ein beitrag zur komplettierung der ballaststoffanalyse

Ein Beitrag zur Komplettierung der Ballaststoffanalyse:Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss resistenter Stärke in der enzymatisch-gravimetrischenBallaststoffanalyse

H. Themeier, J. Hollmann, U. Neese and M.G. Lindhauer

Institut für Sicherheit und Qualität bei Getreide

Gliederung

1. Resistente Stärke als Teil des Ballaststoffkomplexes

2. Resistente Stärke als analytisches Problem in enzymatischen Bestimmungsmethoden

3. Lösungsansätze zur Komplettierung der Ballaststoffanalytik - MikrowelleninduzierterDruckaufschluss

4. Ergebnisse und Diskussion

1. Der “Ballaststoffkomplex“

Resistente Stärke als Teil des Ballaststoffkomplexes

DeklarierungResistente Stärke/Ballaststoffe

Definition

Entwicklung

Deutung

Bestimmung

Analytik(in vitro)

PhysiologischeAspekte (in vivo)

O

OHH

HH

OHOH

H OH

H

OH

FunktionelleLebensmittel

Übersicht unterschiedlicher Ballaststoffquellen

Pflanzenzellwände CelluloseHemicellulose(Proto)-Pektine Nichtstärkepolysaccharide

Reservekohlenhydrate GalactomannaneFructane

Resistente Stärke

Pflanzenexsudate/ Gummi ArabicumSchleimstoffe Tragant, Tamarind Nichtstärkepolysaccharide

Mikrobielle PS Xanthan, Dextran

Synthetische PS/ CellulosederivateDerivate Stärkederivate Zusatzstoffe

AmidpektineSynthetische Oligosacch.

Gerüststoff Lignin Nichtkohlenhydrate ___________________________________________________________________________________Assoziierte Wachse, Lipide, SilikateBegleitstoffe

Definition von Ballaststoffen I:

Physiologisch - biologische Definition

TROWELL et. al (1976)

Ballaststoffe bestehen aus den Rückständen pflanzlicherZellwandbestandteile, Polysaccharide, Lignin und assoziierter Substanzen, die vom menschlichen Verdauungssystem (Magen/ Dünndarm) nicht hydrolysiert werden.

Definition von Ballaststoffen II:

Analytische Definition

Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren LFGB §64 (LMBG §35) Methode 00.0018

Unter dem Ballaststoffgehalt [...] wird der nach dem hier beschriebenen Verfahren ermittelte Anteil an organischen Bestandteilen verstanden, der von den eingesetztenEnzymen unter den Bedingungen der Analyse nichthydrolysiert wird. [...] Es handelt sich dabei vor allem um lösliche und unlösliche Nichtstärke-Polysaccharide(Cellulose, Hemicellulose, Pektinstoffe, Hydrokolloide) sowie Resistente Stärke und Lignin.

Das Phänomen Resistente Stärke

RS Typ I Physikalisch nicht zugängliche Stärke (teilvermahlte Körner und Pflanzenbestandteilen)

RS Typ II Native, granuläre Stärke mit hoher Kristallinität/Polymorphtyp B dominierend(Bananen, Erbsen, hochamylotische Maisstärke)

RS Typ III Durch Retrogradation (verkleisterter Stärke) generiertes partielles hochkristallines Netzwerk (gekochte Bohnen, Erbsen, altbackenes Brot)

RS Typ IV Thermisch oder chemisch modifizierte Stärken(z.B. Hydroxypropylstärken))

Partikelgrößen-verteilung

Kornschädigung

RS inAOAC 991.43

Amylose/Amylopektin

KristallinerStrukturtyp

Molekularmassen-verteilung

physikalischeIsolierung/Wandeffekte

Enzymatische/Hemmeffekte

Isolierungs- /Verarbeitungs-bedingungen

Einflußfaktoren für das Vorliegen Resistenter Stärke innerhalb enzymatischer Abbaureaktionen

