efecto de la adición de fertilizantes inorgánicos
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Ingeniería Ambiental y Sanitaria Facultad de Ingeniería
1-1-2004
Efecto de la adición de fertilizantes inorgánicos compuestos en la Efecto de la adición de fertilizantes inorgánicos compuestos en la
degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con
petróleo - a nivel laboratorio petróleo - a nivel laboratorio
Maria Carolina Perdomo Rojas Universidad de La Salle, Bogotá
Jenny Liliana Pardo Castro Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Perdomo Rojas, M. C., & Pardo Castro, J. L. (2004). Efecto de la adición de fertilizantes inorgánicos compuestos en la degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con petróleo - a nivel laboratorio. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_ambiental_sanitaria/1560
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EFECTO DE LA ADICIÓN DE FERTILIZANTES INORGÁNICOS COMPUESTOS EN LA DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS EN SUELOS CONTAMINADOS CON
PETROLEO - A NIVEL LABORATORIO-
MARIA CAROLINA PERDOMO ROJAS
JENNY LILIANA PARDO CASTRO
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
Bogotá 2004
EFECTO DE LA ADICIÓN DE FERTILIZANTES INORGÁNICOS COMPUESTOS EN LA DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS EN SUELOS CONTAMINADOS CON
PETROLEO - A NIVEL LABORATORIO-
MARIA CAROLINA PERDOMO ROJAS JENNY LILIANA PARDO CASTRO
TRABAJO DE GRADO
DIRECTOR JOAQUIN L. BENAVIDES LOPEZ DE MESA ASESOR FABIO ROLDAN
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
Bogotá 2004
Nota de aceptación
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Firma del presidente del jurado
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Firma del jurado
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Firma del jurado
Bogotá, julio de 2004.
Dedicamos este trabajo a nuestros Abuelos, Padres y hermanos; ya que su
apoyo hizo posible que culmináramos esta etapa satisfactoriamente.
Agradecemos principalmente al personal del Departamento de Ciencias Básicas de la
Universidad De La Salle; especialmente a Joaquin Benavides Lopez de Mesa por ser
pionero en este tipo de trabajos y brindarnos la oportunidad de hacer parte de su
grupo de investigación; por su apoyo incondicional, confianza y esfuerzo. A Ricardo
Montealegre, Hoover Barón, German Gutierrez, Jesús Escovar y Marisol Pardo por
hacer de nuestro trabajo diario una actividad más grata y sencilla, facilitando nuestro
desempeño como investigadoras.
Quisiéramos extender este agradecimiento a nuestros padres, amigos y compañeros
por hacer parte de las largas jornadas de trabajo, por su paciencia, apoyo y
comprensión; especialmente a Yesly Ramirez, Laura Caycedo, Guiomar Ortiz, Diego
Chavez, Maria Fernanda Londoño y Andrea Casas.
Finalmente agradecemos a Cristina Bustos, Clara López de Mesa, Roberto Galindo,
Juan Manuel Arévalo, Roberto Balda, Luis Augusto Cuellar y Abraham Hadra, quienes
compartieron todos sus conocimientos para hacer de esta investigación un trabajo más
profundo y profesional.
GLOSARIO
ÁCIDO NUCLEICO: polímero de nucleótidos. Véase Ácido Ribonucleico.
ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA): polímero de nucleótidos unidos por un esqueleto de
Fosfato-Ribosa. Interviene en la síntesis de proteínas.
ANABOLISMO: procesos bioquímicos en la síntesis de los constituyentes de la célula a
partir de moléculas mas simples, generalmente con requerimiento de energía.
ANIÓN: Elemento electronegativo de una molécula que en la electrólisis se dirige al
ánodo.
BIOLABRANZA (LANDFARMING): es una tecnología para la remediación de suelos, la
cual reduce concentraciones de componentes de petróleo por medio de la
biodegradación.
BIORREMEDIACIÓN: empleo de microorganismos para suprimir o detoxificar productos
químicos tóxicos o indeseables en un hábitat
BIOTECNOLOGÍA: empleo de organismos vivos para llevar a cabo procesos químicos
definidos para la aplicación industrial.
CARCINOGÉNICO: cualquier agente químico, biológico, o físico que puede en potencia
inducir cáncer.
CATABOLISMO: procesos bioquímicos que intervienen en la degradación de los
compuestos orgánicos e inorgánicos; normalmente conducen a la producción de energía.
CATÁLISIS: aumento en la velocidad de una reacción química.
CATALIZADOR: sustancia que facilita una reacción química, pero que mantiene su
propia composición al final de la reacción.
CATION: ión que en una disolución se mueve hacia el cátodo debido a que posee carga
eléctrica positiva.
CITOCROMOS: anillos porfirínicos con hierro que forman complejos con proteínas, y que
actúan como portadores de electrones en el sistema de transporte de electrones.
COENZIMA: molécula de bajo peso molecular que participa en una reacción enzimática
aceptando y dando electrones o grupos funcionales.
COLMATAR: rellenar y fertilizar artificialmente los terrenos bajos o estériles con limos
depositados de ríos o mares.
COMETABOLISMO: Se da en casos de sustratos complejos donde los microorganismos
consumen un compuesto y producen enzimas para transformar otro compuesto, sobre el
que no pueden crecer en uno asimilable por su metabolismo.
CRUDO: líquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por diferentes sustancias
orgánicas. También recibe los nombres de petróleo, petróleo crudo o crudo petrolífero.
DEPURACIÓN: proceso por el cual el organismo elimina sustancias nocivas o inútiles.
DESINFECTANTE: sustancia química capaz de destruir los gérmenes depositados sobre
un material inerte o vivo, alterando lo menos posible el sustrato donde residen y
abarcando en aquella destrucción todas las formas vegetativas de las bacterias, hongos y
virus.
ENZIMA: catalizador, generalmente compuesto de proteína, que induce reacciones o
grupos de reacciones específicas.
ESTÉRIL: ausencia de todo organismo vivo y virus
FOSFOLÍPIDOS: lípido que contiene un grupo fosfato y dos cadenas de ácidos grasos
unidos a un esqueleto de glicerol.
HETERÓTROFOS: organismo que requiere compuestos orgánicos como fuente de
carbono.
HIDROCARBURO (HC): los hidrocarburos son compuestos que contienen Carbono e
Hidrógeno y resultan de los procesos metabólicos de los organismos vivos existentes.
INMUNOTOXINA: agente tóxico unido a un anticuerpo que tiene la capacidad de destruir
células cancerosas sin afectar a las sanas.
HIDROCARBUROS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (PAH): es un grupo de
hidrocarburos que consisten en moléculas que contienen dos o más anillos aromáticos de
6 carbonos fusionados.
QUIMIOORGANOTROFO: organismo que obtiene su energía de la oxidación de
compuestos orgánicos
LÍPIDO: moléculas orgánicas no solubles en agua importantes en la estructura de la
membrana citoplasmática y (en algunos organismos) de la pared celular.
MACRONUTRIENTES: nutrientes requeridos en grandes cantidades.
MICRONUTRIENTES: nutrientes requeridos en pequeñas cantidades.
MICROORGANISMOS: organismo microscópico consistente en una célula o grupo de
células.
NUTRIENTE: substancia que la célula toma de su ambiente y que utiliza en reacciones
catabólicas o anabólicas.
METABOLISMO: conjunto de reacciones bioquímicas, tanto catabólicas como anabólicas,
que tienen lugar en una célula.
METABOLITO PRIMARIO: producto excretado por un microorganismo durante la fase de
crecimiento, o exponencial (por ejemplo ácido láctico en una fermentación láctica).
METABOLITO SECUNDARIO: producto excretado por un microorganismo al final de la
fase exponencial o durante la fase estacionaria (por ejemplo un antibiótico en un
organismo productor).
POLIPÉPTIDO: grupo de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
PROTEÍNA: molécula polimérica que consta de uno o más polipéptidos.
XENOBIÓTICO: compuesto químico completamente sintético que no se da en la tierra de
forma natural.
RESUMEN
Uno de los problemas ambientales más importantes de la actualidad es la contaminación de
ecosistemas terrestres por derrames de hidrocarburos de petróleo y sus derivados que
ocurren en las actividades de explotación y transporte del petróleo, y en Colombia, además de
lo nombrado anteriormente, por las incursiones violentas contra la infraestructura petrolera por
parte de los grupos al margen de la ley.
Para dar solución a esta problemática, existen métodos de tratamiento para la recuperación de
los suelos contaminados, como la técnica de biolabranza (landfarming) con adición de
nutrientes inorgánicos, la cual fue evaluada dentro de la presente investigación, por medio de
un ensayo in vitro, compuesto por 6 unidades experimentales (UE) que contenían suelo
contaminado con petróleo crudo (23280 ppm de TPH’s), tres de las UE fueron tratadas con
fertilizante inorgánico Triple 15 y las otras tres fueron tomadas como un control biótico. La
efectividad de la técnica de biolabranza se determinó por medio de los análisis de pH,
porcentaje de humedad, temperatura, conteos de heterótrofos totales y número más probable
para microorganismos, nutrientes e hidrocarburos totales de petróleo durante un periodo de
experimentación de cuatro meses.
Al final del tiempo de experimentación se lograron porcentajes de remoción de TPH’s altos
(hasta de un 91%) para el tratamiento de biolabranza con adición de nutrientes, alcanzando
concentraciones finales de TPH’s de 2028 ppm; en comparación con el control biótico en el
cual se obtuvieron porcentajes de remoción hasta del 65% y concentraciones finales de 8049
ppm de TPH’s; con lo cual se logro demostrar que la adición de nutrientes agiliza el proceso
de degradación de hidrocarburos en suelos.
CONTENIDO
Pág
INTRODUCCIÓN 1 1 OBJETIVOS 3 2 MARCO TEÓRICO 5 2.1 SUELOS 5 2.1.1 Composición 6 2.1.1.1 Compuestos inorgánicos y nutrientes 6 2.1.1.2 Materia orgánica 7 2.1.1.3 Agua del suelo 11 2.1.1.4 Gases del suelo 12 2.1.2 Propiedades físicas y químicas 12 2.1.2.1 Propiedades físicas. 12 2.1.2.2 Propiedades químicas 13 2.1.3 Influencia del suelo en la actividad microbiana 15 2.1.4 Muestreo de microorganismos en suelo 17 2.2 MICROORGANISMOS. 18
2.2.1 Nutrición y metabolismo. 18 2.2.1.1 Nutrición microbiana. 19 2.2.2 Biodegradación 22 2.3 PETRÓLEO 23 2.3.1 Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH) 24 2.3.1.1 Hidrocarburos alifáticos 25 2.3.1.2 Hidrocarburos Alicíclicos. 25 2.3.1.3 Hidrocarburos Aromáticos. 26 2.3.1.3.1 Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos. 26 2.3.2 Contaminación por hidrocarburos. 28 2.3.2.1 Consecuencias ambientales de la contaminación de suelos por hidrocarburos 29 . 2.3.2.2 Determinación de hidrocarburos en suelo. 30 2.4 REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEO 34 2.4.1 Atenuación natural. 35 2.4.1.1 Adsorción. 35 2.4.1.2 Dispersión y Dilución 36 2.4.1.3 Volatilización. 36
2.4.1.4 Estabilización química 37 2.4.2 Biodegradación 37 2.4.2.1 Microorganismos Degradadores de Petróleo 28 2.4.2.2 Biodegradación de hidrocarburos 41 2.4.2.3 Efecto del suelo en la biodegradación de hidrocarburos 47 2.4.3 Biorremediación 48 2.4.3.1 pH 52 2.4.3.2 Temperatura 53 2.4.3.3 Oxigeno 54 2.4.3.4 Capacidad de retención de agua y humedad 54 2.4.3.5 Nutrientes 55 3 MARCO DE REFERENCIA 57 4 MATERIALES Y MÉTODOS 62 4.1 ANÁLISIS PRELIMINARES DEL SUELO 63 4.2 RECOLECCIÓN DEL SUELO 65 4.3 ADECUACIÓN Y PREPARACIÓN DEL SUELO 65 4.4 DETERMINACIÓN DE LÍNEA BASE 66
4.4.1 pH. 66 4.4.2 Conteo de heterótrofos totales 67 4.5 CONTAMINACION DEL SUELO 68 4.6 MONTAJE DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES 70 4.6.1 Determinación de Humedad. 74 4.6.2 Determinación de Temperatura 75 4.7 MUESTREO DE SUELO 75 4.8 MONITOREO DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL SUELO DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES 78
4.8.1 Características físicas. 78
4.8.2 Características químicas. 78
4.8.2.1 Nutrientes. 79
4.8.2.2 TPH. 79
4.8.2.3 PAHs. 82
4.8.3 Características microbiológicas. 84
4.8.3.1 Análisis de Numero Mas Probable (NMP). 85
4.8.3.2 Aislamiento de los degradadores de hidrocarburos. 86
4.9 ANALISIS ESTADISTICOS 88
5 RESULTADOS 90 5.1 PROPIEDADES FÍSICAS 90 5.1.1 Humedad 90 5.1.2 Temperatura 90 5.2 PROPIEDADES QUÍMICAS 91 5.2.1 pH 91 5.2.2 Hidrocarburos totales de petróleo TPHs 93 5.2.2.1 Balance de masas 95 5.2.3 Hidrocarburos policíclicos aromáticos PAHs 96 5.2.4 Nutrientes 98 5.2.4.1 Fósforo asimilable 98 5.2.4.2 Amonio N-NH4 99 5.2.4.3 Nitratos N-NO2 101 5.2.4.4 Correlación de nutrientes 102 5.2.4.4.1 Triple 15 102 5.2.4.4.2. Control Biótico 103 5.3 COMPORTAMIENTO MICROBIOLÓGICO 104
5.3.1 conteo de heterótrofos totales 104 5.3.2 Numero mas probable 105 5.3.3 aislamiento de microorganismos 106 6 ANALISIS DE FACTIBILIDAD 108 6.1 TRATAMIENTOS A NIVEL “IN SITU” Y “EX-SITU” 108 6.2 TRATAMIENTOS PARA LA BIORRECUPERACIÓN DE SUELOS 110 7 DISCUSIÓN 113 8 CONCLUSIONES 122 9 RECOMENDACIONES 124 BIBLIOGRAFÍA ANEXOS
LISTA DE TABLAS
pág Tabla 1. Ejemplo de adición de nutrientes de varias aplicaciones de campo. 7 Tabla 2. Relación entre el contenido medio de materia orgánica de los suelos de varias regiones de Colombia, la altitud y la temperatura 9
Tabla 3. Composición elemental típica de las células bacterianas con base en su peso seco 21 Tabla 4. Ventajas y desventajas de la Biolabranza 56
Tabla 5. Muestreo para análisis de laboratorio 77
Tabla 6. Datos promedio de %H obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 91 Tabla 7. Datos promedio de temperatura (ºC), obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 92 Tabla 8. Datos promedios de pH (ºC) obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 93 Tabla 9. Datos promedio de TPHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 95 Tabla 10. Tabla 10. Datos promedio de % de remoción de TPHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 95 Tabla 11. Datos promedio de concentración de PAHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 97 Tabla 12. Datos promedio de concentración de PAHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de Control biótico 97 Tabla 13. Datos promedio de nutrientes obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 103 Tabla 14. Datos de conteo de heterótrofos totales obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 104 Tabla 15. Datos de Log de NMP obtenido a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico 105
Tabla 16. Resultados de aislamiento de microorganismos. 106 Tabla 17. Resultados de identificación taxonómica BBL cristal 107 Tabla 18. Variables Para Transferencia Tecnológica 115
LISTA DE FIGURAS pág Figura 1. Asimilación de nutrientes de acuerdo con el pH del suelo 16 Figura 2. Clasificación de los hidrocarburos. 25 Figura 3. Ejemplos de conformación estructural de hidrocarburos aromáticos policíclicos 29 Figura 4. Configuración sistema HPLC. 33 Figura 5. Proceso de biodegradación de alcanos 44 Figura 6. Degradación de PAH 45 Figura 7. Degradación de PAH 46 Figura 8. pH-meter 67 Figura 9. Centrifuga 67 Figura 10. Estantes metálicos. 70 Figura 11. Volteo del suelo 70 Figura 12. Riego del suelo 73 Figura 13. % de humedad 73 Figura 14. Medición de temperatura. 75 Figura 15. Muestreo de suelo. 76 Figura 16. Rotavapor 80
Figura 17. Baño maría en cabina de extracción 80 Figura 18. Hight Performance Liquid Cromatograpy (HPLC) 82 Figura 19. Cromatograma estándar EPA 16 PAH´s principales 84 Figura 20. Placa de 96 pozos 82
Figura 21. Estriado de cuatro zonas. 88 Figura 22. Agar sangre. 88 Figura 23. BBl-cristal. Kit para identificación de gram positivos 88 Figura 24. Correlación del % de humedad Vs tiempo de observación en las UE Triple 15 y control biótico. 91
Figura 25. Correlación entre temperatura vs tiempo de observación en UE de Triple 15 y control biótico 92
Figura 26. Correlación de pH Vs tiempo de observación en UE de Triple 15 y control biótico 93 Figura 27. Correlación de concentración de TPH Vs tiempo de experimentación en UE de triple 15 y control biótico. 94 Figura 28. Valores medios de TPHs durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico 94 Figura 29. % de remoción de TPHs Vs tiempo de observación en las UE de triple 15 y control biótico 96 Figura 30. Concentración de PAHs vs tiempo de experimentación para las UE Triple 15 96 Figura 31 Concentración de PAHs vs tiempo de experimentación para las UE de Control Biótico 97 Figura 32. Correlación de fósforo Vs tiempo de experimentación en UE de triple 15 y control biótico. 98 Figura 33. Valores medios de fósforo durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico. 99 Figura 34. Correlación N-NH4 Vs tiempo de observación entre triple 15 y control biótico 100 Figura 35. Valores medios de amonio durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico. 100 Figura 36. Correlación del N-NO3 vs tiempo de observación en las UE de triple 15 y control biótico 101
Figura 37. Valores medios de nitrato durante el tiempo de observación en triple T15 y control biótico 101 Figura 38. Correlación de nutrientes según tiempo de observación en triple 15 102 Figura 39. Correlación de nutrientes según tiempo de observación en control Biótico 103 Figura 40. Correlación del comportamiento de heterótrofos totales vs tiempo de observación en UE de triple 15 y control biótico 104 Figura 41. Correlación entre numero mas probable vs tiempo de observación en UE de triple 15 y control biótico 105 Figura 42. Tinción de gram. CB 1 A 1 107 Figura 43. .Tinción de gram. T15 1 A 107
LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Cuadro marco de referencia Anexo 2. Cálculos para determinar la cantidad de petróleo a adicionar al suelo Anexo 3. Características crudo castilla Anexo 4. Cálculo para la adición de fertilizante inorgánico
Anexo 5. Determinación de % de recuperación de hidrocarburos mediante la prueba de spike
Anexo 6. Datos analizados por prodycon Anexo 7. Balance de masas Anexo 8. Cromatogramas de PAHs Anexo 9. Datos recolectados en laboratorio Anexo 10. Registros de resultados de BBL cristal Anexo 11. Soporte estadístico del análisis de las variables en estudio
Anexo 12. Costos para tratamiento in-situ Anexo 13. Costos para tratamiento “ex-situ ” Anexo 14. Costos del proyecto de Biorremediación a nivel laboratorio Anexo 15. Tratamientos para la biorrecuperación de suelos
1
INTRODUCCION
Uno de los problemas ambientales más importantes de la actualidad es la contaminación
de ecosistemas terrestres y acuáticos por derrames de hidrocarburos de petróleo y sus
derivados. En el caso del suelo, las principales consecuencias ambientales que se
presentan después de un evento de contaminación por hidrocarburos se encuentran: la
reducción o inhibición del desarrollo de la cobertura vegetal del lugar del derrame, los
cambios en la dinámica poblacional de la fauna y la biota microbiana, y la contaminación
por infiltración de cuerpos de agua subterráneos; además del impacto ambiental negativo,
los derrames de hidrocarburos generan impactos de tipo económico, social y de salud
pública en las zonas aledañas al lugar afectado.
Las principales fuentes de contaminación por hidrocarburos en la actualidad son las
actividades de explotación y transporte del petróleo. En Colombia, además de las fuentes
de contaminación nombradas anteriormente, se presentan derrames de crudo en los
sistemas de conducción debido a las incursiones violentas de los grupos al margen de la
ley; entre los años 1986 y 1998 dichas incursiones ocasionaron el derramamiento de
cerca de dos millones de barriles de petróleo(7.6 veces el petróleo que se derramó en el
desastre del buque Exxon Valdés entre Alaska y Canadá el 24 de marzo de 1998).
