eficacia seguridad inmu subcutanea con endotelina
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EFICACIA Y SEGURIDAD DE LA INMUNIZACIÓN SUBCUTANEA CON
ENDOTELINA, PARA GENERAR ANTICUERPOS CONTRA ENDOTELINA EN
CERDOS.
YARY SOFIA GARIZABALO FORERO.
VIVIAN ANGELICA SALAZAR MONTOYA.
Directores
Dra. Luz Amparo Maldonado
Dr. Mauricio Pineda
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA
Bogotá D.C., Colombia
2002
EFICACIA Y SEGURIDAD DE LA INMUNIZACIÓN SUBCUTANEA CON
ENDOTELINA, PARA GENERAR ANTICUERPOS CONTRA ENDOTELINA
EN CERDOS.
YARY SOFIA GARIZABALO FORERO.
VIVIAN ANGELICA SALAZAR MONTOYA.
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para la obtención del titulo de
BACTERIOLOGO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA
Bogotá D.C., Colombia
2002
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946 “La Universidad no se hace
responsables por los conceptos emitidos por los alumnos en sus tesis de grado”.
EFICACIA Y SEGURIDAD DE LA INMUNIZACIÓN SUBCUTANEA CON
ENDOTELINA, PARA GENERAR ANTICUERPOS CONTRA ENDOTELINA
EN CERDOS.
FIRMA DIRECTORA Dra Aura Rosa Manascero Directora carrera Bacteriología
FIRMA DECANA Ángela Umaña Muñoz, Mphil. Decana Académica Facultad de Ciencias
FIRMA DIRECTOR Dra. Luz Amparo Maldonado Directora de Tesis
FIRMA DIRECTOR Dr. Mauricio Pineda Co-director Tesis
FIRMA JURADO Dra. Viviana Rodríguez Jurado.
FIRMA JURADO Dr. Fernando Rodríguez. Jurado.
DEDICATORIA.
A Dios por habernos tomado siempre de su mano guiándonos por el camino que nos
condujo a esta meta alcanzada, por ser nuestro confidente y más grande soporte ya
que fue la fuente inagótale de energía que nos permitió levantarnos cada día, luchar
contra las adversidades y conseguir tantos triunfos y alegrías.
A nuestros padres, ya que su amor invalorable, es un tesoro que hemos aprendido a
atesorar, por su dedicación y esfuerzo; su compañía fue la luz y el apoyo necesario
para seguir adelante, sin ellos, a los que siempre podemos acudir no hubiese sido
posible alcanzar los triunfos logrados, su voz de aliento nos dio el impulso y la
motivación justa, por eso dedicamos este triunfo a ellos nuestros padres.
A nuestra familia que nos llenaron de alegría y consejos siempre que fueron
necesarios, su compañía y apoyo fue de gran ayuda para nuestra formación personal.
A nuestras compañeras, ellas siempre estuvieron presentes apoyándonos con sus
concejos, amistad y alegría.
A Allam por sus aportes infinitos y gran colaboración, amor y apoyo.
A nuestra muy querida universidad Javeriana, por ser la base para nuestro desarrollo
profesional.
AGRADECIMIENTOS.
Agradecemos a la Dra. Luz Amparo Maldonado y a su esposo Dr. Mauricio Pineda,
por la oportunidad de participar en este proyecto y su invaluable apoyo en todas las
etapas de investigación de este trabajo.
Gracias al Dr. John Mario Gonzáles por su valiosa asesoría en el desarrollo de la
experimentación y análisis de los datos obtenidos, ya que su participación fue vital
para el éxito del proyecto.
Al grupo de trabajo del área de Veterinaria de la Universidad de la Salle, por el
tiempo y ayuda prestada en el proceso de inmunización y obtención de muestras.
INDICE GENERAL.
1 INTRODUCCIÓN. ............................................................................................. 15
2 REVISION BIBLIOGRAFICA .......................................................................... 18
2.1 Anatomía del corazón.................................................................................. 18
2.1.1 Riego sanguíneo coronario. ................................................................. 18
2.2 Conformación de la pared vascular. ............................................................ 21
2.2.1 Anatomía del endotelio. ...................................................................... 24
2.2.2 Fisiología del endotelio. ...................................................................... 31
2.3 Papel vasodilatador del endotelio ................................................................ 34
2.4 Papel vasoconstrictor del endotelio............................................................. 36
2.5 Factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares... 41
2.5.1 Factores individuales........................................................................... 44
2.5.1.1 Edad y sexo. .................................................................................... 44
2.5.1.2 3 Herencia. .................................................................................. 44
2.5.2 Factores modificables para el desarrollo de enfermedades
cardiovasculares. ................................................................................................. 45
2.5.2.1 Lípidos séricos................................................................................. 45
2.5.2.2 Diabetes........................................................................................... 45
2.5.2.3 Gota. ................................................................................................ 46
2.5.2.4 Obesidad y presión arterial.............................................................. 46
2.6 Factores emocionales. ................................................................................. 46
2.7 Factores erradicables................................................................................... 47
2.7.1 Sedentarismo....................................................................................... 47
2.7.2 Tabaquismo. ........................................................................................ 47
2.8 Disfunción endotelial y enfermedad arterosclerótica. ................................. 48
2.9 ARTEROSCLEROSIS................................................................................ 49
2.9.1 Mecanismos celulares. ........................................................................ 52
2.9.2 Radicales libres y disfunción endotelial.............................................. 53
2.9.3 LDL oxidada. ...................................................................................... 56
2.10 Papel de la ET-1 en la arterosclerosis......................................................... 58
2.11 INMUNIZACION....................................................................................... 62
2.11.1 Antecedentes históricos....................................................................... 62
2.11.2 Concepto y tipo de inmunización........................................................ 62
2.11.3 Antígeno.............................................................................................. 63
2.11.4 Adyuvantes.......................................................................................... 64
2.12 Respuesta inmune frente a proteínas......................................................... 65
2.12.1 Secuencia de acontecimientos en la producción de anticuerpos en
respuesta a proteínas............................................................................................ 66
2.13 ELISA.......................................................................................................... 68
2.13.1 EIA heterogéneos................................................................................ 71
2.13.1.1 Elisa indirecto para medir anticuerpo.......................................... 72
3 PROBLEMÁTICA.............................................................................................. 73
4 JUSTIFICACIÓN................................................................................................ 75
5 OBJETIVOS........................................................................................................ 77
5.1 OBJETIVO GENERAL. ............................................................................. 77
5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS. ..................................................................... 77
6 MATERIALES Y METODOS. .......................................................................... 78
6.1 Tipo de estudio............................................................................................ 78
6.2 Hipotesis...................................................................................................... 78
6.3 Materiales .................................................................................................... 78
6.4 Equipos........................................................................................................ 78
6.5 Reactivos..................................................................................................... 79
6.6 Animales...................................................................................................... 80
6.6.1 Conejos................................................................................................ 80
6.6.2 Cerdos.................................................................................................. 80
6.7 Antígeno utilizado. ...................................................................................... 80
6.8 Esquema de inmunización........................................................................... 81
6.8.1 Conejos................................................................................................ 81
6.8.2 Cerdos.................................................................................................. 81
6.9 Protocolo para la estandarización de la técnica de ELISA para la
determinación de anticuerpos contra endotelina 1. ................................................. 82
6.10 Pruebas clínicas realizadas en cerdos.......................................................... 84
6.11 Análisis estadísticos. ................................................................................... 85
7 RESULTADOS. .................................................................................................. 86
8 DISCUSIÓN...................................................................................................... 101
9 CONCLUSIONES. ........................................................................................... 104
10 ANEXOS....................................................................................................... 105
11 BIBLIOGRAFÍA........................................................................................... 107
INDICE DE FIGURAS.
Figura 1. Arterias y venas del corazón; aspecto anterior. El tronco pulmonar está resecado y doblado hacia delante (23) ................................................................. .................20
Figura 2a. Representación esquemática de la pared vascular (29). ......................................22 Figura 2b. Estructura de la pared vascular. Las arterias tienen cuatro capas: el endotelio que
forma parte de la íntima. La íntima. La media, conformada por fibras musculares y elásticas. Y una externa, llamada adventicia, constituida por fibras conjuntivas (29)23
Figura 2c. Pared de una arteria aumentada 80 veces. Se observa con claridad el detalle de la conformación de la pared (4). ................................................................ ..............23
Figura 2d. Pared de una arteria aumentada 80 veces. Se observa con claridad el detalle de la conformación de la pared (4). ................................................................ ..............23
Figura 3. Representación esquemática de la célula endotelial (38)................................. .....26 Figura 4. Estructura química de la ET -1. Las líneas de unión entre residuos de cisteína en la
ET-1 indican puente disulfuro (38)................................................................. ..37 Figura 5: Mecanismo de acción de la endotelina 1. Diversos factores estimuladores e
inhibidores actúan sobre el gen de la endotelina 1 y el receptor tipo A,. Por medio de varios pasos enzimáticos la preproendotelina es convertida en la molécula activa, responsable de los fenómenos de vasoconstricción (29)................................. ........38
Figura 6: Estructura qimica de la ET-1 endógena (14) . ................................ ....................40 Figura 7: Estructura quimica de la ET sintetica (14).........................................................40 Figura 8. Aumento del riesgo de enfermedad coronaria en función de la presencia de los
factores de riesgo en la adolescencia. Factores: 1. Consumo de tabaco (10 o más cigarrillos por día. 2. Tensión arterial sistólica superior a 130 mm Hg. 3. Exceso ponderal indice de talla/ peso igual o inferior a 12,8 (43). ......................................41
Figura 9. Red etiológica de la enfermedad coronaria. Las líneas continuas indican los componentes endógenos. Las discontinuas indican los exógenos. Las líneas de puntos indican las influencias mixtas (43). ................................ ......................................43
Figura 10. La anatomía de la placa se muestra en este dibujo. Si la placa se rompe, un coágulo puede obstruir la arteria. O puede liberarse y obstruir una arteria de menor calibre (48)................................................................................................. ........50
Figura 10a. Este corte transversalde un a coronaria muestra un gran depósito de grasa que la ha obstruido completamente (48). ................................................................ ........51
Figura 11. La LDL es atrapada en el espacio subendotelial, donde puede ser oxidada por células musculares, endoteliales y macrófagos. La LDL oxidada estimula (signo +) la quimiotaxis de monocitos (A) e inhibe (signo -) la salida de estos desde la pared vascular (B). Estos se diferencian en macrófagos que fagocitan LDL oxidada, transformandose en células espumosas (C). La LDL oxidada también causa disfunción endotelial e injuria (D), necrosis de la células espumosas (E), ocasionando la liberación de enzimas liposomales y restos necróticos, que ejercen también efectos adversos (43)................................................................................................. .....57
Figura 12. En modelos animales de hipertensión sensible a la sal, se ha demostrado la liberación de ET-1 por parte del endoteliovascular. Ocasionando vasoconstricción y el incremento de fibras tensionales (29)................................................................61
Figura 13: Interacciones celulares en las respuestas humorales frente antígenos proteicos (1)................................................................................................ ..........................68
Figura 14: Niveles de anticuerpos pre y post inmunizaciones de los conejos 1 y 2. El conejo No1 presenta anticuerpos despues de la tercera y cuarta inmunización (1/320-1/80).
El conejo No 2 presenta anticuerpos despues de la segunda, tercera y cuarta inmunizacion (1/320, 1/1280, 1/640)....................................................................87
Figura 15: Punto de corte. Elisa determinación anticuerpos anti-ET en conejos.Se ve una relación directamente proporcional entre la dilución y la OD, es decir entre mayor concentración de anticuerpos en suero, mayor OD a 450mn. ( OD: Densidad óptica)................................................................................................. ..........................88
Figura 16: Niveles de anticuerpos anti-endotelina 1 en plasma de cerdos según el grupo. Se nota que los cerdos del grupo No 2 presentan altos niveles de anticuerpos ,en comparacion con el grupo No 3 en donde los niveles de anticuerpos se encuentran sobre el punto de corte................................ ........................................................89
Figura 17: Titulación de muestras positivas de los grupos 2 y 3. Se evidencia que en el grupo No2 el cerdo 18 tiene los niveles mas altos de anticuerpos ,seguidos de los cerdos 16 y 20 ................................ ...................................................................................90
Figura 18: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 1 y el grupo No2 según las absorbancias de la prueba de ELISA......................................................91
Figura 19: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 1 y el grupo No3 según las absorbancias de la prueba de ELISA......................................................92
Figura 20: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 2 y el grupo No3 según las absorbancias de la prueba de ELISA......................................................92
Figura 21: Placa de ELISA con plasma de cerdos pre- inmunización (Controles negativos)105 Figura 22: Placa de ELISA con plasma de cerdos post- tercerainmunización.................... 105
INDICE DE TABLAS.
Tabla 1: Inmunoanalisis (EIA): ventajas e inconvenientes
Tabla 2: Clasificación de las técnicas de ELISA
Tabla 3: Inmunización de conejos
Tabla 4: Inmunización de cerdos
Tabla 5: Método para pruebas clínicas en cerdos
Tabla 6: Estadística de los resultados de análisis clínicos en cerdos por ANOVA.
Tabla 7: Estadística de los resultados de análisis clínicos en cerdos por la prueba de
Fischer Exacta
RESUMEN.
Actualmente se sabe que el endotelio cumple muchas funciones críticamente
importantes. Estas incluyen la síntesis y liberación de sustancias biológicamente
activas que tienen funciones locales y distantes dentro de la pared del vaso sanguíneo
o en su superficie, los cambios fisiopatológicos que ocurren en la estructura y función
de la célula endotelial también caracteriza muchos de los mecanismos patológicos
responsables del desarrollo y de la progresión de la Enfermedad Arterial Coronaria
(EAC) y la aterosclerosis. La Endotelina es el más potente vasoconstrictor
producido por células endoteliales ha sido implicada en la patogénesis de la
arterosclerosis, debido a su acción proliferativa y vasoconstrictora in situ y a su
actividad mitogénica sobre las células musculares lisas.
En este estudio se estandarizó la técnica de ELISA indirecta, para demostrar y
cuantificar la producción de anticuerpos anti-endotelina 1 comprobando la eficacia y
seguridad de la inmunización subcutánea realizada con el péptido sintético
endotelina 1 en conejos y cerdos.
Se realizó la determinación y cuantificación de la producción de anticuerpos anti-
endotelina 1 en suero de 2 conejos utilizados como controles positivos mediante la
estandarización de la técnica de ELISA indirecta usando anti- IgG de conejo.
