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Nuacutem 27 pp 103-130 ISSN 1405-2768 Meacutexico 2009

EFECTO DE LA PRESENCIA DE FENANTRENO SOBRE LA EXPRESIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Y LA ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA RADICAL DE CYPERUS

HERMAPHRODITUS

L Angeacutelica Guerrero-ZuacutentildeigaDireccioacuten de Seguridad y Medio Ambiente Instituto Mexicano del Petroacuteleo

Eje Central Laacutezaro Caacuterdenas 152 CP 07730 Meacutexico DF

Angeacutelica Ma Rodriacuteguez-DorantesEscuela Nacional de Ciencias Bioloacutegicas Instituto Politeacutecnico Nacional

Prol Carpio y Plan de Ayala sn CP 11340 Meacutexico DFCorreo electroacutenico anrodo2000hotmailcom

RESUMEN

Los hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAP) forman parte de los contaminantes derivados del petroacuteleo que se encuentran en el ambiente y en particular se ha encontra-do que los suelos con cubierta vegetal son considerados altamente efectivos para la remocioacuten y mineralizacioacuten de eacutestos ya que las raiacuteces de las plantas presentan proteiacutenas relacionadas con la fi torremediacioacuten como son algunos sistemas enzimaacuteticos asociados a la pared celular que contribuyen a la re-mediacioacuten de sitios contaminados a traveacutes de la accioacuten directa o por unioacuten secuestro transformacioacuten y transporte de los contami-nantes orgaacutenicos

El objetivo de este trabajo fue analizar los cambios en la expresioacuten de proteiacutenas radica-les solubles y unidas a la pared celular y la actividad de algunas enzimas consideradas como marcadores bioquiacutemicos de plantas de Cyperus hermaphroditus expuestas a

fenantreno un HAP triciacuteclico con la fi -nalidad de analizar fi sioloacutegicamente estos sistemas radicales y constituir herramientas uacutetiles para la transformacioacuten de contami-nantes orgaacutenicos El efecto del fenantreno en la actividad de guaiacol peroxidasas ascorbato peroxidasas lacasas y fosfatasas aacutecidas radicales de C hermaphroditus mostroacute diferencias signifi cativas entre las enzimas solubles extraiacutedas y la concen-tracioacuten del contaminante mientras que las enzimas unidas ioacutenicamente a la pared celular solamente mostraron diferencias signifi cativas entre ellas y no con respecto a la concentracioacuten del contaminante Los resultados demostraron que la magnitud de la actividad de las enzimas constitutivas y de la expresioacuten de proteiacutenas en su induccioacuten o represioacuten bajo la presencia de fenantreno en las plantas de Cyperus hermaphroditus pueden ser componentes importantes de las reacciones de plantas a la toxicidad de los contaminantes o bien participar en la transformacioacuten parcial de eacutestos a productos

Becaria de la Comisioacuten de Operaciones y Fomento de Actividades Acadeacutemicas (COFAA-IPN)

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Abril 2009Nuacutem 27 103-130

menos toacutexicos que puedan ser faacutecilmente absorbidos por las raiacuteces y ademaacutes ser con-fi nados en el interior de la planta

Palabras clave Cyperus fenantreno proteiacutenas

ABSTRACT

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are part of the petroleum contaminants encountered in the environment It has been shown that soils supporting vegetation are effective in removing and mineralizing these contaminants because plant roots have phytoremediation-related proteins like enzymatic systems linked to the plant cell wall that contribute to the remediation of contaminated sites Through their direct action or by union they sequester transform and transport organic contaminants

The aim of this work was to analyze chan-ges in the expression of the soluble and the ionically-bound cell wall root proteins and the activity of certain enzymes considered as biochemical markers in plants of Cyperus hermaphroditus exposed to phenanthrene a tricyclic aromatic hydrocarbon The effect of phenanthrene on the activity of the root enzymes guaiacol peroxidases ascorbate peroxidases laccases and acid phosphatases showed signifi cant differences between the enzymes of the soluble protein fraction and the contaminant concentration However the enzymes of the ionically-bound cell wall fraction showed signifi cant differences only among themselves not with respect to the concentration of contaminant The results showed that the amount of activity of constitutive enzymes and the induction or repression of protein expression in plants of C hermaphroditus exposed to phenanthrene

can be important mechanisms of plant reac-tions to contaminant toxicity or in partially transforming them to less toxic products that can be easily absorbed by the roots and sequestered in the plants

Key words Cyperus phenanthrene proteins

INTRODUCCIOacuteN

Los contaminantes orgaacutenicos pueden ser absorbidos por las raiacuteces a traveacutes de pro-cesos pasivos yo activos y despueacutes trans-locarse hacia la parte aeacuterea de las plantas por la corriente de transpiracioacuten (Chiou et al 2001 Li et al 2005) El transporte pasivo se efectuacutea a traveacutes de una serie de procesos de particioacuten entre el sistema planta-agua y el sistema planta-materia orgaacutenica y dentro de los diversos com-ponentes de las plantas de acuerdo con las concentraciones de los contaminantes no ioacutenicos en plantas con relacioacuten a la concentracioacuten de eacutestos en el agua o en la solucioacuten del suelo (Su amp Zhu 2007 Vanier et al 2001)

Los hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAP) se encuentran dentro de los conta-minantes derivados del petroacuteleo ubicuos persistentes que son generados por la combustioacuten incompleta de la piroacutelisis de materiales orgaacutenicos (Jiao et al 2007 Sheng amp Gong 2006) dada su naturaleza carcinogeacutenica los hace ser contaminantes blanco (ATSRD 1999)

Ya que las raiacuteces de las plantas generan enzimas aminoaacutecidos y hormonas del cre-cimiento que ayudan a mantener la actividad enzimaacutetica los suelos con cubierta vegetal son considerados altamente efectivos para

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Guerrero amp Rodriacuteguez Efecto de fenantreno sobre proteiacutenas y actividad enzimatica de C hermaphroditus

la remocioacuten y mineralizacioacuten de los HAP De la misma importancia son el intrincado juego de relaciones entre las raiacuteces de las plantas los microorganismos el suelo y los contaminantes que hacen posible los diversos procesos de fitorremediacioacuten (USEPA 2000)

La mayoriacutea de los compuestos HAP se adsorben a la superfi cie radical y se tiene solamente una pequentildea transferencia de eacutestos o de los productos transformados hacia el interior de la planta (Fismes et al 2002 Wang amp Jones 1994)

El fenantreno es un hidrocarburo aromaacute-tico triciacuteclico ampliamente distribuido en el ambiente como resultado de procesos piroacutelicos (Blumer 1976) No obstante que eacuteste no es mutageacutenico ni carcinogeacutenico se ha visto que es toacutexico para los organismos acuaacuteticos (Black et al 1983 Blumer 1976 Kush 1981 Savino amp Tanabe 1989) como se trata de un hidrocarburo aromaacutetico pe-quentildeo eacuteste se emplea frecuentemente como un sustrato modelo para desarrollar estudios sobre el metabolismo de hidrocarburos aro-maacuteticos policiacuteclicos carcinogeacutenicos (Narro et al 1992 Pelkonen amp Nebert 1982)

