efek ekstrak kulit buah rambutan terhadap …lib.unnes.ac.id/25662/1/4411412053.pdf · 6. bapak,...
TRANSCRIPT
-
i
EFEK EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN
TERHADAP KADAR MDA DAN SOD
TIKUS YANG DIPAPAR ASAP ROKOK
Skripsi
disusun sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Program Studi Biologi
oleh
Erni Wulandari
4411412053
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2016
-
ii
-
iii
-
iv
ABSTRAK
Wulandari, Erni. 2016. Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap Kadar
MDA dan SOD Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi. Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Semarang. Dr. drh. R. Susanti, M.P. Dr. Lisdiana, M.Si
Asap rokok merupakan polutan bagi manusia dan lingkungan. Asap rokok
mengandung senyawa radikal bebas yang akan menyebabkan stres oksidatif. Pada
kondisi stres oksidatif, radikal bebas menyebabkan peroksidasi lipid membran sel
dan merusak organisasi membran sel. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis
kadar MDA dan SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi ekstrak kulit
buah rambutan. Penelitian dilakukan pada 30 ekor tikus putih jantan galur Wistar
yang dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok A (normal), B (negatif), C
(positif) dan D, E, F merupakan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan
dengan dosis secara berturut-turut 3, 6, 12 mg/200 gramBB dan paparan asap
rokok selama 14 hari. Untuk mengetahui perbedaan kadar MDA dan SOD setiap
kelompok dilakukan analisis data menggunakan uji one way anova dan uji lanjut
LSD. Hasil analisis statistik menunjukkan kadar MDA pada kelompok A tidak
berbeda nyata dengan kelompok C dan E. Kelompok D tidak berbeda nyata
dengan kelompok F. Aktivitas SOD pada kelompok A berbeda nyata dengan
kelompok lainnya. Aktivitas SOD kelompok C tidak berbeda nyata dengan
kelompok E. Simpulan dari penelitian ini adalah ekstrak kulit buah rambutan
dosis 6 mg/200 gramBB dapat menurunkan kadar MDA dan meningkatkan
aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok.
Katakunci: Asap rokok, ekstrak kulit buah rambutan, MDA, SOD
-
v
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT
atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap Kadar MDA dan SOD
Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi Universitas
Negeri Semarang. Penulis menyadari dalam pembuatan skripsi ini tidak lepas dari
bantuan berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis menyampaikan
penghargaan dan terimakasih kepada:
1. Rektor Universitas Negeri Semarang atas kesempatan yang diberikan untuk
menempuh pendidikan di Unnes.
2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Semarang yang telah memberikan izin penelitian.
3. Ketua Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang yang telah membantu
kelancaran administrasi dalam penyelesaian skripsi.
4. Dr. drh. R. Susanti, M.P. dan Dr. Lisdiana, M.Si. selaku dosen pembimbing I
dan II atas bimbingan, saran, bantuan dan berbagai kemudahan selama proses
penyusunan skripsi.
5. Dr. Wiwi Isnaeni, M.S. selaku penguji skripsi yang telah memberikan kritik
dan saran untuk kelayakan naskah skripsi saya.
6. Bapak, Ibu, Mas Heri, Dek Andry dan semua keluarga atas doa, perhatian dan
dukungannya.
7. Melisa, Wawan, Alam, Nikmah, Mas Herdi dan Mba Fera atas bantuannya
selama penelitian.
8. Nok Ely, Tante nCum, Uti Zamia serta teman-teman Biologi 2012 atas
kebersamaan dan kenangan yang tak terlupakan.
9. Teman-teman seperjuangan di Kos Griya Ayu atas persaudaraan dan
semangat.
Semarang, 3 Oktober 2016
Penulis
-
vi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................... i
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI ........................................... ii
PENGESAHAN .................................................................................. iii
ABSTRAK ....................................................................................... iv
KATA PENGANTAR ...................................................................... v
DAFTAR ISI ..................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR ........................................................................ viii
DAFTAR TABEL ............................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................... x
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ............................................................................. 1
B. Rumusan Masalah ......................................................................... 4
C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 4
D. Manfaat Penelitian ........................................................................ 4
E. Penegasan Istilah .......................................................................... 4
BAB II LANDASAN TEORI
A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok ............................................. 6
B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas ............................... 11
C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan ..................... 14
D. MDA ............................................................................................. 20
E. SOD .............................................................................................. 23
F. Senyawa Antioksidan Vitamin C ................................................. 25
G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan .................................................................. 26
H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH ....................... 27
I. Kerangka Berfikir ......................................................................... 29
J. Hipotesis Penelitian ...................................................................... 29
-
vii
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 30
B. Populasi dan Sampel .................................................................... 30
C. Variabel Penelitian ....................................................................... 31
D. Rancangan Penelitian ................................................................... 31
E. Alat dan Bahan Penelitian ............................................................ 33
F. Prosedur Penelitian ....................................................................... 36
G. Analisis Data ................................................................................ 39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian ............................................................................. 40
B. Pembahasan .................................................................................. 41
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan ....................................................................................... 49
B. Saran ............................................................................................. 49
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... 50
LAMPIRAN ...................................................................................... 58
-
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Kandungan senyawa kimia pada rokok ......................................... 7
2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas ................................. 12
3. Kulit buah rambutan ...................................................................... 15
4. Struktur kimia MDA ..................................................................... 22
5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan .......................... 28
6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom OH ......... 28
7. Kerangka berfikir penelitian ......................................................... 29
8. Desain penelitian ........................................................................... 35
-
ix
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Senyawa yang terkandung dalam asap rokok ............................... 8
2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin content
dan tanin pada kulit buah rambutan ............................................... 16
3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam askorbat
pada kulit buah rambutan .............................................................. 17
4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada kulit
buah rambutan (mg/100 g berat kering) ........................................ 17
5. Alat penelitian ............................................................................... 33
6. Bahan penelitian ............................................................................ 34
7. Prosedur pengukuran kadar MDA ................................................ 38
8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD ............................................. 38
9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD ................................................ 40
-
x
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Hasil pemeriksaan kadar MDA dan aktivitas SOD ....................... 58
2. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc kadar MDA .... 59
3. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc
aktivitas SOD ................................................................................ 64
4. Hasil identifikasi tumbuhan rambutan .......................................... 70
5. Hasil uji DPPH ekstrak kulit buah rambutan ................................ 71
6. Dokumentasi penelitian ................................................................. 72
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Rokok adalah produk dari daun tembakau yang kemunculannya
menyebabkan kontroversial karena mampu menimbulkan pro dan kontra di
masyarakat (Fitria et al. 2013). Merokok merupakan salah satu gaya hidup
masyarakat di dunia, salah satunya Indonesia. Mengonsumsi rokok
diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan, baik secara langsung
maupun tidak. Gangguan kesehatan yang ditimbulkan antara lain dapat
berupa bronkitis kronis, emfisema, kanker paru-paru dan penyempitan
pembuluh nadi (Church & Pryor 1985). Dampak rokok terhadap kesehatan
sering disebut sebagai silent killer. Pengaruh tersebut timbul secara
perlahan, dalam tempo yang relatif lama, tidak langsung dan tidak nampak
secara nyata (Rupinder 2014).
Indonesia merupakan negara berkembang dengan penduduk
perokok terbesar ketiga di dunia setelah Cina dan India (WHO 2013).
Menurut survei WHO (2008), sepertiga dari penduduk dunia terutama orang
dewasa adalah perokok. Jumlah perokok setiap tahun cenderung meningkat
seiring dengan meningkatnya konsumsi rokok. Angka kematian di dunia
akibat rokok mencapai 500 juta orang per tahun. Dalam setiap enam detik
terdapat satu kematian akibat rokok
Pembakaran rokok akan menimbulkan asap rokok. Asap rokok
dapat dibedakan menjadi dua, yaitu asap utama (mainstream smoke) dan
asap samping (sidestream smoke). Asap utama adalah asap yang dihisap
oleh perokok aktif. Asap samping merupakan asap yang terhirup oleh
perokok pasif dan secara terus-menerus keluar dari ujung rokok (Lodovici &
Bigagli 2009). Asap utama terdiri dari 8% fase tar dan 95% fase gas. Asap
rokok di ruangan sekitar perokok 85% asap samping dan 15% asap utama
(Lodovici et al. 2004). Asap rokok yang dihirup oleh seorang perokok
mengandung komponen gas dan partikel. Komponen gas sangat berpotensi
menimbulkan radikal bebas karbon monoksida, asam hidrosianat, nitrogen
-
2
oksida dan formalin. Komponen partikel asap rokok diantaranya adalah tar,
indol nikotin, karbarzol dan kresol (KPAI 2009).
Asap rokok merupakan campuran senyawa yang mengandung
4000 bahan kimia antara lain tar, nikotin, karbon monoksida dan zat-zat
berbahaya lainnya. Senyawa yang terkandung pada asap rokok terdiri dari
200 zat bersifat racun (asam hidrosianat, akrolein, oksida nitrogen) dan
40 zat bersifat karsinogen (tar, nikotin, benzo(a)piren, senyawa
hidrokarbon) (Palanisamy et al. 2009). Dalam satu kali hisapan rokok
terdapat 1014-16
molekul radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh
(Yanbaeva et al. 2007). Asap rokok adalah polutan bagi manusia dan
lingkungan.
Asap rokok dapat menimbulkan respons stres, yaitu kondisi pada
saat individu tidak mampu mengatasi beban fisik atau psikologis. Stres yang
berat diketahui dapat menyebabkan stres oksidatif. Stres oksidatif adalah
ketidakseimbangan antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan tubuh.
