zahlreiche Aufgaben wie Phagozytose, Entfernung von Zelldetritus, Antigenpräsentation, Initiation und Regulation von Entzündungsreaktionen und Wundheilung. Ermöglicht wird diese Fähigkeit zur Ausübung zahlreicher Funktionen durch die so genannte Makrophagenplastizität, also die Fähigkeit von ins Gewebe eingewanderten Monozyten, sich abhängig von Umgebungsfaktoren zu phänotypisch und funktionell unterschiedlichen Makrophagen-Subtypen zu entwickeln. Umgebungsfaktoren können zum einen PAMPS, zum anderen körpereigene Substanzen wie Chemokine und Zytokine sein. Um einen Überblick über die verschiedenen Subtypen zu wahren, werden Makrophagen anhand der Aktivierung durch T-Helferzellen (Th) 1- und Th2-Zellen in klassisch aktivierte M1- und alternativ aktivierte M2-Makrophagen eingeteilt (GORDON 2003; DÜVEL et al. 2012). Da sich herausstellte, dass es unter den M2-Makrophagen wiederum unterschiedliche Subtypen gibt, bevorzugen andere Autoren ein Modell der Einteilung nach funktionellen Eigenschaften in Makrophagen der Wirtsabwehr (klassisch aktiviert) und Makrophagen der Wundheilung und Immunregulation (alternativ aktiviert) (EDWARDS et al. 2006; MOSSER u. EDWARDS 2008). Eine Unterteilung in klassisch und alternativ aktivierte Makrophagen haben beide Modelle gemeinsam.

2.1.2.1 Makrophagen der Wirtsabwehr

Ein Priming mit IFNγ und eine anschließende Stimulation mit bakteriellem Endotoxin (z.B. LPS) führen zu einer klassischen Aktivierung und Reifung zu M1-Makrophagen. Diese zeichnen sich durch mikrobizide und tumorizide Eigenschaften aus sowie eine

Literaturübersicht

5

verstärkte Expression inflammatorischer Mediatoren wie IL1B, TNFα, IL12, Stickstoffmonoxid Synthase (NOS) 2, CXCL5 und CCL2 (O'SHEA u. MURRAY 2008; DÜVEL et al. 2012). Sie weisen zudem eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Calprotectin auf. IFNγ wird in vivo von Th1-Lymphozyten oder Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) sezerniert (MOSSER u. EDWARDS 2008). Auch bestimmte TLR-Liganden sind durch Induktion von TNF und IFNβ direkt in der Lage Makrophagen klassisch zu aktivieren (YAMAMOTO et al. 2003). Aufgrund ihres inflammatorischen Zytokinprofils werden klassisch aktivierte Makrophagen als Makrophagen der Wirtsabwehr bezeichnet. So sind Menschen mit angeborenen Defekten der IL12/IFNγ-Achse beispielsweise sehr anfällig für bakterielle und virale Infekte sowie Protozoeninfektionen und sterben bereits im Kindesalter (FILIPE-SANTOS et al. 2006). Morphologisch unterscheiden sich bovine M1-Makrophagen durch einen runden bis spindelförmigen Zellkörper und einen nierenförmigen Kern von den größeren und komplexer gestalteten M2-Makrophagen, die mit einem runden, zentralen Kern und auffallenden Zytoplasmaausläufern ausgestattet sind. Die unterschiedlichen Morphologien ließen DÜVEL et al. (2012) einen unterschiedlichen Metabolismus der Zellen vermuten.

2.1.2.2 Makrophagen der Wundheilung

Eine alternative Aktivierung zu M2-Makrophagen wird durch ein Priming mit IL4 oder IL13 erzielt und lässt Makrophagen entstehen, die große Mengen Arginase 1 (Arg 1) und IL10 produzieren und den Oberflächenmarker CD163 verstärkt exprimieren (GORDON 2003). In-vitro-differenzierte M2-Makrophagen besitzen eine geringere Fähigkeit T-Zellen Antigen zu präsentieren, produzieren weniger inflammatorische Zytokine, weniger toxische Sauerstoff- und Stickstoffradikale und töten intrazelluläre Bakterien weniger effizient als klassisch aktivierte Makrophagen (EDWARDS et al. 2006). Vielmehr sezernieren diese Zellen Komponenten der Extrazellulärmatrix, weshalb sie auch als Makrophagen der Wundheilung bezeichnet werden. Erhöhte IL4- und IL13-Konzentrationen kommen im Körper bei Th2-vermittelten Immunantworten zustande und sind Folgen von Gewebeverletzungen, Störungen der mukosomalen Oberflächen von Darm und Lunge sowie Wurm- und Pilzinfektionen (WILSON et al. 2006; KREIDER et al. 2007; REESE et al. 2007). Die Zytokine werden dabei von Th2-Lymphozyten, basophilen Granulozyten und Mastzellen freigesetzt (BRANDT et al. 2000; SICA u. MANTOVANI 2012). Die Wichtigkeit von M2-Makrophagen wird unter anderem von STIJLEMANS et al. (2010) beschrieben. So kommt es nach einer Infektion mit Afrikanischer Trypanosomiasis zu einem Wechsel der anfänglichen M1- zu einer M2-Antwort, die die Tiere vor schwerwiegenden Anämien und Immunpathologien bewahrt (STIJLEMANS et al. 2010). Allerdings können Makrophagen der Wundheilung im Falle einer Dysregulation auch wirtsschädigend werden. Beispielsweise wird die bei chronischer

Literaturübersicht

6

Schistosomiasis auftretende Gewebefibrose auf eine unkontrollierte Aktivierung von Makrophagen der Wundheilung zurückgeführt (HESSE et al. 2001).

Die Expression von CD163 und Calprotectin sowie von den Zytokinen IL10 und IL12 werden häufig zur Charakterisierung von Makrophagentypen herangezogen. Allerdings konnten DÜVEL et al. (2012) den Anstieg der IL10-Expression bei alternativer Aktivierung für bovine Zellen nicht nachweisen. Bovine Makrophagen zeigten diesen Anstieg lediglich nach LPS-Stimulation. Ein Rückgang von Calprotectin und ein Anstieg der CD163-Expression wurden des Weiteren auch bei unstimulierten bovinen Makrophagen im Laufe der In-vitro-Reifung beobachtet (DÜVEL et al. 2012).

2.1.2.3 Regulatorische Makrophagen

Von MOSSER u. EDWARDS (2008) werden bei humanen Zellen weitere Subtypen, die regulatorischen Makrophagen, beschrieben. Diese können durch die Einwirkung verschiedener Stimuli induziert werden, wobei die Stimulation durch Glucocorticoide der am besten erforschte Weg ist. Glucocorticoide werden stressbedingt ausgeschüttet und vermindern die Makrophagen-vermittelte inflammatorische Wirtsabwehr durch Hemmung der Transkription inflammatorischer Zytokin-Gene und Verminderung der mRNA-Stabilität (STERNBERG 2006). Weitere Faktoren, die als Stimuli für eine Differenzierung zu regulatorischen Makrophagen diskutiert werden sind TLR-Agonisten bei gleichzeitigem Einfluss von Immunkomplexen (Typ-II-Aktivierung), Prostaglandinen oder apoptotischen Zellen. Auch wenn sich die Makrophagen abhängig von den Stimuli unterscheiden, haben sie eine erhöhte IL10-Produktion und eine verminderte IL12-Sekretion gemeinsam, weshalb ihnen anti-inflammatorische Funktionen zugeschrieben werden (GERBER u. MOSSER 2014). Im Unterschied zu Wundheilungsmakrophagen tragen sie nicht zur Produktion von Extrazellularmatrix bei, sondern sind durch die Expression von Haupt-histokompatibilitätskomplex (MHC) -Klasse-II-Molekülen und co-stimulatorischen Molekülen (CD80 und CD86) vermeintlich an der Antigenpräsentation beteiligt (EDWARDS et al. 2006). Somit bestehen sowohl auf funktioneller wie auch auf biochemischer Ebene klare Unterschiede zwischen regulatorischen und Wundheilungsmakrophagen.

2.1.3 Ausgewählte Oberflächenantigene von Monozyten und Makrophagen

CD163

Der Rezeptor CD163 gehört zur cysteinreichen Klasse B der Scavenger Rezeptoren und wird spezifisch nur von Monozyten und Makrophagen exprimiert. Allgemein stellen Scavenger Rezeptoren eine sehr heterogene Gruppe von Oberflächenrezeptoren dar, die geladene Liganden, low density lipoproteins,

Literaturübersicht

7

Antikörper und mikrobielle Bestandteile (z.B. LPS) sowie körpereigene modifizierte Strukturen erkennen können. Sie übernehmen vielschichtige Aufgaben im Körper und wirken bei der Zelladhäsion und Antigenpräsentation mit. Eine der Hauptfunktionen von CD163 liegt in der Bindung von Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexen, wodurch freies Hämoglobin nach Traumata oder aus Entzündungsgebieten von Makrophagen entfernt werden kann (AKILA et al. 2012). In der Immunabwehr spielt CD163 ebenfalls eine große Rolle. Es bindet an TLRs, ist jedoch auch in der Lage bakterielle Strukturen direkt zu erkennen (CANTON et al. 2013). Zusammen mit CD68 wird CD163 zur Identifizierung von Makrophagentypen verwendet und auf M2-Makrophagen besonders stark exprimiert. CD163-positiven Makrophagen werden anti-inflammatorische Funktionen zugeschrieben, da sie in großer Zahl im Wundheilungsgewebe und bei chronischen Erkrankungen aufgefunden wurden, während frisch ins entzündliche Gewebe infiltrierte Zellen überwiegend CD163-negativ waren (FABRIEK et al. 2008). Eine Stimulation von Makrophagen mit LPS führt zu einer proteolytischen Abspaltung der CD163-Rezeptoren von der Zelloberfläche und Abgabe in den Überstand. Eine Langzeitinkubation mit LPS führt hingegen zu einem Anstieg der Rezeptorexpression (SULAHIAN 2004).

CD16

Die Gruppe der CD16-Rezeptoren besteht aus zwei Untergruppen. Auf der einen Seite den FcgRIIIa-Rezeptoren, die auf NK Zellen, T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen exprimiert werden. Auf der anderen Seite den FcgRIIIb-Rezeptoren, die auf neutrophilen Granulozyten zu finden sind. Auf eosinophilen Granulozyten können FcgRIIIb ebenfalls induziert werden. CD16 fungieren als Rezeptoren für die Fc-Region von Immunglobulin (Ig) G Antikörpern, die die Zelle bei Kontakt aktivieren und zur Phagozytose anregen. Da CD16-Rezeptoren auf Monozyten-Subpopulationen unterschiedlich stark exprimiert werden, werden sie zu deren Klassifizierung verwendet (2.1.1).

MHCII

Moleküle der MHC-II-Klasse sind Proteinkomplexe, die vorwiegend auf der Oberfläche professioneller Antigenpräsentierender Zellen (APCs) wie Dendritischen Zellen, Makrophagen und B-Lymphozyten zu finden sind. Sie präsentieren Peptide von extrazellulären, durch Phagozytose in die Zelle aufgenommenen Proteinen und werden von CD4-Rezeptoren der T-Helferzellen erkannt (HERRERO et al. 2001). In inflammatorischem Milieu und im Besonderen durch das Zytokin IFNγ werden Monozyten und Makrophagen aktiviert und die MHC-Klasse-II-Expression hochreguliert. Daher kann sie als Kennzeichen für den Aktivierungszustand von Immunzellen verwendet werden (KAMPHORST et al. 2010).

Literaturübersicht

8

CD11b

Das Protein CD11b (auch CR3a, ITGAM, Integrin αM) wird von vielen Leukozyten des angeborenen Immunsytems, wie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und NK-Zellen exprimiert. Es bildet zusammen mit CD18 (auch Integrin β2) das Integrin αMβ2 (auch Mac1, Komplementrezeptor (CR) 3, CD11b/CD18 genannt). Während Integrin αMβ2 in viele immunologische Funktionen wie Chemotaxis, Zellaktivierung, Adhäsion, Migration, Phagozytose und Chemotaxis involviert ist, wird vermutet, dass das Molekül CD11b allein nur an der Steuerung der Zelladhäsion und dem Zellwachstum beteiligt ist. Werden Makrophagen durch neutrophile Granulozyten aktiviert, führt dies zu einer gesteigerten CD11b/CD18 Expression und verstärkten Adhärenz (MAZZONE u. RICEVUTI 1995). Als Rezeptor für Fibrinogen γ, Faktor X sowie Komplementfaktor 3b vermittelt CD11b die Aufnahme komplementgebundener Partikel in die Zelle. Weitere Liganden sind Faktor x, ICAM-1, E. coli und LPS. Werden bovine Makrophagen mit LPS stimuliert, wird der CD11b-Rezeptor auf deren Oberfläche verstärkt exprimiert (WERLING et al. 1998).

2.1.4 Das Chemokin CCL5

CCL5, auch bekannt als RANTES (Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted) ist ein Chemokin, das aus 68 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von 7 kDa besitzt (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Es wird überwiegend von CD8+ T-Zellen gebildet, kann aber auch von Epithelzellen, Fibroblasten und Thrombozyten sezerniert werden. CCL5 gilt als inflammatorisches Chemokin, da es zum einen die Stickstoffmonoxid (NO) -Produktion in Makrophagen induziert und zum anderen die Leukozytenmigration von T-Lymphozyten, Monozyten, Mastzellen, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Granulozyten über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (CC-Chemokinrezeptoren (CCR) 3, 4 und 5) auslöst (SCHALL 1991; SAMSON et al. 1996; VILLATA et al. 1998). CCR1 und CCR5 sind Rezeptoren, die auf Monozyten exprimiert werden. In humanem Fettgewebe spielt CCL5 durch die Rekrutierung von Monozyten und anti-apoptotische Einflüsse auf Gewebsmakrophagen eine wichtige Rolle (KEOPHIPHATH et al. 2009). Doch hat das Chemokin aufgrund der Rekrutierung von Immunzellen und Förderung entzündlicher Prozesse auch schädigende Eigenschaften. So wurden erhöhte Konzentrationen bei allogenen Transplantatabstoßungen und Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ sowie bei Erkrankungen wie Atherosklerose, Arthritis, atopischer Dermatitis, Glomerulonephritis und Asthma beschrieben (ROSSI u. ZLOTNIK 2000; APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Zudem soll es in der frühen Phase für die Induktion und Promotion von Tumoren und in der späten Phase für die Stimulation der Angiogenese und Metastasierung verantwortlich sein (APPAY u. ROWLAND-JONES 2001). Auch Einflüsse auf Viruserkrankungen werden beschrieben, wobei manche

Literaturübersicht

9

Autoren positive Funktionen in der Virusbekämpfung aufführen (CULLEY et al. 2006), während andere von einer Förderung viraler Infekte berichten (YE et al. 2004).

Bei der Untersuchung der Einflüsse von CCL5 auf bovine monozytäre Zellen zeigte sich, dass insbesondere die Migration von klassischen Monozyten von CCL5 gesteigert wird und dass das Chemokin in der Lage ist, die Überlebensrate von Makrophagen währen der In-vitro-Differenzierung zu erhöhen. Der Phänotyp CCL5-gereifter Makrophagen wird verändert und es kommt zu einer LPS-Hyporesponsivität der Zellen (HUSSEN et al. 2014).

2.2 Bildung Reaktiver Sauerstoffspezies

Ein wichtiger antimikrobieller Mechanismus von mononukleären Phagozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten ist die Produktion großer Mengen reaktiver Sauerstoffspezies. Die ROS-Bildung erfolgt während der Phagozytose oder bei Stimulation mit verschiedenen Substanzen und wird auch oxidativer burst oder respiratory burst genannt, da explosionsartig große Mengen Sauerstoff aufgenommen, Glukose umgewandelt und ROS produziert werden. Die toxischen Sauerstoffmetaboliten tragen zum Abtöten eingedrungener Mikroorganismen bei, können aufgrund ihrer Reaktivität aber auch körpereigene Strukturen zerstören. Das Schlüsselenzym für die ROS-Bildung ist die membranständige Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Oxidase (NADPH-Oxidase), die die Reduktion von molekularem Sauerstoff (O2) zum Superoxid-Anion (O2

-) katalysiert, welches zum Teil spontan, zum Teil mithilfe des Enzyms Superoxiddismutase (SOD) mit sich selbst und mit Wasserstoff reagiert und zusätzlich Hydrogenperoxid (H2O2) bildet (EL-BENNA et al. 2008). Diese beiden Substanzen sind Ausgangsprodukte für eine Reihe verschiedener Reaktionen, deren mikrobizide Endprodukte in zwei Gruppen eingeteilt werden können: oxidierte Halogene und Sauerstoffradikale (BABIOR 1983). Halogenionen wie Chlorid, Jodid oder Bromid reagieren zusammen mit H2O2

mithilfe des Enzyms Myeloperoxidase zu oxidierten Halogenen, die die Membran von Pathogenen schädigen. Sauerstoffradikale wie Hydroxylradikale (HO˙) und Peroxid-Anionen (O2

2-) entstehen durch eine von Metallsalzen (in der Regel Eisen oder Kupfer) katalysierte Oxidation aus H2O2 und sind hochreaktive keimtötende Agenzien, die Enzyme oder Membranbestandteile oxidieren und somit inaktivieren können (MURPHY et al. 2009).

Da Neutrophile die mit Abstand größte Kapazität zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies aufweisen, wurden die meisten Studien an ihnen durchgeführt. So sind neben der Phagozytose zahlreiche Mediatoren beschrieben, die in der Lage sind, die NADPH-Oxidase zu aktivieren: das Komplementfragment C5a, der chemotaktische Faktor N-formyl-methionyl-leucyl-methionin (FMLP), die bioaktiven

Literaturübersicht

10

Peptide Plättchenaktivierender Faktor (PAF) und Leukotrien B4 sowie das Chemokin IL8 (GOODMAN et al. 1995; RUIZ et al. 1995). Die inflammatorischen Zytokine TNFα, Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (GCSF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GMCSF) sind wie LPS indirekt an der Induktion reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt durch ein Priming der Zellen für eine nachfolgende Stimulation (HALLETT u. LLOYDS 1995; SAYEED 2000). Auch eine Bindung an Fc- und Komplementrezeptoren (FcR, CR) auf polymorphkernigen Leukozyten (PMN) aktiviert die NADPH-Oxidase (MIRONOVA 2004).

Die Bedeutung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies für den Körper wird z.B. anhand der Septischen Granulomatose deutlich, einer humanen Erbkrankheit, bei der Neutrophile aufgrund einer Fehlenden Komponente der NADPH-Oxidase nicht in der Lage sind ROS zu bilden. Die Patienten leiden unter ständigen Bakterien- und Pilzinfektionen, was zu einer Bildung zahlreicher Granulome und zum frühen Tod führt (EL-BENNA et al. 2008). Doch auch Bakterien haben Schutzmechanismen entwickelt um der Eliminierung durch bakterizide Sauerstoffmetaboliten zu entgehen, wie beispielsweise die von E.-coli-Spezies gebildeten Enzyme Cytochrom-C-Nitrit-Reduktase, Flavohämoglobin und Flavorubredoxin, die in der Lage sind Sauerstoffradikale zu schwächen (BAPTISTA et al. 2012).

2.3 Die Transitperiode

Die Transitperiode wird definiert als der Zeitraum von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Kalbung der Kuh. In dieser Zeit treten bei hochleistenden Milchkühen besonders häufig so genannte „Produktionskrankheiten“ auf, deren Folgen sich noch bis in die nächste Laktationsperiode und die folgende Fruchtbarkeit ziehen können. Zu den häufigsten Produktionskrankheiten zählen Infektions-krankheiten wie Mastitis, Metritis und Endometritis sowie Stoffwechselerkrankungen wie Milchfieber, Nachgeburtsverhaltung, Pansenazidose, Ketose, Labmagen-verlagerung und Leberverfettung. Häufig treten mehrere Erkrankungen gleichzeitig auf. Zwar sind die Krankheiten multifaktoriell bedingt, stehen jedoch in engem Zusammenhang mit einer nicht genügenden Anpassung des Stoffwechsels, Hormonsystems und Immunsystems der Hochleistungskuh an die besonderen Gegebenheiten um die Geburt herum (MULLIGAN u. DOHERTY 2008). Im Folgenden sind die wichtigsten Veränderungen in diesem Zeitraum aufgeführt.

In den letzten drei Wochen vor der Geburt zeigen Kühe eine reduzierte Futteraufnahme, obwohl ihr Energieverbrauch durch das Wachstum des Fötus gegen Ende der Trächtigkeit zunimmt. Bereits vor der Geburt stellt sich daher eine negative Energiebilanz (NEB) im Stoffwechsel der Kuh ein, die mit Einsetzen der immensen Milchleistung noch verstärkt wird und ihren Höhepunkt in der ersten Woche der Laktation erreicht (GRUMMER 1995). Als Folge der katabolen Stoffwechsellage

Literaturübersicht

11

werden im Körper vermehrt freie Fettsäuren (FFS) aus den Adipozyten freigesetzt und zusammen mit Aminosäuren, die durch den Abbau von körpereigenem Protein gewonnen werden, in der Leber verstoffwechselt (BELL 1995). Während der Trächtigkeit ist das Immunsystem vor die Herausforderung gestellt, eine Abstoßung des semi-allogenen Fetus zu verhindern und gleichzeitig ausreichenden Schutz für Muttertier und Fetus gegenüber Pathogenen zu bieten. So werden Teile des Immunsystems gehemmt, während andere modifiziert oder auf eine lokale Immunabwehr beschränkt werden (2.3.1). Mit dem Geburtsvorgang gelangen Keime in die Gebärmutter, auf die das modifizierte Immunsystem reagieren muss. So sind bei 80 – 100 % der Tiere in den ersten beiden Wochen nach der Kalbung Bakterien im Uterus nachweisbar, bei 40 % der Tiere noch nach drei Wochen (SHELDON et al. 2008). Nekrose und Ablösung der Karunkel bei der Involution des Uterus bieten zusätzlich einen optimalen Nährboden für Pathogene und mit Einsetzen der Milchleistung und Öffnung der Zitzenkanäle stellt die Milchdrüse eine weitere Eintrittspforte für Keime dar. Mit der Milch werden schützende Immunglobuline und Lactoferrin ausgewaschen und die Funktionalität von Phagozyten durch gebildete Fettsäuren und Kaseine reduziert (BURVENICH et al. 2007). Die durch die negative Energiebilanz und hormonellen Veränderungen geschwächten Tiere sind häufig nicht in der Lage die Keime zu eliminieren.

Endokrinologische Veränderungen wie die Abnahme der Insulinkonzentration in den letzten beiden Wochen vor der Geburt potenzieren den katabolen Stoffwechsel (BELL 1995). Auch erhöhte Cortisolkonzentrationen um den Geburtszeitraum wirken immunsupprimierend und induzieren die Entwicklung regulatorischer Makrophagen (KINDAHL et al. 2004). Während der katabolen Stoffwechsellage kommt es zu einer Resistenz des Gewebes gegenüber dem im Hypophysenvorderlappen gebildeten Wachstumshormon (GH) was eine verminderte Produktion des Insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) zur Folge hat. Dieser Umstand wird in der Literatur als „Entkopplung der Somatotropen Achse“ beschrieben (HOLZHAUSEN 2012; PIECHOTTA et al. 2012). Da IGF-I insulinähnliche Einflüsse auf den Stoffwechsel hat, verschlimmert sich die katabole Situation durch seine Regression zusätzlich.

Im zirkulierenden Blut verändert sich der Anteil von Immunzellen peripartal, was mutmaßlich auch Einfluss auf die uterine Immunität hat. Im Laufe der Trächtigkeit steigt die Gesamtleukozytenzahl tendenziell an und fällt kurz nach der Geburt wieder ab. Demgegenüber sinkt der Anteil an totalen T-Zellen (CD3), T-Helfer (CD4) und zytotoxischen T-Zellen (CD8) zur Geburt hin ab und steigt nach der Geburt wieder signifikant an. Die Monozytenzahl zeigt tägliche Schwankungen und keine tendenziellen Veränderungen (KIMURA et al. 1999).

Literaturübersicht

12

2.3.1 Monozytäre Zellen im graviden Uterus

Die Gebärmutter schützt sich mithilfe verschiedener Mechanismen vor eindringenden Pathogenen. Eine erste Barriere bildet der anatomische Aufbau der Vulva, die kollagenen Zervixringe sowie der zähe, sich im Verlauf des Zyklus verändernde Zervikovaginalmukus. Die längs und quer verlaufende Uterusmuskulatur erleichtert zudem eine mechanische Austreibung von Partikeln und Erregern (BONDURANT 1999).

Haben Erreger die anatomischen und funktionellen Barrieren überwunden, können sie auf vielfältige Weise vom Immunsystem erkannt und eliminiert werden. Da in dieser Arbeit Monozyten und Makrophagen im Mittelpunkt stehen, wird im Folgenden schwerpunktmäßig auf die zelluläre Abwehr und insbesondere auf monozytäre Zellen eingegangen. Endometriale Epithel- und Stromazellen exprimieren den TLR4-CD14-MD2-Komplex, einen Rezeptor, der bakterielles Lipopolysaccharid identifiziert und die Zellen zu einer vermehrten Sekretion der Mediatoren IL8, IL6 und Prostaglandin E anregt. Diese wiederum locken Monozyten und neutrophile Granulozyten an (SHELDON et al. 2014). So konnte im Endometrium infizierter Tiere eine verstärkte Genexpression der Zytokine IL1, IL6, TNF, der Chemokine CXCL8, CXCL5, CCL5 sowie der Rezeptoren TLR1 und TLR4 nachgewiesen werden (FISCHER et al. 2010). Den eingewanderten neutrophilen Granulozyten wird dabei die größte Rolle bei der Selbstreinigung des Uterus zugesprochen. Sie können bakterielle Erreger durch Phagozytose, Freisetzung antimikrobieller Substanzen (Degranulation) und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies eliminieren. Die größte Anzahl neutrophiler Granulozyten befindet sich während des Östrus und puerperal im Uterus (BONDURANT 1999).

Doch auch die in großer Zahl einwandernden Monozyten spielen eine Rolle bei der Immunabwehr, da sie zu Makrophagen reifen, die vielschichtige Aufgaben in der Immunabwehr, aber auch in der Resolution von Entzündungen übernehmen. Im gesunden Uterus sind Makrophagen diffus im Stratum Spongiosum und in etwas geringerer Zahl im Stratum Compactum verteilt, während im luminalen Epithel kaum Phagozyten zu finden sind (SHELDON et al. 2009). Auch während der verschiedenen Zyklusphasen verändert sich ihre Zahl nicht (COBB u. WATSON 1995). Während im nichtgraviden uterinen Gewebe kaum Makrophagen auftreten, wandern diese besonders in der mittleren und späten Trächtigkeit ins Uteruslumen ein und reifen dort vorwiegend zu M2-Makrophagen mit anti-inflammatorischen, angiogenetischen und Gewebe-remodellierenden Funktionen (OLIVEIRA et al. 2010). Als Ursache hierfür wird der so genannte ‚Th2-switch‘ angesehen, was bedeutet, dass die T-Zellaktivität in der Gebärmutter zugunsten einer regulatorischen Th2-Antwort verschoben wird (MAEDA et al. 2012). Auf diese Weise wird der Fetus vor einer Abstoßung geschützt und vermehrt trächtigkeitsprotektive Chemokine wie

Literaturübersicht

13

IL4 und IL10 produziert. Induziert wird der ‚Th2-switch‘ durch die Sekretion von IL3, IL4, IL5 und IL10 von Zellen der Plazenta (HEIKKINEN et al. 2003; MENZIES et al. 2011).

Die Plazenta des Rindes wird als Plazenta epitheliochorialis bezeichnet, was bedeutet, dass während der Trächtigkeit alle Gewebeschichten der Gebärmutter erhalten bleiben. Die Plazenta fetalis, das Chorion, bildet Zottenfelder, die Kotyledonen, die mit Karunkeln der Gebärmutterschleimhaut verankert sind. Die übrigen Chorionteile sind zottenfrei (SCHNORR 2001). Dass Lymphozyten und Makrophagen überwiegend im interkarunkulären Endometrium zu finden sind, weist darauf hin, dass sich bestimmte immunologische Reaktionen in der Trächtigkeit auf einzelne Areale beschränken. Die Lymphozytenfraktion im graviden wie im nicht graviden Uterus wird von B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen gebildet (CROY et al. 2013). Beim Menschen wird angenommen, dass spezialisierte uterine natürliche Killerzellen (uNK-Zellen) eine große Rolle spielen, da sie während der Schwangerschaft bis zu 70 % der uterinen Lymphozytenpopulation ausmachen und in der Lutealphase des Zyklus sowie zu Beginn der Schwangerschaft stark ansteigen. Beim Rind gibt es einen ähnlichen Peak gegen Tag 16 des Zyklus. Im graviden Uterus bleibt die Zahl an uNK-Zellen jedoch konstant, weshalb deren Bedeutsamkeit noch diskutiert wird (CROY et al. 2013).

Das vom Gelbkörper und in geringen Mengen von Plazenta und Nebennieren gebildete Progesteron hält die Trächtigkeit aufrecht. Ab dem 250. Trächtigkeitstag sinkt die Plasmakonzentration konstant, da die erhöhten Cortisolwerte über Enzymaktivierungen zu einer Umsetzung von Progesteron in Östrogene führen. Nach erfolgter Luteolyse ca. 24 Stunden vor der Geburt fällt die Plasmakonzentration erneut stark ab. Aufgrund seiner Fähigkeit, die NO-Produktion sowie die Expression von IL12, IL17 und IFNγ von Makrophagen zu reduzieren und die IL4-Expression bei trächtigen Tieren zu steigern, wird angenommen, dass Progesteron Makrophagen in Richtung von M2-Subtypen polarisiert und immunsupprimierend wirkt (SHELDON et al. 2009; MAEDA et al. 2012). Dass aber auch die Expression von IL10, Arg 1 sowie des mit einer alternativen Aktivierung assoziierten Gens mrc1 reduziert werden, zeigt, dass in der Gebärmutter gereifte Makrophagen eine Plastizität besitzen, die nicht eindeutig einer M2-Antwort zugeordnet werden kann (MENZIES et al. 2011). Geringe Progesteron- und IL-6-Konzentrationen im peripheren Blut prä partum wurden bei Kühen mit anschließender Nachgeburtsverhaltung gemessen, während Tiere mit hohen IL6-Konzentrationen vermehrt an Endometritis erkrankten (ISHIKAWA et al. 2004).