Esta liberación excesiva de hidrocarburos al medio y la disposición inapropiada de los
residuos de petróleo; hace necesario implementar métodos de tratamiento para la
recuperación de los suelos afectados, que sean ambientalmente aceptables y
económicamente rentables. Dentro de la presente investigación se evaluó el efecto de la
adición de nutrientes en la técnica de biolabranza (landfarming), por medio de un ensayo
2
in vitro, para el cual se dispusieron 6 unidades experimentales (UE) con suelo
contaminado con petróleo crudo. En tres de las UE se adicionó fertilizante inorgánico
Triple 15 (tratamiento) y en las otras se dejó tan solo el sustrato (control biótico). Para
determinar la efectividad de la técnica de biolabranza se llevaron a cabo análisis de pH,
porcentaje de humedad, temperatura, conteos de heterótrofos totales y número más
probable para microorganismos, nutrientes e hidrocarburos totales de petróleo durante un
periodo de experimentación de cuatro meses
Al cabo del tiempo de experimentación se encontró que la bioestimulación por medio de la
adición de nutrientes dentro del tratamiento de biolabranza generó una alta
biodegradación de los hidrocarburos, lo cual demuestra que este es un tratamiento
efectivo para la recuperación de suelos contaminados con petróleo.
Esta investigación representa una puerta de entrada para la elaboración de otros
proyectos de investigación en temáticas relacionadas con la biorremediación de suelos
como bioaumentación, bioventing, y biopilas, entre otros; y la aplicación ex situ de la
técnica de biolabranza
3
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL.
Evaluar la eficacia de la biodegradación de hidrocarburos mediante el uso de
fertilizantes inorgánicos compuestos, en un suelo contaminado con petróleo, por medio
de la realización de un ensayo de biolabranza in vitro.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Evaluar la eficacia de degradación de petróleo por medio de la atenuación natural
(Control Biótico), mediante el análisis de hidrocarburos totales de petróleo durante
el tiempo de experimentación.
• Evaluar la eficacia de degradación de petróleo en el tratamiento de biolabranza y
adición del fertilizante inorgánico (Triple 15), mediante el análisis de hidrocarburos
totales de petróleo y la concentración de nutrientes (amonio, nitratos y fósforo).
durante el tiempo de experimentación.
• Comparar los procesos de degradación de hidrocarburos entre el montaje
experimental de atenuación natural y el de biolabranza mediante el análisis de
hidrocarburos totales de petróleo (TPHs), la concentración de nutrientes (amonio,
nitratos y fósforo).
4
• Determinar la dinámica poblacional de la biota microbiana mediante la realización de
análisis cuantitativos de heterótrofos totales a lo largo del tiempo de experimentación.
• Analizar el desempeño de los microorganismos degradadores de petróleo, mediante la
determinación de los porcentajes de remoción de hidrocarburos totales de petróleo
(TPHs) y de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en cada una las unidades
experimentales.
• Analizar los costos, tecnologías y usos del suelo para el proceso de biorremediación
de suelos contaminados con hidrocarburos con el fin de determinar la viabilidad y
aplicabilidad de este en la realidad.
5
2 MARCO TEÓRICO
Cuando se presentan eventos de contaminación del suelo por hidrocarburos se genera en
él una disminución sustancial de productividad que se ve representada principalmente en
el efecto que tiene sobre la fauna y flora nativas, además de la imposibilidad para su uso
en actividades agrícolas ya sea cultivos o ganadería. Los hidrocarburos, al ser sustancias
orgánicas pueden ser degradadas por la biota microbiana natural del suelo, por lo que la
aplicación de técnicas de biorremediación basadas en este hecho se ha convertido en uno
de los mecanismos más utilizados para la eliminación de dichas sustancias del ambiente
y la recuperación de los recursos naturales que han sido afectados. Para comprender
completamente los procesos de recuperación biológica de suelos contaminados con
hidrocarburos, es necesario conocer los aspectos generales de temáticas como el suelo,
los microorganismos, los hidrocarburos y la biorremediación.
2.1 SUELO
En los ecosistemas terrestres el suelo representa el medio físico que sustenta la vida de
diversas especies tanto animales como vegetales y se define como un agregado de
minerales no consolidados y de partículas orgánicas producidas por la acción combinada
del viento, el agua y los procesos de desintegración orgánica.; su composición química y
estructura física están determinadas por: el tipo de material geológico del que se origina,
6
por la cantidad de tiempo en que ha actuado la meteorización, por la topografía, la
cubierta vegetal, y por los cambios artificiales resultantes de las actividades humanas.1
2.1.1 Composición. Los componentes primarios del suelo son: compuestos inorgánicos
no disueltos y nutrientes solubles, distintos tipos de materia orgánica, viva o muerta,
gases y agua; los cuales son necesarios para el desarrollo de los seres vivos (macro y
microscópicos) que allí habitan.2
2.1.1.1 Compuestos inorgánicos y nutrientes. Los compuestos inorgánicos no
disueltos constituyen los principales componentes estructurales de los suelos y suponen
mas del 50% de su volumen total. Estos compuestos son materiales minerales que en su
mayoría son producto de la meteorización y la descomposición de las rocas superficiales.
Las plantas y los microorganismos requieren de algunos compuestos inorgánicos
(nutrientes) necesarios para su desarrollo tales como lo son el nitrógeno, el fósforo y el
potasio, (como se explica en el numeral 1.2.1), los cuales se obtienen a partir de los
coloides del suelo.3
A menudo es necesario la adición de nutrientes inorgánicos para compensar la ausencia
de nitrógeno o fósforo en el suelo natural. A menos que se hagan pruebas de laboratorio
para encontrar la relación optima C:N:P, necesaria para degradar los residuos, se usa una
1 Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta® Online 2004. http://es.encarta.msn.com © 1997-2004 Microsoft Corporation. 2 Ibid 3 Ibid
7
relación de 100:10:1 a 300:10:1.4 Las pruebas de laboratorio pueden mostrar que altas
concentraciones de nitrógeno y fósforo se trabaja mejor para degradar los residuos. En la
tabla 1 se muestran ejemplos de tasas que se han empleado en campo.
Tabla 1. Ejemplo de adición de nutrientes de varias aplicaciones de campo.
Relacion C:N:P deseada
Adicion de nutriente (formula empírirca) Referencia
100:2:0,4 Fosfato dihidrógeno de amonio (NH4H2PO4) Genes y Consentini, 1993 200:10:1 Nitrato Amónico (NH4NO3) US EPA, 1995 10:3:3 Fogel, 1994
100:10:1 Fosfato diamónico (NH4)2HPO4
Nitrato amónico Fosfato dihidrpogeno potásico (KH2PO4)
Troy et al., 1994 Flathman et al., 1995 Calabrese et al., 1993
Fuente: EWEIS, Juana. et. al. Principios de Biorecuperación. Tratamientos para la descontaminación y regeneración de suelos y aguas subterráneas mediante procesos biológicos y fisicoquímicos. McGraw Hill. España. 1999. p. 196.
Con el agua de riego también pueden introducirse fertilizantes que son muy solubles. No
obstante, si se añaden nitratos en altas concentraciones pueden lixiviar con el agua de
drenaje. También se pueden usar nutrientes en gránulos para asegurar un aporte
constante en el tiempo.5 La presencia de un suelo con partículas que adsorban con gran
intensidad determinadas clases de sustancias, pueden reducir la disponibilidad de
compuestos orgánicos para la biodegradabilidad.
2.1.1.2 Materia orgánica. La fracción orgánica del suelo está compuesta por
residuos de plantas y animales, células microbianas y productos resultantes del
metabolismo microbiano y que, a menudo, se conoce por el nombre de Humus.6 Esta
4 EWEIS, Juana. Et. al. Principios de Biorecuperación. Tratamientos para la descontaminación y regeneración de suelos y aguas subterráneas mediante procesos biológicos y fisicoquímicos. McGraw Hill. España. 1999. p. 195 5 Ibid , p. 196 6 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Microbial ecology: Fundamentals and Applications. 2da ed. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA. 1987; p. 361
8
representa entre el 2 y el 5% del suelo superficial en las regiones húmedas, pero puede
ser menos del 0.5% en suelos áridos o más del 95% en suelos de turba.7
En el proceso de descomposición de la materia orgánica intervienen fuerzas físicas como
los cambios de temperatura y humedad. También intervienen organismos como
vertebrados, insectos y lombrices, quienes juegan un papel importante en la incorporación
de los residuos al suelo al reducirlos de tamaño para que los otros factores (químicos y
bióticos) actúen. 8
Los microorganismos, especialmente las bacterias y los hongos, al utilizar la materia
orgánica como fuente de su alimento, la degradan, produciendo sustancias mas simples.
Este proceso en general, se denomina mineralización de la materia orgánica, y como
consecuencia de lo anterior, una parte del carbono es asimilado por ellos y la otra parte se
libera como CO2. Como se muestra en la siguiente ecuación, en este tipo de reacción se
produce energía y agua:9
Como consecuencia de la mineralización, algunos elementos que son nutrimentos
(elementos esenciales para el crecimiento de las plantas) se transforman de una forma
orgánica no utilizable por la planta, a una forma inorgánica asimilable, como por ejemplo
el nitrógeno, el fósforo y el azufre.10
7 Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta®; Op. Cit. 8 SALAMANCA S. RAFAEL. Suelos y fertilizantes. Universidad Santo Tomas – USTA . Bogotá – Colombia. 1990. p. 34. 9 Ibid. 10 Ibid.
Compuestos Oxidación enzimática CO2 + H2O + Energía
9
Además de la naturaleza química de las sustancias existen otros factores como la
temperatura, la humedad, el pH, el tipo de arcillas, etc.., que afectan la descomposición
de la materia orgánica del suelo. La temperatura es uno de los factores que mas
intervienen en la rata de descomposición de la materia orgánica; la tasa aumenta cuando
hay mayor temperatura, este hecho explica en muchos casos el mayor contenido de
materia orgánica en suelos de zonas altas del trópico, comparado con suelos en
posiciones mas bajas11, como se muestra en la tabla 2.
El contenido de nitrógeno es un factor importante en la descomposición de los residuos
orgánicos en el suelo. En general, se considera que la tasa de descomposición de un
material orgánico dado es proporcional a su contenido de nitrógeno. Sin embargo, es tal
vez más importante tener en cuenta el contenido de nitrógeno con respecto al carbono, es
decir la relación N/C.12
Tabla 2. Relación entre el contenido medio de materia orgánica de los suelos de varias regiones de Colombia, la altitud y la temperatura.
Región Temperatura Media anual (ºC) Altitud media (m) Materia orgánica
(%) Páramo (Cundinamarca) 10 3400 24.0 Sabana de Bogotá 14 2600 12.0 Zona cafetera 19 1400 8.0 Valle del Cauca 24 1000 4.2 Llanos Orientales 27 300 3.4 Costa Atlántica 28 100 2.5
Fuente: LORA S. RODRIGO. Interpretación de análisis de suelos y recomendaciones de fertilizantes. ICA. Programa de suelos. Bogotá . 1971
La relación C/N resulta de dividir el porcentaje de Carbono (%C) por el porcentaje de
nitrógeno (%N), la cual se califica de la siguiente manera:
11 SALAMANCA S. RAFAEL; Op cit p. 35 12 Ibid. p. 227
10
< 10: Baja. Indica alta mineralización
10-12: Media. Indica mineralización normal.
>12: Alta. Indica mineralización lenta13
La relación C/N en la materia orgánica del suelo es casi siempre de 8 a 1 hasta de 15 a 1;
siendo el término medio de 10 ó 12 a 1. Esta relación es muy importante. La competencia
por el nitrógeno asimilable aparece cuando la relación es alta; lo que equivale a decir, que
el aporte de nutrientes por parte de la materia orgánica es poco eficiente. Cuando la
relación es baja, seguramente la materia orgánica da buenos suministros de algunos
nutrientes.14
Esta relación en los vegetales y en el estiércol, es de aproximadamente de 30 a 1 y de 90
a 1 respectivamente, que son altas. Al ser incorporados estos materiales al suelo, ocurre
un cambio rápido, los microorganismos se multiplican rápidamente, tomando el nitrógeno
disponible en el suelo y abandonando carbono en forma de CO2; bajo estas condiciones,
el nitrógeno del suelo desaparece prácticamente, debido a la gran demanda por parte de
los microorganismos, de tal manera que a las plantas no les queda nada. Cuando ocurre
la desintegración, la relación C/N de los materiales incorporados decrece, pues el carbono
se va perdiendo, en cambio el nitrógeno se conserva.15
La anterior situación permanece hasta cuando los materiales se han humificado. En este
momento, la actividad de los microorganismos decrece. La relación C/N disminuye, pues
gran parte del Carbono ha salido en forma de CO2. Al morir los microorganismos, le
devuelven al suelo el nitrógeno y se forman nitratos. En esta condición, el nitrógeno es
13 SALAMANCA S. RAFAEL; Op cit p. 227. 14 Ibid. P. 228 15 Ibid.
11
tomado por las plantas o es lixiviado. Después de cierto tiempo, la relación se torna mas o
menos constante, o sea cerca de 10 ó 12 a 1. La velocidad de todos estos procesos está
incidida por el clima, siendo mas activa en climas cálidos. 16
2.1.1.3 Agua del suelo. Este componente líquido, es sobre todo agua con varias
sustancias minerales en disolución, cantidades grandes de oxígeno y dióxido de carbono
disueltos. Dicha solución, (solución del suelo), cobra gran importancia al ser el medio por
el que los nutrientes son absorbidos por las raíces de las plantas. Cuando el agua
contenida en el suelo carece de los elementos requeridos para el crecimiento de las
plantas, éste es estéril. 17
La cantidad de agua retenida depende del tamaño y de la disposición de los poros en el
terreno. En suelos gruesos y desagregados, el agua tiende a drenarse hacia abajo por la
acción de la gravedad, dejando un pequeño remanente. Los suelos compuestos por
partículas finas suelen tener una porosidad total superior, por tanto, retienen cantidades
de agua mayores que los suelos de textura gruesa. El agua se mueve y queda retenida
por un sistema de poros. Sólo están disponibles para las plantas dos tercios del agua
almacenada después de que se haya drenado el exceso. Las partículas del suelo
absorben el agua restante con fuerza suficiente como para impedir su uso por las
plantas.18
2.1.1.4 Gases del suelo. Existe una relación directa entre las cantidades de agua y aire
contenidas en un volumen de suelo, ya que el espacio de poro que no esta ocupado por
16 SALAMANCA S. RAFAEL; Op cit p. 228 17 Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta®; Op. Cit. 18 Ibid.
12
agua lo estará por gas. Los principales gases de un suelo son: nitrógeno, oxigeno y
dióxido de carbono.19 Las concentraciones de estos gases, en concreto del oxígeno y del
dióxido de carbono, dependen de la aireación del suelo y de la actividad microbiana en
todo el perfil. En suelos con buena aireación la concentración de oxigeno puede oscilar
entre el 18 y el 20% y la concentración del dióxido de carbono puede alcanzar valores tan
altos como del 1 al 2%. En suelos con menor aireación (suelos arcillosos), con alto
contenido en agua y una actividad microbiana considerable, el dióxido de carbono puede
suponer un 10% del volumen de aire. 20
2.1.2 Propiedades físicas y químicas. Las propiedades físicas y químicas de los
suelos influyen en gran manera sobre la aireación, la disponibilidad de nutrientes y la
retención de agua y por lo tanto en la actividad biológica.
2.1.2.1 Propiedades físicas. En un volumen dado de un suelo mineral, hay una
proporción aproximadamente igual de sólidos y de espacio de poro. Los primeros se
componen de 45% de minerales y un 5% de materia orgánica y el último se encuentra
constituido por agua y aire.
El movimiento del aire y de la humedad a través del suelo son factores importantes en la
descomposición de la materia orgánica. Un suelo con una humedad demasiado baja da
lugar a zonas secas y a una disminución en la actividad microbiana. Sin embargo,
demasiada humedad inhibe el intercambio de gases y el movimiento de oxigeno a través
del suelo y resulta en la aparición de zonas anaerobias, hecho que daría lugar a la
19 Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta®; Op. Cit. 20 PAUL, E.A Y CLARK, F.E. Soil microbiology and biochemistry, Academic Press, Londres. 1989.
13
eliminación de las bacterias aerobias y el aumento de la presencia de anaerobios o
anaerobios facultativos.21
De la misma manera, la textura y la estructura del suelo son determinantes claves que
afectan al movimiento tanto del aire como del agua en el perfil del mismo. La textura de un
suelo es la proporción de los tamaños de los grupos de partículas que constituyen la
parte sólida del mismo y se encuentra relacionada tanto con la conductividad hidráulica
como con la retención del agua, propiedades que influyen en la lixiviación y en la
escorrentía. La estructura por su parte, se refiere a la forma en que se disponen y se
mantienen juntas las partículas primarias individuales como unidades identificables más o
menos diferentes.22
2.1.2.1 Propiedades químicas. Además de definir las características al suelo, las
fracciones mineral y orgánica, también determinan las propiedades químicas del suelo, ya
que contienen la mayor parte de los nutrientes en formas que no están disponibles para
las plantas. Las partículas inorgánicas del tamaño de la arcilla y el humus son las
responsables de la mayor parte de las propiedades químicas del suelo.
Una de las propiedades químicas del suelo es su capacidad para el Intercambio iónico, el
cual consiste en una serie de procesos de intercambio que resultan de las interacciones
entre la fase sólida y líquida del suelo y dependen de la composición y características de
las partículas de materia orgánica, arcillas e hidróxidos y de la composición de la solución
del suelo.23
21 . Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta®; Op. cit. 22 Ibid. 23 MAHECHA, CLAVIJO G. Y ROA, TRUJILLO S. H. Serie Recursos Naturales. No 4 Suelo. Universidad Santo Tomas. Facultad de Educación y Humanidades. 1998
14
Otra característica del suelo es su grado de Acidez o Alcalinidad que se expresa a través
de los valores de pH, estos a su vez dependen de la naturaleza de la roca madre, del
grado de disgregación y del tipo de actividad biológica que presente. Si se analiza en
conjunto las sustancias y procesos que influyen sobre el pH del suelo, se puede encontrar
que la máxima acidez aparecerá en los horizontes A, dominados por la materia orgánica y
en los cuales ocurren la mayoría de los procesos de degradación en los cuales se da una
gran liberación de ácidos orgánicos. A medida que se desciende en el perfil el influjo de la
materia orgánica decrece a la par que aumenta el de la alteración mineral, razón por la
cual el pH irá creciendo. En algunas ocasiones, este crecimiento se verá aumentado por
la acumulación de las bases lavadas en los horizontes superiores, que a su vez se irán
acidificando por esta pérdida.24
El pH de la solución del suelo afecta profundamente a la solubilidad de los diferentes
iones presentes, de este modo varía la asimilabilidad de los mismos por las plantas ya
que estas solo pueden absorberlos en solución. En otros casos el pH afecta a la actividad
microbiana necesaria para provocar la transformación de ciertos elementos, que se
liberan en formas no asimilables y han de sufrir una transformación química que permita
su fácil absorción. Este es el caso del Nitrógeno cuyas formas inorgánicas son todas
solubles independientemente del pH reinante por lo que no debería verse afectada su
asimilabilidad por aquel. Sin embargo para valores de pH inferiores a 6 o superiores a 8
se atenúa la actividad bacteriana con lo que disminuye tanto la liberación de amonio como
24 Programa de Edafología: Primer curso de ciencias ambientales [online]: Universidad de Extremadura, departamento de biología y producción de los vegetales, área de edafología y química agrícola, Badajoz- España . Lección 5 Propiedades del suelo. Propiedades físico químicas. Reacciones del suelo. Última actualización mayo del 2001. Disponible en internet: http://www.unex.es/edafo/ECAL5PFQReaccion.htm
15
su oxidación a nitrato, y ello hace bajar la concentración de nitrógeno en forma
asimilable.25
En el caso del fósforo el pH puede inducir su fijación o su precipitación, solo entre valores
comprendidos entre 6.5 y 7.5 su asimilabilidad es óptima. Cuando el pH se sitúa por
debajo de 6.5, se inicia un incremento en el contenido en cargas positivas del complejo
absorbente, ello provoca una fuerte fijación de los aniones sobre todo el fosfato que, se
incorpora a las arcillas; este hecho provoca una inmovilización definitiva del mismo.
Cuanto menor es el valor del pH mayor es la fijación, pudiendo provocar fuertes carencias
cuando el pH es inferior a 526. En la figura 1 se representa con la anchura de las franjas,
la capacidad de asimilación de nutrientes en un suelo dependiendo de su pH.
2.1.3 Influencia del suelo en la actividad microbiana. La materia orgánica e
inorgánica del suelo da cabida a la coexistencia de una gran cantidad de microorganismos
que se adaptan a sus características físicas y químicas aun cuando estas sean variables.
Durante las primeras etapas de la formación del suelo, la actividad microbiana es escasa,
principalmente debido a la falta de carbono y nitrógeno. En un suelo, la existencia de vida
depende de la presencia de organismos capaces de conseguir la fijación del dióxido de
carbono y el nitrógeno. Tales organismos casi siempre utilizan la luz como su fuente de
energía y por esta razón, la colonización de nuevos terrenos se produce en zonas
cercanas a la superficie. Entre los productos resultantes de la degradación microbiana se
25 Programa de Edafología: Primer curso de ciencias ambientales [online]. Op. Cit. 26 Ibid.
16
encuentran los compuestos orgánicos complejos y los nutrientes necesarios para el
crecimiento de microorganismos más delicados, plantas y animales27
Figura 1. Asimilación de nutrientes de acuerdo con el pH del suelo.