Pada kondisi stres oksidatif, terjadi peningkatan jumlah reactive oxygen
species (ROS) di dalam tubuh (Haliwell & Gutteridge 1999). ROS adalah
oksidan yang sangat reaktif. Dampak negatif senyawa tersebut timbul
karena aktivitasnya, sehingga dapat merusak komponen sel yang sangat
penting untuk mempertahankan integritas sel. Setiap ROS yang terbentuk
dapat memulai suatu reaksi berantai yang terus berlanjut hingga ROS itu
dihilangkan oleh ROS yang lain atau sistem antioksidan (Pillon & Soulage
2012).
Aktivitas radikal bebas di dalam tubuh diimbangi dengan
mekanisme pertahanan endogen, yaitu tubuh akan memproduksi antioksidan
yang mempunyai pengaruh sebagai anti radikal bebas. Salah satu
antioksidan endogen adalah superoxide dismutase (SOD) yang merupakan
sistem pertahanan tubuh garis pertama terhadap aktivasi ROS (Fridovich
1981). Pada saat level ROS meningkat melebihi kemampuan pertahanan
endogen, maka terjadilah ketidakstabilan oksidatif yang disebut stres
oksidatif. Pada kondisi stres oksidatif, radikal bebas akan menyebabkan
-
3
peroksidasi lipid membran sel dan merusak organisasi membran sel. Salah
satu biomarker terjadinya stres oksidatif adalah tingginya kadar
malondialdehyde (MDA) dan menurunnya aktivitas SOD akibat proses
peroksidasi lipid yang berlebihan di dalam sel (Hu et al. 2014).
Suatu cara untuk mengendalikan terjadinya stres oksidatif yang
berlebihan yaitu dengan mengonsumsi antioksidan dari makanan
(antioksidan eksogen). Salah satu sumber antioksidan eksogen adalah kulit
buah dari tanaman rambutan (Nephelium lappaceum L). Tanaman rambutan
banyak ditemui di Indonesia. Tanaman rambutan terdiri dari bagian akar,
daun, biji, buah, kulit kayu dan kulit buah yang memiliki banyak manfaat
sebagai sumber vitamin dan senyawa berkhasiat obat. Kulit buah rambutan
merupakan salah satu bagian dari tanaman rambutan yang belum
dimanfaatkan secara maksimal. Kulitnya yang berwarna merah ditemukan
mengandung berbagai macam senyawa kimia.
Berdasarkan penelitian, kulit buah rambutan memiliki aktivitas
antioksidan yang mengandung senyawa fenolik, alkaloid, steroid, terpenoid
(Wardhani & Supartono 2015), asam askorbat (Wall 2006), flavonoid
(Dirmawati 2008) serta antosianin (Hutapea et al. 2014) dengan kandungan
tertinggi adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Penelitian Thitilerdecha
et al. (2010) berhasil mengisolasi asam ellagat, korilagin dan geranin yang
merupakan senyawa fenolik pada kulit buah rambutan. Senyawa fenolik
bersifat antioksidan kuat dan terdapat paling banyak pada kulit buah
rambutan. Senyawa tersebut mempunyai cincin aromatik dengan gugus
hidroksil lebih dari satu dan berperan melindungi sel tubuh dari bahaya
radikal bebas dengan cara mengikat radikal bebas.
Palanisamy et al. (2008) menyatakan bahwa sebagai tanaman yang
mengandung antioksidan, kulit buah rambutan diduga dapat menghambat
terjadinya kerusakan oksidatif, sehingga diperlukan suatu penelitian untuk
mengetahui pengaruh ekstrak kulit buah rambutan terhadap kadar MDA dan
aktivitas SOD akibat paparan asap rokok.
-
4
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah dalam
penelitian ini adalah:
Bagaimana pengaruh pemberian ekstrak kulit buah rambutan terhadap kadar
MDA dan aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok?
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah: Untuk menganalisis kadar MDA dan
aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi ekstrak kulit
buah rambutan.
D. Manfaat Penelitian
Dengan dilaksanakannya penelitian ini diharapkan dapat memberi
manfaat sebagai berikut :
1. Memberikan informasi tentang hasil kajian efek pemberian ekstrak kulit
buah rambutan sebagai sumber antioksidan
2. Meningkatkan kepercayaan masyarakat terhadap penggunaan obat yang
berasal dari bahan-bahan alami.
3. Berguna sebagai bahan acuan untuk penelitian lebih lanjut mengenai
ekstrak kulit buah rambutan sebagai antioksidan.
E. Penegasan Istilah
Untuk menghindari salah pengertian dalam memahami isi skripsi
ini, perlu ada batasan-batasan terhadap beberapa istilah sebagai berikut :
1. Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi
zat aktif dari simplisia menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian
semua pelarut diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan
sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI 1995).
Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah ekstrak dari
seluruh bagian kulit buah rambutan yang diperoleh dari hasil ekstraksi
menggunakan pelarut etanol. Hasil akhirnya berupa pasta.
-
5
2. MDA
MDA merupakan senyawa dialdehida produk akhir dari peroksidasi
lipid (Winarsi 2007). MDA dalam penelitian ini adalah hasil
peroksidasi lipid oleh senyawa radikal bebas akibat dipapar asap rokok.
MDA diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
545 nm.
3. SOD
SOD adalah antioksidan enzimatis yang melindungi jaringan dari
kerusakan oksidatif akibat radikal bebas (Muchtadi 2013). SOD dalam
penelitian ini diukur dengan metode kolorimetri dari BioVision
Incorporated menggunakan microplate reader pada panjang gelombang
450 nm.
4. Asap Rokok
Asap rokok merupakan bahan toksik yang diperoleh dari hasil
pembakaran rokok. Jenis rokok dalam penelitian ini adalah rokok kretek
yang dijual bebas di pasaran dengan kandungan tar 30 mg dan nikotin
1,8 mg per batang rokok.
-
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok
Rokok merupakan salah satu sumber utama paparan toksin yang
secara kimiawi berpengaruh dalam menimbulkan berbagai jenis penyakit.
Rokok adalah produk dari tembakau yang mengandung nikotin dan tar.
Rokok berbentuk silinder terdiri dari kertas berwarna putih dan cokelat,
berukuran panjang antara 70-120 mm (bervariasi tergantung negara) dengan
diameter 10 mm, berisi cacahan daun tembakau dengan tambahan sedikit
racikan cengkeh (Triswanto 2007). Rokok dibakar pada salah satu ujungnya
dan dibiarkan membara agar asapnya dapat dihirup lewat mulut pada ujung
lainnya. Rokok terdiri dari dua jenis, yaitu rokok yang berfilter dan rokok
tidak berfilter. Filter pada rokok terbuat dari bahan busa serabut sintesis
yang berfungsi untuk menyaring nikotin. Filter rokok mampu mengurangi
jumlah tar dan nikotin dalam asap hingga 40-50% dibandingkan dengan
rokok tidak berfilter (Shin et al. 2009).
Berdasarkan bahan bakunya rokok terbagi menjadi tiga kategori
yaitu rokok putih, rokok kretek dan rokok klembak. Rokok putih adalah
rokok yang terbuat dari daun tembakau dan diberi saus. Rokok kretek adalah
rokok berbahan daun tembakau dan cengkeh yang diberi saus, sedangkan
rokok klembak yaitu rokok yang terbuat dari daun tembakau, cengkeh,
kemenyan dan saus. Fungsi penambahan bahan lain dalam pembuatan rokok
adalah untuk mendapatkan efek rasa dan aroma tertentu (Sitepoe 2000).
Merokok adalah kegiatan menghisap asap dari pembakaran
tembakau pada rokok. Mengonsumsi rokok sudah menjadi tren dan bahkan
didalilkan sebagai tanda kedewasaan seseorang. Di Indonesia, jenis rokok
yang banyak dikonsumsi adalah rokok kretek. Rokok kretek mengandung
60-70% tembakau, 30-40% cengkeh dan ramuan lainnya (Hutapea 2013).
Rokok kretek mengandung 5 komposisi tambahan yaitu eugenol, acethyl
6
-
7
eugenol, -caryophillene, -humulene dan caryophillene epoxide.
Berdasarkan penelitian, eugenol merupakan bahan anestetik yang digunakan
oleh dokter gigi. Apabila eugenol dikonsumsi maka akan timbul efek
anestesi pada pengguna rokok kretek. Eugenol juga memiliki efek
antikonvulsan, penghambat transmisi neural dan peradangan (Guidotti et al.
1989).
Gambar 1. Kandungan senyawa kimia pada rokok (Kandar 2014)
Pembakaran rokok menghasilkan asap rokok, terdiri dari dua
komponen yaitu 85% komponen cepat menguap yang berbentuk gas dan
15% komponen partikel-partikel terdispersi di dalamnya. Asap yang
dihasilkan pembakaran rokok terdiri dari asap utama dan asap samping.
Asap utama adalah asap rokok yang dihirup & dihembuskan langsung oleh
perokok, sedangkan asap samping adalah asap dari ujung rokok terbakar
yang disebarkan ke udara bebas sehingga dapat terhirup oleh lingkungan
sekitar (Lodovici et al. 2004). Asap rokok merupakan radikal bebas yang
berasal dari sumber eksogen. Beberapa unsur yang terdapat dalam asap
rokok dapat diamati dalam Tabel 1.
-
8
Tabel 1. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam asap rokok
Fase Asap Rokok Senyawa Efek
Fase Partikel a. Tar Karsinogen
b. Hidrokarbon aromatik polinuklear
Karsinogen, depressor
ganglion, kokarsinogen
c. Nikotin Kokarsinogen & iritan
d. Fenol Kokarsinogen & iritan
e. Kresol Kokarsinogen & iritan
f. -Naftilamin Karsinogen
g. N-Nitrosonomikotin Karsinogen
h. Benzo(a)piren Karsinogen
i. Logam renik Karsinogen
j. Indol Akselerator tumor
k. Karbazol Akselerator tumor l. Katekol Kokarsinogen
Fase Gas a. Karbon monoksida Pengurangan transfer dan pemakaian O2
b. Asam hidrosianat Sitotoksik & iritan
c. Asetaldehid Sitotoksik & iritan
d. Akrolein Sitotoksik & iritan
e. Amonia Sitotoksik & iritan
f. Formaldehid Sitotoksik & iritan
g. Oksida dari nitrogen Sitotoksik & iritan
h. Nitrosamin Karsinogen
i. Hidrozin Karsinogen
j. Vinil klorida Karsinogen
(Palanisamy et al. 2009)
Fase gas asap rokok berisi hingga 1014
radikal bebas dan zat-zat
reaktif per kepulan asap rokok. Radikal bebas dan oksidan yang terdapat
pada fase gas asap rokok memiliki waktu paruh pendek namun senyawa
tersebut dapat memasuki aliran darah dan menyebabkan kerusakan oksidatif
makromolekul. Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi autooksidasi in
vitro dari PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid (Swan & Lessov-
Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida jenuh dan
tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen peroksida.
Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan ROS
melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang jauh dari
-
9
paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif (Tostes et al.
2008).
Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon yang
akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk senyawa
radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat menginisiasi PUFA
dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel asap rokok
memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase partikel
mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil dari
hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel dan
dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas akan
mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel seperti
PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama radikal
bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil (Allard et
al. 1994).
Zat-zat yang terkandung dalam asap rokok sangat beracun karena
mampu menimbulkan efek inflamasi dan radikal bebas yang dapat
menurunkan efek antioksidan. Menurut Fitria et al. (2013) racun utama pada
asap rokok yang mengganggu kesehatan sebagai berikut:
1. Tar
Tar adalah sejenis cairan kental berwarna coklat tua atau hitam,
merupakan substansi hidrokarbon yang bersifat lengket dan menempel pada
paru-paru. Tar merupakan suatu zat karsinogen yang dapat menimbulkan
kanker pada saluran pernafasan dan paru-paru. Tar terdiri dari dua fase yaitu
fase tar dan fase gas. Pada fase tar, merupakan pembentuk radikal bebas
seperti quinon, semiquinon dan hidroquinon dalam bentuk matriks polimer.
Pada fase gas, mengandung nitrit oksida dan nitrit peroksida yang dapat
mengubah oksigen menjadi radikal bebas superoksida dan radikal bebas
hidroksil yang sangat merusak (Lustbrader et al. 1983).
2. Nikotin
Nikotin adalah senyawa porillidin dalam Nicotiana tabacum,
Nicotiana rustica dan spesies lainnya yang bersifat adiktif serta dapat
-
10
mengakibatkan ketergantungan. Nikotin berbentuk cair, tidak berwarna dan
merupakan basa yang mudah menguap. Nikotin dapat meracuni saraf tubuh,
meningkatkan tekanan darah, menimbulkan penyempitan pembuluh darah
tepi dan menyebabkan ketagihan serta ketergantungan pada pemakainya
(Benowitz 2008). Jumlah nikotin yang dihisap perokok dipengaruhi oleh
berbagai faktor, yaitu kualitas rokok, jumlah tembakau setiap batang rokok,
dalamnya isapan dan penggunaan filter.
Kandungan nikotin dalam rokok kretek lebih besar daripada rokok
filter. Nikotin yang terdapat dalam asap rokok samping 46 kali lebih besar
dari asap rokok utama. Rokok kretek mengandung lebih banyak nikotin
dibandingkan dengan rokok putih. Kadar nikotin pada rokok kretek sebesar
46,8 mg sedangkan pada rokok putih yaitu 16,3 mg. Nikotin yang
dikeluarkan oleh rokok kretek jumlahnya lebih banyak karena rokok kretek
tidak dilengkapi dengan filter (Susanna et al. 2003).
3. Karbon monoksida
Karbon monoksida adalah sejenis gas beracun yang tidak berwarna
dan tidak berbau. Gas CO yang dihasilkan sebatang rokok dapat mencapai
3-6%, sedangkan CO yang dihisap oleh perokok sejumlah 400 ppm (parts
per million). Karbon monoksida terkandung dalam asap rokok mainstream
maupun sidestream. Pada dosis rendah, paparan karbon monoksida dapat
meningkatkan kadar karboksi hemoglobin (COHb) dalam darah sejumlah 2-
16% yang dapat menyebabkan kekurangan oksigen pada jaringan (Sitepoe
2000).
4. Logam timbal (Pb)
Timbal adalah logam beracun yang berwarna abu-abu. Timbal
paling banyak ditemukan pada gas buangan kendaraan bermotor dan asap
rokok (Rodgaman & Perfetti 2009). Timbal yang dihasilkan oleh sebatang
rokok adalah sebesar 0,5 g, sementara ambang batas bahaya Pb yang
masuk ke dalam tubuh adalah 20 g per hari (Patrick 2006). Paparan timbal
yang terjadi secara terus-menerus di dalam tubuh dapat menimbulkan efek
-
11
negatif dalam tubuh serta menyebabkan penurunan kemampuan antioksidan
sehingga menyebabkan stres oksidatif.
B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas
Radikal bebas adalah suatu senyawa yang memiliki satu atau lebih
elektron tidak berpasangan di orbital luarnya (unpaired electron). Oleh
karena elektronnya tidak berpasangan, maka senyawa tersebut labil dan
sangat reaktif mencari pasangan. Radikal bebas akan menyerang dan
mengikat elektron molekul di sekitarnya. Molekul yang terambil
elektronnya akan mewarisi sifat reaktifnya sehingga timbul reaksi berantai
yang tidak terputus (Muchtadi 2013). Reaksi rantai akan berhenti apabila
reaktivitasnya diredam oleh senyawa yang bersifat antioksidan.
Radikal bebas dapat terbentuk melalui 3 tahapan reaksi yaitu
inisiasi, propagasi dan terminasi.
1. Tahap inisiasi (permulaan), yaitu tahap pembentukan awal radikal-
radikal bebas.
Misalnya:
Fe++
+ H2O2 Fe
+++ + OH
- + OH
R1 H + OH R1 + H2O
2. Tahap propagasi (perambatan), yaitu tahap radikal bebas mengawali
sederetan reaksi sampai terbentuk radikal bebas baru yang sering disebut
sebagai reaksi rantai
R2 H + R1 R2 + R1 H
R3 H + R2 R3 + R2 H
3. Tahap terminasi (pengakhiran), yaitu tahap terputusnya daur propagasi
oleh reaksi-reaksi terminasi. Reaksi ini mengubah radikal bebas menjadi
radikal bebas yang stabil dan tidak reaktif.
R1 + R1 R1 R1
R2 + R1 R2 R1
Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh (endogen) maupun
dari luar tubuh (eksogen). Radikal yang berasal dari dalam tubuh terbentuk
-
12
sebagai sisa proses metabolisme protein, karbohidrat, lemak pada
mitokondria, proses inflamasi, reaksi antara besi logam transisi dalam
tubuh, fagosit, xantin oksidase, peroksisom maupun pada kondisi iskemia.
Sumber dari luar tubuh adalah asap rokok, asap kendaraan bermotor, polusi
lingkungan, radiasi ultraviolet, obat-obatan dan pestisida. Radikal bebas
terpenting dalam tubuh adalah radikal derivat dari oksigen yang disebut
kelompok oksigen reaktif (ROS) (Haliwell & Gutteridge 2007). ROS adalah
senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif, terdiri
atas kelompok radikal bebas dan kelompok nonradikal. Kelompok radikal
bebas antara lain superoxide anion (O2-), hydroxyl radicals (OH) dan
peroxyl radicals (RO2). Kelompok nonradikal misalnya hydrogen peroxide
(H2O2) dan organic peroxides (ROOH) (Haliwell & Whiteman 2004).
Gambar 2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas
(Young & Woodside 2001)
Radikal bebas dalam jumlah normal diperlukan bagi kelangsungan
beberapa proses fisiologis dalam tubuh, karena radikal bebas berperan
dalam transportasi elektron (Ott et al. 2007). Pada saat tubuh mengandung
radikal bebas dalam jumlah yang banyak, maka radikal bebas akan
dinetralkan oleh enzim yang berperan sebagai antioksidan intraseluler
menjadi molekul yang lebih stabil. Namun, apabila jumlah radikal bebas
terus menerus mengalami peningkatan, maka antioksidan dalam tubuh tidak
-
13
dapat mengikat radikal bebas lagi. Hal tersebut berbahaya karena radikal
bebas berpotensi untuk berikatan dengan molekul lain sehingga molekul lain
tidak stabil, menyebabkan peroksidasi lipid membran sel yang berlebihan,
serta menyebabkan kerusakan pada protein dan DNA (Packer 1994).
Merokok telah diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan
yang diakibatkan oleh nikotin dari asap perokok aktif dan asap perokok
pasif. Target utama asap rokok adalah paru-paru. Rusaknya paru-paru
sebagai target utama yang langsung terkena asap rokok dapat dijelaskan
dengan adanya paparan agen kimia di dalam asap rokok. Namun, efek yang
menyebabkan penyakit kronik pada sistem organ lain kemungkinan adalah
hasil pajanan secara tidak langsung (Yanbaeva et al. 2007). Merokok juga
merupakan salah satu faktor resiko utama terhadap penyakit kardiovaskuler.
Mekanisme potensial yang disebabkan merokok terhadap penyakit
kardiovaskuler meliputi gangguan homeostasis, abnormalitas lipid dan
disfungsi endotel (Papathanasiou et al. 2014).
Berdasarkan mekanisme kerjanya di dalam tubuh manusia, racun
dibagi menjadi dua yaitu racun yang bekerja lokal dan sistemik (Wu &
Wang 2005). Racun yang bekerja lokal dapat bersifat korosif, iritasi atau
anestetik. Racun yang bekerja sistemik biasanya mempunyai afinitas
terhadap salah satu sistem, contohnya alkohol dan karbon monoksida.