Es de consideracioacuten mencionar que la bio-degradacioacuten de los contaminantes comienza con la participacioacuten de enzimas extracelula-res pero que se requiere la presencia de la ceacutelula completa y de sus viacuteas metaboacutelicas para completarse Los HAP y otros conta-minantes toacutexicos se han transformado exi-tosamente por oacutexidorreductasas e hidrolasas que se han aislado de hongos bacterias y ceacutelulas vegetales en ensayos realizados bajo condiciones de laboratorio

En el caso particular de los HAP de tres y cuatro anillos se tiene que el antraceno el fenantreno el pireno y el fl uoranteno se han oxidado in vitro por enzimas tales como la peroxidasa de raacutebano picante (Guenther et al 1998)

Las plantas pueden responder a estreacutes abioacutetico y bioacutetico con un cambio raacutepido en la expresioacuten de genes lo cual da lugar a la siacutentesis de novo de proteiacutenas especiacutefi cas (Didierjean et al 1996 Yun et al 1999) que son consideradas como protectoras o proteiacutenas resistentes que en su mayoriacutea participan como transportadoras de xeno-bioticos como herbicidas y de compuestos orgaacutenicos endoacutegenos hacia dentro o fuera de las ceacutelulas o hacia las vacuolas (Keppler et al 1999 Wang amp Dawn 2003) Asiacute mismo eacutestas poseen un fuerte sistema en-zimaacutetico de defensa para manejarse contra xenobioacuteticos El metabolismo de eacutestos en plantas se divide en tres fases fase I que involucra reacciones de transformacioacuten fase II que consiste en el desarrollo de reacciones de conjugacioacuten y fi nalmente la fase III que es la fase de la compartamentalizacioacuten interna y procesos de almacenamiento de los xenobioacuteticos (Sandermann 1992) Se ha probado la existencia de varios sistemas enzimaacuteticos detoxifi cadores para muchas plantas de diferentes especies de angiosper-mas gimnospermas helechos musgos y en macroalgas (Pfl ugmacher et al 1999)

Las proteiacutenas relacionadas con la fi torre-mediacioacuten (phytoremediation related pro-teins PRP) contribuyen a la remediacioacuten de contaminantes ambientales a traveacutes de la accioacuten directa o por unioacuten secuestro transformacioacuten y transporte de los contami-nantes orgaacutenicos esto distingue a las PRPs de otras proteiacutenas que participan en el esta-

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blecimiento de la estructura de las plantas que controlan la expresioacuten de genes o que transforman los metabolitos centrales que pueden ser productos fi nales de degradacioacuten de toacutexicos orgaacutenicos (Herle et al 2002 Salekdeh et al 2002 Saacutenchez et al 2001 Wang amp Dawn 2003)

Recientemente se ha tenido el intereacutes por conocer la diversidad geneacutetica inter e intraespeciacutefi ca de la respuesta al estreacutes en plantas la importancia de analizar los perfi les proteicos se ha aceptado en muchos estudios de estreacutes abioacutetico en plantas Al-gunos estudios previos han proporcionado informacioacuten uacutetil sobre enzimas individuales o transportadoras midiendo sus cambios dependientes de estreacutes en cantidad y ac-tividad Los resultados de estos estudios han formado las hipoacutetesis sobre cadenas de respuestas al estreacutes que juegan un papel signifi cativo en el control del tiempo y es-pacio de este tipo de respuestas en plantas (Bohnert et al 2006)

Se sabe que algunos sistemas enzimaacuteticos de plantas pueden degradar algunas estruc-turas hidrocarbonadas aromaacuteticas y lineales (Lu et al 1998 Tommasini et al 1998) Estas enzimas frecuentemente son enzimas asociadas a la pared celular que propor-cionan una transformacioacuten parcial de los compuestos a productos faacutecilmente dispo-nibles para las raiacuteces o los microorganismos rizosfeacutericos (Gianfreda amp Rao 2004)

El presente estudio forma parte de la in-vestigacioacuten baacutesica fi sioloacutegica que se ha desarrollado para evaluar la respuesta de cyperaacuteceas crecidas de manera natural en un suelo contaminado con hidrocarburos derivados del petroacuteleo investigacioacuten que ha consistido en el estudio de la respuesta del

crecimiento de tres especies de cyperaacuteceas en un suelo contaminado con hidrocarburos derivados del petroacuteleo (Guerrero 2000 Guerrero amp Rodriacuteguez 2006) en la evalua-cioacuten de la actividad enzimaacutetica de fenoloxi-dasas de Cyperus elegans de los sistemas radicales de plantas in toto y de cultivo de raiacuteces (in vitro) expuestos a fenantreno (Guerrero 2005 Guerrero amp Rodriacuteguez 2005) en la deteccioacuten de fenantreno en el sistema radical de Cyperus hermaphroditus empleando teacutecnicas fotoacuacutesticas (Cruz et al 2004) y en este trabajo el objetivo planteado fue analizar los cambios en la expresioacuten de proteiacutenas radicales de plantas de Cyperus hermaphroditus expuestas a fenantreno y el efecto de este contaminante sobre la actividad de algunas enzimas con-sideradas como marcadores bioquiacutemicos con la fi nalidad de analizar fi sioloacutegicamente estos sistemas radicales y constituir herra-mientas uacutetiles para la transformacioacuten de contaminantes orgaacutenicos

MATERIAL Y MEacuteTODOS

Obtencioacuten de las plaacutentulas de Cyperus hermaphroditus

Las semillas empleadas provienen de una colecta de material vegetal de Cyperus hermaphroditus en el pantano Santa Ale-jandrina cercano a la refi neriacutea de Minatitlaacuten en el estado de Veracruz Ver una zona contaminada con un total de hidrocarburos del petroacuteleo de 81 640 mg kg-1 de suelo seco (IMP amp UAM-I 1997)

La germinacioacuten se realizoacute en germinadores con arena y agua destilada esteacuteril a 36degC en oscuridad Posteriormente las plaacutentulas se trasplantaron y mantuvieron para su cre-cimiento en cultivos hidropoacutenicos en conte-

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nedores de vidrio aacutembar de 500 mL con 400 mL de solucioacuten mineral 020M NH4H2PO4 050M NH4NO3 115M Ca(NO3)2 026M CaCl2 020M MgCl26H2O 020M Mg(NO3)26H2O 040M MgSO47H2O 020M KH2PO4 120M KNO3 050M K2SO4 0040M FeCl36H2O 12 x 10-2M H3BO3 12 x 10-4M CuCl2H2O 23 x 10-3M ZnCl2 44 x 10-4M MnCl24H2O 6 x 10-6M Na2MoO4H2O EDTA and FeSO47H2O pH 6 y se mantuvieron bajo condiciones controladas en invernadero a 3717degC y 56 de humedad relativa en promedio con fotoperiodo 1212 por 90 diacuteas para su ex-posicioacuten con fenantreno