Östrogene werden zum Großteil von der Plazenta gebildet. Die Östrogenkonzentration steigt zur Geburt hin an und sorgt für die Geburtsvorbereitung, unter anderem durch Vermehrung von Oxytozinrezeptoren,

Literaturübersicht

14

Erhöhung der Uteruskontraktilität und Stimulation der Freisetzung von Prostaglandin F2α. Nach der Geburt sinken die Östrogenwerte rapide (KINDAHL et al. 2004; HOLZHAUSEN 2012). Zwar geht man davon aus, dass die Einwanderung von Monozyten zu Beginn der Trächtigkeit östrogenvermittelt ist, jedoch wird der direkte Einfluss des Hormones auf Immunzellen noch diskutiert und es werden sowohl immunsupprimierende als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. So steigern Östrogene die humane B-Zell-Proliferation und IgM-Synthese, stimulieren die IL5, IL2 und IL3-Synthese humaner T-Zellen und hemmen die humane Lymphozytenproliferation und murine NK-Zell-Aktivität (MILLER u. HUNT 1996). BONDURANT (1999) beschreibt außerdem eine östrogenvermittelte Steigerung der Fähigkeit von uterinen Zellen zur Antigenpräsentation und MHC-Klasse-II-Expression.

Neben Progesteron wird das in der Frühträchtigkeit kurzzeitig vom Trophoblasten gebildete IFN-τ als Hauptregulator für die immunologischen Veränderungen angenommen (MANSOURI-ATTIA et al. 2012). Als Inhibitor der Prostaglandin-F2α-Sekretion verhindert IFN-τ die Luteolyse und ermöglicht somit das Einnisten des Trophoblasten (MARTAL et al. 1998). Doch auch immunsupprimierende Einflüsse auf Makrophagen wie die Reduktion der Phagozytosekapazität, der induzierten ROS-Bildung sowie eine verminderte IL1β-Sekretion nach Priming der Zellen mit IFN-τ werden beschrieben (HARA et al. 2014).

2.3.2 E.-coli-Infektionen des Uterus

Bei gesunden Kühen löst sich die Nachgeburt innerhalb von sechs Stunden nach der Geburt ab, die Gebärmutter zieht sich in den folgenden Wochen zusammen und Geburtsverletzungen verheilen. Nach sechs Wochen hat die Gebärmutter Ihre ursprüngliche Funktionalität und Größe erreicht und ein regelmäßiger Zyklus stellt sich ein. Die bei der Kalbung eingedrungenen Keime lösen einen Einstrom von Neutrophilen aus, die die Pathogene zügig eliminieren. Ein ungestörter Ablauf ist jedoch nur bei 50 % der Kühe zu beobachten. Viele Tiere schaffen es nicht, die Keime aus dem Uterus zu eliminieren und leiden unter unregelmäßigen Zyklen, schlechten Konzeptionsraten und entwickeln eine klinisch oder subklinische Gebärmutterentzündung (SHELDON et al. 2009).

Grundsätzlich ist zu unterscheiden zwischen Metritis und Endometritis. Eine Metritis tritt in den ersten 21 Tagen nach der Kalbung auf und wird je nach klinischen Krankheitszeichen in drei Grade unterteilt. Mehr als 20 % der Kühe entwickeln nach der Kalbung eine Metritis, die wiederum bei mehr als 20 % der erkrankten Tiere in eine Endometritis führt, d.h. länger als 21 Tage, beziehungsweise (bzw.) 26 Tage p.p. andauert (GALVÃO et al. 2012). Unter subklinischer Endometritis versteht man eine Inflammation des Endometriums fünf Wochen post partum, bei welcher der

Literaturübersicht

15

Anteil an PMN bei über 10 % der intrauterinen Zellen liegt und keine klinischen Symptome vorliegen (KASIMANICKAM et al. 2004).

SHELDON et al. (2009) beschreiben Escherichia coli und Trueperella pyogenes (T. pyogenes) als die am häufigsten aus dem Uterus erkrankter Tiere isolierten Keime. Seltener sind die anaerobier Prevotella species, Fusobacterium necrophorum und Fusobacterium nucleatum. Für eitrigen Ausfluss, der unter Feldbedingungen das deutlichste und oftmals einzige sichtbare Anzeichen für eine Gebärmuttererkrankung ist, sorgt vor allem T. pyogenes, häufig in Kombination mit Fusobacterium necrophorum und P. melaninogenicus (WILLIAMS et al. 2005). Während E. coli in den ersten Tagen nach der Kalbung den Uterus vieler, auch nicht klinisch erkrankter Kühe besiedelt, kommt T. pyogenes seltener vor und verursacht schwere eitrige Endometritiden. Da ein statistischer Zusammenhang zwischen hohen E.-coli-Keimzahlen an Tag 7 und hohen T. pyogenes- Keimzahlen an Tag 14 p.p. besteht, wird vermutet, dass E. coli als Wegbereiter für spätere pathogene Keimbesiedlung mit klinischen Erkrankungen fungiert (WILLIAMS et al. 2007). Zudem sind E.-coli-Bakterien in der Lage die Menge der vom Endometrium sezernierten Hormone Prostaglandin-F2α und Prostaglandin-E2 zu modulieren und so die Lutealphase zu verkürzen (HERATH et al. 2006). Die bei E.-coli-Infektionen verzögerte Follikelreifung, geringere Progesteronproduktion und verspätete Luteolyse haben zudem Einfluss auf die folgende Fruchtbarkeit. Erhöhte Akute-Phase-Protein-Konzentrationen im Blut zeigen Einflüsse auf das Immunsystem (WILLIAMS et al. 2007).

Neben pathogenen Keimen besiedeln auch nicht-pathogene Bakterien wie Koagulase-negative Staphylokokken und α-hämolysierende Streptokokken die Gebärmutter. Da Ihre Anwesenheit mit einer verringerten Anfälligkeit für klinische Endometritiden einhergeht wird vermutet, dass ihr Einsatz in Zukunft eine Rolle in der Endometritisprophylaxe spielt (WILLIAMS et al. 2005; SHELDON et al. 2009). Infusionen von E.-coli-LPS in die Gebärmutter induzierten einen Einstrom von PMN und führten somit zu einer schnelleren Abheilung von Endometritiden. Daher wurde auch LPS als mögliche alternative Endometritistherapie diskutiert (HUSSAIN u. DANIEL 1992; DHALIWAL et al. 2001).

2.3.3 E.-coli-Mastitis

Mit Einsetzen der Milchleistung und Öffnen der Strichkanäle wird die Milchdrüse zu einer potenziellen Eintrittspforte für Erreger. Um dies zu verhindern verfügt sie über verschiedene Schutzmechanismen im anatomischen Aufbau und in der Zellzusammensetzung. Die erste Barriere bildet der Strichkanal, dessen Durchmesser von der spiralig angeordneten glatten Muskulatur bestimmt wird, die über das autonome Nervensystem gesteuert wird. Er ist mit Keratin ausgekleidet,

Literaturübersicht

16

welches in Verbindung mit freien und veresterten Fettsäuren (Myristinsäure, Palmitolensäure, Linolsäure) bakteriostatisch wirkt und während der Zwischenmelkzeit sowie der Zeit des Trockenstehens einen schützenden Keratinpfropf bildet (SORDILLO u. STREICHER 2002). Weiter proximal in Richtung der Fürstenberg’schen Rosette nimmt die Anzahl der im Gewebe eingebetteten Immunzellen stetig zu. Durch den regelmäßigen Milchfluss werden einwandernde Erreger immer wieder aus dem Euter gespült, weshalb der Beginn des Trockenstellens mit einer gehäuften Inzidenz von Mastitiden einher geht.

Aufgrund ihres häufigen Auftretens, der Reduktion der Milchleistung und der damit verbundenen hohen Kosten werden Euterentzündungen als die wichtigsten Erkrankungen bei Milchkühen angesehen. Verursacht werden können sie von einer Vielzahl grampositiver (Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium bovis) und gramnegativer (E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Proteus) Keime, wobei E. coli, Staphylococcus aureus (S. aureus) und Streptococcus uberis (S. uberis) die am häufigsten isolierten Erreger darstellen. Im klinischen Erscheinungsbild unterscheiden sich E.-coli-Mastitiden durch eine kurze Dauer, hohe Erregerzahlen, ausgeprägte klinische Symptome und eine massive Immunantwort von den eher langwierigen, oft subklinisch verlaufenden, S. aureus- und S. uberis-Mastitiden (SCHUKKEN et al. 2011). E.-coli-Bakterien gehören zu den umweltassoziierten Keimen, die sich in der kotverschmutzten Umgebung und auf den Liegeflächen der Tiere befinden und insbesondere nach dem Melken über die noch geöffneten Strichkanäle ins Euter gelangen. Inwieweit es spezielle an die Milchdrüse angepasste Stämme gibt, wird in der Literatur diskutiert. Während einige Autoren von Euter-adaptierten Keimen berichten (DOGAN et al. 2006; SHPIGEL et al. 2008), sind andere der Meinung, dass alle E.-coli-Stämme gleichermaßen in der Lage sind Mastitiden auszulösen (BURVENICH et al. 2003; SUOJALA et al. 2011). Aufgrund ihrer Fähigkeit Milchbestandteile wie Laktose als Energiequelle zu nutzen, sind E. coli perfekt an die Bedingungen in der Milchdrüse angepasst.

Die Stärke der Immunantwort auf E.-coli-Bakterien korreliert positiv mit der Anzahl der eingedrungenen Erreger. Dies beschreiben GÜNTHER et al. (2010), welche die Expression von TNFα und IL8 von Epithelzellen des Euters zur Messung der Immunantwort heranzogen. Hauptverantwortlich für die ausgeprägte Immunreaktion ist das Endotoxin LPS, das während der Vermehrung, aber auch beim Zelltod nach Aktivierung der Immunantwort, in großen Mengen freigesetzt wird (GÜNTHER et al. 2010). Als TLR4-Ligand induziert es die Freisetzung inflammatorischer Zytokine, insbesondere IL1β und TNFα, die wiederum die Genexpression von weiteren inflammatorischen Mediatoren wie Zytokinen, Enzymen für die Eikosanoidsynthese, Akute-Phase Proteinen sowie solchen für die Zellproliferation und Apoptose steuern (SCHUKKEN et al. 2011). Neben LPS werden jedoch auch weitere TLR-Liganden wie Flagellin, Cytosin-Phosphatidyl-Guanin-DNA oder Curli von E.-coli-Bakterien

Literaturübersicht

17

freigesetzt (KARCZMARCZYK et al. 2008). Hauptverantwortlich für die Initiierung der Immunantwort und die Freisetzung der Zytokine sind die hochkompetenten Euterepithelzellen sowie Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Die genauen Aufgabengebiete der Phagozyten wurden anhand verschiedener Mausmodelle untersucht, wobei sich herausstellte, dass neutrophile Granulozyten die Bakterien beseitigen, während Makrophagen LPS erkennen und ein Eindringen der Bakterien ins Eutergewebe verhindern (ELAZAR et al. 2010; SCHUKKEN et al. 2011).

2.4 Das E.-coli-Sekretom

Die Spezies Escherichia coli wurde erstmals 1885 von Theodor Escherich als physiologischer Bewohner der Dickdarmflora beschrieben und als „Bacterium coli commune“ bezeichnet. Im Jahr 1958 erhielt sie ihren heutigen Namen.

E. coli gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges, fakultativ anaerobes Bakterium mit einer Größe von durchschnittlich 1,3 µm x 4 µm. Die meisten Stämme sind opportunistische Erreger, die überwiegend im Darm angesiedelt sind. Jedoch gibt es auch darmpathogene Stämme, die schwere Enteritiden verursachen können. Zusätzlich sind die Bakterien häufiger Auslöser für Harnwegsinfekte, Meningitiden, Mastitiden, Metritiden, Pneumonien, Septikämien und andere Krankheiten und entsprechend dieser Krankheitsbilder benannt. So werden die intestinal-pathogenen Erreger in sechs Kategorien unterteilt: enterohämorrhagische E. coli (EHEC), enteropathogene E. coli (EPEC), enterotoxische E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) und diffus adhärente E. coli (DAEC). Extraintestinal-pathogene E. coli (ExPEC) werden weiterhin entsprechend ihres Krankheitsbildes gegliedert in uropathogene E. coli (UPEC), sepsis-assoziierte E. coli (sepEC), neugeborenenmeningitis-assoziierte E. coli (NMEC) sowie aviär-pathogene E. coli (APEC) (KAPER et al. 2004). In den letzten Jahren kam zusätzlich die Gruppe der endometrium-pathogenen E. coli (EnPEC) hinzu, Isolate, die als im Endometrium besonders adhärent und invasiv auffielen (SHELDON et al. 2010).

Neben der Einteilung in kommensale und pathogene Stämme lassen sich E. coli serologisch anhand ihrer O-Antigene (hitzestabile Bestandteile des Lipopolysaccharid-Komplexes der Membran), K-Antigene (Polysaccharide der Kapsel) und H-Antigene (Geißeln) unterscheiden. Die Kombination der einzelnen Antigene ermöglicht die Klassifizierung einer großen Zahl verschiedener Serotypen. Eine weitere Form der Klassifizierung ist die phylogenetische Gruppierung. Verschiedene Verfahren wie die Multilokus-Enzym-Elektrophorese (MLEE), die Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -basierte Methoden teilen E. coli anhand Strukturen ihrer DNA in verwandtschaftliche Gruppen ein (HOMEIER-BACHMANN 2009). Diese Gliederung

Literaturübersicht

18

klassifiziert E.-coli-Stämme in die Phylogruppen A, B1, B2 und D, bzw. nach neueren Erkenntnissen werden auch die Phylogruppen C und E diskutiert (ESCOBAR-PARAMO 2004). Davon ausgehend, dass es im Genom von Bakterien Bereiche gibt, die nur sehr langsam fortschreitenden Veränderungen ihrer Nukleotidsequenz unterliegen und als Kerngenom und Housekeeping-Gene (=Loki) bezeichnet werden, werden beispielsweise mithilfe der MLST mehrere Loki eines Isolates sequenzanalysiert und das Isolat so den Phylogruppen zugeordnet. Zwar steht die Phylogruppierung eines Isolates nicht im Zusammenhang mit bestimmten Eigenschaften oder der Virulenz, doch gibt es Untersuchungen, nach denen kommensale E. coli häufig den Phylogruppen A und B1 angehören, während extraintestinale Keime vor allem in Phylogruppe B2 und D zu finden sind (GORDON et al. 2008). Isolate aus Uteri von an Metritis erkrankten Tieren gehörten häufig (> 65 %) der Phylogruppe B1 (GOLDSTONE et al. 2014), bzw. den Phylogruppen A und B1 (SHELDON et al. 2010) an.

Die Virulenz von Isolaten lässt sich hingegen durch die Sequenzanalyse ihres Genoms ermitteln. Neben dem konservativen Kerngenom verfügen die Bakterien über einen flexiblen Genpool, der durch horizontalen Gentransfer über Plasmide, Phagen, Transposons, Integrons und genomische Inseln zwischen den Bakterien verbreitet wird. Genomische Inseln, die zur Pathogenität eines Bakteriums beitragen werden Pathogenitätsinseln (PAI) genannt und verfügen über die Eigenschaften virulenzassoziierte Gene zu beinhalten, eine Größe von mehr als 10 kb zu besitzen, in nicht-pathogenen Stämmen nicht vorhanden zu sein, sich vom Kerngenom zu unterscheiden sowie über Mobilitäts- und Insertionselemente zu verfügen (OELSCHLAEGER u. HACKER 2004).

Über die Rolle von E. coli in der Pathogenese von Metritis und Endometritis bei der Kuh herrscht trotz intensiver Forschung noch Unklarheit. Bei der Isolation verschiedener E. coli aus dem postpartalen Uterus konnten SILVA et al. (2009) Gene von 15 Virulenzfaktoren (VF) isolieren, jedoch keinen Zusammenhang mit einer Erkrankung darstellen, während SHELDON et al. (2010) 17 VF fanden, von denen die Gene fimH sowie fyuA mit einer Gebärmutterentzündung in Zusammenhang standen. Eine Studie von BICALHO et al. (2010) hingegen bezeichnete die Gene fimH, hlyA, cdt, kpsMII, ibeA und astA als signifikant mit Metritis und Endometritis assoziiert, wobei fimH die bedeutendste Rolle spielte (SILVA et al. 2009; BICALHO et al. 2010; SHELDON et al. 2010).

Mit dem Begriff Sekretom wird das gesamte Repertoire der löslichen Proteine, das eine Zelle in den Extrazellularraum sezerniert einschließlich der Proteine, die direkt und indirekt an der Sekretion beteiligt sind bezeichnet. Die Sekretion kann über verschiedene Sekretionssysteme erfolgen wie beispielsweise Typ I (ABC-Transporter), Typ III (T3SS), Typ 4 (konjugationsassoziierter Typ),

Literaturübersicht

19

Autotransporter, Tat-Transporter und ESAT-6 sowie den am häufigsten vorkommenden Sec-abhängigen Sekretionsweg (Sec) (TJALSMA et al. 2000; SONG et al. 2009). Da Sec und T3SS in fast allen Bakterien vorkommen und mit Abstand den größten Anteil des Sekretoms sezernieren sind sie die am weitesten erforschten Sekretionssysteme (ECONOMOU 2002). Bakterien, die in der Lage sind sog. Attaching-and-Effacing- (AE-) Läsionen des Darmepithels zu bilden wie z.B. EHEC und EPEC verfügen über ein stark entwickeltes T3SS-Sekretionssystem, welches von Genen der Pathogenitätsinsel „locus of enterocyte affacement“ (LEE) kodiert wird und die Sekretion wichtiger Virulenzfaktoren durchführt. Nach Analysen von DENG et al. (2012) werden beispielsweise alle 25 bisher entschlüsselten EPEC-Proteine vom T3SS sezerniert, unter anderem die Toxine und Adhäsine LifA, ToxB, Efa1 und Z4332 (DENG et al. 2012).

Material und Methoden

20

3 Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit bovinen Monozyten und den daraus reifenden Makrophagen im Allgemeinen sowie während der so genannten Transitperiode. Daher stammten die Versuchstiere aus zwei verschiedenen Tiergruppen. Für die Messungen des Einflusses von Zellkulturüberständen auf Monozyten wurde Blut von nicht tragenden und nicht laktierenden Holsteinkühen verwendet. Die Tiere stammten aus einem Gruppenlaufstall der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover und wurden mit Heu und Maissilage gefüttert. Die Gruppengröße betrug 10 Tiere, das Durchschnittsalter lag bei 4 Jahren.

Die Blutproben zur Messung der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in der Transitperiode wurden von Tieren des Institutes für Tierernährung des Friedrich-Loeffler-Institutes in Braunschweig im Rahmen des Tierversuches: 33.9-42502-04-11/0444 entnommen. Hierbei wurden 32 gesunde Holsteinkühe im Alter von zwei bis acht Jahren an den Tagen 42 und 14 vor der Geburt, sowie 7, 21 und 56 Tage nach der Geburt für die Blutentnahme herangezogen. Im Rahmen von dort stattfindenden Fütterungsversuchen wurden die Tiere zu Beginn der Versuche zusätzlich gemäß ihres BCS in zwei Gruppen eingeteilt. Kühe mit einem hohen BCS (BCShigh, Durchschnittswert 3,2) wurden 42 Tage vor der Kalbung mit einem hohen Kraftfutteranteil (60 %) gefüttert, der nach der Kalbung reduziert (30 %) und nur langsam an den abschließenden Wert (50 %, 21 Tage p.p.) angehoben wurde. Demgegenüber wurden Tiere mit einem niedrigen BCS (BCSlow), Durchschnittswert 2,6) vor der Kalbung mit einem niedrigen Kraftfutteranteil (20 %) versorgt, der nach der Geburt auf 30 % und bereits 14 Tage p.p. auf 50 % angehoben wurde. Die Inzidenz einer subklinischen Ketose betrug mithilfe dieses Modelles > 90 % bzw. < 10 %.

Die Skala zur Vergabe des BCS reicht von 1 bis 5. Hierbei sind ein BCS von 1 mit einer hochgradigen Unterernährung und ein BCS von 5 mit einer hochgradigen Verfettung gleichbedeutend. Zur Bestimmung werden 8 Körperteile (Dornfortsätze der Lendenwirbelsäule, Verbindung zwischen den Dorn- und Querfortsätzen, Enden der Querfortsätze, Übergang von den Dornfortsätzen zur Hungergrube auf der rechten Seite, Hüfthöcker, Sitzbeinhöcker, Beckenausgangsgrube) hinsichtlich ihrer Fettauflagen beurteilt und eine Durchschnittsnote vergeben. Bei dem BCS-Wert 3 erscheint die Wirbelsäule beispielsweise als abgerundeter Kamm, Wirbel- und Wirbelfortsätze sind visuell nicht mehr voneinander abzugrenzen, Hüft- und Sitzbeinhöcker sowie Knochen und Bänder im Bereich des Schwanzansatzes sind abgerundet, Anzeichen von Fettablagerungen sind jedoch keine erkennbar (MANSFELD et al. 2000).


21

3.2 Gewinnung einzelner Leukozytenpopulationen des Blutes

Blutproben wurden unter sterilen Kautelen durch Punktion der Vena Jugularis von gesunden, nichtlaktierenden Kühen aus der Tierärztlichen Hochschule bzw. trächtigen und laktierenden Kühen aus dem Institut für Tierernährung des Friedrich Löffler Institutes in Braunschweig gewonnen. Es wurde ein Vacutainersystem verwendet und das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen (Na-Heparinat, 9.2.1) aufgefangen. Die Abnahme erfolgte konstant um 8 Uhr.

Das Blut wurde 1:2 mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 9.2.5) vermischt und jeweils 35 mL wurden vorsichtig über 15 mL Lymphozytenseparationsmedium (9.2.3) in ein Zentrifugenröhrchen (50 mL) geschichtet. Durch eine Zentrifugation (1000 x g, 30 Minuten (Min.), 10 °C, ohne Bremse) wurden die Zellfraktionen des Blutes aufgrund ihrer Dichte aufgetrennt. Mononukleäre Zellen (MNCs) sowie Anteile der Thrombozyten waren als grau schimmernde Interphase zwischen dem Separationsmedium und dem darüber liegenden Blutplasma zu erkennen. Unterhalb des Mediums waren Erythrozyten und PMN angereichert.

3.2.1 Gewinnung von mononukleären Zellen

Die Interphase wurde mit einer 10 mL Pipette abgesaugt und in ein Zentrifugenröhrchen (50 mL) mit vorgelegtem PBS (10 mL) überführt. Nach Auffüllen mit PBS folgte ein Zentrifugationsschritt (500 x g, 10 Min., 10 °C). Zur hypotonen Lyse noch vorhandener Erythrozyten wurden 20 mL Aqua destillata (A. dest.) zu den resuspendierten Zellen gegeben, 10 Sekunden (Sek.) geschwenkt und mit 20 mL 2-fach konzentriertem PBS aufgefüllt. Es folgten zwei weitere Zentrifugationsschritte (250 x g, 120 x g, 10 Min., 10 °C), zwischen denen die Zellen resuspendiert und in 45 mL PBS aufgenommen wurden. Mit dieser Methode konnten 1 bis 2 x 106 MNCs/mL Blut mit einer Reinheit von durchschnittlich 94 % und einem Monozytenanteil von 10 bis 30 % gewonnen werden.

3.2.2 Gewinnung von Monozyten

Um Monozyten aus den MNCs zu gewinnen, wurden separierte MNC mit einem Mouse-anti-Bovine Ig-G-CD172a-Antikörper (Tabelle 9-1) inkubiert und in einem zweiten Schritt mit einem Ziege-anti-Maus Ig-G Antikörper (Tabelle 9-2) markiert, der mit magnetischen Beeds gekoppelt ist. Danach wurden die Monozyten mithilfe eines Systems zur magnetischen Zellseparation (MACS) selektiert. Die durch Dichtegradientenzentrifugation gewonnenen mononukleären Zellen wurden nach dem letzten Waschen resuspendiert und in 5 mL PBS-Ethylendiamintetraacetat, PBS-EDTA, 9.2.5) aufgenommen. Um Zellaggregate zu entfernen, wurde die Zellsuspension durch einen Nylonfilter in ein 15 mL Falcon laufen lassen. Der Filter wurde 2mal mit 5 mL PBS-EDTA gespült und der Durchlauf mit der Zellsuspension


22

gesammelt. Nach Zentrifugation (300 x g, 10 Min., 10 °C) und Resuspendierung in 1 mL Puffer wurden den Zellen CD172a-PE-Cy5 Antikörper (Tabelle 9-1) im Verhältnis 1:40 zugegeben. Die anschließende Inkubation erfolgte für 15 Min. bei 4 °C. Um ungebundene Antikörper zu entfernen, wurde das Falcon mit PBS-EDTA aufgefüllt, zentrifugiert (300 x g, 10 Min., 10 °C) und resuspendiert. Für die magnetische Markierung der CD172a-positiven Monozyten wurden Ziege-anti-Mouse Ig-G Beads in einer Konzentration von 6 µL/107 MNCs in 1 mL PBS-EDTA zugegeben und 15 Min. bei 4 °C inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen in 3 mL PBS-EDTA aufgenommen. Zur magnetischen Separation wurde eine MACs-Säule in einen Magneten eingespannt und mit 3 mL PBS-EDTA äquilibriert. Die Zellsuspension wurde nun auf die Säule gegeben und diese anschließend mit 3 x 3 mL PBS-EDTA durchgespült. Zur Eluierung der CD172a-positiven Zellen wurde die Säule aus dem Magneten genommen, auf einem frischen Falcon platziert und mit 3 mL PBS-EDTA mit Hilfe eines Stempels in das Falcon gespült. Auf diese Weise konnten 100.000 Monozyten/1 mL Blut gewonnen werden, die eine durchschnittliche Reinheit von 90 % aufwiesen.

3.2.3 In-vitro-Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten

Zur In-vitro-Generierung von Makrophagen (MdM) wurden die separierten Blutmonozyten in I10F+-Medium (9.2.5) aufgenommen und auf eine Zellzahl von 0,5 x 106 Monozyten/mL eingestellt. Anschließend wurde je 1 mL der Zellsuspension/Well in 24-Well-Platten gegeben und über vier Tage bei 37 °C und 5 Vol% CO2 reifen lassen. Nach vier Tagen wurden die Zellen im Invertmikroskop auf Adhärenz und Wachstum sowie Kontamination überprüft.

3.2.4 In-vitro-Stimulation boviner Makrophagen

Bei den Versuchen zur Analyse der Monozyten-Subpopulationen wurde ein Teil der MdM an Tag 4 für drei Stunden mit LPS (9.2.3) in einer finalen Konzentration von 1 µg/mL bei 37 °C und 5 Vol% CO2 stimuliert. Ein Teil der Zellen wurde als Kontrollgruppe unstimuliert belassen. Anschließend wurde die Genexpression der Zellen mittels quantitativer real time Polymerasekettenreaktion (qPCR) gemessen.

Die Stimulation der separierten CD14+-Monozyten mit dem Sekretom von E.coli und LPS erfolgte an Tag 1. Die Zellen wurden mikroskopisch auf Adhärenz überprüft und mit vier verschiedenen Überständen im Verhältnis 1:50 stimuliert. Ein Teil der Monozyten wurde zur Negativkontrolle unstimuliert belassen, ein weiterer Teil wurde mit LPS in einer finalen Konzentration von 10 ng/mL stimuliert. Bei ausgeprägter Adhärenz oder einer Reinheit < 80 % der Monozyten wurde vorab das Medium gewechselt. Nach der Stimulation reiften die Zellen weitere 3 Tage bei 37 °C und 5 Vol% CO2, ehe sie weiter verarbeitet wurden.


23

Das Sekretom wurde gewonnen, indem E.-coli-Bakterien aus Uterus und Euter subklinisch und klinisch erkrankter Tiere separiert, in Kulturmedium angezüchtet und die zellfreien Überstände abgenommen wurden. Zusätzlich wurde das Sekretom weiterer E.-coli-Stämme unterschiedlicher Herkunft verwendet (Tabelle 3-1).

Tabelle 3-1: Überstände von E.-coli-Isolaten aus dem Uterus.

Herkunft der E.-coli-Isolate 1

Kurz-bez.

Bezeichnung Beschreibung

Tier 871 U1 4616/1/12 Subklinische Endometritis, DNA-Konz.: 1,6 µg/µL


Tier 802 U3 4854/1/12 Klinische Endometritis, DNA-Konz.: 1,6 µg/µL

Tier 841 U4 2045/2/12 Klinisch gesund, DNA-Konz.: 2,9 µg/µL


Tier 811 U6 4071/2/12 Klinisch gesund, DNA-Konz.: 1,3 µg/µL


1) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Robert Goldstone, Institute of Infection, Immunity and Inflammation der University of Glasgow, Scotland.

Tabelle 3-2: Überstände von E.-coli-Isolaten aus der Milchdrüse.

Herkunft der E.-coli-Isolate 1

Kurz-bez.