Además se realiza la determinación y cuantificación de anticuerpos anti-endotelina 1
en plasmas de 30 cerdos de la raza Landrace utilizando anti-IgG de cerdos. El
control negativo de la prueba se realizo con el p lasma de 10 cerdos control.
Los resultados de este estudio demuestran que la inmunización subcutánea con
endotelina 1 (20?g) es eficaz para estimular la producción de anticuerpos anti- ET1
sin producir cambios clínicos o bioquímicos en los cerdos
1 INTRODUCCIÓN.
El conocimiento del endotelio ha tenido una transformación impresionante en los
últimos años, cambiándose el concepto de simples células tapizadoras, a llegar a ser
clasificado como un nuevo órgano complejo que constituye un eslabón fundamental
en la cadena de la vida, siendo no solo el responsable del estado de la salud, si no que
su disfunción se traduce en enfermedad y muerte (38).
En la ultima década el conocimiento de la patogénesis de las enfermedades
cardiovasculares ha aumentado, esto debido a los avances en el reconocimiento del
papel central que juegan las células que recubren el sistema vascular / endotelio
(38).
El redescubrimiento del endotelio ha expandido enormemente el conocimiento
científico y este mismo hecho ha suscitado un enorme interés investigativo sobre la
biología del endotelio, su papel en múltiples patologías y el manejo terapéutico de la
enfermedad con miras a cambiar la historia natural de múltiples patologías en donde
este órgano vascular esta implicado. Es posible que cambiando la historia natural de
estas patologías, podría, cambiar la historia de la humanidad, buscando una mejor
cantidad y calidad de vida, mediante la perpetuación de la integridad del órgano
endotelial (30).
El órgano endotelial cumple múltiples funciones: Regulación de proteínas
plasmáticas, ser órgano endocrino, paracrino y autocrino, tapizar el sistema
cardiovascular de vertebrados formando una barrera dinámica y funcional entre los
tejidos y la sangre, además de estar relacionado con la integridad vascular siendo esta
última, tal vez, la función mas importante (30)
Se involucra en la patología de muchas enfermedades como arteriosclerosis,
trombosis, hipertensión arterial, artritis y crecimiento de tumores sólidos; favorece la
inflamación, la homeóstasis y la transferencia de información genética. En estado de
normofunción, cumple funciones de resistencia plaquetaria, anticoagulación,
profibrinolísis, inhibición de factores de crecimiento, resistencia leucocitaria, ejerce
funciones vasodilatadoras y de permeabilidad selectiva. En disfunción, el endotelio se
torna en todo lo contrario a lo anteriormente dicho, convirtiéndose en un órgano
agresivo y potencialmente letal (4).
Son muchas las sustancias que derivan del endotelio, una de ellas es la endotelina, el
vasoconstrictor mas potente conocido, de ella la mas importante es la isoforma 1
debido a su función vasoconstrictora llamada también la endotelina humana-porcina.
La endotelina tiene un efecto inotropico, el cual esta basado en un aumento de calcio
en el citosol, constriñe el sistema vascular incluyendo linfáticos, siendo mas
sensibles las venas y a nivel coronario más el lecho subendocardico y el epicardico
(4).
La endotelina 1 tienen un efecto arritmogénico que disminuye el umbral de
fibrilación y otro efecto mitogénico que produce hiperplasia, remodelación y
apoptósis. En exceso la ET -1 ocasiona daño endotelial directo, lo cual facilita la
infiltración por monocitos-macrófagos, facilita la infiltración lipidica y propicia la
formación de la placa aterosclerótica. Este tipo de enfermedades cardiovasculares son
la principal causa de muertes en el mundo (48).
2 REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 Anatomía del corazón.
La irrigación sanguínea del corazón se efectúa mediante dos arterias: la coronaria
derecha y la coronaria izquierda que son las primeras ramas de la aorta (figura 1). La
arteria coronaria derecha se inicia a nivel del seno derecho, sigue hacia abajo por la
pared de la aorta, al surco coronario. La arteria coronaria izquierda es más grande que
la derecha; se inicia a nivel del seno izquierdo de la aorta, sigue a la izquierda por
detrás de la raíz del tronco pulmonar, donde se divide en dos ramos. Así, la arteria
coronaria derecha irriga las paredes del tronco pulmonar y de la aorta, de los atrios
derecho e izquierdo, del ventrículo derecho, la pared posterior del ventrículo
izquierdo y los septos interatrial e interventricular (23).
La arteria coronaria izquierda nutre las paredes de los atrios derecho e izquierdo, de
los ventrículos derecho e izquierdo, la pared posterior del ventrículo izquierdo y los
septos interatrial e interventricular (48).
2.1.1 Riego sanguíneo coronario.
Por las coronarias circulan aproximadamente 225 ml de sangre por minuto, lo que
suma poco más o menos al 4 o 5 por ciento del volumen sanguíneo total expulsado
por el corazón. El flujo de sangre por las coronarias se regula principalmente según la
necesidad de nutrición del miocardio, por un mecanismo de autorregulación. Quiere
decir que, cuando la necesidad metabólica de sustancias nutritivas, principalmente de
oxígeno, excede el suministro, las arterias se dilatan automáticamente. En
consecuencia, aumenta el caudal sanguíneo por las arterias coronarias hasta que la
nutrición alcanza un nivel adecuado a la actividad cardiaca (23).
Figura 1. Arterias y venas del corazón; aspecto anterior. El tronco pulmonar está resecado y doblado hacia delante (23) .
Para un óptimo mecanismo de autorregulación es necesaria la integridad del sistema.
Así, si existiera oclusión coronaria, sería imposible lograr un equilibrio. En este caso,
el papel del endotelio coronario es fundamental.
2.2 Conformación de la pared vascular.
La pared vascular está conformada por cuatro niveles:
El endotelio, que forma parte de la íntima de todos los vasos sanguíneos, es la
primera capa de células que están en contacto con la luz del vaso. Las células
endoteliales permanecen viables por aproximadamente 30 años y son reemplazadas
por regeneración (34).
La íntima, representada por elastina y que contiene células musculares lisas y
ocasionalmente macrófagos (34).
La media, compuesta por una gran masa de células musculares lisas, dispuestas en
forma circular y juega un papel fundamental al mantener la integridad estructural y el
tono vascular (34).
Y por último, la adventicia, que contiene fibroblastos, tejido conectivo, vasos
sanguíneos, fibras nerviosas, fibras elásticas y colágeno.
Las pequeñas arterias y ramas que nutren la pared vascular de los grandes vasos
sanguíneos se conocen como “vasa-vasorum” (figuras 2a, b, c, d). Las láminas
elásticas de la arteria muscular son fenestradas, permitiendo el tráfico de nutrientes,
citoquinas y autacoides en condiciones normales y el tráfico celular en condiciones
anormales (29).
Figura 2a. Representación esquemática de la pared vascular (29).
Figura 2b. Estructura de la pared vascular. Las arterias tienen cuatro capas: el endotelio que forma parte de la íntima. La íntima. La media, conformada por fibras musculares y elásticas. Y una externa, llamada adventicia, constituida por fibras conjuntivas (29)
Figura 2c. Pared de una arteria aumentada 80 veces. Se observa con claridad el detalle de la conformación de la pared (4).
Figura 2d. Pared de una arteria aumentada 80 veces. Se observa con claridad el detalle de la
conformación de la pared (4).
2.2.1 Anatomía del endotelio.
? Generalidades:
El endotelio fue considerado hasta hace poco tiempo como una barrera pasiva de
filtrado de macro moléculas y cuerpos extraños que protegían los tejidos de la
agresión del medio exterior; este concepto fue cambiando y en este momento el
endotelio constituye una capa vascular que sirve de interfase entre la sangre y los
tejidos, es sensible a los cambios de flujo de presión, de señales inflamatorias y a
hormonas circulantes, de ahí su gran importancia desde el punto de vista funcional
(4).
De igual manera, actúa como regulador del tráfico celular y molecular sanguíneo
hacia el interior de los tejidos, gracias a su estructura altamente diferenciada y
especializada, y a su localización estratégica. El endotelio es intocable, ya que en
condiciones normales ninguna célula sanguínea entra en contacto con él (4).
Embriológicamente, el endotelio se deriva del mesodermo y hacia el final de la
tercera semana ya es funcional y demuestra actividad endo y exopicnocítica.
No es el endotelio, simplemente, un recubrimiento vascular sino que se desempeña
como un órgano ubicuo, pluripotencial y plurifuncional. Tiene un peso total de dos
kilogramos, lo cual lo clasifica como el órgano más pesado del organismo (4).
? Célula Endotelial:
El endotelio es un tejido disímil compuesto de células poliédricas altamente
especializadas y metabólicamente muy activas. Constituyen una monocapa interna
orientada en el sentido del flujo sanguíneo. La presencia de vesículas picnocíticas es
un dato característico de estas células. Los bordes de las células endoteliales son
irregulares de tal forma que las células vecinas muestran interdigitaciones y tienen
zonas cerradas que se entrecruzan (29).
Cada célula endotelial tiene forma de placa curva y delgada de perfil poligonal, tiene
un espesor central de aproximadamente 3-4 micras y de 0.1 micras en los bordes, de
20 a 50 micras de largo con su eje mayor orientado longitudinalmente en sentido del
eje del capilar con sus extremos terminados en punta. El núcleo se encuentra en la
zona abultada, es voluminoso, y está constituido básicamente de eucromatina,
rodeada por un complejo sistema cisternal y abundantes estructuras tubulares ovoides,
considerados como cuerpos de Weibel-Palade (depósitos de proteína de Wíllebrand, y
Factor VIII antihemofílico) los cuales se encuentran en el lado luminal de la célula
endotelial, y a los que se vincula con la liberación de sustancias tromboplásticas y
fibrinolíticas. Se observa en la región yuxtanuclear un complejo de Golgi y unas
pocas mitocondrias, mientras en la región delgada periférica del citoplasma hay
elementos tubulares tortuosos del retículo endoplasmático. Un rasgo llamativo de las
células endoteliales es la presencia de una numerosa población de vesículas de unas
Comentario:
70 micras de diámetro, que están presentes en ambas superficies celulares y que se
abren a la luz y al espacio extravascular (4).
El citoplasma de la célula endotelial forma parte de la pared vascular y en muchos
casos una sola célula puede constituir un capilar, aunque usualmente se encuentran
formados por varias células endoteliales, las cuales se hallan relacionadas por medio
de uniones que permiten el paso de sustancias simples (fascia ocludens) e impiden el
paso de macromoléculas desde el plasma (5).
Al igual que la mayoría de las células eucarióticas posee su propio citoesqueleto bien
organizado que varía sustancialmente de acuerdo con su localización y función.
Exhibe filamentos de actina, localizados principalmente en su periferia, que se
contraen en la fase inicial del proceso inflamatorio con el propósito de ampliar las
uniones intercelulares y facilitar la diapédesis leucocitaria (figura 3).
Figura 3. Representación esquemática de la célula endotelial (38).
La célula endotelial produce de novo proteína de von Willebrand, aunque aquí no está
activa como la de la plaqueta, pero cumple su función de empate de dominios
arginina-glicina -ácido aspártico de células que se adhieren al endotelio en
determinadas circunstancias+3 (34).
Las células conectivas próximas al capilar (fibroblastos e histiocitos) se disponen de
una manera particular alrededor de este; se alargan en sentido del vaso y se ponen
sobre su pared constituyendo lo que se conoce como peritelio. Entre estas células
periteliales, se encuentran algunas células de Rouget, células adventiciales, pericitos
que presentan numerosas expansiones que rodean en mayor o menor extensión la
circunferencia del vaso capilar y a cuyas contracciones se debería los cambios de
calibre que este presenta (34).
La célula endotelial presenta una gran cantidad de vesículas picnocíticas tanto en la
vecindad luminal como en la subluminal (vesículas transcitósicas) que presentan un
tráfico de doble vía muy activo que transporta nutrientes de la luz del capilar hacia el
subendotelio y metabolitos en dirección contraria (4).
La actividad picnocítica de la célula endotelial varía considerablemente en minutos y
horas cuando la célula endotelial es estimulada en procesos patológicos. La
picnocitósis facilita el tráfico de ciertos iones como el Ca++ (29).
En la célula endotelial se distinguen dos variedades de picnocitosis:
macropicnocitosis y micropicnocitosis. En la última, hay incorporación de pequeñas
cantidades de líquido y se reconocen dos cantidades, la micropicnocitosis de fase
líquida (no selectiva) y la micropicnocitosis no adsortiva donde se aprecia
internalización selectiva de líquidos que empatan en receptores en forma de cepillo,
presentes en la membrana de la célula (29).
Varios de estos receptores están representados por formaciones proteicas de
transporte facilitado llamadas clatrinas. El receptor de clatrina capta el ligando, la
envoltura del receptor se recicla por fenómenos de up-regulation y se vuelve a
expresar en la membrana de la célula endotelial (29).
En el proceso de picnocitosis la célula endotelial emite pseudópodos en forma de
arandelas, cálices y membranas ondulantes que engloban el soluto uniendo sus
bordes gracias al fenómeno de fusión-fisión de membranas. Este fenómeno requiere
identidad bioquímica de los fosfolípidos que constituyen la bicapa lipídica de la
célula endotelial, despolarización de la membrana y disminución de su contenido de
ácido siálico, presencia de isolecitina y desactivación del citoesqueleto in situ (4).
La endocitosis adsortiva es aquella mediada por receptores es decir que requiere que
un ligando se una a unos receptores existentes en la membrana para que se lleve a
cabo la invaginación de la membrana dicha endocitosis se sucede en la captación de
colesterol que la célula endotelial hace para suplir sus necesidades de síntesis de la
membrana celular. Cuando la célula endotelial necesita colesterol para la síntesis de
su membrana activa nuevos receptores que se expresan en su membrana asociados
con vesículas revestidas (clatrina) que captan e internalizan las LDL (29).
Algunos individuos heredan genes defectuosos y no exhiben estos receptores de
membrana para LDL (hiperlipidemia familiar); estos individuos desarrollan
enfermedad arterosclerótica prematuramente (4).
Como la célula endotelial es altamente diferenciada es incapaz de transformarse en
otra célula de tejido conectivo y de multiplicarse una vez que alcanza su grado de
diferenciación celular. Generalmente se encuentra acompañada por una célula
satélite: el pericito; esta célula acompaña al capilar sanguíneo (arterial y venoso) y al
linfático, y proporciona una función de sostén y contención del tono muscular;
representa la célula más pluripotente e indeferenciada presente en el tejido conectivo
pudiendo diferenciarse en cualquiera de las células del tejido conectivo según la
necesidad y dar origen a fibroblasto, dendrocito, célula mesangial e incluso en célula
endotelial (4).