Einfluß des Amylosegehaltes auf RS Type II (AOAC 2002.02)von Erbsenstärken

R2 = 0,9406

0

5

10

15

20

25

20 30 40 50 60 70 80Amylosegehalt [%]

Res

iste

nte

Stä

rke

[%]

SEM / Polarisationsmikroskopische Aufnahmen Erbsenstärke

Morphologische Daten: Erbsenstärke

Amylose: 30 - 34 %

Stärke-schädigung: << 1%

Polymorph- 60 - 80 % A-Type Typ: 20 - 40 % B-Type

Median Partikelgröße: 21 - 22 μm

Verkleisterungs-enthalpie: 11 - 12 J g-1

Resistente Stärke: 11,4%

Hochkristalline Bereiche granulärer Stärken oder Rekristallisations-Effekte retrogradierter Stärken sind hauptverantwortlich für RS-Phänomene

Niedrigamylotische Erbsenstärke mit erhöhtem Anteil resistenter Stärke

SEM / Polarisationsmikroskopische Aufnahmen Erbsenstärke

Morphologische Daten: Erbsenstärke

Amylose: 20.7 %

Stärke-schädigung: << 1 %

Polymorph 80 % A-Type Typ 20 % B-Type

Median Partikelgröße: 16.1 μm

Verkleisterungs-enthalpie: 13.4 J g-1

Resistente Stärke 16,4 %

2. Resistente Stärke ein analytisches Problem ?

Einfluß des Amylosegehaltes auf erfassbare RS-Anteile in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse(AOAC 991.43) von Erbsenstärke

R2 = 0,9419

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50 60 70 80Amylosegehalt [%]

TDF

[% ]

aus

RS

-Fra

ktio

n

AOAC 985.29991.43

Native Stärke

AmyloseAmylopectin

Lipide < 1.0%Protein < 0.8 %Asche <0.3%

von:WeizenReisMaisErbse

DMSO.Aufschluss

Alpha-amylase95°C/ 6 min

Amylo-glucosidase50°C / 30 min

Glukose-bestimmungabbaubarerStärkefraktionen

Alpha-amylase/Amylo-glucosidase37°C/ 16 h

GlukosebestimmungnichtabbaubarerStärkefraktionenrnachKOH-Aufschluß

Alpha-amylase95°C / 6 min



Alpha-amylase95°C / 35min

Amyloglucosidase60°C / 30 min

Ethanol FällungGravimetrische Bestimmung

Teil nativer Stärke Teil nativer Stärke Teil “Total starch“ Teil Resistantstarch

AOAC 996.11 AOAC 996.11 AOAC 2002.02

“Resistant starch““Enzyme solublestarch““Total starch“Kommerziell/

isolierte Stärke “Dietary starch“ ?> > > >

Folge des Phänomens “Resistente Stärke“ in analytischen Bestimmungsmethoden unter Verwendung AA/AMG

Die Sonderrolle der resistenten Stärke (RS)in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analytik

In allen Probenmaterialien bei denen RS nicht als Minorkomponente vorkommt, läßt sich mit enzymatisch -gravimetrischen Bestimmungsmethoden kein exakter Ballaststoffgehalt quantifizieren, da die RS hierbeinur partiell miterfasst wird.

Eine Quantifizierung und Ausweisung der RS durch Separatbestimmungsmethoden ist zwar möglich, aber der enzymatisch-gravimetrisch ermittelte Ballaststoffgehaltläßt sich nicht inkremental korrigieren.

Vergleich ermittelter RS-Gehalte (AOAC 2002.02) mit Werten der enzymatisch-gravimetrischenTDF-Analyse (AOAC 991.43/Standard) von niedrig-amylotischen Stärken

Stärkeart Starch[%]

Protein[%]

MS[%]

Amylose[%]

RS[%]

TDF[%]