Bezeichnung Beschreibung

Tier 1 M1 Isolat 1 Mastitis, CMT2: + (0,4 Mio-1,5 Mio Zellen/mL Milch)

Tier 2 M2 Isolat 2 Mastitis, CMT: + (0,4 Mio-1,5 Mio Zellen/mL Milch)

Tier 3 M3 Isolat 3 Mastitis, CMT: +++ (> 5 Mio Zellen/mL Milch)

Tier 4 M4 Isolat 4 Mastitis, CMT: +++ (> 5 Mio Zellen/mL Milch)

Tier 5 M5 Isolat 5 Mastitis, CMT-Ergebnis unbekannt

Tier 6 M6 Isolat 6 Mastitis, CMT-Ergebnis unbekannt 1) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Abteilung Milchhygiene des Institutes für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover, freundlicherweise isoliert und bearbeitet vom Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover 2) CMT: California Mastitis Test, Test zur Einschätzung der Zell-Zahl und des pH-Wertes in der Milch.


24

Tabelle 3-3: Überstände von E.-coli-Isolaten unterschiedlicher Herkunft 1

Kurzbez. Bezeichnung Beschreibung 2 Phylogruppe

Nr. 1 J5 Mastitis Vakzinestamm J5 unbekannt

Nr. 2 H10407 Humaner ETEC A

Nr. 3 MG1655 Humaner enterischer SAFE-Stamm A

Nr. 4 HS Humane enterische Kommensale A

Nr. 5 MS 151 Bovine Uteruskommensale E

Nr. 6 Mutaflor, Nissle 1917

Humaner probiotischer Stamm B2

Nr. 7 MS499 Boviner EnPEC, Mastitis-Isolat B1

Nr. 8 E2348/69 Humaner EPEC B2

Nr. 9 MPEC P4 Tierisches Mastitis-Isolat A

Nr. 10 APEC 01 APEC, extraintestinal B2

Nr. 11 EAEC 042 Humaner EAEC D

Nr. 12 UPEC 536 Humaner UPEC B2 1) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Robert Goldstone, Institute of Infection, Immunity and Inflammation der University of Glasgow, Scotland. 2) ETEC: enterotoxischer E. coli, EnPEC: endometrium-pathogener E. coli, EPEC: enteropathogener E. coli, APEC: aviär-pathogener E. coli, UPEC: uropathogener E. coli.

3.3 Durchflusszytometrie

Im Durchflusszytometer (9.1) werden Einzelzellen an einem Laserstrahl vorbeigeführt und der von den Zellen gebrochene Lichtstrahl als Vorwärtsstreulicht (FSC) und Seitwärtsstreulicht (SSC) erfasst. Mit dem FSC können Partikelgröße und der Refraktionsindex, mit dem SSC die Komplexität, d.h. Oberflächenbeschaffenheit und Granularität, erfasst werden. Des Weiteren können Fluoreszenz-Emissionen in vier verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL1 = Grünfluoreszenz: 530 ± 15 nm; FL2 = Orangefluoreszenz:585 ± 20 nm; FL = Rotfluoreszenz: > 650 nm; FL4 = Violettfluoreszenz: 675 ± 12,5 nm) erkannt werden. Durch diese Parameter kann das Gerät Zellgruppen darstellen und analysieren.

Bei dem für die Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein BD Accuri C6 ® mit zwei Lasern, die Licht einer Wellenlänge von 488 nm und 640 nm erzeugen.

Die Daten wurden mit der zugehörigen Software BD Accuri CFlow R erfasst, sortiert und ausgewertet.


25

3.3.1 Phänotypisierung boviner Makrophagen mittels

Membranimmunfluoreszenz

Die zu Tag-4-Makrophagen gereiften Monozyten wurden zur Lösung vom Well für 5 Min. auf Eis gestellt, durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren sowie durch Zugabe von kaltem PBS abgelöst und in ein 5 mL Röhrchen überführt. Nach Zentrifugation (300 x g, 10 Min.) und Resuspendierung wurden die Zellen in MIF-Puffer (9.2.5) aufgenommen und je 100 mL der Zellsuspension mit ca. 100.000 Zellen in eine 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert. Nach Zentrifugation (300 x g, 10 Min.), Abgießen des Überstandes und Resuspendierung wurden 20 µL MIF-Puffer mit monoklonalen Antikörpern (Tabelle 9-1) zugegeben und für 20 Min. bei 4 °C inkubiert. Es erfolgte ein weiterer Waschschritt (300 x g, 10 Min.) und die Aufnahme in 50 µL MIF-Puffer. Anschließend wurden die Zellen sorgfältig aus den Wells pipettiert, mit 50 µL PBS-PJ (9.2.5) gemischt und im Durchflusszytometer gemessen.

Auswertung

Für die Auswertung der Membranimmunfluoreszenz (MIF)(Abbildung 3-1) wurde zuerst auf vitale Zellen gefenstert und diese in einem separaten Dichteplot angezeigt. Anschließend wurde ein Fenster um die Makrophagen gezogen, das mit einem weiteren Dichteplot verknüpft wurde, in dem die Expression von CD16 und MHCII, bzw. CD163 und CD11b in Form der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) gemessen wurde.

Abbildung 3-1: Strategie zur Messung der Membranim munfluoreszenz boviner Tag-4-Makrophagen.

Makrophagen wurden mit direktmarkierten Antikörpern gegen CD16 und MHC-Klasse-II markiert. In einem FL3/SSC-Dichteplot wurde ein Fenster auf PJ-negative, lebende Zellen gesetzt (A). Anschließend wurden Makrophagen nach Morphologie in einem FSC/SSC-Dichteplot identifiziert (B). In einem FL1/FL2-Dichteplot konnte daraufhin die Fluoreszenz der Makrophagen dargestellt und als mittlere Fluoreszenzintensität gemessen werden (C).

SS

C

A)

-

B) C)

FL-3 FSC CD16

MH

C-II

SS

C


26

3.3.2 Messung reaktiver Sauerstoffspezies boviner M akrophagen

Zur Messung der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies wurde Dihydrorhodamin (DHR) 123 (9.2.3) eingesetzt. Das nicht-fluoreszierende DHR 123 wird in die Zellen aufgenommen, in Anwesenheit von Sauerstoffmetaboliten durch Peroxidasen gespalten und zu Rhodamin 123 umgesetzt. Dieses ist grün fluoreszierend und kann somit durchflusszytometrisch erfasst werden. Die Fluoreszenzintensität ist ein zuverlässiges Maß für die ROS-Bildung.

Nach der Reifung zu Tag-4-Makrophagen wurden die Zellen aus den Wells gelöst, zentrifugiert (300 x g, 5 Min.) und in RPMI-Medium (9.2.3) aufgenommen. Je 100 µL der Zellsuspension mit ca. 100.000 Makrophagen wurden in eine 96-Well-Rundbodenplatte pipettiert. Zur Induktion der mit Phagozytose einhergehenden ROS-Bildung wurden einem Teil der Zellen 25 µL hitzegetötete, formalinfixierte S. aureus zugegeben. Zur Kontrolle blieb ein Teil der Wells unstimuliert.

Nach gründlichem Durchmischen wurden die Ansätze für 20 Min. bei 37 °C und 5 Vol% CO2 inkubiert. Im Anschluss wurden 15 µg DHR 123 im Verhältnis 1:5 in RPMI-Medium verdünnt und 25 µL des Gemisches in jedes Well pipettiert. Die Platte wurde erneut für 10 Min bei 37 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt (300 x g, 5 Min.) wurden 50 µL PBS-PJ (4 µg/mL) und 50 µL MIF-Puffer in jedes Well gegeben und die Platte zur Vermeidung der Adhärenz der Makrophagen für 10 Min. auf Eis gestellt. Zum Schluss erfolgte die Messung im Durchflusszytometer.

Auswertung

Für die Auswertung der ROS-Bildung (Abbildung 3-2) wurde zuerst auf vitale Zellen und auf Makrophagen gefenstert und diese in einem separaten Dichteplot dargestellt. Die Fluoreszenz von Rhodamin wurde auf der X-Achse abgebildet. Nun wurde zuerst die nicht mit Bakterien inkubierte Negativkontrolle gemessen, anschließend die mit Bakterien inkubierte Probe. Um die veränderte Basisfluoreszenz der verschiedenen Proben aufzuzeigen, wurde die MFI der nicht mit Bakterien inkubierten Proben bestimmt und verglichen. Außerdem wurde von jeder Probe die MFI der inkubierten im Verhältnis zur nicht inkubierten Probe gesetzt. So konnte die unterschiedlich starke Stimulierbarkeit der verschiedenen Proben deutlich gemacht werden.


27

Abbildung 3-2: Messung der Bildung reaktiver Sauer stoffspezies boviner Tag-4-Makrophagen.

In einem FL3/SSC-Dichteplot wurde auf PJ-negative, vitale Zellen gefenstert (A). Anschließend wurden in einem weiteren Plot (FSC/SSC) Makrophagen nach ihrer Morphologie umrandet (B) und in einem anderen FL1/SSC-Dichteplot abgebildet (C, D). Rhodamin stellt sich im Durchflusszytometer in der FL1-Fluoreszenz dar. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Negativkontrolle, also der Messung der Probe ohne Bakterienzugabe wurde für die Auswertung herangezogen. Außerdem wurde die MFI der mit Bakterien stimulierten Probe im Verhältnis zur nicht stimulierten gesetzt (Induction Fold). Hier entstanden Werte zwischen 1 und 6.

3.3.3 Intrazelluläre Kalziummessung

Frisch separierte bovine MNCs wurden nach dem letzten Waschschritt in MIF-Puffer aufgenommen und mit CD172a-RPE-Cy5 und CD14-PE Antikörpern (Tabelle 9-1) für 20 Min. auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 5 mL MIF-Puffer gewaschen (300 x g, 10 Min., 4 °C), in Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, 9.2.3) aufgenommen und auf eine Konzentration von 5 x 106/mL eingestellt. Es

SS

C

SS

C

Rhodamin-A

A) B)

C) D)

Rhodamin-A

SS

C

SS

C

FSCFL3


28

wurden 50 µg Acetoxymethyl Ester Kalzium Indikator (Fluo-4, 9.2.3) in 5 µL Dimethyl-sulfoxid gelöst und mit 95 µL fetalem Kälberserum (9.2.3) versetzt und je 1 mL Zell-suspension wurde mit 2 µL 1:10 in PBS verdünntem Fluo-4 (final 100 nmol/L) für 30 Min. bei 37 °C inkubiert. Teilweise wurden im Rahmen der Versuche separierte Monozyten bzw. Monozyten-Subpopulationen verwendet. In diesem Fall konnte auf das Markieren der Zellen mit Antikörpern verzichtet und direkt mit der Einstellung der Zellzahl und Zugabe von Fluo-4 begonnen werden. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal in HBSS gewaschen (300 x g, 6 Min.) und auf eine Konzentration von 5 x 106/mL eingestellt. Unmittelbar danach wurde mit der Messung bei Raumtemperatur begonnen. Hierfür wurden in 1,5 mL Eppendorfgefäßen 100 µL PBS-PJ vorgelegt und direkt vor der Messung 150 µL Zellsuspension hinzupipettiert. Für die Messung der Zellaktivierung wurde die FL1 über die Zeit in Abhängigkeit vom Stimulus und der jeweiligen Probe gemessen. Nach dem Einstellen einer Basislinie (ca. 20 Sek.), wurden vorsichtig 50 µL des jeweiligen Stimulus zur laufenden Messung gegeben. Die Messung verlief über 2 Min. Als Negativkontrolle diente HBSS, während Ionomycin (1 µg/mL) als Positivkontrolle verwendet wurde.

Auswertung

Je nach Ziel der Messung wurde auf CD14-positive und negative Zellen oder CD172a-positive Gesamtmonozyten gefenstert. Von jeder Zellgruppe wurde die Grünfluoreszenz (FL1) über die Zeit dargestellt. Zur Auswertung der Stärke des Kalziumeinstromes wurde eine 15 Sek. breite Region im Bereich der Basislinie in einem neuen Dichteplot gesondert dargestellt. Da die Basislinie im Verlauf der Messungen nicht immer konstant blieb, wurde ein Quadrant so gelegt, dass die horizontale Linie der Basislinie auflag und der Anteil der darüber liegenden Zellen zwischen 20 % und 25 % betrug. Anschließend wurde die 15 Sek. breite Region auf die Stelle der maximalen Fluoreszenzzunahme verschoben. Der Anteil der Zellen oberhalb der horizontalen Linie des Quadranten wurde erneut erfasst. Es wurde nun die Differenz des Anteils an Zellen oberhalb der horizontalen Quadrantenlinie am maximalen Fluoreszenzpunkt im Vergleich zur Basislinie errechnet. Für die Normierung der Ergebnisse mit Zellen verschiedener Tiere wurde der Prozentsatz aktivierter Zellen für die unstimulierten Kontrollansätze (HBSS) gleich 0 % und für die Positiv-Kontrollansätze (Stimulation mit Ionomycin) gleich 100 % gesetzt.


29

Abbildung 3-3: Strategie zur Auswertung der intraze llulären Kalziummessung.

Zur Auswertung wurde ein 15 Sek. breites Fenster auf die Messung vor der Stimulation gelegt (A). Das Fenster wurde in einem separaten Dichteplot angezeigt. Hier wurde ein Kreuz so gelegt, dass eine horizontale Trennlinie die Basislinie so trennte, dass der Anteil an Zellen oberhalb der Trennlinie bei 20-25 % lag (B). Das Fenster wurde nun auf die Stelle der maximalen Fluoreszenzzunahme geschoben (C) und der Anteil der Zellen oberhalb der Basislinie an dieser Stelle gemessen (D). Die Differenz der beiden Werte wurde gebildet.

3.4 Quantitative real time Polymerasekettenreaktion

3.4.1 Aufbereitung von messengerRNA aus bovinen Makrophagen

Für die Extraktion der RNA aus Makrophagen wurde das RNeasy® Plus Micro Kit verwendet. Ein Lysepuffer (9.2.5) wurde im Verhältnis 100:1 aus RLT-Puffer (9.2.3) und β-Mercaptoethanol (9.2.3) hergestellt. Zur Zelllyse wurde das Medium der Makrophagen abpipettiert und anschließend 350 µL des Lysepuffers zugegeben. Vor der Überführung in sterile 1,5 mL Eppendorf-Cups wurde darauf geachtet, dass die adhärenten Makrophagen gut vom Boden der Wells gelöst wurden. Die Aufbewahrung der Proben erfolgte bei -80 °C. Zur weiteren Verarbeitung wurde das Lysat durch einen im Kit enthaltenen Filter gegeben, um genomische DNA (gDNA) zu entfernen, bevor es durch weitere Waschschritte auch von Proteinen und Salzen befreit wurde. Zuerst wurde 70 %iges Ethanol (9.2.3) zu dem gefilterten Lysat gegeben und vorsichtig durch Pipettieren gemischt. Danach folgten die Waschgänge mit 700 µL RW1-Puffer (9.2.3), 500 µL RPE-Puffer (9.2.3) und 80 %igem Ethanol. Zentrifugiert wurde jeweils für 15 Sek. bei > 8000 x g, der Durchfluss wurde verworfen.

Nach dem Trocknen der Filtermembran durch Zentrifugation für 5 Min. mit offenem Deckel wurde die aufbereitete mRNA in 14 µL sterilem, Ribonuklease (RNase)-freiem Wasser (9.2.3) aufgenommen. Hierfür wurde das Wasser direkt auf die Filtermembran pipettiert und durch Zentrifugation für 2 Min. aus dem Filtersystem in ein steriles 1,5 mL Eppendorf-Cup überführt. Die gewonnene RNA wurde direkt nach

SS

C

Fluo-4

A) B) C) D)


30

der letzten Zentrifugation auf Eis gelagert oder bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

3.4.2 Qualitative und quantitative Analyse der RNA mit dem Experion

Automated Electrophoresis System

Zur Analyse der Genexpression mittels quantitativer real-time Polymerase-kettenreaktion (qPCR) ist die Qualität der verwendeten RNA von großer Bedeutung. Zum Prüfen der RNA-Qualität wurde das Experion Automated Electrophoresis System von Bio Rad (9.1) verwendet. Dies ist ein automatisches System, basierend auf Gelelektrophorese, das kleinvolumige RNA-Proben selbstständig auftrennen, färben, detektieren und analysieren kann. Die Elektrophorese erfolgt in einem Chip (9.2.2), der aus einer von Mikrokanälen durchzogenen Glasplatte und damit verbundenen Plastikvertiefungen besteht, die mit RNA befüllt werden. Die Kanäle werden vor der Messung in einer Priming Station mit Gel befüllt, welches nach Anlegen einer Spannung das Wandern und die Auftrennung der RNA ermöglicht.

Für die Analyse von Makrophagen wurde das Experion RNA StdSens Analysis Kit (9.2.2) verwendet, dessen Reagenzien vor der Messung auf Raumtemperatur gebracht wurden. Außerdem wurde 1,5 µL der RNA zusammen mit der RNA-Leiter (9.2.3) aufgetaut, für 2 Min. bei 70 °C hitzedenaturiert und für 5 Min. auf Eis gestellt. Währenddessen konnte das Experion nach Herstellerangabe gereinigt werden. Dazu wurden 600 µL des Gels zur Befüllung des Chips bei 13000 x g für 10 Min. filtriert. Anschließend wurden 65 µL der filtrierten Lösung mit 1 µL einer Färbelösung versetzt und 9 µL in die dafür vorhergesehene Vertiefung auf dem Chip pipettiert. Zur Vorbereitung wurde der Chip für 1 Min. in die zugehörige Priming Station eingelegt und die im Chip vorhandenen Mikrokanäle mit Gel gefüllt. Nachfolgend wurden weitere Vertiefungen mit gefärbtem und ungefärbtem Gel befüllt. In die verbleibenden Vertiefungen wurden je 5 µL Ladepuffer und 1 µL der RNA-Proben bzw. RNA-Leiter pipettiert. Nach Durchmischung im Vortex-Gerät wurde der Chip in die Experion Elektrophorese Station eingelegt und der Analyse-Lauf gestartet. Nach dem Lauf wurde der Chip entnommen und die Elektroden gereinigt. Die Auswertung erfolgte mit der zugehörigen Experion Software. Für die nachfolgende Synthese von komplementärer DNA (cDNA) wurden die Proben auf 5 ng RNA/µL eingestellt.

3.4.3 Synthese von komplementärer DNA durch Reverse Transkription

Für die PCR musste die aus Makrophagen gewonnene RNA durch das Enzym SuperScriptTM II Reverse Transkriptase (9.2.3) in cDNA umgeschrieben werden. Um ausschließlich für die Genexpressionsanalyse relevante mRNA in cDNA umzuschreiben, wurden Oligo–(dt)12-18–Primer (9.2.3.)verwendet. Diese lagern sich an das Poly-A-Ende der mRNA Moleküle an und dienen somit als Startregion für die Reverse Transkriptase. In einem 200 µL Reaktionsgefäß wurden 10 µL der auf 50 ng


31

RNA/µL eingestellten RNA, 1 µL Oligo-(dt)-12-18-Primer und 1 µL Trinukleotide gemischt und für 5 Min. bei 65 °C im Biometra T-Gradient inkubiert. Dies diente dazu, die Sekundärstrukturen der RNA aufzufalten. Die Proben wurden sofort auf Eis gestellt und jeweils 7 µL des in der Zwischenzeit hergestellten Mastermix (Tabelle 3-4) beigefügt. Um das Temperaturoptimum für die Reverse Transkriptase zu erreichen, folgte eine zweite Inkubation bei 42 °C für 2 Min. Zuletzt wurde 1 µL (200 U) SuperScriptTM II Reverse Transkriptase in die Proben pipettiert und bei 42 °C für 50 Min. inkubiert. Hierbei erfolgte die Reverse-Transkriptase-Reaktion. Zum Stoppen der Reaktion und um eine Interaktion der bei der Umschreibung verwendeten Enzyme mit denen der nachfolgenden PCR zu vermeiden, wurden die Enzyme anschließend bei 70 °C für 15 Min. denaturiert.

Tabelle 3-4: Mastermix für das Umschreiben von RNA in cDNA mithilfe der SuperScriptTM II Reverse Transkriptase.

Reagenz Volumen (µL)

5 x First-Strand- Buffer (250 mmol/L Tris-HCl, 375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2

4,0

RNase Inhibitor (RNaseOUT TM) 1,0

Reduktionsmittel (Dithiothreitol, DTT) 2,0

3.5 Prinzip der quantitativen real time Polymerasek ettenreaktion

Bei der qPCR wird der DNA der grün fluoreszierende Farbstoff SYBR Green beigemischt, der sich an die kleine Windung doppelsträngiger DNA anlagert. Bei jedem Amplifikationszyklus wird die Fluoreszenz gemessen und die Vervielfältigung der DNA damit ‚in Echtzeit' sichtbar. Aufgezeichnet wird der Fluoreszenzanstieg über die gesamte Laufzeit durch die StepOneTM Software Version 2.0. Wie eine konventionelle PCR besteht auch die qPCR aus der Wiederholung der drei Reaktionsschritte: 1) Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA; 2) Anlagerung der Primer; 3) Verlängerung des Produkts. Der Ablauf aller drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. In den frühen Zyklen der PCR kommt es lediglich zu einem basalen Fluoreszenzsignal, das auch als Hintergrundsignal bezeichnet wird. Je nach ursprünglicher Menge an DNA im Reaktionsansatz steigt nach einer bestimmten Zyklenzahl die Fluoreszenz des PCR-Produkts exponentiell an. Der Zyklus, an dem die Fluoreszenz aus dem Hintergrundsignal in eine exponentielle Phase übergeht, wird als Cycle threshold (Ct) bezeichnet. Im weiteren Verlauf der PCR geht die exponentielle Phase aufgrund von Inhibition durch Reaktionsprodukte und Enzymlimitierung zunächst in eine lineare Phase und letztendlich in eine Plateauphase über (Abbildung 3-4, A).


32

SYBR Green bindet unspezifisch an jede doppelsträngige DNA. Um Messfehler zu vermeiden, muss nach den Amplifikationszyklen eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden (Abbildung 3-4, B). Hierbei werden die Proben schrittweise denaturiert, wodurch die Amplifikationsprodukte zerfallen und die Fluoreszenz schlagartig abfällt. Je nach Größe der DNA-Stränge findet dies zu einem bestimmten Zeitpunkt statt. Befinden sich also verschiedene Produkte im Reaktionsansatz, wird eine Schmelzkurve mit mehreren Scheitelpunkten sichtbar.

Abbildung 3-4: Amplifikationsplot und Schmelzkurve einer qPCR.

Dargestellt ist die Amplifikation (Steigung der SYBR Green-Fluoreszenz (∆ Rn) von Messplasmiden des Gens CXCL1 in den Verdünnungen 1 x 102 Kopien bis 1 x106 Kopien über 40 Zyklen. Der Ct-Wert (Eintritt in die exponentielle Phase) und der Übergang in die Plateau-Phase am Ende der Amplifikation sind gekennzeichnet (A). Exemplarische Darstellung einer Schmelzkurve von CXCL1 in der ersten negativen Ableitung des Reporter-Farbstoffs SYBR Green (Derivative Reporter(-Rn)) aufgetragen gegen die Temperatur mit einem einheitlichen Peak bei 82,49 °C (B).

3.5.1 Probenmessung

In der qPCR wurde die Genexpression der unter Zellkulturüberständen und LPS gereiften bovinen MdM gemessen. Zur Vorbereitung der qPCR wurden die Proben wie in 3.4 beschrieben extrahiert, auf 5 ng/µL Gesamt-RNA eingestellt und in cDNA umgeschrieben. Für die Durchführung der qPCR wurde der SYBR Green® PCR Master Mix verwendet. In eine Micro Amp TM Fast 96-Well-PCR-Platte wurden pro Vertiefung jeweils 24 µL eines hergestellten Mastermix (Tabelle 3-5, Tabelle 3-6) und 1 µL cDNA pipettiert. Außerdem wurden für jede Messung mindestens fünf Punkte der Standardreihe (102-106 Kopien) und eine Negativkontrolle (Mastermix + Wasser)

Plateau-Phase

Ct-Wert

Zyklus

∆R

n

A

1

2

3

4

Der

ivat

ive

Rep

orte

r (-

Rn)

B

Temperatur (°C)65 70 75 80 85 90 95


33

eingesetzt. Alle Ansätze wurden in Duplikaten angelegt. Zu Beginn der Two-Step-PCR wurden die Proben zur vollständigen Denaturierung der DNA einmalig für 10 Min. auf 95 °C erhitzt. Danach erfolgten 40 Zyklen mit je einer Denaturierung der Proben über 15 Sek. bei 95 °C sowie der Anlagerung der Primer und der Verlängerung des Produkts über 1 Min. bei 60 °C. Nach Ablauf der Amplifikationszyklen wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dabei wurden die Proben von 60 °C in Schritten von 0,3 °C unter ständiger Aufzeichnung der Fluoreszenz auf 95 °C erhitzt.

Tabelle 3-5: Mastermix für IL1B, CXCL1


SYBR Green ® PCR Master Mix 12,5

Wasser (RNase-, DNase-frei) 8,5

Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Tabelle 3-6: Mastermix für CXCL8, UXT, NOS2


SYBR Green ® PCR Master Mix 12,5

Wasser (RNase-, DNase-frei) 9,75

Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 0,25

Auswertung

Die StepOneTM-Software zeichnete die SYBR-Green-Fluoreszenz auf und legte für die einzelnen Proben sowie für die Standardreihen mit bekannter Kopienzahl die Ct-Werte fest. Durch die logarithmische Darstellung der ermittelten Ct-Werte gegen die Kopienzahl der Standardpunkte entstand eine Regressionsgerade (Abbildung 3-5). Anhand der Standardreihe konnte die in den Proben enthaltene Kopienzahl von der Software ermittelt werden. Zur Validierung der PCR werden im Allgemeinen die Parameter Steigung der Regressionsgeraden, Effizienz, Bestimmtheitsmaß (R²) und Güte der Schmelzkurve herangezogen. Die Effizienz der Amplifikation lässt sich aus der von der Software berechneten Steigung der Geraden ermitteln. Bei einer Steigung von -3,32 liegt eine 100 %ige Effizienz vor. Dies bedeutet, dass die DNA in jedem Zyklus exakt verdoppelt wird. Nur Steigungen von -3,1 bis -3,6 (90 % - 110 % Effizienz) gelten als auswertbar, da bei nicht genügender Effizienz der Amplifikation die Ausgangsmengen nicht exakt berechnet werden können. Zusätzlich


34

wird von der Software das Bestimmtheitsmaß berechnet. Mit deren Hilfe kann der lineare Zusammenhang zwischen Ct-Werten und eingesetzter Kopienzahl überprüft werden, wobei R² Werte > 0,985 annehmen sollte. Weiterhin ist von Bedeutung, dass die Schmelzkurve lediglich einen einzelnen Scheitelpunkt aufweist, um sicherzustellen, dass nur ein Produkt amplifiziert wurde. Nur wenn die genannten Parameter den vorgegebenen Kriterien entsprachen, wurden die berechneten Kopienzahlen der Proben für die weitere Auswertung verwendet.

Abbildung 3-5: Regressionsgerade einer Standardreih e in der qrtPCR

Dargestellt sind Messplasmide von CXCL1 in den Verdünnungen 102-Kopien bis 106-Kopien. Die Ct-Werte sind gegen die Kopienzahl aufgetragen und ergeben die Regressionsgerade (hier mit einer Steigung s = -3,208; einer Effizienz von 105 % und einem R2-Wert von 0,999).

3.6 Statistische Auswertung

Zur statistischen Auswertung und für das Erstellen der Grafiken wurde das Programm GraphPad Prism 5,0 (GraphPad Software, Inc) (9.1) verwendet. Tierzahlen und Häufigkeiten der Versuchsdurchführungen sind in den Einzelexperimenten beschrieben. Um zu untersuchen, ob sich zwei qualitative Merkmale (Gruppen) bezüglich eines quantitativen Merkmals unterscheiden, wurde bei normalverteilten Daten der gepaarte t-Test verwendet. Zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen bei normalverteilten, unabhängigen Daten wurde die einfaktorielle Analysis of Variance (Varianzanalyse, ANOVA) gewählt. Hierbei wurden die Mittelwerte der quantitativen Merkmale miteinander verglichen und die Varianz innerhalb der Gruppen mit der Varianz zwischen den einzelnen Gruppen verglichen. Um falsch-positive Resultate zu vermeiden, wurde anschließend mit der Bonferroni-Methode korrigiert.

Ct-W

ert

Kopienzahl (Quantität)10² 10³ 104 105 106

12

14

16

18

20

22

24

26


35

Unterschiede zwischen Parameterklassen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p ≤ 0,001 wurden als höchst signifikant (***), p ≤ 0,01 als hoch signifikant (**) und p ≤ 0,05 als signifikant (*) bezeichnet. Werte mit p>0,05 galten als nicht signifikant.

Ergebnisse

36

4 Ergebnisse

4.1 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständ en auf Monozyten

Makrophagen nehmen Schlüsselrollen in der Initial- und Resolutionsphase einer Entzündung ein und sind für die Feinregulation des Entzündungsverlaufs verantwortlich. Die Entwicklung zu Makrophagen unterschiedlicher Funktionalität ist abhängig von den sie umgebenden Faktoren, die vom Wirt selbst oder von Erregern sezerniert werden. Daher wurde im Folgenden untersucht, welchen Einfluss das Sekretom von bovinen uterinen Gewebezellen und von verschiedenen E.-coli-Isolaten auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung nimmt. Um die unmittelbare Reaktion von Monozyten auf die Überstände zu messen, wurden diese während einer laufenden durchflusszytometrischen Messung zu Monozyten gegeben. Mithilfe des Ca2+-Indikators Fluo-4 konnte der Ca2+-Einstrom in die Zellen erfasst werden.