Fuente: Programa de Edafología: Primer curso de ciencias ambientales [online]: Universidad de Extremadura, departamento de biología y producción de los vegetales, área de edafología y química agrícola, Badajoz- España . Lecció5 Propiedades del suelo. Propiedades físico químicas. Reacciones del suelo. Última actualización mayo del 2001. Disponible en internet: http://www.unex.es/edafo/ECAL5PFQReaccion.htm
Como se explico anteriormente, los microorganismos obtienen parte de los nutrientes que
necesitan de la fracción mineral del suelo. Dichos nutrientes comprenden el carbono, el
nitrógeno, el fósforo, el potasio, el magnesio, el azufre y el calcio entre otros, por lo cual
se debe tener en cuenta la composición del medio cuando se llevan a cabo procesos de
biodegradación de contaminantes.
Existe una gran variedad de microorganismos ( bacterias, actinomicetos, hongos, algas y
protozoos) que casi siempre están presentes en los suelos, cuyas densidades
poblacionales varían ampliamente dependiendo de sus características.
27 Suelo, Enciclopedia Microsoft® Encarta®; Op. cit.
17
2.1.4 Muestreo de microorganismos en suelo. Si se desea conocer la conformación
de las comunidades microbianas presentes en un suelo determinado, existen diferentes
métodos que pueden ser aplicados directamente en campo, entre los cuales se
encuentran: la técnica Cholodny-Rossi en la que se entierra directamente en el sustrato
un portaobjeto que actúa como la superficie de las partículas minerales del suelo por lo
que se adhieren directamente los microorganismos más representativos de la comunidad
y el uso de Pedoscopios que consisten en la introducción de capilares de vidrio aplanado
en el suelo, los cuales asemejan espacios porosos del medio y permiten que los
microorganismos pueden entrar en ellos libremente 28.
Otro método utilizado es la obtención de diluciones consecutivas de una solución de
suelo hasta alcanzar un punto de extinción de los microorganismos, dichas diluciones
pueden ser utilizadas en técnicas como el conteo de heterótrofos en la que se inoculan
medios enriquecidos que estimulen el crecimiento de estos; para analizar grupos de
microorganismos específicos se utilizan medios selectivos y se pueden aplicar técnicas
como la de número más probable que consiste en utilizar análisis estadísticos y las
diluciones sucesivas nombradas anteriormente. Dichas técnicas permiten cuantificar la
densidad de la población microbiana en unidades formadoras de colonia por gramo de
muestra (UFC /g).
2.2 MICROORGANISMOS
Los microorganismos son un extenso y variado grupo de seres vivos microscópicos que
existen como células aisladas o agrupaciones celulares29 capaces de llevar a cabo sus
28 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Op. cit.; p. 218
29 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Biologia de los Microorganismos. Prentice-Hall. 8. 1997. Englewood Cliffs, NJ. 1997. p. 2
18
procesos vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción, estando siempre
presentes en el ambiente con una importante participación en muchos de los ciclos
biogeoquímicos de elementos como el carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros
minerales.
A continuación se presenta una breve descripción de los principales aspectos en el
desarrollo de un microorganismo.
2.2.1 Nutrición y metabolismo. Los productos químicos exteriores a partir de los
cuales se construye una célula se denominan nutrientes los cuales son transformados en
su interior por constituyentes celulares mediante un proceso denominado anabolismo.
Debido a que el anabolismo da cómo resultado la síntesis bioquímica de nuevo material
celular, también sé le conoce como biosíntesis. 30
La biosíntesis es un proceso que requiere energía, y cada célula debe poseer los medios
para generarla, ya que es necesaria para funciones tales como movimiento celular y
transporte de nutrientes. Como otros nutrientes, las fuentes de energía se obtienen
también del medio exterior celular, de tal manera que se pueden usar dos fuentes de
energía: luz y compuestos químicos. Aunque es cierto que un determinado número de
microorganismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen por oxidación de
compuestos químicos que son transformados en constituyentes más simples y si esto
ocurre se libera la energía. A este proceso se le denomina catabolismo.31
30 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Op. cit. p.. 110
31 Ibid.
19
Por otra parte la mayor parte de los microorganismos utilizan compuestos orgánicos como
fuente de energía y se denominan quimiorganotrofos. Los organismos capaces de utilizar
compuestos inorgánicos como fuente de energía se denominan quimiolitotrofos.32
2.2.1.1 Nutrición microbiana. El metabolismo microbiano esta orientado hacia la
reproducción de los organismos, y estos requieren que los constituyentes químicos,-
componentes de la célula-, estén disponibles para la asimilación y síntesis de nuevo
material celular. 33
Las células contienen grandes cantidades de pequeñas moléculas así como de
macromoléculas. La célula puede obtener la mayoría de las pequeñas moléculas que
necesita del exterior o sintetizarlas a partir de moléculas más simples. Las
macromoléculas, por el contrario son siempre sintetizadas en la célula. Aunque hay
muchos elementos en la naturaleza, prácticamente la totalidad de la masa celular esta
formada por sustancias con cuatro tipos de átomos: carbono, oxigeno, hidrógeno y
nitrógeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto de las macromoléculas así
como las moléculas orgánicas pequeñas. Otros elementos son menos abundantes que el
C, O, H y N, pero son igualmente importantes para el conjunto del metabolismo. Estos
incluyen al fósforo, potasio, calcio, magnesio, azufre, hierro, zinc, manganeso, cobre,
molibdeno, cobalto y otros pocos elementos, dependiendo del organismo.34
En el caso del agua, esta representa el 90% del peso húmedo de una célula y las
macromoléculas la masa global del peso seco.
32 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T.Op.cit. p.. 110 33 EWEIS, Juana. Et. al.; Op. cit.; p. 93 34 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T.; Op. cit.; p. 112
20
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: macronutrientes, los que son
requeridos en grandes cantidades y micronutrientes que lo son solamente en pequeñas
cantidades.
• Macronutrientes. La mayoría de los procariotas requieren un compuesto orgánico
de algún tipo como fuente de carbono. Estudios nutricionales han demostrado que
muchas bacterias pueden asimilar varios compuestos de carbono orgánico y utilizarlos
para fabricar material celular. En peso seco una célula típica consta de aproximadamente
el 50% de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromoléculas. 35
Después del carbono, el siguiente elemento más abundante en la célula es el nitrógeno.
Una bacteria típica contiene aproximadamente el 12% de nitrógeno (peso seco) y a su vez
el nitrógeno es un componente mayoritario de proteínas, ácidos nucleicos y otros
constituyentes celulares. El nitrógeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma
orgánica como inorgánica. Sin embargo la globalidad del nitrógeno utilizable por los
microorganismos y las plantas, esta en forma inorgánica, bien como amoniaco (NH3),
nitrato (NO3-) o N2. 36
Existen otros macronutrientes como el fósforo que acontece en la naturaleza en forma de
fosfatos orgánicos o inorgánicos y es requerido por la célula para la síntesis de ácidos
nucleicos y fosfolípidos;37 el potasio es necesario en todos los organismos ya que una
gran variedad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la síntesis de proteínas, lo
requieren específicamente; el magnesio estabiliza los ribosomas, las membranas
celulares, los ácidos nucleicos y se requiere también para la actividad de muchas enzimas
35 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T.; Op. cit.; p. 112 36 Ibid. 37 Ibid.
21
y el hierro juega un papel fundamental en la respiración celular, siendo un componente
clave de los citocromos y de las proteínas que contienen hierro y azufre implicadas en el
transporte de electrones, (algunas veces se le considera un micronutriente).38
• Micronutrientes (Elementos traza). Aunque los micronutrientes son requeridos en
muy pequeñas cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes
para la función celular. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman
parte de enzimas que son los catalizadores celulares. 39
Los elementos que se muestran en la tabla 3 son requeridos en la proporción aproximada
en la que están dados, y representan una composición elemental típica de las células
bacterianas con base a su peso seco.
Tabla 3. Composición elemental típica de las células bacterianas con base en su peso seco. ELEMENTO PORCENTAJE DE
PESO SECO FUNCIÓN FISIOLÓGICA GENERAL
Carbono 50 Componente de materiales orgánicos celulares Oxígeno 20 Componente de materiales orgánicos celulares y agua celular. Nitrógeno 14 Componente de proteínas, ácidos nucleicos y coenzimas. Hidrógeno 8 Componente de agua celular y materiales orgánicos celulares Fósforo 3 Componente de ácidos nucleicos, fosfolípidos y coenzimas Otros 5 Fuente: STAINER, R.Y. et al. The microbial world. Prentice-Hall, Englewood Cliffs. NJ. 1986.
Las transformaciones biológicas de compuestos orgánicos están catalizadas por acción
de las enzimas, lo cual permite que los nutrientes estén disponibles para ser asimilados
por los microorganismos. Esta asimilación se puede dar desde un número limitado de
38 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T.; Op. cit.; p. 113 39 Ibid; p. 114
22
estados elementales y por lo tanto, la cantidad de nutrientes presentes y el estado de los
mismos son importantes.40
2.2.2 Biodegradación. Los microorganismos tienen una gran importancia ecológica en
los ecosistemas terrestres debido a que cumplen la función de descomponer sustancias
orgánicas de desecho en sus componentes básicos, los cuales metabolizan junto con los
nutrientes obtenidos del suelo, para generar nueva biomasa y llevar a cabo sus funciones
vitales; los residuos generados dentro de este proceso son reincorporados dentro del
sistema para ser utilizados nuevamente por los organismos productores (plantas). Esta
capacidad de los microorganismos, también se aplica a diversos contaminantes orgánicos
del suelo, ya que tienen la capacidad metabólica para transformarlos o mineralizarlos en
compuestos menos peligrosos que puedan integrarse a los ciclos biogeoquímicos
naturales. 41
La biodegradación se puede dar en condiciones aerobias y anaerobias. En condiciones
aerobias, los microorganismos usan el oxígeno disponible en la atmósfera para
metabolizar las sustancias y transformarlas en dióxido de carbono y agua. En
condiciones anaerobias, la actividad biológica tiene lugar en ausencia de oxígeno, de
modo que los microorganismos descomponen compuestos químicos del suelo para liberar
la energía que necesitan. A veces, en los procesos aerobios y anaerobios de
descomposición de los contaminantes originales se crean productos intermedios de
toxicidad menor, igual o mayor.42
40 EWEIS, Juana. Et. al.; Op. cit.; p. 93
41 MOTRAS BOET A. Y VINCENT HUGUET T. Biodegradación y Bierremediación. Ecotropía [online], marzo 2001 No. 44. Disponible en http://www.ecotropia.com/n1010402.htmhttp://www.ecotropia.com/n1010402.htm 42 US EPA. Medidas Biocorrectivas. Guia del Ciudadano [online], abril 1996. EPA 542-F-96_023. Disponible en: http://www.clu-in.org/download/remed/spanbio.pdf
23
Cuando se presenta un evento de contaminación en suelos, se da un aumento de los
microorganismos degradadores de la sustancia contaminante, el crecimiento de la
población microbiana se comporta de manera exponencial hasta que llega a un punto en
el que el contaminante empieza a agotarse lo que genera una disminución de la población
que se prolonga hasta que se estabiliza nuevamente dentro de su entorno.
La gran mayoría de los tratamientos biológicos de suelos contaminados con hidrocarburos
estan basados o incluyen los procesos de biodegradación microbiana dentro de sus
metodologías debido a que estos se dan de manera natural en el lugar contaminado y
presentan una gran eficacia en la descomposición y eliminación de hidrocarburos del
medio.
2.3 PETRÓLEO.
El petróleo es una sustancia de origen orgánico producto de la degradación y
metamorfización de material detrítico tanto vegetal como animal, ocurrida hace millones
de años en las capas más profundas de la corteza terrestre; debido a esto se encuentra
formando grandes mantos o yacimientos varios metros abajo de la superficie.
Este combustible fósil, de olor desagradable, color oscuro y consistencia aceitosa,
representa junto con el carbón, una de las principales fuentes energéticas del hombre en
la actualidad. Anualmente se extraen cerca de dos mil millones de toneladas métricas de
petróleo de los distintos yacimientos subterráneos o en mar abierto.43 La mayor parte del
petróleo se utiliza como combustible en forma de gasolina, diesel, kerosene, gas-oil, fuel-
oil, y turbosina, entre otros.
43 BARTHA, R. Biotechnology of petroleum Pollutant Biodegradation, Microbial Ecology, Vol. 12, 1986, p. 155-172.
24
Químicamente, el petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos formados
principalmente por carbono e hidrógeno con contenidos menores de otros elementos
como azufre, oxígeno, nitrógeno o trazas de metales, dependiendo del lugar de donde
provengan. 44
2.3.1 Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH) . Los TPH´s son una mezcla de
productos químicos compuestos principalmente de hidrógeno y carbono, llamados
hidrocarburos. En general, los TPH´s se clasifican en grupos de hidrocarburos de
petróleo que se comportan en forma similar en el suelo o el agua. Estos grupos se llaman
fracciones de hidrocarburos de petróleo. Cada fracción contiene muchos productos
químicos individuales diferenciados según: el número de átomos de carbono que
contengan, el tipo de estructura que presenten, ya que pueden ser lineales (cadenas) o
cíclicos (anillos), y el tipo de enlaces de energía que establezcan los átomos entre sí. 45
Como se muestra en la figura 2 los hidrocarburos se clasifican en tres grupos generales
que a su vez se subdividen en varios subgrupos.
Cada una de estas familias de hidrocarburos presenta una serie de características
estructurales y químicas que los diferencian entre si, a continuación se explicaran algunas
de ellas.
44 VIVEROS, RUIZ ALMA D. Hidrocarburos. Quimica Orgánica Morrison. Capitulo Quince. 1993, p. 247. 45 ATSDR Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades [online]. Atlanta (Georgia): ToxFAQs™ para los Hidrocarburos Totales de Petróleo (Total Petroleum Hydrocarbons), 2001, acualización 10 de junio del 2003. Disponible en: http://www.atsdr.cdc.gov/es/es_index.html
25
HIDROCARBURO
SATURADOS
NO SATURADOS
ALIFATICOS
ALICICLICOS
AROMÁTICO
CICLOALCANOS
CICLOALQUENO
BENCENO
POLIFENILOS
POLICICLICOS
ALCANOS
ALQUENOS
ALQUINOS
Figura 2. Clasificación de los hidrocarburos.
Fuente: VIVEROS, RUIZ ALMA D. Quimica Orgánica Morrison. Hidrocarburos. 1993. Capitulo Quince, p. 249.
2.3.1.1 Hidrocarburos alifáticos. Comprenden los compuestos de estructura en cadena
ya sea lineal o ramificada. Pueden ser saturados cuyos átomos se encuentran unidos
entre sí por medio de enlaces sencillos y son llamados parafinas, o no saturados que
presentan enlaces dobles o triples llamados olefinas y acetilenos respectivamente. 46
Como se vio en la figura 2, los hidrocarburos alifáticos se subdividen en alcanos, alquenos
y alquinos, que se diferencian entre si por el tipo de enlace que presentan entres sus
carbonos: sencillo, doble o triple respectivamente.
2.3.1.2 Hidrocarburos Alicíclicos. Los hidrocarburos alicíclicos son moléculas
saturadas o no saturadas en las que se unen tres o más átomos de carbono para formar
una estructura de anillo. Los compuestos saturados se denominan cicloparafinas o
46 .VIVEROS, RUIZ ALMA D.; Op. cit.; p. 250
26
naftenos. Los hidrocarburos cíclicos con uno o más dobles enlaces se denominan
cicloalquenos o cicloolefinas. Estos compuestos son líquidos incoloros. 47
2.3.1.3 Hidrocarburos Aromáticos. Son compuestos que contienen por lo menos
una estructura de benceno. La serie polifenílica comprende a los compuestos que
presentan los anillos de bencenos unidos de tal forma que no comparten electrónes con
más de un anillo. Además se encuentran los aromáticos polinucleares o policíclicos, en
los cuales se pueden encontrar fusionados dos o más anillos, de los que al menos uno
debe ser de benceno. 48
Dentro de este grupo encontramos compuestos que presentan un riesgo para la salud por
tener efectos narcóticos o cancerigenos,49 como es el caso del benceno, tolueno y xilenos
(BTX) y los hidrocarburos policiclicos aromaticos (PAHs) que se explican a continuación:
2.3.1.3.1 Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH). Conforman un grupo de
hidrocarburos que consisten en moléculas que contienen dos o más anillos aromáticos de
6 carbonos fusionados. La mayoría de los PAHs contienen habitualmente anillos de
benceno fusionados aunque hay que tener en cuenta la existencia de PAHs basados en
estas estructuras que contienen grupos alquilo.50
47 SISSO Sistema Informático de Seguridad y Salud Ocupacional para la República Argentina, [online]: Agente de Riesgo Hidrocarburos alicíclicos. Disponible en http://www.jvsa.com.ar/Sisso/Spanish/MedicinaLaboral/Agentes/Agentes183.htm 48 VIVEROS, RUIZ ALMA D.; Op. cit.; p.251
49 Ibid. 50 VIVEROS, RUIZ ALMA D.; Op. cit.; p.251
27
Existen más de 100 grupos de PAHs diferentes. Los PAHs se consideran compuestos
orgánicos persistentes (COPs), por lo que pueden permanecer en el medioambiente
durante largos periodos de tiempo sin alterar sus propiedades tóxicas. Las propiedades
semivolátiles de los PAHs les otorga gran movilidad. Como característica común
presentan una baja solubilidad en agua.51
En general, son contaminantes ubicuos, sus procesos de formación pueden ser naturales
o antropogénicos, en los primeros se pueden resaltar algunas reacciones geológicas y los
segundos están relacionados con actividades económicas como la producción petrolera,
de gas y la preservación de la madera. Por otra parte, este tipo de compuestos son
utilizados como insumo en diversos procesos industriales como lo son la preparación de
tintas, resinas, espumas de poliuretano, antioxidantes y estabilizantes para funguicidas.52
Los principales impactos de los PAHs en la salud humana se centran en sus propiedades
genotóxicas, es decir causan daños al material genético (teratogénicas, mutagénicas y
carcinogénicas). Los más potentes carcinógenos son el benzo(a)antraceno,
benzo(a)pireno y el dibenzo(ah)antraceno.53
Según IARC (Agencia Internacional de Investigación del Cáncer), dependiente de la OMS
(Organización Mundial de la Salud), que cataloga las sustancias según el conocimiento de
su carcinogenicidad, entre los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) (sin contar los
derivados) hay 6 en los catálogos como posibles carcinógenos humano:
Benzo(a)antraceno – 2 A, Benzo(b)fluoranteno – 2 B, Benzo(k)fluoranteno – 2 B,
Benzo(a)pireno – 2 A, Dibenzo(ah)antraceno – 2 A, Indeno (1,2,3-cd) pireno – 2 B.
51 Hidrocarburos aromáticos policíclicos. Greenpeace. Disponible en: http://archivo.greenpeace.org/informes/Hidrocarburos.pdf 52 VIVEROS, RUIZ ALMA D.; Op. cit. 53 Hidrocarburos aromáticos policíclicos. Op. cit
28
Estos seis compuestos forman parte de los 16 PAHs designados por la Agencia
Americana de Protección Ambiental (USEPA) como contaminantes prioritarios.54
2.3.2 Contaminación por hidrocarburos. La utilización de petróleo como materia prima
o de energía dentro las actividades normales del hombre, ha generado un impacto
negativo en el ambiente ya que la liberación excesiva de hidrocarburos al medio y la
disposición inapropiada de los residuos de petróleo, ha generado problemas de
contaminación de talla mundial como el efecto invernadero, la contaminación de fuentes
hídricas y suelos y la extinción de numerosas especies de flora y fauna debido a derrames
de crudo. Además muchos de los compuestos contenidos en el petróleo son
cancerogénicos e inmunotóxicos, convirtiéndose en una amenaza para la salud
pública.55,56
En Colombia, el transporte de crudo y sus derivados se ha visto afectado
considerablemente durante los últimos 18 años, por una permanente actividad terrorista
contra los oleoductos e instalaciones petroleras. Entre los años 1986 y 1998 las
incursiones violentas de los grupos al margen de la ley ocasionaron el derramamiento de
cerca de dos millones de barriles de petróleo (7.6 veces el petróleo que se derramo en el
desastre del buque Exxon Valdés entre Alaska y Canadá el 24 de Marzo de 1989) sobre
ciénagas, pantanos, ríos, quebradas y suelos en su mayoría con vocación agrícola,
pecuaria y pesquera; hasta dicha fecha el estimativo de las áreas afectadas fue de 6000
hectáreas de terrenos con potencial agrícola y pecuario, 2600 kilómetros de ríos y
54 Hidrocarburos aromáticos policíclicos. Op. cit 55 SANJEET, et al., Evaluation of Inoculum Addition to Stimulate In Situ Bioremediation of Oily-Sludge-Contamiinated Soil. Applied and Enviromental Microbiology. 2001. p. 1675-1681.. 56 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA. Microbiología del Petróleo y sus Derivados. [online]. Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 1998. Disponible en: http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap2/
29
quebradas y 1600 hectáreas de ciénagas y humedales, originando grandes impactos
negativos de carácter económico social y ambiental.57
Hasta noviembre de 1998 el país presentó 920 ataques contra su infraestructura
petrolera, 575 de ellos en el oleoducto Caño limón - Coveñas, que mediante roturas y
abolladuras han perjudicado no solo a los ecosistemas y fuentes de producción y
abastecimiento de las comunidades aledañas al oleoducto, si no a regiones por donde
este transita. Las áreas perjudicadas por los derrames de petróleo se ubican
principalmente en la zona alta de la llanura Araucana, en la región de la cuenca del rió
Catatumbo, en la llanura del valle medio y medio bajo del río Magdalena (departamentos
de Santander, Cesar y Sucre, principalmente) y en los departamentos del Putumayo y
Nariño. 58
Entre los años 2000 y 2003 los ataques terroristas disminuyeron considerablemente con
respecto a los años anteriores, en el año 2001, los grupos al margen de la ley realizaron
263 ataques, para el año 2002 la cifra llegó a 74 incursiones y para el primer semestre del
2003 la cantidad llegó a 60.59 Aunque los ataques han disminuido, los impactos
ambientales permanecen en los diferentes ecosistemas afectados y se ven representados
en las consecuencias ambientales que se explican a continuación.