? Uniones célula-célula.
Los capilares están formados por varias células endoteliales que se relacionan por
medio de uniones oclusivas de tipo fascia (uniones discontinuas o desmosomales),
que dejan pequeñas hendiduras y permiten el paso de sustancias simples e impiden el
tráfico de proteínas macromoleculares del plasma sanguíneo. Las células
endoteliales también presentan uniones más fuertes e intimas y prácticamente
impermeables, conocidas como zonas occludens (uniones intercelulares de tipo
intimo), que constituye la forma más común de unión entre ellas (20).
En el seno venoso de la médula ósea hematopoyética, las células endoteliales se
relacionan por medio de estas uniones íntimas; así, el paso de las células sanguíneas
maduras se hace entre las célula endotelial vecina a la unión intercelular, en esta zona
la célula se ha adelgazado hasta el punto que sus membranas interna y externa se
unen, desplazando sus organelos (37).
El endotelio de los post-capilares tienen uniones intercelulares menos impermeables.
Entre estas se dan discretas hendiduras que permiten la diapédesis leucocitaria y el
tráfico selectivo de pequeñas moléculas (37).
También se ha reportado la presencia de microfibrillas extracelulares en íntimo
contacto con la membrana plasmática de la célula endotelial; estos se han
denominado filamentos de anclaje. Se ha descrito una estriación característica de
estos filamentos sugiriendo una función contráctil y de anclaje del conjunto, que
impide la deformación y desprendimiento de la célula endotelial y al mismo tiempo
distribuye las fuerzas de fricción de la hemorreología ( estudio de los efectos del flujo
sanguíneo sobre los componentes celulares de la sangre y sobre las paredes de los
vasos sanguíneos). El estrés de las fuerzas de fricción se transmite a través de los
filamentos de anclaje a la elastina de la íntima para disipar las fuerzas en forma
adecuada.
La célula endotelial interactúa con diferentes células sanguíneas por medio de sus
receptores de membrana y citoesqueleto en el lado luminal, y en el subluminal con la
matriz extracelular y las células vecinas (38).
Varios factores influyen sobre el transporte trasendotelial: el tamaño molecular, su
naturaleza química, su carga neta y la carga de los caminos que recorre. En general,
la superficie del endotelio está cargada negativamente, cuando se perfunden los
vasos con marcadores de carga contraria, se unen al azar sobre el plasmalema y de
modo especialmente tenaz a los diafragmas fenestrados. Así, la superficie endotelial
presenta a la sangre un mosaico de microáreas de carga diferente y puede así
seleccionar las macromoléculas de acuerdo con su diferente carga. Los iones
catiónicos son captados fundamentalmente por endocitosis adsortiva en las vesículas
revestidas, mientras que los marcadores aniónicos o neutros son transportados a
través del endotelio en vesículas lisas .
2.2.2 Fisiología del endotelio.
Dentro de las funciones del endotelio está la liberación de sustancias autacoides que
son una especie de hormonas caracterizadas por ser producidas, actuar y degradarse
in situ. El endotelio hace las funciones de un radar exquisitamente sensible a
estímulos de diferentes antagonistas (serotonina, bradiquinina, ADP) y productos
hormonales (angiotensina II). Además, algunos neuropéptidos intervienen en el
funcionamiento del sistema cardiovascular y se manifiestan en finas terminaciones
nerviosas que se encuentran relacionadas con los vasos sanguíneos (50).
Las funciones constitutivas del endotelio pueden resumirse en:
1. Las células endoteliales perciben los cambios de las fuerzas hemodinámicas (tales
como el estrés de rozamiento y la presión). Tambien actúa como una barrera
macromolecular (34).
2. Proporciona una superficie trombo resistente: el endotelio vascular ejerce un
importante papel protector contra el desarrollo de lesiones arterioscleróticas,
mediante la liberación de factores derivados del endotelio, que están involucradas en
el mantenimiento del tono vascular y la inhibición de la adhesión y agregación
plaquetaria, adhesión de leucocitos y proliferación de células musculares lisas,
actividades en las cuales la participación de la prostaciclina y el óxido nítrico (ON)
son fundamentales (34) .
3. El endotelio estimula el sistema anticoagulante permitiendo la unión de la
trombina a la trombomodulina y activando a la proteína C, la cual inactiva los
factores de coagulación Va y VIIIa. También modula el sistema fibrinolítico a través
de la síntesis y liberación del activador tisular del plasminógeno (t-PA) y del
inhibidor del activador tisular del plasminógeno (PAI) .
Se desempeña como un órgano endocrino y paracrino con numerosas funciones
reguladoras de la pared vascular: la célula endotelial actúa con características
autocrinas y paracrinas manipulando el funcionamiento de las células vecinas (51).
Esto lo realiza a través de la síntesis y liberación de sustancias vasoactivas
constrictoras (renina, angiotensina, endotelinas (ETs)) y dilatadoras (NO,
prostaciclina, factor hiperpolarizante derivado del endotelio, bradicinina) (50).
4. Mecanismos Inflamatorios y Anti – Inflamatorios: (mediante la expresión de
moléculas quimiotácticas y de adhesión sobre la membrana celular). Las células
endoteliales expresan sobre su superficie, en forma inducible, moléculas específicas
de adhesión leucocitaria, las cuales funcionan entonces como un receptor específico
para los leucocitos polimorfonucleares. La adhesión leucocitaria es inhibida por el
ON endotelial. Un mecanismo puede ser la inactivación del anión superóxido, el
responsable de promover la adhesión leucocitaria al endotelio (58).
En la disfunción endotelial se presenta una alteración del balance entre los factores
vasodilatadores, antitrombóticos, antiproliferativos (ON, prostaciclina, factor
hiperpolarizante derivado del endotelio, bradicinina, péptido natriurético tipo C) y los
factores vasoconstrictores, protrombóticos y proliferativos (ETs, superóxido y
tromboxáno A2) lo cual se asocia con el desarrollo de la arterosclerosis (58).
Este proceso puede concluir con un bloqueo del vaso coronario. La parte del corazón
correspondiente al territorio del vaso pierde su nutrición y deja de contraerse. Se dice
entonces que el individuo sufre un infarto del miocardio (59).
Cierta evidencia tamb ién sugiere que el estrés metabólico impuesto sobre el endotelio
por la aterosclerosis y la hipertensión, da como resultado una producción excesiva de
anión superóxido en el endotelio y en el músculo liso vascular (4).
2.3 Papel vasodilatador del endo telio
Una de las principales funciones delo endotelio consiste en mantener el tono vascular
(relajación y contracción). Esto se logra a través de la producción de varios factores
relajantes y factores de contracción que tienen un impacto sobre el músculo liso
subyacente.
Entre los vasodilatadores se destaca el ON, el vasodilatador mas potente y un
inhibidor de la agregación plaquetaria y la prostaciclina un metabolito del ácido
araquidónico inhibidor de plaquetas (34).
Prostaciclina (PGI2). Forma parte de un grupo de sustancias con actividad biológica
conocida como prostaglandinas descubiertas por Kurzrok y Lieb en 1920.
Samuelsson y cols demostraron que el ácido araquidónico es el precursor de éstas.
La prostaciclina se libera in situ por la célula endotelial y actúa localmente; en el lado
luminal, previniendo la agregación plaquetaria y adherencia al endotelio, gracias a la
activación de la adenil-ciclasa plaquetaria que conduce al aumento intracelular del
monofosfato cíclico de adenosina (cADP) y en el lado subluminal actúa sobre el
músculo liso vascular relajándolo . Además, inhibe la movilización de sitios de
fibrinogeno en las plaquetas humanas “in vivo”. También, aumenta la actividad
fibrinolitica, procesos que pueden contribuir en la terapia de enfermedades
circulatorias obstructivas crónicas (50).
La corta vida de la prostaciclina, demuestra que no es una hormona circulante que
actúa a distancia, sino una sustancia paracrina que ejerce sus efectos biológicos en las
células aledañas al propio endotelio donde se genera (35).
Actúa sinérgicamente con el factor relajante derivado del endotelio (EDRF) y tiene
una acción opuesta a la del tromboxáno A2 (TxA2).
Oxido nítrico (ON):
Esta denominado como factor relajante derivado del endotelio (EDRF) desde 1987 .
El ON simple es un gas, soluble tanto un agua como en lípidos, no es almacenado,
sino que se difunde libremente desde su sitio de formación. Se puede considerar un
radical libre, es gas altamente difusible con vida media muy corta y actividad local y
sublumial fugaz. El ON es un inhibidor de la agregación plaquetaria y actúa
conjuntamente con la prostaciclina en la actividad tromboresistente del endotelio
vascular (29). Aumenta dramáticamente en estados infecciosos y al estimular el
sistema inmune (4).
La actividad del Oxido nítrico en el sistema cardiovascular consiste en:
Debido a su actividad inhibidora de la mitogénesis de fibroblasto y de la célula
muscular lisa ( lo cual sugiere actividad antiproliferativa sobre la célula muscular
previniendo la arterosclerosis) (51), la disminución en la síntesis de ON esta envuelta
en la patogénesis de algunas condiciones vasculares, como el vaso espasmo, la
aterosclerosis y la hipertensión. La adhesión de los leucocitos al endotelio, la
acumulación en la intima y la trasformación de monocitos a células espumosas son
eventos iniciadores en la aterogenesis que conducen a la formación de la estría
grasa. El ON ejerce una importante influencia sobre muchas etapas de la aterogenesis.
En la disfunción endotelial se presenta una alteración del balance entre los factores
vasodilatadores, antitrombóticos, antiproliferativos (ON, prostaciclina factor
hiperpolarizante del endotelio, bradicinina , péptido natriurético) y los factores
vasoconstrictores, protrombóticos y proliferativas (ETs, superóxido y tromboxáno
A2) lo cual se asocia con el desarrollo de la aterosclerosis (58).
2.4 Papel vasoconstrictor del endotelio.
ENDOTELINAS (ETs). La ET-1 fue descrita por primera vez por Yanagisawa et al.
en 1988 (5). Es un péptido de 21 aminoácidos lineales con dos puentes disulfuros
(cys1-cys15 y cys3-cys11) que se organizan en forma de espiral cónica. Es el
vasoconstrictor más potente conocido hasta el momento y es diez veces más activa
que la angiotensina II (Figura 4) .
Figura 4. Estructura química de la ET -1. Las líneas de unión entre residuos de cisteína en la
ET-1 indican puente disulfuro (38).
En humanos se han aislado además los isopéptidos ET -2 y ET-3 que son estructural y
farmacológicamente diferent es. La ET-2 se sintetiza posiblemente en el riñón e
intestino y la ET -3 está asociada con el tejido nervioso, cerebro, pulmón, intestino y
glándula adrenal. La ET-1 se encuentra en las células endoteliales y se expresa
también en una gran variedad de tejidos (53).
La síntesis de ET -1 se sucede a partir de un propéptido llamado pre-proendotelina,
que es clivado por una endopeptidasa y forma la “big ET”, un precursor inactivo con
38-39 aminoácido que sufre un clivaje especial entre un residuo de triptófano (W) y
otro de valina (V) por acción de una metaloproteasa neutra caracterizada como
endopeptidasa putativa muy atípica, llamada Enzima Convertidora de ET (Figura 5).
Figura 5: Mecanismo de acción de la endotelina 1. Diversos factores estimuladores e inhibidores actúan sobre el gen de la endotelina 1 y el receptor tipo A,. Por medio de varios pasos enzimáticos la preproendotelina es convertida en la molécula activa, responsable de los fenómenos de vasoconstricción (29).
Las ETs no están presentes en forma constitutiva, sino que son reguladas por
cambios en la trascripción genética en respuesta a una amplísima variedad de
estímulos físicos (desgarro o tensión) y químicos (hipoxia, endotoxina, trombina,
adrenalina, angiotensina II, citoquinas, epinefrina y el ionóforo de Ca A23187). Estos
agonistas actúan por mecanismos mediados por receptores de membrana.
Se han identificado dos tipos de receptores a la Endotelina, ETA: con un rango de
afinidad (ET-1 = ET-2 > ET -3) y ETB: con un rango de afinidad (ET -1 = ET-2 = ET-
3). Estos receptores tienen una amplia distribución (corazón, riñón, cerebro, hígado,
intestino, placenta y útero) aunque sólo el primero se expresa en el músculo liso
vascular y su estimulación induce vasoconstricción y el segundo, en el endotelio que
produce vasodilatación al ser estimulado (48).
La ET-1 actúa de una forma paracrina sobre los receptores ETA y ETB, localizados
en la superficie del músculo liso vascular, asociados a la proteína G, activa la
fosfolipasa C con liberación de fosfato de inositol, producción de diacil-glicerol
(DAG) y elevación de niveles cálcicos que activan la proteína kinasa-C (PKC) y la
mitogénesis en células musculares lisas, vasculares, mesangiales y fibroblastos (ETA)
y la fosfolipasa A2 (ETB) (44).
La endotelina-1 endógena como se dijo anteriormente esta conformada por 21
aminoácidos lineales y dos puentes disulfuros (cis1-cis15, cis3-cis11). Por su parte la
ET-1 sintética se conforma por igual numero de aminoácidos, pero las cisteinas
ubicadas en la posición 1,3 ,11 y 15 son reemplazadas por alaninas facilitando de
esta manera su elaboración in-vitro (Figura 6 y 7).
10 20 | | CSCSSLMDKECVYFCHLDIIW
cccchhctthheeeeecceee
Alpha helix (Hh) : 4 is 19.05% 310 helix (Gg) : 0 is 0.00% Pi helix (Ii) : 0 is 0.00% Beta bridge (Bb) : 0 is 0.00% Extended strand (Ee) : 8 is 38.10% Beta turn (Tt) : 2 is 9.52% Bend region (Ss) : 0 is 0.00% Random coil (Cc) : 7 is 33.33% Ambigous states (?) : 0 is 0.00%
Other states : 0 is 0.00%
Figura 6: Estructura qimica de la ET-1 endógena (14) .
10 20 | | ASASSLMDKEAVYFAHLDIIW hhhhhhccthheeeeecceee
Figura 7: Estructura quimica de la ET sintetica (14).
2.5 Factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares.
La insuficiencia coronaria, los accidentes cerebrovasculares y la hipertensión son los
responsables de más de la mitad de las defunciones de origen cardiovascular (13).