Exposicioacuten de los cultivos de Cyperus hermaphroditus a fenantreno

Se transfirieron plantas completas a contenedores de vidrio aacutembar de 1L de capacidad que conteniacutean 900 mL de la solucioacuten mineral a los cuales posteriormente se les adicionoacute fenantreno (grado HPLC SIGMA Chemical Co) a las concentraciones de 40 80 y 120 ppm a partir de una solucioacuten patroacuten de fenantreno (100 mg10 mL etanol al 95) exponieacutendolos durante tres diacuteas Los cultivos hidropoacutenicos con el contaminante se mantuvieron bajo condiciones de invernadero a 3717degC y 56 de humedad relativa en promedio con un sistem de burbujeo continuo mediante varillas de vidrio sumergidas en cada unidad hidropoacutenica conectadas a una bomba de aireacioacuten para proveer de aire a la solucioacuten prevenir la deposicioacuten de fenantreno insoluble en el fondo y favorecer la intercepcioacuten de eacuteste por los sistemas radicales y garantizar la distribucioacuten del compuesto en el sistema

Despueacutes de transcurrido el periodo de ex-posicioacuten a fenantreno se obtuvo el peso de la biomasa total epigea (material foliar) e hipogea (material radical) para cada expe-rimento y se separoacute el sistema radical para la obtencioacuten y caracterizacioacuten de proteiacutenas totales radicales y para los anaacutelisis enzi-maacuteticos

Obtencioacuten de proteiacutenas radicales totales separacioacuten de proteiacutenas solubles y unidas ioacutenicamente a la pared celular

La extraccioacuten de las proteiacutenas totales radi-cales se realizoacute seguacuten el meacutetodo de Flocco et al (2002) para el fraccionamiento de proteiacutenas tomando 15 g de material radical de muestras de cada experimento homoge-neizando esta biomasa en mortero en friacuteo (4ordmC) con 10 mL de regulador de KPO4 50 mM pH = 60 friacuteo las muestras se centri-fugaron a 3 500 rpm por 20 minutos a 4degC Posteriormente se guardoacute este sobrenadante que conteniacutea las proteiacutenas solubles unidas deacutebilmente a la pared celular (extracto I) mientras que el precipitado celular se lavoacute con el mismo regulador de fosfatos y se centrifugoacute nuevamente y resuspendioacute en regulador KPO4 50 mM + NaCl 1M pH 60 incubaacutendolo a 4ordmC durante 24 horas estas muestras nuevamente se centrifugaron guardando el sobrenadante que correspondioacute a las proteiacutenas ioacutenicamente unidas a la pared celular (extracto II)

Para los dos extractos radicales se cuantifi coacute la proteiacutena total para cada muestra de cada uno de los experimentos empleando el meacute-todo convencional de Bradford (1976)

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Actividad especiacutefi ca de guaiacol peroxida-sas (GPX) de los extractos radicales

La determinacioacuten de la actividad de guaia-colperoxidasas de los extractos I y II se realizoacute empleando el meacutetodo espectro-fotomeacutetrico de la oxidacioacuten de guaiacol (Guerrero 2005) depositando en tubos eppendorf de 15 mL 100 μL de muestra (extracto radical) + 15 mL de regulador de fosfato de potasio 01M pH = 60 + 32 μL de guaiacol 02M + 32 μL de peroacutexido de hidroacutegeno 003M Los tubos se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente se eviden-cioacute la actividad de las proteiacutenas a traveacutes del desarrollo de la coloracioacuten cafeacute-rojiza carac-teriacutestica de la oxidacioacuten y polimerizacioacuten del guaiacol y se leyoacute la absorbancia a 436 nm que se transformoacute utilizando el coefi ciente de extincioacuten molar del guaiacol (ε436 = 64 x 103 M-1 cm-1) para la determinacioacuten de la actividad especiacutefi ca de peroxidasas (nM guaiacol oxidadominμg proteiacutenag de peso fresco radical)

Actividad especiacutefica de lacasas de los extractos radicales

La determinacioacuten de la actividad de lacasas de los extractos I y II se realizoacute emplean-do el meacutetodo espectrofotomeacutetrico de la oxidacioacuten de catecol (Guerrero 2005) depositando en tubos eppendorf de 15 mL 100 μL de muestra (extracto radical) + 15 mL de regulador de fosfato de potasio 20 mM pH = 68 + 100μL de catecol 02M Los tubos se incubaron 15 minutos a tem-peratura ambiente se evidencioacute la actividad de las proteiacutenas a traveacutes del desarrollo de la coloracioacuten amarilla caracteriacutestica de la oxi-dacioacuten y polimerizacioacuten del catecol y se leyoacute la absorbancia a 450 nm que se transformoacute utilizando el coefi ciente de extincioacuten molar

del catecol (ε450 = 2211 x 103 M-1 cm-1) para la determinacioacuten de la actividad especiacutefi ca de laccasas (nM catecol oxidadominμg proteiacutenag de peso fresco radical)

Actividad especiacutefi ca de ascorbato peroxi-dasas (APX) de los extractos radicales

La determinacioacuten de la actividad de las ascorbato peroxidasas de los extractos I y II se realizoacute empleando el meacutetodo espec-trofotomeacutetrico de la oxidacioacuten de ascorbato (Nakano amp Asada 1981 Sairam et al 2004) depositando en tubos eppendorf de 15 mL 100 μL de muestra (extracto radical) + 15 mL de regulador de fosfato de potasio 50 mM pH = 70 + 500 μL de peroacutexido de hidroacutegeno 25 mM + 500 μL de ascorbato de sodio 10 mM para iniciar la reaccioacuten Se leyoacute el incremento en la absorbancia a 286 nm que se transformoacute utilizando el coefi ciente de extincioacuten molar del aacutecido ascoacuterbico (ε450 = 2211 x 103 M-1 cm-1) durante cinco minutos con intervalos de un minuto para la determinacioacuten de la ac-tividad especiacutefi ca de ascorbato peroxidasas (nM ascorbato oxidadominμg proteiacutenag de peso fresco radical)

Actividad especiacutefi ca de fosfatasas aacutecidas de los extractos radicales

La determinacioacuten de la actividad de fosfata-sas aacutecidas de los extractos I y II se realizoacute con base en la medicioacuten espectrofotomeacutetrica de la formacioacuten de para nitrofenol (pNP) (Triana-Coacuterdova 1994) que resulta de la hidroacutelisis del para-nitrofenil fosfato (pNPP) utilizado como sustrato para la enzima depositando en tubos de ensaye de 10 mL 100 μL de muestra (extracto radical) + 1 mL de regulador de acetato de sodio 50 mM pH = 48 + 05 mL de pNPP (para nitrofenil

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fosfato) 5 mM en regulador de acetatos 5 mM pH = 48 Los tubos se incubaron por 15 minutos a 30ordmC y se detuvo la reaccioacuten con 45 mL de NaOH 01N y se leyoacute la absorbancia de la solucioacuten a 400 nm Los resultados obtenidos se interpolaron en una curva tipo de pNP Para la determinacioacuten de la actividad especiacutefi ca de fosfatasas aacutecidas (nM paranitrofenolminμg proteiacutenag de peso fresco radical)