2.3.2.1 Consecuencias ambientales de la contaminación de suelos por
hidrocarburos. Diversos ecosistemas se pueden ver afectados por derrames de petróleo,
generando cambios importantes en sus distintos componentes.
57 EMPRESA COLOMBIANA DE PETROLEOS. Un ecocidio irracional: los atentados contra la infraestructura petrolera. Bogotá, noviembre de 1998. ; p:2-3 58 Ibid. 59 EMPRESA COLOMBIANA DE PETROLEOS.; Op cit.;p. 2-3
30
Cuando el crudo llega al suelo, impide inicialmente el intercambio gaseoso con la
atmósfera; esto desencadena una serie de fenómenos fisicoquímicos como evaporación y
penetración cuya velocidad depende tanto de la temperatura, humedad y porosidad del
suelo, como del tipo de hidrocarburo y cantidad vertida. Mientras más liviano sea el
hidrocarburo presenta una evaporación mayor y tiende a fluir más rápidamente por el
camino más permeable. 60
En cuanto a la biota terrestre, (animales inferiores y microorganismos), aquellos que
habitan su superficie como en el caso de: arañas, ciempiés-carnívoros de la cadena
alimenticia-, pueden huir rápidamente en el caso de un derrame de crudo, en cambio
aquellas especies que viven en el suelo subsuperficial como: lombrices, cochinillas,
bacterios, hongos, y algas -participan de forma directa en el proceso de formación del
suelo, -presentan un desplazamiento muy lento y mueren irremediablemente. 61
Las respuestas fisiológicas de las plantas expuestas a diferentes tipos de hidrocarburos
fueron estudiadas por Baker en 197062 y están representadas en la reducción en la
respiración, transpiración, fotosíntesis, germinación y crecimiento. Otro tipo de efectos de
los derrames de hidrocarburos en la vegetación han sido evaluados y citados por diversos
autores y se pueden resumir en: la reducción de la cobertura vegetal del lugar afectado
por el derrame, la inhibición de la germinación y un marcado retraso en el crecimiento de
60 RESTREPO, MANRIQUE RICARDO. Impacto Ecológico de un Derrame de Hidrocarburos en la Fauna y Flora del Ecosistema Suelo. Ecopetrol. Bogotá. 1996.
61 Ibid. 62 BAKER, J.M. The effects of Oils on plants. Environ. Poll. 1970, No. 1, p. 27-44, citado por RESTREPO, MANRIQUE RICARDO. Impacto Ecológico de un Derrame de Hidrocarburos en la Fauna y Flora del Ecosistema Suelo. Ecopetrol. Bogotá. 1996.
31
ciertas especies de importancia agroindustrial, y la necrosis foliar que presentan las
plantas maderables en ecosistemas forestales. 63
2.3.2.2 Determinación de hidrocarburos en suelo. Para la determinación de los
hidrocarburos presentes en suelo existen una serie de técnicas instrumentales de análisis
especializadas en las diferentes fracciones de hidrocarburos; dentro de las más utilizadas
se puede encontrar la espectrofotometría de absorción UV-visible, la espectrofluorimetría ,
la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía de líquidos de alta resolución. Esta
última será utilizada para el desarrollo de la investigación, por lo cual será explicada a
continuación:
• Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). La cromatografía es un
método de separación de los constituyentes de una mezcla mediante una adsorción
selectiva por sólidos o una partición entre solventes que interactúan con un analito de
interés. De acuerdo con la interacción entre el analito y la fase estacionaria la
cromatografía puede desarrollarse en diferentes fases: Cromatografía fase normal,
Cromatografía fase reversa, Cromatografía de intercambio iónico, Cromatografía de
exclusión y Cromatografía de afinidad.
La versatilidad y eficiencia de la cromatografía en fase reversa se ha visto incrementada
con el uso de sistemas de alto desempeño "High Performance Liquid Chromatography"
(HPLC) que utilizan alta presión para mejorar la resolución y reducir los tiempos de
separación de los compuestos del analito de interés.64
63 RESTREPO, MANRIQUE RICARDO.;Op cit. 64 La cromatografia en fase reversa. [online]. Disponible en: http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/Eprpc.html#ejemplo
32
Los sistemas de alto desempeño pueden también emplearse en otros tipos de
cromatografías, de manera que para referirse a la cromatografía en fase reversa en
sistemas de alto desempeño se emplea la abreviatura HPLC-RPC.65
La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es su fase estacionaria, la cual
es de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados,
insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una
matriz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías en la fase móvil se emplean
mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y
alcoholes alifáticos66, que deben cumplir con las siguientes características: estar
disponible en el mercado, ser compatible con el sistema de detección., presentar bajos
niveles de trazas, tener una alta pureza y estabilidad, estar desgasificados, ser misible
con otros solventes para formar mezclas útiles y finalmente, no degradar o disolver la fase
estacionaria
En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografía ha sido también llamada como
cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Las moléculas se retienen en la columna
debido a las interacciones hidrofóbicas que establecen con la sílica modificada. Aunque,
las interacciones hidrofóbicas son en general bastante débiles, son también a menudo
muy numerosas y para eluír las moléculas es casi siempre necesario disminuir la
polaridad del disolvente; para ello se puede sustituir el agua de la fase móvil con un
solvente orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente. 67
65 La cromatografia en fase reversa. [online]. Op. cit. 66 Ibid 67 Ibid
33
El sistema HPLC completo que se muestra en la figura 4, requiere una mezcladora de
solventes, un inyector, una bomba que inyecta líquido a la columna, y un detector a la
salida de esta (generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia). Generalmente
las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la
mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector
permite la aplicación de la muestra.
Figura 4. Configuración sistema HPLC.
En los sistemas modernos, el análisis de la información obtenida se realiza mediante una
computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar
la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido.
Al hacer la inyección de un analito, y este al ser detectado se observan gráficas llamadas
cromatogramas que permiten observar picos que se relacionan según su "tiempo de
34
retención (tR)” con estándares, que permiten identificar los compuestos presentes en la
mezcla; entendiéndose que tR es el tiempo que tarda un analito en migrar y en interactuar
con la columna.
Por otra parte, la eliminación de los contaminantes nombrados anteriormente
(hidrocarburos), se puede realizar de forma natural o artificial por medio de diferentes
tipos de técnica que serán comentadas a continuación.
2.4 REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEO.
Los diferentes compuestos que se encuentran presentes en el petróleo, se pueden
clasificar según su composición y estructura química en hidrocarburos degradables y
compuestos polares relativamente no degradables. Los hidrocarburos junto con los
compuestos polares se conocen como petróleo total y grasa, mientras que la fracción de
hidrocarburos se conoce como Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH). La degradación
del petróleo se puede cuantificar según las variaciones de los TPH presentes en un
medio contaminado. 68
Como se dijo anteriormente, los hidrocarburos de petróleo son compuestos intermedios
entre altamente y difícilmente degradables que han penetrado a la biosfera a través de la
filtración y la erosión durante millones de años, desarrollando rutas naturales para su
degradación como la atenuación natural. Adicionalmente, se han generado procesos de
tratamiento o remediación de suelos afectados por derrames de crudo como la
bioventilación, biolabranza y otras como la bioaumentación. En general, las técnicas y
procesos de biorecuperación de suelos contaminados con petróleo requieren de un
68 SRINIVASAN, NERALLA Y WEAVER, RICHARD W. Inoculants and Biodegradation of Crude Oil Floating on Marsh Sediments. Battelle Memorial Institute. Bioremediation Journal. 1997. p. 89-96..
35
manejo apropiado de ciertos parámetros para optimizar la degradación; algunos de dichos
parámetros son: los niveles de Hidrocarburos totales de petróleo (TPH´s) en el suelo,
aireación y mezcla, adición de nutrientes fertilizantes, pH y control de humedad.
En la recuperación de suelos contaminados por hidrocarburos, se presentan diferentes
procesos que permiten la disminución del contaminante, algunos naturales y otros
asistidos. A continuación se explican los más representativos.
2.4.1 Atenuación natural. La atenuación natural es un remedio pasivo que depende de
procesos naturales para degradar y disipar los contaminantes en el suelo y en la
superficie del agua. Se constituye en un conjunto de procesos físicos, químicos y
biológicos que bajo condiciones favorables actúan sin la intervención del hombre, en la
reducción de la masa, toxicidad, movilidad, volumen, o concentración de contaminantes y
otras sustancias orgánicas presentes en suelos o aguas subterráneas.69
Los procesos que se dan dentro de la atenuación natural se pueden dividir según sus
características en: físicos, químicos y biológicos. Los procesos físicos y químicos se
subdividen en: dispersión y dilución, adsorción, volatilización y estabilización química. La
parte biológica representa uno de los componentes más importantes de la atenuación
natural y consiste principalmente en los procesos de biodegradación y transformación
biológica de los contaminantes hasta lograr su estabilización o destrucción.
A continuación se relacionan los principales procesos físicos y químicos que se presentan
dentro de la atenuación natural y posteriormente en los subsiguientes numerales se
explicará a fondo los procesos biológicos.
69 US EPA [online]. Monitored natural attenuation of petroleum hydrocarbons: remedial technology fact sheet, mayo del 1999, EPA/600/F-98/021.
36
2.4.1.1 Adsorción. El suelo y los sedimentos a través de los cuales se mueven los
contaminantes, pueden adsorberlos, es decir que dichas moléculas pueden quedar
adheridas a las superficies de las partículas del medio a través de enlaces químicos que
resultan mucho más fuertes que las uniones físicas. Dentro de este fenómeno también
se debe tener en cuenta la retención de fracciones líquidas del contaminante de alta
densidad, en los poros del suelo. La consecuencia principal de la adsorción es que
disminuye o detiene completamente el movimiento de los contaminantes .70
La adsorción se ve afectada por varios factores de los cuales los más importantes son: las
propiedades del contaminante (estructura molecular, carga, polaridad y solubilidad en
agua) y las propiedades del terreno (contenido de arcillas y compuestos orgánicos, pH,
humedad y temperatura).71
En general, un aumento de temperatura o de humedad se traduce en una menor
adsorción del contaminante por parte del terreno. 72
2.4.1.2 Dispersión y Dilución. A medida que los contaminantes se desplazan más
lejos del lugar de la contaminación o derrame puntual se van dispersando y diluyendo
hasta llegar a concentraciones muy bajas. Este fenómeno también se presenta cuando
hay lavados del terreno, ya sea por infiltración o por escorrentía. 73
70 US EPA [online]. Monitored natural attenuation of petroleum hydrocarbons: remedial technology fact sheet. Op. cit 71 Ibid 72 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 51 73 US EPA [on line]. Monitored natural attenuation of petroleum hydrocarbons: remedial technology fact sheet.; Op. cit.
37
2.4.1.3 Volatilización. Muchos hidrocarburos de petróleo pueden evaporarse
fácilmente del suelo a la atmósfera en donde las corrientes de aire pueden dispersar los
contaminantes, reduciendo su concentración. La tasa de volatilización de un
contaminante en un terreno es función de su concentración, de su presión de vapor, y su
solubilidad en agua.74
Al igual que la dispersión, a medida que aumenta la temperatura aumenta
apreciablemente la volatilización, al igual que con la turbulencia del aire cercano a la
superficie. Otros factores que influyen en la tasa de volatilización incluyen, la porosidad
del sitio, la humedad, el contenido de materia orgánica, y de arcilla en el suelo.75
2.4.1.4 Estabilización Química. Algunos contaminantes se degradan a partir de
reacciones químicas. La mayoría de los hidrocarburos no pueden ser degradados a través
de este proceso.
2.4.2 Biodegradación. Uno de los componentes más importantes de la atenuación
natural es la biodegradación ya que permite la contención de la pluma de hidrocarburos
de petróleo y a la reducción de las concentraciones de los contaminantes.
La biodegradabilidad de los hidrocarburos de petróleo, está afectada en gran medida por
su estado físico y toxicidad. Puesto que el petróleo es una mezcla compleja, su
74 US EPA [on line]. Monitored natural attenuation of petroleum hydrocarbons: remedial technology fact sheet.; Op. cit. 75 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.. p: 51
38
degradación se favorece por una población variada de microorganismos con amplia
capacidad enzimática. La degradación inicial de estos compuestos requiere
frecuentemente la acción de enzimas oxigenasas; por consiguiente, las condiciones
aerobias son necesarias para romper inicialmente los hidrocarburos. En subsecuentes
etapas, los nitratos y sulfuros pueden servir como aceptores terminales de electrones pero
el oxigeno es el que se más se utiliza comúnmente.76
Se debe tener en cuenta que la biodegradación de los hidrocarburos depende tanto de los
microorganismos capaces de degradarlos como de la estructura química del compuesto a
degradar.
2.4.2.1 Microorganismos Degradadores de Petróleo. La comunidad microbiana del
suelo usualmente incluye una gran cantidad de especies capaces de utilizar los
hidrocarburos como fuente de carbono y energía dentro de sus procesos metabólicos.
Dichas especies pueden aumentar fácilmente su número en respuesta a eventos de
contaminación del suelo con hidrocarburos, pero su población y eficiencia se pueden ver
afectadas cuando se presentan varios contaminantes tóxicos a la vez, por lo que se
requieren poblaciones mixtas de microorganismos con diferentes y amplias capacidades
enzimáticas para degradar mezclas complejas de hidrocarburos como el petróleo
crudo.77,78,79
76 BARTHA, R.; Op. cit.. 77 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R. Microbial Degradation of Hidrocarbons in the Enviroment. Microbiological Reviews. 1990. p. 308 . 78 SANJEET, et al.; Op. cit.
79 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA.; Op. cit.
39
Las cantidades de microorganismos degradadores de petróleo en el suelo reflejan el
estado de contaminación del mismo.
Las bacterias y hongos oxidadores de hidrocarburos son los principales agentes de la
descomposición del petróleo y sus derivados, los cuales se desarrollan rápidamente sobre
la superficie del petróleo. 80
Ya que los hidrocarburos alifáticos no son fermentables, para que se produzca una
oxidación significativa de los hidrocarburos es necesaria la presencia de O2; si el petróleo
esta en condiciones anóxicas, su descomposición será muy lenta y puede permanecer en
el mismo lugar durante muchos años. Incluso en ambientes óxicos, los microorganismos
oxidadores de hidrocarburos pueden actuar solo si otras condiciones ambientales como
temperatura, pH y concentración de nutrientes inorgánicos, son las adecuadas. 81
Debido a que el petróleo es insoluble en agua y menos denso, flota y forma manchas en
la superficie. Las bacterias oxidadoras de hidrocarburos pueden atacar las gotículas
insolubles de petróleo y a menudo pueden verse en grandes cantidades. La acción de
estas bacterias lleva a la descomposición del petróleo y a la dispersión de las gotículas. El
petróleo puede ser degradado biológicamente por una gran variedad de microorganismos,
entre los cuales se encuentran las pseudomonas, varias corinebacterias y micobacterias,
e incluso algunas levaduras. 82
En la eliminación de vertidos de petróleo, los microorganismos actúan oxidando el
petróleo a CO2. Cuando se producen grandes vertidos, las fracciones de hidrocarburos
volátiles se evaporan rápidamente, quedando los componentes aromáticos y alifáticos de
cadena larga para que sean eliminados por los microorganismos. En algunos vertidos
80 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.TOp. cit. p. 582 81 Ibid 82 Ibid.
40
estudiados se ha visto que las bacterias oxidadoras de hidrocarburos han aumentado su
número de 103 a 106 veces, poco tiempo después de producirse el vertido. En
experimentos llevados a cabo con hidrocarburos radioisotópicos mediante el consumo de
O2 para medir la actividad heterotrófica, se ha visto que, en condiciones ideales, hasta un
80% de los componentes no volátiles son oxidados por bacterias en los seis primeros
meses después de producirse el vertido, sin embargo determinadas fracciones, como los
hidrocarburos con cadenas laterales y los hidrocarburos policíclicos, permanecen en el
ambiente por mas tiempo. 83
Añadiendo nutrientes inorgánicos, como fósforo o nitrógeno a las zonas afectadas, se
puede acelerar de manera significativa el proceso de biorremediación.
• Fenómeno de Adaptación. La exposición de las comunidades microbianas a
hidrocarburos, ya sea por fuentes antropogénicas o naturales aumenta su potencial de
oxidación de los hidrocarburos, fenómeno conocido como adaptación. Existen tres
mecanismos relacionados, a través de los cuales puede ocurrir la adaptación de una
comunidad microbiana a la presencia de hidrocarburos en su medio:84
- Inducción y/o depresión de enzimas especificas. Cuando un microorganismo se
encuentra en una condición ambiental completamente desconocida, busca la manera
de utilizar lo que tiene para su sobrevivencia; es decir que puede explotar alguna
capacidad enzimática existente para degradar un compuesto nuevo y sobrevivir a
dicha condición. Ejemplos de este tipo de situaciones se ven en utilización de
83 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Op. cit., p. 583. 84 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 309
41
enzimas dedicadas a la degradación de lignina, para degradar PAH`s por algunos
hongos. 85
- Cambios genéticos para desarrollar nuevas capacidades metabólicas. Los
microorganismos pueden intercambiar material genético con organismos similares
por medio de mecanismos celulares de transferencia, de organismos distantes e
inclusive completamente diferentes por transducción o del medio por transformación.
El material genético integrado puede enriquecer el repertorio metabólico de la
bacteria incluyendo nuevas funciones como la degradación de compuestos
xenobióticos. 86
- Enriquecimiento selectivo del medio contaminado. Representado en el incremento
del número o proporción de microorganismos que pueden utilizar los compuestos de
interés, dentro de la comunidad bacteriana del suelo en estudio. Esto se ve
representado en el aumento del número y proporción de los microorganismos que
pueden utilizar hidrocarburos, dentro de la comunidad heterotrófica del suelo, cuando
este es expuesto a petróleo u otros hidrocarburos contaminantes.87,88
• Metabolismo microbiano. Casi todos los microorganismos degradores de petróleo
son eubacterias, aunque pueden presentarse algunos arqueobacterios y eucariotes.
Muchos de estos microorganismos presentan actividad de peroxidasa y oxigenasas, que
permiten la oxidación de algunas fracciones de petróleo. Esta oxidación cambia las
propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y
85 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA.; Op. cit. 86 Ibid. 87 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 309 88 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA.; Op. cit.
42
facilitando su conversión a dióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es
necesario llegar a una mineralización de los contaminantes sino que basta una oxidación
para disminuir notablemente su toxicidad, o aumentar su solubilidad en agua,
incrementando su biodisponibilidad. 89
2.4.2.2 Biodegradación de hidrocarburos. De igual forma, la biodegradación de los
hidrocarburos difiere según la estructura química del compuesto. Por ejemplo, el potencial
de degradación de los alcanos es una función de la longitud de la cadena de carbonos.
Las cadenas cortas (entre 6 y 12 carbonos), tienden a ser tóxicas como resultado de su
alta solubilidad lo cual puede inhibir el crecimiento de los microorganismos
degradadores.90 En cambio, las cadenas largas de hidrocarburos alifáticos son fácilmente
degradadas por una extensa variedad de microorganismos en condiciones aeróbias. 91 En
el caso de los compuestos cíclicos como los PAH, la degradación se dá en varias etapas
por lo que requiere una mayor cantidad de tiempo en completarse.
A continuación se mencionaran algunas de las principales consideraciones que se deben
tener en cuenta al momento de bioremediar los diferentes tipos de hidrocarburos:
• Biodegradación de Hidrocarburos alifáticos. Dentro de la familia de los
hidrocarburos alifáticos, los procesos de biodegradación más conocidos son los de los
alcanos, y en especial, los de estructura lineal. Sin embargo, los compuestos de este tipo
que presentan un número de carbonos entre C5 y C10 requieren procesos de
89 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA.; Op. cit. 90 CUNNINGHAM C. J. Y PHILP J. C. Comparison of Bioaugmentation and Biostimulation in ex situ Treatment of Diesel Contaminated Soil. Land Contamination & Reclamation, 8 (4), 2000. p. 261 91 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 305
43
cometabolismo para su degradación pero en altas concentraciones, inhiben la
degradación de muchos hidrocarburos debido a su característica de solvente, generando
la ruptura de la membrana lipídica. Por otro lado, los alcanos con numero de carbonos
entre C20 a C40 (tales como las ceras) son sólidos hidrófobos, por lo cual su baja
solubilidad interfiere con su biodegradación. 92
Generalmente, la degradación de alcanos genera productos oxidados los cuales son
menos volátiles que los compuestos de donde proceden. Sin embargo, estos alcanos
iniciales son altamente volátiles y pueden ser removidos primeramente del suelo a través
de arrastre por aire bajo condiciones aerobias. 93
Para que los microorganismos puedan degradar alcanos primero deben de oxidar con
oxigeno el último carbono de la molécula gracias al complejo multienzimático que no hace
mas que incorporar esta molécula de oxigeno. Así se obtiene un hidrocarburo con un
grupo alcohol siendo así una molécula mas reactiva. Mediante otras enzimas este grupo
alcohol se oxida mas hasta grupo aldheído y finalmente carboxílico. Así se obtiene una
molécula similar a un ácido graso y puede ser degradado a acetil-CoA por β-oxidación.