4.1.1 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyte n durch Überstände von

uterinen Zellkulturen

Uterusstroma-Zellüberstände lösten einen signifikan ten Kalziumeinstrom in Monozyten aus

Während Kulturmedium nicht zu einem Ca2+-Einstrom in Monozyten führte, bewirkten Überstände unstimulierter und LPS-stimulierter uteriner Stromazellen einen signifikanten Ca2+-Einstrom in Monozyten (Abbildung 4-1). Der Unterschied zwischen Überständen stimulierter und nicht stimulierter Zellen war nicht signifikant. Der Ca2+-Einstrom durch die 1:30 verdünnten Zellkulturüberstände erreichte ca. 50 % des von CCL5 induzierten Ca2+-Einstroms (Abbildung 4-1).

Ergebnisse

37

Abbildung 4-1: Ca 2+-Einstrom induzierender Einfluss von Stromazellüber ständen auf Makrophagen.

Gesamtleukozyten wurden mit Fluo-4-markiert und mit CD14-PE- und CD172a-PE-Cy5-Antikörpern doppelt markiert, um im Durchflusszytometer Monozyten identifizieren zu können. Die Zunahme der FL1-Fluoreszenz nach Zugabe von Ionomycin (1 µg/mL, Positiv-Kontrolle) wurde gleich 100 % gesetzt. Die Zunahme der FL1-Fluoreszenz nach Zugabe von 1:30 verdünnten Kulturüberständen unstimulierter (Str.), LPS-stimulierter (Str. LPS) Stromazellen oder dem Chemokin CCL5 (100 nM) wurde als Anteil der Ionomycin-Antwort dargestellt (n = 11, Mittelwert ± Standarderror of the mean (Standardfehler, SEM), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, Signifikanzen bezogen auf die Mediumkontrolle).

Überstände von uterinen Epithelzellen erzeugten ein en signifikanten Kalziumeinstrom in Monozyten

Überstände von unstimulierten und LPS-stimulierten uterinen Epithelzellen induzierten einen signifikanten, konzentrationsabhängigen Ca2+-Einstrom in Monozyten. Kulturmedium bewirkte keinen Ca2+-Einstrom (Abbildung 4-2). Ein Unterschied zwischen Überständen stimulierter und nicht stimulierter Zellen war nicht vorhanden. Der durch 1:30 verdünnte Zellkulturüberstände ausgelöste Ca2+-Einstrom erreichte ca. 45 %, der durch 1:60 verdünnte Überstände ausgelöste Ca2+-Einstrom ca. 25 % des von CCL5 (100 nM) induzierten Ca2+-Einstroms.

0 20 40 60

CCL5

Str. LPS

Str.

Med

***

***

% von Ionomycin

**

Ergebnisse

38

Abbildung 4-2: Auslösung eines Kalziumeinstroms in Monozyten durch Überstände uteriner Epithel-Zellkulturen.

Gesamtleukozyten wurden mit Fluo-4-markiert und mit CD14-PE- und CD172a-PE-Cy5-Antikörpern doppelt markiert um im Durchflusszytometer Monozyten identifizieren zu können. Die Zunahme der FL1-Fluoreszenz nach Zugabe von Ionomycin (1 µg/mL, Positiv-Kontrolle) wurde gleich 100 % gesetzt. Die Zunahme der FL1-Fluoreszenz nach Zugabe von 1:30 und 1:60 verdünnten Kulturüberständen unstimulierter (Epi.), LPS-stimulierter (Epi. LPS) Epithelzellen oder dem Chemokin CCL5 (100nM) wurde als Anteil der Ionomycin-Antwort dargestellt (n = 6, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, Signifikanzen bezogen auf die Mediumkontrolle).

4.1.2 Induktion eines Kalziumeinstromes in Monozyte n durch Überstände

verschiedener E.-coli-Isolate

Die in Tabelle 3-1 beschriebenen E.-coli-Kulturüberstände wurden auf ihre Monozyten aktivierende Wirkung getestet.

Alle Überstände (supernatants, SN) von E.-coli-Isolaten aus Uterus und Euter lösten einen signifikanten Ca2+-Einstrom in Monozyten aus. Die Kulturüberstände von Isolaten anderer Herkunft variierten deutlich in der Stärke des von ihnen induzierten Ca2+-Einstroms (4 % - 51,8 %, Abbildung 4-3 C). Die vier E.-coli-Überstände, die einen signifikanten Ca2+-Einstrom auslösten, gehörten zusammen mit dem nicht typisierten Mastitis-Vakzinestamm J5 der Phylogruppe A an (Tabelle 3-1).

1:60

0 20 40 60

1:30

% von Ionomycin

*

*

***

Med

Epi.

Epi. LPS

CCL5

Ergebnisse

39

Abbildung 4-3: Ca 2+ Einstrom in Monozyten, ausgelöst von Überständen verschiedener E.-coli-Isolate.

Um die Stärke des Ca2+-Einstromes erfassen zu können, wurden Ansätze von Gesamtleukozyten mit Fluo-4 gefärbt und die verschiedenen 1:50 verdünnten Überstände während der laufenden Messung zugegeben. Um nur die Reaktion von Monozyten zu messen, wurden diese nach ihrer Morphologie aus Gesamtleukozyten gefenstert. Zur Auswertung wurde die Fluoreszenzzunahme bei Zugabe von Ionomycin (1 µg/mL) als 100 % gesetzt. Die Reaktion auf eine LPS-Zugabe diente als Vergleich. Da die Überstände von E.-coli-Isolaten anderer Herkunft separat auf Zellen anderer Versuchstiere gemessen wurden, sind sie in einem gesonderten Diagramm dargestellt (n ≥ 3, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Signifikanzen bezogen auf die Mediumkontrolle).

A) E. coli-SN

aus dem Uterus:

B) E. coli-SN

aus dem Euter:

C) E. coli-SN

anderer Herkunft:

% Ionomycin0 10 20 30 40 50

654321

7654321

LPSMed

****

******

***

******

***

% Ionomycin0 5 10 15 20 25

121110987654321

LPSMed

******

****

% von Ionomycin

Ergebnisse

40

In der Reaktion auf die E.-coli-SN wurden tierspezifische Unterschiede beobachtet. Die meisten untersuchten E.-coli-SN waren nicht in der Lage die Monozyten aller geprüften Tiere zu stimulieren (Tabelle 4-1).

Tabelle 4-1: Tierspezifische Unterschiede in der R eaktion auf verschiedene E.-coli-Überstände.

Monozyten-spendertier

Med.-Kontrolle

SN Nr. 3 SN Nr. 4 SN Nr.5 SN Nr.6 SN Nr.7

434 0 % 8 % 15 % 3 % 8 % 21 %

430 0 % 8 % 22 % 10 % 0 % 15 %

35 0 % 0 % 16 % 0 % 2 % 20 %

567 0 % 0 % 7 % 3 % 4 % 0 %

Cut Off 1: 2,5 %

Reagierende Tiere: 2 von 4 4 von 4 3 von 4 2 von 4 3 von 4 1) Cut Off = Mittelwert + 2x Standardabweichung der Mediumkontrolle

Dargestellt ist die Stärke des von E.-coli-Überständen (SN 3-7) ausgelösten Ca2+-Einstroms als prozentualer Anteil der Stärke des von Ionomycin ausgelösten Influx in Monozyten am Beispiel von fünf Spendertieren. Als Cut-Off-Wert wurde der Mittelwert der Mediumkontrolle + 2s angenommen. Alle Tiere, bei deren Monozyten ein Ca2+-Einstrom ausgelöst wurde, der über dem Cut-Off-Wert lag, wurden als ‚reagierende Tiere‘ gewertet.

4.2 Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständ en auf Phänotyp und

Funktionalität in-vitro-differenzierter Makrophagen

Monozyten reagierten auf im Sekretom von Stromazellen enthaltene Faktoren mit einem signifikanten Ca2+-Einstrom (Abbildung 4-1). Nachfolgend sollte nun geprüft werden, wie sich diese Monozyten-Aktivierung auf die Differenzierung zu Makrophagen auswirkt.

Ergebnisse

41

4.2.1 Zellkulturüberstände

4.2.1.1 Der Phänotyp in-vitro-differenzierter Makrophagen wurde nicht von Uterusstroma-Zellüberständen beeinflusst

Die Reifung von Monozyten zu Makrophagen unter dem Einfluss von LPS führte zu einer signifikant verminderten Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf Tag-4-MdM (Abbildung 4-4 B). Die Reduktion der CD163-Expression (Abbildung 4-4 D) nach LPS-Stimulation war statistisch nur tendenziell (p = 0,09). Weder LPS noch Stromazellüberstände beeinflussten signifikant die Expression von CD16 und CD11b auf Tag-4-Makrophagen (Abbildung 4-4 A C).

Abbildung 4-4: Einfluss von uterinen Stromazell-Ku lturüberständen auf die Expression von Makrophagen-Oberflächenmolekülen.

CD14-positive Monozyten wurden in vitro zu Makrophagen gereift. Parallelkulturen wurde an Tag 1 LPS (10 ng/mL), Stromazell-Überstand unstimulierter (Str.) und Stromazell-Überstand LPS-stimulierter (Str. LPS) Zellen (1:50) zugesetzt. Ansätze ohne Zusatz (Med) dienten zur Kontrolle. Die Tag-4-MdM wurden durchflusszytometrisch auf ihre CD16-, MHC-Klasse-II-, CD11b- und CD163-Expression untersucht (n = 10, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05).

80000

100000

120000

A) CD16

6000

8000

10000

12000

14000 * *

B) MHCII

Med

LPS

Str.

Str.LP

S

200000

300000

400000

500000C) CD11b

Med LPS

Str.

Str.LPS

15000

20000

25000

30000

35000D) CD163

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Ergebnisse

42

4.2.1.2 Die Funktionalität in-vitro-differenzierter Makrophagen wurde nicht von Uterusstroma-Zellüberständen beeinflusst

Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wurde genutzt, um zu analysieren, ob die funktionellen Eigenschaften von Makrophagen von Stromazellen und deren Sekretom beeinflusst wurden.

Makrophagen, die aus Monozyten unter dem Einfluss von LPS oder Stromazellüberständen generiert wurden, zeigten keine Unterschiede in der basalen Produktion reaktiver Sauerstoffmetaboliten (Abbildung 4-5 A). Nach Stimulation der Kontroll-Makrophagen mit Bakterien wurde die Fluoreszenzintensität des ROS-Indikators um das 3-fache gesteigert (Abbildung 4-5 B). Die leicht schwächere Antwort der Makrophagen, die unter dem Einfluss von LPS oder Stromazell-Überständen ausdifferenzierten, war nicht signifikant (Abbildung 4-5 C).

Abbildung 4-5: Basale und induzierte ROS-Bildung v on Stromazell-Überstand-gereiften Makrophagen.

CD14-positive Monozyten wurden in vitro zu Makrophagen gereift. Parallelkulturen wurde an Tag 1 LPS (10 ng/mL), Stromazell-Überstand unstimulierter (Str.) und Stromazell-Überstand LPS-stimulierter (Str. LPS) Zellen (1:50) zugesetzt. Makrophagen wurden mit hitzegetöteten S. aureus stimuliert (B) oder blieben unstimuliert (A). Nach Inkubation mit dem Fluorochrom DHR123 wurde die MIF der Zellen durchflusszytometrisch ermittelt (A). Um die individuelle ROS-Bildungskapazität zu normieren, wurde in (C) der Induction Fold (MFI des mit Bakterien stimulierten Ansatzes/ MFI des unstimulierten Ansatzes) bestimmt (n = 4, Mittelwert ± SEM, p > 0,05).

4.2.2 E.-coli-Kulturüberstände

Aufgrund der Ca2+-Einstrom-induzierenden Eigenschaften der Überstände von E.-coli-Isolaten wurde im Folgenden geprüft, ob sich Monozyten unter dem Einfluss dieser Überstände zu morphologisch oder funktionell unterschiedlichen

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Med LPS

Str.

Str.LP

S

200000

400000

600000

800000A)

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Med LPS

Str.

Str.LPS

200000

400000

600000

800000B)

Med LPS

Str.

Str .LP

S

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Indu

ctio

n F

old

C)

Ergebnisse

43

Makrophagen entwickeln. Zusätzlich wurde untersucht, ob Monozyten, die zu verschiedenen Zeiten in der Transitperiode gewonnen wurden, eine unterschiedliche Reaktivität aufwiesen. Dies erfolgte ebenso unter Berücksichtigung des antepartal erhobenen BCS der Tiere. Dazu wurden Monozyten von Milchkühen an Tag -42 und Tag -14 vor der Geburt, und an den Tagen 7, 21 und 56 nach der Geburt gewonnen (3.1). Unter dem Einfluss von vier ausgewählten E.-coli-Kulturüberständen (Tabelle 3-1) reiften diese Monozyten zu Tag-4-Makrophagen.

4.2.2.1 E.-coli-Kulturüberstände hatten einen Einfluss auf den Phä notyp in-vitro-differenzierter Makrophagen

Unabhängig von BCS und Trächtigkeitstag wiesen unter dem Einfluss von E.-coli-Überständen gereifte Makrophagen eine geringere CD16, MHC-Klasse-II und CD163-Expressionsstärke auf (Abbildung 4-6 A, B, D). Die Expression des Oberflächenmoleküls CD11b blieb unbeeinflusst (Abbildung 4-6 C). Unterschiede zwischen den E.-coli-Überständen zeigten sich in signifikanter Form nur bei der MHC-Klasse-II-Expression (Abbildung 4-6 B).

Ergebnisse

44

Abbildung 4-6: Expression verschiedener Zelloberfl ächenmoleküle auf in-vitro-differenzierten Makrophagen.

CD14-positive Monozyten wurden an den Tagen -42 und -14 vor der Geburt und den Tagen 7, 21 und 56 nach der Geburt aus dem Blut separiert. Bis zum Tag 4 in vitro wurden Parallelansätze der Zellen unter dem Einfluss von LPS (10 ng/mL) oder den 1:50 verdünnten Überständen von E.-coli-Isolaten aus dem Euter (M1, M3) oder dem Uterus (U3, U5) zu Makrophagen (MdM) gereift. Diese wurden durchflusszytometrisch auf ihre CD16 (A), MHC-Klasse-II (B), CD11b (C) und CD163 (D) -Expression untersucht (MFI). Pro Ansatz: n = 125, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Med LPS M1 M3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

**

**

A) CD16

****

Med LPS M1 M3 U3 U5

6000

8000

10000

12000

****

*

******

***B) MHCII

***

Med LPS M

1M

3 U3 U5200000

250000

300000

350000

400000C) CD11b

Med LP

S M1 M3 U3 U510000

15000

20000

D) CD163

*

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Ergebnisse

45

Nach Gruppierung der Versuchstiere bezüglich Trächtigkeitstag und BCS blieb diese Tendenz einer geringeren CD16-Expression auf E.-coli-SN-gereiften MdM bestehen. Weder bei Tieren mit hohem (BCShigh) noch mit niedrigem BCS (BCSlow) waren diese Effekte signifikant (Abbildung 4-7).

Abbildung 4-7: Expression von CD16 auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere.

Vgl. Abbildung 4-6. Die Daten wurden nach dem Entnahmezeitpunkt relativ zur Geburt des Kalbes gruppiert (A-E). Pro Zeitpunkt wurden die Daten nach dem Body Condition Score (BCShigh, BCSlow) getrennt dargestellt (n ≥ 6). Unterschiede zwischen den Ansätzen, den Tagen sowie zwischen BCShigh und BCSlow-Tieren waren statistisch nicht signifikant.

Mit

tle

re F

luo

resz

en

zin

ten

sitä

t

60000

80000

100000

120000

140000

B) D -14

Med LPS

M1 M3 U3 U5 Med

LP

S M1 M3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

C) D 7

Med LP

S M

1 M

3 U3 U5 Med

LP

S M

1 M

3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

D) D 21

Med LP

S M1 M3 U3 U5

Med LP

S M1 M3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

E) D 56

BCShigh

60000

80000

100000

120000

140000

A) D -42

BCSlow

Ergebnisse

46

Die E.-coli-Überstand-induzierte Reduktion der MHC-Klasse-II-Expression blieb nach Gruppierung der Versuchstiere tendenziell bestehen. Signifikante Unterschiede zwischen den unter dem Überstand U3 differenzierten Makrophagen und den Kontrollen bestanden punktuell an den Tagen -14, 7 und 21. An Tag 7 und Tag 21 war dies gleichermaßen bei BCShigh- und BCSlow-Tieren zu beobachten. An Tag -14 konnte der signifikante Effekt nur bei BCSlow-Kühen festgestellt werden (Abbildung 4-8).

Abbildung 4-8: Expression von MHC-Klasse-II auf in vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpun kt und dem Body Condition Score der Tiere.

Vgl. Abbildung 4-6. Die Daten wurden nach dem Entnahmezeitpunkt relativ zur Geburt des Kalbes gruppiert (A-E). Pro Zeitpunkt wurden die Daten nach dem BCS (BCShigh, BCSlow) getrennt dargestellt (n ≥ 6). Unterschiede zwischen den Ansätzen, den Tagen sowie zwischen BCShigh- und BCSlow-Tieren waren statistisch nicht signifikant.

6000

8000

10000

12000

6000

8000

10000

12000

**

Med

LP

S M

1 M

3 U3 U5 M

ed LP

S M

1 M

3 U3 U5

6000

8000

10000

12000

***

Med LPS

M1 M3 U3 U5 Med

LPS

M1 M3 U3 U5

6000

8000

10000

12000

* **

Med LPS

M1 M3 U3 U5 Med

LPS

M1 M3 U3 U5

6000

8000

10000

12000

A) D -42 B) D -14 C) D 7

D) D 21 E) D 56

BCShigh

BCSlow

Mitt

lere

Flu

ore

sze

nzin

ten

sitä

t

Ergebnisse

47

Die Expression von CD11b auf in-vitro-generierten Makrophagen wurde nicht durch die initiale Anwesenheit von E.-coli-Überständen beeinflusst. Dies galt für alle geprüften Tage vor und nach der Geburt des Kalbes, an denen Monozyten isoliert wurden (Abbildung 4-9). Ein signifikanter Unterschied zwischen BCShigh- und BCSlow- Tieren bestand nicht. Auffällig war die signifikant schwächere CD11b-Expression an Tag 56 in allen geprüften Ansätzen (Abbildung 4-9 E).

Abbildung 4-9: Expression von CD11b auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere.

Vgl. Abbildung 4-6. Die Daten wurden nach dem Entnahmezeitpunkt relativ zur Geburt des Kalbes gruppiert (A-E). Pro Zeitpunkt wurden die Daten nach dem BCS (BCShigh, BCSlow) getrennt dargestellt (n ≥ 6). Unterschiede zwischen den Ansätzen, den Tagen sowie zwischen BCShigh und BCSlow-Tieren waren statistisch nicht signifikant.

200000

300000

400000

200000

300000

400000

Med LP

S M1 M3 U3 U5

Med LP

S M1 M3 U3 U5

200000

300000

400000

Med LP

S M

1 M

3 U3 U5 Med

LPS

M1

M3 U3 U5

200000

300000

400000

Med LP

S M1 M3 U3 U5

Med LP

S M1 M3 U3 U5

200000

300000

400000

A) D -42 B) D -14 C) D 7

D) D 21 E) D 56

BCShigh

BCSlow

Mitt

lere

Flu

ore

sze

nzi

nte

nsitä

t

Ergebnisse

48

Die Tendenz einer reduzierten Expression von CD163 auf Makrophagen, die unter dem Einfluss von E.-coli-Überständen generiert wurden, blieb auch dann bestehen, wenn die Daten nach Trächtigkeitszeitpunkt und BCS gruppiert wurden. Allerdings waren die Unterschiede zur Kontrolle nicht signifikant. Ebenso konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen BCShigh- und BCSlow-Tieren festgestellt werden (Abbildung 4-10).

Abbildung 4-10: Expression von CD163 auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere.

Vgl. Abbildung 4-6. Die Daten wurden nach dem Entnahmezeitpunkt relativ zur Geburt des Kalbes gruppiert (A-E). Pro Zeitpunkt wurden die Daten nach dem BCS (BCShigh, BCSlow) getrennt dargestellt (n ≥ 6). Unterschiede zwischen den Ansätzen, den Tagen sowie zwischen BCShigh- und BCSlow-Tieren waren statistisch nicht signifikant.

10000

15000

20000

10000

15000

20000

Med LPS

M1 M3 U3 U5 Med

LPS

M1 M3 U3 U5 10000

15000

20000

Med

LP

S M

1 M

3 U3 U5 M

ed LPS

M1

M3 U3 U5

10000

15000

20000

Med

LP

S M

1 M

3 U3 U5 M

ed LP

S M

1 M

3 U3 U5 10000

15000

20000

A D -42 B) D -14 C) D 7

D) D 21 E) D 56

BCShigh

BCSlow

Mitt

lere

Flu

ore

sze

nzi

nte

nsi

tät

Ergebnisse

49

4.2.2.2 E.-coli-Kulturüberstände hatten einen Einfluss auf die Fun ktionalität in-vitro-differenzierter Makrophagen

Makrophagen, die unter dem Einfluss von LPS und von E.-coli-Überständen in vitro reiften, zeigten eine signifikante Verstärkung der basalen Produktion reaktiver Sauerstoffmetaboliten (Abbildung 4-11 A). Die ROS-Bildungskapazität der Makrophagen, die unter dem Einfluss der beiden uterinen E.-coli-Isolate gereift wurden, war signifikant verringert (Abbildung 4-11 B).

Abbildung 4-11: Basale und induzierbare ROS-Produk tion von Makrophagen, die unter dem Einfluss von E.-coli-Überständen in-vitro-differenziert wurden.

CD14-positive Monozyten wurden in vitro zu Makrophagen gereift (vgl. Abbildung 4-7). Bis zum Tag 4 wurden Parallelansätze der Zellen unter dem Einfluss von LPS (10 ng/mL) oder den 1:50 verdünnten Überständen von E.-coli-Isolaten aus dem Euter (M1, M3) oder dem Uterus (U3, U5) zu Makrophagen (MdM) gereift. Makrophagen wurden mit hitzegetöteten S. aureus stimuliert (B) oder blieben unstimuliert (A). Nach Inkubation mit dem Fluorochrom DHR123 wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen durchflusszytometrisch ermittelt. (A). Um die individuelle ROS-Bildungskapazität zu normieren wurde in (C) der Induction Fold (MFI des mit Bakterien stimulierten Ansatzes/ MFI des unstimulierten Ansatzes) bestimmt (n = 125, *p < 0,05, **p < 0,01, **p < 0,001, ***p < 0,0001).

Med LPS M1 M3 U3 U5100000

200000

300000

400000

Dur

chsc

hnitt

liche

Flu

ore

szen

zint

ensi

tät

B)


200000

300000

400000

***

******

Dur

chsc

hnitt

liche

Flu

ore

sze

nzin

tens

ität

A)

*

***

Indu

ctio

n F

old

Med LPS M1 M3 U3 U5

1.5

2.0

2.5

3.0

*

*

***

C)

Ergebnisse

50

4.3 Einflüsse auf das Genexpressionsmuster in-vitro-differenzierter

Makrophagen

4.3.1 Reifung unter E.-coli-Kulturüberständen führte zu einer verstärkten

Genexpession

Unter E.-coli-Kulturüberständen gereifte Makrophagen wiesen eine signifikant stärkere Expression der Gene CXCL1, CXCL8 und NOS2 und tendenziell stärkere Expression des Gens IL10 auf.

Ergebnisse

51

Abbildung 4-12: Relative Genexpression in-vitro-differenzierter, unter LPS sowie unter dem Überstand eines Uterus- E.coli-Isolates gereifter Makrophagen.

CD14-positive Monozyten wurden an den Tagen -42 und -14 vor der Geburt und den Tagen 7, 21 und 56 nach der Geburt aus dem Blut separiert. Bis zum 4. Reifungstag in vitro wurden Parallelansätze der Zellen unter dem Einfluss von LPS (10 ng/mL) oder dem 1:50 verdünnten Überstand eines E.-coli-Isolates aus dem Uterus (U3) zu Makrophagen (MdM) gereift. Mittels qPCR wurde die Expression von IL10 (1), IL1B (2) CXCL1 (3) CXCL8 (4) und NOS2 (5) erfasst und im Verhältnis zum Referenzgen UXT (6) dargestellt. Pro Ansatz: n ≥ 12; Mittelwert ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Kop

ien

Med LPS U3

0

200000

400000

600000

8000006) UXT

Kop

ien

CX

CL

8/ U

XT

Med LPS U3

0.0

0.1

0.2

0.3

0.44) CXCL8

*

Kop

ien

IL1B

/ UX

T

Med LPS U3

0.00

0.05

0.10

0.15

0.202) IL1B

Kop

ien

IL10

/ U

XT

Med LPS U3

0.00

0.05

0.10

0.15

0.201) IL10

Kop

ien

NO

S2/

UX

T

Med LPS U3

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.05) NOS2

*

Kop

ien

CX

CL

1/ U

XT

Med LPS U3

0.0

0.5

1.0

1.53) CXCL1

*****

Ergebnisse

52

4.3.2 Reifung unter CCL5 führte zu einer vermindert en Genexpression

Unter dem Einfluss von CCL5 gereifte Tag-4-Makrophagen zeigten eine signifikant geringere Basisexpression der Gene IL1B und NOS2. Auch CXCL1 und CXCL8 wurden tendenziell weniger stark exprimiert, während die Expression von IL10 gleich blieb.

Abbildung 4-13: Relative Genexpression in-vitro-differenzierter, CCL5-gereifter Tag-4-Makrophagen.

Monozyten von nicht tragenden, gesunden Tieren wurden unter dem Einfluss von 100 ng/mL CCL5 zu Tag-4-Makrophagen gereift. Anschließend wurde mittels qPCR die Expression der Gene IL10 (1), IL1B (2) CXCL1 (3) CXCL8 (4) und NOS2 (5) erfasst und im Verhältnis zum Referenzgen UXT (6) dargestellt. N = 4, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05

Kop

ien

IL10

/ U

XT

MedCCL5

0.00

0.02

0.04

0.06

1) IL10

Kop

ien

IL1B

/ U

XT

Med

CCL50.00

0.05

0.10

0.15

*

2) IL1B

Kop

ien

CX

CL

1/ U

XT

MedCCL5

0.0

0.5

1.0

1.53) CXCL1

Kop

ien

CX

CL

8/ U

XT

MedCCL5

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.254) CXCL8

Kop

ien

NO

S2/

UX

T

MedCCL5

0.0

0.2

0.4

0.6

*5) NOS2

Kop

ien

MedCCL5

0

20000

40000

60000

80000

1000006) UXT

Ergebnisse

53

4.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der Transitperiode

Um zu überprüfen, ob Blutentnahmezeitpunkt, BCS oder Laktationszahl der Tiere einen Einfluss auf den Phänotyp oder die funktionellen Eigenschaften boviner MdM hatten, wurden die erhobenen Daten nach diesen Eigenschaften gruppiert.

4.4.1 Phänotypische Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen

Die CD11b-Expression boviner Makrophagen war nach d er Geburt signifikant reduziert

Die Expression von MHC-Klasse-II, CD16 und CD163 auf in-vitro-differenzierten Makrophagen änderte sich um die Geburt des Kalbes herum nicht signifikant. Die Expression von CD11b war an Tag 56 post partum signifikant schwächer als an den anderen geprüften Tagen (Abbildung 4-14).

Abbildung 4-14: Relative Expressionsstärke von Zel loberflächenmolekülen auf Tag-4-MdM in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt der Monozyten in der Transitperiode.

CD14-positive Monozyten wurden an den Tagen -42 und -14 vor der Geburt und den Tagen 7, 21 und 56 nach der Geburt aus dem Blut separiert und in vitro 4 Tage zu Makrophagen gereift. Die Expression von CD16 (A), MHC-Klasse-II (B), CD11b (C) und CD163 (D) wurde durchflusszytometrisch erfasst (n = 125, Mittlere Fluoreszenzintensität ± SEM, **p < 0,01, ***p < 0,001).

D 42

D 14 D 7

D 21 D 56

80000

100000

120000

140000A) CD16

D 42

D 14 D 7

D 21 D 56

6000

8000

10000

12000B) MHCII

D 42

D 14 D 7

D 21 D 5

6150000

200000

250000

300000

350000

400000C) CD11b

**

***

******

D 42

D 14 D 7

D 21 D 5

610000

15000

20000

25000D) CD163

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Ergebnisse

54

Die Laktationszahl hatte keinen Einfluss auf den Ph änotyp in-vitro-differenzierter Makrophagen

Die CD16-, MHC-Klasse-II- und die CD163-Expression auf in-vitro-differenzierten Makrophagen unterschied sich zu keinem Zeitpunkt vor oder nach der Geburt des Kalbes zwischen erstlaktierenden und mehrfach laktierenden Kühen (Abbildung 4-15, ABD). Zellen von Tieren in der ersten Laktation wiesen an Tag -42 und an Tag 7 tendenziell eine höhere CD16-Fluoreszenzintensität auf als Zellen von zwei- und mehrfachlaktierenden Kühen (Abbildung 4-15, A). Beide Gruppen wiesen eine signifikant geringere CD11b-Expressionsstärke an Tag 56 (verglichen mit Tag -42, Tag -14, und Tag -7) auf. Der Unterschied zwischen Tag 21 und Tag 56 erwies sich nur für Tiere mit ≥ 2 Laktationen als signifikant (Abbildung 4-15, C).

Abbildung 4-15 Relative Expressionsstärke von Zell oberflächenmolekülen auf MdM in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt und der Anzah l der Laktationen der Spenderkühe.

Vgl. Abbildung 4-14. Die Spendertiere wurden zusätzlich nach Anzahl der Laktationen in zwei Gruppen geteilt. Unterschiede zwischen den Laktationszahlen waren statistisch nicht signifikant (n > 9, Mittlere Fluoreszenzintensität ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, **p < 0,001, ***p < 0,0001).