Adapun racun yang bekerja lokal maupun sistemik misalnya asam karbol,
arsen dan Pb. Efek lokal maupun sistemik dari paparan asap rokok dapat
dijelaskan melalui mekanisme stres oksidatif dan inflamasi (Pearson et al.
2003).
Radikal bebas dari asap rokok dapat menyebabkan peroksidasi dari
asam lemak tak jenuh membran sel yang memperkuat stres oksidatif selama
merokok. Stres oksidatif akan terjadi apabila ROS yang dihasilkan lebih
besar dibandingkan yang dapat diredam oleh mekanisme pertahanan sel.
Apabila senyawa-senyawa tersebut tidak diredam, maka oksigen akan
berbalik menjadi racun bagi tubuh (Droge 2002).
-
14
Stres oksidatif dapat dilihat dari beberapa tanda yang berbeda, yaitu
dengan pengukuran langsung agen oksidatif seperti produksi ROS oleh sel
darah perifer, efek stres oksidatif pada target molekul (produk lipid
peroksidasi dan protein teroksidasi), atau respon kapasitas antioksidan
dalam plasma (Yanbaeva et al. 2007). Paparan bahan kimia oksidan dalam
asap dikaitkan dengan penurunan tingkat antioksidan endogen dalam
kompartemen sistemik. Sejumlah penelitian melaporkan bahwa merokok
mengakibatkan rendahnya konsentrasi antioksidan dalam plasma.
Hasil penelitian Adyttia et al. (2014) menunjukkan bahwa
pemberian asap rokok (3 batang/hari) pada tikus selama 14 hari
mengakibatkan peningkatan kadar MDA. Penelitian Muhammad (2009),
melaporkan bahwa pemberian asap rokok (4 batang/hari selama 30 hari)
pada tikus menunjukkan adanya kenaikan kadar MDA dan penurunan
aktivitas SOD. Hal ini dikarenakan keadaan stres akibat pemaparan asap
rokok dapat meningkatkan jumlah radikal bebas yang menyebabkan
penggunaan SOD semakin banyak sehingga jumlahnya semakin berkurang.
C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan
Tanaman rambutan merupakan salah satu tanaman tropis asli Asia
Tenggara. Tanaman tersebut sangat mudah dijumpai dan dikembangkan.
Saat ini tanaman rambutan telah menyebar hingga Amerika Latin dan dapat
ditemukan di daratan yang mempunyai iklim sub tropis. Tanaman rambutan
dapat tumbuh subur pada ketinggian 30-50 mdpl. Tanaman rambutan
memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Subkelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Sapindaceae
Genus : Nephelium
Spesies : Nephelium lappaceum L.
Kultivar : Nephelium lappaceum L. Sekaran (Lampiran 4)
-
15
Rambutan merupakan tumbuhan yang memiliki banyak manfaat
dan sangat digemari masyarakat. Salah satu bagian yang belum
dimanfaatkan secara maksimal adalah kulit buah rambutan. Banyak
penelitian telah membuktikan berbagai macam senyawa kimia yang
terkandung di dalamnya. Kulit buah rambutan ditemukan memiliki efek
biologis seperti aktivitas antioksidan, antibakteri (Palanisamy et al. 2008;
Thitilerdecha et al. 2008), antiproliferasi (Khonkarn et al. 2010), anti herpes
simplex virus tipe 1 (Nawawi et al. 1999) dan antihiperglikemik
(Palanisamy et al. 2011).
Gambar 3. Buah rambutan kultivar Sekaran (Dokumentasi penulis 2016)
Kulit buah rambutan mengandung berbagai macam antioksidan
seperti alkaloid, fenolik, steroid, terpenoid (Wardhani & Saptono 2015),
tanin (Thinkratok 2011), saponin (Fila et al. 2012) dan asam askorbat (Wall
2006). Kulit buah rambutan juga mengandung flavonoid dan antosianin.
Antosianin merupakan senyawa golongan flavonoid yang memberikan
pigmen sehingga berwarna merah tua (Nurdin et al. 2013).
-
16
Tabel 2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin content dan tanin pada kulit buah rambutan
Metode ekstraksi Pelarut Total phenolic
content
Total
anthocyanin
content (mg/100
g ekstrak segar)
Tanin
(% ekstraksi)
Referensi
Maserasi Butanol
Etanol
Etil asetat
Heksana
Metanol
1.73 0.03a
0.72 0.05a
2.28 0.02a
0.29 0.01a
2.05 0.11a
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Khonkarn et al. (2010)
Maserasi Etanol
Air
762b
300b
-
-
-
-
Palanisamy et al. (2008)
Maserasi Etanol - - - Palanisamy et al. (2011a)
Maserasi Etanol
Air
Aquades
975 34b
428 21b
393.2 7.4c
-
-
-
-
-
-
Palanisamy et al (2011b)
Maserasi Eter
Metanol : Etanol
293.3 0.5c
542.2 0.0c
-
-
-
-
-
-
Thitilerdecha et al. (2008)
Maserasi Water : asam
asetat (60:39:1)
- 181.3
-
-
-
Sun et al. (2011)
Maserasi Air - - 21.18 Wongsiri et al. (1993)
a = mg gallic acid/ml; b = mg gallic acid/g berat ekstrak kering; c = mg katekin/g ekstrak kering
-
17
Tabel 3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam askorbat pada kulit buah rambutan
Metode ekstraksi Pelarut Geraniin Ellagic acid
(mg/g ekstrak
kering)
Corilagin (mg/g
ekstrak kering)
Asam askorbat
(mg/100 g
berat segar)
Referensi
Maserasi Etanol
Air
37.9 8.3d
15.2 2.3d
-
-
-
-
-
-
Palanisamy et al. (2011b)
Maserasi Etanol 3.79%c - - - Palanisamy et al. (2011a)
Maserasi Methanol 568d 53.5 71.9 - Thitilerdecha et al. (2010)
- - - - - 36.4 Wall 2006
Tabel 4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada kulit buah rambutan (mg/100 g berat kering)
Metode ekstraksi Pelarut Saponin Alkaloid Tanin Flavonoid Referensi
- - 2.24 0.57 4.41 0.01 1.72 0.02 22.30 0.30 Fila et al. (2010)
-
18
Alkaloid merupakan kelompok dari metabolit sekunder yang
memiliki atom nitrogen, dan merupakan bagian dari cincin heterosiklik.
Sebagian besar alkaloid mempunyai aktivitas biologis tertentu. Beberapa
alkaloid dilaporkan memiliki sifat beracun, tetapi ada pula yang sangat
berguna dalam pengobatan. Senyawa alkaloid dapat bertindak sebagai
penangkap radikal bebas dan dapat mencegah terjadinya peroksidasi lipid
pada hepatik mikrosomal (Moura et al. 2007).
Terpenoid merupakan senyawa yang mengandung atom karbon
kelipatan lima. Terpenoid merupakan antioksidan alami, seperti halnya
tokoferol dan asam askorbat. Terpenoid merupakan senyawa hidrokarbon
isometrik terdapat pada lemak esensial, dapat membantu tubuh dalam proses
sintesis organik dan pemulihan sel-sel tubuh. Terpenoid mampu menunda,
memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid (Grassman 2005).
Tanin merupakan senyawa polifenol yang memiliki berat molekul
cukup tinggi (lebih dari 1000) dan dapat membentuk kompleks dengan
protein. Berdasarkan strukturnya, tanin dibedakan menjadi dua kelas yaitu
tanin terkondensasi (condensed tannins) dan tanin terhidrolisiskan
(hydrolysable tannins) (Harborne 1996). Tanin dilaporkan memiliki efek
fisiologis seperti mempercepat pembekuan darah, menurunkan tekanan
darah, menurunkan kadar lipid serum, menghasilkan nekrosis hati dan
memodulasi respons imun (Chung et al. 1998). Tanin mempunyai
kemampuan untuk mengikat protein dan juga menimbulkan astringent
sensation (rasa tidak enak) bagi hewan ternak atau manusia yang
mengkonsumsinya. Astringent sensation ini ditimbulkan karena adanya
ikatan kompleks antara mukoprotein dengan tanin (Farida et al. 2000).
Konsumsi senyawa tanin dalam jumlah banyak akan menimbulkan
pengaruh negatif, misalnya menghambat penyerapan mineral. Selain itu,
tanin juga berperan sebagai zat karsinogenik, hepatoksik dan memiliki
aktivitas antinutritional (Chung et al. 1998).
Tanaman yang mengandung senyawa flavonoid telah terbukti
mempunyai aktivitas antioksidan (Alan & Miller 1996). Flavonoid adalah
-
19
senyawa golongan fenolik yang mempunyai struktur kimia C6-C3-C6
Flavonoid merupakan salah satu kelompok fenol yang terbesar di alam.
Lebih dari 4000 jenis flavonoid telah diidentifikasi dan beberapa
diantaranya memberikan warna pada bunga, buah dan daun. Flavonoid
merupakan pigmen tumbuhan kuning, kuning jeruk, dan merah yang dapat
ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji batang, bunga, herba, rempah-
rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti teh, minyak
zaitun, cokelat, anggur merah dan obat herbal (de Groot & Rauen 1998).
Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mempunyai sifat kimia fenol,
yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid
mempunyai gugus hidroksil tak tersulih atau suatu gula, sehingga
merupakan senyawa polar. Flavonoid larut dalam pelarut polar seperti
etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan
lain-lain (Markham 1988).
Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mengkelat
logam, berada dalam bentuk glukosida (memiliki rantai samping glukosa)
atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon. Mekanisme flavonoid
sebagai antioksidan yaitu mendonorkan ion hidrogen sehingga menetralisir
efek toksik dari radikal bebas serta meningkatkan ekspresi gen antioksidan
endogen melalui aktivasi nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2 ).
Akibat dari proses tersebut akan terjadi peningkatan gen yang berperan
dalam sintesis enzim antioksidan endogen, misalnya SOD (Sumardika &
Jawi 2012).