Este proceso de oxidación también puede darse en carbonos no terminales dando lugar a
dos ácidos grasos que se procesarán por β-oxidación.94 Todo este proceso se puede ver
representado en la figura 5.
En el caso de los alifáticos insaturados, se posee muy poca información sobre sus
procesos de biodegradación y los alicíclicos presentan un potencial de degradación
92 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 132-133 93 Ibid. 94 Degradación de hidrocarburos. (on line). Disponible en:
http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs02-3/RBurgos/dades/alifaticos#alifaticos
44
variable que depende del tipo de sustituciones que presenten así como de la
complejidad de sus estructuras.95
• Biodegradación de Hidrocarburos aromáticos. Diversos compuestos aromáticos
están presentes en el petróleo, incluyendo compuestos de uno a cinco anillos y
aromáticos alquil sustituidos. El compuesto aromático más simple es el benceno. Además
del benceno, el tolueno, el etilbenceno y los tres xilenos, conocidos colectivamente como
BTEX, están entre los más solubles en el agua y son los componentes más móviles de la
gasolina convencional. Estos compuestos orgánicos volátiles son algunos de los más
potencialmente peligrosos, especialmente benceno, el cual es cancerigeno. Por esto los
BTEX frecuentemente son usados como indicadores de contaminación de suelos y aguas
subterráneas.96
Figura 5. Proceso de biodegradación de alcanos.
Fuente: Degradación de hidrocarburos. (on line). Disponible en: http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs02-03/RBurgos/dades/alifaticos#alifaticos
95 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 132-133 96 Ibid; p: 134-135
45
Algunas consideraciones en la degradación microbiológica de los hidrocarburos
aromáticos se presentan a continuación:
- Los compuestos basados en anillos de benceno son mineralizados por modos de
metabolismo aeróbio y degradados por modos de metabolismo anaerobio. La
facilidad de degradación tanto en la etapa aerobia como en la anaerobia depende del
número, tipo y localización de las sustituciones químicas que presenten los anillos
bencénicos.97
- Los microorganismos aeróbios capaces de degradar este tipo de compuestos son
ubicuos en suelo. 98
Los microorganismos que utilizan estos compuestos aromáticos como fuente de carbono,
en lugar de utilizar una enzima monooxigenasa específica para cada molécula diferente,
utilizan unas vías bioquímicas llamadas vias altas o periféricas que consisten en modificar
los diferentes anillos aromáticos absorbidos en protocatecuato y catecol. A partir de estas
dos moléculas que convergen todos los compuestos, ya se puede llevar a cabo el
rompimiento del anillo mediante enzimas específicas. Esta segunda fase en la
degradación seria lo que se conocería como vías bajas,99 en las cuales el protocatecuato
y catecol son degradados a compuestos que pueden entrar en el ciclo del ácido citrico:
succinato, acetil-CoA y Pirubato100. Las figuras 6 y 7 muestran el proceso de degradación
de un hidrocarburo aromático.
97 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 134-135 98 Ibid. 99 Degradación de hidrocarburos. (on line). Op. cit 100 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Op. cit. p. 523
46
Figura 6. Hidroxilación del benceno a catecol por una monoxigenasa
Fuente: BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Biologia de los Microorganismos. Prentice-Hall. 8. 1997. Englewood Cliffs, NJ. p. 524
Figura 7. Ruta metabólica de catecol a Acetil-CoA.
Fuente: Degradación de hidrocarburos. (on line). Disponible en: http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs02-03/RBurgos/dades/alifaticos#alifaticos.
47
• Biodegradación de Hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH). Los
hidrocarburos policíclicos aromáticos son contaminantes en industrias y rellenos
incontrolados de residuos peligrosos. Para los PAHs en general, un incremento en el peso
molecular y en el número de anillos en su estructura produce un decremento en la
solubilidad y volatilidad e incrementa la capacidad de adsorción.101
Los hidrocarburos policíclicos aromáticos se degradan, un anillo cada vez, por
mecanismos similares a los que se utilizan para compuestos aromáticos. La
biodegradación de PAH tiende a disminuir con el incremento del numero de anillos y con
el incremento del numero de sustituyentes alquilos.102
2.4.2.3 Efecto del suelo en la biodegradación de hidrocarburos. Cuando ocurre un
derrame de petróleo en un ecosistema terrestre, el desplazamiento y distribución de los
hidrocarburos en el suelo puede afectar su naturaleza tanto física como química y de esta
forma su susceptibilidad a la degradación microbiana.103
Los derrames de petróleo en suelo se caracterizan principalmente por presentar un
desplazamiento vertical más que horizontal, lo que significa que los hidrocarburos se
infiltran en su interior, esto previene y limita las perdidas por evaporación de la fracción
volátil que puede ser tóxica para los microorganismos. El material particulado del suelo,
puede disminuir por absorción la toxicidad efectiva de los compuestos del petróleo, pero
101 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 134-135 102 .Ibid. ; p:136 103 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 306
48
los procesos de adsorción y absorción de hidrocarburos en las sustancias húmicas
pueden contribuir a la formación de residuos persistentes.104
Una vez ocurrido el derrame, el proceso de biodegradación de hidrocarburos en el suelo
se da de forma natural, ya que estos contaminantes representan una fuente de carbono
(C) para los microorganismos, a partir de la cual obtienen la cantidad necesaria de este
elemento para producir biomasa, compuestos celulares y productos metabólicos como
CO2, agua y enzimas. Para que los microorganismos puedan llevar a cabo estos
procesos, además de la fuente de C, se requiere la presencia de nutrientes en el medio
como el nitrógeno (N) y el fósforo (P) en una relación C:N:P de 100 a 300:10:1
respectivamente.105
La concentración total de hidrocarburos puede ser un limitante para los procesos de
biodegradación en suelos ya que se ha demostrado que en ambientes terrestres con una
concentración de petróleo de 1.2 a 5 % de masa de hidrocarburos por peso seco de
suelo, se presenta un incremento de la evolución del CO2 (resultado del metabolismo
microbiano), en una concentración del 10% no se presenta ningún incremento en la
evolución del CO2, y en concentraciones del 15% esta evolución presenta un decremento,
lo que se puede interpretar como una inhibición de la actividad microbiana debida a los
componentes tóxicos de los hidrocarburos. 106
2.4.3 Biorremediación. La bioremediación es una tecnología que tiene como objetivo
acelerar la biodegradación natural de los compuestos orgánicos, mediante la optimización
104 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 306 105 EWEIS et al. Op cit. p.306 106 Ibid; p. 307
49
de las condiciones limitantes del proceso107 y es definida por la Academia Americana de
Microbiología como el uso de organismos vivos para reducir o eliminar riesgos
ambientales que resultan de la acumulación de desechos peligrosos.108
En la bioremediación de contaminantes, diversos grupos de microorganismos pueden ser
necesarios para degradar y/o mineralizar completamente un compuesto. Estos grupos de
microorganismos se conocen como asociaciones sintróficas que consisten en dos o más
organismos que viven en estrecha proximidad uno a otro interactuando entre sí. Está
generalmente implica una interacción positiva, donde un grupo se beneficia de las
acciones del otro. 109
Se ha encontrado, que especies aisladas a partir de cultivos puros a las cuales se les
proporciona un compuesto determinado como fuente de carbono, son incapaces de
mineralizarlo. 110 111 En cambio en una asociación de microorganismos, los consumidores
primarios inician el proceso de degradación y los consumidores secundarios utilizan los
productos metabólicos de los primeros para degradarlos. Además pueden facilitar el
crecimiento de los primarios, suministrándoles productos metabólicos (como factores de
crecimiento), eliminando tóxicos mediante cometabolismo y produciendo intercambio de
material genético. 112
Para el caso del tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos se requiere una
concentración mínima de microorganismos degradadores específicos de 103 a 104 UFC /
107 MOTRAS BOET A. Y VINCENT HUGUET T. Op. cit 108 CANTÚ, MARTINEZ PEDRO CESAR. La Biorremediación. [online] Facultad de Salud Pública y Nutrición. México. 1998 109 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R.; Op. cit.; p. 305
110 SALANITRO, J.P. et al. Isolation of a Bacterial Culture that Degrades Methyl t-buthyl Ether. Applied and Enviromental Microbiology. Vol.60. No.7. 1994. P. 2593-2596 111 WOLFAARDT, G.M. et al. The role of interactions, Sessile Growth and the nutrient Amendments on the Degradative Efficiency of a Microbial Consorstium. Canadian Journal of Microbiology. Vol. 40. P: 331-340. 1994
112 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 82
50
g. suelo (UFC: unidades formadoras de colonias) y de microorganismos heterótrofos
totales de 105 a 106 UFC / g. de suelo. En este caso generalmente no se necesita
inoculación. Si esta masa crítica no es suficiente se pueden incorporar microorganismos
al suelo mediante inoculación o a través del proceso conocido como bioaumentación.
También se puede lograr un incremento importante estimulando la población microbiana
existente por incorporación de nutrientes.
Los contaminantes orgánicos que son susceptibles de una degradación microbiana como
la que se explico anteriormente son: productos de petróleo (gasolina, diesel,
combustibles), compuestos peligrosos del petróleo (benceno, xileno, tolueno (BTEX),
hidrocarburos policíclicos aromático (PAH), naftaleno, benzopyrina, etc), pesticidas como
el malatión, compuestos de carbón (fenoles y cianhídricos, en carbón de hulla y desechos
de coque), solventes industriales como la acetona, éteres, alcoholes simples tales como
metanoles y otros contaminantes en agua subterranea, incluyendo metil etil kenona y etil
glicol. 113
Existen sustancias de origen antropogénico (xenobióticas) o que son producto de una
mezcla de desechos que no son susceptibles de degradación o son parcialmente
degradables ya que son tóxicas para los microorganismos, los cuales no cuentan con
sistemas enzimáticos que las ataquen. Estas sustancias se conocen como no
biodegradables o recalcitrantes y algunos ejemplos de ellas son: Derivados del petróleo:
plásticos, pesticidas, refrigerantes y retardantes de flama; tricloro etileno, percloroetileno,
bifenilos policlorados, dioxinas, arsénico y metales pesados como: uranio, mercurio y
cromo; estas sustancias no son biorremediables pero los microorganismos los
bioacumulan.114,115
113 CANTÚ, MARTINEZ PEDRO CESAR.; Op. cit. 114 Ibid.
51
El proceso de bioremediación del suelo se puede realizar directamente en el sitio
contaminado (in situ), ó se puede remover para ser tratado (ex situ) y finalmente ser
devuelto a su origen una vez recupere sus características iniciales. Las técnicas más
utilizadas en la actualidad para tal fin se caracterizan por presentar soluciones que
generan la menor cantidad de impactos negativos en el ambiente y una recuperación
relativamente rápida de los terrenos afectados, algunas de ella son:
• Bioventing. Técnica in situ que consiste en la ventilación forzada del suelo mediante
la inyección a presión de aire en la zona contaminada a través de pozos de inyección.116
• Biopilas. Técnica ex situ que consiste en la formación de pilas de material
biodegradable de dimensiones variables, formadas por suelo contaminado y materia
orgánica (compost) en condiciones favorables para el desarrollo de los procesos de
biodegradación de los contaminantes. 117
• Bioaumentación. Consiste en la inoculación, en los suelos contaminados, de
consorcios de microorganismos degradadores de hidrocarburos, aislados de otros suelos
contaminados o de cepas manipuladas en laboratorio para tal fin. La aplicación de esta
técnica puede aumentar considerablemente las tasas de biodegradación de petróleo que
generan los microorganismos nativos del lugar afectado. 118,119
115 VALDERRAMA, BLANCO BRENDA.; Op. cit.
116 MAROTO ARROYO, MARIA E. y ROGEL QUESADA, JUAN M. Aplicación de sistemas de biorremediación de suelos y aguas contaminadas por hidrocarburos. GEOCISA. Div. Protección Ambiental de Suelos. 117 Ibid. 118 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit.; p. 310 119 SANJEET, et al.; Op. cit.
52
• Biolabranza (Landfarming). La biolabranza o landfarming es un tratamiento o
tecnología de remediación superficial de tierra que reduce concentraciones de petróleo a
través de la biodegradación. En este tratamiento básicamente se realiza una excavación
extendida de suelo contaminado y una estimulación a la actividad aerobia microbiana
mediante la aireación, adición de minerales, nutrientes y humedad.
Esta técnica es efectiva ya que permite una reducción de las concentraciones de casi
todos los constituyentes de los productos del petróleo (fracción volátil: gasolina y fracción
no volátil: aceites calientes y lubricantes); cuando se esta llevando a cabo el proceso de
landfarming se debe tener en cuenta que existen mas de 100 tipos de petróleo con amplio
rango de volatilidad, entre ellos encontramos la gasolina, el querosene y el diesel los
cuales poseen componentes con suficiente volatilidad para evaporarse; los mas volátiles
tienden a ser removidos por evaporación durante los procesos de aireación (cultivando o
arando) y en menor magnitud son degradados por respiración microbiana; los aceites
calientes y lubricantes no se evaporan durante la aireación; los productos como diesel y
querosene contienen más bajos porcentajes de volatilidad que la gasolina, y su
biodegradación es más significante que la evaporación y por ello requieren largos
periodos de tiempo para ser degradados.120
La efectividad de esta técnica está influenciada por ciertos factores ambientales; como lo
son: humedad, aireación, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes como se muestra
a continuación.
120 EWEIS, Juana. et. al.; Op. cit.; p: 196 – 197
53
2.4.3.1 pH. El pH del suelo es importante para el desarrollo de los microorganismos
degradadores, siendo los más adecuados los comprendidos entre 6 y 8. Condiciones
altamente ácidas o alcalinas generalmente inhiben la actividad microbiológica y muchas
bacterias se benefician de las condiciones neutras.
El pH del suelo afecta la solubilidad del fósforo, nutriente importante para los
microorganismos y el transporte de metales peligrosos en el suelo. La solubilidad de este
elemento se maximiza a niveles de pH de 6.5 y el transporte de metales se minimiza a
valores de pH superiores a 6. 121
En la naturaleza existen suelos de carácter ácido o básico. De ser necesaria la
modificación del pH del medio, se pueden adicionar diferentes sustancias como oxido de
calcio (limo), hidróxido de calcio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio y escorias
de silicato de calcio para incrementar el pH; y se usan para disminuirlo ácido sulfúrico,
polisulfuro de amonio y sulfatos de aluminio y hierro.
2.4.3.2 Temperatura. La temperatura tiene una gran influencia en la biodegradación
debido a: su efecto sobre la naturaleza física y química del petróleo, la tasa de
metabolismo microbiano de hidrocarburos, y la composición de las comunidades de
microorganismos. En bajas temperaturas, la viscosidad del petróleo aumenta al igual que
su solubilidad en el agua y se reduce la volatilización de las cadenas cortas tóxicas de
alcanos, esto puede retardar o detener por completo el proceso de biodegradación ya
que las comunidades microbianas se pueden ver afectadas por la toxicidad de dichos
compuestos. Las temperaturas altas incrementan al máximo las tasa de metabolismo
121 SIMS, J.L. et al. Approach to Bioremediation of Contaminated Soil. Hazardous Waste and Hazardous Materials. Vol. 7 (4). 1990. Pags. 117-149
54
microbiano de hidrocarburos ya que se intensifica su actividad enzimática. El rango de
temperatura más apropiado para la biorremediación se presenta entre 30 y 40 ºC, por
encima de este rango la toxicidad de los hidrocarburos aumenta. 122, 123
2.4.3.3 Oxigeno. Las primeras etapas del catabolismo de los hidrocarburos alifáticos,
cíclicos y aromáticos por parte de microorganismos y hongos incluyen la oxidación del
sustrato por oxigenasas por lo que es necesaria la presencia de oxígeno molecular en el
medio. Por esta razón, son necesarias las condiciones aeróbias para que la
biodegradación se pueda realizar por esta ruta. La concentración de oxígeno es una
variable limitante para las tasas de degradación de los hidrocarburos, si el contenido de
oxígeno en el suelo es muy bajo algunas porciones del medio pueden volverse
anaeróbicas y afectar de manera negativa la biodegradación 124, 125
La oxigenación del medio se puede hacer de varias maneras, mediante el volteo manual o
mecánico, ventilación y / o aspersión de aire y el suministro de peroxido de hidrógeno, el
cual resulta económico y representa mayor facilidad de manejo; además tiene mayor
capacidad de disolverse en el agua que el oxigeno.126 Estas técnicas además de
favorecer el suministro de oxígeno al suelo, permiten la volatilización de los compuestos
tóxicos.
122 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit. 123 SRINIVASAN, NERALLA Y WEAVER, RICHARD W.; Op. cit. 124 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit. 125 WENTZ, CHALES A.. Hazardous Waste Management Second Edition. McGraw-Hill International Editions. 1995. p. 224-235.. 126 PARDIECK, D. et al. Hydrogen peroxide use to increase oxidant capacity for in situ bioremediation of contaminated soils and aquifers. Citado por: CARDONA S. y ITURBE R. Biodegradación de diesel mexicano por un consorcio de bacterias de un suelo agrícola. Instituto de Ingeniería, Coordinación de Ingeniería Ambiental, Grupo de Saneamiento de suelos y acuíferos. UNAM, México. 2003 . Disponible online: http://www.minas.unalmed.edu.co/facultad/publicaciones/dyna/138/BIODEGRADACI%D3N%20DE%20DIESEL.pdf
55
2.4.3.4 Capacidad de retención de agua y humedad. La biodegradación en
ecosistemas terrestres puede ser limitada por la cantidad de agua disponible en el medio
para el crecimiento y metabolismo de los microorganismos. La capacidad de retención de
agua en el suelo, en los lugares afectados por derrames de petróleo se ve disminuida por
la presencia de los hidrocarburos en la superficie terrestre. Esto afecta el crecimiento
tanto de microorganismos como de vegetales superiores. Diferentes estudios realizados
reportan que las tasas óptimas de biodegradación se dan cuando la saturación de agua
en el suelo se encuentra en el rango de 30 a 90 %, en valores menores la degradación se
ve inhibida.127, 128
2.4.3.5 Nutrientes. La adición de hidrocarburos al suelo aumenta la cantidad de
carbono (C) disponible en el medio para a actividad metabólica de los microorganismos, si
esto ocurre en lugares donde la concentración de nutrientes inorgánicos como nitrógeno
(N) y fósforo (P) es baja, produce unas relaciones C/N y C/P muy altas.
Debido a que la disponibilidad de N y P en el medio es un factor limitante en la
degradación microbiana, se puede ajustar la proporción C/N/P mediante la adición al
medio de urea- fosfato, fertilizantes N-P-K, y sales de amonio y fosfato y de esta manera
se puede acelerar el proceso de biodegradación.
Algunos investigadores han encontrado que no hay incrementos en la tasa de
degradación después de la adición de N y P al medio o que dichos aumentos se
127 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit. 128 SRINIVASAN, NERALLA Y WEAVER, RICHARD W.; Op. cit.
56
presentan sólo después de varios meses de la aplicación, pero esto puede ser atribuido a
la compleja composición de los suelos y a otros factores como las reservas de nitrógeno y
la presencia de bacterias degradadoras de nitrógeno. 129, 130Las principales ventajas y
desventajas de dicha técnica se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Ventajas y desventajas de la Biolabranza.
VENTAJAS DESVENTAJAS
Diseño e implementación sencilla
Es difícil de lograr reducción de concentraciones mayores al 95% y concentraciones menores a 0.1 ppm
Tiempos de tratamiento cortos (desde 6 meses a 2 años bajo condiciones optimas)
No es efectivo para altas concentraciones (50000 ppm)
Efectivo en constituyentes orgánicos con tasas de biodegradación bajas.
La presencia significativa de metales pesados inhibe el crecimiento microbiano.
Fuente: U.S ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY [on line]. How to Evaluate Alternative Cleanup Technologies for Underground Storage Tank Sites: A Guide for Corrective Action Plan Reviewers. (EPA 510-B-95-007). Ultima actualización marzo, 2001. Disponible en internet: http://www.epa.gov/swerust1/pubs/tums.htm.
129 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.; Op. cit. 130 SRINIVASAN, NERALLA Y WEAVER, RICHARD W.; Op. cit.