Unter E.-coli-Überständen gereifte MdM von Tieren mit postpartal en Infektionserkrankungen zeigten einen stärkeren Rück gang der CD16- und MHC-Klasse-II-Expression als Zellen gesunder Tiere.

1.Laktation2.-5.Laktation

Mit

tle

re F

luo

resz

en

zin

ten

sitä

t

60000

80000

100000

120000

140000

A) CD16

6000

8000

10000

12000B) MHCII

10000

15000

20000

25000D) CD163

100000

200000

300000

400000 ****

**

**

C) CD11b

Ergebnisse

55

Der bei E.-coli-SN-gereiften Makrophagen gemessene Rückgang der Expression der Oberflächenantigene CD16 und MHC-Klasse-II war bei Tieren mit postpartalen Infektionserkrankungen stärker ausgeprägt als bei klinisch gesunden Tieren.

Abbildung 4-16: Relative Expressionsstärke von Zel loberflächenmolekülen auf stimulierten MdM in Abhängigkeit vom Gesundheitssta tus der Spendertiere.

Vgl. Abbildung 4-6: Die Daten wurden zusätzlich nach dem Gesundheitsstatus der Spendertiere gegliedert, wobei Tiere mit postpartalen Infektionserkrankungen als ‚klinisch erkrankt‘ eingestuft wurden. Pro Ansatz: n > 3, Mittelwert ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p <0,001.

Med LP

S M1

M3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

A) CD16

Med LPS M1 M3 U3 U5

60000

80000

100000

120000

140000

**

*

****

***


6000

7000

8000

9000

10000 **

B) MHCII

Med LPS M1

M3 U3 U5

5000

6000

7000

8000

9000

10000**

****

***

***


250000

300000

350000

400000C) CD11b

Med LPS M1 M3 U3 U5

200000

250000

300000

350000

400000

Med LPS M

1M

3 U3 U512000

14000

16000

18000

20000D) CD163

Med LP

S M1

M3 U3 U5

12000

14000

16000

18000

20000

klinisch gesund klinisch erkranktM

ittle

re F

luor

esze

nzin

tens

ität

Ergebnisse

56

4.4.2 Funktionelle Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen

Der Zeitpunkt der Blutentnahme und die Körperkondit ion der Spendertiere beeinflussten die funktionellen Eigenschaften bovin er Makrophagen

Die basale ROS-Bildung der BCSlow-Tiere stieg an Tag -14 signifikant gegenüber Tag -42 an, um danach kontinuierlich bis Tag 56 wieder abzufallen (Abbildung 4-17, A). Diese Unterschiede zwischen den Tagen waren bei den BCShigh-Tieren nicht zu beobachten. Die stimulierte ROS-Bildung in Zellen von BCShigh-Tieren war am stärksten am Tag -14. An den Tagen 21 und 56 post partum war sie signifikant schwächer. Die gleiche Tendenz (mit stärksten Werten an Tag -42) konnte bei Zellen von BCSlow-Tieren beobachtet werden (Abbildung 4-17, B). Der aus den Werten für die induzierte und die Basis-ROS-Bildung errechnete Induction Fold zeigte die stärkste Induzierbarkeit an Tag -14 für Makrophagen von BCShigh-Tieren und Tag -42 für BCSlow-Tiere (Abbildung 4-17, C).

Ergebnisse

57

Abbildung 4-17: Induzierbare ROS-Bildungskapazität von Makrophagen, die an verschiedenen Tagen der Transitperiode von Tieren m it hohem und niedrigem Body Condition Score in vitro generiert wurden.

CD14-positive Monozyten wurden an den angegebenen Tagen relativ zur Geburt des Kalbes aus dem Blut von Kühen mit hohem (BCShigh) oder niedrigem (BCSlow) isoliert und in vitro 4 Tage zu Makrophagen gereift (vgl. Abbildung 4-6). Die Makrophagen wurden mit hitzegetöteten S. aureus stimuliert (B) oder blieben unstimuliert (A). Nach Inkubation mit dem Fluorochrom DHR123 wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen durchflusszytometrisch ermittelt (A, B). Um die individuelle ROS-Bildungskapazität zu normieren, wurde in (C) der Induction Fold (MFI des mit Bakterien stimulierten Ansatzes/ MFI des unstimulierten Ansatzes) bestimmt. (n ≥ 5, *p < 0,05, **p < 0,01, **p < 0,001, ***p < 0,0001).

0

200000

400000

600000

0

200000

400000

600000

* ***

0

200000

400000

600000**

***

0

200000

400000

600000

****

****

D -42

D -14

D 7

D 21

D 56

1

2

3

4

5

**

D -42

D -14

D 7

D 21

D 56

1

2

3

4

5

***

****

**

BCShigh BCS low

A) unstimuliert

B) stimuliert

C) Induction Fold

Mitt

lere

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t

Indu

ctio

n F

old

Ergebnisse

58

Die funktionellen Eigenschaften der Makrophagen wur den nicht von der Laktationszahl beeinflusst

Tendenziell wiesen die Zellen mehrfachlaktierender Kühe zu jedem Zeitpunkt eine stärkere ROS-Bildungskapazität auf als die Zellen erstlaktierender Tiere. Die Unterschiede waren nicht signifikant.

Abbildung 4-18: ROS-Bildungskapazität von Makropha gen erstlaktierender und mehrfachlaktierender Kühe im Vergleich.

Die in Abbildung 4-17 (C) dargestellten Daten wurden zusätzlich differenziert nach Laktationszahlen der Spendertiere (n ≥5, p > 0,05).

Indu

ctio

n Fo

ld

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

1. Laktation2.-5. Laktation

Diskussion

59

5 Diskussion

5.1 Induktion eines Kalziumeinstroms in Monozyten d urch Bakterien- und

Zellkulturüberstände

Wandern Monozyten ins entzündete Gewebe ein, werden sie vom Sekretom der lokalen Gewebezellen und anderen Entzündungszellen sowie von den eingedrungenen Pathogenen selbst beeinflusst. Um diese Situation in vitro nachzubilden, wurde die unmittelbare Aktivierung von Monozyten durch Überstände uteriner Zellkulturen und E.-coli-Kulturen gemessen. Hierzu wurde die von FRANK (2012) etablierte Methode der intrazellulären Kalziummessung angewandt, in der das hier zur Kontrolle verwendete Chemokin CCL5 einen signifikanten Kalziumeinstrom in bovinen Monozyten auslöste (FRANK 2012). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Überstände von uterinen Stroma- und Epithelzellen ebenfalls einen signifikanten Ca2+-Einstrom in Monozyten induzierten.

Welche Substanzen in den Zellüberständen für den Kalziumeinstrom verantwortlich sind, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Die verstärkte Wirkung von LPS-stimulierten Stromazellen lässt jedoch vermuten, dass entzündungsvermittelte Mediatoren an der Monozytenaktivierung beteiligt sind. LPS, welches noch in den untersuchten Überständen enthalten war, war jedenfalls nicht das auslösende Agens, da Parallelstimulationen der Zellen mit reinem LPS nicht zu einem Ca2+-Einstrom führten. Eine mögliche Aktivierung könnte über TLR4-Rezeptoren auf uterinen Zellen erfolgen, die durch endogene TLR4-Liganden aktiviert werden. Für den Menschen und in Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass die Proteine S100A8/9 endogene TLR4-Liganden darstellen und wesentlich an inflammatorischen Entzündungsreaktionen beteiligt sind (VOGL et al. 2007). Dies konnte jedoch für das Rind nicht bestätigt werden. Eine Stimulation von bovinen Monozyten mit S100A8/A9 führte beim Rind im Gegensatz zu Mensch und Maus zu keiner gesteigerten Sekretion inflammatorischer Zytokine (KOY et al. 2013).

Wahrscheinlicher, aber in dieser Arbeit nicht geprüft, ist die Sekretion von Chemokinen von LPS-stimulierten Zellen. Ähnlich wie das hier verwendete CCL5 binden die freigesetzten Chemokine an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf der Oberfläche von Monozyten und induzieren dadurch einem Kalziumeinstrom. Dass sowohl Milchdrüsenepithelzellen als auch Epithelzellen des Endometriums in der Lage sind Chemokine zu sezernieren, ist in der Literatur mehrfach beschrieben. Jedoch lag der Fokus dieser Arbeiten vorwiegend auf dem Chemokin CXCL8. So steigerten sowohl eine E.-coli-Stimulation als auch eine LPS-Zugabe die IL6- und CXCL8-Produktion boviner uteriner Epithel- und Stromazellen (LAHOUASSA et al. 2007; CRONIN et al. 2011) und die Expression von CCL5, IL1β, CXCL8 und TNF war bei Tieren mit klinischer und subklinischer Endometritis erhöht (FISCHER et al.

Diskussion

60

2010). Eine LTA-Infusion führte zu vermehrter Sekretion der Chemokine CXCL1, CXCL2, CXCL3 und CXCL8 in die Milchdrüse (RAINARD et al. 2008; BOUGARN et al. 2010).

REDELFS (2011) führte Messungen des Kalziumeinstroms in neutrophile Granulozyten nach Zugabe von Überständen verschiedener Uterus- und Milchdrüsenzellen durch. Die Wirkung dieser Überstände auf Neutrophile konnte durch Antikörper gegen CXCL8 nicht inhibiert, durch den CXCR2-Antagonisten SB225002 jedoch vollständig aufgehoben werden (REDELFS 2011). Da CXCR2 auch von Monozyten exprimiert wird (HUSSEN et al. 2014), ist es wahrscheinlich, dass im Überstand befindliche CXCR2-Liganden wie CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL7 und CXCL8 auch für den Kalziumeinstrom in Monozyten verantwortlich sind.

In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass bovine Epithel- und Stromazellen sowohl unstimuliert als auch nach Stimulation mit LPS Faktoren sezernieren, welche immigrierende Monozyten aktivieren können. Anders als bei Stromazellen führte eine LPS-Stimulation von Epithelzellen nicht zur Sekretion von Mediatoren, die den Kalziumeinstrom in Monozyten induzierten.

Nachfolgend wurden Überstände von E.-coli-Stämmen untersucht, die aus gesunden Tieren sowie aus Kühen mit Mastitis oder Metritis/Endometritis isoliert wurden. Es zeigte sich, dass alle Überstände einen Kalziumeinstrom auslösten, der zwischen 25 % und 40 % des von Ionomycin induzierten Wertes lag. Ein Zusammenhang zwischen dem Erkrankungsgrad der Tiere, aus deren Euter oder Uterus die E. coli isoliert wurden und der Stärke der Monozytenaktivierung stellte sich nicht dar. Damit scheint es nicht so zu sein, dass Euter- oder Uterus-angepasste E.-coli-Stämme zu einer differentiellen Aktivierung von bovinen Monozyten führen. Für eine statistisch aussagekräftige Erhebung war in dieser Arbeit jedoch der Stichprobenumfang zu gering. Zudem lagen nicht ausreichend Informationen über die Spendertiere vor.

Zusätzlich wurden E.-coli-Isolate verschiedener Herkunft mit dieser Methode untersucht. Hierbei konnte zwischen starken (15 – 20 % von Ionomycin) und schwachen (0 - 5 % von Ionomycin) Ca2+-Influx auslösenden Stämmen unterschieden werden. Zu den starken Stämmen gehörten humane enterische Stämme der Phylogruppe A sowie der Mastitis-Vakzinestamm J5, dessen Phylogruppe unbekannt war. Auffallend war hier die Zugehörigkeit von drei der vier starken Stämme zur Phylogruppe A. Zu den schwachen Monozyten-aktivierenden Stämmen gehörten verschiedene humane und tierische enterische sowie extraintestinale Stämme der Phylogruppen E, B und D, der probiotische Stamm Nissle 1917 sowie ein Mastitiserreger mit Phylogruppe A.

Diskussion

61

Anhand ihres Genoms lassen sich E. coli den Phylogruppen A, B1, B2 und D zuordnen, nach ESCOBAR-PARAMO (2004) auch noch den Gruppen C und E. Die Gruppen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer phänotypischen Eigenschaften, Antibiotikaresistenzen, ökologischen Nischen und anderer Faktoren. So ist beschrieben, dass Stämme der Gruppen B2 und D selten aus der Umwelt isoliert werden und häufig unter den extraintestinalen E. coli zu finden sind (GORDON et al. 2008). Stämme der Phylogruppe A und B1 hingegen sind besonders häufig in den Uteri von an Metritis erkrankten Kühen in den ersten beiden Wochen post partum vorhanden.

Trotzdem ließ sich bislang kein deutlicher Zusammenhang zwischen E.-coli-Phylogruppe und Pathogenität finden. Vielmehr dient die Phylogruppierung der genetischen familiären Zuordnung der Erreger und berücksichtigt so genannte „Housekeeping-Gene“, die nur sehr langsam fortschreitenden Veränderungen unterliegen. Für die Virulenz von E. coli sind hingegen vor allem Virulenzfaktoren verantwortlich, die als „flexibler Genpool“ durch horizontalen Gentransfer zwischen den Bakterien verbreitet werden können (GORDON et al. 2008). So konnte BICALHO (2010) einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein der Virulenzfaktoren fimH, astA, cdt, kpsMII, ibeA und hlyA und einer Erkrankung an Metritis und Endometritis bei Kühen erkennen. Über die Virulenzfaktoren in den für diese Arbeit verwendeten E.-coli-Kulturüberständen lagen keine Informationen vor.

Über die Ursache der monozytenaktivierenden Wirkung von E.-coli-Kulturüberständen ist darüber hinaus nicht viel bekannt. Jedoch sind Virulenzfaktoren wie Hämolysine in der Lage, einen Kalziumeinstrom in Zellen zu induzieren. So zeigten KOSCHINSKI et al (2006) mithilfe elektrophysiologischer Messungen, dass das E.-coli-Hämolysin α (hlyA) eine oszillierende Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in Epithelzellen humaner Nierentubuli bewirkt. Der Einstrom erfolgt nicht durch Kalziumkanäle sondern durch vom Hämolysin gebildete Poren in der Zellmembran (KOSCHINSKI 2006).

Eine Ca2+-Influx auslösende Wirkung des hitzestabilen E.-coli-Enterotoxin B (STB) auf Nierenzellen und intestinalen Epithelzellen von Hunden sowie Hypophysenzellen von Ratten untersuchten DREYFUS et al. (1993). STB induzierte in allen Zelltypen einen Ca2+-Einstrom, der nur von Somatostatin und dem Toxin von Bordetella pertussis (B. pertussis) verhindert werden konnte; beides Substanzen, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren blockieren. Mithilfe spektrofluorometrischer Messungen konnte außerdem gezeigt werden, dass das in der Membran verschiedener E.-coli-Bakterien vorkommende Peptid FMLP einen Ca2+-Einstrom in humane neutrophile Granulozyten induziert (VAINER et al. 2003). FMLP-Rezeptoren sind G-Protein- gekoppelt und sind sowohl auf Granulozyten als auch auf Makrophagen lokalisiert

Diskussion

62

(EGGER 2005). Im Vergleich zu menschlichen Zellen ließen sich Granulozyten des Rindes jedoch nicht mit FMLP stimulieren (BROWN u. ROTH 1991).

Bei der Einwanderung ins Gewebe treffen Monozyten auf ein komplexes Sekretom, welches Produkte von Körperzellen und von E.-coli-Bakterien enthält. Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in der Lage sind Monozyten zu aktivieren. Folglich stellte sich die Frage, wie die Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen von diesen Faktoren beeinflusst wird.

5.2 Einfluss von Bakterien- und Zellkulturüberständ en auf die

In-vitro-Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen

Um den Einfluss des Zell- und Bakteriensekretoms auf die Differenzierung zu Makrophagen zu beobachten, wurden Monozyten für vier Tage unter Stromazell- und Bakterienkulturüberständen in-vitro-differenziert. Dabei wurde die Expression der Oberflächenmoleküle MHC-Klasse-II, CD163, CD16 und CD11b weder von Überständen unstimulierter noch von stimulierten Stromazellen beeinflusst. Demgegenüber wiesen unter dem Einfluss von E.-coli-Überständen gereifte Makrophagen eine signifikant verringerte Expression der Oberflächenmoleküle CD16, MHC-Klasse-II und CD163 auf. Die Expression des Oberflächenmoleküls CD11b blieb von den Überständen unbeeinflusst. Es lag jedoch eine signifikant verminderte CD11b-Expression auf den an Tag 56 nach der Geburt gewonnenen MdM vor. Die Oberflächenmoleküle MHC-Klasse-II, CD16 und CD163 wurden hingegen weder vom relativ zur Geburt gelegenen Blutentnahmezeitpunkt noch vom BCS der Tiere beeinflusst (4.4). Ausschließlich unter LPS-Einfluss gereifte Makrophagen wiesen eine signifikant geringere Expression von MHC-Klasse-II und eine tendenziell geringere Expression von CD163 auf als unstimulierte Kontrollen.

Unterschiedliche Potenzen der verschiedenen E.-coli-Überstände zeigten sich in signifikanter Form nur in der MHC-Klasse-II-Expression. Unter dem Überstand eines aus dem Uterus eines klinisch an Endometritis erkrankten Tieres isolierten E. coli (U3) gereifte Makrophagen wiesen eine signifikant schwächere Expression von MHC-Klasse-II auf als unter anderen E.-coli-Überständen gereifte Zellen. Ein Zusammenhang mit der Fähigkeit der initialen Monozytenaktivierung schien nicht zu bestehen, da dieser Überstand zu den schwächeren Ca2+-Influx auslösenden Stimuli gehörte. Auch bei den anderen Überständen war kein Zusammenhang zwischen der Reduktion der MHC-II-Expressionsstärke und der Fähigkeit, einen Kalziumeinstrom auszulösen, gegeben.

Eine erhöhte MHC-Klasse-II-Expression steht für eine Aktivierung der Zelle. Sie wird, zusammen mit CD11c, mit der Reifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen in Zusammenhang gebracht und in einem inflammatorischen Milieu beobachtet (KAMPHORST et al. 2010). Nach induzierter Peritonitis in Mäusen wurde

Diskussion

63

beispielsweise eine vermehrte MHC-Klasse-II-Expression auf Peritoneal-makrophagen festgestellt, was als eine mögliche Differenzierung in Richtung Dendritischer Zellen interpretiert wurde (COOK et al. 2003).

Eine Stimulation mit LPS führte auf Makrophagen jedoch zu einer verminderten Expression des Oberflächenmoleküls MHC-Klasse-II. So beobachteten WERLING et al. (1997) einen Rückgang der Anzahl MHC-Klasse-II-positiver boviner Tag-6-Makrophagen nach deren 24-stündiger Stimulation mit LPS. Auch BRYANT u. PLOEGH (2004) beschreiben eine reduzierte MHC-Klasse-II-Expression auf LPS-stimulierten Makrophagen und erklären diesen Vorgang als eine mögliche Schutzfunktion der Zellen vor intrazellulären Erregern. Ob die in dieser Arbeit beobachtete reduzierte Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf unter E.-coli-Überständen gereiften Makrophagen von dem LPS-Gehalt im Überstand abhing oder ob weitere Substanzen im Sekretom dafür verantwortlich waren, konnte nicht abschließend geklärt werden. Dass Überstände von LPS-stimulierten Stromazellen keine signifikanten Veränderungen der MHC-Klasse-II-Expression hervorriefen, könnte an einer nur geringen LPS-Konzentration in diesen Überständen liegen. Denkbar wäre auch, dass Stromazellen Substanzen sezernieren, die gegensätzlich zu LPS die MHC-Klasse-II-Expression steigern. Hierfür kämen vor allem inflammatorische Zytokine wie IFNγ und IL12 in Frage (FIGUEIREDO et al. 1989; FENG et al. 2007).

Unter Beachtung des Zeitpunktes der Blutentnahme zeigte sich, dass die durch E.-coli-Überstände induzierte verminderte Expression von MHC-Klasse-II an den Tagen -14, 7 und 21 relativ zur Geburt am stärksten war. Scheinbar reagierten die Zellen in dieser Zeit besonders empfindlich auf die Stimulation, denn nicht stimulierte Zellen unterschieden sich an diesen Tagen nicht in ihrer MHC-Klasse-II-Expression. Eine Infusion von E.coli ins Euter von Kühen im peripartalen Zeitraum zeigte, dass das Immunsystem vor der Trächtigkeit eher in Richtung einer anti-inflammatorischen, nach der Geburt eher mit einer inflammatorischen Antwort reagierte (BURVENICH et al. 2007). Die in dieser Arbeit gemessene verstärkte Reaktivität der rund um den Geburtszeitpunkt entnommenen Zellen stimmt daher nur teilweise mit den von BURVENICH et al. (2007) beschriebenen Beobachtungen überein. Ob es sich bei der von den E.-coli-Überständen induzierten verminderten MHC-Klasse-II-Expression um eine anti-inflammatorische Reaktion handelt, ist ungewiss.

Die in dieser Arbeit beschriebene Minderung der CD163-Expression nach LPS-Stimulation deckt sich mit bereits publizierten Ergebnissen. So zeigten humane Makrophagen nach 24-stündiger Inkubation mit LPS in Konzentrationen von 1 ng/mL bis 1 µg/mL einen signifikanten Rückgang des CD163-Rezeptors auf ihrer Oberfläche (BUECHLER et al. 2000). SULAHIAN (2004) beobachtete eine zeitabhängige Expression von CD163 auf humanen Makrophagen. Eine kurze

Diskussion

64

LPS-Stimulation unter drei Stunden führte zu einer reduzierten, eine lange LPS-Stimulation zu einer gesteigerten CD163-Expression.

Da CD163-positive Makrophagen überwiegend in der späten entzündlichen Phase, in chronisch erkranktem Gewebe und in Wundheilungsgeweben vorgefunden werden, werden ihnen anti-inflammatorische und zellregenerative Eigenschaften zugeschrieben. Frisch ins infizierte Gewebe eingewanderte Makrophagen sind hingegen überwiegend CD163-negativ (FABRIEK et al. 2008). Ausgehend vom Modell der Makrophagenplastizität steht diese geringe CD163-Expression mit einer klassischen Aktivierung von Makrophagen mit einer vermehrten Sekretion inflammatorischer Chemokine und Zytokine wie CCL5, IL1β, TNFα, IL12 und NOS2 in Zusammenhang (GORDON 2003; DÜVEL et al. 2012). Zur eindeutigen Klassifizierung von Makrophagen müssen jedoch weitere Zellmoleküle wie Calprotectin oder CD68 sowie Sekretionsmuster oder Genexpression dieser Zellen berücksichtigt werden.

Über den direkten Einfluss von E.-coli-Überständen auf die CD163-Oberflächen-expression liegen bislang keine Veröffentlichungen vor. Es wird jedoch von einem unkontrollierten Einstrom von M1-Makrophagen bei akuten E.-coli-Infektionen berichtet (SICA u. MANTOVANI 2012). Dass E.-coli-Überstände in der Lage sind, die CD163-Oberflächenexpression in vitro signifikant zu reduzieren, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. Fraglich bleibt, ob das im Überstand vorhandene LPS oder weitere Faktoren dafür verantwortlich waren. Stromazellüberstände hatten keinen Einfluss auf die CD163-Expression. Dies lässt vermuten, dass in den Überständen kein Übergewicht an Mediatoren vorhanden war, welche die Makrophagen in eine bestimmte Richtung differenzieren ließen.

Das Molekül CD11b wird von vielen Zellen des angeborenen Immunsytems exprimiert und ist an der Steuerung der Zelladhäsion und dem Zellwachstum beteiligt. Werden Makrophagen durch Neutrophile aktiviert, führt dies zu einer gesteigerten CD11b/CD18-Expression und verstärkten Adhärenz der Zellen am Gefäßendothel. Auch LPS und E. coli sowie IL1β, IFNγ und TNFα spielen eine Rolle bei der Induktion von CD11b auf Neutrophilen. Krankheiten wie Sepsis, Verbrennungen, Lupus erythematosis und Diabetes führen beim Menschen zu einer erhöhten CD11b-Expression auf Leukozyten (MAZZONE u. RICEVUTI 1995).

Über das Verhalten von CD11b auf bovinen Makrophagen liegen nur wenige Studien vor. Eine Infusion von S. aureus ins bovine Euter führte zu einem initialen Anstieg des CD11b-Rezeptors auf Phagozyten im peripheren Blut (RIVAS et al. 2001). Eine In-vitro-Infektion von Makrophagen mit dem Bovinen Leukämievirus hatte hingegen keinen Einfluss auf die CD11b-Expression (ALTREUTHER et al. 2001). Demgegenüber beschreibt WERLING et al. (1998) eine reduzierte Anzahl

Diskussion

65

CD11b-positiver, boviner Makrophagen nach 24-stündiger LPS-Stimulation in vitro. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen blieb hingegen gleich. Dies entspricht den Ergebnissen in dieser Arbeit. Eine Stimulation mit LPS, Bakterien- oder Zellkulturüberständen bewirkte keine Veränderung der CD11b-Expressionsdichte auf Makrophagen.

Der Rezeptor CD16 befindet sich auf der Oberfläche verschiedener Leukozyten, darunter Monozyten und Makrophagen. CD16-Liganden stellen Fc-Regionen von IgG-Antikörpern dar. Auf Monozyten wird CD16 zusammen mit CD14 zur Klassifizierung monozytärer Subpopulationen verwendet, wobei der Phänotyp CD14high/CD16low den größten Anteil der zirkulierenden Blutmonozyten ausmacht. Da er die stärkste Phagozytosekapazität aufweist, wird er zusammen mit dem CD14high/CD16high-Phänotyp, der nach LPS-Stimulation die größte Menge TNFα, IL1β, CXCL1 und CXCL8 produziert, als inflammatorischer Phänotyp bezeichnet (HUSSEN et al. 2013). In dieser Arbeit wurde die CD16-Oberflächenexpression weder von einer Reifung unter Stromazellüberständen, noch von LPS signifikant beeinflusst. Unter E.-coli-Überständen gereifte Makrophagen wiesen hingegen eine signifikant verminderte CD16-Expression auf. Dies könnte ein Hinweis auf eine inflammatorische Reaktion der Zellen auf den Stimulus sein.

Phagozyten wie Neutrophile und Makrophagen produzieren reaktive Sauerstoffspezies durch Aktivierung der in der Plasmamembran lokalisierten NADPH-Oxidase. Dieser bislang auch als „respiratory burst“ beschriebene Vorgang geschieht bei der Phagozytose oder Aktivierung der Phagozyten durch verschiedene Stimuli. Heute ist bekannt, dass auch viele andere Zelltypen zur Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies befähigt sind und diese Teil der physiologischen Signalübertragung sind (FORMAN u. TORRES 2002). Welche Stimuli zu einer Aktivierung der NADPH-Oxidase führen, ist überwiegend an humanen und murinen Neutrophilen erforscht. Beispielsweise sind bakterielle Strukturen, Komplementfaktor C5a, f-MLP, LTB4 und IL8 sowie Liganden von FcRs und CRs in der Lage eine ROS-Bildung direkt zu induzieren. Binden andere Substanzen wie LPS, TNFα, IL1β, GMCSF, GCSF und Immunkomplexe an Neutrophile, führt dies zu einem Priming der Zellen. Priming bedeutet, dass diese nicht direkt mit einer ROS-Bildung antworten, beim anschließenden Kontakt mit einem Stimulus aber um so stärker reagieren (SAYEED 2000).

Der Effekt von uterinen Stromazellüberständen und Explants auf Neutrophile wurde von REDELFS (2011) untersucht, wobei die Überstände weder eine direkte noch eine primende Wirkung auf neutrophile Granulozyten hatten. Auch eine 30-minütige Stimulation mit LPS zeigte bei REDELFS (2011) keine initiale oder primende Veränderung. Als Ursache hierfür nannte sie die Möglichkeit, dass S. aureus, der zweite verwendete Stimulus, die Zelle über andere Signalwege stimulierte als LPS

Diskussion

66

und somit nicht von einem Priming profitierte. In dieser Arbeit wurden die Zellen nicht kurzfristig stimuliert, sondern unter den Überständen und LPS zu Makrophagen gereift. Unter Stromazellüberständen gereifte Makrophagen zeigten keine veränderte ROS-Bildung im Vergleich zu Mediumkontrollen. Demgegenüber wiesen die unter LPS, genau wie die unter E.-coli-Überständen gereiften Makrophagen eine signifikant höhere Konzentration an reaktiven Sauerstoffmetaboliten auf. Die Zellen scheinen grundsätzlich einen stärkeren Aktivierungszustand zu besitzen als die Kontroll-gruppen. Nach Zugabe von Bakterien stieg der ROS-Anteil zwar bei allen Zellen an, ein Unterschied zwischen unstimulierten und unter Stimuli gereiften Zellen war jedoch nicht vorhanden. Daraus folgt, dass die Aktivierbarkeit dieser Zellen nach Kontakt mit S. aureus hingegen nicht erhöht sondern wie am Induction Fold erkennbar eher vermindert war.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Reifung unter LPS und besonders unter E.-coli-Überständen den Phänotyp boviner Makrophagen veränderte. Die Veränderungen ließen keine eindeutige Klassifizierung der Makrophagen hinsichtlich M1- oder M2-Makrophagen zu oder gaben Hinweise auf deren Aktivierungszustand. Unter E.-coli-Überständen und unter LPS gereifte Makrophagen wiesen eine erhöhte Konzentration reaktiver Sauerstoffmetaboliten auf, ein Hinweis auf eine Aktivierung der Zellen. Zur weiteren Analyse wurde im Folgenden die mRNA-Expression ausgewählter Gene gemessen.