Kandungan senyawa kimia tertinggi pada kulit buah rambutan
adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Senyawa fenolik adalah senyawa
antioksidan alami yang berupa flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin,
tokoferol dan asam-asam organik. Komponen senyawa fenolik bersifat polar
dan memiliki kemampuan antioksidan melalui mekanisme sebagai
pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkelat logam, peredam
terbentuknya singlet oksigen serta pendonor elektron (Winarsi 2007).
Senyawa fenolik dapat larut dalam air. Penelitian Thitilerdecha et al. (2010)
-
20
berhasil mengisolasi senyawa fenolik bentuk polifenol dalam kulit buah
rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam ellagat, corilagin dan geraniin yang
berpotensi sebagai antioksidan. Polifenol merupakan senyawa kimia yang
mempunyai cincin aromatik dengan gugus hidroksil lebih dari satu.
Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan
sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut
memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi lipid.
Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain dengan
cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk
intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal fenoksil relatif
stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal selanjutnya.
Aktivitas biologis yang tinggi pada senyawa fenolik terletak pada posisi dan
jumlah gugus OH (Nzaramba 2008).
Grup fenolik memiliki aktivitas sebagai antioksidan juga
prooksidan. Banyaknya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat
berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup fenolik dapat
menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun, pada
konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan
antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Gordon 1990).
D. Malondialdehida (MDA)
Kerusakan oksidatif pada senyawa lipid terjadi ketika senyawa
radikal bebas bereaksi dengan senyawa polyunsaturated fatty acid (PUFA).
Lipid membran bilayer diketahui merupakan campuran fosfolipid dan
glikolipid yang berikatan dengan asam lemak pada C1 dan C2 rantai gliserol.
Tingkat maupun jenis reaksi oksidasi pada berbagai asam lemak akan
berlainan. Perbedaan ini sangat bergantung pada jumlah dan posisi ikatan
rangkap pada rantai asam lemaknya (Muchtadi 2013).
Peroksidasi lipid pada membran dapat mendegradasi asam lemak
tak jenuh secara selektif kemudian mengakumulasikannya menjadi aldehid,
hidrokarbon dan produk-produk cross linking (Winarsi 2007). Peroksidasi
-
21
lipid merupakan inisiasi reaksi berantai oleh radikal hidrogen atau oksigen
yang menyebabkan teroksidasinya PUFA. PUFA lebih rentan terhadap
reaksi radikal bebas dibandingkan asam lemak jenuh. Jembatan metilen
yang dimiliki PUFA merupakan sasaran utama radikal bebas yang akan
membentuk radikal alkil, peroksil, dan alkoksil. Bentuk produk oksidasi
lipid yang banyak ditemukan dalam cairan biologis antara lain diena
terkonjugasi dalam plasma, hidroperoksida dalam plasma, LDL teroksidasi
dalam plasma, aldehid dalam plasma seperti TBARs, MDA dan 4-
hidroksinoneal (Allard et al. 1994).
MDA terbentuk dari peroksidasi lipid pada membran sel yang
merupakan reaksi radikal bebas. Apabila aktivitas radikal bebas melebihi
mekanisme pertahanan normal, maka akan terjadi berbagai gangguan
metabolis dan seluler. Radikal bebas dapat merusak sel dengan cara
merusak membran sel tersebut. Kerusakan pada membran sel dapat terjadi
dengan cara:
a. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan enzim dan/atau
reseptor yang berada di membran sel sehingga mengubah aktivitas
komponen-komponen yang terdapat pada membran sel tersebut
b. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan komponen membran
sel sehingga mengubah struktur membran dan mengakibatkan
perubahan fungsi membran dan/atau mengubah karakter membran
menjadi seperti antigen
c. Radikal bebas mengganggu sistem transpor membran sel melalui
ikatan kovalen, mengoksidasi kelompok thiol atau dengan mengubah
PUFA
d. Radikal bebas menginisiasi peroksidasi lipid secara langsung
terhadap PUFA dinding sel
Radikal bebas akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran sel.
Peroksida-peroksida lipid akan terbentuk dalam rantai yang makin panjang
dan dapat merusak organisasi membran sel. Peroksidasi lipid akan
-
22
mempengaruhi fluiditas membran, cross-linking membran, serta struktur
dan fungsi membran (Powers & Jackson 2008).
Mekanisme kerusakan sel akibat serangan radikal bebas yang
paling awal diketahui dan terbanyak diteliti adalah peroksidasi lipid.
Peroksidasi lipid paling banyak terjadi di membran sel, terutama asam
lemak tidak jenuh yang merupakan komponen penting penyusun membran
sel. Pengukuran tingkat peroksidasi lipid diukur dengan mengukur produk
akhirnya, yaitu malondialdehida (Lima et al. 2004). MDA merupakan
produk peroksidasi lipid yang relatif konstan terhadap proporsi peroksidasi
lipid, oleh karena itu merupakan indikator yang tepat untuk mengetahui
kecepatan (rate) proses peroksidasi lipid in vivo. Malondialdehida memiliki
tiga rantai karbon dengan rumus molekul C3H4O2 (Pryor et al. 1976).
MDA dapat bereaksi dengan komponen nukleofilik atau
elektrofilik. Aktivitas non spesifiknya, MDA dapat berikatan dengan
berbagai molekul biologis seperti protein, asam nukleat dan aminofosfolipid
secara kovalen (Muchtadi 2013). Efek negatif senyawa radikal maupun
metabolit elektrofilik dapat diredam oleh antioksidan, baik antioksidan zat
gizi maupun antioksidan non gizi. Oleh karena itu, tinggi rendahnya kadar
MDA sangat bergantung pada status antioksidan dalam tubuh seseorang.
Gambar 4. Struktur kimia MDA (Current Protocols 2010)
Winarsi et al. (2005), menemukan bahwa dalam tubuh wanita
perimenopause banyak terbentuk radikal bebas. Hal tersebut diketahui
melalui pengukuran kadar MDA plasma. Tingginya produk MDA
merupakan bukti rendahnya status antioksidan tubuh sehingga tidak dapat
mencegah reaktivitas senyawa radikal bebas. Di sisi lain, tingginya kadar
-
23
MDA plasma membuktikan kerentanan komponen membran sel terhadap
reaksi oksidasi.
Pemeriksaan kadar MDA dapat dilakukan menggunakan beberapa
cara, salah satunya dengan metode thiobarbituric acid reactive substance
(TBARs) yang dapat dilakukan secara in vivo maupun in vitro (Josephy
1997). Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu molekul MDA
dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Jumlah MDA yang terdeteksi
menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi.
E. Superoksida Dismutase (SOD)
Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron yang mampu
menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan
bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang
bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat.
Antioksidan terbagi menjadi tiga kelompok besar yaitu:
a. Antioksidan primer
Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis.
Antioksidan meliputi enzim SOD, katalase dan glutation peroksidase (GSH-
Px). Enzim-enzim tersebut mampu menekan atau menghambat
pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan
mengubahnya menjadi produk lebih stabil, disebut sebagai reaksi chain
breaking antioxidant. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer
apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa
radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah
menjadi senyawa yang lebih stabil (Winarsi 2007).
b. Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder merupakan antioksidan non enzimatis atau
antioksidan eksogen. Antioksidan dalam kelompok ini disebut sebagai
sistem pertahanan preventif. Dalam sistem pertahanan ini, terbentuknya
senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan logam atau
dirusak pembentukannya. Antioksidan non enzimatis dapat berupa
-
24
komponen non nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan buah-buahan
meliputi vitamin E, vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin dan
albumin. Kerja antioksidan non enzimatis dengan cara memotong reaksi
oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkap radikal
bebas (scavenger free radical). Akibatnya, radikal bebas tidak akan bereaksi
dengan komponen seluler (Lampe 1999).
c. Antioksidan tersier
Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA repair
dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim tersebut berfungsi dalam
perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas.
Enzim SOD merupakan antioksidan penting yang berasal dari
tubuh sendiri, berpengaruh sangat kuat dan merupakan pertahanan tubuh
garis pertama dalam mengatasi stres oksidatif (Fridovich 1981). SOD
merupakan antioksidan pencegah yang dapat menghambat kerusakan anion
superoksida. Cara kerja SOD yaitu dengan mengkonversi anion superoksida
menjadi komponen lain yang kurang berbahaya, yaitu hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida di dalam mitokondria akan mengalami detoksifikasi
oleh enzim katalase menjadi senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2 yang
berdifusi ke dalam sitosol akan didetoksifikasi oleh enzim glutation
peroksidase (Lee et al. 2004). SOD bersifat tidak stabil terhadap panas,
cukup stabil pada kondisi basa dan masih mempunyai aktivitas walaupun
disimpan sampai lima tahun pada suhu 5 0C.
SOD
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2
Aktivitas enzim SOD memiliki peran penting dalam sistem
pertahanan tubuh, terutama terhadap aktivitas senyawa oksigen reaktif yang
dapat menyebabkan stres oksidatif. Berdasarkan adanya logam yang
berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzim, dapat dikelompokkan
menjadi 3 yaitu Cu/ZnSOD, MnSOD dan FeSOD (Bannister et al. 1987).
Menurut Haliwell & Gutteridge (2007), aktivitas SOD tertinggi ditemukan
-
25
di hati, kelenjar adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas, otak, paru-paru,
lambung, usus, ovarium dan timus.
F. Senyawa Antioksidan Vitamin C
Vitamin C atau L-asam askorbat merupakan antioksidan yang larut
dalam air (aqueous antioxidant). Senyawa tersebut merupakan bagian dari
sistem pertahanan tubuh terhadap senyawa oksigen reaktif dalam plasma
dan sel (Zakaria 1996). Vitamin C merupakan antioksidan yang bekerja
sebagai donor elektron dengan cara memindahkan satu elektron ke senyawa
logam Cu. Vitamin C juga dapat menyumbangkan elektron ke dalam reaksi
biokimia intraseluler dan ekstraseluler. Vitamin C mampu menghilangkan
senyawa oksigen reaktif di dalam sel netrofil, monosit, protein lensa dan
retina. Vitamin tersebut juga dapat berinteraksi dengan Fe-ferritin. Di luar
sel, vitamin C mampu menghilangkan senyawa oksigen reaktif, mencegah
terjadinya LDL teroksidasi, mentransfer elektron ke dalam tokoferol
teroksidasi dan mengabsorpsi logam dalam saluran pencernaan (Levine et
al. 1995).