Tanto en nuestro país como en el norte de América y en Europa, la angina de pecho y
los infartos son la primera causa de mortalidad, con un compromiso cada vez mayor
de individuos más jóvenes. Un 30% al 40% de los que sufren la primera crisis mueren
a las pocas horas del comienzo de la misma y un 10% al 15% en las semanas
siguientes (figura 8).
Figura 8. Aumento del riesgo de enfermedad coronaria en función de la presencia de los factores de riesgo en la adolescencia. Factores: 1. Consumo de tabaco (10 o más cigarrillos por día. 2. Tensión arterial sistólica superior a 130 mm Hg. 3. Exceso ponderal indice de talla/ peso igual o inferior a 12,8 (43).
En los países en desarrollo el número de muertes causadas por accidentes
cerebrovasculares es el doble que en los países desarrollados, en estos últimos, las
enfermedades cardiovasculares representan aproximadamente el 10% de los costos
directos de la atención de salud, y más de la mitad de dichas enfermedades ocurre en
personas de 65 años de edad o más. Estos costos generalmente equivalen a entre el
0.5% y el 1% del producto nacional bruto del país (43).
La prevención de la enfermedad, identificando y modificando los factores de riesgo,
es por lo tanto el sistema adecuado para disminuir el impacto de la enfermedad
coronaria en el país (figura 9).
Figura 9. Red etiológica de la enfermedad coronaria. Las líneas continuas indican los componentes endógenos. Las discontinuas indican los exógenos. Las líneas de puntos indican las influencias mixtas (43).
2.5.1 Factores individuales.
2.5.1.1 Edad y sexo.
Hay una relación directa entre edad, severidad y frecuencia de arterósclerosis
coronaria. Entre los 50 y los 60 años, alcanza el máximo en el hombre, mientras que
en la mujer sube progresivamente desde los 40 años. Es menos frecuente en la mujer
antes de la menopausia iguala al hombre en la posmenopausia y llega a sobrepasarlo
en las últimas décadas de la vida. Parece haber un papel protector de los estrógenos
contra la enfermedad arteriosclerótica coronaria (EAC) (43).
2.5.1.2 3 Herencia.
Los factores genéticos representan alrededor del 25% del conjunto de la etiología.
Los antecedentes familiares y genéticos desempeñan un papel fundamental en
algunos factores de riesgo coronario, en especial la hipertensión , la diabetes, el ácido
úrico y los niveles de lipoproteínas en sangre (35).
2.5.2 Factores modificables para el desarrollo de enfermedades
cardiovasculares.
2.5.2.1 Lípidos séricos.
Es uno de los factores de riesgo más estudiados. La relación entre el colesterol y la
cardiopatía coronaria se atenúa con la edad cuando el riesgo relativo se toma como
medida de la asociación. Cualquiera de las lipoproteínas provoca un aumento de
colesterol y puede llevar a la arterósclerosis y por tanto a la enfermedad coronaria. La
dieta con sobrecarga de grasa de origen animal juega un papel fundamental en la
hiperlipidemia (43).
2.5.2.2 Diabetes.
La arterosclerosis coronaria es usual en los diabéticos y en ellos aparece en una edad
más temprana. En las personas diabéticas, no sólo es más frecuente la cardiopatía
coronaria, sino que también es más elevada la letalidad. De igual forma, la diabetes se
asocia con un aumento del riesgo de mortalidad y morbilidad por accidente
cerebrovascular (23).
2.5.2.3 Gota.
La probabilidad de enfermedades coronaria aumenta al doble en los pacientes con
artritis gotosa. Este aumento de ácido úrico generalmente se acompaña de aumento de
peso, de presión arterial, de colesterol y de triglicéridos, que en conjunto constituyen
un riesgo mayor de arterosclerosis (43).
2.5.2.4 Obesidad y presión arterial.
Generalmente, la obesidad se acompaña de alteraciones metabólicas tales como
alteración de los niveles y composición de los lípidos en sangre (dislipidemias)
hipertensión arterial e intolerancia a la glucosa. Mediante estudios longitudinales y
transversales se ha confirmado que la hipertensión sistólica, ya sea por sí sola o
combinada con la presión diastólica elevada, sigue siendo un factor predictivo de la
mortalidad y morbilidad cardiovasculares (43) .
2.6 Factores emocionales.
La tensión emocional impuesta por el ritmo de vida de nuestra sociedad tecnificada se
señala como una causa de cardiopatía coronaria. Esta tensión emocional persistente
aumentaría el nivel de colesterol produciendo descargas de las sustancias conocidas
como catecolaminas, que movilizan las grasas de sus depósitos, primero los ácidos
grasos libres y luego el colesterol, facilitando su depósito en los vasos sanguíneos.
Desde el punto de vista de personalidad, es más común en individuos preocupados,
con gran sentido de responsabilidad, impulsivos y con tendencia competitiva (50).
2.7 Factores erradicables.
2.7.1 Sedentarismo.
La falta de ejerc icio y las ocupaciones sedentarias aumentan el riesgo. Entre las
razones por las cuales existe una relación inversa entre la actividad física y la
cardiopatía coronaria figuran los efectos de dicha actividad en el aumento de las
HDL, la reducción del peso corporal y el descenso de la presión arterial, y su
influencia sobre la tolerancia a la glucosa.
También se postula que la actividad física aumenta la actividad de la sintetasa
constitutiva del ON (43).
2.7.2 Tabaquismo.
La enfermedad coronaria es cuatro veces más frecuente entre los fumadores que en
los no fumadores y el índice de mortalidad por infarto del miocardio es más alto en
los fumadores porque en estos se presentan lesiones arterioscleróticas más extensas y
en más de una arteria coronaria.
La nicotina produce un aumento en la frecuencia cardiaca, vasoconstricción periférica
y aumento de la presión arterial (38).
El oxígeno es transportado por la hemoglobina de la sangre, que en los fumadores
esta alterada, por cuanto se une al monóxido de carbono producido por la combustión
del tabaco formando carboxihemoglobina, que puede llegar a reemplazar el 15% del
oxígeno unido a la hemoglobina, disminuyendo aún más el suministro de oxígeno al
corazón. Además, la nicotina facilita la entrada de LDL oxidada a la célula endotelial
(38).
2.8 Disfunción endotelial y enfermedad arterosclerótica.
El endotelio normal funciona en forma inhibitoria, manteniendo el tono muscular e
inhibiendo el crecimiento del músculo liso vascular, la adhesión y agregación
plaquetaria y leucocitaria, y la trombosis (34).
Diversos factores o condiciones alteran la función endotelial normal y las respuestas
vasomotoras, iniciando la cascada de eventos cardiovasculares que pueden dar como
resultado una enfermedad cardiaca terminal. Por eje mplo, la vasodilatación es la
respuesta vasomotora usual de la acetilcolina o el ejercicio (para acomodarse al
incremento de flujo). Sin embargo, se produce vasoconstricción en presencia de
trastornos asociados con disfunción endotelial (respuesta paradójica a la Acetilcolina)
(35).
La disfunción endotelial ocurre antes del desarrollo de una lesión aterosclerótica. En
pacientes con etapas iniciales de aterosclerosis coronaria, la función vasoactiva
endotelial se deteriora progresivamente, oscilando desde una disfunción endotelial
selectiva en pacientes con hipercolesterolemia hasta pérdida completa de la
vasodilatación endotelio-dependiente en las arterias con aterosclerosis definida
angiográficamente (59).
Sin embargo, el grado de disfunción con frecuencia no es uniforme en las arterias
coronarias con áreas de disfunción severa que alternan con áreas de menor
disfunción, sugiriendo que en algunas regiones coronarias existe un potencial
considerable para la recuperación con tratamiento adecuado (59).
2.9 ARTEROSCLEROSIS.
La arterosclerosis o aterosclerosis deriva de las palabras griegas athero que significa
“pasta” y scleros que significa “dura” . Varios factores pueden promover el desarrollo
de esta patología, entre ellos están la hipertensión, predisposición genética, obesidad,
diabetes, sedentarismo y una aumentada concentración de LDL. A estos agentes se
les puede sumar el papel de influencias mecánicas. La más clara demostración de esto
es el hecho que algunas partes del árbol vascular son mucho más propensas al
ateroma que otras. Muchos de los conocimientos sobre esta enfermedad han sido
estudiados a lo largo del siglo. En 1973 Ross y cols. en la universidad de Washington
en Seattle proponen la hipótesis que la arterosclerosis es una “reacción a daño”. Esta
hipótesis ha sido revisada y modificada a la luz de nuevos hallazgos (60).
La arterosclerosis es una enfermedad en la cual se disminuye la elasticidad de las
arterias y se da un engrosamiento de las paredes de las mismas, como resultado de
depósitos llamados placas, que se componen principalmente de colesterol, pequeñas
cantidades de fosfolípidos, grasa neutras, Calcio y fibrina. Estas placas están
ubicadas dentro de la pared de la arteria, entre el músculo liso y la íntima.
Gradualmente, la adhesión, migración y acumulación de los leucocitos en la íntima y
la transformación de los monocitos en células espumosas son eventos iniciadores de
la aterogénesis que también conducen a la formación de la estría grasa (Fig.10, 10a,)
Figura 10. La anatomía de la placa se muestra en este dibujo. Si la placa se rompe, un coágulo puede obstruir la arteria. O puede liberarse y obstruir una arteria de menor calibre (48).
Figura 10a. Este corte transversalde una coronaria muestra un gran depósito de grasa que la ha obstruido completamente (48).
Alrededor de estos depósitos adiposos y dentro de ellos se desarrolla tejido fibroso
debido a la migración y proliferación de la célula muscular lisa que causa la
progresión de la estría grasa a una lesión fibrosa intermedia y posteriormente a placa
fibrosa. Adicional a esto, el Calcio de los líquidos corporales suele combinarse con la
grasa para formar sustancias cálcicas sólidas, que por último se convierten en placas
duras semejantes a hueso (60).
Así pues, en la arterósclerosis incipiente, en las paredes vasculares sólo hay depósitos
adiposos, pero en un período ulterior los vasos pueden estar muy fibrosos y
contraídos, incluso tener consistencia ósea.
La arterosclerósis puede causar oclusión aguda de vasos coronarios por tres
mecanismos:
a. En primer lugar, la ruptura de la placa y la hemorragia resultante, estimula a las
plaquetas e inicia la coagulación que ayuda a completar el bloqueo, esta situación es
responsable de las más serias consecuencias de la arterosclerósis: ataques cardíacos y
apoplejías.
b. En segundo lugar, la grasa prominente puede separase del sitio original y ocluir
un vaso de menor calibre, obstruyendo el flujo sanguíneo.
c. Y, en tercer lugar, y menos frecuentemente, los depósitos adiposos pueden
corroer uno de los vasos diminutos llamados vasa vasorum, que se distribuyen en las
paredes de las coronarias y producir necrosis de la pared y fibrosis (37).
2.9.1 Mecanismos celulares.
Una de las propiedades del endotelio es su capacidad para oxidar las LDL. El
macrófago es la principal célula inflamatoria de la lesión arterosclerótica y es también
rica fuente de crecimiento para las células del músculo liso. A pesar de la aparente
uniformidad en su distribución, estas últimas son heterogéneas con orígenes
embrionarios diferentes y respuestas variables a estímulos heterogéneos. La mayoría
de las células proliferativas están dentro de la placa y son también altamente
responsables de la síntesis de la matriz extracelular.
Las células del músculo liso son descritas en estados fenotípicos: “contráctil” su
condición normal saludable y “sintético” o “proliferativo” en la arterosclerosis donde
las células sintetizan proteínas de la matriz, tales como proteoglicanos, colágeno y
elastina, y que constituyen más del 60% del volumen intimal (49).
En adición a sus actividades las células del músculo liso deben migrar de la media a
la íntima en respuesta al estímulo quimiotáctico porque la placa está exclusivamente
en la lesión intimal .
Aunque los linfocitos T son encontrados abundantemente dentro de las placas, su rol
no es claro. La cantidad de linfocitos T encontrada en la placa es aumentada por
citocinas proliferativas secretadas por los macrófagos adyacentes. Recientemente se
propuso que los linfocitos T dentro de las placas son específicamente respuesta a la
presencia de LDL oxidada. O como manifestación de una reacción inflamatoria en la
arteriosclerosis (2).
2.9.2 Radicales libres y disfunción endotelial.
Un radical libre es una sustancia química con un electrón libre no apareado, esto hace
a dicha molécula muy inestable, extraordinariamente reactiva y de vida media muy
corta. Estas características le confieren una enorme capacidad para combinarse
inespecíficamente en la mayoría de los casos con diversidad de moléculas integrantes
de la estructura celular: carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y derivados de cada
uno de ellos. La combinación de una molécula funcional con un radical libre da lugar
a la formación de una molécula disfuncional, lo que puede repercutir en la vida
celular.
Cuando se incrementa su concentración fisiológica, pueden producir importantes
alteraciones. Esto ocurre como consecuencia de la presencia de algunos agentes
químicos, entre los que se incluyen cambios bruscos en la disponibilidad de la presión
parcial de oxígeno tisular (34).
Los radicales derivados del oxígeno comprenden entre otros el radical superóxido
(O2-) que proviene de una serie de reacciones enzimáticas que reducen la molécula
de oxígeno, es decir ceden un electrón. El peróxido de hidrógeno(H2O2) no es
estrictamente un radical, su importancia radica en el hecho de que puede captar un
electrón y un protón, con lo cual forma un radical hidroxilo (OH-) y agua. Este
hidroxilo, se forma bajo la catalización de metales de transición , tales como Cu+ o
el Fe+2 (29).
El oxígeno molecular simple (O*) no tiene electrones no apareados, ya que en
presencia de energía el oxígeno aparea sus dos electrones en un sólo orbital, dando
lugar a la formación de 1/2O 2 que es una especie altamente reactiva, pero de vida
muy efímera (29) .
Los radicales derivados del oxígeno al interactuar con los ácidos grasos
polinsaturados dan lugar a la formación y a la propagación de peróxidos lípidos, los
cuales participan en el proceso aterogénico. Cuando las tas as de formación de los
radicales libres rebasan los mecanismos antioxidantes normales, ocurre una oxidación
molecular desmedida, al romperse el balance oxidante-antioxidante se presenta el
denominado estrés oxidativo. De esta es así, como se ha relacionado los radicales
libres y consecuentemente el estado de estrés oxidativo, en varias enfermedades como
arterosclerósis, hipertensión y preeclampsia (35).