Mais 98.6 0.25 0.05 7.6 0.5 1.5

Mais 97.8 0.33 0.10 32.3 0.7 1.7

Weizen 99.6 n.d. n.d. 30.2 0.3 0.2

Weizen 95.6 (97.8) 0.39 0.18 33.7 0.2 1.0

Reis 99.5 n.d. n.d. 31.1 0.2 0.3

Erbse 94.5 (97.8) 0.22 0.05 31.8 11.2 2.7

Erbse 92.0 (97.6) 0.24 0.03 30.1 11.4 1.6

Vergleich ermittelter RS-Gehalte (AOAC 2002.02) mit Werten der enzymatisch-gravimetrischenTDF-Analyse (AOAC 991.43/Standard) von hoch-amylotischen Stärken

Stärkeart Stärke[%]

Protein[%]

MS[%]

Amylose[%]

RS[%]

TDF[%]

Erbse 95.4 0.50 0.16 62.5 18.7 12.0

Erbse 95.5 0.43 0.12 62.5 18.0 11.6

Erbse 97.4 0.67 0.25 70.6 18.4 12.8

Mais 99.0 0.73 0.13 66.5 54.4 17.2

Mais 95.4 0.75 0.09 65.8 49.1 17.5

3. Lösungsansätze

?ProbeRS + TDF

Vollständige Mitterfassungder RS innerhalb derTDF-Methode AOAC 991.43

Vollständige Eliminierung der RSInnerhalb der TDF-MethodeAOAC 991.43

Änderung der Inkubations-bedingungen entsprechendden physiologischen Be-dingungen der RS-BestimmungAOAC 2002.02

DMSO-AufschlussMcCleary, Rossiter 2004

Lösungsansätze zur Komplettierung der enzymatisch-gravimetrischen BallaststoffanalytikMethode AOAC 991.43 (985.29)

KOH-Aufschluss

Mikrowellenaufschluss ?

Stärkebereiche mit kristallinen Strukturen (Bsp. Polymorphtyp B und V)

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss

Lassen sich enzymresistente hochkristalline Bereiche in Stärken effektiv durch Mikrowellenbestrahlung destrukturieren und somit einem vollständigen enzymatischen Abbau zugänglich machen?

Vollständiger enzymatischer Abbau kolloidal gelöster amorpher Stärkeanteile

Mikrowellenstrahlung

Mikrowellengerät MW 3000 Landgraf Laborsysteme

Techische Daten:

Leistung max. 600 Watt

Strahlungsfrequenz 2450 MHz

Variable Parameter:

Strahlungsleistung

Strahlungszeit

Aufschlußgefäße

MengenverhältnisseKühler zur Verhinderung unerwünschter Rückreflexionen

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischen Stärkebestimmung (AOAC 996.11)

Lassen sich resistente Stärkefraktionen überhaupt komplett via Mikrowellentechnik aufschließen?

Aufgeschlossene hochamylotischeMaisstärkefraktion ?

Bola-Hydrolysier- und Aufschlussgefäß A 240

Fluor-Kunststoff PTFEV = 100 mlBerstscheibe < 20 bar

AOAC 985.29991.43

Native Stärke

AmyloseAmylopectin

Lipide < 1.0%Protein < 0.8 %Asche <0.3%

von:WeizenReisMaisErbse

DMSO.Aufschluss

Alpha-amylase95°C/ 6 min



Alpha-amylase/Amylo-glucosidase37°C/ 16 h

GlukosebestimmungnichtabbaubarerStärkefraktionenrnachKOH-Aufschluß

Alpha-amylase95°C / 6 min



Alpha-amylase95°C / 35min

Amyloglucosidase60°C / 30 min

Ethanol FällungGravimetrische Bestimmung

Teil nativer Stärke Teil nativer Stärke Teil “Total starch“ Teil Resistantstarch

AOAC 996.11 AOAC 996.11 AOAC 2002.02

“Resistant starch““Enzyme solublestarch““Total starch“Kommerziell/

isolierte Stärke “Dietary starch“ ?> > > >

Enzymatische Bestimmungsmethoden unterEinsatz von AA/AMG

Stärke Amylosegehalt[%]