57
3. MARCO DE REFERENCIA
En las últimas décadas, se han aplicado diversas técnicas, con variado índice de
éxito para contrarrestar el efecto de la contaminación por hidrocarburos. Una de
las prácticas más comunes que se ha realizado en el pasado, consiste en la
utilización de encapsuladores para estabilizar presas de crudo. Estos productos
absorben el hidrocarburo y lo retienen en su estructura interna.131 En otros casos,
se han aplicado productos a base de detergentes, con el objeto de hacer un
lavado del suelo y así separar la matriz (suelo, sedimento o agua) del hidrocarburo
a un costo considerable. Los surfactantes sintéticos frecuentemente aplicados en
el lavado de suelos, debido a su alta solubilidad, movilizan contaminantes; no
obstante, ellos tienden a inhibir la actividad microbiológica sobre las moléculas del
contaminante.132
A principio de los años 70 se empezó a aplicar la técnica de biolabranza o landfarming la
cual consistía en una supervisión científica de la aplicación de lodos contaminados
directamente al terreno. Esta técnica fue diseñada para optimizar la degradación en un
proceso biológico aerobio, utilizando el suelo como inóculo y medio de soporte para el
131 WINI SCHMIDT. Suelos contaminados con hidrocarburos: la biorremediación como una solución ecológicamente compatible. Cooperación técnica alemana (GTZ). p. 1-2. 132 MATA-SANDOVAL JC, et al., The influence of surfactants and biosurfactants on the bioavailability of hidrophobic organic pollutants in subsurface environments. Citado por WINI schmidt. Suelos Contaminados Con Hidrocarburos: La Biorremediación Como Una Solución Ecológicamente Compatible. Cooperación Técnica Alemana (GTZ). p. 2.
58
crecimiento microbiano. Los resultados obtenidos en investigaciones como la de Dibble y
Bartha en 1979133 han permitido una optimización sistemática del proceso de
experimentación en campo y en laboratorio.
A partir de los años 90, a nivel internacional se han venido desarrollando muchos
estudios, por medio de los cuales se ha demostrado que la fertilización estimula el
proceso de biorremediación de hidrocarburos en suelos. Belloso observó en un estudio in
vitro que la mayor degradación de hidrocarburos en suelos se presentó en un sustrato que
había sido inoculado con una cepa microbiana y al cual se le había adicionado un
fertilizante NPK 20:20:1.134 La adición de fertilizantes para agilizar la biodegradación de
hidrocarburos fue estudiada por otros investigadores como Reynolds quien mediante
comparaciones entre diferentes técnicas de tratamiento para suelos contaminados con
petróleo (landfarming y bioventing) demostró que el landfarming con adición de
fertilizantes fue mas efectivo en el tratamiento de hidrocarburos de cadenas cortas como
el diesel, ya que logró disminuciones notables en las concentraciones de hidrocarburos
totales de petróleo desde 8348 ±291 mg/Kg TPH a 1664 mg/Kg TPH. por lo contrario,
dicho tratamiento no presentó la misma efectividad para los hidrocarburos de cadenas
largas como el petróleo crudo ya que se obtuvieron disminuciones de concentración
desde 6072 ±266 mg/Kg TPH a 4736 mg/Kg TPH. 135
Sanjeet por medio del montaje de seis tratamientos diferentes determinó que la adición de
un consorcio bacteriano y nutrientes en el suelo contaminado con petróleo, obtuvo las
máxima biorremediación, en la cual se redujo la concentración de TPHs desde 91.8 ± 9.2
133 DIBBLE, J.T. and BARTHA, R. Effect of Environmental Parameters on the Biodegradation of Oil Sludge. Applied and Environmental Microbiology, 1979. 37(4): 729-739. 134 BELLOSO CLAUDIO et al., Biodegradación de hidrocarburos en suelos contenidos en terrarios, XXVI congreso interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental. 1998. p. 1-6. 135 CHARLES M. REYNOLDS, et al., Soil remediation demonstration projetc: biodegradation of heavy fuel Oils, 1997.
59
g/Kg suelo a 47.2 ± 5.4 g/Kg suelo, lo que equivale a una reducción del 48.5% en 120
días. Con base en estos resultados realizo un tratamiento a gran escala, en el cual obtuvo
reducciones de TPHs en un 92% después de 360 días; 94.2% alcanos, 91.9% aromáticos,
y 85.2 % NSO2. La degradación de estos compuestos fue llevada a cabo por bacterias
contenidas en un consorcio bacteriano adicionado al suelo las cuales fueron previamente
identificadas como: Acinetobactes baumannii, Burkholderia cepacia y Pseudomonas sp.136
La eficacia del tratamiento de landfarming no ha sido solo demostrada con la aplicación
de fertilizantes inorgánicos sino tambien con la aplicación de sales como NH4NO3 y
K2HPO4, que son adicionados al suelo manteniendo relaciones C:N:P de acuerdo a las
características del suelo a tratar. Salanitro desarrollando tratamientos en campo, observó
que suelos con cantidades de materia orgánica alta y bajo condiciones C:N:P 100:1:0.2,
han requerido elevadas aplicaciones de nutrientes, presentando tasas de degradación
mayores (del 10 al 90%) que suelos que contenían menores cantidades de materia
orgánica, la misma relación C:N:P y requirieron aplicaciones de nutrientes mas bajas
(degradación del 50 al 75%)137.
Para la biorremediación de hidrocarburos de petróleo existe un conjunto de procesos
físicos, químicos y biológicos que reducen la concentración o toxicidad del contaminante
sin que haya intervención del hombre, denominado atenuación natural. Pocos estudios
han evaluado la eficiencia de este tratamiento; uno de ellos evaluó la contaminación con
hidrocarburos de petróleo especialmente tolueno en un sistema de acuífero poco profundo
en Corea, el cual alcanzo la tabla de agua que se encuentra a poca profundidad. Por
medio de monitoreos se determinó que las concentraciones más altas de tolueno se
136 SANJEET MISHRA, Op. cit. 137 SALANITRO JOSEPH H. et al., Crude oil hidrocarbon Bioremediatión and soil ecotoxity assesment. Environmental Science & Technology. Vol.31, No. 6. 1997. p. 1769-1776
60
encontraban cerca de la tabla de agua y que los niveles de este compuesto decrecían por
encima y por debajo de este nivel. Las concentraciones de CO2 bajo la superficie
indicaron actividad microbiana del 10% y del 20% cerca de la tabla de agua. Los procesos
microbiológicos identificados incluyeron respiración aeróbia, reducción de nitratos,
reducción de hierro, reducción de sulfatos y metanogénesis. La mayor concentración de
hidrocarburos en el suelo fue de 2653 mg/Kg, y el proceso de biodegradación por
atenuación fue evaluado por cerca de un 50% en este sitio.138
En Colombia el Instituto Colombiano del petróleo (ICP) ha desarrollado desde los años
80`s tecnologías para el tratamiento de residuos aceitosos y aguas residuales generadas
por la industria del petróleo, en las ciénagas aceitosas del Complejo Industrial de
Barrancabermeja. Estas incluyen procesos de biodegradación estimulada, inyección de
vapor, biosurfactantes y deshidratación entre otras.139 Estas tecnologías han hecho
posible la depuración de aguas y lodos contaminados asociados a la actividad petrolera.
De las técnicas desarrolladas por el ICP, la biodegradación estimulada es una de las más
interesantes ya que al aplicarla se logra recuperar las tierras contaminadas en un periodo
de tiempo aproximado de 15 días con disminuciones del 70 al 80% de los hidrocarburos.
El aislamiento de cepas nativas garantiza que estas ya estén aclimatadas y adaptadas a
las condiciones tropicales lo cual hace que sirvan a nivel nacional y que no sea necesario
realizar procesos específicos para cada tipo de suelos afectados con derrames de
hidrocarburos, además después de que el suelo es sometido a la biodegradación
estimulada este puede ser usado como material de relleno, mezclados con fertilizantes
138 LEE CHEOL-HYO, et al. Attenuation Of Petroleum Hydrocarbons In Smear Zones: A Case Study. Journal of environmental engineering. July 2001. p. 639-647. 139 GROSSO, JORGE. Sistema Integral para el Tratamiento de Lodos Aceitosos y Aguas Residuales de la Industria del Petróleo. Instituto Colombiano de Petróleo, ICP – ECOPETROL. Disponible online: http://www.colciencias.gov.co/simbiosis/percepcion/c1mambiente.htm
61
para enriquecerlos y usarlos de nuevo en el proceso o como de material de cobertura
para sembrar árboles ornamentales140.
Por otra parte, a partir de 1991, en el Centro de Investigaciones Microbiológicas de la
Universidad de los Andes, se han realizado investigaciones sobre diferentes cepas
degradadoras de hidrocarburos de petróleo in vitro, a partir de pooles microbianos de
cepas nativas obtenidas de suelos de la región de Caño limón. Entre 1993 y 1996, se
realizaron estudios sobre la efectividad de este tipo de cepas, en la biorremediación de
aguas contaminadas con petróleo crudo, obteniendo entre el 90 % y 100% de remoción
del contaminante.141
Finalmente en el año 2001, la Unidad de Biotecnología y Saneamiento Ambiental (USBA)
de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ) realizó estudios sobre la biodegradación de
lodos contaminados provenientes de la industria del petróleo en Campo Dina (Huila,
Colombia) que incluían el aislamiento de cepas nativas, la adición de aceptores de
electrones y nutrientes y evaluación de parámetros físicos y químicos necesarios para
llevar a cabo el proceso de biorremediación en un tratamiento ex situ de biolabranza.142
Algunos de las referencias explicadas anteriormente, las cuales describen y analizan
diversas metodologías para biorremediar los suelos contaminados con petróleo de
acuerdo a las condiciones del sustrato y al tipo de contaminante; se describen más
ampliamente en el anexo 1.
140 Microbios que limpian el petróleo derramado. En: Ciencia Tecnología Y Futuro. Instituto colombiano de petroleo ICP - Empresa colombiana de petróleos ECOPETROL. Vol. 1 No 1. Dic 1995. 141 DUSSÁN JENNY, et al. Escalamiento y mantenimiento de bacterias nativas biodegradadoras de crudo y fenol en cultivo contin. Facultad de Ciencias - CIMIC: Centro de Investigaciones Microbiologicas - Microbiología Industrial. Universidad de los Andes. Disponible online: http://wwwprof.uniandes.edu.co/~cimic 142 CLEVES, I y SANDOVAL, M. Evaluación de la Biodegradación de Hidrocarburos presentes en suelos contaminados con Lodos Aceitosos de la Industria Petrolera (HUILA- COLOMBIA). 2001. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad Ciencias Básicas.
62
4 MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio fue de tipo experimental, prospectivo, comparativo desarrollado en
una muestra de suelo procedente de la estación experimental (Finca San Javier) de la
Pontificia Universidad Javeriana ubicada en la vía Zipaquirá – Nemocón (Cundinamarca)
con el cual se evaluó una alternativa de tratamiento para suelos contaminados con
petróleo por medio de un proceso de biorremediación en el que se evaluó la adición de
nutrientes (fósforo y nitrógeno) aplicando la técnica de biolabranza durante un tiempo de
experimentación de 4 meses.
La zona, (planicie aluvial al norte de Zipaquirá), donde fue recolectado el suelo pertenece
a la asociación geológica Granja de acuerdo con estudios realizados por el Instituto
Geográfico Agustín Codazzi y presenta material parental compuesto de arcillas lacustres
recubiertas posteriormente por sedimentos de la Cordillera Oriental. 143
El área presenta clima frío-húmedo transcicional al seco, el relieve es plano con
pendientes de 0-1%. Los suelos son moderadamente profundos e imperfectamente
drenados por lo que en periodos lluviosos sufren encharcamientos. Morfológicamente
presentan horizonte A de 20 a 40 cm de espesor, de color pardo grisáceo oscuro con
manchas rojizas a pardo fuertes y textura arcillosa. El horizonte B es arcilloso de 20 a 30
cm de espesor y color pardo fuerte. Químicamente los suelos son ácidos a muy ácidos,
con alto contenido de carbón y en general de fertilidad baja. 144
143 BURGOS L. Et al. Estudio general de suelos de las provincias de Ubate y norte de la Sabana de Bogotá. Ministerio de Hacienda y Crédito público – Instituto Geográfico Agustín Codazzi, Subdirección Agrícola. 1982. p. 113 - 115 144 BURGOS L. Et al. Op cit.
63
Para llevar a cabo la investigación, Inicialmente se tomaron muestras directas del suelo
de la finca san Javier para análisis físico-químicos y microbiológicos; posteriormente se
recolectó aproximadamente una tonelada de suelo del mismo lugar, el cual fue trasladado
al invernadero de la Pontificia Universidad Javeriana, en donde durante 1 semana fue
regado y volteado. Luego este fue contaminado con petróleo crudo de castilla,
homogenizado y tamizado durante dos días, y del cual se tomaron muestras compuestas
para la determinación de hidrocarburos totales de petróleo (TPHs) y nutrientes (NO3, NH4
y P). Parte de este suelo se dispuso en 6 cajas de polipropileno que se denominaron
unidades experimentales (UE) que fueron llevadas a la Universidad De La Salle y se
localizaron en los laboratorios de Microbiología del departamento de Ciencias Básicas. De
las UE se tomaron muestras iniciales para la determinación de nutrientes que permitieron
luego adicionar un fertilizante inorgánico en tres de ellas y en las tres restantes como
control biótico. Monitoreos de humedad, pH, y temperatura fueron realizados
semanalmente para dos muestras de cada UE al igual que análisis microbiológicos, de
nutrientes y de TPHs una vez por mes durante el periodo de experimentación.
El diseño experimental consistió en el análisis de 2 muestras compuestas para cada una
de las unidades experimentales (UE), cada una formada a partir de 4 muestras puntuales
tomadas por medio de números aleatorios estadísticos. Para la toma de estos muestreos
el suelo contenido en cada unidad fue homogenizado previamente como se explica en el
numeral 4.7.
A partir de las muestras compuestas se tomaron submuestras de diferentes volúmenes
como se puede observar en la tabla 5, para realizar los análisis físicos, químicos y
microbiológicos anteriormente mencionados, para el caso de las mediciones de
humedad, pH y temperatura se llevo a cabo un total de 192 análisis y para el caso de las
pruebas microbiológicas de nutrientes y de TPHs se realizaron un total de 48 análisis
durante el periodo de experimentación.
64
Las etapas desarrolladas para ejecutar la investigación se describen a continuación:
4.1 ANÁLISIS PRELIMINARES DEL SUELO.
Inicialmente fue necesario determinar algunas características tanto físicas como químicas
de dicho suelo para lo cual se tomaron 2 muestras de terrones y 6 muestras puntuales del
sustrato, para ser analizadas en los laboratorios de suelos del Instituto Geográfico Agustín
Codazzi.
La técnica de muestreo consistió en la delimitación de un área de 2 m2 en la cual se
removió la capa vegetal superficial y luego se tomaron del suelo dos muestras de terrones
con un diámetro mayor a 5 cm los cuales fueron empacadas por separado en bolsas
resellables con capacidad de una libra; las muestras puntuales del suelo fueron tomadas
de los primeros 20 cm de profundidad con un peso aproximado de 500 g cada una y
fueron empacadas en bolsas resellables de la misma capacidad. La totalidad de las
muestras fue transportada hasta los laboratorios de la Facultad de Ciencias Básicas de la
Universidad De La Salle, en donde las muestras puntuales fueron mezcladas para obtener
una muestra compuesta de 2 kg.
En el laboratorio de suelos del Instituto Geográfico Agustín Codazzi, se practicaron los
siguientes análisis a las muestras descritas anteriormente: Nitrógeno total (N-NO3, N-NH4)
con extracción KCl (2N) y cuantificación potenciométrica, fósforo (P) asimilable con
extracción por Bray II y cuantificación colorimétrica, densidad aparente por el método del
terrón parafinado y carbono orgánico por el método de titulación de Walkley - Black.
Los análisis de nitrógeno y fósforo fueron necesarios debido a que dichas fracciones
hacen parte de las sustancias necesarias para un correcto desarrollo de los procesos
65
metabólicos microbianos y por ende para que la degradación de hidrocarburos sea más
eficiente. En el caso del nitrógeno, la extracción con KCl (2N) permite cuantificar
específicamente la fracción inorgánica que de dicho compuesto se encuentra en el suelo
(NO3 y NH4), estos compuestos son generados dentro del proceso de mineralización y
representan una evidencia de que dicho proceso se dio en las UE. Para el fósforo se
determinó que el método más apropiado para la determinación de la forma asimilable por
los microorganismos era el Bray II debido a que esta prueba se realiza en suelos con
condiciones de pH ligeramente ácidas a muy ácidas (pH< 6) como se presenta en el suelo
de estudio.145
4.2 RECOLECCIÓN DEL SUELO
En la estación experimental (Finca San Javier) se recogieron 24 bultos de suelo por medio
de un muestreo compuesto.
La técnica utilizada para la recolección del suelo consistió inicialmente en la delimitación
de un área de 15 m2 aproximadamente dentro de la cual se removió la capa vegetal
superficial presente y se tomaron muestras aleatorias excavando hasta una profundidad
aproximada de 20.0 cm, ya que hasta esta profundidad hay variedad de biota microbiana
aerobia; las muestras fueron empacadas en 24 sacos de polietileno que completaron un
peso aproximado de 1 ton.
La cantidad de suelo recolectada fue llevada a las instalaciones de la Pontificia
Universidad Javeriana (Bogotá) y almacenado durante una semana en el vivero del
Departamento de Microbiología-Facultad de Ciencias.
145 OLARTE R LUIS J. et al. Métodos analíticos del laboratorio de suelos. Instituto Geográfico Agustín Codazzi IGAC
66
4.3 ADECUACIÓN Y PREPARACIÓN DEL SUELO
Para mantener el suelo recolectado en condiciones óptimas de humedad y aireación,
éste se colocó a la intemperie sobre polietileno negro calibre 4, realizando un riego y
volteo con manguera y con palas de jardinería respectivamente, una vez por semana
durante un mes, con el fin de mantener la humedad entre 30 – 60%. Este parámetro fue
calculado mediante el método aplicado por el instituto geográfico Agustín Codazzi como
se verá en el numeral 3.6.1. Para evitar la deshidratación del suelo y las pérdidas por
acción del viento, éste fue recubierto con sacos de polietileno.
4.4 DETERMINACIÓN DE LÍNEA BASE
Como línea base debe entenderse el conjunto de características físico-químicas y
microbiológicas presentes en el suelo antes de ser contaminado con el hidrocarburo; para
su determinación en la presente investigación se complementó la información de
contenido de nutrientes (N y P), densidad aparente y contenido de carbono orgánico
obtenida en los análisis preliminares con la determinación del pH y el conteo de
unidades formadoras de colonias para heterótrofos; estas ultimas pruebas fueron
realizadas en los laboratorios de la Facultad de Ciencias Básicas de la Universidad de la
Salle. Las técnicas seguidas para la realización de dichos análisis se describen a
continuación:
4.4.1 pH. Para la determinación de pH del suelo, se desarrolló el método 9045C (Soil
And Waste pH EPA)146 el cual es un procedimiento que requiere una muestra sólida, lodo
Subdirección agrológica. Ministerio de Hacienda y Crédito Público. 4ta edicion. Bogotá D.E. 1979 p. 90 y 136 146 Method EPA-9045C; (1995); Soil and Waste pH; Revision 3, Enero 1995.
67
o líquidos no acuosos, cuya presencia de agua sea menos del 20% del volumen total de
la muestra. El equipo utilizado para esta medición fue un potenciómetro Fisher Accumet®
pH-meter model 600 el cual se muestra en la figura 8.
Inicialmente se calibra el sistema de electrodo del potenciómetro antes de hacer la
medición. Para desarrollar este análisis se pesan 20 g de muestra de suelo, se le
adicionan 20 ml de agua destilada y se agita la mezcla en shaker a 200 rpm durante 5
minutos. Luego la muestra se deja en suspensión por una hora. Finalmente se inserta el
electrodo en el sobrenadante acuoso y se reporta el resultado.
Figura 8. pH-meter Figura 9. Centrifuga
68
4.4.2 Conteo de heterótrofos totales. Para el recuento de heterótrofos totales se utilizó
agar infusión suelo por el método de la Sociedad Americana de Microbiología (ASM)147 y
conteo de heterótrofos por el método 9215 del standard methods148
La preparación de la infusión suelo149 requiere que se disuelvan 500 g de la muestra de
suelo en 1 litro de agua destilada, la cual se agita por 15 minutos en plancha caliente
(50ºC), luego se deja precipitar durante una hora ó hasta que se presente un
sobrenadante oscuro que posteriormente se lleva a centrifugar (centrifuga BHG Hermle Z
230) a 2000 rpm durante 5 minutos como se ve en la figura 9, con el fin de obtener una
infusión de color mas claro. Del sobrenadante resultante de la centrifugación se toman
200 ml, y se mezclan con 800 ml de agar nutritivo en estado líquido. Esta solución se
esteriliza en autoclave a 121 ºC y 15 atm de presión durante 15 minutos para finalmente
dispensar en las cajas de petri bajo condiciones asépticas.