En conclusión, un incremento en la generación de radicales libres de oxígeno
participa en la génesis de la arterosclerósis por:
a. Activar los genes envueltos en la generación de la respuesta inflamatoria en
presencia de hiperlipidemia, situación que lleva a la formación de placa
arterosclerótica.
b. Activar la proliferación de las células lisas musculares, lo que conlleva a
hiperplasia y remodelación de la pared vascular, fenómeno que se observa también en
hipertensión y restenosis.
c. Conducir a disfunción endotelial vía inactivación del NO por el radical
superóxido, que es el mecanismo básico y principal (50).
2.9.3 LDL oxidada.
Es bien conocido que los niveles aumentados de LDL circulante son fuertemente
asociados con la arterosclerósis. También, se ha establecido que estas partículas se
modifican a formas más aterogénicas en la pared del vaso, principalmente por
oxidación.
La LDL oxidada es tóxica para el endotelio, macrófagos y músculo liso. La oxidación
de las LDL está constantemente opuesta a antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos
endógenos, aún cuando estos no tiene acceso a las partes de la pared del vaso donde
las partículas de las lipoproteínas son localizadas y tiene lugar la oxidación. Una
particularidad es que el antagonista indirecto de la oxidación son las HDL; así, es
tentativo suponer que ese puede ser un mecanismo por el cual las HDL son
protectoras en la enfermedad cardiovascular arterosclerótica (49)
De acuerdo a Witztum y Steimberg, el mecanismo de la patogenicidad de las LDL es
el siguiente:
La LDL penetra y es retenida en la íntima de la pared del vaso, donde sufre una
modificación oxidativa mínima. Entonces, los monocitos son atraídos y se adhieren al
endotelio, migran al interior del subendotelio y se diferencian en macrófagos, los
cuales expresan el receptor barrredor. Luego, la LDL sufre un proceso de mayores
modificaciones oxidativas por parte de los macrófagos y otras células en la íntima, y
entonces es atrapada vía el receptor barredor para formar las “células espumosas”
ricas en lípidos (figura 11). La LDL oxidada causa disfunción endotelial e injuria así
como necrosis de las células espumosas, teniendo como resultado la liberación de
enzimas liposomales y restos necróticos. Estas partículas rotas también ejercen
efectos adversos sobre las celulas endoteliales.
Figura 11. La LDL es atrapada en el espacio subendotelial, donde puede ser oxidada por células musculares, endoteliales y macrófagos. La LDL oxidada estimula (signo +) la quimiotaxis de monocitos (A) e inhibe (signo -) la salida de estos desde la pared vascular (B). Estos se diferencian en macrófagos que fagocitan LDL oxidada, transformandose en células espumosas (C). La LDL oxidada también causa disfunción endotelial e injuria (D), necrosis de la células espumosas (E), ocasionando la liberación de enzimas liposomales y restos necróticos, que ejercen también efectos adversos (43) .
Así, varios estudios han demostrado que la relajación del músculo liso vascular
estimulado por vasodilatadores como el ON y PG dependientes del endotelio son
inhibidos particularmente por LDL. Además, se ha demostrado que la LDL oxidada
potencializa la vasoconstricción inducida por sustancias agonistas a través de un
efecto directo en el músculo liso vascular, también tiene propiedades aterogénicas y
citotóxicas y se ha propuesto que es de esta forma como la LDL dentro de la pared
arterial y especialmente en la placa arterosclerótica ejerce sus efectos aterogénicos.
La LDL oxidad consume cofactores necesarios para la síntesis de ON, es decir,
inhibe la producción de este y causa disfunción endotelial (49).
Cuando se ha formado la placa arterosclerótica se produce una disrupción del
endotelio vascular y una deficiente generación de las sustancias biológicamente
activas producidas por él, como el ON, las prostaciclinas y junto a esto se observa un
incremento en la concentración de ET -1 (49).
2.10 Papel de l a ET-1 en la arterosclerosis.
Los tres isopéptidos de ET tiene un parecido importante, tanto en estructura como en
actividad biológica a las sarafotoxinas, una familia de isopéptidos aislados del veneno
de la serpiente Atractospis engoddensis, sugiriendo un posible origen evolutivo
común (2).
Se ha establecido que pacientes con arterosclerósis coronaria muestra una paradójica
vasoconstricción en respuesta a la acetil-colina intracoronaria asi como al ejercicio.
Estudios in vitro han mostrado que los factores proaterogénicos, como la LDL
oxidada induce el aumento de síntesis y liberación de ET-1 y cómo la expresión de
mRNA que codifica para la ET -1 está aumentado en lesiones arterioscleróticas.
Niveles aumentados de ET -1, tanto en tejidos como en sangre, han sido encontrados
en humanos con arterosclerósis avanzada y ET-1 inmunorreactiva ha sido
evidenciada en muestras de aterectomías coronarias de pacientes con arterosclerósis.
Puede suceder que durante la arterosclerósis temprana exista un disbalance ent re ON
y ET -1 que conlleve a la producción y liberación de ET -1 y a la potencialización de
su acción vasoconstrictora (5).
La ET-1 plasmática podría también servir como factor pronóstico en falla cardiaca
congestiva (CHF), esto gracias a estudios animales que sugieren que la ET -1 puede
tener un severo efecto cardiotóxico como también efectos arritmogénicos.
El aumento de la concentración de ET -1 estuvo asociado con una alta mortalidad
cardiaca y, este aumento se mantuvo hasta después del infarto del miocardio. Por eso,
los niveles de ET -1 han sido recientemente identificados como un predictor de muerte
cardiaca 3 días después de ocurrir el infarto en pacientes con moderada CHF, sin
encontrar relación entre las concentraciones de ET-1 y el sexo o la edad, y
aparentemente ayuda a la severidad de la falla cardiaca .
Otros estudios realizados por Lerman et al, encontraron que la inmunorreactividad de
la ET-1 circulante estaba realzada en la circulación coronaria en pacientes con
disfunción endotelial coronaria y arterosclerósis temprana. La administración de
acetil-colina intracoronaria incrementa la concentración de ET-1 coronaria en estos
pacientes y estaba asociada con la vasoconstricción. Además, los niveles de cGMP,
el segundo mensajero para la actividad del ON, estaba disminuido en estos pacientes
(5).
Es probable que el control de la producción de ET-1 está a nivel de trascripción de
mRNA preproET, aunque el control de su formación a partir de la big -ET por la
enzima convertidora de ET puede ser también relevante.
Para disminuir la gravedad de la arterosclerosis, y conociendo que las sustancias
vasodilatadoras y las vasoconstrictoras producidas por el endotelio tienen una
relación inversamente proporcional, el ON y PGI2 han sido usados para inhibir la
producción de ET -1 por ser dependientes de cGMP. A bajas concentraciones, la ET -1
actúa sobre receptores de ETB en células endoteliales, estimulando la producción de
PGI2 y ON (16). Los niveles de ET-1 también están asociados con hipertensión, ya
que se encontró un incremento en la expresión de ET-1 en el endotelio de ratas con
forma severa de hipertensión, aunque no aumentó el nivel de ET -1 en plasma (48). Lo
anterior se corrobora con estudios europeos y estadounidenses, que demostraron la
participación
de la ET-1 en la secuencia de eventos de la remodelación vascular, en particular en
los individuos denominados “ahorradores de sodio” que presentan hipertensión
sensible a la sal. En estos sujetos, el ion sodio promueve la producción de ET -1 y
ello se traduce en elevación de la resistencia vascular periférica e hipertensión (figura
12) .
Si la ET -1 está actualmente envuelta en el desarrollo y la fisiopatología de la
hipertensión, esta puede resultar de : aumentada respuesta del músculo liso vascular
al péptido, aumentada secreción de mediadores neurohumorales de la regulación de la
presión sanguínea (norepinefrina, renina, angiotensina II) o producción disminuida de
los mediadores vasodilatadores (2).
Figura 12. En modelos animales de hipertensión sensible a la sal, se ha demostrado la liberación de ET-1 por parte del endoteliovascular. Ocasionando vasoconstricción y el incremento de fibras tensionales (29).
Como blanco terapéutico para disminuir la acción de la ET-1 se podría trabajar sobre
la enzima convertidora. Aparte de esto, en algunos países el tratamiento para
disminuir el riesgo de infarto por arterosclerósis se basa en la administración de ON
inhalado, pero aún no se ha inhibido la producción de ET-1.
2.11 INMUNIZACION
2.11.1 Antecedentes históricos.
Durante centurias se ha reconocido que los individuos quienes se recuperan de
ciertas enfermedades quedan protegidos de recaídas. La introducción moderadamente
exitosa, pero riesgosa , de pequeñas cantidades de liquido de pústulas de viruela en la
piel de personas no infectadas, fue el primer esfuerzo por imitar esta fenómeno
natural. La introducción por Edward Jenner de la vacunación con virus de la viruela
de la vaca (1796), para proteger contra la viruela humana , fue el primer uso
documentado de una vacunada viral viva atenuada y el inicio de la inmunización
moderna. En 1876 Robert Koch demostró la causa de la virulencia especifica del
ántrax y de ahí en adelante, se identificaron con rapidez la causa de varias
enfermedades comunes. A partir de aquí siguieron los intentos para desarrollar
agentes inmunizantes .
2.11.2 Concepto y tipo de inmunización.
La inmunización es un proceso que induce o aumenta una respuesta inmunitaria
frente a un antígeno. La inmunización puede ser activa en la cual la administración
de un antígeno origina como resultado la producción activa de inmunidad o pasiva en
la cual la administración de suero que contenga anticuerpos o células sensibilizadas
proporcionan protección pasiva al receptor (57).
La inmunización activa primaria produce una concentración protectora de anticuerpos
con mas lentitud que el periodo de incubación que la mayor parte de las infecciones ,
por tanto deberá inducirse antes de la exposición del agente etiológico. En contraste
la reinmunización de refuerzo en un sujeto previamente inmunizado proporciona un
incremento secundario rápido de la inmunidad (15 ).
La respuesta inmunitaria se induce por una sustancia denominada antígeno. La
respuesta puede implicar la parte humoral o celular exclusivamente del sistema
inmunitario pero por lo común implica ambas.
2.11.3 Antígeno.
La capacidad de provocar una respuesta inmunitaria y la naturaleza e intensidad de
un respuesta, no depende solamente de las propiedades físico-químicas del propio
inmunógeno sino también de otros factores tales como las características del
organismo que se inmuniza, la vía de contacto y la sensibilidad de los métodos
usados para detectar la respuesta.
Los factores que influyen sobre la inmunogenicidad son complejos, pero pueden
hacerse varas generalizaciones importantes:
? Propiedades del antígeno: La inmunogenicidad esta relacionada con el tamaño
molecular. Los antígenos mas potentes son proteínas con pesos moleculares
superiores a 100.000 daltons. Las moléculas en extremo pequeñas , como los
aminoácidos, monosacáridos y la mayor parte de otras especies con PM menor de
10.000 daltons de ordinario no son inmunógenicas. Unas cuantas sustancias con pesos
moleculares por debajo de 1.000 daltons pueden inducir respuesta in munitaria pero
en la mayor parte de los casos solo lo hacen cuando se fijan a una macromolécula
de un huésped como una proteína.
Lo mas importante es que el sistema inmunitario discrimina normalmente entre lo
propio y lo ajeno, de manera que solo moléculas extrañas al huésped son
inmunógenicas.
? Modo de contacto: Que una sustancia provoque o no una respuesta inmunitaria
también depende de la dosis y de la vía por la cual penetra al cuerpo. Es posible que
una cantidad de sustancia que no tiene efecto cuando se inyecta intravenosa,
provoque una respuesta de anticuerpo copiosa, cuando se inyecta por vía subcutánea.
? Tanto la intensidad como el carácter de la respuesta a un inmunógeno puede
alterarse si se administra en combinación con otros. Es to se debe a que la respuesta
en proceso a una sustancia puede afectar las concentraciones locales de citocinas
así como al tipo y estado de activación de células inmunitarias locales , y estas a su
vez, favorecen o no tipos particulares de respuesta a otros inmunógenos. Ciertas
sustancias llamadas adyuvantes e inmunomoduladores son en especial eficaces para
aumentar o modificar las respuestas a muchos inmunógenos distintos cuando se
administran junto con ellos.
2.11.4 Adyuvantes.
La respuesta a un inmunógeno se puede incrementar si se administra como mezcla
con sustancias llamadas adyuvantes (57). Los adyuvantes actúan en mas de una de
las siguientes maneras:
? Al prolongar la retención del inmunógeno.
? Al aumentar el tamaño efectivo del inmunógeno y así promover la fagocitosis y
la presentación por macrófagos
? Al estimular la salida de macrófagos y otros tipos celulares inmunitarios al sitio
de la inyección.
? Al promover la producción local de citocinas y otras actividades inmunológicas
de tales células inmunitarias.
Se ha empleado varios adyuvantes en animales de experimentación, de los cuales el
mas potente es el adyuvante de Freund (CFA complete Freund´s adjuvant), una
emulsión de agua en aceites que contienen micobacterias muertas. El CFA parece
actuar al proporcionar un deposito para el antígeno, y al estimular macrófagos y
ciertos linfocitos; sin embargo sus intensos efectos inflamatorios evitan su uso en el
ser humano.
2.12 Respuesta inmune frente a proteínas.
La exposición del sistema inmunitario a los antígenos extraños pone en marcha una
serie de acontecimientos que conducen a la activación linfocitaria y a la generación
de la inmunidad humoral y de la mediada por células. Diferentes antígenos y de
condiciones de inmunización llevan a respuestas que varían cuantitativa y
cualitativamente (1).
Tres factores principales influyen en la naturaleza y la magnitud de la respuesta
inmunitaria:
? El tipo de antígeno así como su dosis y vía de entrada
? El numero y tipo de células accesorias que interactuan inicialmente con el
antígeno e inducen la activación linfocitaria
? Naturaleza de los linfocitos respondedores.
Aunque estos factores se consideran por separado, debemos tener en cuenta que ,los
antígenos, las células accesorias y los linfocitos actúan juntos, influyen entre si de
múltiples formas, y no pueden separarse en la inducción o regulación de las
respuestas inmunitarias.
Por esto, los antígenos son la primera señal obligatoria para la activación linfocitaria.
La naturaleza del antígeno tiene una influencia significativa sobre el tipo y magnitud
de la respuesta inmunitaria que aparece. Esos efectos reguladores son de diferentes
tipos:
Antígenos diferentes bajo el punto de vista químico estimulan diferentes tipos de
respuestas inmunitarias. Mientras que los antígenos proteicos estimulan respuestas
humorales y mediada por células.