5.3 Einflüsse von CCL5 und E.-coli-Überständen auf die Genexpression

in-vitro-differenzierter Makrophagen

Dem Ziel folgend, den Einfluss lokaler Faktoren auf die Differenzierung eingewanderter Monozyten näher zu analysieren, wurde der Genexpressions-phänotyp der unter LPS und E.-coli-Überständen gereiften Makrophagen untersucht. Gemessen wurde die Expression von Genen, die der klassischen und alternativen Aktivierung zuzuordnen sind (NOS2 und IL10), die im Zusammenhang mit der Aktivierung neutrophiler Granulozyten stehen (CXCL1, CXCL8) sowie die Expression des inflammatorischen Gens IL1B.

In humanen und bovinen Monozyten führt eine LPS-Stimulation zu einem Anstieg der Genexpression verschiedener Mediatoren wie TNFα, IL6, IL8, IL10, IL12, IL1B, NOS2, Arg 1, CXCL1 und CXCL8 (NAU et al. 2002; GUO et al. 2009; HUSSEN et al. 2014). Auch Bestandteile verschiedener Pathogene sind in der Lage, die Makrophagendifferenzierung zu steuern. Beispielsweise führte die Inkubation humaner mononukleärer Zellen mit dem Bakterium B. pertussis zu einer Genexpressionssteigerung von TNFα, IL1α, IL1B und MIP1B (BOLDRICK et al. 2002). Eine Stimulation boviner Makrophagen mit Bestandteilen des Leberegels Fasciola hepatica induzierte eine gesteigerte Expression der Gene IL10 und Arg1,

Diskussion

67

was auf eine alternative Aktivierung der Makrophagen schließen ließ (FLYNN u. MULCAHY 2007). In den Körper eingedrungene Pathogene können also einen direkten Einfluss auf die Monozyten-Makrophagendifferenzierung ausüben.

In dieser Arbeit wiesen die unter LPS gereiften Makrophagen keine Veränderung der Genexpression im Vergleich zu Medium-gereiften MdM auf. Dies könnte darauf beruht haben, dass die verwendete LPS-Konzentration (10 ng/mL) sehr gering sein musste, um ein LPS-verursachtes Zellsterben während der Reifungszeit zu vermeiden. Da jedoch eine Veränderung des Phänotyps durch LPS hergeführt wurde (4.2.2) muss die Konzentration für eine Einflussnahme ausgereicht haben. Während LPS in der Literatur überwiegend als kurzzeitiger Stimulus verwendet wurde, wurde hier der Langzeiteffekt von LPS auf die Makrophagendifferenzierung untersucht. Da LPS zu einer Endotoxintoleranz bei Phagozyten führt (PETZL et al. 2011), liegt die Vermutung nahe, dass Makrophagen, die für längere Zeit unter dem Einfluss von LPS stehen ihre Genexpression, entsprechend einer körpereigenen Schutzfunktion, wieder herunterregulieren.

Im Gegensatz zu LPS waren E.-coli-Überstände in der Lage die Genexpression der gereiften Makrophagen zu beeinflussen, wobei die Gene CXCL1, CXCL8 und NOS2 signifikant, die Gene IL10 und IL1B tendenziell stärker exprimiert wurden als bei den Mediumkontrollen. Der gleichzeitige Anstieg von IL10 und NOS2 ließ keine Schlüsse auf eine Polarisierung der Zellen in Richtung M1- oder M2-Makrophagen zu. Der Expressionsanstieg von CXCL1 und CXCL8 lässt vermuten, dass Makrophagen vom E.-coli-Sekretom dazu angeregt werden, chemotaktische Faktoren zu sezernieren, die neutrophile Granulozyten anlocken und aktivieren. Welche Substanzen in den Überständen diese Veränderungen herbeiführten, kann zu diesem Zeitpunkt nicht klar definiert werden. Da die Reifung unter purem LPS diesen Effekt nicht hatte, kann LPS als alleiniger Auslöser ausgeschlossen werden. Zusätzlich bleibt zu bedenken, dass von der Wirkung der Überstände nicht direkt auf die Wirkung von lebenden E.-coli-Bakterien geschlossen werden darf. Beispielsweise führte eine von BOLDRICK et al. (2002) durchgeführte Inkubation humaner mononukleärer Zellen mit B. pertussis zu einem Anstieg der Expression verschiedener Gene. Es zeigte sich jedoch, dass die erhöhte Genexpression in Zellen, die mit lebenden Bakterien inkubiert wurden, nach einiger Zeit wieder abnahm. Im Gegensatz dazu blieb die erhöhte Genexpression bei den mit toten Bakterien inkubierten Zellen bestehen. Wahrscheinlich verfügten die Bakterien über Mechanismen, die in der Lage waren, Zellen aktiv zu beeinflussen (BOLDRICK et al. 2002). Gleiches wäre für E.-coli-Bakterien denkbar.

Im Entzündungsgebiet sind neben den eingedrungenen Pathogenen auch körpereigene Mediatoren vorhanden, welche die Makrophagendifferenzierung beeinflussen. Mehrfach beschrieben ist beispielsweise der Einfluss von IFNγ, IL4 und

Diskussion

68

IL13 auf Phänotyp und Genexpression der Phagozyten, die je nach Stimulation in Richtung M1- oder M2-Makrophagen differenzieren (SICA u. MANTOVANI 2012). Auch ein Einfluss von CCL5 auf den funktionellen Phänotyp boviner Makrophagen konnte von HUSSEN et al. (2014) nachgewiesen werden. Er zeigte, dass unter CCL5 generierte Makrophagen nach dreistündiger LPS-Stimulation eine signifikant verminderte Expression der Gene IL10, IL6, Arg1 und CXCL8 verglichen mit Medium-gereiften-MdM aufwiesen. Der Autor vermutete, dass eine Reifung unter CCL5 zu einer Form der Endotoxin-Toleranz führte, die sich bei bovinen Zellen nicht nur in einer Einschränkung des Anstiegs inflammatorischer sondern auch anti-inflammatorischer Gene nach LPS-Stimulation zeigte (PETZL et al. 2011).

Da CCL5 und E.-coli-Überstände in dieser Arbeit einen Kalziumeinstrom auslösten, also eine unmittelbare Wirkung auf Monozyten ausübten, stellte sich nun die Frage, wie sich die Genexpression von unter CCL5 gereiften Makrophagen darstellte. Diese wiesen eine signifikant verminderte Expression von NOS2 und IL1β und eine tendenziell verringerte Expression von CXCL1 und CXCL8 auf. Dies stand ganz im Gegensatz zu den unter E.-coli-Überständen gereiften Makrophagen. Bislang gibt es nur eine ähnliche, von HUSSEN (2014) durchgeführte Studie, in welcher der Phänotyp boviner, unter CCL5 gereifter Makrophagen mittels Membranimmun-fluoreszenz bestimmt wurde. Hierbei wiesen CCL5-gereifte-MdM eine signifikant gesteigerte Expression von CD16, eine reduzierte Expression von MHC-Klasse-II und CD14 sowie eine gleichbleibende Expression von CD163 und CD11b auf. Während die Reduktion von MHC-Klasse-II und CD14 und der Anstieg von CD16 auf eine Differenzierung in Richtung eines M2-Phänotyps hinwiesen (AMBARUSA et al. 2011), warf die gleichbleibende CD163-Expression Zweifel auf, ob es sich um eine Polarisierung der Makrophagen handelte (HUSSEN et al. 2014). Auch eine Berücksichtigung des in dieser Arbeit bestimmten Genexpressionstyps der Zellen lieferte aufgrund der gleichbleibenden IL10-Expression keine eindeutigen Hinweise auf eine Polarisierung, auch wenn die Reduktion des Gens NOS2 auf einen M2-Phänotyp hinweisen könnte.

5.4 Eigenschaften in-vitro-differenzierter Makrophagen der Transitperiode

Bemerkenswert war eine in dieser Arbeit gemessene verminderte CD11b-Expression auf Makrophagen, die aus nach der Geburt gewonnenen Monozyten differenziert wurden. Die schwächste und signifikant verminderte Expression bestand an Tag 56. Unterschiede zwischen Überstand-, LPS- oder Medium-gereiften Zellen bestanden nicht. Die Oberflächenmoleküle CD16, MHC-Klasse-II und CD163 wiesen keine vom Entnahmezeitpunkt abhängige veränderte Expression auf.

Eine Studie über die Oberflächenexpression von CD11/CD18 auf Monozyten während des peripartalen Zeitraumes des Rindes wurde von DIEZ-FRAILE et al.

Diskussion

69

(2002) durchgeführt. Die Autoren maßen die MFI markierter CD11b-Oberflächenrezeptoren auf frisch entnommenen Blutmonozyten und stellten keine veränderte Expression des Rezeptors im Zeitraum von zwei Wochen vor und fünf Wochen nach der Geburt fest. Andere Studien über die CD11b-Expression auf Makrophagen während der Trächtigkeit beschäftigten sich überwiegend mit Gewebsmakrophagen im Uterus. Hier beschreiben MANSOURI-ATTIA et al. (2012) eine Zunahme von CD11b-positiven Makrophagen im uterinen Lumen an Tag 16 der Trächtigkeit und eine gleichzeitige Abnahme der Zahl CD11b-positiver Zellen im umgebenden Stroma. Als mögliche Gründe hierfür wurden ein Einwandern der CD11b+-Zellen ins Uteruslumen oder ein Rückgang der CD11b-Expression und somit das Erlangen eines stationären Phänotyps vermutet.

Basierend auf dieser These könnte die hohe CD11b-Expression auf Makrophagen vor der Geburt darauf beruhen, dass Monozyten während der Trächtigkeit darauf programmiert sind, zu CD11b+-Makrophagen heranzureifen, um besser in den Uterus einwandern zu können. Allerdings ist eine hohe Mobilität von Monozyten auch nach der Geburt gefragt, da in dieser Zeit in die Gebärmutter und das Euter eingewanderte Keime eliminiert und eine Uterusinvolution gewährleistet werden müssen. Der postpartale Rückgang der CD11b-Expression lässt sich damit nicht erklären. Vor der Geburt tendiert das Immunsystem zu einer anti-inflammatorischen Immunantwort, vermutlich um die bestehende Trächtigkeit nicht mit einer inflammatorischen Immunreaktion zu gefährden (SHELDON et al. 2009). Wäre die erhöhte CD11b-Expression vor der Geburt ein Teil dieser anti-inflammatorischen Reaktionslage, könnte der Rückgang von CD11b nach der Geburt als ein sich wieder normalisierendes Immunsystem interpretiert werden.

Viele andere Faktoren nehmen in diesem Zeitraum einen Einfluss auf das Immunsystem. So dokumentierten MENZIES et al. (2011) eine dosisabhängige, negative Regulation der alternativen Makrophagenaktivierung durch das trächtigkeitserhaltende Hormon Progesteron. Hingegen zeigten SORDILLO et al. (2009), dass eine negative Energiebilanz zu einer reduzierten Immunantwort und Elimination von Erregern führt. Während der Transitperiode sind viele dieser Einflussfaktoren verändert, was die Ursache für die verminderte CD11b-Expression zu finden erschwert. Zudem werden Makrophagen bei der Reifung sehr intensiv von äußeren Einflüssen beeinflusst. Gleichzeitig war die Expression der anderen gemessenen Oberflächenmoleküle in dieser Arbeit nicht vom Entnahmezeitpunkt des Blutes abhängig. Folglich stellt sich die Frage, ob der Blutentnahmezeitpunkt nach der viertägigen In-vitro-Reifung noch eine so große Rolle spielen kann. Auch Fehler in der Methodik, wie ein Verlust der Fluoreszenzintensität des CD11b-Markers, müssen in Erwägung gezogen werden.

Diskussion

70

Der BCS der Spendertiere wurde bei der Auswertung der Daten ebenfalls berücksichtigt, es waren jedoch zu keinem Zeitpunkt Unterschiede in der Expression der gemessenen Oberflächenrezeptoren zu finden (4.2.2). Dies entsprach nicht den Erwartungen, da der Einfluss des Metabolismus auf das Immunsystem in der Literatur vielfach beschrieben ist. Beispielsweise wiesen Kühe mit einer negativen Energiebilanz stärkere klinische Symptome nach bakterieller Induktion einer Mastitis auf (BURVENICH et al. 2007). Weiterhin hatten Ketonkörper einen negativen Einfluss auf die Funktion neutrophiler Granulozyten (HOEBEN et al. 1997). Aufgrund des Fütterungssystems der Versuchstiere in dieser Arbeit kann davon ausgegangen werden, dass bei mindestens 90 % der BCShigh-Tiere eine subklinische Ketose vorlag. Da während der durchgeführten Untersuchungen jedoch ausschließlich Daten über den BCS und nicht über den Ketonkörpergehalt oder die Leberfunktion der Tiere vorlagen, sollte der einfache Schluss von einem hohen BCS auf eine negative Energiebilanz und erhöhte Werte freier Fettsäuren nicht ohne weiteres gezogen werden. Es zeigte sich lediglich, dass der BCS alleine keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von CD16, MHC-Klasse-II, CD11b und CD163 hatte.

Der auf E.-coli-SN-gereiften Makrophagen gemessene Rückgang der Expression der Oberflächenantigene CD16 und MHC-Klasse-II (Abbildung 4-6) war bei Tieren mit postpartalen Infektionserkrankungen stärker ausgeprägt als bei klinisch gesunden Tieren. Zellen von Tieren mit Infektionserkrankungen reagierten sensibler auf die In-vitro-Differenzierung unter E.-coli-Überständen, was sich anhand von stärkeren Signifikanzen zwischen stimulierten und unstimulierten Zellen darstellte. Unterschiede zwischen Monozyten gesunder und an Metritis erkrankter Kühe beschreiben GALVAO et al. (2012). Sie untersuchten die Zytokinexpression an den Tagen 0 bis 42 post partum und stellten eine verringerte Expression der Gene TNFα, IL1B und IL6 bei erkrankten Tieren nach Stimulation mit bestrahlten E.-coli-Bakterien an den Tagen 0 bis 14 fest. An Tag 42 waren keine Unterschiede mehr vorhanden. Die Autoren vermuteten, dass eine verminderte Zytokinexpression und verringerte Produktion inflammatorischer Zytokine zu einer beeinträchtigten Immunantwort führte, was sich prädisponierend auf die Metritisentstehung auswirkte (GALVÃO et al. 2012). Eine Gliederung der in dieser Arbeit gemessenen Daten nach den Zeitpunkten der Blutentnahme ergab keine Unterschiede in der CD16- und MHC-Klasse-II-Expression. Fraglich bleibt, ob die stärkere Reaktivität der Zellen der Grund für eine Erkrankung oder ob die Erkrankung die Ursache für die stärkere Reaktivität war.

Im Gegensatz zum Phänotyp wies die Funktionalität der zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommenen MdM mitunter signifikante Unterschiede auf. So verfügten unstimulierte Zellen von Tieren mit einem niedrigen BCS kurz vor der Geburt, an Tag -14, über eine signifikant höhere ROS-Konzentration als an anderen Tagen differenzierte MdM. Auf eine Stimulation mit S. aureus reagierten alle Makrophagen

Diskussion

71

mit einem deutlichen ROS-Anstieg. Hierbei zeigten die in der Gruppe der BCSlow-Tiere die an Tag -42 gewonnenen MdM einen signifikant stärkeren Anstieg als an anderen Tagen differenzierte Zellen. Die von Tieren mit hohem BCS entnommenen Zellen wiesen keine vom Entnahmezeitpunkt abhängigen Unterschiede in der initialen ROS-Konzentration auf. Eine prägnant gesteigerte ROS-Bildung nach bakterieller Stimulation konnte jedoch auch bei diesen Zellen gemessen werden, wobei hier die an Tag -14 differenzierten MdM den stärksten Anstieg zeigten. Zusammenfassend ließ sich beobachten, dass während der Trächtigkeit entnommene MdM beider Gruppen über eine signifikant stärkere ROS-Bildungskapazität verfügten als nach der Geburt entnommene Zellen und dass geringe Unterschiede zwischen BCShigh- und BCSlow-Gruppen bestanden.

Während über die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von Makrophagen in der Transitperiode bislang keine Studien vorliegen, ist die ROS-Bildung boviner neutrophiler Granulozyten in der Literatur mehrfach erwähnt. So beschreiben DOSOGNE et al. (1998) eine gesteigerte ROS-Bildungskapazität während der Trächtigkeit von Milchkühen und einen signifikanten Rückgang des oxidativen Burst ab der ersten bis zur dritten Woche nach der Geburt. Andere Autoren beobachteten diesen Rückgang bereits in der ersten Woche post partum (GILBERT et al. 1993; DOSOGNE et al. 1998; REVELO u. WALDRON 2010). Neuere Studien bestätigen die post partum reduzierte Freisetzung von Sauerstoffmetaboliten in den extrazellulären Raum, stellen jedoch gleichzeitig einen Anstieg der intrazellulären ROS-Bildung fest. Da die bakterizide Wirkung vor allem von der intrazellulären Produktion abhängt, sehen sie die Fähigkeit der Neutrophilen zur Bekämpfung von Bakterien im postpartalen Zeitraum trotz Rückgang der extrazellulären Freisetzung gewährleistet (RINALDI et al. 2008). Die reduzierte ROS-Produktion der Monozyten-gereiften Makrophagen in dieser Arbeit könnte darauf hinweisen, dass sich Makrophagen im peripartalen Zeitraum ähnlich verhalten wie neutrophile Granulozyten.

Womöglich sind mehrere Faktoren während und nach der Trächtigkeit für die veränderte Funktionalität von Makrophagen verantwortlich. Wurden humane Makrophagen beispielsweise unter dem Zusatz von Medium von Trophoblastenzellen gereift, wiesen sie eine gesteigerte Expression von CD16 und eine erhöhte Phagozytosekapazität auf (ALDO et al. 2014). Auch in vivo stieg während der Schwangerschaft die Phagozytosekapazität von Makrophagen, was mit der steigenden Östrogenkonzentration und mit erhöhten Progesteronwerten begründet wurde (MILLER u. HUNT 1996; ZERBE u. SCHEIBL 2000). Während der Schwangerschaft wird in der Plazenta des Menschen das Hormon humanes Chorion-gonadotropin (hCG) gebildet, das unter anderem den Anstieg von Östrogenen und Progesteron fördert. Bei In-vitro-Untersuchungen mit murinen Makrophagen war hCG

Diskussion

72

ebenfalls in der Lage die ROS-Produktion und die NO-Synthese zu steigern (WAN et al. 2007).

Ein optimaler Fütterungszustand einer Milchkuh zum Zeitpunkt der Kalbung liegt vor, wenn der BCS-Wert 3,5 beträgt. Dieser Wert sollte in der Frühlaktation nicht unter 2,5 absinken. Eine Unterkonditionierung hat Verluste in der Milchleistung, Fruchtbarkeit und Gesundheit zur Folge, während eine Überkonditionierung zusätzlich die Gefahr der Leberverfettung erhöht (MANSFELD et al. 2000). Anhand der Fütterungsstrategie und der Gruppierung der Tiere in diesem Versuch sollte postpartal der Zustand einer subklinischen Ketose mit erhöhten unveresterten Fettsäure (NEFA) -Werten bei > 90 % der BCShigh-Tiere erreicht werden. Die Auswirkungen erhöhter NEFA auf den oxidativen Burst neutrophiler Granulozyten werden in der Literatur kontrovers diskutiert. So beobachteten einige Autoren eine reduzierte ROS-Produktion, während andere einen Anstieg der Fähigkeit neutrophiler Granulozyten zur ROS-Bildung dokumentierten (BURVENICH et al. 2007; GALVÃO 2012; STER et al. 2012). Grundsätzlich wird eine negative Energiebilanz mit einer Immunsuppression und erhöhten Krankheitsanfälligkeit in der Transitperiode in Zusammenhang gebracht. Zusammenfassend war zu sehen, dass die Körperkondition einen Einfluss auf die Funktionalität boviner in-vitro-gereifter Makrophagen hatte und dass unstimulierte Zellen von Tieren mit niedrigem BCS kurz vor der Geburt eine erhöhte ROS-Konzentration aufwiesen.

Vergleiche zwischen MdM erstlaktierender Kühe mit denen mehrfachlaktierender Tiere zeigten keine signifikanten Unterschiede im Phänotyp und der Funktionalität dieser Zellen. Lediglich eine verstärkte ROS-Bildungskapazität der Makrophagen mehrfachlaktierender Tiere zu allen gemessenen Zeitpunkten war zu erkennen, die jedoch nicht signifikant war. Versuche mit neutrophilen Granulozyten zeigten einen bei mehrfachlaktierenden Kühen signifikant stärkeren Rückgang der ROS-Bildung nach der Geburt als bei erstkalbenden Tieren (GILBERT et al. 1993; BURVENICH et al. 2007). Während BURVENICH et al. (2007) diese verminderte Funktionalität bereits bei Kühen in der zweiten Laktation beobachteten, erfassten GILBERT et al. (1993) erst bei Tieren in der vierten Laktation Unterschiede. In dieser Arbeit konnte aufgrund der unterschiedlich verteilten Tierzahlen lediglich ein Vergleich primiparer und pluriparer Kühe erfolgen, wobei eine verminderte Kapazität zur Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten bei mehrfach laktierenden Tieren für Makrophagen nicht nachgewiesen werden konnte. Dies könnte zum einen bedeuten, dass die Funktionalität von Makrophagen nicht von der Parität abhängt, zum anderen wäre es möglich, dass der oxidative Burst von Makrophagen bei pluriparen Tieren erhöht ist, um die reduzierte ROS-Bildungsfähigkeit von neutrophilen Granulozyten auszugleichen. Weitere Untersuchungen mit größeren Tierzahlen und eine Fokussierung auf diesen Themenbereich wären von Interesse.

Zusammenfassung

73

6 Zusammenfassung

Christine Gesterding Einfluss von Zell- und Bakteri enkulturüberständen auf die In-vitro-Differenzierung boviner Makrophagen.

Makrophagenplastizität ist ein wesentlicher Bestandteil einer funktionierenden Erregerabwehr, wobei die gereiften Makrophagen vielfältige Aufgaben von der Erregereliminierung bis hin zur Resolution einer Entzündung und der Gewebeneubildung übernehmen. Die Steuerung der Makrophagen-Funktion, deren Polarisierung, wird von Mediatoren beeinflusst, die sowohl von körpereigenen Gewebezellen als auch von Pathogenen selbst gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Situation in vitro mithilfe von Zell- und Bakterien-Kulturüberständen simuliert und deren Einfluss auf Monozyten sowie auf ihre Reifung zu Makrophagen untersucht. Da bei Milchkühen ein gehäuftes Auftreten von E.-coli-Erkrankungen während der Transitperiode zu beobachten ist, wurden zur bakteriellen Stimulation verschiedene E.-coli-Isolate verwendet. Ferner handelt es sich überwiegend um Faktorenkrankheiten. Daher wurden weitere Parameter wie der relativ zur Geburt gelegene Blutentnahmezeitpunkt, die Körperkondition, die Laktationszahl der Tiere und deren Gesundheitsstatus bei der Auswertung der Daten berücksichtigt.

Sowohl uterine Stromazell-Kulturüberstände als auch Kulturüberstände von uterinen Epithelzellen waren in der Lage Monozyten zu aktivieren. Sie induzierten einen unmittelbaren, konzentrationsabhängigen Kalziumeinstrom. Hierbei hatten Überstände E.-coli-Lipopolysaccharid (LPS) -stimulierter Stromazellen eine stärkere Wirkung als solche unstimulierter Zellen. Dies ließ vermuten, dass die aktivierenden Mediatoren stimulationsabhängig gebildet werden. Die Reifung zu Makrophagen unter dem Einfluss von Stromazellüberständen führte zu keinen veränderten phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der Zellen. Die Expressionsstärke der Oberflächenmoleküle CD16, CD11b, CD163 und MHC-Klasse-II blieb unverändert, ebenso die Kapazität der Zellen zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Kulturüberstände der geprüften E.-coli-Isolate wiesen Unterschiede in der Stärke des induzierten Kalziumeinstroms auf. Überstände der E.-coli-Isolate der Phylogruppe A wie auch die Überstände von E.-coli-Isolaten aus dem Uterus und der Milchdrüse von Tieren mit Endometritis oder Mastitis induzierten eine starke Monozytenaktivierung. Makrophagen, die aus Monozyten in Anwesenheit von E.-coli-Überständen in vitro reiften, wiesen eine signifikant verringerte Expression von CD16, CD163 und MHC-Klasse-II-Molekülen auf. Zudem zeigten die Makrophagen eine verstärkte ROS-Bildung.

Auch das Genexpressionsprofil der gereiften Makrophagen wurde von E.-coli-Überständen beeinflusst. Die Gene CXCL1, CXCL8 und NOS2 wurden signifikant,

Zusammenfassung

74

die Gene IL10 und IL1B tendenziell stärker exprimiert. Ebenso wie der modulierte Oberflächen-Phänotyp lässt der gleichzeitige Anstieg von IL10 und NOS2 keine Schlüsse auf eine drastische Polarisierung der Makrophagen durch die E.-coli-Überstände in Richtung M1- oder M2-Makrophagen zu. Der Expressionsanstieg von CXCL1 und CXCL8 zeigte, dass unter E.-coli-Sekretom gereifte Zellen dazu angeregt wurden, chemotaktische Faktoren zu sezernieren, die neutrophile Granulozyten anlocken und aktivieren; ein Hinweis auf eine inflammatorische Ausrichtung der Zellen.

Das Chemokin CCL5 und LPS, Mediatoren, die in der Regel auch in erhöhter Konzentration im entzündeten Gewebe vorliegen, wurden zur Kontrolle bei den Versuchen ebenfalls als Stimuli verwendet. Während LPS keinen Kalziumeinstrom in Monozyten auslöste, war der Einfluss auf die Makrophagenreifung ähnlich der Wirkung der E.-coli-Überstände, wenngleich die induzierten Veränderungen schwächer waren. Demgegenüber hatte CCL5, das einen deutlichen Kalziumeinstrom in Monozyten auslöste, einen gegenteiligen Effekt auf die Genexpression boviner Monozyten-gereifter Makrophagen (MdM). CCL5-gereifte Makrophagen exprimierten die Gene IL1B und NOS2 signifikant und die Gene CXCL1 und CXCL8 tendenziell schwächer als Medium-gereifte-MdM. Möglicherweise entwickeln sich Makrophagen unter dem Langzeiteinfluss des inflammatorischen Chemokins zu anti-inflammatorisch ausgerichteten Subtypen, um die Gefahr von Gewebsschädigungen zu verringern.

Der Zeitpunkt der Monozytengewinnung in der Transitperiode hatte keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von CD16, MHC-Klasse-II und CD163, jedoch wurde CD11b gegen Tag 56 post partum zunehmend schwächer exprimiert. Die Fähigkeit zur ROS-Bildung war vom relativ zur Geburt gelegenen Entnahmezeitpunkt abhängig. So wiesen vor der Geburt differenzierte MdM eine signifikant stärkere Kapazität zur ROS-Bildung auf als nach der Geburt differenzierte Zellen. MdM von Tieren mit unterschiedlichen Körperkonditionen wiesen keine signifikanten Unterschiede in ihren phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf. Die durch E.-coli-Überstand induzierte, reduzierte Expression von CD16 und MHC-Klasse-II auf gereiften MdM war bei Tieren mit postpartalen Infektionserkrankungen stärker ausgeprägt als bei klinisch gesunden Tieren. Funktionell unterschieden sich die MdM der Tiere mit unterschiedlichen postpartalen Gesundheitszuständen nicht. Vergleiche zwischen MdM erstlaktierender Kühe mit denen mehrfachlaktierender Tiere zeigten keine signifikanten Unterschiede im Phänotyp und der Funktionalität dieser Zellen.

Die sensiblere Reaktion von Monozyten postpartal erkrankter Tiere auf den Kontakt mit E.-coli-Sekretom kann nicht sicher als Ursache oder Folge der Infektions-erkrankung bestimmt werden. Die zum Teil konträren Wirkungen von Wirts-mediatoren (hier: CCL5) und bakteriellen Produkten auf die phänotypische und

Zusammenfassung

75

funktionelle Modulation der aus Monozyten entstandenen Makrophagen eröffnen eine Möglichkeit zur Einflussnahme auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung. Da die Gesamt-Reaktivität des Gewebes nach Erregerkontakt von dieser Differenzierung abhängt, können die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse langfristig zu neuen Ansätzen der Metritis- und Mastitisprävention durch eine gezielte Modulation der Monozyten-Makrophagen-Differenzierung führen.

Summary

76

7 Summary

Christine Gesterding The effect of cell culture sup ernatants and bacteria on the in vitro differentiation of bovine macrophages.

Taking over crucial tasks from the initial elimination of pathogens to the resolution of inflammation and tissue regeneration, macrophages and their plasticity are an essential component of a well-functioning immune system. Polarization of macrophages is affected by secreted mediators of endogenous cells as well as by the secretome of invaded bacteria. In this study, the impact of supernatants (SN) from bovine cell cultures and E. coli bacteria on monocytes and their in vitro differentiation into macrophages was analyzed. Dairy cows show a distinct susceptibility towards E. coli infection during the transition period. Since the outcome of these infections is determined by several variables, day of blood collection, body condition, lactation number and health status of the animals were taken into account.

To examine whether the SN have the ability to activate monocytes, calcium influx in monocytes was measured during stimulation with SNs of bovine uterine stromal cells and uterine epithelial cells. Both supernatants induced a concentration-dependent Ca2+-influx. Since SNs of lipopolysachharid (LPS) -treated stromal cells had a stronger effect than those of unstimulated stromal cells, it can be assumed that the substances which led to this activation were induced by stimulation. E. coli SNs differed in their ability to induce Ca2+-influx. SNs from phylogroup A isolates and those from E. coli which were isolated from cows with endometritis and mastitis had the strongest impact. Whilst in vitro differentiation of monocytes into macrophages was not influenced by the secretome of stromal cells, macrophages differentiated under the influence of E. coli SNs showed a significantly reduced expression of surface CD16, CD11b and MHC-class-II. In addition, their capacity to generate reactive oxygen species (ROS) was enhanced.