Kulit buah rambutan mengandung senyawa kimia, salah satunya
adalah vitamin C. Rata-rata kadar vitamin C yang terkandung pada kulit
buah rambutan adalah 36,4 mg/100 g (Wall 2006). Penelitian Palanisamy et
al. (2008), menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit buah rambutan
memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas sebanding dengan vitamin C
dan jauh lebih tinggi dari biji anggur. Antioksidan vitamin C mampu
bereaksi dengan radikal bebas kemudian mengubahnya menjadi radikal
askorbil. Senyawa radikal terakhir tersebut akan segera berubah menjadi
askorbat dan dehidroaskorbat. Asam askorbat dapat bereaksi dengan
oksigen teraktivasi, seperti anion superoksida dan radikal hidroksil. Pada
konsentrasi rendah, vitamin C dapat bereaksi dengan radikal hidroksil
menjadi askorbil yang sedikit reaktif. Pada konsentrasi tinggi asam tersebut
tidak akan bereaksi. Kerja askorbat sebagai antioksidan secara tidak
-
26
langsung juga meregenerasi ikatan antioksidan membran dengan cara
menangkap radikal peroksil dan oksigen singlet (Zakaria 1996).
Penelitian Huang et al. (2002) pada perokok menunjukkan bahwa
pemberian suplemen vitamin C 500 gram memberikan pengaruh dalam
menurunkan peroksidasi lipid subjek yang diukur dengan kadar 8-iso-
prostaglandin F2 urin. Mahfudz (2013), melaporkan bahwa pemberian
vitamin C mampu menurunkan kadar MDA dan meningkatkan FMD (Flow
Mediated Dilatation) pada pasien PGK stadium V yang menjalani
hemodialisis. Ramatina (2014), melaporkan bahwa suplementasi vitamin C
500 mg mampu menurunkan kadar MDA plasma pada kelompok wanita
muda sehat, mahasiswi alih jenis IPB. Berdasarkan hal tersebut, dapat
disimpulkan bahwa vitamin C merupakan antioksidan sekunder yang
mampu menangkap radikal bebas (scavenger free radical) sehingga radikal
bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler.
G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan
Dalam pengertian kimia, senyawa antioksidan adalah senyawa
pemberi elektron (electron donors). Secara biologis, pengertian antioksidan
adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak negatif
oksidan dalam tubuh. Antioksidan mampu memerangi radikal bebas baik
dengan cara mencegah, menghentikan ataupun memperlambat proses
oksidasi. Antioksidan melindungi sel dan jaringan sasaran dengan cara
memusnahkan ROS secara enzimatik atau dengan reaksi kimia langsung,
mengurangi pembentukan ROS, mengikat ion logam yang terlibat dalam
pembentukan ROS (tranferin, seruplasmin, albumin), memperbaiki
kerusakan sasaran serta menghancurkan molekul yang rusak dan
menggantinya dengan yang baru (Schuler 1990).
Antioksidan bereaksi melalui pembersihan senyawa ROS atau
penurunan konsentrasinya secara lokal (eliminating oxygen), pembersihan
ion logam katalitik (immobilizing catalysts or metal ion), pembersihan
radikal bebas yang berfungsi sebagai inisiator seperti hidroksil, peroksil dan
-
27
alkalosil (terminating chain reaction), pemutus rantai dari rangkaian reaksi
yang diinisiasi oleh radikal bebas (inhibiing radical generating enzymes)
dan peredam reaksi serta pembersih singlet oksigen (Kartikawati 1999).
Kulit buah rambutan mengandung senyawa polifenol yang
berperan sebagai zat antioksidan. Polifenol memiliki struktur kimia yang
sangat baik dalam aktivitas scavenging radikal dan menunjukkan aktivitas
antioksidasi yang lebih efektif secara in vitro dibandingkan dengan asam
askorbat dan -tokoferol. Aktivitas antioksidasi dari polifenol ditandai
dengan aktivitas yang relatif tinggi sebagai donor hidrogen (elektron),
pemutus rantai dan pengkelat transisi logam (Rice-Evans et al. 1995).
Aktivitas antioksidan senyawa polifenol dapat menghambat kerja radikal
bebas melalui pengubahan senyawa radikal bebas reaktif menjadi stabil.
Polifenol mampu menangkal oksigen dan radikal alkil dengan memberikan
donor elektron (hidrogen) kepada radikal bebas sehingga terbentuk radikal
fenoksil. Radikal fenoksil memiliki ikatan rangkap terkonjugasi sehingga
tidak menimbulkan radikal bebas dan bersifat lebih stabil (Thitilertdecha et
al. 2010).
H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal menggunakan DPPH
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) merupakan suatu radikal
bebas yang stabil pada suhu ruangan dan dapat bereaksi dengan atom
hidrogen dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi. DPPH
berperan sebagai sumber radikal bebas. Penangkapan radikal bebas
menggunakan DPPH paling umum digunakan untuk menentukan aktivitas
antioksidan suatu ekstrak tumbuhan. Radikal DPPH adalah suatu senyawa
organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada
maks 517 nm dan berwarna ungu gelap. DPPH akan bereaksi dengan
senyawa antioksidan kemudian mereduksi DPPH. Proses tersebut akan
menyebabkan perubahan warna menjadi kuning. Perubahan warna menjadi
kuning dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Aktivitas antioksidan
dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh dari
-
28
nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sampel (Kedare & Singh
2011). Reaksi penangkapan radikal bebas menggunakan DPPH oleh suatu
antioksidan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan (Windono 2001)
Gambar 6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom H
(Cowie & Arrighi 2007)
Penggunaan DPPH sebagai metode penangkapan radikal
mempunyai keuntungan, yaitu mudah digunakan, mempunyai sensitivitas
yang tinggi dan dapat menganalisis sejumlah sampel dalam waktu yang
singkat.
-
29
I. Kerangka Berfikir
Gambar 7. Kerangka berfikir penelitian
J. Hipotesis Penelitian
Berdasarkan rumusan masalah yang telah dikemukakan, maka
hipotesis yang akan diuji dalam penelitian ini adalah:
Pemberian ekstrak kulit buah rambutan menurunkan kadar MDA dan
meningkatkan aktivitas SOD tikus yang dipapar asap rokok.
Peroksidasi lipid
Ekstrak kulit buah
rambutan
Kandungan senyawa
fenolik, alkaloid,
steroid, terpenoid, tanin,
flavonoid, asam
askorbat, antosianin
MDA SOD
ROS meningkat
Karbon monoksida, tar,
nikotin dan senyawa
berbahaya lainnya
Paparan asap rokok
Antioksidan MDA SOD
Peroksidasi lipid
Menghambat
-
30
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 2 bulan. Penelitian ini terdiri dari
beberapa tahap, yaitu pembuatan ekstrak kulit buah rambutan, pengukuran
aktivitas antioksidan, pemeliharaan hewan coba, pemeriksaan kadar MDA
dan aktivitas SOD. Pembuatan ekstrak kulit buah rambutan dilakukan di
Laboratorium Farmasi FK Unissula. Pemeliharaan hewan coba dilakukan di
Laboratorium Biologi FMIPA Unnes. Pengukuran aktivitas antioksidan
dilakukan di Laboratorium Pangan Unika Soegijapranata. Pemeriksaan
kadar MDA dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
UNDIP dan pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan di Laboratorium Gizi
Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM.
B. Populasi dan Sampel
Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih
(Rattus novergicus) galur Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Semarang.
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih galur
Wistar jantan terdiri dari 30 ekor, berumur 2 bulan dengan berat badan 150-
200 gram, sehat, tidak cacat secara anatomi. Sampel diambil secara acak
dan dibagi menjadi 6 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 5
ekor. Banyaknya jumlah sampel sesuai rekomendasi dari WHO (1993)
bahwa besar sampel minimal yang digunakan untuk uji eksperimental
adalah 5 ekor setiap kelompoknya.
-
31
C. Variabel Penelitian
Ada 3 macam variabel dalam penelitian ini yaitu:
1. Variabel Bebas
Variabel bebas berupa ekstrak kulit buah rambutan.
2. Variabel terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar MDA dan aktivitas
SOD tikus.
3. Variabel kendali
Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis rokok, jenis
kelamin, umur, berat badan, jenis pakan tikus, ukuran dan kondisi
lingkungan kandang tikus.
D. Rancangan Penelitian
Desain penelitian adalah Randomized Post Test Only With Control
Group Design dengan rancangan kelompok:
Kelompok A : Merupakan kelompok kontrol normal, tikus diberi
akuades
Kelompok B : Merupakan kelompok kontrol negatif, tikus diberi
paparan asap rokok selama 14 hari
Kelompok C : Merupakan kelompok kontrol positif, tikus diberi
asap rokok dan vitamin C 1 mg/200gBB selama 14
hari
Kelompok D : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 3
mg/200gBB selama 14 hari
Kelompok E : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 6
mg/200gBB selama 14 hari
Kelompok F : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 12
mg/200gBB selama 14 hari
-
32
Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah kulit buah
rambutan kultivar Sekaran yang diperoleh dari Gunungpati, Semarang.
Paparan asap rokok dalam penelitian ini merupakan hasil pembakaran 3
batang rokok kretek sebagai bahan penyebab peningkatan radikal bebas.
Desain penelitian dapat dicermati pada Gambar 8.
Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Buah Rambutan, Vitamin C dan Rokok
1. Dosis ekstrak kulit buah rambutan
Dosis ekstrak kulit buah rambutan mengacu pada penelitian
Sandhiutami et al. (2015). Dosis ekstrak kulit buah rambutan yang
digunakan yaitu: 21 mg/kgBB, 42 mg/kgBB dan 84 mg/kgBB. Sandhiutami
et al. (2015) melaporkan bahwa dosis efektif untuk menurunkan kadar
MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari adalah 42
mg/kgBB.
Dosis per 200 gram tikus adalah sebagai berikut:
Dosis I :
Dosis II :
Dosis III :
Dosis ekstrak kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini
yaitu 3 mg/ekor/hari, 6 mg/ekor/hari dan 12 mg/ekor/hari.
2. Dosis vitamin C
Dosis vitamin C mengacu pada penelitian Sandhiutami et al.
(2015). Penelitian tersebut melaporkan bahwa pemberian vitamin C 6,5
mg/kgBB mampu meningkatkan aktivitas SOD pada mencit yang diberi
aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari. Dosis per 200 gram tikus adalah
sebagai berikut:
Dosis Vit C : 0,13 x 7 = 1 mg
Dosis vitamin C yang digunakan adalah 1 mg/ekor/hari.
-
33
3. Dosis rokok
Penentuan jumlah rokok yang digunakan dalam penelitian ini
mengacu pada penelitian Adyttia et al. (2014). Pada penelitian tersebut
menunjukkan bahwa pemberian rokok 3 batang/hari selama 14 hari pada
tikus mampu meningkatkan kadar MDA tikus. Oleh sebab itu, pada
penelitian ini jumlah rokok yang digunakan adalah 3 batang/hari selama 14
hari.
E. Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam Tabel 5
dan 6.
Tabel 5. Alat penelitian
No Nama Alat Fungsi
1. Gelas ukur Tempat untuk mengukur aquades dan
larutan ekstrak kulit buah rambutan
2. Pengaduk Untuk mengaduk ekstrak kulit buah
rambutan
3. Neraca digital Untuk menimbang berat tikus
4. Wadah minum Tempat minum tikus
5. Sonde lambung spuit Alat untuk menginjeksi ekstrak kulit buah
rambutan secara oral
6. Kandang tikus Tempat pemeliharaan tikus dengan ukuran
36 cm x 28 cm x 12 cm
7. Smoking chamber Tempat untuk pengasapan rokok pada
tikus dengan ukuran 42 cm x 29 cm x 33
cm
8. Pipet hematokrit Untuk mengambil darah pada sinus
orbitalis tikus
9. Tabung eppendorf Untuk menampung darah
10. Sentrifuge scientific Untuk memisahkan bagian-bagian pada sel
darah
11. Container box Untuk penyimpanan sementara sampel
darah saat dibawa ke laboratorium
12. Kamera Sebagai dokumentasi
-
34
Tabel 6. Bahan penelitian
No Nama Bahan Fungsi
1. Ekstrak kulit buah
rambutan
Bahan uji coba yang dilakukan
2. Asap rokok kretek Bahan uji coba sebagai radikal bebas
3. Akuades Pelarut ekstrak kulit buah rambutan
4. EDTA Untuk mencegah terjadinya koagulasi atau
penggumpalan darah
5. Tikus putih jantan Hewan uji coba
6. Asam pikrat Untuk menandai tikus
7.
8.
Kapas/tissue
Etanol
Untuk membersihkan alat
Pelarut ekstraksi kulit buah rambutan
-
35
Gambar 8. Alur penelitian
30 ekor tikus
E
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan 6
mg/200gB
B
D
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan 3
mg/200gBB
C
Asap rokok
+ Vitamin C
1
mg/200gBB
B
Asap
rokok/har
i
A
akuades
F
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan
12
mg/200gBB
Aklimatisasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar dan akuades
Perlakuan dilakukan selama 14 hari
Mengambil sampel darah pada hari ke
15
Mengukur kadar MDA dan SOD
Analisis data
Randomisasi menjadi 6 kelompok
-
36
F. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
kulit buah yang telah dipotong menjadi bagian kecil. Kulit buah kemudian
dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan di dalam ruangan selama
3-5 hari. Kulit yang sudah kering selanjutnya dihaluskan menggunakan
blender hingga didapat serbuk kering. Metode ekstraksi yang digunakan
dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Serbuk kering diekstrasi
menggunakan pelarut etanol 96% selama 24 jam pada suhu kamar dengan
perbandingan 1:1. Suspensi yang diperoleh disaring menggunakan kertas
Whatman No. 1. Filtrat yang terkumpul diuapkan menggunakan rotary
evaporator hingga terbentuk pasta.
2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Menggunakan DPPH
Pengukuran diawali dengan pembuatan larutan DPPH. Sebanyak
1,97 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 100 ml,
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,05 mM. Selanjutnya
dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan.
Sebanyak 25 mg ekstrak kulit buah rambutan dilarutkan dengan metanol
dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian pada labu ukur sampel
ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM. Larutan blanko dibuat dengan
cara larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 25 ml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai
garis tanda. Absorbansi DPPH diukur menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai
penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan sampel.
Nilai serapan larutan DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut (%):
-
37
3. Perlakuan Hewan Percobaan
Penelitian ini diawali dengan mempersiapkan 30 ekor tikus putih
galur Wistar yang diaklimatisasi selama 7 hari. Hewan percobaan
dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok masing-masing kelompok
5 ekor. Hewan ditempatkan pada kandang individual yang dibersihkan
setiap hari. Tikus diberi pakan standar dan air minum secara ad libitum
selama penelitian. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi menggunakan 3
batang rokok dalam satu hari. Pemaparan dilakukan selama 14 hari. Pada
saat akan diberi paparan asap rokok, hewan coba dipindahkan ke dalam
kandang khusus yaitu smoking chamber sesuai kelompoknya. Kandang
tersebut merupakan kotak pengasapan yang di dalamnya terdapat jeruji
pembatas untuk memisahkan hewan coba dengan ujung rokok yang
terbakar. Apabila hewan coba dimasukkan maka tikus dapat secara langsung
terkena paparan asap rokok. Asap rokok dihembuskan berulang kali dengan
bantuan tabung injeksi hingga rokok habis terbakar. Pemberian ekstrak kulit
buah rambutan dilakukan satu jam setelah paparan asap rokok.
4. Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 15 penelitian. Darah
diambil dari sinus orbitalis dengan hematokrit sebanyak 3 ml dan
ditampung dalam tabung eppendorf yang telah berisi EDTA. Sampel yang
digunakan untuk pengukuran kadar MDA adalah plasma darah dan untuk
pengukuran aktivitas SOD adalah whole blood. Darah yang terkumpul
selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 0C. Plasma yang terbentuk dipindah ke dalam tabung baru dan
disimpan pada suhu -80 0C sampai siap untuk dianalisis. Larutan penyangga
yang terbentuk dihilangkan dari pelet eritrosit, kemudian eritrosit dilarutkan
sebanyak 5X volumenya dengan menggunakan ddH2O. Eritrosit yang telah
dilarutkan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm dan
supernatan yang terbentuk disimpan pada suhu -80 0C sampai siap untuk
dianalisis.
-
38
5. Pengukuran Kadar MDA
Pemeriksaan kadar MDA menggunakan plasma darah. Prosedur
pengukuran kadar MDA dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Prosedur pengukuran kadar MDA
Sampel Blanko
Sampel plasma 200 l -
TCA 15% 2000 l 2000 l
TBA 0,37% dalam HCl 0,25 N 2000 l 2000 l
Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada
suhu 950C selama 60 menit. Kemudian tabung diletakkan pada ice bath
selama 15 menit. Sampel yang sudah dingin disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk
dipindahkan ke dalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 545 nm.
Rumus penghitungan kadar MDA (nmol/ml) :
6. Pengukuran Aktivitas SOD
Pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan menggunakan metode
kalorimetri. Sampel yang digunakan dalam pengukuran ini adalah whole
blood. Prosedur pengukuran aktivitas SOD dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD
Sampel Blanko 1 Blanko 2 Blanko 3
Whole blood 20 l - 20 l -
ddH2O - 20 l - 20 l
Larutan pereaksi WST 200 l 200 l 200 l 200 l
Larutan pengencer buffer - - 20 l 20 l
Larutan pereaksi enzim 20 l 20 l - -
Semua larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 370C selama 20 menit,
selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 450 nm
menggunakan microplate reader
Rumus penghitungan aktivitas SOD (%) :
( ) ( )
( )
-
39
G. Analisis Data
Analisis data dalam penelitian ini meliputi uji normalitas
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov test dilanjutkan uji homogenitas
dengan uji Levene test. Untuk mengetahui perbedaan rata-rata antara
kelompok dilakukan uji komparasi menggunakan uji one way Anova dan
dilanjutkan dengan uji Least Significant Differences (LSD). Analisis
statistik dibantu dengan program SPSS (Statistical Product and Service
Solutions) for windows versi 17.
-
40
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian
Hasil penelitian aktivitas antioksidan yang diuji menggunakan
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan dinyatakan sebagai % inhibisi,
menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan
memiliki nilai sebesar 77,83% yang termasuk dalam kategori sedang. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa setiap kelompok memiliki variasi kadar
MDA dan SOD. Berdasarkan uji normalitas diketahui bahwa data MDA dan
SOD berdistribusi normal. Hasil uji one way anova menunjukkan ekstrak
kulit buah rambutan berpengaruh terhadap kadar MDA dan SOD tikus yang
dipapar asap rokok (Lampiran 2 & 3).
Hasil uji LSD (Tabel 9) menunjukkan bahwa pada kelompok A yaitu
kelompok normal memiliki kadar MDA terendah dan SOD tertinggi.