Anaacutelisis electroforeacutetico de proteiacutenas totales radicales

Se realizoacute la caracterizacioacuten electroforeacutetica de las proteiacutenas totales radicales de los extractos I y II con el empleo de geles de poliacrilamida-SDS para determinar la pre-sencia de algunas proteiacutenas inducidas bajo la presencia de fenantreno Los patrones de proteiacutenas totales radicales se obtuvieron mediante la teacutecnica de Laemmli (Ausubel et al 1992) empleando geles discontinuos con 4 y 12 de poliacrilamida-bisacrila-mida en los geles superior e inferior respec-tivamente Previo al corrimiento electrofo-reacutetico las muestras de proteiacutenas totales de los extractos se concentraron por el meacutetodo de Sauveacute et al (1995) empleando fenol y eacuteter Como marcadores de peso molecular se emplearon las proteiacutenas albuacutemina bovina (cross-linked) (66 000 + 132 000 + 198 000 y 264 000 Da) y hemoglobina (cross-linked) (16 000 + 32 000 + 48 000 y 64 000 Da) y Peroxidasa de raacutebano picante tipo VI (SIGMA Chemical Co) que se disolvieron conjuntamente en 15 mL de regulador de muestra (Regulador Tris-HCl pH = 68 + glicerol + azul de bromofenol + SDS) y se sometieron a ebullicioacuten tambieacuten por cinco minutos antes de su empleo

El corrimiento se realizoacute utilizando regula-dor Tris-Glicina (Tris 06 g y Glicina 288 g) pH 83 a 120 volts durante dos horas

Al teacutermino del corrimiento los geles se fi ja-ron con aacutecido tricloroaceacutetico al 10 friacuteo por 30 minutos para la tincioacuten con plata por el meacutetodo de Nielsen amp Brown (1984) esta teacutecnica de tincioacuten es mucho maacutes sensible ya que permite la deteccioacuten de menos de 1ng de proteiacutena en un gel y se basa en la capacidad que tiene el ion plata para unirse a los restos de aminoaacutecidos presentes en las proteiacutenas y formar complejos plata-proteiacutena que producen bandas coloridas

Los corrimientos se realizaron por triplicado y las imaacutegenes de los geles tentildeidos se cap-turaron con una caacutemara digital con 3664 x 2752 pixeles de resolucioacuten se digitalizaron cotejando con los patrones electroforeacuteticos obtenidos y se documentaron empleando el programa SIGMA-GEL ANALYSIS Software Ver 10 para su anaacutelisis y la determinacioacuten de los pesos moleculares de las proteiacutenas resueltas

Se caracterizaron tambieacuten las guaiacol peroxidasas de los extractos radicales I y II mediante una tincioacuten directa en el gel la cual consistioacute en depositar el gel despueacutes de realizado el corrimiento electroforeacutetico en 100 mL de solucioacuten reguladora de fosfatos 01M pH = 60 adicionando 213 mL de guaiacol 02M y fi nalmente 23 mL de H2O2 003M Se mezcloacute la solucioacuten y se dejoacute el gel en incubacioacuten por 40 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo de la reaccioacuten que se caracterizoacute por la presencia de una coloracioacuten cafeacute producto de la polimeriza-cioacuten del guaiacol en las enzimas de reaccioacuten especiacutefi ca con este sustrato

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RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Evaluacioacuten de la actividad enzimaacutetica de las proteiacutenas solubles o ioacutenicamente unidas a la pared celular de los extractos radicales de C hermaphorditus

Se han desarrollado tecnologiacuteas avanzadas que permiten ahora visualizar de manera directa a los HAP compuestos quiacutemicos que pueden adsorberse a las superfi cies radicales o ser absorbidos por los tejidos radicales Dentro de estos meacutetodos se tienen extraccio-nes secuenciales para separar los compues-tos quiacutemicos adsorbidos en la superfi cie tal como Schwab et al (1998) sugieren que al realizar extracciones con CaCl2 de muestras radicales con HAP se extraen los compues-tos disueltos en la solucioacuten acuosa que se localiza dentro del espacio libre aparente de las raiacuteces y que los compuestos adsorbidos a la superfi cie radical pueden ser recuperados posteriormente con un solvente orgaacutenico (Binet et al 2000)

El primer paso efectivo para la transforma-cioacuten viacutea celular de contaminantes es comuacuten-mente la reaccioacuten catalizada por enzimas ecto y extracelulares que son liberadas por las ceacutelulas en su ambiente cercano (Gianfre-da amp Rao 2004) Las enzimas extracelulares incluyen una amplia gama de oacutexidorreduc-toras e hidrolasas ambas enzimas poseen una funcioacuten degradativa y transforman las sustancias polimeacutericas en productos par-cialmente oxidados yo degradados que pueden ser incorporados faacutecilmente por las ceacutelulas (Korte et al 2000) Eacutestas tambieacuten se localizan en el citoplasma y en organelos de las ceacutelulas de tal forma que existe una distribucioacuten intracelular de enzimas que

Se realizoacute tambieacuten un anaacutelisis compara-tivo de los resultados de la expresioacuten de proteiacutenas como respuesta a la presencia de fenantreno para determinar la similitud entre los experimentos realizados con C hermaphroditus para los resultados de los polipeacuteptidos radicales resueltos Se utilizoacute el programa NTSYS-PC versioacuten 211T (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) de Rohlf (2004) para la aplicacioacuten de los iacutendices de SMC (Simple Matching Coeffi cient) y DICE Una vez obtenidos los valores de similitud entre los tratamientos se construyoacute el fenograma respectivo utilizando el meacutetodo de agrupa-miento UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Averages) para todos los casos analizados Tambieacuten se establecioacute la veracidad y confi anza de los fenogramas obtenidos a traveacutes de la obtencioacuten del coe-fi ciente de correlacioacuten producto-momento de Pearson (Sneath amp Sokal 1973)

Anaacutelisis estadiacutestico de los resultados

A los resultados de cuantifi cacioacuten de bio-masa epigea e hipogea y actividad enzimaacute-tica se les aplicoacute un anaacutelisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey-Kramer de comparacioacuten muacuteltiple empleando el pa-quete estadiacutestico GraphPad Instat V203 (Aceves 1993) y el paquete estadiacutestico de disentildeos experimentales FAUANL versioacuten 14 (Olivares 1989) Todos los experimen-tos se realizaron por triplicado

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incrementa considerablemente la habilidad de detoxifi cacioacuten en plantas

No obstante que en ambos extractos I y II el efecto de la presencia de fenantreno en las plantas expuestas mostroacute un decremen-to en las actividades de todas las enzimas analizadas al incrementarse la concentra-cioacuten del contaminante lo que se corroboroacute con el anaacutelisis factorial entre enzimas y tratamientos donde se obtuvo para cada extracto una diferencia signifi cativa entre las enzimas analizadas (GPX Lacasas APX y APasa) se alcanzoacute un mayor crecimiento de las plantas (biomasa foliar y radical) en los experimento con la mayor concentracioacuten de fenantreno comparadas con el testigo (Fig 1)