Adicionalmente fue necesario preparar agua buferada que contiene 0.085 g de KH2PO4 en
1.25 ml de agua destilada, 0.405 g de MgCl2 - 6H2O en 5 ml de agua destilada,
posteriormente se mezclan y se llevan a un volumen de con 1000 ml con agua destilada
para luego esterilizar en autoclave a 121 ºC y 15 atm de presión durante 15 minutos.150
A continuación, se prepararon diluciones a partir de 10 g del suelo que se agregaron a
90 ml del agua buferada, para obtener la dilución (10-1). Esta se colocó 25 minutos en
147 DEMAIN A.L Y SALOMÓN N.A. Department of nutrition and food science , Massachusetts. American society for microbiology Washington, D.C.1986. p. 20. 148 STANDARD METHOD FOR THE EXAMINATION FOR WATER AND WASTEWATER. Edited by: Arnold E. Greenberg, Lenores Clesceri and Andrew D. Eaton. 18th edition, 1992. 149 DEMAIN A.L Y SALOMÓN N.A.; Op. Cit. 150 . STANDARD METHOD FOR THE EXAMINATION FOR WATER AND WASTEWATER. Part 9050C. Editado por: Arnold E. Greenberg, Lenores Clesceri and Andrew D. Eaton. 20th edition. 2000
69
shaker a 200 rpm y posteriormente se dejó decantar por 30 min. Se realizaron diluciones
sucesivas hasta ( 10-8).
Las diluciones preparadas se sembraron en placas de agar nutritivo por duplicado
dejándolas incubar a temperatura ambiente (17 ± 3°C) durante un periodo de 7 días, al
cabo de los cuales se realizó el recuento de unidades formadoras de colonias.
4.5 CONTAMINACION DEL SUELO
El suelo fue contaminado con 24 L de petróleo de acuerdo con los cálculos mostrados en
el anexo 2 El petróleo crudo tipo Castilla (Ver anexo 3), con gravedad API 12, fue
proporcionado por ECOPETROL y transportado por la empresa Coltanques. Este fue
distribuido en todo el suelo de manera homogénea y posteriormente la mezcla fue
tamizada para lograr un tamaño de partícula uniforme.
La técnica utilizada para homogenizar el suelo fue de forma manual mediante el uso de
palas de jardinería. En primer lugar se realizó un volteo con las palas para luego romper
los terrones manualmente con el fin de dejar el suelo con una textura fina; después se
vertieron los 24 L de petróleo crudo sobre el mismo mezclando con palas para lograr
homogeneidad; debido a la gran viscosidad del hidrocarburo fue necesario desatar
manualmente los cúmulos que se formaban para lograr una distribución uniforme del
contaminante en el suelo.
El suelo contaminado con petróleo fue cubierto con sacos de polietileno y se dejo reposar
durante 4 días para lograr que el contaminante impregnara completamente el sustrato; al
cabo de este tiempo se realizo un volteo con el fin de permitir la volatilización de las
fracciones de hidrocarburos de cadenas cortas de menos de 10 carbonos, las cuales
70
tienden a ser tóxicas (como resultado de su alta solubilidad) é inhiben el crecimiento de
los microorganismos degradadores.
Por último, el suelo contaminado fue tamizado por medio de costales de fique con el fin de
obtener un tamaño de partícula menor (≤ 5 mm).
El procedimiento de tamizado consistió en hacer pasar el suelo contaminado por los
orificios de los costales de fique hasta separar las partículas con diámetros superiores a
5mm las cuales se redujeron de tamaño manualmente por macerado y se tamizaron para
evitar perdidas de hidrocarburo. Este procedimiento se llevó a cabo hasta que se
completo un total de 900 kg de suelo contaminado aproximadamente.
Luego de tener el suelo bajo condiciones uniformes se tomaron dos muestras compuestas
de 1 kilo para ser analizadas. La primera fue llevada a la empresa Prodycon para
determinar la concentración de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) por medio del
método de infrarrojo y la segunda fue llevada a los laboratorios de suelos del IGAC en
donde analizaron las concentraciones de nitrato, amonio y fósforo asimilable de la
muestra, de igual forma que en los análisis preliminares.
4.6 MONTAJE DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES
Para el desarrollo de la presente investigación se realizó un montaje de 6 unidades
experimentales (cajas de polipropileno con capacidad de 0.0312 m3, sin sistemas de
drenaje); a tres de las cuales se les adicionó un fertilizante inorgánico y a las otras tres
conformaron un control biótico.
La técnica empleada consistió en llenar con el suelo contaminado cada una de las UE
hasta una altura de 14 cm. Luego las UE fueron transportadas hasta el laboratorio de
71
microbiología de la Universidad De La Salle para posteriormente ubicarlas en estantes
metálicos como se muestra en la figura 10 .
Figura 10. Estantes metálicos Figura 11. Volteo del suelo
De las seis unidades experimentales tres corresponden al tratamiento con un fertilizante
inorgánico (Triple 15, T15, distribuido por Servi Ocampo), el cual contiene nitrógeno
amoniacal y orgánico (N), fósforo asimilable (P2O) y potasio soluble (K2O) en una
proporción equivalente al 15 % por kilogramo de fertilizante. Las otras tres corresponden a
un control biótico, al cual no se le adicionó ninguna sustancia diferente al crudo.
La adición del fertilizante se realizó teniendo en cuenta los análisis de nutrientes y de TPH
del suelo de las unidades experimentales, con base en la relación C:N:P 100:10:1 como
se ve en el anexo 4. Se adicionaron en total 308 g de T15 a cada una de las 3 unidades
experimentales; esta cantidad de fertilizante se distribuyó en el tiempo de la siguiente
manera: un 50% (154g) durante el primer mes de experimentación, un 25% (77g) el
72
segundo mes y el 25% restante en el tercer mes. Los nutrientes fueron agregados de esta
manera, ya que la adición de un exceso de estos inhibe el metabolismo de las bacterias
para degradar hidrocarburos; además como el nitrógeno y el fósforo son solubles en
agua, al aplicarlo en poca cantidad, se evita que por aguas de lavado estos nutrientes
sean arrastrados al fondo de las UE.
Para mantener condiciones adecuadas de temperatura, humedad y concentración de
oxigeno en el suelo de todas las unidades experimentales, fue necesario regar y realizar
volteo una vez por semana durante los cuatro meses de investigación.
La técnica para el volteo del suelo contenido en las unidades experimentales consistió en
una mezcla manual de la totalidad del sustrato, tanto en profundidad como en extensión,
como se puede observar en la figura11. Con dicho procedimiento se logró una correcta
aireación del suelo y una distribución equitativa tanto de los nutrientes adicionados a cada
uno de los tratamientos, como del contaminante presente en ellos, logrando una textura
uniforme en el suelo y evitando la formación de terrones o cúmulos que generaran áreas
anóxicas que pudieran afectar los procesos de biodegradación.
El riego semanal se justifica porque uno de los factores de mayor influencia en los
procesos de biodegradación de hidrocarburos en suelo es la cantidad de agua disponible
en el medio para los microorganismos; el porcentaje de humedad (%H) presente en el
medio para que las funciones metabólicas microbianas se desarrollen de manera óptima
se encuentra entre un 30 y un 90% . 151, 152
151 SRINIVASAN, NERALLA Y WEAVER, RICHARD W; Op. cit. 152 LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R.: Op. cit.
73
Para el caso de la presente investigación se estableció un rango de 30 a 60% de
humedad para las U.E, con el fin de evitar un exceso de agua en el sustrato, lo cual
generaría procesos anaeróbicos de degradación.
La capacidad de campo del suelo de las U.E. se determinó tomando una cantidad
conocida del suelo en estudio en un recipiente con orificios en el fondo y se agregaron
cantidades conocidas de agua hasta que por la base del recipiente se presentó un goteo
constante. La cantidad de suelo tomada para la prueba fue 0.443 kg y alcanzo su
capacidad de campo al adicionar 30 ml de agua.
Teniendo en cuenta que el peso total del suelo seco contenido en cada U.E. corresponde
a:
Ws = δa x A x h (Ec.1)
De donde :
Ws : Peso del suelo en cada U.E.
δa : Densidad aparente del suelo en estudio*
A : Area superficial de las U.E. (cm2)
h : Profundidad de la capa de suelo en la U.E. (cm)
Ws = 1.08 gr/cc x 2400 cm2 x 13cm
Ws = 33696 gr = 33.696 kg
De acuerdo con la relación agua / suelo obtenida en la prueba, y realizando una regla de
tres, se obtuvo que el suelo de las U. E. alcanza su capacidad de campo con 2.457 L de
* Datos proporcionados por el Laboratorio de Suelos del Instituto Geográfico Agustín Codazzi IGAC
74
agua, lo que representa un 100 % de humedad. Para obtener el rango de humedad
establecido en cada una de las U.E se requirió un volumen de riego aproximado de 0.7 a
1.5 L, equivalente a un rango entre el 30 y 60% de humedad.
El riego de las U.E. se realizó manualmente mediante un recipiente con capacidad de 2 L
y con tapa perforada, como se observa en la figura12.
Adicionalmente al suelo contenido en cada una de las 6 unidades se le llevo a cabo un
control semanal de temperatura y humedad. Las técnicas utilizadas se describen a
continuación.
4.6.1 Determinación de Humedad. De acuerdo con el Instituto Geográfico Agustín
Codazzi I.G.A.C, la determinación del porcentaje de humedad de cada U.E. se realizó
como se describe a continuación:
Se pesan 10 g de muestra. Se agrega la muestra a un recipiente rectangular de aluminio
con un volumen de 15cm3 aproximadamente, previamente pesado. Se seca en estufa
durante 24 horas a una temperatura de 105ºC, lo cual se puede observar en la figura13.
Figura 12. Riego del suelo Figura 13. % de humedad
75
Finalmente se deja el recipiente en el desecador hasta que la muestra alcanza la
temperatura ambiente. Se registra el peso final del recipiente.
Los pesos obtenidos antes y después del proceso de secado se utilizaron en las
siguientes ecuaciones para obtener los datos de Fracción Peso Seco (FPS) y Porcentaje
de Humedad (%H):
húmedamuestra.g
asecmuestra.gFPS = (Ec. 2)
100*asecmuestra.g
asecmuestra.ghúmedamuestra.gH% −= (Ec. 3)
De donde:
g muestra húmeda = Peso recipiente + muestra antes del secado
g muestra seca = Peso recipiente + muestra después del secado
Debe entenderse que la FPS representa la fracción de suelo de la muestra que no
contiene humedad y fue utilizada a lo largo de la investigación para la conversión de g de
peso húmedo a g de peso seco de los datos recogidos en los diferentes análisis.
76
4.6.2 Determinación de Temperatura. La medición de temperatura fue realizada con
un termómetro marca Mengte, cuya escala va desde –10°C a 110°C, utilizado para medir
la temperatura del suelo. Esta medición como se muestra en la figura14, requirió que el
termómetro fuera intoducido en la muestra de suelo por un lapso de tiempo de 3 minutos
aproximadamente.
Figura 14. Medición de temperatura
4.7 MUESTREO DE SUELO
La recolección de las muestras de suelo tratado de las UE se realizó mediante un
muestreo compuesto, que se ajustó a las características de la investigación por dos
razones: 1) El suelo de las UE fue constantemente homogenizado proporcionando una
distribución uniforme del contaminante así como de los nutrientes adicionados y 2) las
unidades experimentales no poseían un sistema de drenaje por lo cual no se presentaron
pérdidas significativas de hidrocarburos ni nutrientes debido a la escorrentía o lavado del
suelo. La selección de las muestras se realizó de manera aleatoria.
77
La técnica utilizada para el muestreo se llevó a cabo realizando en primer lugar un volteo
para la homogenización del suelo como se explicó anteriormente en el numeral 3.6.
Luego se tomaron 8 muestras puntuales de la superficie de las UE, por medio de una
cuadrícula de 60 x 40 cm (área superficial) subdividida en 77 recuadros de 5 x 5 cm, la
cual se muestra en la figura 15; los puntos para tomar las muestras se seleccionaron por
medio de números aleatorios, y con el suelo recogido se conformaron dos muestras
compuestas que se remitieron al laboratorio de microbiología de la Univesidad De La
Salle para ser analizadas.
Figura 15. Muestreo de suelo
Las muestras compuestas 1 y 2 (M1 y M2) de cada UE se obtuvieron mezclando 4 de las
muestras puntuales para M1 y 4 para M2, en una bandeja de fondo plano con espátula
hasta lograr una textura uniforme en ellas. Una vez terminado este procedimiento se
tomaban submuestras, tomando de la bandeja con una espátula la cantidad de suelo
necesaria para cada análisis de laboratorio, ya que los tamaños de estas submuestras
eran variables y dependían de los análisis que se fueran a realizar. Dicha relación se
evidencia en la tabla 5.
78
4.8 MONITOREO DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL SUELO DE LAS UNIDADES
EXPERIMENTALES
Para el desarrollo de la investigación se hizo un monitoreo de las características físicas,
químicas y microbiológicas de cada una de las UE durante los 4 meses de
experimentación, con lo cual se analizó profundamente el proceso de biodegradación del
hidrocarburo.
Tabla 5. Muestreo para análisis de laboratorio Submuestra
Tipo de análisis Muestra puntual (g)
Muestra compuesta (g) Prueba de
laboratorio Peso (g)
pH 20 % H 10 Físicos y
químicos 10 40 TPH por gravimetría 1
Microbiológicos 5 20 NMP y Conteo de heterótrofos 10
Nutrientes Universidad Jorge
Tadeo Lozano 125 500 Nitrógeno total y
fósforo asimilable -
4.9 MONITOREO DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL SUELO DE LAS UNIDADES
EXPERIMENTALES
Para el desarrollo de la investigación se hizo un monitoreo de las características físicas,
químicas y microbiológicas de cada una de las UE durante los 4 meses de
experimentación, con lo cual se analizó profundamente el proceso de biodegradación del
hidrocarburo.
Parámetros como humedad, temperatura y pH fueron medidos una vez por semana. El
conteo de heterótrofos y el análisis de número más probable (NMP) fueron realizados en
la segunda o tercera semana de cada uno de los meses de experimentación al igual que
79
los análisis de nutrientes y la determinación de la concentración de TPH´s y PAH’s. El
aislamiento de los microorganismos degradadores de hidrocarburos se realizó durante el
último mes de experimentación.
4.9.1 Características físicas. Los procesos para la determinación de la humedad y la
temperatura en cada una de las UE fueron descritos anteriormente en los numerales 3.6.1
y 3.6.2 respectivamente. Estos análisis se realizaron una vez por semana durante los 4
meses de experimentación.
4.9.2 Características químicas. Entre las características químicas monitoreadas para
cada UE encontramos: pH, análisis de nutrientes, concentración de TPH’s y PAH’s. La
técnica para la determinación de pH del suelo, fue descrita en el numeral 3.4.1, la cual
fue llevada a cabo semanalmente durante los cuatro meses de experimentación; las
características químicas restantes se explican a continuación:
4.9.2.1 Nutrientes. Los análisis de nutrientes se realizaron en el Centro de Investigación y
Asesoría Agroindustrial de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, donde llevaron a cabo las
siguientes determinaciones: Nitrógeno total (N-NO3 y N-NH4) con extracción por KCl (1N)
y cuantificación potenciométrica y fósforo asimilable (P) con extracción por Bray II y
cuantificación calorimétrica.
4.9.2.2 TPH. La determinación de los hidrocarburos totales de petróleo (Total Petroleum
Hidrocarbons TPH’s) se llevo a cabo por determinación gravimétrica, con el numeral
80
5520E, Standard Methods, 20th edition153, y se determinó el porcentaje de recuperación de
hidrocarburos por esta técnica utilizando una muestra con spike.
La extracción del hidrocarburo de las muestras de suelo, se llevó a cabo utilizando un
sistema de extracción por agitación orbital (shaker) con diclorometano como solvente154
Este método se realizó de la siguiente manera:
Primero se pesa 1 g de suelo contaminado en un erlenmeyer de 100 ml, se le adiciona 10
ml del solvente y se agita en shaker (Bainstead Lab-Line Labrotator) por 30 minutos a
120 rpm. Luego esta muestra se filtra al vacio con papel wathman con silica gel
(previamente colocada en mufla a 250°C por una hora) y se recoge en otro erlenmeyer de
100 ml. Este procedimiento se repite 3 veces y finalmente se lava el suelo con 10 ml del
solvente. Toda la muestra recogida en el erlenmeyer de 100 ml (40 ml aprox.) se trasvasa
a un balón de 500 ml para rotoevaporarla, en un rotavapor marca Heidolph el cual se
muestra en la figura16, a 60°C al vacío hasta obtener 5ml. Los 5 ml resultantes más 2 ml
del enjuague del balón se pasan a un tubo de ensayo previamente pesado. La muestra se
lleva a evaporar a sequedad al baño de maría a 60°C en cabina de extracción como se
muestra en la figura17. Finalmente se pesa el tubo.
Figura 16. Rotavapor Figura 17. Baño maría en cabina de extracción
153 STANDARD METHOD FOR THE EXAMINATION FOR WATER AND WASTEWATER 20thedition Op cit 154 SCHWAB A,P. et al., Extraction of petroleum hydrocarbons from soil by mechanical shaking. En: Enviromental Science and technology. Vol 33. No. 11 1999 p. 1940-1945 .
81
Los datos de los pesajes del tubo de ensayo antes y después del procedimiento
permitieron obtener el valor de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) por diferencia de
pesos de acuerdo con la ecuación 4.
kgmg
opesofraccionmuestrapesokg
ggmgpesoenganancia
TPH =⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
=sec*
11000*
11000
(Ec. 4)
En donde:
Ganancia en peso = (peso final muestra - peso inicial muestra) – (peso final blanco –
peso inicial blanco).
Para la determinación del porcentaje de recuperación de hidrocarburos de la técnica
descrita anteriormente se analizó una muestra que presentaba una concentración de
hidrocarburos 3 veces mayor que la contenida en las UE, los procedimientos seguidos
para dicha prueba se describen a continuación:
82
Durante el primer mes de experimentación, se tomó una muestra compuesta del suelo de
las UE, que contenía una concentración de aproximadamente 20.000 ppm de
hidrocarburos, a dicha muestra se le adicionó 0,06 g. de petróleo crudo (Spike) con el fín
de conseguir una concentración de hidrocarburos de 60.000 ppm, seguidamente se
realizó el procedimiento de extracción y la determinación por gravimetría de los TPH
presentes en la muestra, dichos resultados se compararon con los obtenidos para una
muestra sin spike utilizando la ecuación 5.
[ ] 100*sin%spikeHC
spikeTPHspikeTPHR −= (Ec. 5)
En donde:
TPH spike: Cantidad de TPH presentes en la muestra con spike de acuerdo con los
resultados de la ecuación 4.
TPH sin spike: Cantidad de TPH presentes en la muestra sin spike de acuerdo con los
resultados de la ecuación 4.
[ ] spikeHC : Concentración de hidrocarburos contenidos en la muestra con spike.
Después de realizar la prueba de spike se obtuvo que el porcentaje de recuperación del
método es de 91.71% como se muestra en el anexo 5
4.9.2.3 PAHs. El procedimiento para el análisis de PAH´s de las muestras de suelo de las
UE se realizo por cromatografía líquida en un Hight Performance Liquid Cromatograpy
(HPLC), marca MERCK-Hitachi model D-7000 el cual se observa en la figura18, y se
desarrollo mediante los siguientes pasos:
1. Construcción de curvas de calibración a partir de un estándar de PAH´s y
estandarización del método analítico para este tipo de hidrocarburos.
83
2. Tratamiento de las muestras de suelo de las UE por medio del procedimiento de
extracción por agitación orbital utilizado par la determinación de TPH, explicado en el
numeral. 2.9.2.3, con el cual se busca aislar los sólidos presentes que pueden
taponar la columna del HPLC.
3. Obtención de los cromatogramas mediante la inyección de cada muestra tratada y
resuspendida en 0.8 ml de acetonitrilo y 0.2 ml de diclorometano.
4. Análisis de los cromatogramas obtenidos.
Figura 18. Hight Performance Liquid Cromatograpy (HPLC) Figura 20. Placa de 96 pozos. NMP
Las técnicas utilizadas para el análisis de PAH´s fueron:
La aplicación de un método analítico de PAH´s dentro del software (HPLC system
Manager D-7000) que muestra un aumento progresivo de las proporciones de los
solventes durante un tiempo de 40 minutos con lo cual se logra una detección
diferenciada de cada uno de los hidrocarburos presentes en la muestra analizada.
84
La construcción de las curvas de calibración se realizó por medio del análisis de una
ampolleta de 2000 ng/µl cuyo estándar contenía los 16 PAHs identificados por la USEPA
como contaminantes prioritarios: naftaleno, aceftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno,
antraceno, fluoranteno, pireno, B(a) antraceno, criseno, B(b) fluoranteno, B(k) fluoranteno,
B(a) pireno, DB (a,h) antraceno, B(ghi) pe, é indeno (123) como se muestra en la figura
10. Con este estándar se prepararon soluciones a diferentes concentraciones (200, 100,
50, 20 y 10 ppm) que se inyectaron en el equipo con el fin de observar que los 16
compuestos aparecieran correctamente en los cromatogramas; es decir con sus
respectivos nombres y tiempos de retención similares a los encontrados en la literatura.
Con base en los resultados obtenidos se realizaron ajustes de la longitud de onda del
detector y los rangos de tiempo en los que se detecta cada pico (ventanas de tiempo de
retención) teniendo en cuenta su resolución. Posteriormente se obtuvieron las curvas de
calibración que permitieron analizar las muestras de suelo contaminado.