Monocyte/macrophage differentiation in the presence of E. coli SNs had an effect on gene expression profiles of monocyte-derived macrophages (MdM). Gene expression of CXCL1, CXCL8 and NOS2 was significantly, the expression of IL10 and IL1B was in tendency enhanced in stimulated MdM. Neither the modulated surface phenotype nor the simultaneous increase in IL10 and NOS2 gene expression provide evidence for a preferential polarization by E. coli supernatants towards M1 or M2 macrophages. The increased gene expression of CXCL1 und CXCL8 indicates that cells stimulated by E. coli SNs secrete chemotactic mediators which attract and activate neutrophils.

The chemokine CCL5 and LPS are usually present in enhanced concentrations in inflamed tissue. They were used as stimuli in this study as well. Whilst LPS did not

Summary

77

induce Ca2+-influx in monocytes, it had an influence on macrophage differentiation similar to but less intense than the effect of E. coli SNs. In comparison, CCL5 was capable to induce a strong Ca2+-influx in monocytes. Its influence on the gene expression profile of MdM was just the opposite of the effects induced by E. coli. Macrophages stimulated with CCL5 showed a significantly lower expression of the genes IL1B and NOS2 and in tendency lower expression of CXCL1 and CXCL8 compared to unstimulated cells. Hypothetically, macrophages maturing under the influence of CCL5 become anti-inflammatory cells to diminish the risk of tissue damage.

The day relative to parturition of monocyte isolation had no effect on the MdM surface expression of CD16, MHC-class-II and CD163. However, the expression of CD11b became significantly lower towards day 56 post partum. The ability of the cells to produce ROS was dependent on the day of blood collection. It was significantly higher in macrophages derived from monocytes, which were isolated during pregnancy than from MdM generated from monocytes taken after birth. Both Body Condition Score and the lactation number of the cows had no significant effect on phenotypic and functional properties of macrophages while the health status affected their phenotype. The decreased expression of CD16 induced by E. coli SNs was more pronounced on MdM from animals with post partal infectious diseases than on cells from healthy cows. In contrast, the ability to generate ROS was not influenced by the health status.

Whether the more sensitive reaction of MdM isolated from animals with post partal diseases is a reason or a consequence of the disease cannot safely be assumed. The in part contrary effect of host mediators (CCL5) and bacterial products on the modulation of phenotype and function of monocyte-derived macrophages may point to new ways of manipulating macrophage differentiation. As tissue damage after pathogen exposure also depends on this differentiation, the findings of this study may support new concepts in mastitis and endometritis prevention.

Literaturverzeichnis

78

8 Literaturverzeichnis

AKILA, P., V. PRASHANT, M. N. SUMA, S. N. PRASHANT u. T. R. CHAITRA (2012): CD163 and its expanding functional repertoire. Clinica Chimica Acta 413, 669-674 ALDO, P. B., K. RACICOT, V. CRAVIERO, S. GULLER, R. ROMERO u. G. MOR (2014): Trophoblast Induces Monocyte Differentiation Into CD14+/CD16+ Macrophages. American Journal of Reproductive Immunology 72, 270-284 ALMEIDA, P. E., P. S. WEBER, J. L. BURTON, R. J. TEMPELMAN, J. P. STEIBEL u. A. J. ZANELLA (2007): Gene expression profiling of peripheral mononuclear cells in lame dairy cows with foot lesions. . Vet. Immunol. Immunopathol. 120, 234-245 ALTREUTHER, G., L. LLAMES, S. NEUENSCHWANDER, W. LANGHANS u. D. WERLING (2001): Morphologic and Functional Changes in Bovine Monocytes Infected In vitro with the Bovine Leukaemia Virus. Scand. J. Immunol. 54, 459–469 AMBARUSA, C. A., S. KRAUSZA, M. V. EIJKB, J. HAMANNC, T. R. D. J. RADSTAKED, K.A. REEDQUISTA, P. P. TAKA u. D. L. P. BAETEN (2011): Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. Journal of Immunological Methods 375, 196-206 APPAY, V. u. S. ROWLAND-JONES (2001): RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends Immunol. 22, 83-87 AUFFRAY, C., M. H. SIEWEKE u. F. GEISSMANN (2009): Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology 27, 669-692 BABIOR, B. M. (1983): The Respiratory Burst of Phagocytes. J. Clin. Invest. 73, 599-601


79

BAPTISTA, J. M., M. C. JUSTINO, A. M. P. MELO, M. TEIXEIRA u. L. M. SARAIVA (2012): Oxidative Stress Modulates the Nitric Oxide Defense Promoted by Escherichia coli Flavorubredoxin. Journal of Bacteriology 194, 3611-3617 BELL, A. W. (1995): Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late Pregnancy to Early Lactation. J ANIM SCI 73, 2804-2819 BICALHO, R. C., V. S. MACHADO, M. L. S. BICALHO, R. O. GILBERT, A. G. V. TEIXEIRA, L. S. CAIXETA u. R. V. V. PEREIRA (2010): Molecular and epidemiological characterization of bovine intrauterine Escherichia coli. Journal of Dairy Science 93, 5818-5830 BOLDRICK, J. C., A. A. ALIZADEH, M. DIEHN, S. DUDOIT, C. L. LIU, C. E. BELCHER, D. BOTSTEIN, L. M. STAUDT, P. O. BROWN u. D. A. RELMAN (2002): Stereotyped and specific gene expression programs in human innate immune responses to bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences 99, 972-977 BONDURANT, R. H. (1999): Inflammation in the bovine female reproductive tract.pdf. Journal of animal science 77, 101-110 BOUGARN, S., P. CUNHA, A. HARMACHE, A. FROMAGEAU, F. B. GILBERT u. P. RAINARD (2010): Muramyl Dipeptide Synergizes with Staphylococcus aureus Lipoteichoic Acid To Recruit Neutrophils in the Mammary Gland and To Stimulate Mammary Epithelial Cells. Clinical and Vaccine Immunology 17, 1797-1809 BRANDT, E., GAETANE WOERLY, AMENA BEN YOUNES, SYLVIE LOISEAU u. M. CAPRON (2000): IL-4 production by human polymorphonuclear neutrophils. Journal of Leukocyte Biology 68 BROWN, G. B. u. J. A. ROTH (1991): Comparison of the response of bovine and human neutrophils to various stimuli. Vet. Immunol. Immunopathol. 28, 201-218 BRYANT, P., H. PLOEGH (2004): Class II MHC peptide loading by the professionals. Current Opinion in Immunology, 16, 96-102


80

BUECHLER, C., MIRKO RITTER, EVELYN ORSO´, THOMAS LANGMANN, A. JOCHEN KLUCKEN u. G. SCHMITZ (2000): Regulation of scavenger receptor CD163 expression in human monocytes and macrophages by pro- and antiinflammatory stimuli. J. Leukoc. Biol. 67, 97–103 BURVENICH, C., D. D. BANNERMAN, J. D. LIPPOLIS, L. PEELMAN, B. J. NONNECKE, M. E. KEHRLI u. M. J. PAAPE (2007): Cumulative Physiological Events Influence the Inflammatory Response of the Bovine Udder to Escherichia coli Infections During the Transition Period. Journal of Dairy Science 90, E39-E54 BURVENICH, C., V. R. VAN MERRIS, J. MEHRZAD, A. DIEZ-FRAILE u. L. DUCHATEAU (2003): Severity of E. coli mastitis is mainly determined by cow factors. Veterinary Research 34, 521-564 CANTON, J., D. NECULAI u. S. GRINSTEIN (2013): Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nature Reviews Immunology 13, 621-634 CASTAÑO, D., L. F. GARCÍA u. M. ROJAS (2011): Increased frequency and celldeath of CD16 monocytes with Mycobacterium tuberculosis infection. Tuberculosis (Edinb). 91, 348-360 COBB, S. P. u. E. D. WATSON (1995): Immunohistochemical study of immune cells in the bovine endometrium at different stages of the oestrous cycle. Res. Vet. Sci. 59, 238-241 COOK, A. D., E. L. BRAINE u. J. A. HAMILTON (2003): The Phenotype of Inflammatory Macrophages Is Stimulus Dependent: Implications for the Nature of the Inflammatory Response. The Journal of Immunology 171, 4816-4823 CRONIN, J. G., M. L. TURNER, L. GOETZE, C. E. BRYANT u. I. M. SHELDON (2011): Toll-Like Receptor 4 and MYD88-Dependent Signaling Mechanisms of the Innate Immune System Are Essential for the Response to Lipopolysaccharide by Epithelial and Stromal Cells of the Bovine Endometrium. BIOLOGY OF REPRODUCTION 86, 51-51


81

CROY, A., L. J. OLIVEIRA, N. R. MANSOURRI-ATTIA, A. G. FAHEY, J. BROWNE, N. FORDE, J. F. ROCHE, P. LONERGAN u. T. FAIR (2013): Characterization of the Th Profile of the Bovine Endometrium during the Oestrous Cycle and Early Pregnancy. PLoS ONE 8, e75571 CULLEY, F. J., A. M. J. PENNYCOOK, J. S. TREGONING, J. S. DODD, G. WALZL, T. N. WELLS, T. HUSSELL u. P. J. M. OPENSHAW (2006): Role of CCL5 (RANTES) in Viral Lung Disease. Journal of Virology 80, 8151-8157 DENG, W., HONG B. YU, CARMEN L. DE HOOG, NIKOLAY STOYNOV, YULING LI, LEONARD J. FOSTER u. B. B. FINLAY (2012): Quantitative Proteomic Analysis of Type III Secretome of Enteropathogenic Escherichia coli Reveals an Expanded Effector Repertoire for Attaching/Effacing Bacterial Pathogens. Molecular & Cellular Proteomics 11, 692–709 DHALIWAL, G. S., R. D. MURRAY u. Z. WOLDEHIWET (2001): Some aspects of immunology of the bovine uterus related to treatments for endometritis. Animal Reproduction Science 67 (2001) 67, 135–152 DIEZ-FRAILE, A., L. DUCHATEAU, E: MEYER, C: BURVENICH (2002): Expression of beta2-integrin on monocytes and blood polymorphnuclear leukocytes in the periperturient period in dairy cows. The Canadian Journal of Veterinary Research67, 235-23 DOGAN, B., S. KLAESSIG, M. RISHNIW, R. A. ALMEIDA, S. P. OLIVER, K. SIMPSON u. Y. H. SCHUKKEN (2006): Adherent and invasive Escherichia coli are associated with persistent bovine mastitis. Veterinary Microbiology 116, 270-282 DOSOGNE, H., C. BURVENICH, A. E. FREEMAN, M. E. K. JR., J. C. DETILLEUX, J. SULON, J.-F. BECKERS u. D. HOEBEN (1998): Pregnancy-associated glycoprotein and decreased polymorphonuclear leukocyte function in early post-partum dairy cows. Veterinary Immunology and Immunopathology 67, 47–54 DREYFUS, L: A:, B. HARVILLE, D. HOWARDT, R. SHABAN, D. BEATTY, S. J. MORRIS (1993): Calcium influx mediated by the Escherichia coli heat-stable enterotoxin B (STB). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3202-320


82

DÜVEL, A., CONSTANZE FRANK, ANKE SCHNAPPER, HANS-JOACHIM SCHUBERTH u. A. SIPKA (2012): Classically or alternatively activated bovine monocyte-derived macrophages in vitro do not resemble CD163/Calprotectin biased macrophage populations in the teat. Innate Immun. 2012, 6 ECONOMOU, A. (2002): Bacterial secretome: the assembly manual and operating instructions (Review). Molecular Membrane Biology 19, 159-169 EDWARDS, J. P., X. ZHANG, K. A. FRAUWIRTH u. D. M. MOSSER (2006): Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology 80, 1298-1307 EGGER, G. (2005): Die Akute Entzündung: Grundlagen, Pathophysiologie und klinische Erscheinungsbilder der Unspezifischen Immunität. Auflage: 2005, Springer EL-BENNA, J., P. M.-C. DANG u. M.-A. GOUGEROT-POCIDALO (2008): Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Seminars in Immunopathology 30, 279-289 ELAZAR, S., E. GONEN, A. LIVNEH-KOL, I. ROSENSHINE u. N. Y. SHPIGEL (2010): Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research 41 ESCOBAR-PARAMO, P. (2004): A Specific Genetic Background Is Required for Acquisition and Expression of Virulence Factors in Escherichia coli. Molecular Biology and Evolution 21, 1085-1094 FABRIEK, B. O., ROBIN VAN BRUGGEN, DONG MEI DENG, ANTOON J. M. LIGTENBERG, KAMRAN NAZMI, KARIN SCHORNAGEL, RIANKA P. M. VLOET, CHRISTINE D. DIJKSTRA u. T. K. V. D. BERG (2008): The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood 113, 887-892


83

FENG, X. M., X. L. CHEN, N. LIU, Z. CHEN, Y. L. ZHOU, Z. B. HAN, L. ZHANG u. Z. C. HAN (2007): Interleukin-27 upregulates major histocompatibility complex class II expression in primary human endothelial cells through induction of major histocompatibility complex class II transactivator. Human Immunology 68, 965-972 FIGUEIREDO, F., T. J. KOERNER u. D. ADAMS (1989): Molecular mechanisms regulating the expression of class II histocompatibility molecules on macrophages. Effects of inductive and suppressive signals on gene transcription. THE JOURNAL OF MMUNOLOGY 143, 3781-3786. FILIPE-SANTOS, O., J. BUSTAMANTE, A. CHAPGIER, G. VOGT, L. DE BEAUCOUDREY, J. FEINBERG, E. JOUANGUY, S. BOISSON-DUPUIS, C. FIESCHI, C. PICARD u. J.-L. CASANOVA (2006): Inborn errors of IL-12/23- and IFN-γ-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Seminars in Immunology 18, 347-361 FISCHER, C., MARC DRILLICH, SIMONE ODAU, WOLFGANG HEUWIESER, R. EINSPANIER u. C. GABLER (2010): Selected pro-inflammatory factor transcripts in bovine endometrial epithelial cells are regulated during the oestrous cycle and elevated in case of subclinical or clinical endometritis. Reproduction, Fertility and Development 22, 818–829 FLYNN, R. J. u. G. MULCAHY (2007): Possible Role for Toll-Like Receptors in Interaction of Fasciola hepatica Excretory/Secretory Products with Bovine Macrophages. Infection and Immunity 76, 678-684 FORMAN, H. J. u. M. TORRES (2002): Reactive Oxygen Species and Cell Signaling. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 166, 4-8 FRANK, C. (2012) Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen und deren In-vitro-Differenzierung in Makrophagen Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss GALVÃO, K. N., M. J. B. FELIPPE, S. B. BRITTIN, R. SPER, M. FRAGA, J. S. GALVÃO, L. CAIXETA, C. L. GUARD, A. RICCI u. R. O. GILBERT (2012): Evaluation of cytokine expression by blood monocytes of lactating Holstein cows with or without postpartum uterine disease. Theriogenology 77, 356-372


84

GERBER, J. S. u. D. M. MOSSER (2014): Reversing Lipopolysaccharide Toxicity by Ligating the Macrophage Fcg receptors. The Journal of Immunology 166, 6861-6868 GILBERT, R. O., GRÖHN Y.T., MILLER P.M. u. H. D.J. (1993): Effect of parity on periparturient neutrophil function in dairy cows. Immunology and Immunopathology 36, 75–82 GOLDSTONE, R. J., R. TALBOT, H.-J. SCHUBERTH, O. SANDRA, M. SHELDON u. D. G. E. SMITH (2014): Draft Genome Sequence of Escherichia coli MS499, Isolated from the Uterus of a Postpartum Cow with Metritis. Genome A 2 GOODMAN, E. B., DONALD C. ANDERSON u. A. J. TENNER (1995): C1q triggers neutrophil superoxide production by a unique CD18-dependent mechanism. Journal of Leukocyte Biology 58, 168-176 GORDON, S. (2003): Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunology 3, 23-35 GORDON, O. CLERMONT, H. TOLLEY u. E. DENAMUR (2008): Assigning Escherichia coli strains to phylogenetic groups: multi-locus sequence typing versus the PCR triplex method. Environmental Microbiology 10, 2484-2496 GRUMMER, R. R. (1995): Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding the transition cow. Journal of animal science 73, 2820-2833 GÜNTHER, J., LIU S, ESCH K, SCHUBERTH HJ u. S. HM. (2010): Stimulated expression of TNF-alpha and IL-8, but not of lingual antimicrobial peptide reflects the concentration of pathogens contacting bovine mammary epithelial cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 135, 152-157 GUO, Y., G. ZHAO, S. TANAKA u. T. YAMAGUCHI (2009): Differential Responses Between Monocytes and Monocyte-Derived Macrophages for Lipopolysaccharide Stimulation of Calves. Cellular & Molecular Immunology 6, 223-229 HALLETT, M. B. u. D. LLOYDS (1995): Neutrophil priming: the cellular signals that say 'amber' but not 'green'. Immunol. Today 16, 264-268


85

HARA, K., K. SHIRASUNA, F. USUI, T. KARASAWA, Y. MIZUSHINA, H. KIMURA, A. KAWASHIMA, A. OHKUCHI, S. MATSUYAMA, K. KIMURA u. M. TAKAHASHI (2014): Interferon-Tau Attenuates Uptake of Nanoparticles and Secretion of Interleukin-1β in Macrophages. PLoS ONE 9, e113974 HEIKKINEN, J., M. MÖTTÖNEN, J. KOMI, A. ALANEN u. O. LASSILA (2003): Phenotypic characterization of human decidual macrophages. Clin. Exp. Immunol. 131, 498–505 HERATH, S., D. P. FISCHER, D. WERLING, E. J. WILLIAMS, S. T. LILLY, H. DOBSON, C. E. BRYANT u. I. M. SHELDON (2006): Expression and Function of Toll-Like Receptor 4 in the Endometrial Cells of the Uterus. Endocrinology 147, 562-570 HERRERO, C., CARLOS SEBASTIÁN, LAURA MARQUÉS, MÒNICA COMALADA, JORDI XAUS, ANNABEL F. VALLEDOR, JORGE LLOBERAS u. A. CELADA (2001): Immunosenescence of macrophages: reduced MHC class II gene expression. Experimental Gerontology 37, 389-394 HESSE, M., M. MODOLELL, A. C. LA FLAMME, M. SCHITO, J. M. FUENTES, A. W. CHEEVER, E. J. PEARCE u. T. A. WYNN (2001): Differential Regulation of Nitric Oxide Synthase-2 and Arginase-1 by Type 1/Type 2 Cytokines In Vivo: Granulomatous Pathology Is Shaped by the Pattern of L-Arginine Metabolism. The Journal of Immunology 167, 6533-6544 HOEBEN, D., R. HEYNEMAN u. C. BURVENICH (1997): Elevated levels of β-hydroxybutyric acid in periparturient cows and in vitro effect on respiratory burst activity of bovine neutrophils. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 165-170 HOLZHAUSEN (2012) Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus. Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss HOMEIER-BACHMANN, T. (2009) Der GimA-Lokus von Extraintestinal-pathogenen E.coli (ExPEC) Reduktive Evolution in Abhängigkeit von Habitat und Pathovar. Berlin, freie Univ., Fachber. Veterinärmed., Diss


86

HUSSAIN, A. M. u. R. W. DANIEL (1992): Effects of intrauterine infusion of Escherichia coli endotoxin in normal cows and in cows with endometritis induced by experimental infection with Streptococcus agalactiae. Theriogenoiogy 37, 791-810 HUSSEN, J., DÜVEL A, SANDRA O, SMITH D, SHELDON IM, ZIEGER P u. S. HJ. (2013): Phenotypic and Functional Heterogeneity of Bovine Blood Monocytes. PLoS ONE 8 HUSSEN, J., C. FRANK, A. DÜVEL, M. KOY u. H.-J. SCHUBERTH (2014): The chemokine CCL5 induces selective migration of bovine classical monocytes and drives their differentiation into LPS-hyporesponsive macrophages in vitro. Developmental & Comparative Immunology 47, 169-177 ISHIKAWA, Y., K. NAKADA, K. HAGIWARA, R. KIRISAWA, H. IWAI, M. MORIYOSHI u. Y. SAWAMUKAI (2004): Changes in Interleukin-6 Concentration in Peripheral Blood of Pre- and Post-Partum Dairy Cattle and Its Relationship to Postpartum Reproductive Diseases. J. Vet. Med. Sci. 66, 1403-1408 KAMPHORST, A. O., P. GUERMONPREZ, D. DUDZIAK u. M. C. NUSSENZWEIG (2010): Route of Antigen Uptake Differentially Impacts Presentation by Dendritic Cells and Activated Monocytes. The Journal of Immunology 185, 3426-3435 KAPER, J. B., J. P. NATARO u. H. L. T. MOBLEY (2004): Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-140 KARCZMARCZYK, A., TWARDOŃ J, SOBIESZCZAŃSKA B u. P. M. (2008): Curli expression by Escherichia coli strains isolated from bovine mastitis. Pol J Vet Sci. 11, 133-137 KASIMANICKAM, R., T. F. DUFFIELD, R. A. FOSTER, C. J. GARTLEY, K. E. LESLIE, J. S. WALTON u. W. H. JOHNSON (2004): Endometrial cytology and ultrasonography for the detection of subclinical endometritis in postpartum dairy cows. Theriogenology 62, 9-23 KEOPHIPHATH, M., C. ROUAULT, A. DIVOUX, K. CLEMENT u. D. LACASA (2009): CCL5 Promotes Macrophage Recruitment and Survival in Human Adipose Tissue. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 30, 39-45


87

KIMURA, K., J. P. GOFF, M. E. KEHRLI u. J. A. HARP (1999): Phenotype Analysis of Peripheral Blood Mononuclear Cells in Periparturient Dairy Cows. Journal of Dairy Science 82, 315-319 KINDAHL, H., B. KORNMATITSUK u. H. GUSTAFSSON (2004): The Cow in Endocrine Focus Before and After Calving. Reprod. Dom. Anim. 39, 217–221 KOSCHINSKI, A. (2006): Why Escherichia coli -hemolysin induces calcium oscillations in mammalian cells--the pore is on its own. The FASEB Journal 20, 973-975 KOY, M., N. HAMBRUCH, J. HUSSEN, C. PFARRER, H.-M. SEYFERT u. H.-J. SCHUBERTH (2013): Recombinant bovine S100A8 and A9 enhance IL-1β secretion of interferon-gamma primed monocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology 155, 162-170 KREIDER, T., R. M. ANTHONY, J. F. U. JR. u. W. C. GAUSE (2007): Alternatively activated macrophages in helminth infections. Curr. Opin. Immunol. 19, 448–453 LAHOUASSA, H., E. MOUSSAY, P. RAINARD u. C. RIOLLET (2007): Differential cytokine and chemokine responses of bovine mammary epithelial cells to Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Cytokine 38, 12-21 MAASS, J. (2013) Angeborene Immunität im bovinen Uterus: Phänotypische und funktionelle Eigenschaften uteriner monozytärer Zellen. Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss MAEDA, Y., H. OHTSUKA, M. TOMIOKA u. M. OIKAWA (2012): Effect of progesterone on Th1/Th2/Th17 and Regulatory T cell-related genes in peripheral blood mononuclear cells during pregnancy in cows. Veterinary Research Communications 37, 43-49 MANSFELD, R., W. HEUWIESER, M. METZNER u. M. SCHÄFERS (2000): Die fortlaufende Konditionsbeurteilung_Unverzichtbarer Bestandteil der Fütterungsüberwachung beim Milchvieh. milchpraxis 180-184


88

MANSOURI-ATTIA, N. R., LILIAN J. OLIVEIRA, NIAMH FORDE, ALAN G. FAHEY, JOHN A. BROWNE, JAMES F. ROCHE, OLIVIER SANDRA, PIERRETTE REINAUD, A. PATRICK LONERGAN u. T. FAIR (2012): Pivotal Role for Monocytes/Macrophages and Dendritic Cells in Maternal Immune Response to the Developing Embryo in Cattle. BIOLOGY OF REPRODUCTION 87, 1-12 MARTAL, J. L., L.E HUYNH, M. L'HARIDON, EB. REINAUD, M.W. GUILLOMOFF, M.A. CHARLIER u. Y. CHARPIGNY (1998): IFN-tau: a novel subtype I IFN1. Structural characteristics, non-ubiquitous expression, structure-function relationships, a pregnancy hormonal embryonic signal and cross-species therapeutic potentialities. Biochimie 80, 755-777 MAZZONE, A. u. G. RICEVUTI (1995): Leukozyte CD11/CD18 integrins: biological and clinical relevance. Haematologica 80, 161-175 MENZIES, F. M., F. L. HENRIQUEZ, J. ALEXANDER u. C. W. ROBERTS (2011): Selective inhibition and augmentation of alternative macrophage activation by progesterone. Immunology 134, 281–291 MILLER, L. u. J. S. HUNT (1996): Sex steroid hormones and macrophage function. Life Sciences 59, 1-14 MIRKOVITCH, J., A. KÖNIG, K. S. SAUTER, M. BRCIC, J. C. HOPE, C. J. HOWARD u. T. W. JUNGI (2006): Single-cell analysis divides bovine monocyte-derived dendritic cells into subsets expressing either high or low levels of inducible nitric oxide synthase. . Vet. Immunol. Immunopathol. 114, 1-14 MIRONOVA, L. (2004) Modifizierte durchflusszytometrische Methode zum empfindlicheren Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies neutrophiler Granulozyten in vitro. Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss MONIUSZKOA, M., ANNA BODZENTA-LUKASZYKA, KRZYSZTOF KOWALA, DANUTA LENCZEWSKAA u. M. DABROWSKAB (2009): Enhanced frequencies of CD14++CD16+, but not CD14+CD16+, peripheral blood monocytes in severe asthmatic patients. Clinical Immunology 130, 338–346


89

MOSSER, D. M. u. J. P. EDWARDS (2008): Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology 8, 958-969 MULLIGAN, F. J. u. M. L. DOHERTY (2008): Production diseases of the transition cow. The Veterinary Journal 176, 3-9 MURPHY, K., P. TRAVERS u. M. WALPORT (2009): Janeway's Immunobiology. Garland Science, Taylor & Francis Group NAU, G. J., J. F. L. RICHMOND, A. SCHLESINGER, E. G. JENNINGS, E. S. LANDER u. R. A. YOUNG (2002): Human macrophage activation programs induced by bacterial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences 99, 1503-1508 NEUVIANS, T. P. (2004): Involvement of Pro-Inflammatory Cytokines, Mediators of Inflammation, and Basic Fibroblast Growth Factor in Prostaglandin F2 -Induced Luteolysis in Bovine Corpus Luteum. BIOLOGY OF REPRODUCTION 70, 473-480 O'SHEA, J. J. u. P. J. MURRAY (2008): Cytokine Signaling Modules in Inflammatory Responses. Immunity 28, 477-487 OELSCHLAEGER, T. A. u. J. HACKER (2004): Impact of pathogenicity islands in bacterial diagnostics. APMIS 112, 930–936 OLIVEIRA, L. J., S. MCCLELLAN u. P. J. HANSEN (2010): Differentiation of the Endometrial Macrophage during Pregnancy in the Cow. PLoS ONE 5 PETZL, W., J. GUNTHER, T. PFISTER, C. SAUTER-LOUIS, L. GOETZE, S. VON AULOCK, A. HAFNER-MARX, H. J. SCHUBERTH, H. M. SEYFERT u. H. ZERBE (2011): Lipopolysaccharide pretreatment of the udder protects against experimental Escherichia coli mastitis. Innate Immunity 18, 467-477 PIECHOTTA, M., A. K. SANDER, J. P. KASTELIC, R. WILDE, M. HEPPELMANN, B. RUDOLPHI, H. J. SCHUBERTH, H. BOLLWEIN u. M. KASKE (2012): Short communication: Prepartum plasma insulin-like growth factor-I concentrations based on day of insemination are lower in cows developing postpartum diseases. Journal of Dairy Science 95, 1367-1370


90

RAINARD, P., A. FROMAGEAU, P. CUNHA u. F. B. GILBERT (2008): Staphylococcus aureuslipoteichoic acid triggers inflammation in the lactating bovine mammary gland. Veterinary Research 39, 52 REDELFS, S. (2011) Aktivierung boviner neutrophiler Granulozyten über die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2. Hannover, tierärztl. Hochsch., Diss REESE, T. A., H.-E. LIANG, A. M. TAGER, A. D. LUSTER, N. VAN ROOIJEN, D. VOEHRINGER u. R. M. LOCKSLEY (2007): Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with allergy. Nature 447, 92-96 REVELO, X. S. u. M. R. WALDRON (2010): Effects of in vitro insulin and 2,4-thiazolidinedione on the function of neutrophils harvested from blood of cows in different physiological states. Journal of Dairy Science 93, 3990-4005 RINALDI, M., P. MORONI, M. J. PAAPE u. D. D. BANNERMAN (2008): Differential alterations in the ability of bovine neutrophils to generate extracellular and intracellular reactive oxygen species during the periparturient period. The Veterinary Journal 178, 208-213 RIVAS, A. L., QUIMBY FW, COKSAYGAN O, ALBA A, ARINA A, ARROBAS MJ, GONZÁLEZ RN, MOHAMMED HO u. L. DH. (2001): Expression of CD3 and CD11b antigens on blood and mammary gland leukocytes and bacterial survival in milk of cows with experimentally induced Staphylococcus aureus mastitis. Am J Vet Res. 62, 1840-1851 ROSSI, D. u. A. ZLOTNIK (2000): The biology of chemokines and their receptors. Annu. Rev. Immunol. 18, 217-242 ROSSOL, M., S. KRAUS, M. PIERER, C. BAERWALD u. U. WAGNER (2012): The CD14brightCD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism 64, 671-677 RUIZ, S., A. H. HENSCHEN-EDMAN u. A. J. TENNER (1995): Localization of the Site on the Complement Component C1q Required for the Stimulation of Neutrophil Superoxide Production. Journal of Biological Chemistry 270, 30627-30634