La extraccioacuten que se obtuvo de las proteiacutenas totales radicales solubles y las asociadas a la pared o al sitio apoplaacutestico radical fa-vorecida por la fuerza ioacutenica del regulador de extraccioacuten dio lugar a evidenciar que la actividad de las enzimas unidas ioacutenicamente a la pared celular de las ceacutelulas radicales fue mayor que la actividad de las enzimas solu-bles extraiacutedas (Fig 2) Este comportamiento puede relacionarse con la localizacioacuten y abundancia de eacutestas en los sitios apoplaacutes-ticos (sitios intercelulares) y simplaacutesticos (sitios intracelulares) de las raiacuteces la uacutenica diferencia entre ellas se dio en la magnitud de los valores obtenidos

La mayor actividad enzimaacutetica que se asocioacute tambieacuten con la abundancia de estas enzimas en los dos extractos obtenidos la presenta-

Fig 1 Biomasa radical y foliar obtenida de plantas de Cyperus hermaphroditus expuestas a diferentes concentraciones de fenantreno se encontroacute diferencia signifi cativa entre la

cantidad de biomasa foliar y radical obtenida (p lt 005)

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ron las fosfatasas aacutecidas La respuesta de las fosfatasas aacutecidas de C hermaphroditus no presentoacute una diferencia significativa entre la naturaleza soluble o unida a la pared celular de estas enzimas ni entre los diferentes tratamientos con fenantreno (p lt 005) (Fig 2)

En comparacioacuten con el resto esto pudo estar asociado con la naturaleza de la extraccioacuten de las proteiacutenas obtenidas ya que se ha re-portado que las fosfatasas aacutecidas unidas a la pared celular se activan por un incremento en la fuerza ioacutenica de la mezcla de reaccioacuten (Noat et al 1980)

Asiacute mismo se sabe que son susceptibles de su induccioacuten bajo condiciones con metales pesados como el zinc plomo y cadmio tanto para enzimas unidas a membrana como solubles lo que final-mente depende de la condicioacuten y forma estructural de la enzima (Tikhaya et al 1999 Tikhaya amp Fedorovskaya 2000) y que las fosfatasas externas a la mem-brana citoplaacutesmica pueden catalizar la liberacioacuten de ortofosfato de compuestos orgaacutenicos que contienen foacutesforo y con ello incrementan la disponibilidad de fosfato en el ambiente inmediato Esto es importante ya que los fosfatos orgaacutenicos son frecuentemente uno de los componen-tes principales de la solucioacuten del suelo en ambientes con limitacioacuten de foacutesforo (Livingstone amp Whitton 1984 Shand et al 1994 Turner amp Haygarth 2000 Turner et al 2001)

El siguiente grupo que mostroacute una mayor actividad bajo la presencia de fenantreno fue el de las ascorbato peroxidasas en estos resultados se obtuvo una diferencia signifi cativa en la actividad de este tipo de

enzimas tanto solubles como ioacutenicamente unidas a la pared (p lt 005) (Fig 2) en este caso la evidencia de su presencia dada por su actividad fue mayor en los extractos de las proteiacutenas unidas a la pared y su partici-pacioacuten puede estar relacionada con aquellas condiciones que pudieron generarse bajo la accioacuten de radicales libres o simplemente para controlar la concentracioacuten de agentes oxidantes (Song et al 2005) condiciones a las que se sometieron las plantas de C hermaphroditus ante fenantreno generando reacciones secundarias para las plantas ya que se sabe que son enzimas que se activan bajo condiciones de estreacutes en las plantas y son consideradas como antioxidantes (Sairam et al 2004) participan en las respuestas a la desecacioacuten (Menconi et al 1995 Zhang amp Kirkham 1996 Sairam amp Saxena 2000 Sairam amp Srivastava 2001) a altas temperaturas (Upadhyaya et al 1990 Sairam et al 2000) bajas temperaturas y heladas (Anderson et al 1995 Doulis et al 1997 Scebba et al 1999) a alta lumi-nosidad (Danna et al 2003 Kampfenkel et al 1995 Mittler et al 1999) a la infeccioacuten patogeacutenica (Park et al 2004 Yabuta et al 2002 Yoshimura et al 2000) y la salinidad (Hernaacutendez et al 1999 2000) Las guaiacol peroxidasas mostraron di-ferencias significativas en la actividad de las enzimas solubles (extracto I) entre los testigos y los tratamientos con 80 y 120 ppm de fenantreno (p lt 005) lo que no sucedioacute con las enzimas ioacutenica-mente unidas (extracto II) (Fig 2) Para estas enzimas el efecto de la presencia de fenantreno fue mayor en las unidas deacutebilmente a la pared este efecto pronun-ciado se relaciona con el hecho de que se localizan principalmente en las paredes celulares y son importantes en procesos

113


de detoxificacioacuten ya que parecen ser las responsables de la formacioacuten de uniones covalentes entre contaminantes hidroxi-lados metabolitos y los poliacutemeros de las paredes celulares de plantas a traveacutes de la polimerizacioacuten oxidativa no especiacutefica de unidades fenoacutelicas en la pared celular para producir lignina (Harvey et al 2001 Harms et al 2003) Maacutes auacuten las peroxidasas tambieacuten se han detectado en la superficie radical de muchas especies de plantas y se han empleado en la detoxi-ficacioacuten de contaminantes in vivo a nivel de la superficie radical (Adler et al 1994) y estaacuten relacionadas con el metabolismo de varios contaminantes orgaacutenicos (Dec amp Bollag 1994 Klibanov et al 1980 Mackovaacute et al 2001 Schnoor et al 1995 Wevar-Oller et al 2005)

En este caso de C hermaphroditus con fenantreno en comparacioacuten con el trabajo de Flocco et al (2002) con alfalfa y fenol la actividad de las peroxidasas solubles radicales no mostroacute un incremento signifi -cativo y en su caso las peroxidasas unidas ioacutenicamente a la pared celular no se vieron afectadas por la presencia del contaminan-te Aquiacute el incremento en la concentracioacuten de fenantreno (40 a 120 ppm) indujo un efecto negativo sobre su actividad lo que sugiere una respuesta de estreacutes ante el contaminante (Kortc et al 2000 Lyte amp Lite 2001)

Finalmente las laccasas radicales de C her-maphroditus medidas tanto en el extracto I como en el extracto II no presentaron una diferencia signifi cativa en cada caso (p lt 005) (Fig 2) Estas enzimas pueden ser consideradas como un caso aparte ya que la actividad de eacutestas se incrementoacute con la presencia del contaminante en particular

para el caso de las enzimas unidas ioacutenica-mente a la pared celular no obstante que mostraron un decremento en la actividad a medida que aumentoacute la concentracioacuten del contaminante