2.12.1 Secuencia de acontecimientos en la producción de anticuerpos en
respuesta a proteínas.
Los principales pasos en la respuesta de anticuerpos frente a antígenos proteicos son
los siguientes (Figura 13):
? Uno a dos días de administrar el antígeno proteico (péptido sintético) a un
individuo virgen los macrófagos y las células dendríticas presentan los antígenos
a las células T CD4+ específicos para el antígeno situados en las zonas ricas en
células T del bazo y de los ganglios linfáticos. Grupos de células T activadas se
acumulan en esta regiones. Estas células T expresaran el ligando de CD 40, el gp
39, y evolucionaran a células efectoras productoras de citocinas.
? Los linfocitos B también se encuentran con el antígeno, pueden ser estimulados
para entrar en el ciclo celular y presentan fragmentos peptídicos del antígeno a las
células T cooperadoras activadas. Debido al contacto célula mediado por el
CD40 y el gp39, así como a la exposición a las citocinas de las células T, las
células B presentadoras de antígeno comienzan a proliferar y a diferenciarse en
células productoras de anticuerpos. No se sabe si el encuentro entre células T o B
especificas para el antígeno es enteramente aleatorio o si esta regulado por
estímulos que controlan la migración celular y la adhesión intracelular. Estas son
las fases de reconocimiento y activación de las respuestas humorales.
Figura 13: Interacciones celulares en las respuestas humorales frente antígenos proteicos (1)
2.13 ELISA.
A través del tiempo se ha podido observar la utilización de los antígenos y de los
anticuerpos como herramientas en la investigación y en el diagnostico clínico. Los
análisis mas comúnmente utilizados son los inmunoanálisis los cuales sirven para
detectar y cuantificar los antígenos y los anticuerpos. Las pruebas de inmunoanálisis
son usadas en el estudio de enfermedades infecciosas. Además de ser usadas para
identificar agentes causales de la enfermedad, para valorar el alcance y la naturaleza
de la enfermedad y medir niveles fisiológicos de hormonas. Entre las técnicas de
inmunoanálisis mas empleadas se encuentra el ELISA (Análisis de inmunoabsorción
enzimática) la cual fue descrita por primera vez en 1971 por Engvall y Van Weemen.
El ELISA provee métodos altamente sensibles y precisos además de analizar
rápidamente grandes cantidades de numero de muestras, dichos análisis son
versátiles y han sido aplicados a un amplio rango de agentes biológicos, como lo son
los virus, bacterias, hongos, parásitos, etc. El ELISA y pruebas relacionadas
involucran el uso de enzimas para obtener resultados colorimetricos reemplazando
así el uso de radioinmunoanálisis (7).
Ejemplo de áreas especificas en las cuales el ELISA a sido aplicado en la
investigación y en el diagnostico son:
1. Detección e identificación de todo o de partes de antígenos (tipificación).
2. Discriminación de antígenos infecciosos (subtipificación).
3. Cuantificación de todos o partes de antígenos para la estimación de parásitos o
estimación de proteínas inmunógenicas en vacunas.
4. Identificación de anticuerpos específicos, serodiagnosticos para estudios
epidemiológicos (seroconversión).
5. Cuantificación de isotipos específicos de anticuerpos.
Por definición el ELISA utiliza enzimas acopladas a uno de los reactivos que se
utilizan en la prueba. Seguido de esto la adición de enzimas relevantes sustrato /
cromogeno, las cuales causan cambios en el color; los resultados pueden ser
cuantificados usando espectrofotómetros especialmente diseñados. El hecho que
proteínas (anticuerpos) y carbohidratos pueden ser acoplados pasivamente a fases
sólidas a sido explotado en mas aplicaciones del ELISA. Desde que uno de los
componentes este unido a la fase sólida por absorción pasiva, los reactivos que
pueden ser adicionados y después de un periodo de incubación el material reactivo
pueda ser lavado, tal ensayo se denomina como ELISA heterogéneo (7).
El EIA ( Inmunoanálisis enzimático) es capaz de detectar cantidades muy pequeñas
de reactivos inmunológicos. Su clasificación depende de:
a) El reactivo que hay que determinar, es decir antígeno o anticuerpo.
b) El reactivo marcado.
c) El método de separación de los reactivos unidos o libres.
Existen varios criterios importantes para seleccionar un marcador enzimático
particular, entre otros:
a) El numero de recambio o el numero de moléculas de sustratos que se convierten
en productos por lugar enzimático / unidad de tiempo.
b) Pureza.
c) Sensibilidad
d) Facilidad de velocidad de detección.
e) Ausencia de factores que puedan interferir en el liquido que hay que analizar.
f) Grupos reactivos potenciales.
g) Estabilidad
Existen dos tipos fundamentales de EIA el heterogéneo y el homogéneo. En el
primer sistema la reacción antígeno - anticuerpo no modifica la actividad del
marcador enzimático en el segundo, la interacción modula la actividad de la enzima,
lo que hace que desaparezca la necesidad de un paso de separación.
2.13.1 EIA heterogéneos.
Todos los EIA heterogéneos tienen, al menos, un paso de separación para diferenciar
entre el material que ha reaccionado y el que no lo ha hecho. En el sistema de EIA
heterogéneo, la enzima sobre el antígeno y el anticuerpo marcados conserva su
actividad, incluso después de la reacción con el anticuerpo o antígeno recíprocos.
El ELISA es un EIA heterogéneo basado en el mismo principio que el RIA. En el
ELISA, la actividad enzimática en la fracción unida y en la libre se cuantifica por la
conversión, catalizada po r la enzima, de un producto relativamente incoloro o no
fluorescente.
Tabla1 : Inmunoanálisis (EIA): ventajas e inconvenientes
A. Ventajas. 1. Pueden desarrollarse análisis sensibles por el efecto de amplificación de las enzimas 2. Pueden desarrollarse múltiples análisis simultáneamente 3. Se puede realizar una amplia variedad de configuraciones analíticas 4. No hay riesgo de radiación durante el marcado ni en la eliminación de productos de desecho 5. Se puede desarrollar un EIA rápido y simple, adaptable a la automatización B. Inconvenientes 1. La actividad enzimática puede afectarse por los constituyentes del plasma 2. Los radioinmunoanálisis han alcanzado actualmente una sensibilidad muy alta no dada por análisis
homogéneos.
Tabla2: Clasificación de las técnicas de ELISA
2.13.1.1 Elisa indirecto para medir anticuerpo.
Se trata de otro tipo de ELISA para medir la concentración de anticuerpo en las
muestras de líquidos biológicos. En este procedimiento se emplea antígeno
inmovilizado, que reacciona con la muestra de anticuerpo. El paso siguiente cosiste
en un lavado y la reacción posterior con anticuerpo marcado enzimáticamente y
especifica para inmunoglobulina de la especie que se trata de analizar.
Análisis competitivos empleando. 1. Conjugando antígeno – enzima 2. Análisis de anticuerpo marcado de enzima. Análisis no competitivos 1. Análisis inmunoenzimétrico sandwich de dos sitios 2. Análisis indirecto para medir el anticuerpo
3 PROBLEMÁTICA.
Conociendo el gran impacto que ocasiona en la sociedad, la enfermedad coronaria, no
debe ser considerada solamente como un problema de salud pública sino como un
problema socioeconómico de la mayor gravedad por cuanto afecta con gran
frecuencia a individuos entre los 45 y los 55 años, en el período de mayor
productividad y responsabilidad familiar y cuya muerte o incapacidad ocasiona
traumatismos en la familia y en la economía del país .
Sabiendo que la arterosclerósis empeora no sólo por la perpetuación de los factores
desencadenantes, sino también por la respuesta del cuerpo cuando se enfrenta a estos,
la verdadera forma de disminuir el impacto de dicha patología, es de carácter
profiláctico, previniendo y/o disminuyendo la exposición a los factores de riesgo.
Pero, en una sociedad tan cambiante, como la actual, donde se observan estilos de
vida tan agitados en los que las personas están expuestas a grandes descargas de
estrés , y asumiendo pésimos hábitos alimenticios y comportamentales , las campañas
de prevención han sido casi inútiles.
Se ha demostrado por técnicas de Inmunofluoresencia el deposito de endotelina 1 en
la pared de las arterias afectadas por arteriosclerosis (52) pero aun no existen
estudios previos que demuestren que la inyección subcutánea de endotelina 1 pueda
generar anticuerpos contra ET-1. Si se logra estandarizar la técnica de ELISA para
demostrar la generación de anticuerpos anti-ET1, en un futuro se podrían generar
alternativas terapéuticas de sensibilización con endotelina para el manejo de la
aterosclerosis, disfunción endotelial, insuficiencia cardiaca congestiva, así como para
prevenir la reestenosis después de la angioplastia.
4 JUSTIFICACIÓN.
La segunda causa de muerte en Colombia se le atribuye a enfermedades
cardiovasculares como la son HTA, Arteriosclerosis, Falla cardiaca congestiva,
Infarto agudo de miocardio, entre otras. Las enfermedades cardiovasculares (ECV)
se constituyen en la epidemia de fin de siglo en los países desarrollados y
subdesarrollados, siendo un problema de salud pública y considerándose como una de
las enfermedades que pertenecen al grupo denominado “enfermedades catastróficas“.
Es necesario enfrentarlas agresiva y rápidamente, y con base a un adecuado
conocimiento de las particularidades epidemiológicas que presentan nuestras
poblaciones y de un apropiado entendimiento de los mecanismos etio-fisio-
patológicos básicos que conllevan a una alteración de la función endotelial. En este
contexto, el cabal conocimiento del papel crucial que cumple el endotelio vascular en
la fisiología vascular y en la fisiopatología de la aterosclerosis es imprescindible.
Como es bien conocido los niveles altos de endotelina producidos en el endotelio
causan efectos importantes a nivel cardiovascular explicando de este modo la
relación que tienen con la falla cardiaca.
Los efectos biológicos de dicha endotelina depende de su interacción con receptores
localizados en la membrana de las células de los órganos del sistema cardiovascular.
El mas importante de estos es el receptor de endotelina A (ETA), presente en las
células del músculo liso vascular dicho receptor presenta afinidad especifica por
endotelina 1 y produce contracción y proliferación celular (30).
Actualmente se ha investigado el papel de la endotelina 1 en la génesis de la placa
aterosclerótica,(50) pero aun su rol no a sido bien establecido. Sin embargo en
estudios recientemente publicados se ha demostrado un aumento de las
concentraciones de endotelina 1 en la placa aterosclerótica y en el plasma de
pacientes con enfermedad aterosclerótica y síndromes coronarios agudos, y aún en
pacientes con hipercolesterolemia y disfunción endotelial sin evidencia de
aterosclerosis. Se ha demostrado por técnicas de Inmunofluoresencia el deposito de
endotelina 1 en la pared de las arterias afectadas por arteriosclerosis (52) pero aun no
existen estudios previos que demuestren que la inyección subcutánea de endotelina 1
pueda generar dichos anticuerpos. Este trabajo busco determinar la producción de
anticuerpos contra ET-1 después de haber realizado una previa inmunización en
cerdos, por medio de la estandarización de la técnica de Elisa, para que en el futuro
la inmunización con ET-1 sea utilizada como alternativa terapéutica en pacientes con
riesgo cardiovascular en etapas tempranas en el manejo de aterosclerosis, disfunción
endotelial , en insuficiencia cardiaca congestiva y para prevenir la reestenosis después
de una angioplástia.
5 OBJETIVOS.
5.1 OBJETIVO GENERAL.
Demostrar la generación de niveles anticuerpos anti-endotelina 1 detectables en
plasma, mediante la inyección subcutánea del antígeno endotelina 1 en cerdos.
5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.
a. Estandarizar la técnica de Elisa para la determinación de anticuerpos contra
endotelina 1 en cerdos.
b. Comprobar que la sensibilización subcutánea con endotelina 1 no tienen efectos
a corto y mediano en los cerdos.
c. Titular los niveles de antiendotelina 1 en plasma de cerdos inmunizados.
6 MATERIALES Y METODOS.
6.1 Tipo de estudio.
Estudio analítico tipo experimental.
6.2 Hipotesis.
Determinar la presencia de anticuerpos contra ET -1 en los grupos 2 y 3 después de
realizar la inmunización subcutánea con ET en plasma de cerdos.
6.3 Materiales
? Placas de 96 pozos Nunc-Imno plate MaxiSortp Surface. Nunc Brand Product.
? Pipetas de 10ml.
? Tubos Falcon
? Micropipetas de 0.5 a 10?l
? Micropipetas de 10 a 100?l
? Micropipetas de 100 a 1000?l
? Jeringas a 2 ml.
6.4 Equipos.
Para el desarrollo de los diferentes procedimientos realizados en este trabajo se
utilizaron los siguientes equipos
? Lector de ELISA Multiskan MCC/340.
? Vortex, marca thermolyne (Maxi Mix II)
? Nevera de refrigeración , marca Supernordico.
6.5 Reactivos
? Adyuvante completo de Freund, Sigma F5881 10x10ml Lote 11K8928. Cada ml
contiene 1mg de Micobacterium tuberculosis (H37RA ATCC 25177)
? Adyuvante incompleto de Freund , Sigma F 5506 10x10ml Lote 51K8929.
? PBS 1x pH7.2 (Buffer fosfato Salino)
? Buffer citrato pH 5.0
? Ácido clorhídrico HCl 2N
? Albúmina bovina (BSA). A2153 50g. Lote 40K0896. Sigma
? Tween 20 Lote 051K8203 10nM Buffer fosfato pH 7.4 0.05% Tween 20 Sigma.
? Anti-conejo IgG conjugado peroxidasa. Anticuerpo desarrollado en cabra.
Producto No. A6667 Casa comercial Sigma..
? Anti- cerdo IgG conjugado peroxidasa. Anticuerpo desarrollado en conejo.
Producto No. A5670 Casa comercial Sigma
? OPD (Ortofenilendiamina). P6787. Lot 13K8254 50 tabletas 2mg sustrato por
tableta.
6.6 Animales.
6.6.1 Conejos.
Se utilizaron dos conejos adultos como prueba piloto, los cuales fueron inmunizados
con el péptido sintético (Endotelina 1), un conejo denominado No 1 y otro
denominado No 2.