Stärke (Total Starch)[%]AA/AMG ohne DMSO-Aufschluss

Stärke (Total Starch)[%]AA/AMGmit DMSO-Aufschluss

Mais 7,6 98,6 97,6Mais 30,0 93,6 99,1Weizen 30,2 91,2 99,6Reis 31,1 94,3 99,5Erbse 32,5 93,2 99,8Weizen 33,7 94,5 95,6Erbse 47,6 90,8 94,4Erbse 62,5 89,5 95,5Erbse 62,9 87,7 98,1Mais 66,5 86,9 99,0Mais 70,6 87,7 97,4

DMSO-Aufschluß in der enzymatischen Stärkebstimmung(AOAC 996.11)

80

85

90

95

100

0 200 400 600

Bestrahlungszeit [s]

Stär

kege

halt

[%]

P = 600 W

Hochamylose Maisstärkeamylogel 03003

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischenStärkebestimmung (AOAC 996.119)Einfluß der Bestrahlungszeit auf die erfassbare Gesamtstärkemenge

Mais-stärke03402

Mais-stärke39

Mais-stärkeamylogel

Erbsen-stärke16

Erbsen-stärkeTRISTAR

Cellulose

Protein [%] 0,38 0,75 0,15 0,43 0,5 -

Asche [%] 0,07 0,09 0,79 0,12 0,16 -

Lipide [%] 0,14 0,50 0,50 0,49 0,21 -

Amylose [%] 26,9 65,8 ~70 62,5 62,5 -

Resistente Stärke [%]

0,6 49,1 47,0 18,0 18,7 -

GesamtstärkeAA/AMG[%]

91,8 87,2 84,5 89,5 88,1 -

GesamtstärkeDMSO/AA/AMG[%]

94,4 95,4 94,7 95,5 95,4 -

GesamtstärkeMikrowelle/AA/AMG [%]

94,6 96,4 98,5 96,3 92,3 0,1

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischenStärkebestimmung (AOAC 996.11)

Aufschlußgefäße für Mikrowellenversuche zur Modifizierung der TDF-Analyse

Bola-Hydrolysier- und Aufschlussgefäß A 240

Fluor-Kunststoff PTFE

V = 100 ml

Berstscheibe < 20 bar

Inneres Reaktionsgefäß für dieTDF-Analyse

L= 116 mm, D = 29/32

V = 70 ml

Verkleinerung des Aufschluss-Volumens. Ermöglichungmehrerer Aufschlüssehintereinander

Enzymatisch-gravimetrische TDF- BestimmungAOAC 985.29 PROSKY et. al. (1985)

PROBENVORBEREITUNGAnalysenprobe 1000 mg

STÄRKE-/PROTEINHYDROLYSE

Phosphatpuffer

Termamyl pH 6,0 95°C 30 minProtease pH 7,5 60°C 30 minAmyloglu. pH 4,5 60°C 30 min

Rückstand

PRÄZIPITATION

80 Vol.% Ethanol

Filtration Filtrat

GravimetrischMS-Gehalt

Gravimetrisch

Gesamtballaststoffe

VolumetrischProtein (Kjeldahl-N 6.25)

Enzymatisch-gravimetrische TDF-BestimmungAOAC 991.43 LEE et. al. (1994)

PROBENVORBEREITUNGAnalysenprobe 1000 mg

STÄRKE-/PROTEINHYDROLYSE

MES/ TRIS -Puffer


Rückstand

PRÄZIPITATION

80 Vol.% Ethanol

Filtration Filtrat

VolumetrischProtein (Kjeldahl-N 6.25)

GravimetrischMS-Gehalt

Gravimetrisch

Gesamtballaststoffe

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatisch- gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC 991.43)

1 g Probe

40 mL MES-Tris-Puffer pH 8,2

5 min Rühren

Mikrowellen-bestrahlung

5 min Rühren

15 min Rühren/Kühlen


Hydrolyse/Inkubation

Ethanol-präzipitation

4. Ergebnisse und Diskussion

0

10

20

0 150 300 450

Bestrahlungszeit [s]

Bal

last

stof

fgeh

alt

[%]