La naturaleza de estas enzimas como feno-loxidasas sugiere que fueron susceptibles de inducir su actividad al contacto con el contaminante de manera maacutes evidente que las guaiacol peroxidasas esto puede obedecer al hecho de que se sabe que las laccasas catalizan la oxidacioacuten de un am-plio espectro de compuestos aromaacuteticos (Baise et al 2003 Duran et al 2002) y su papel no se limita al metabolismo de compuestos fenoacutelicos dentro de las plan-tas ya que pueden ser liberadas al suelo y ejercer un papel ecoloacutegico al emplearse para transformar contaminantes fenoacutelicos y detoxifi car el microambiente del suelo que rodea a las raiacuteces esta detoxifi cacioacuten ex planta proporciona una ventaja sobre las estrategias de fi torremediacioacuten basadas en la incorporacioacuten de xenobioacuteticos por las plantas y su acumulacioacuten yo metabolismo (Hannik 2001 Song 2003 Wang et al 2004)

Comparando con los estudios de Gramms et al (1999) que evaluaron la exudacioacuten de enzimas por las raiacuteces de 12 especies vegetales donde demostraron que varios miembros de las familias Fabaceae Gra-mineae y Solanceae liberaron de manera eficiente y considerable tanto oxidasas como hidrolasas en las zonas radicales del suelo y que ademaacutes dentro de estas enzi-mas se encontraron de manera particular peroxidasas laccasas monofenol monooxi-genasas lipasas y esterasas para C her-maphroditus la evaluacioacuten de la actividad de las enzimas seleccionadas bien puede

114


Fig 2 Actividad enzimaacutetica de los extractos radicales I y II de guaiacol peroxidasas lac-casas ascorbato peroxidasas y fosfatasas aacutecidas de plantas de Cyperus hermaphroditus expuestas a diferentes concentraciones de fenantreno Solamente se encontroacute diferencia signifi cativa para las peroxidasas del extracto I entre los experimentos testigo con 80 y

120 ppm de fenantreno (p lt 005)

115


tratarse de un estudio que pudiera sugerir la participacioacuten de algunas de estas enzimas en procesos de detoxifi cacioacuten o auacuten maacutes de transformacioacuten del HAP probado Ya que esto se puede relacionar con los estudios reportados por Pfl ugmacher et al (1999) con los cormos de Phragmites australis donde se investigaron las actividades de algunas enzimas que participan en procesos de detoxifi cacioacuten relacionados con las fases I y II como son las guaiacol peroxidasas las glutation peroxidasas y las glutation transferasas entre otras Presentaacutendose la mayor actividad medida en las enzimas radicales de P australis comparada con la actividad enzimaacutetica en hojas y tallo La razoacuten de este comportamiento se pudo dar porque las raiacuteces se encuentran en contacto directo con los contaminantes en el suelo o en agua (Folsom amp Price 1991) pudiendo entonces asociarse por mucho maacutes tiempo con ellos lo que permite su transformacioacuten yo detoxifi cacioacuten por las plantas

Tambieacuten cabe mencionar que en los experi-mentos in vitro de Chroma et al (2002) con algunos cultivos de plantas de varias espe-cies y morfologiacuteas eacutestas fueron capaces de transformar hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos y que esta transformacioacuten fue atribuible a la produccioacuten de una peroxida-sa constitutiva asociada a la pared celular Se ha mencionado tambieacuten que peroxidasas extracelulares de plantas pueden mostrar diferentes funciones dependiendo de las condiciones de pH y de la naturaleza de los donadores de electrones esto fue demos-trado por Harvey et al (2002) en cultivos de Ipomea batada que produce una amplia gama de peroxidasas que se expresan a diferentes condiciones de pH a pH de 7 pueden oxidar compuestos en su forma de quinona mientras que a un pH de 3 en

presencia de sustratos secundarios como el NADH que sirve como un mediador redox se da la oxidacioacuten por peroxidasas dependientes de NADH Kraus et al (1999) han determinado tambieacuten que el contacto de las raiacuteces con los contaminantes como los HAP induce la actividad de peroxida-sas las cuales pueden tener una funcioacuten intracelular como parte de un mecanismo de defensa yo un efecto directo sobre la degradacioacuten de compuestos aromaacuteticos en el medio externo

Caracterizacioacuten de proteiacutenas inducibles polipeacuteptidos resueltos de los experimentos de Cyperus hermaphroditus

Los anaacutelisis electroforeacuteticos consideraron las proteiacutenas totales radicales extraiacutedas tanto solubles como las unidas ioacutenicamente a la pared de las plantas de C hermaphroditus expuestas a fenantreno de las que se muestran los patrones electroforeacuteticos (tablas 1 y 2) y electroferogramas representativos (Figs 3 y 4)

La presencia de fenantreno no ejercioacute tampoco un efecto notorio sobre la expresioacuten de las proteiacutenas en cuanto al nuacutemero de proteiacutenas totales solubles radicales resueltas en la electroforesis que no fue mayor al patroacuten obtenido de las proteiacutenas radicales de plantas no expuestas a fenantreno y solamente un 17 de ellos fueron inducidos de manera uacutenica con el fenantreno

En cuanto a las proteiacutenas totales radicales unidas ioacutenicamente a la pared el nuacutemero de polipeacuteptidos totales resueltos comparados con las proteiacutenas solubles fue menor ademaacutes de que soacutelo el 18 de sus proteiacutenas expresadas fueron inducidas bajo la presencia del contaminante

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Sobrenadante I

Nuacutem banda

Polipeacuteptidos resueltos

(kDa) Tes

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40 p

pm

80 p

pm

120

ppm

1 170 + + + + 2 129 + 3 105 + + 5 70 + + 6 65 + + 7 64 + + + + 8 62 + + + + 9 60 + +

10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +

Polipeacuteptidos totales

17 13 14 12

Tabla 1 Polipeacuteptidos resueltos (kDa) de los extractos I (proteiacutenas solubles) representativos de los experimentos de las plantas de Cyperus hermaphroditus expuestas a fenantreno

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Sobrenadante II

Nuacutem banda


(kDa) Tes

tigo

40 p

pm

80 p

pm

120

ppm

1 180 + + + + 2 88 + + + 3 65 + + + 4 63 + + 5 59 + + + + 6 55 + + + + 7 48 + + + 8 44 + + + + 9 24 + + +

10 18 + + + + 11 lt 15 + + + +


9 11 11 7

Tabla 2 Polipeacuteptidos resueltos (kDa) de los extractos II (proteiacutenas unidas ioacutenicamente a la pared) representativos de los experimentos de las plantas de Cyperus hermaphroditus

expuestas a fenantreno

Fig 3 Electroforesis PAGE-SDS muestras de los extractos radicales I concentrados con fenol-eacuteter Carriles 1 y 2 testigo (sin fenantreno) 3 y 4 40 ppm 5 y 6 80 ppm 7 y 8 120 ppm 9 peroxidasas de raacutebano picante y 10 Marcadores de peso molecular albuacutemina

bovina y hemoglobina (tincioacuten con plata)