6.6.2 Cerdos
Se utilizaron 30 cerdos hembras de la raza Landrace con edad inicial de 3meses que
fueron divididos en tres grupos de acuerdo al esquema de inmunización de la
siguiente manera:
Grupo control o No 1 Cerdos 1-10
Grupo No 2 Cerdos 11-20
Grupo No 3 Cerdos 21-30
6.7 Antígeno utilizado.
? Endotelina 1 Ala 1,3,11,15. Casa Bachem. Estructura: H2N-Ala-Ser- Ala- Ser-
Ser- Leu- Met-Asp-Lis-Glu-Val-Tir-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH. Peso
molecular:2367.9.
6.8 Esquema de inmunización.
6.8.1 Conejos.
Se tomaron muestras previas de sangre venosa y post a las inmunizaciones en tubo
seco, las cuales se dejaran coagular a 37°C y posteriormente se centrifugaron a 2500
rpm por 5 minutos. Finalmente fueron almacenadas a –70°C para su posterior
utilización. De acuerdo al siguiente esquema:
1 2 3 4 Inmunización.
0 15 30 40 días
Conejo 1 10?g 10?g 10?g 20 ?g ET Conejo 2 10?g 10?g 10?g 20 ?g ET CFA/ IFA 75/25 50/50 25/75 25/75 % Volumen Inoculado
1ml 1ml 1ml 1ml
Tabla 3: Inmunización de conejos. ( IFA: Adyuvante incompleto de Freund . CFA: Adyuvante completo de Freund). 6.8.2 Cerdos.
Se tomaron muestras de sangre venosa previas a las inmunizaciones y luego de la
tercera inmunización, en tubo heparinizado las cuales se centrifugaron a 3500 rpm ,
el plasma obtenido fue almacenado a –70°C para su posterior utilización.
1 2 3 Inmunización .
0 15 30 dias
Tabla 4: Inmunización de cerdos
6.9 Protocolo para la estandarización de la técnica de ELISA para la
determinación de anticuerpos contra endotelina 1.
1. Se sensibilizo la placa de Elisa con 100? l ET 1 por pozo (concentración
1?g/ml de PBS 1x pH 7.4). Incubar a 4°C toda la noche.
2. Se bloqueo la placa con 200 ? l de PBS tween 20 al 0.05%- BSA 1% por 1
hora a temperatura ambiente.
3. Se colocaron 100? l de las diluciones (1/40 hasta 1/5120) de suero de conejo
o plasma de cerdo pre -inmunización, post - a inmunización por duplicado.
Dichas diluciones se realizaron con PBS tween 20 al 0.05%- BSA 1% . Se
incubaron 1 hora a temperatura ambiente.
4. Se lavo 5 veces con 200 ?l de PBS tween 0.05%
5. Se agregaron 100? l del conjugado anti- conejo o anti-cerdo. Incubar 1 hora en
oscuridad a temperatura ambiente.
6. Se lavó 5 veces con 200 ?l de PBS tween 0.05%.
Grupo control 0?g 0?g 0?g ET Grupo 2 20 ?g 20?g 40?gET Grupo 3 2?g 2?g 4?g ET CFA/IFA 75/25 50/50 25/75% Volumen inoculado
1ml 1ml 1ml
7. Se agrego 100?l de OPD (sustrato) por pozo 2mg de OPD/ 5ml de buffer
citrato pH 5.0 mas peroxido de hidrógeno 2.5?l/5ml. Incubar 20 minutos en
oscuridad a temperatura ambiente.
8. Se detuvo la reacción con 50? l de HCl 2N.
9. Lectura en el Multiskan a 450 nm.
El titulo discriminatorio del conjugado Anti- conejo IgG peroxidasa en la
estandarización del ELISA para la determinación de anticuerpos anti -endotelina en
conejos fue de 1/500.
El titulo discriminatorio del conjugado Anti- cerdo IgG peroxidasa en la
estandarización del ELISA para la determinación de anticuerpos anti -endotelina en
cerdos fue de 1/8000.
Se determino el punto de corte para los conejos tomando la lectura de la densidad
óptica a 450 nm de los sueros preinmunización , se obtuvo el promedio y las
respectivas desviaciones estándar . El punto de corte de los conejos pre-inmunizados
fue la media + 2 desviaciones estándar
El punto de corte para los cerdos preinmunización , se obtuvo de la media de los
plasmas preinmunización + tres desviaciones estándar, mejorando el nivel de
discriminación.
6.10 Pruebas clínicas realizadas en cerdos
Los análisis clínicos realizados a los cerdos tanto pre como post-inmunización se
realizaron con el fin de establecer si se producían cambios hemodinamicos y
bioquímicos en los cerdos demostrando que no habían efectos atribuibles a la
inmunización a corto y a mediano plazo. Estos análisis fueron realizados en la
Fundación Cardioinfantil utilizando los siguientes métodos:
PRUEBA METODO SISTEMA EQUIPO Cuadro hematico 3D (VCS) Automatizado STKS Coulter
Rochem -Biocare Plaquetas 3D (VCS) Automatizado STKS Coulter
Rochem -Biocare BUN Colorimétrico-
Ureasa Automatizado Vitros 250
Creatinina Enzimatico Automatizado Vitros 250 Sodio Ion selectivo directo Automatizado Vitros 250 Potasio Ion selectivo directo Automatizado Vitros 250 Cloro Ion selectivo directo Automatizado Vitros 250 Calcio Colorimétrico Automatizado Vitros 250 Magnesio Colorimétrico Automatizado Vitros 250 Amilasa Enzimático 37°C Automatizado Vitros 250 Colesterol Enzimático Automatizado Vitros 250 Triglicéridos Enzimático-Glicerol
quinasa Automatizado Vitros 250
HDL Enzimático Automatizado Vitros 250 Ácido úrico Uricaza Automatizado Vitros 250 Proteínas Biuret Automatizado Vitros 250 Albúmina Verde de
bromocresol Automatizado Vitros 250
LDH Enzimático 37°C Automatizado Vitros 250 F. alcalina Enzimático 37°C Automatizado Vitros 250 Bilirrubinas Colorimétrico Automatizado Vitros 250 Osmolaridad Punto de
congelación Automatizado Fiske-Osmometro
Tabla 5: Método para pruebas clínicas en cerdos
6.11 Análisis estadísticos.
Para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas en las pruebas
de ELISA realizadas en los cerdos para la cuantificación de anticuerpos anti- ET se
realizo una prueba de MANN-Whitney .
Para evaluar la presencia de distribución normal de los datos clínicos de los cerdos
se realizo la prueba Shapiro-Wilk empleando el programa Statistix 7.0.
Una vez establecida la distribución norma l; a los datos normales se le aplico la prueba
de ANOVA para ver si había diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos (p?0.05).
Los datos no parametricos, fueron evaluados utilizando la prueba de Fischer exacta
ya que se trabajo con grupos de cinco o menos de cinco datos . Esta se realizo con el
fin de establecer si hay diferencias estadísticamente significativas entre los datos
(p?0.05) empleando Excel .
Los resultados obtenidos se interpretaron a través de medida de tendencia central
como la media y medida de dispersión coma la DS obtenidas a partir del empleo de
Excel.
7 RESULTADOS.
En la realización del ELISA para la determinación de anticuerpos anti-endotelina 1
en suero de los conejos se utilizo como titulo discriminatorio de conjugado 1/500
(anti-conejo) después de haberse realizado varios ensayos con diferentes diluciones
de conjugado teniendo en cuenta las indicaciones de la casa comercial y
sensibilizando la placa con suero de conejo diluido 1/50.
La determinación de anticuerpos contra endotelina 1 en suero de los conejos pre
inmunización y luego de la primera inmunización demuestran que no hay presencia
de anticuerpos en ninguno de los dos conejos. Después de haber realizado la segunda
inmunización se evidenció la presencia de anticuerpos en el conejo No2 siendo
positivos hasta una dilución 1/320; mientras que en el conejo No1 no se observaron
anticuerpos. Luego de la tercera y cuarta inmunización el conejo No 1 el titulo de
anticuerpo fue de 1/320 y 1/80 respectivamente. En el conejo No 2 los títulos de
anticuerpo luego de la tercera y cuarta inmunización fueron 1/1280 y 1/640
respectivamente. Es interesante notar que el titulo de ambos conejos disminuyó
después de la cuarta inmunización, la cual fue con una mayor dosis. (Figura 14)
1
10
100
1000
10000
Inmunización
Rev
erso
del
tít
ulo
Conejo 1
Conejo 2
Conejo 1 320 80
Conejo 2 320 1280 640
Pre Post 1 Post 2 Post 3 Post 4
Figura 14: Niveles de anticuerpos pre y post inmunizaciones de los conejos 1 y 2. El conejo No1 presenta anticuerpos despues de la tercera y cuarta inmunización (1/320-1/80). El conejo No 2 presenta anticuerpos despues de la segunda, tercera y cuarta inmunizacion (1/320, 1/1280, 1/640)
El punto de corte para determinar positivos y negativos se obtuvo de la media de
controles negativos + 2 desviaciones estándar. En donde la media de los controles
negativos fue de 0.293 y la desviación estándar de los controles negativos fue de
0.093, obteniéndose como punto de corte 0.479 (Figura 15)
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
40 80 160 320 640 1280 2560 5120
Dilución
OD
450
nm
Conejo 1 Post 3
Conejo 1 Post 4
Conejo 2 Post 2
Conejo 2 Post 3
Conejo 2 Post 4
Figura 15: Punto de corte. Elisa determinación anticuerpos anti-ET en conejos.Se ve una
relación directamente proporcional entre la dilución y la OD, es decir entre mayor concentración de anticuerpos en suero, mayor OD a 450mn. ( OD: Densidad óptica).
El titulo optimo de conjugado fue 1/8000 (anti-cerdo) después de haber realizado
varios ensayos con diferentes diluciones, teniendo en cuenta las indicaciones de la
casa comercial y sensibilizando la placa con plasma de cerdo diluido 1/50. Luego se
determino la presencia de anticuerpos anti-ET1; para esto se utilizaron tres muestras
al azar del grupo No 2 para confirmar la determinación del conjugado.
El punto de corte para determinar positivos y negativos se obtuvo de la media de los
controles negativos (grupo control o No1) + 3 Desviaciones estándar, en donde la
media de los controles negativos fue de 0.123, la desviación de los controles
negativos 0.039 y el punto de corte 0.240.
De una población de 30 cerdos, nueve murieron por neumonía durante el proceso de
inmunización. Del grupo control se murieron los cerdos 3, 5, 9 y 10. Del grupo No 2
murieron los cerdos 13,14 ,15 ,17,19. No hubo mortalidad en el grupo No 3.
Se evidencio en las muestras luego de la tercera inmunización, que el grupo No2 con
la dosis más alta de ET1 subcutánea, presentaron altos niveles de anticuerpos anti-ET
siendo los mas significativos los cerdos 11, 16, 18 y 20. El grupo No 3 mostró
niveles de anticuerpos no tan altos como los del grupo 2 , algunos niveles de
anticuerpos anti-endotelina fueron significativos en los cerdos 21,25, 26,27, 29,30.
(Ver anexo)
( Figura 16)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1 2 4 6 7 8 11 12 16 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Figura 16: Niveles de anticuerpos anti-endotelina 1 en plasma de cerdos según el grupo. Se nota que los cerdos del grupo No 2 presentan altos niveles de anticuerpos ,en comparacion con el grupo No 3 en donde los niveles de anticuerpos se encuentran sobre el punto de corte
Los resultados que se obtuvieron de la titulación de las muestras positivas fueron las
siguientes. Del grupo No2 el cerdo 18 fue positivo hasta una dilución 1/1280, el 16 y
el 20 hasta una dilución 1/160, el 11 hasta 1/80 y el 12 hasta 1/40. En grupo No 3 el
cerdo No 21 fue positivo hasta una dilución 1/80 y los cerdos 25,26,27,29 y 30
hasta 1/40 (Figura 17)
80 40
160
1280
16080 40 40 40 40 40
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
11 12 16 18 20 21 25 26 27 29 30
Código del cerdo
Rev
erso
del
titu
lo
Figura 17: Titulación de muestras positivas de los grupos 2 y 3. Se evidencia que en el grupo
No2 el cerdo 18 tiene los niveles mas altos de anticuerpos ,seguidos de los cerdos 16 y 20
Para evaluar si habían o no diferencias estadísticamente significativas entre los tres
grupos de los cerdos se realizo la prueba de MANN-Whitney la cual compara dos
muestras cuya distribución de probabilidad no se conoce, además se utiliza para datos
no parametricos. Dicha prueba arrojo los siguientes resultados teniendo en cuenta
que cuando p>0.05 no hay diferencias estadísticamente significativas y cuando
p<0.05 si hay diferencias estadísticamente significativas.
Comparación grupo 1vs grupo 2.
Ho= Mediana 1=Mediana 2.
H1 =Mediana 1? Mediana 2.
Figura 18: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 1 y el grupo No2 según las absorbancias de la prueba de ELISA
El nivel de anticuerpos del grupo 1 y el 2 son estadísticamente diferentes,
observando que el grupo No 2 tiene mayor absorbancia, lo que determina mayor
cantidad de anticuerpos contra ET -1con una p=0,000114144.
Comparación grupo 1 vs grupo 3.
Ho= Mediana 1 = Mediana 3.
H1 = Mediana 1? Mediana 3.
Grupo No 1 Grupo No 2
Mediana de grupo 1: 0,189
Mediana de grupo 2: 0.587
Valor de P = 0,000114144
Mediana de grupo 1: 0,189
Mediana de grupo 3: 0,2455
Valor de P = 0,00962601
Figura 19: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 1 y el grupo No3 según las absorbancias de la prueba de ELISA
El grupo No 1 y el No 3 son estadísticamente diferentes, observando que el grupo No
3 tiene mayor absorbancia lo que determina mayor cantidad de anticuerpos anti- ET-1
con una p=0,00962601
Comparación grupo2 vs grupo3
Ho= Mediana 2= Mediana 3.
H1 = Mediana 2? Mediana 3
Figura 20: Diferencias estadisticamente significativas entre el grupo No 2 y el grupo No3 según las absorbancias de la prueba de ELISA
Grupo 1 Grupo 3
Mediana de grupo 2 1: 0,587
Mediana de grupo 3: 0,2455
Valor de P=0,0000986784
Grupo 2
Grupo3
El grupo No 2 y el No 3 son estadísticamente diferentes, observando que el grupo No
2 tiene mayor absorbancia lo que determina mayor cantidad de anticuerpos anti- ET-
1 con una p=0,0000986784
Para evaluar la presencia de distribución normal o anormal de los datos clínicos de
los cerdos se realizo la prueba Shapiro-Wilk .Una vez establecido que datos tenían
una distribución normal se decidió aplicar la prueba de ANOVA ya que esta técnica
maneja simultáneamente mas de dos variables además analiza simultáneamente la
influencia de dos a mas factores de clasificación sobre una variable de respuesta
continua.