91

SAMSON, M., LABBE O, MOLLEREAU C, VASSART G u. P. M. (1996): Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene. Biochemistry 35, 3362-3367 SAYEED, M. M. (2000): Exuberant Ca(2+) Signaling in Neutrophils: A Cause for Concern. News Physiol. Sci. 15, 130-136 SCHALL, T. J. (1991): Biology of the RANTES/SIS cytokine family. Cytokine 3, 165-183 SCHNORR, B., M. Kressin (2001): Embryologie der Haustiere. 4. Auflage, Enke Verlag SCHUKKEN, Y. H., J. GÜNTHER, J. FITZPATRICK, M. C. FONTAINE, L. GOETZE, O. HOLST, J. LEIGH, W. PETZL, H. J. SCHUBERTH, A. SIPKA, D. G. E. SMITH, R. QUESNELL, J. WATTS, R. YANCEY, H. ZERBE, A. GURJAR, R. N. ZADOKS u. H. M. SEYFERT (2011): Host-response patterns of intramammary infections in dairy cows. Veterinary Immunology and Immunopathology 144, 270-289 SHELDON, M., ANDREW N. RYCROFT, BELGIN DOGAN, MELANIE CRAVEN, JOHN J. BROMFIELD, ALYSSA CHANDLER, MARK H. ROBERTS, SIAN B. PRICE, ROBERT O. GILBERT u. K. W. SIMPSON (2010): Specific Strains of Escherichia coli Are Pathogenic for the Endometrium of Cattle and Cause Pelvic Inflammatory Disease in Cattle and Mice. PLoS One 5 SHELDON, M., J. CRONIN, L. GOETZE, G. DONOFRIO u. H. J. SCHUBERTH (2009): Defining Postpartum Uterine Disease and the Mechanisms of Infection and Immunity in the Female Reproductive Tract in Cattle. BIOLOGY OF REPRODUCTION 81, 1025-1032 SHELDON, M., JAMES G CRONIN, GARETH D HEALEY, CHRISTOPH GABLER, WOLFGANG HEUWIESER, DOMINIK STREYL, JOHN J BROMfiELD, AKIO MIYAMOTO, CHRYS FERGANI u. H. DOBSON (2014): Innate Immunity and inflammation of the bovine female reproductive tract in health and disease. Reproduction 148, 41-51


92

SHELDON, M., E. J. WILLIAMS, A. N. A. MILLER, D. M. NASH u. S. HERATH (2008): Uterine diseases in cattle after parturition. The Veterinary Journal 176, 115-121 SHPIGEL, N. Y., S. ELAZAR u. I. ROSENSHINE (2008): Mammary pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology 11, 60-65 SICA, A. u. A. MANTOVANI (2012): Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 SILVA, E., S. LEITÃO, T. TENREIRO, C. POMBA, T. NUNES, L. LOPES DA COSTA u. L. MATEUS (2009): Genomic and phenotypic characterization of Escherichia coli isolates recovered from the uterus of puerperal dairy cows. Journal of Dairy Science 92, 6000-6010 SKRZECZYÑSKA, J., KOBYLARZ K, HARTWICH Z, ZEMBALA M u. P. J. (2002): CD14+CD16+ monocytes in the course of sepsis in neonates and small children: monitoring and functional studies. Scand J Immunol. 55, 629-638 SONG, C., A. KUMAR u. M. SALEH (2009): Bioinformatic Comparison of Bacterial Secretomes. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 7, 37-46 SORDILLO, L. M. u. K. L. STREICHER (2002): Mammary gland immunity and mastitis susceptibility. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 7, 135-146 STER, C., M. C. LOISELLE u. P. LACASSE (2012): Effect of postcalving serum nonesterified fatty acids concentration on the functionality of bovine immune cells. Journal of Dairy Science 95, 708-717 STERNBERG, E. M. (2006): Neural regulation of innate immunity: a coordinated nonspecific host response to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 6, 318–328 STIJLEMANS, B., A. VANKRUNKELSVEN, G. CALJON, V. BOCKSTAL, M. GUILLIAMS, A. BESCHIN, G. RAES, S. MAGEZ u. P. DE BAETSELIER (2010): The central Role of Macrophages in Trypanosomiasis-Associated Anemia: Rationale for Therapeutical Approaches Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 10, 71-82


93

SULAHIAN, T. H. (2004): Cross-linking of Fc R triggers shedding of the hemoglobin-haptoglobin scavenger receptor CD163. Journal of Leukocyte Biology 76, 271-277 SUOJALA, L., T. POHJANVIRTA, H. SIMOJOKI, A.-L. MYLLYNIEMI, A. PITKÄLÄ, S. PELKONEN u. S. PYÖRÄLÄ (2011): Phylogeny, virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated in clinical bovine mastitis. Veterinary Microbiology 147, 383-388 TAUBERT, A. u. C. HERMOSILLA (2007): Bovine recombinant IFNgamma induces endothelial cell gene transcription of immunoregulatory molecules and upregulates PMN and PBMC adhesion on bovine endothelial cells. Vet. Res. Commun. 32, 35-47 TJALSMA, H., ALBERT BOLHUIS, JAN D. H. JONGBLOED, SIERD BRON u. J. M. V. DIJL (2000): Signal Peptide-Dependent Protein Transport in Bacillus subtilis: a Genome-Based Survey of the Secretome. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS 64, 515–547 VAINER, B., KASPER LAMBERTH, JENS BRIMNES, O. H. N. AND u. M. H. CLAE¨SSON (2003): Ca2+ response in neutrophils after exposure to bacterial N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine: delayed response in ulcerative colitis. European Journal of Gastroenterology & Hepatology 15, 267–273 VILLATA, F., YUAN ZHANG, KARTZ E. BIBB, JOHN C. KAPPES u. M. F. LIMA (1998): The cysteine-cysteine family of chemokines RANTES, MIP-1alpha, and MIP-1beta induce Trypanocidal Activity in Human Macrophages via Nitric Oxide. INFECTION AND IMMUNITY 66, 4690–4695 VOGL, T., K. TENBROCK, S. LUDWIG, N. LEUKERT, C. EHRHARDT, M. A. D. VAN ZOELEN, W. NACKEN, D. FOELL, T. VAN DER POLL, C. SORG u. J. ROTH (2007): Mrp8 and Mrp14 are endogenous activators of Toll-like receptor 4, promoting lethal, endotoxin-induced shock. Nature Medicine 13, 1042-1049 WAN, H., M. A. VERSNEL, W. Y. CHEUNG, P. J. M. LEENEN, N. A. KHAN, R. BENNER u. R. C. M. KIEKENS (2007): Chorionic gonadotropin can enhance innate immunity by stimulating macrophage function. Journal of Leukocyte Biology 82, 926-933


94

WERLING, D., J.C. HOWARD, E. NIEDERER, O.C. STRAUB, A. SAALMULLER u. W. LANGHANS (1998): Analysis of the phenotype and phagocytic activity of monocytes/ macrophages from cattle infected with the bovine leukaemia virus. Veterinary Immunology and Immunopathology 62, 185-195 WILLIAMS, E. J., D. P. FISCHER, D. E. NOAKES, G. C. W. ENGLAND, A. RYCROFT, H. DOBSON u. I. M. SHELDON (2007): The relationship between uterine pathogen growth density and ovarian function in the postpartum dairy cow. Theriogenology 68, 549-559 WILLIAMS, E. J., D. P. FISCHER, D. U. PFEIFFER, G. C. W. ENGLAND, D. E. NOAKES, H. DOBSON u. I. M. SHELDON (2005): Clinical evaluation of postpartum vaginal mucus reflects uterine bacterial infection and the immune response in cattle. Theriogenology 63, 102-117 WILSON, M. S., M. M. MENTINK-KANE, J. T. PESCE, T. R. RAMALINGAM, R. THOMPSON u. T. A. WYNN (2006): Immunopathology of schistosomiasis. Immunology and Cell Biology 85, 148-154 WONG, K. L., W. H. YEAP, J. J. Y. TAI, S. M. ONG, T. M. DANG u. S. C. WONG (2012): The three human monocyte subsets: implications for health and disease. Immunologic Research 53, 41-57 YAMAMOTO, M., SHINTARO SATO, HIROAKI HEMMI, KATSUAKI HOSHINO, TSUNEYASU KAISHO, HIDEKI SANJO, OSAMU TAKEUCHI, MASANAKA SUGIYAMA, MASARU OKABE, KIYOSHI TAKEDA u. S. AKIRA (2003): Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science 301, 640-643 YANG, W., H. ZERBE, W. PETZL, R. M. BRUNNER, J. GÜNTHER, C. DRAING, S. VON AULOCK, H. J. SCHUBERTH u. H. M. SEYFERT (2007): Bovine TLR2 and TLR4 properly transduce signals from Staphylococcus aureus and E. coli, but S. aureus fails to both activate NF-kappaB in mammary epithelial cells and to quickly induce TNFalpha and interleukin-8 (CXCL8) expression in the udder. Mol. Immunol. 45, 1385-1397 YE, P., KAZANJIAN P, KUNKEL SL u. K. DE. (2004): Lack of good correlation of serum CC-chemokine levels with human immunodeficiency virus-1 disease stage and response to treatment. J Lab Clin Med. 143, 310-319


95

ZERBE, H. u. P. SCHEIBL (2000): Influence of progesterone on the immune system in consideration of the bovine placental retention. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107, 221-227 ZHANG, J.-Y., Z.-S. ZOU, A. HUANG, Z. ZHANG, J.-L. FU, X.-S. XU, L.-M. CHEN, B.-S. LI u. F.-S. WANG (2011): Hyper-Activated Pro-Inflammatory CD16+ Monocytes Correlate with the Severity of Liver Injury and Fibrosis in Patients with Chronic Hepatitis B. Plos One 6 ZIEGLER-HEITBROCK, L., P. ANCUTA, S. CROWE, M. DALOD, V. GRAU, D. N. HART, P. J. M. LEENEN, Y. J. LIU, G. MACPHERSON, G. J. RANDOLPH, J. SCHERBERICH, J. SCHMITZ, K. SHORTMAN, S. SOZZANI, H. STROBL, M. ZEMBALA, J. M. AUSTYN u. M. B. LUTZ (2010): Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood 116, 74-80

Anhang

96

9 Anhang

9.1 Geräte

A. dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage „Typ RO 50/14SMB Typ I“

(Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel)

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“

(Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel)

Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden)

Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060

(Heraeus, Hanau)

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung

(Wartewig, Göttingen)

Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen)

Experion Automated Electrophoresis System

(BioRad Laboratories GmbH, München)

Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell Accuri C6, mit angeschlossenem Computer

(BD Biosciences, Heidelberg)

Heissluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau)

Kühlschrank mit Gefrierfach (-20 °C) (Einzelhandel)

Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeits-aufsatz und Mikrotiterplattenrotor

(Heraeus Instruments, Osterode)

Laborfeinwaage „TE 1249“ (Sartorius GmbH, Göttingen)

Laborwaage „BL 310“ (Sartorius GmbH, Göttingen)

MACS ® MultiStand Metallständer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen)

MIDI MACSTM Separations-Einheit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Minishaker MS2 (IKA, Staufen)

Minizentrifuge (National Labnet CO., Woodbrige, NJ, USA)

Optima™ LE-80K Ultracentrifuge (Beckman Coulter, Krefeld)

Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer, Tuttlingen)

Pipette, einstellbar „Transferpette ®“ (2-20 µL)

(Brand, Wertheim)

Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL, 10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL)

(Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)

Pipettierhilfe „accu-jet ® “ (Brand, Wertheim)

Anhang

97

Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel)

Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJII KS) (Heraeus-Christ. Osterode)

QUADRO MACS Separationseinheit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau)

Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“

(Dynatec, Zug/Schweiz)

StepOnePlus ® Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt)

Tiefkühltruhe -80 °C (Thermo Scientific, Osterode)

Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor

(Wifug, Bradford/England)

Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Hermle, Gosheim)

Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim)

Zentrifuge Espresso Personal Microzentrifuge

(Thermo Scientific, Osterode)

Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Heraeus Instruments, Osterode)

Zentrifuge Multifuge 1 S-R (Thermo Scientific, Osterode)

9.2 Material

9.2.1 Klinikbedarf

Heidelberger Extension, Verlängerungen (Fresenius Kabi AG, Bad Homburg)

Kanülen 1,20 x 40 mm, steril, „Hypodermic Needle“

(Henry Schein, Hamburg)

Staukette nach Witte (Eickemeyer, Tuttlingen)

Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson, Heidelberg)

Vacutainer ® System, Halter (Becton Dickinson, Heidelberg)

Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU)

(Becton Dickinson, Heidelberg)

9.2.2 Laborbedarf

Abdeckung für PCR-Platten optical adhesive covers

(Applied Biosystems, Darmstadt)

Combitips, 1,25 ml (Eppendorf, Hamburg)

Combitips, 2,5 ml (Eppendorf, Hamburg)

Einmal-Filter, Celluloseacetate Membrane, 0,2 µm, steril

(Renner, Dannstadt)

Entsorgungsbeutel (Brand Wertheim)

Anhang

98

Eppendorf-Reaktionsgefäß, 0,5 ml (Sarstedt, Nürnbrecht)

Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 ml (Greiner, Frickenhausen)

Experion TM RNA StdSens und HighSens Chips


Flachboden Zellkulturplatten mit Abdeckung, steril, 24 Vertiefungen

(Greiner bio-one, Frickenhausen)

Flachboden Zellkulturplatten mit Abdeckung, steril, 12 Vertiefungen

(costar, USA)

Laborflaschen mit Gewinde, 500 mL (VWR International, Hannover)

MACS Pre-Separation Filters (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

MACS Säulen LS Columns (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Parafilm (Americancan Company, USA)

PCR-Platten Micro Amp TM Fast 96-Well plate

(Applied Biosystems, Darmstadt)

PCR-Reaktionsgefäß, 0,2 mL (Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf)

Pipettenspitzen 200 und 1000 µL (Sarstedt , Frickenhausen)

Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL

(Becton Dickinson, Heidelberg)

Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen

(Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz)

Saugpipetten, 10 mL (Sarstedt, Nürnbrecht)

Zentrifugenröhrchen, 15 mL aus Polypropylen, steril

(Sarstedt, Nürmbrecht)

Zentrifugenröhrchen, 50 mL aus Polypropylen (Falcons), steril

(Corning, Wiesbaden)

9.2.3 Reagenzien

β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Albumin Fraktion V, bovine, pulv. 98 % (Roth, Karlsruhe)

Bovines Serumalbumin (BSA) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) (Promega, Mannheim)

Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

EDTA (Ethylendiamine-Tetraacetic Acid) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Ethanol 641, absolut, vergällt (CG Chemikalien, Laatzen)

Anhang

99

Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Experion TM RNA StdSens Reagents and Supplies für 10 Chips


Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Mykoplasmen getestet

(Biochrom, Berlin)

Fluo 4 Acetoxymethyl Ester Calcium Indikator

(Invitrogen, Karlsruhe)

Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Formaldehyd 37 %, p.a., ACS, Rotiuran® (Roth, Karlsruhe)

HBSS (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Ionomycin (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Isocove® DMEM mit L-Glutamin (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Kaliumchlorid (KCl), kristallin (Biochrom, Berlin)

Lipopolysaccharid (LPS), E. coli 0111:B4 (Invitrogen, Karlsruhe)

Lymphozytenseparationsmedium (PAA Laboratories, Linz/Österreich)

MultiSort Stop Reagent 2 (Miltenyi Biotec)

MultiSort Release Reagent (Miltenyi Biotec)

Natriumazid (NaN3), 10 %ig (Sigma-Aldrich, Steinheim)

Natriumchlorid (NaCl) (Roth, Karlsruhe)

Oligo (dt) 12-18 Primer (Invitrogen, Karlsruhe)

Propidiumjodid (PJ) (Calbiochem, Bad Soden)

QIAshredder QIAGEN, Hilden

Random primers (Invitrogen, Karlsruhe)

rekombinantes bovines CCL-5 (Kingfisher, USA)

RLT-Puffer (QIAGEN GmbH, Hilden)

RNeasy® Plus Micro Kit (QIAGEN GmbH, Hilden)

RNaseOUTTM Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, Karlsruhe)

RNase/DNase-freies Wasser (Sigma-Aldrich, Steinheim)

RNase-Free DNase Set (QIAGEN GmbH, Hilden)

RPE-Puffer (QIAGEN GmbH, Hilden)

RPMI 1640 mit L-Glutamine und NaHCO3 (Sigma-Aldrich, Steinheim)

RW1-Puffer (QIAGEN GmbH, Hilden)

SuperScriptTM II Reverse Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe)

SYBR Green® PCR Master Mix (Appiled Biosystems, Darmstadt)

Anhang

100

9.2.4 Antikörper

9.2.4.1 Antikörper für die Membranimmunfluoreszenz

Tabelle 9-1: Monoklonale Primärantikörper für die M embranimmunfluoreszenz.

Bezeichnung Hersteller Spezifität 1 Donor/Isotyp Verdünnung (v/v) 2

CD172a-RPE-Cy-5

AbD Serotec boCD172a Mouse/IgG2b 1:50

CD163-RPE AbD Serotec poCD163 Mouse/IgG1 1:50

CD14-RPE AbD Serotec huCD14 Mouse/IgG2a 1:50

CD16-FITC AbD Serotec huCD16 Mouse/IgG2a 1:40

MHCII-PE AbD Serotec boMHCII Mouse/IgG2a 1:40

CD11b-FITC AbD Serotec boCD11b Mouse/IgG 1:50 1) bo: bovin; hu: human; po: porzin; 2) in MIF-Puffer

9.2.4.2 Antikörper für die magnetische Zellseparati on

Tabelle 9-2: Antikörper für die magnetische Zellsep aration

Bezeichnung Hersteller Spezifität 1 Donor/Isotyp Verdünnung (v/v) 2

Anti-FITC MultiSort MicroBeads

Miltenyi Biotec FITC Mouse/IgG1 1:10

Anti-Mouse IgG MicroBeads

Miltenyi Biotec muIgG Ziege/F(ab`)2 Fragmente

1:10

CD14 MicroBeads

Miltenyi Biotec huCD14 Mouse/IgG2a 1:10

1) hu: human; mu: murin; 2) in MIF-Puffer

9.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen

Für die Kultivierung von Leukozyten wurden das Medium Isocove® (9.2.3) verwendet. Zum Ausschluss von Komplementaktivität und um eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, 9.2.3) bei 56 °C für eine Stunde inkubiert. Ein mit Penicillin/Streptomycin versetztes Medium wurde mit einem hochgestellten ‚+‘ gekennzeichnet.

Anhang

101

I10F+ (Isocove®-Medium mit 10 Vol% fetalem Kälberserum)

Iscove® DMEM mit L-Glutamin

500 mL

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert)

50 mL

Penicillin-Streptomycin 500 µL Lymphozytenseparationsmedium

Bei Lymphozytenseparationsmedium (9.2.3) handelt es sich um eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdiatrizoat und einenm hochmolekularen Zucker mit Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10 °C besitzt das Separations-medium eine Dichte von 1,077 g/mL.

Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)

Zur Herstellung der Lösung wurden folgende Chemikalien miteinander vermischt:

NaCl 8 g

KCl 1,24 g

Na2HPO4 0,2 g

KH2PO4 0,2 g

A. tridest. ad 1000 mL

Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4 und wurde bei 4 °C gelagert.

Doppelt konzentrierte Phosphat-gepufferte Salzlösun g (2x PBS)

NaCl 16 g

KCl 2,48 g

Na2HPO4 0,4 g

KH2PO4 0,4 g

A. tridest. ad 1000 mL PBS-EDTA

BSA 5 g

EDTA-Stammlösung 4 mL

PBS ad 1000 mL

Nach vollständiger Lösung der Chemikalien wurde die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter steril filtriert.

Anhang

102

PBS-PJ

Propidiumjodid 2,0 mg

NaN3 0,05 g

PBS ad 500 mL Die Stammlösung mit 100 µg Propidiumjodid/mL Trägerflüssigkeit wurde in aliquotierten Teilen (1 mL) bei -20 °C gelagert. MIF-Puffer

BSA 2,5 g

NaN3 0,05 g

PBS ad 500 mL

Die Lagerung erfolgte bei 4 °C.

Lysepuffer

Mercaptoethanol 10 µL

RLT-Puffer ad 1000 µL

9.2.6 Genspezifische Primer für die qPCR

Tabelle 9-3 Genspezifische Primer für die qPCR

Gen Primer und verwendete Konzentrationen (nm/L)

Länge des Amplikons (bp)

Referenz

IL1B for TTCTCTCCAGCCAACCTTCATT rev ATCTGCAGCTGGATGTTTCCAT

198 (NEUVIANS 2004)

IL10 for CCTTGTCGGAAATGATCCAGTTTT rev TCAGGCCCGTGGTTCTCA

67 (ALMEIDA et al. 2007)

CXCL1 for CGCCTGTGGTCAACGAACT rev CACCTTCACGCTCTGGATGTT

83 (TAUBERT u. HERMOSILLA 2007)

CXCL8 for CCTCTTGTTCAATATGACTTCCA rev GGCCCACTCTCAATAACTCTC

170 (YANG et al. 2007)

NOS2 for GAGATAGAAACAACAGGAACCTAC rev AGGCCTGCTTGGTGGCGAA

70 (MIRKOVITCH et al. 2006)

UXT for AACTTCTTCGTTGACACAGTGG rev CTGTGAGGAGACTGCTCTTACG

130 NM_ 00103747121

For (Vorwärts-) und rev (Rückwärts-) Primer; Primer von Eurofins MWG Operon, Ebersberg, 1) Accession-Nummer der Nukleotid-Sequenz der NCBI-Gen-Datenbank, Primer wurde selbst generiert

Anhang

103

9.3 Verzeichnis der verwendeten Abbildungen

Abbildung 3-1: Strategie zur Messung der Membranimmunfluoreszenz boviner Tag-4-Makrophagen. ............................................................. 25

Abbildung 3-2: Messung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies boviner Tag-4-Makrophagen. .......................................................................... 27

Abbildung 3-3: Strategie zur Auswertung der intrazellulären Kalziummessung. ............................................................................... 29

Abbildung 3-4: Amplifikationsplot und Schmelzkurve einer qPCR. ............................ 32

Abbildung 3-5: Regressionsgerade einer Standardreihe in der qrtPCR ..................... 34

Abbildung 4-1: Ca2+-Einstrom induzierender Einfluss von Stromazellüberständen auf Makrophagen. ........................................ 37

Abbildung 4-2: Auslösung eines Kalziumeinstroms in Monozyten durch Überstände uteriner Epithel-Zellkulturen. ........................................... 38

Abbildung 4-3: Ca2+ Einstrom in Monozyten, ausgelöst von Überständen verschiedener E.-coli-Isolate. ............................................................. 39

Abbildung 4-4: Einfluss von uterinen Stromazell-Kulturüberständen auf die Expression von Makrophagen-Oberflächenmolekülen. ...................... 41

Abbildung 4-5: Basale und induzierte ROS-Bildung von Stromazell-Überstand-gereiften Makrophagen. .................................. 42

Abbildung 4-6: Expression verschiedener Zelloberflächenmoleküle auf in-vitro-differenzierten Makrophagen. ................................................. 44

Abbildung 4-7: Expression von CD16 auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere. ......................................... 45

Abbildung 4-8: Expression von MHC-Klasse-II auf in vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere. ......................................... 46

Abbildung 4-9: Expression von CD11b auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere. ......................................... 47

Anhang

104

Abbildung 4-10: Expression von CD163 auf in-vitro-differenzierten Makrophagen in Abhängigkeit vom Blutentnahmezeitpunkt und dem Body Condition Score der Tiere. ......................................... 48

Abbildung 4-11: Basale und induzierbare ROS-Produktion von Makrophagen, die unter dem Einfluss von E.-coli-Überständen in-vitro-differenziert wurden. .............................. 49

Abbildung 4-12: Relative Genexpression in-vitro-differenzierter, unter LPS sowie unter dem Überstand eines Uterus-E.coli-Isolates gereifter Makrophagen. ...................................................................... 51

Abbildung 4-13: Relative Genexpression in-vitro-differenzierter, CCL5-gereifter Tag-4-Makrophagen. ................................................. 52

Abbildung 4-14: Relative Expressionsstärke von Zelloberflächenmolekülen auf Tag-4-MdM in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt der Monozyten in der Transitperiode. ................................................. 53

Abbildung 4-15 Relative Expressionsstärke von Zelloberflächenmolekülen auf MdM in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt und der Anzahl der Laktationen der Spenderkühe. ......................................... 54

Abbildung 4-16: Relative Expressionsstärke von Zelloberflächenmolekülen auf stimulierten MdM in Abhängigkeit vom Gesundheitsstatus der Spendertiere. ................................................. 55

Abbildung 4-17: Induzierbare ROS-Bildungskapazität von Makrophagen, die an verschiedenen Tagen der Transitperiode von Tieren mit hohem und niedrigem Body Condition Score in vitro generiert wurden. ............................................................................... 57

Abbildung 4-18: ROS-Bildungskapazität von Makrophagen erstlaktierender und mehrfachlaktierender Kühe im Vergleich. ................................... 58

Anhang

105

9.4 Verzeichnis der verwendeten Tabellen

Tabelle 3-1: Überstände von E.-coli-Isolaten aus dem Uterus. .............................. 23

Tabelle 3-2: Überstände von E.-coli-Isolaten aus der Milchdrüse. ......................... 23

Tabelle 3-3: Überstände von E.-coli-Isolaten unterschiedlicher Herkunft1 ............. 24

Tabelle 3-4: Mastermix für das Umschreiben von RNA in cDNA mithilfe der SuperScriptTM II Reverse Transkriptase. .................................... 31

Tabelle 3-5: Mastermix für IL1B, CXCL1................................................................ 33

Tabelle 3-6: Mastermix für CXCL8, UXT, NOS2 .................................................... 33

Tabelle 4-1: Tierspezifische Unterschiede in der Reaktion auf verschiedene E.-coli-Überstände. ...................................................... 40

Tabelle 9-1: Monoklonale Primärantikörper für die Membranimmunfluoreszenz. .............................................................. 100

Tabelle 9-2: Antikörper für die magnetische Zellseparation ................................... 100

Tabelle 9-3 Genspezifische Primer für die qPCR .................................................. 102

Anhang

106

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth für die Bereitstellung des Themas und die tolle Betreuung bedanken. Danke für Ihren Optimismus und Ihre Motivation und dass Sie es mir ermöglicht haben, meine Dissertation trotz Arbeitsbeginn zu beenden. Ihre schnellen und positiven Rückmeldungen haben mich immer sehr gefreut und motiviert.

Weiterhin bedanke ich mich bei meiner anfänglichen Betreuerin Dr. Anna Düvel für die Einführung in das Thema und die Unterstützung und Hilfestellung. Vielen Dank auch an die Betreuer Dr. Jamal Hussen und Dr. Mirja Koy. Danke, dass ich bei Fragen und Problemen zu Euch kommen konnte und Eure Unterstützung erhielt.

Mein besonderer Dank gilt auch den Mitarbeitern der Immunologie: Silke Schöneberg, Udo Rabe, Sonja Kordex und Jutta Parker. Danke für Eure große Hilfsbereitschaft im Labor und im Büro.

Es hat immer Spaß gemacht in der lockeren und familiären Atmosphäre der Arbeitsgruppe Immunologie zu arbeiten und dafür seid Ihr im Wesentlichen verantwortlich. „Frühstück in der Immuno“ wird mir immer fehlen und ich denke, Amelie geht es genauso.

Bei der Blutentnahme in Braunschweig wurden wir tatkräftig unterstützt von den Mitarbeitern und Doktoranden des Friedrich-Loeffler-Institutes, Braunschweig, wofür ich mich recht herzlich bedanken möchte. Danke auch an Melanie Eger für die vielen gemeinsamen Stunden im Labor und den großen Überblick über Neuigkeiten bezüglich der Versuchstiergruppe.

Auch bei der Abteilung Milchhygiene des Institutes für Lebensmittelqualität und -sicherheit und bei dem Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie bei dem Institute of Infection, Immunity and Inflammation der University of Glasgow möchte ich mich für die Aufarbeitung und Bereitstellung von Probenmaterial bedanken.

Danke an Janine und Desiree für die schöne Anfangszeit und für Eure anhaltende Freundschaft. Und ein ganz besonderes Dankeschön an meine liebe Johanna für die schöne Zeit! Durch Dich wurden auch die nicht so guten Tage noch zu guten Tagen.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern Birgit und Hajo für die bedingungslose Unterstützung in allem, was ich tue. Danke, dass Ihr immer für mich da seid, immer ein offenes Ohr für meine Probleme habt und mich tatkräftig bei meinen Tieren unterstützt. Meiner lieben Oma Greta danke ich neben so vielem anderen für unsere netten Gespräche und die zahlreichen Mittagessen während der Tage am

Anhang

107

Schreibtisch. Danke an Kathi und Philip, dass ich immer bei Euch wohnen durfte und danke an Chrissi für die tatkräftige Hilfe bei Deinen Besuchen. Auch bedanken möchte ich mich bei der netten Dorfgemeinschaft Breitenwiesen-Mitte, also Petra und Stefan, für die Versorgung der Tiere während meiner Abwesenheit.

Zu guter Letzt möchte ich meinem Mann Moritz danken, für die anhaltende Motivation und die intensive Korrektur meiner Arbeit. Dein Verständnis, Deine Unterstützung und Deine Liebe vollenden mein Glück.

einfluss von zell- und bakterienkulturüberständen auf die ... · metritis, endometritis oder...

Documents