118


Fig 4 Electroforesis PAGE-SDS muestras de los extractos radicales II concentrados con fenol-eacuteter Carriles 1 y 2 testigo (sin fenantreno) 3 y 4 40 ppm 5 y 6 80 ppm 7 y 8 120 ppm 9 peroxidasas de raacutebano picante y 10 marcadores de peso molecular albuacutemina


La comparacioacuten de los patrones electro-foreacuteticos obtenidos entre experimentos mostroacute que se comparten entre ellos algunas proteiacutenas los polipeacuteptidos resueltos comunes entre las proteiacutenas solubles y las unidas ioacutenicamente a la pared fueron cuatro de 65 44 18 kDa y dos polipeacuteptidos de lt 15 kDa de eacutestos sobresalioacute por su distribucioacuten comuacuten el de 18 kDa ya que se presentoacute en todos los experimentos realizados y puede ser considerado como constitutivo de la especie

Los polipeacuteptidos especiacutefi cos que corres-ponden a los polipeacuteptidos de las proteiacutenas solubles extraiacutedas exclusivos en los experimentos de testigo y fenantreno 40 80 y 120 ppm fueron los de 170 64 62 53 47 y 42 kDa Los polipeacuteptidos de las proteiacutenas ioacutenicamente unidas a la pared de

los experimentos de testigo y fenantreno 40 80 y 120 ppm fueron los de 180 59 y 55 kDa aunque quizaacute tambieacuten puedan considerarse los de 88 y 48 kDa

Para cada experimento eacutestos pudieran tratarse de proteiacutenas constitutivas y de manera particular los de 129 y 58 kDa para las proteiacutenas solubles y el de 63 kDa de las proteiacutenas totales ioacutenicamente unidas a la pared celular ser considerados como polipeacuteptidos inducidos bajo la presencia del contaminante La frecuencia del resto de los polipeacuteptidos se mantuvo repartida entre todos los patrones electroforeacuteticos obtenidos sin mostrar una tendencia par-ticular quizaacute con una importancia relativa dependiendo de las condiciones y con ello de su grado de expresioacuten por la planta bajo las condiciones del contaminante

119


Cabe mencionar tambieacuten que en general los polipeacuteptidos resueltos correspondieron a proteiacutenas con un alto contenido de lisina y aacutecido aspaacutertico entre los aminoaacutecidos que las conforman por la evidencia colorida del gel con la tincioacuten con plata (Nielsen amp Brown 1984)

La comparacioacuten entre los polipeacuteptidos resueltos de las peroxidasas de raacutebano picante empleadas como marcador de peso molecular en la tincioacuten con plata mostroacute que algunos de eacutestos fueron los mismos que se presentaron en los extractos radicales tanto de las proteiacutenas solubles (170 58 y 22 kDa) como las proteiacutenas extraiacutedas unidas ioacutenicamente a la pared (59 55 y 24 kDa) los de las peroxidasas de raacutebano picante de 38 y 11 kDa resultaron un caso uacutenico ya

que no se presentaron en ninguno de los resultados radicales

En cuanto a la caracterizacioacuten de las guaiacol peroxidasas por la tincioacuten especiacutefi ca de eacutestas en el gel se obtuvo como resultado la presencia de un polipeacuteptido comuacuten en todos los experimentos de ambos extractos radicales que correspondioacute tambieacuten a un polipeacuteptido caracteriacutestico de las peroxidasas de raacutebano picante cuyo peso molecular fue de 65 kDa (Fig 5) Cabe mencionar que no se mostroacute ninguacuten patroacuten isoenzimaacutetico para este tipo de peroxidasas en las muestras de los extractos de proteiacutenas totales radicales analizados aunque se reporta que el nivel de los patrones isoenzimaacuteticos de peroxidasas pueden alterarse por condiciones de estreacutes ambiental (Flocco et al 2002) estas

Fig 5 Electroforesis PAGE-SDS deteccioacuten de las guaiacol peroxidasas presentes en las muestras de los extractos I 1 testigo (sin fenantreno) 2 40 ppm 3 80 ppm 4 120 ppm las muestras de los extractos II 5 testigo (sin fenantreno) 6 40 ppm 7 80 ppm 8 120

ppm 9 y 10 peroxidasas de raacutebano picante

120


enzimas pueden considerarse constitutivas e inducibles las cuales se expresan como proteiacutenas solubles tanto extracelulares como unidas a membrana en algunos tejidos vegetales donde se presenta la oxidacioacuten de sustratos aromaacuteticos y se emplea peroacutexido de hidroacutegeno como un cosustrato (Gonzaacutelez et al 2006 Pearse et al 2005) La peroxidasa de raacutebano picante (HRP horseradish peroxidase) es una peroxidasa que puede ser excretada tambieacuten por raiacuteces transformadas de plantas de raacutebano picante y pueden catalizar la oxidacioacuten de compuestos tales como fenoles bifenoles anilinas y benzidinas sobre una amplia gama de pH y temperaturas (Duran amp Esposito 2000) y pueden ser consideradas por ello dentro del gran nuacutemero de enzimas extracelulares con potencial para la biorremediacioacuten (Ruggaber et al 2006)

Comparacioacuten de los resultados bio-quiacutemicos y moleculares de la respuesta de Cyperus hermaphroditus a fenantreno empleando anaacutelisis numeacuterico

Se obtuvo informacioacuten relevante del anaacutelisis de la comparacioacuten entre los tratamientos sin fenantreno y con 40 80 y 120 ppm del contaminante donde se compararon el nuacutemero de polipeacuteptidos totales resueltos de las proteiacutenas totales radicales extraiacutedas solubles y las ioacutenicamente unidas a la pared celular

Se presenta el fenograma de la comparacioacuten de los polipeacuteptidos totales resueltos de las proteiacutenas totales radicales extraiacutedas (extractos I y II) de los diferentes tratamientos con y sin fenantreno (Fig 6) derivado de la aplicacioacuten del coeficiente de Dice con un valor de correlacioacuten de 098 que

numeacutericamente resultoacute confi able (Kohl-mann 1994 Rodriacuteguez 1998 Rodriacuteguez amp Castantildeeda 1998) en el establecimiento de los grupos asociados cuya cercaniacutea se relacionoacute con la respuesta de induccioacuten de proteiacutenas bajo la presencia de fenantreno como se describe a continuacioacuten

El anaacutelisis numeacuterico realizado con los polipeacuteptidos presentes en todos los expe-rimentos relacionados con la expresioacuten de las proteiacutenas inducidas por la presencia de fenantreno mostroacute la asociacioacuten entre dos grupos principales los patrones de las proteiacutenas totales radicales solubles (extracto I) y las ioacutenicamente unidas a la pared (extracto II) de manera independiente Dentro de cada uno de ellos la similitud entre los tratamientos de 40 y 80 ppm con fenantreno y testigo por separado e independientes a eacutestos el tratamiento con 120 ppm de las proteiacutenas de ambos extractos