P = 600 W

Hochamylose Maisstärkeamylogel 03003

Einfluß der Bestrahlungszeit auf die als Ballaststoff erfaßbare Menge RS in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC991.43)

Polysaccharid-Komponente

TDF[%]

Standard AOAC 991.43

TDF[%]

DMSO

TDF[%]

Mikrowelle480 Watt2x3 min

TDF[%]

Mikrowelle600 Watt2x3 min

Maisstärke03402

0,9 n.d. 0,7 0,5

Maisstärkeamylogel

21,0 4,5 1,5 0,3

Cellulose 99,3 97,3 99,9 100,1Arabinoxylan 96,9 102,6 96,4 98,9ß-Glucan 95,4 97,9 96,6 98,8Pectin 91,6 124,1 78,6 55,5

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss im Vergleich zum DMSO-Aufschlussin der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC 991.43)

RS-TDFModell-Mischung10:1

TDF[%]berechnet

TDF[%]StandardAOAC 991.43

TDF[%]Mikrowelle600 Watt2x3 min

TDF[%]Mikrowelle480 Watt2x3 min

Maisstärke03402/Cellulose

9,8 10,5 10,9 10,9

Maisstärke03402/Arabinoxylan

9,6 11,9 9,8 10,0

Maisstärke03402/ß-Glucan

9,5 11,9 9,8 10,3

Maisstärke03402/Pectin

9,1 9,5 8,1 8,7

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC 991.43)

RS-TDFModell-Mischung10:1

TDF[%]berechnetmit RS

TDF[%]AOAC 991.43Standard

TDF[%]berechnetohne RS

TDF[%]AOAC 991.43DMSO

TDF[%]AOAC 991.43Mikrowelle1

MaisstärkeAmylogel/Cellulose

28,1 27,4 9,9 9,8 10,5

MaisstärkeAmylogel/Arabinoxylan

27,9 23,9 9,7 10,7 9,5

MaisstärkeAmylogel/ß-Glucan

27,8 25,2 9,6 10,3 9,7

MaisstärkeAmylogel/Pectin

27,4 25,3 9,2 14,8 9,3

Cellulose/Pectin

98,6 99,1 98,6 110,8 104,6

1 P = 600 Watt, t = 2x3 min

Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatisch-Gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC 991.43)

Zusammenfassung

RS Typ II läßt sich durch einen Mikrowellenaufschluss vollständig destrukturieren, kolloidal in Lösung bringen und enzymatisch abbauen

Bei Vorliegen hochamylotischer Stärken in der enzymatischenStärkebestimmung (AOAC 996.11) kann der bisher erforderliche DMSO-Aufschluss durch ein Mikrowellenaufschluss ersetzt werden

In der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Bestimmung (AOAC 991.43) lassen sich resistente Stärkefraktionen (Typ II) ebenfalls durch einen Mikrowellenaufschluss auch bei Vorliegen traditioneller Ballaststoffkomponenten weitgehend eliminieren;Hierdurch können analytisch ermittelte TDF-Werte entsprechend physiologischen Definitionen besser angepasst werden

Ausblick

Untersuchung von TDF-Fraktionen und Resistenter Stärke inkomplexen Lebensmitteln

Einfluss von Mikrowellenbestrahlung und DMSO-Aufschluß unterBerücksichtigung von Matrixeffekten

Untersuchung zur Pektinstabilität unter Berücksichtigung von Temperatur und Druck

Untersuchungen zur Kombination der Methoden AOAC 991.43 (TDF)und AOAC 2001.03 (RS) zur kompletten Erfassung der RS unterBerücksichtigung von Matrixefekten

“Aktuelle Codex-Diskussionen“

Codex-Komitee für Ernährung und diätische Lebensmittel

1. “A source element identifying that dietary fibre is an intrinsic component of food groups“

2. “A chemical element identifying the component to bemeasured“

Vorschlag:

“Dietary fibre consists of intrinsic plant cell wallpolysaccharides“

ein beitrag zur komplettierung der ballaststoffanalyse

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