Kelompok normal digunakan sebagai kelompok kontrol untuk mengetahui
kadar MDA dan SOD pada keadaan normal tanpa pemberian ekstrak kulit
buah rambutan dan paparan asap rokok. Kadar MDA pada kelompok A
berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan tidak berbeda nyata dengan
kelompok C dan E. Aktivitas SOD kelompok A berbeda nyata dengan
kelompok lainnya (B, C, D, E dan F).
Tabel 9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD
Kelompok Perlakuan Kadar MDA
(nmol/ml)
Aktivitas SOD
(%)
A Normal 10,24 0,55a 81,09 4,37
a
B Asap rokok 15,30 0,57b 29,45 3,50
b
C Asap rokok + vitamin C 1
mg/200gBB
10,82 1,22a 65,81 3,49
c
D Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 3 mg/200gBB
12,59 1,20c 50,18 4,91
d
E Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 6 mg/200gBB
11,06 1,71a 60,72 6,62
ec
F Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 12 mg/200gBB
13,53 0,55dc
42,91 6,62f
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf pada kolom yang sama
menunjukkan perbedaan pada setiap kelompok perlakuan
dengan taraf ketelitian p
-
41
Pada kelompok B yaitu kelompok kontrol negatif memiliki kadar
MDA sebesar 15,30 nmol/ml dan merupakan kelompok dengan kadar MDA
tertinggi. Kelompok B memiliki aktivitas SOD terendah, yaitu sebesar
29,45%. Kelompok B merupakan kelompok yang dipapar asap rokok 3
batang/hari. Kadar MDA dan aktivitas SOD pada kelompok B berbeda
nyata dengan semua kelompok lainnya (A, C, D, E dan F)
Pada kelompok E dan F merupakan kelompok yang diberi ekstrak
kulit buah rambutan dengan dosis 6 mg/200gBB dan 12 mg/200gBB .
Kadar MDA kelompok E berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan tidak
berbeda nyata dengan kelompok A dan C. Aktivitas SOD kelompok E
berbeda nyata dengan kelompok A, B, D, F dan tidak berbeda nyata dengan
kelompok C. Kadar MDA kelompok F berbeda nyata dengan kelompok A,
B, C, E dan tidak berbeda nyata dengan kelompok D. Aktivitas SOD
kelompok F berbeda nyata dengan kelompok lainnya.
B. Pembahasan
Hasil penelitian menunjukkan pemaparan asap rokok menyebabkan
peningkatan kadar MDA. Pada kelompok kontrol negatif (kelompok B)
memiliki kadar MDA tertinggi yang berbeda nyata dengan kelompok
lainnya. Pada keadaan normal, radikal bebas terbentuk di dalam tubuh
sangat lambat dan perlahan. Pada saat radikal bebas meningkat melebihi
kemampuan pertahanan endogen, maka akan terjadi ketidakseimbangan
antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan endogen, sehingga
terjadilah ketidakstabilan (stres) oksidatif. Stres oksidatif menyebabkan
peroksidasi lipid yang berlebihan. Hasil dari peroksidasi lipid adalah MDA,
sehingga meningkatnya peroksidasi lipid dapat menyebabkan kadar MDA
dalam tubuh meningkat (Winarsi 2007).
Paparan asap rokok dapat menyebabkan kerusakan pada organ
paru-paru. Rusaknya paru-paru sebagai target utama yang langsung terkena
asap rokok dapat dijelaskan dengan adanya paparan agen kimia di dalam
asap rokok. Namun, efek yang menyebabkan penyakit kronis pada sistem
-
42
organ lain kemungkinan adalah hasil pajanan secara tidak langsung
(Yanbaeva et al. 2014).
Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi autooksidasi in vitro dari
PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid. Fase gas asap rokok dapat berisi
hingga 1014
radikal bebas dan zat-zat reaktif per kepulan asap rokok.
Radikal bebas dan oksidan yang terdapat pada fase gas asap rokok memiliki
waktu paruh pendek, namun senyawa tersebut dapat memasuki aliran darah
dan menyebabkan kerusakan oksidatif makromolekul (Swan & Lessov-
Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida jenuh dan
tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen peroksida.
Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan ROS
melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang jauh dari
paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif (Tostes et al.
2008).
Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon yang
akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk senyawa
radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat menginisiasi PUFA
dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel asap rokok
memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase partikel
mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil dari
hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel dan
dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas akan
mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel seperti
PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama radikal
bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil (Allard et
al. 1994).
Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan
dengan variasi 3 dosis mengalami penurunan. Ekstrak kulit buah rambutan
mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, steroid, terpenoid,
fenolik (Wardhani & Saptono 2015) yang berfungsi sebagai antioksidan.
Senyawa fenolik adalah senyawa antioksidan alami yang berupa flavonoid,
-
43
turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik.
Komponen senyawa fenolik bersifat polar dan memiliki kemampuan
antioksidan melalui mekanisme sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas,
pengkelat logam, peredam terbentuknya singlet oksigen serta pendonor
elektron (Winarsi 2007). Senyawa fenolik dapat larut dalam air. Penelitian
Thitilerdecha et al. (2010) berhasil mengisolasi senyawa fenolik bentuk
polifenol dalam kulit buah rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam ellagat,
corilagin dan geraniin yang berpotensi sebagai antioksidan.
Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan
sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut
memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi lipid.
Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain dengan
cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk
intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal fenoksil relatif
stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal selanjutnya
(Nzaramba 2008). Pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan
didapatkan dosis efektif untuk menurunkan kadar MDA yaitu dosis 6
mg/200gBB (kelompok E).
Kadar MDA kelompok C 10,821,22 nmol/ml berbeda nyata
dengan kelompok B (kontrol negatif) ), D dan F. Kelompok C merupakan
kelompok kontrol positif. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa vitamin C
dapat mencegah proses peroksidasi lipid dengan mendonorkan elektron.
Vitamin C memiliki sifat antioksidan yang dapat melindungi molekul yang
dibutuhkan oleh tubuh (seperti protein, lipid, karbohidrat dan asam nukleat)
dari kerusakan oleh radikal bebas (Winarsi 2007).
Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan
dosis 12 mg/200gBB (F) sebesar 13,53 nmol/ml tidak berbeda nyata
dengan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan 3 mg/200gBB
(kelompok D). Penelitian Sandhiutami et al. (2015) juga memaparkan
bahwa ekstrak kulit buah rambutan dosis 84 mg/kgBB meningkatkan kadar
MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan. Fila et al. (2012)
-
44
melaporkan bahwa kandungan senyawa tertinggi pada kulit buah rambutan
adalah senyawa fenolik. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa
antioksidan fenolik juga memiliki aktivitas prooksidan dalam kondisi
tertentu, seperti pada dosis tinggi, pH tinggi atau di hadapan ion logam
(Decker 1997). Banyaknya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat
berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup fenolik dapat
menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun, pada
konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan
antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Bouayed & Bohn 2010). Oleh
karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis ekstrak kulit
buah rambutan sehingga diketahui dosis yang efektif sebagai antioksidan
dan prooksidan.
Enzim SOD adalah antioksidan enzimatis yang memegang peranan
penting dalam melindungi sel dari stres oksidatif (Fridovich 1981). SOD
mengatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi
hidrogen peroksida (H2O2). H2O2 akan diubah menjadi H2O oleh enzim
katalase dan glutation peroksidase (Lee et al. 2004). Kesempurnaan kerja
sistem enzim antioksidan diperankan oleh tiga macam enzim tersebut (SOD,
katalase, glutation peroksidase), namun antioksidan seluler tidak dapat
bekerja secara individual tanpa dukungan asupan antioksidan sekunder dari
bahan pangan. Oleh karena itu, diperlukan konsumsi bahan makanan yang
kaya akan komponen antioksidan dengan jumlah memadai agar mampu
memacu kerja enzim antioksidan dalam tubuh (Lampe 1999).
Pembentuk radikal bebas dari asap rokok terdapat dalam dua fase,
yaitu fase gas yang berupa NO & nitrit peroksida (NO2) dan fase partikel
berupa quinine, semiquinone & hydroquinone (Trabel et al. 2000). Kedua
fase pembentuk radikal bebas tersebut apabila bereaksi dengan logam
transisi seperti Fe dan Cu akan menghasilkan radikal bebas O2 dan H2O2
yang selanjutnya membentuk radikal hidroksil. Pemakaian enzim SOD yang
terlalu besar untuk menetralisir radikal bebas secara terus-menerus akan
menurunkan aktivitas enzim tersebut (Muhammad 2009).
-
45
Penurunan aktivitas SOD pada kelompok B menunjukkan bahwa
pemaparan asap rokok mengakibatkan peningkatan radikal bebas pada tikus.
Pada saat pemaparan asap rokok akan terbentuk radikal superoksida (O2),
yaitu zat reaktif yang berbahaya bagi tubuh. Enzim SOD dapat menetralisir
radikal tersebut dengan mengubah dua molekul O2 menjadi H2O2 dan O2.
Peningkatan O2 secara terus-menerus akan mengganggu aktivitas SOD
yang menyebabkan ketidakseimbangan antara oksidan dan antioksidan
endogen (Fridovich 1981). Hal ini didukung oleh penelitian Muhammad
(2009) yang menyatakan bahwa keadaan stres dapat meningkatkan jumlah
radikal bebas. Kondisi tersebut akan menyebabkan penggunaan enzim SOD
semakin banyak sehingga enzim SOD yang tersedia jumlahnya semakin
berkurang.
Pada kondisi stres oksidatif, imbangan normal antara ROS dengan
kemampuan antioksidan tubuh untuk mengeliminasinya mengalami
gangguan sehingga menggoyahkan rantai reduksi-oksidasi normal.
Akibatnya, terjadilah kerusakan jaringan (stres oksidatif). Kerusakan
jaringan akibat radikal bebas tergantung pada beberapa faktor, antara lain
target molekuler, tingkat stres yang terjadi, mekanisme yang terlibat serta
waktu dan sifat alami dari sistem yang diserang