La mayor identidad o similitud se obtuvo entre los experimentos con 40 y 80 ppm de fenantreno en cuanto al nuacutemero y tipo de polipeacuteptidos comunes inducidos por la presencia del contaminante Las agrupaciones derivadas del anaacutelisis numeacuterico permitieron analizar con detalle que la expresioacuten de las proteiacutenas analizadas por electroforesis mostraron que la respuesta fue similar entre el testigo y las concentraciones de 40 y 80 ppm de fenantreno lo que sugiere que al aumentar la concentracioacuten de fenantreno en el ensayo a 120 ppm la respuesta particular en cuanto a la naturaleza de las proteiacutenas inducidas es de considerar una respuesta de estreacutes ante el contaminante

121


Fig

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0 pp

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122


transformacioacuten parcial de los compuestos en productos menos toacutexicos que puedan ser faacutecilmente absorbidos por las raiacuteces y ser confi nados en el interior de la planta

AGRADECIMIENTOS

El segundo autor agradece a la Direccioacuten de Posgrado e Investigacioacuten del IPN el apoyo financiero otorgado al Proyecto SEPI 2006749 para la realizacioacuten de este trabajo

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CONCLUSIONES

Del anaacutelisis sobre el efecto de fenantreno en la actividad de guaiacol peroxidasas ascorbato peroxidasas laccasas y fosfatasas aacutecidas radicales de Cyperus hermaphroditus se mostraron diferencias signifi cativas entre las enzimas solubles extraiacutedas analizadas y la concentracioacuten del contaminante lo que para el caso de las unidas ioacutenicamente a la pared celular solamente se obtuvieron diferencias signifi cativas entre las enzimas analizadas La variacioacuten en la actividad de las enzimas radicales de ambos extractos mostroacute que la presencia de fenantreno alteroacute la naturaleza de la respuesta lo que puede asociarse a una adaptacioacuten bioquiacutemica de esta especie ante el contaminante

Los resultados demostraron que los niveles de la actividad de las enzimas constitutivas y de la expresioacuten de proteiacutenas en su induccioacuten o represioacuten bajo la presencia de fenantreno en las plantas de Cyperus hermaphroditus pueden ser componentes importantes de las reacciones de plantas a la toxicidad de los contaminantes ya que estas enzimas pueden considerarse como biomarcadores no especiacutefi cos de contaminacioacuten ambiental a traveacutes de los cambios en su actividad como respuesta a condiciones de estreacutes al ser uacutetiles para proporcionar una deteccioacuten temprana de las alteraciones primarias en plantas y la presencia de nuevas proteiacutenas puede ser considerada como respuesta a una amplia gama de anaacutelisis de estreacutes ambiental lo que pudiera derivar en la implicacioacuten de enzimas transformadoras de contaminantes orgaacutenicos liberadas por las raiacuteces de las plantas al ambiente cercano del suelo Estas enzimas al estar asociadas comuacutenmente a la pared celular pueden realizar una

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menos toacutexicos que puedan ser faacutecilmente absorbidos por las raiacuteces y ademaacutes ser con-fi nados en el interior de la planta

Palabras clave Cyperus fenantreno proteiacutenas

ABSTRACT

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are part of the petroleum contaminants encountered in the environment It has been shown that soils supporting vegetation are effective in removing and mineralizing these contaminants because plant roots have phytoremediation-related proteins like enzymatic systems linked to the plant cell wall that contribute to the remediation of contaminated sites Through their direct action or by union they sequester transform and transport organic contaminants

The aim of this work was to analyze chan-ges in the expression of the soluble and the ionically-bound cell wall root proteins and the activity of certain enzymes considered as biochemical markers in plants of Cyperus hermaphroditus exposed to phenanthrene a tricyclic aromatic hydrocarbon The effect of phenanthrene on the activity of the root enzymes guaiacol peroxidases ascorbate peroxidases laccases and acid phosphatases showed signifi cant differences between the enzymes of the soluble protein fraction and the contaminant concentration However the enzymes of the ionically-bound cell wall fraction showed signifi cant differences only among themselves not with respect to the concentration of contaminant The results showed that the amount of activity of constitutive enzymes and the induction or repression of protein expression in plants of C hermaphroditus exposed to phenanthrene

can be important mechanisms of plant reac-tions to contaminant toxicity or in partially transforming them to less toxic products that can be easily absorbed by the roots and sequestered in the plants

Key words Cyperus phenanthrene proteins

INTRODUCCIOacuteN

Los contaminantes orgaacutenicos pueden ser absorbidos por las raiacuteces a traveacutes de pro-cesos pasivos yo activos y despueacutes trans-locarse hacia la parte aeacuterea de las plantas por la corriente de transpiracioacuten (Chiou et al 2001 Li et al 2005) El transporte pasivo se efectuacutea a traveacutes de una serie de procesos de particioacuten entre el sistema planta-agua y el sistema planta-materia orgaacutenica y dentro de los diversos com-ponentes de las plantas de acuerdo con las concentraciones de los contaminantes no ioacutenicos en plantas con relacioacuten a la concentracioacuten de eacutestos en el agua o en la solucioacuten del suelo (Su amp Zhu 2007 Vanier et al 2001)

Los hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAP) se encuentran dentro de los conta-minantes derivados del petroacuteleo ubicuos persistentes que son generados por la combustioacuten incompleta de la piroacutelisis de materiales orgaacutenicos (Jiao et al 2007 Sheng amp Gong 2006) dada su naturaleza carcinogeacutenica los hace ser contaminantes blanco (ATSRD 1999)

Ya que las raiacuteces de las plantas generan enzimas aminoaacutecidos y hormonas del cre-cimiento que ayudan a mantener la actividad enzimaacutetica los suelos con cubierta vegetal son considerados altamente efectivos para

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Sobrenadante I

Nuacutem banda


(kDa) Tes

tigo

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pm

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ppm

1 170 + + + + 2 129 + 3 105 + + 5 70 + + 6 65 + + 7 64 + + + + 8 62 + + + + 9 60 + +

10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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Sobrenadante II

Nuacutem banda


(kDa) Tes

tigo

40 p

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ppm

1 180 + + + + 2 88 + + + 3 65 + + + 4 63 + + 5 59 + + + + 6 55 + + + + 7 48 + + + 8 44 + + + + 9 24 + + +

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Fig

6 F

enog

ram

a de C

yper

us h

erm

aphr

oditu

s an

aacutelis

is co

mpa

rativ

o de

los r

esul

tado

s de

los p

olip

eacuteptid

os re

suel

tos d

e las

pro

teiacuten

as

tota

les r

adic

ales

sol

uble

s (ex

t I) y

uni

das i

oacutenic

amen

te a

la p

ared

cel

ular

(ext

II)

de lo

s exp

erim

ento

s sin

y c

on fe

nant

reno

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y 12

0 pp

m

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AGRADECIMIENTOS


LITERATURA CITADA





CONCLUSIONES



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10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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Sobrenadante II

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(kDa) Tes

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Sobrenadante I

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10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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Sobrenadante II

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10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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10 58 + + + 11 53 + + + + 12 47 + + + + 13 44 + + + 14 42 + + + + 15 35 + 16 30 + 17 27 + + 18 22 + + 19 18 + + + + 20 15 + + + 21 lt 15 + + + +


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