Con base en la estadística realizada por la prueba de ANOVA a los análisis clínicos
de los cerdos, se evidenció que no hubo diferencias estadísticamente significativas
(p?0.05) entre los 3 grupos pre-inmunización y los 3 grupos post-inmunización con
relación a las siguientes variables: Leucocitos, plaquetas, glucosa, sodio, calcio,
magnesio, colesterol, triglicéridos y HDL (Tabla 6). Por esta misma prueba se
comprobó que existen diferencias estadísticamente significativas en el numero de
neutrofilos ( p=0.0014 )y en el porcentaje de linfocitos (p=0.0005) dentro de los
grupos 1, 2 y 3 pre-inmunización, así como dentro de los grupos 1 ,2 y 3 post-
inmunización
A los datos no parametricos, se les aplicó la prueba de Fischer exacta donde no se
encontraron diferencias significativas con relación a las siguientes variables:
Hematocrito, Hemoglobina y Creatinina (Tabla 7).
Esta misma prueba arrojó que hay diferencia estadísticamente significativas en las
variables de BUN, proteínas, albúmina, deshidrogenasa láctica y fosfatasa alcalina.
( Tabla 7).
Tabla 6 : Estadística de los resultados de análisis clínicos en cerdos por ANOVA.
NS: no hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos por ANOVA. p? 0.05 No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.
Pre-inmunización Post-inmunización Valor P
Variable/ grupos Unidad 1 2 3 1 2 3
Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS
Leucocitos uL 16760,0 2389,1 14740,0 2434,7 16550,0 2975,2 18480,0 3720,5 17420,0 1217,4 17260,0 3050,8 N S
Plaquetas uL 227000,0 64811,3 249800,0 79697,6 224800,0 75515,7 221600,0 76258,1 250800,0 92880,0 231000,0 82980,6 N S
Glucosa mg/dL 94,7 15,2 96,2 15,0 90,7 10,3 96,2 26,6 102,6 12,3 89,1 17,0 N S
Sodio mM/L 153,5 6,9 146,8 2,8 148,9 5,6 147,7 7,1 153,6 8,6 150,2 4,9 N S
Potasio mM/L 5,1 0,6 5,2 0,7 4,9 0,4 5,1 0,9 5,5 0,9 4,9 0,4 N S
Calcio mM/L 9,6 0,5 10,2 0,6 10,1 0,6 9,4 0,7 9,9 0,4 9,9 0,3 N S
Magnesio mM/L 2,1 0,2 2,4 0,3 2,3 0,2 2,2 0,2 2,3 0,3 2,3 0,2 N S
Colesterol mg/dL 91,2 15,5 93,6 9,0 88,5 13,3 95,3 12,0 101,0 14,0 98,7 5,9 N S
Trigliceridos mg/dL 54,0 12,5 58,0 17,5 67,2 17,7 51,2 13,8 65,0 13,6 52,1 14,9 N S
HDL mg/dL 42,0 5,8 44,4 2,2 43,5 5,2 41,8 4,5 42,0 9,5 41,8 4,5 N S
Valor PVariable/ grupos Unidad 1 2 3
Media DS Media D S Media D S Media D S Media D S Media D S
Neutrofilos % 35,3 6,5 26,1 3,1 33 ,9 4,1 35 ,3 6,5 26,1 3,1 33,9 4,1 0.0014
Linfocitos % 63,1 6,2 72,7 3,1 64 ,3 4,1 63 ,1 6,2 72,7 3,1 64,3 4,1 0.0005
Pre-inmunización Post-inmunización
1 2 3
p?0.05 Existen diferencias estadísticamente significativas
Comparación entre los grupos preinmunización
Valor P
Variable/ grupos Unidad
Media DS Media DS Media DS
Leucocitos uL 16760,0 2389,1 14740,0 2434,7 16550,0 2975,2 NS
Plaquetas uL 227000,0 64811,3 249800,0 79697,6 224800,0 75515,7 NS
Glucosa mg/dL 94,7 15,2 96,2 15,0 90,7 10,3 NS
Sodio mM/L 153,5 6,9 146,8 2,8 148,9 5,6 NS
Potasio mM/L 5,1 0,6 5,2 0,7 4,9 0,4 NS
Calcio mM/L 9,6 0,5 10,2 0,6 10,1 0,6 NS
Magnesio mM/L 2,1 0,2 2,4 0,3 2,3 0,2 NS
Colesterol mg/dL 91,2 15,5 93,6 9,0 88,5 13,3 NS
Trigliceridos mg/dL 54,0 12,5 58,0 17,5 67,2 17,7 NS
HDL mg/dL 42,0 5,8 44,4 2,2 43,5 5,2 NS
Pre-inmunización
1 2 3
Valor PVariable/ grupos Unidad 1 2 3
Media D S Media D S Media DS Media DS Media DS Media D S
Neutrofilos % 35,3 6,5 26,1 3,1 33,9 4,1 35,3 6,5 26,1 3,1 33,9 4,1 0.0014
Linfocitos % 63,1 6,2 72,7 3,1 64,3 4,1 63,1 6,2 72,7 3,1 64,3 4,1 0.0005
Pre-inmunización Post-inmunización
1 2 3
Comparación entre los grupos post-inmunización
Valor P
Variable/ grupos Unidad 1 2 3
Media DS Media DS Media DS
Leucocitos uL 18480,0 3720,5 17420,0 1217,4 17260,0 3050,8 NS
Plaquetas uL 221600,0 76258,1 250800,0 92880,0 231000,0 82980,6 NSGlucosa mg/dL 96,2 26,6 102,6 12,3 89,1 17,0 NSSodio mM/L 147,7 7,1 153,6 8,6 150,2 4,9 NSPotasio mM/L 5,1 0,9 5,5 0,9 4,9 0,4 NSCalcio mM/L 9,4 0,7 9,9 0,4 9,9 0,3 NSMagnesio mM/L 2,2 0,2 2,3 0,3 2,3 0,2 NSColesterol mg/dL 95,3 12,0 101,0 14,0 98,7 5,9 NSTrigliceridos mg/dL 51,2 13,8 65,0 13,6 52,1 14,9 NSHDL mg/dL 41,8 4,5 42,0 9,5 41,8 4,5 NS
Post-inmunización
Tabla 7 : Estadística de los resultados de análisis clínicos en cerdos por la
prueba de Fischer Exacta
a) Comparación grupo 1 y 2 preinmunización. b) Comparación grupo 1 y 3 preinmunización. c) Comparación grupo 2 y 3 preinmunizacion
Valor P
Variable/ grupos Unidad 1 2 3
Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS
Hematocrito % 35,8 1,6 36,0 3,4 34,6 2,7 36,1 1,9 36,1 3,6 34,7 2,5 NS*
Hemoglobina gr/dL 12,3 0,3 12,4 0,7 11,9 0,7 12,4 0,4 12,2 1,2 11,9 0,7 NS*
Creatinina mg/dL 1,3 0,1 1,6 0,1 1,6 0,2 1,5 0,2 1,4 0,2 1,6 0,2 NS*
Pre-inmunización Post-inmunización
1 2 3
Diferencias significativas prueba de Fischer exacta
Variable/ grupos Unidad
Media DS Media DS Media DS
Nitrógeno (BUN) mg/dL 10,5 0,5 9,4 2,1 11,7 1,6 a,bCloro mM/L 110,0 1,3 115,0 3,4 114,1 4,0 a,bAlbumina gr/dL 2,8 0,5 3,1 0,4 3,0 0,1 b,c
Pre-inmunización
1 2 3
d) Comparación grupo 1 y 3 postinmunización. e) Comparación grupo 2 y 3 postinmunización
f) Comparación grupo 1 x 1 g) Comparación grupo 3 x 3
Diferencias significativas prueba de Fischer exacta
Variable/ grupos Unidad
Media DS Media DS Media DS
Nitrógeno (BUN) mg/dL 9,5 1,0 9,2 2,6 10,6 3,7 dProteínas gr/dL 6,4 0,8 6,5 0,4 6,3 0,2 dAlbumina gr/dL 2,9 0,9 3,2 0,6 2,9 0,2 d,eDeshidrogenasa láctica U/L 1981,3 226,8 2142,6 228,6 2245,3 737,7 e
1 2 3
Post-inmunización
Diferencias significativas prueba de Fischer exacta
Variable/ grupos Unidad 1 2 3
Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS Media DS
Cloro mM/L 110,0 1,3 115,0 3,4 114,1 4,0 111,5 5,3 116,0 7,3 113,4 4,0 f
Nitrógeno (BUN) mg/dL 10,5 0,5 9,4 2,1 11,7 1,6 9,5 1,0 9,2 2,6 10,6 3,7 g
Fosfatasa Alcalina U/L 127,7 20,1 121,0 15,6 129,6 13,4 126,4 33,7 138,6 18,6 129,3 26,8 g
1 2 3
Pre-inmunización Post-inmunización
8 DISCUSIÓN.
En estudios realizados anteriormente, se ha determinado que la endotelina esta
implicada en el daño vascular tanto en reestenosis después de una angioplástia, como
en aterosclerosis (50). Se ha demostrado una relación directa entre factores
proaterogénicos como la LDL oxidada y el aumento en la síntesis y liberación de la
ET 1 así como la expresión de RNA mensajero que codifica la síntesis de
endotelina.
Recientemente han sido encontrados en humanos con aterosclerosis avanzada ,
niveles aumentados de endotelina 1 , tanto en tejidos como en sangre (48). Se
estableció mediante inmunofluorecencia que en arterias coronarias sometidas a
barotrauma se encontraban depósitos de endotelina, al igual que anticuerpos dirigida
contra esta. Por esta razón se quizo realizar un trabajo que demostrara la producción
de anticuerpos contra endotelina 1, desarrollándose un esquema de inmunización en
cerdos, lo cual no se ha informado en la literatura mundial hasta hoy. En este trabajo
se evidenció la eficacia de la inmunización subcutánea con ET-1, al estimular la
producción anticuerpos tanto en conejos como en cerdos . Las altas cantidades de
anticuerpos determinadas en el grupo No2 de los cerdos comprueba que la aplicación
de concentraciones mayores de endotelina producen una buena respuesta comparado
con el grupo 3 de cerdos que recibió una concentración menor de ET -1. Dicha
respuesta inmunológica quizá sea debida a que la ET-1 que se utilizo como antígeno
(ET-1 sintética) tiene una conformación diferente a la ET-1 endógena de conejos y
cerdos, la cual se caracteriza por tener un segmento activo igual.
La eficacia de la inmunización está directamente relacionada con el hecho de haberse
utilizado un adyuvante, en este caso el de Freund que permitió incrementar la
respuesta a la ET-1 que es un péptido muy pequeño y requiere que el adyuvante
aumente su tamaño efectivo y estimule de esta manera el reconocimiento por parte
de los macrófagos.
La inmunización con ET-1 subcutánea en cerdos es segura como la muestran los
datos estadísticos obtenidos de los análisis clínicos realizados a los cerdos, tanto
preinmunización como postinmunización; se pudo establecer que no existen
diferencias estadísticamente significativas en la mayor parte de los parámetros
analizados ; algunos datos (neutrofilos, linfocitos, BUN, cloro, proteínas, albúmina,
LDH y fosfatasa alcalina) presentaron diferencias estadísticamente significativas pero
esta diferencia se encontró entre los grupos tanto antes como después de la
inmunización, por lo cuál no puede ser atribuida a la inoculación de ET1 subcutánea,
ya que los cerdos antes de iniciar la inmunización tenían una infección viral,
establecida por el informe de los veterinarios encargados de su cuidado.
Por otro lado se encontraron diferencias estadísticamente significativas dentro de los
grupos tanto pre como postinmunización con respecto a las variables de BUN,
proteínas, albúmina y LDH las cuales se presentaron por las condiciones de stress y
hacinamiento a los que estaban sometidos los animales según el dictámen de
veterinaria.
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de cloro
comparando el grupo 1 pre y el grupo 1 postinmunización; igualmente se
encontraron diferencias en los niveles de BUN y fosfatasa alcalina con respecto al
grupo 3 preinmunización y el grupo 3 postinmunización a causa a las que estaban
sometidos los cerdos.
En la determinación de anticuerpos en la prueba de ELISA se evidencio la
reproductibilidad de los resultados confirmando que los datos obtenidos del estudio
son confiables.
9 CONCLUSIONES.
? La estandarización del ELISA realizada con títulos discriminatorios óptimos
demostró una alta reproductibilidad y exactitud de los datos.
? Se logró estimular la producción de anticuerpos anti ET-1 , después de tres
inmunizaciones subcutáneas en conejos ya que a partir de la cuarta inmunización los
títulos de anticuerpos disminuyeron , por tal razón solo se realizaron tres
inmunizaciones en los cerdos alcanzando niveles óptimos de anticuerpos anti-ET 1
determinados por la prueba de ELISA.
? La inmunización subcutánea de los cerdos con Endotelina 1, es segura ya que se
estableció que no sufrieron ningún daño atribuible a la inmunización, excepto
cambios en los niveles de cloro , en el grupo control ( No 1 ) y en los niveles de
BUN y fosfatasa alcalina en el grupo No 3.
? Se requiere reproducir estos resultados en seres humanos , con el fin de evaluar la
eficacia y seguridad de la inmunización con ET1, y potencialmente bloquear la
acción de la Endotelina 1 sobre la pared vascular.
10 ANEXOS
Figura 21: Placa de ELISA con plasma de cerdos pre- inmunización (Controles negativos)
Figura 22: Placa de ELISA con plasma de cerdos post- tercerainmunización
Preparación buffers utilizados en la estandarización del ELISA
Buffer citrato pH 5.0
NaHPO42H2O 35.6gr/l
Ácido cítrico 21gr/l
Para prepara 200 ml de buffer
Ácido cítrico 2.1gr Na2HPO42H2O 3.56gr
Agua destilada 100ml Agua destilada 100ml
Mientras mide el pH de forma continua a la solución base, adicione el ácido hasta que
llegue al pH deseado (pH 5.0). Almacenar a 4°C
HCl 2N
HCL 10N 4ml
Agua destilada 16ml
PBS 1*
Un litro de agua destilada
Na2HPO4 1.194gr
NaH2PO.H2O 0.256gr
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