Fuente: Cromatograma estándar de la EPA perileno y 7.12-dimetilbenzo(a)antraceno. Detección UV a 254 nm. Columna
Nucleosil 5C18 PAH. Gradiente con Metanol, agua y acetonitrilo
Figura 19. Cromatograma estandar EPA 16 PAH´s principales
Picos identificados: 1. Naftaleno 2. Aceftileno 3. Acenafteno 4. Fluoreno 5. Fenantreno 6. Antraceno 7. Fluoranteno 8. Pireno 9. B(a) antraceno 10. Criseno, 11. B(b) fluoranteno 12. B(k) fluoranteno 13. B(a) pireno 14. DB (a,h) antraceno 15. B(ghi) perileno 16. indeno (123)
85
El cromatograma de cada muestra permite, mediante la comparación con el estándar
utilizado para las curvas de calibración, determinar la presencia de PAH´s en la misma.
4.9.3 Características microbiológicas. Las características microbiológicas evaluadas a
lo largo de la investigación fueron analizadas cuantitativamente mediante el conteo de
heterótrofos totales y análisis de número más probable para degradadores de
hidrocarburos y cualitativamente realizando un aislamiento de este tipo de
microorganismos. El conteo de heterótrofos totales se llevo a cabo bajo las técnicas
descritas en el numeral 3.4.2, el cual se desarrollo durante la segunda o tercera semana
de cada uno de los cuatro meses de experimentación, el análisis de número mas
probable y el aislamiento de los microorganismos se explican a continuación:
4.9.3.1 Análisis de Numero Mas Probable (NMP). Se implementó un procedimiento en
placas de 96 pozos para microtitulación; en este se usa petróleo como sustrato de
crecimiento selectivo y se le adicionó iodonitrotetrazolium violeta (INT), sustancia que
compite con el O2 por electrones de la cadena respiratoria microbiana y es reducida a un
compuesto insoluble que se deposita como un precipitado rojo debido a la respiración
activa de los microorganismos. Se consideran positivos todos los pozos que presenten
una coloración rojiza o rosada. Este procedimiento arroja una estimación de la densidad
de la población degradadora en varios cultivos enriquecidos por degradadores de
petróleo. 155
Las placas de 96 pozos constan de 12 columnas y 8 filas como se muestra en la figura20.
En cada uno de los pozos de las primeras 5 filas se adiciona 180 µl de medio Bushnell-
Haas (BH) el cual contiene: 0.2 g de MgSO4-7H2O, 0.02 g de CaCl2, 1 g de K2HPO4,
155 HAINS J.R. measurement of hight hidricarbon-degrading microbial populations by a 96-well plate most- probable-number procedure. Journal of industrial microbiology. No 16. p.36-41. 1996).
86
NH4NO3, 5 g de NaCl, 0.05 g de FeCl3-6H2O, disueltos en 1000 ml de agua destilada,
dicha solución se agita durante 30 minutos y se esteriliza en autoclave a 121 °C durante y
15 atm de presión durante 15 minutos 156; 20 µl de cada dilución (cada columna es una
dilución) y finalmente se adicionan 5µl de petróleo refinado como fuente de carbono. Las
ultimas 3 filas fueron un control negativo, el primer control contenía 205 µl de BH, el
segundo 200 µl de BH y 5 µl del hidrocarburo; y el tercero 185 µl de BH y 20µl de la mayor
dilución.157
Para llevar a cabo este procedimiento se usó una micropipeta (Trasnferpette ® -12
Brand 20-200 µl) y al finalizar el procedimiento las placas fueron selladas con Parafilm e
incubadas por 14 días a 20°C. 158
Al cumplir el día 14 de incubación se adicionaron 50 µl de una solución estéril de INT a
cada pozo. 24 horas después se reportaron los pozos positivos por dilución159. Los datos
obtenidos en dicho recuento fueron analizados con el software Most Probable Number
Calculator version 4.04 desarrollado por la Agencia de Protección Ambiental de Estados
Unidos (US EPA).
4.9.3.2 Aislamiento de los degradadores de hidrocarburos. Para aislar los
microorganismos degradadores de hidrocarburos fue necesario tomar 2 muestras de
suelo de 0.1 g, a partir de un muestreo compuesto realizado en cada una de las UE.
Cada muestra se inoculó en 50 ml de medio mineral líquido Bushnell Haas (BH),
156 AISLABIE JACKIE. Hydrocarbon-degrading Bacteria. Enumeration of hydrocarbon-degrading bacteria in the environment. Disponible online: http://www.nexusresearchgroup.com/microbiology/hcmicrobes.htm#top 157 CLEVES, I y SANDOVAL, M. Op cit. 158 CLEVES, I y SANDOVAL, M. Op cit. 159 Ibid
87
contenido en erlenmeyers de 100 ml; a esto se le adicionó 1 ml de petróleo refinado como
fuente de carbono. Los inóculos fueron colocados en un agitador orbital (Shaker) a 120
rpm durante 3 días a temperatura ambiente; al cabo de este tiempo se realizaron
siembras por duplicado de 0.1 ml de cada muestra en agar BH, utilizando petróleo
refinado como fuente de carbono. Después de seis días de incubación a 37°C se observó
el crecimiento de colonias sobre el medio de cultivo; posteriormente se hicieron tinciones
de Gram para la observación microscópica.
Con el fin de obtener colonias diferenciadas, se realizaron diluciones sucesivas desde
10-2 hasta 10-7 siguiendo un procedimiento similar al descrito en el numeral 2.5.2; se
obtuvo un inóculo a partir de la adición de 4 ml de agua buferada a las cajas de petri que
presentaron mayor densidad de colonias, escogiendo una muestra por cada UE. Dichas
diluciones fueron sembradas nuevamente en agar BH con la misma fuente de carbono e
incubadas durante 7 días a 37ºC.
Una vez se observó crecimiento de colonias sobre el medio, se tomaron las mayores
diluciones (10-6 y 10-7) de cada U.E. Para aislar las colonias presentes en ellas, cada caja
de petri se observó en estereoscopio para distinguir la morfología y color de las diferentes
colonias. Dichas colonias fueron resembradas por duplicado en agar BH utilizando un
estriado de cuatro zonas por agotamiento y petróleo crudo como fuente de carbono que
se aplicó directamente sobre el agar siguiendo el estriado como se observa en la figura
21…. Las resiembras fueron incubadas durante 7 días a 37ºC; al cabo de este tiempo se
obtuvo un crecimiento significativo de colonias sobre el petróleo crudo y para confirmar la
morfología de las colonias escogidas anteriormente se realizó una observación con
estereoscopio y tinciones de gram. A partir de dicha revisión se seleccionaron
nuevamente colonias para ser aisladas procurando escoger aquellas que presentaran
características morfológicas diferentes, dichas colonias fueron sembradas nuevamente en
88
agar BH con estriado de cuatro zonas por agotamiento y con petróleo crudo como fuente
de carbono e incubadas durante 7 días a 37ºC. De las mismas colonias se realizaron
tinciones de Gram con el fin de determinar la morfología bacteriana y la coloración. Una
vez terminado el periodo de incubación las colonias seleccionadas fueron resembradas en
agar base sangre con estriado de cuatro zonas por agotamiento e incubadas durante 3
días a 37ºC; este procedimiento se repitió una vez mas con el fin de obtener en cada caja
de petri tan solo un tipo de colonia bacteriana.
Finalmente, cuando se tuvieron cultivos puros se procedió a realizar su identificación por
medio de pruebas bioquímicas de BBL Crystal; para lo cual necesario sembrar las
diferentes colonias en agar sangre, mostradas en la figura 22, incubarlas durante 24 horas
a 37ºC y realizar tinciones de gram . Los cultivos de la resiembra fueron analizados con el
kit para identificación de microorganismos gram positivos Gram-Positive ID Kit BBL
Cristal Identificación Sistems, de Becton, Dickinson and Company, como se ve en la figura
23.
Figura 21. Estriado de 4 zonas Figura 22. agar sangre
89
Figura 23. BBL Cristal. Kit para la identificación de gram positivos.
4.10 ANALISIS ESTADISTICOS
Los datos obtenidos al desarrollar los análisis descritos anteriormente fueron procesados
en el programa estadístico SPSS con el cual se analizaron las variables de pH,
temperatura, porcentaje de humedad (%H), hidrocarburos totales de petróleo (TPH),
nutrientes, heterótrofos totales y numero mas probable (NPM) para hallar diferencias
significativas entre los datos obtenidos en cada una de las unidades experimentales y
entre el tratamiento con Triple 15 y el Control Biótico.
La prueba de Anova de un factor, es un análisis de varianza de comparación múltiple con
el cual se puede determinar si un grupo de datos presentan una diferencia significativa
entre ellos. Esta prueba es útil para entender el concepto de dividir la variación en
diferentes partes y al aplicarla a un grupo de datos, considera la variación en todas las
observaciones y las divide en160:
• Variación entre cada tiempo de observación y la media del grupo en estudio.
• Variación entre la media de cada grupo y la media general.
160 DAWSON B. y TRAPP R. Bioestadística médica. 3a edición. Manual Moderno. 2002. p. 181
90
Si las medias de los grupos son muy diferentes la una de la otra ocurrirá una considerable
variación entre ellas y la media general. La diferencia entre dos medias será significativa
si es ≤ a 0.05.161
Esta prueba se utilizó para determinar los datos obtenidos en las mediciones de cada
variable de estudio presentaban una diferencia significativa entre ellas. También se realizó
la prueba entre los datos del tratamiento con triple 15 y los del control biótico.
Además del anova se llevaron a cabo pruebas específicas como la de Duncan y la de
Kruskal-Wallis para determinar exactamente entre que grupos de datos se encontraba la
diferencia significativa y de esta manera poder describir el comportamiento de las
diferentes variables en el tiempo.
161 Ibid
90
5. RESULTADOS
Los parámetros analizados a lo largo de la investigación fueron: porcentaje de
humedad, temperatura, pH, TPH´s, nutrientes y biota microbiana.
Con el fin de facilitar el análisis de la información, las UE de Triple 15 y control biótico
fueron nombradas grupo 1 y grupo 2 respectivamente.
5.1 PROPIEDADES FISICAS
5.1.1 Humedad. Como se observa en la figura 24 la humedad tuvo un
comportamiento creciente entre los meses 0 y 2, y decreciente entre los meses 2 y 4,
con valores comprendidos entre 36 a 67% de humedad, los cuales se encuentran
dentro del rango establecido para la presente investigación (30 – 60%). La correlación
entre los datos de Triple 15 y los de control biótico fue de r=0.52, es decir que su
comportamiento es directamente proporcional, a medida que aumenta la humedad en
el grupo 1, también aumenta en similares proporciones la humedad del grupo 2. No
hubo variación estadísticamente significativa durante el tiempo de observación, en los
dos grupos de estudio (p=No Significativa= NS).
5.1.2 Temperatura. La figura 25 muestra que la temperatura presenta un
comportamiento creciente entre los meses 2 y 4 para ambos grupos. En general la
totalidad de los datos se mantuvieron dentro de un rango de 13 a 17 ºC.
La temperatura no presentó diferencias estadísticamente significativas entre los dos
grupos durante el tiempo de experimentación. (p= NS)
91
Figura 24. Correlación del % de humedad Vs tiempo de observación en las UE de Triple 15 y control biótico.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Meses
% d
e hu
med
ad
T15 CB
Tabla 6. Datos promedio de %H obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
% H MES 0 1 2 3 4
SEMANA S1 S2 S3 S4 S1 S2 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 T15 52 37 46 47 47 53 46 48 42 50 46 41 42 44 40 T15 52 37 47 51 42 57 50 53 49 41 49 50 44 44 42 T15 52 37 40 47 43 53 47 52 47 41 51 52 47 50 43 CB 52 40 51 50 42 59 50 53 53 49 45 49 44 45 44 CB 52 46 51 48 43 58 54 59 55 52 46 51 43 45 46 CB 52 40 48 45 43 42 53 54 53 51 50 47 45 45 43
5.2 PROPIEDADES QUÍMICAS
5.2.1 pH. Como se observa en la figura 26, el pH presenta un comportamiento
creciente desde la semana 0 hasta la 10 y un comportamiento decreciente desde la
semana 10 a la 16, en ambos grupos de experimentación, presentando datos de pH
entre un rango de 4.2 a 6.96 para el grupo 1 y de 4.7 a 6.8 para el grupo 2.
92
Los valores de pH en los grupos 1 y 2 fueron más bajos en las UE de Triple 15, que
los encontrados en UE de Control Biótico, siendo estadísticamente significativa la
diferencia entre los dos experimentos (p=0.001 Kruskal-Wallis)
Figura 25. Correlación entre temperatura vs tiempo de observación en UE de Triple 15 y control biótico
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1 2 3 4 5
Meses
Gra
dos
Cen
tígra
dos
Triple 15 Control Biótico
Tabla 7. Datos promedio de temperatura (ºC), obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
TEMPERATURA ºC MES 0 1 2 3 4
SEMANA S1 S2 S3 S4 S1 S2 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 T15 15 15 14 14 15 16 16 17 16 15 15 15 17 16 15 T15 15 15 14 14 13 15 15 16 15 14 14 16 16 15 14 T15 15 15 14 14 13 15 16 16 16 15 15 15 16 16 15 CB 14 15 14 14 13 14 17 16 17 15 14 16 16 17 15 CB 15 14 14 14 13 15 17 15 16 15 14 16 15 16 15 CB 14 15 14 14 14 14 16 15 17 15 14 16 15 17 15
93
Figura 26. Correlación de pH Vs tiempo de observación en UE de Triple 15 y control biótico
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20
Semanas de Observación
pH
T15 CB
Tabla 8. Datos promedios de pH obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
pH MES 0 1 2 3 4
SEMANA S1 S3 S1 S2 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 T15 5,2 5,6 5,6 6,0 6,0 6,5 6,5 5,0 4,8 4,6 4,6 4,6 4,3 T15 5,2 5,6 5,6 6,0 6,1 6,5 6,6 5,3 4,9 4,7 4,6 4,5 4,3 T15 5,2 5,6 5,6 6,0 5,8 6,5 6,5 5,0 4,8 4,6 4,6 4,5 4,2 CB 5,2 6,1 6,0 6,0 6,5 6,6 6,8 5,4 5,3 5,2 5,2 5,0 4,8 CB 5,2 6,1 6,1 6,0 6,4 6,6 6,8 5,4 5,4 5,3 5,3 5,0 4,8 CB 5,2 6,1 6,0 6,0 6,5 6,0 6,8 5,3 5,3 5,2 5,2 5,0 4,7
5.2.2 Hidrocarburos totales de petróleo-TPHs. En la figura 27 se puede observar
que los resultados obtenidos de TPHs para los dos grupos en estudio, parten de un
valor de 23280 mg/kg TPH en el mes 1 (valor analizado por Prodycon como se
muestra en el anexo 6), decreciendo hasta el mes 4 bajo el mismo comportamiento.
Los valores de TPH para el grupo 1 fueron más bajos que en el grupo 2, llegando a un
mínimo de 2028 mg/Kg y 8049 mg/Kg TPH respectivamente; presentando una
diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).
94
Figura 27. Correlación de concentración de TPH Vs tiempo de experimentación en UE de triple 15 y control biótico.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0 1 2 3 4 5
Tiempo (meses)
TPH
(mg/
kg) d
e su
elo
T15 CB
Figura 28. Valores medios de TPHs durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico
La figura 28. muestra los valores medios de TPH para los dos grupos de observación y
a través de el diagrama de cajas se puede observar que la dispersión de los datos
presentan el mismo comportamiento para las UE de Triple 15 en los meses 2, 3 y 4,
notandose que en el primer mes esta dispersión es muy pequeña. Los valores del
control biótico presentan dispersiones mayores para los datos obtenidos en los meses
2, 3 y 4 que los del grupo 1, comportándose los datos del mes 1 de la misma manera.
P<0.05
95
Tabla 9. Datos promedio de TPHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
T15 CB MES UE1 UE2 UE3 UE1 UE2 UE3
1 23280 23280 23280 23280 23280 23280 2 19009,3 22442,1 21715,2 21988,8 23936,76 24839,6 3 7121,33 7694,49 5106,93 15359,6 9472,482 17617,94 4 6597,32 5136,88 2724,12 8765,41 8179,098 12960,15
5.2.2.1 Balance de masas. El análisis de balance de masa es relevante para los
hidrocarburos, debido a que este permite la determinación del porcentaje de remoción
obtenido en cada una de las unidades experimentales a lo largo del tiempo de
experimentación. Como se observa en la tabla 10, el grupo 1 presenta valores mas
altos de remoción que el control biótico, presentando su máximo valor en el mes 2 con
un % de remoción del 75%; mientras que el mayor % de remoción alcanzado en el
grupo 2 es del 62%.durante el mes 2. Los porcentajes de remoción total a lo largo de
la investigación desde el mes 1 al 4 en el grupo 1 tiene valores comprendidos entre el
67 y 91%, y valores del grupo 2 comprendidos entre el 37 y 65%; esto se puede
observar en el balance de masas mostrado en al anexo 7.
Tabla 10. Datos promedio de % de remoción de TPHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
%REMOSION TPHs MES 1 mes 2 mes 3
entrada salida %
remociónentrada salida %remoción entrada salida
% remoción
T15 23280 19009 12 19009 7121 62 7121 6597 7 T15 23280 22442 4 22094 7694 66 7694 5137 48 T15 23280 21715 7 21715 5107 66 5107 2724 47 CB 23280 21989 6 21989 15360 30 15360 8765 43 CB 23280 22963 1 23937 9472 60 9472 8179 14 CB 23280 23170 0 24840 17618 30 17618 12960 26
96
Figura 29. % de remoción de TPHs Vs tiempo de observación en las UE de triple 15 y control biótico
0102030405060708090
0 1 2 3 4
meses
% R
emoc
ión
Triple 15 control biótico
5.2.3 Hidrocarburos policiclicos aromáticos PAHs. como se puede ver en las figuras 30 y 31, el comportamiento de los PAHs analizados en las UE de Triple 15 y Control Biótico, tuvieron una disminución baja a lo largo del tiempo de experimentación. Las concentraciones que mas disminuyeron fueron las de pireno y B(k) fluoranteno como se puede ver en la tabla 11. Las concentraciones que presentaron dichos compuestos en el sustrato fueron muy reducidas con respecto a las concentraciones de TPHs. Figura 30. Concentración de PAHs vs tiempo de experimentación para las UE Triple 15.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Tiempo de experimentación
ppm
Pireno B(a) antraceno B(b) fluorantenoB(k) fluoranteno B(a)pireno
97
Tabla 11. Datos promedio de concentración de PAHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15
T15
MESES Pireno B(a) antraceno B(b) fluoranteno
B(k) fluoranteno B(a)pireno
1 1,41 0,04 0,04 0,20 2 1,00 0,03 0,03 0,13 0,04 3 1,09 0,03 0,03 0,14 0,04 4 1,17 0,03 0,03 0,16 0,04
Figura 31. Concentración de PAHs vs tiempo de experimentación para las UE de Control Biótico
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50Tiempo de experimentación
ppm
Pireno B(a) antraceno B(b) fluorantenoB(k) fluoranteno B(a) pireno
Tabla 12. Datos promedio de concentración de PAHs obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de Control biótico
MESES Pireno B(a) antraceno
B(b) fluoranteno
B(k) fluoranteno B(a) pireno
1,00 1,41 0,04 0,04 0,20 2,00 1,36 0,04 0,05 0,17 0,06 3,00 1,33 0,04 0,04 0,13 0,05 4,00 1,07 0,03 0,03 0,10 0,04
Los cromatogramas obtenidos con sus respectivos datos se muestran en el anexo 8
98
5.2.4 Nutrientes
5.2.4.1 Fósforo asimilable. Como se puede observar en la figuras 32, el
comportamiento del fósforo en los dos grupos de estudio presenta una diferencia
estadísticamente significativa (p<0.05); esto se puede evidenciar en el comportamiento
del grupo 1 que presenta un crecimiento exponencial hasta alcanzar un valor de 658 ppm,
para luego presentar una disminución en el mes 4 hasta 474 ppm; mientras que el grupo 2
presenta un bajo crecimiento alcanzando su máximo valor en 250 ppm, y una disminución
en el mes 4 hasta 123 ppm.
Figura 32. Correlación de fósforo Vs tiempo de experimentación en UE de triple 15 y control biótico.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4 5 6
Meses
fósf
oro
ppm
T15 CB
En la figura 33 se puede observar que para los grupos 1 y 2 en los meses 0 a 1, 2 a 3 y 4
a 5 no hubo dispersión de datos estadísticamente significativos, pero si se dio una
dispersión estadísticamente significativa al compararlos entre si.
99
Figura 33. Valores medios de fósforo durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico.
5.2.4.2 Amonio N-NH4 Como se observa en la figura 34, el N-NH4 presenta un
comportamiento creciente durante los cuatro meses de experimentación tanto para el
grupo 1 como para el 2, con mayor magnitud en el grupo 1, el cual partió de un valor de
2.3 ppm hasta 1952 ppm, con una disminución en la concentración del mes 2 al 3,
mientras que el grupo 2 partió del mismo valor (2.3ppm) hasta alcanzar un valor de 557
ppm, sin ninguna fluctuación.
Los valores de N-NH4 en los 2 grupos de trabajo fueron más bajos en las UE del Control
Biótico, siendo estadísticamente significativa la diferencia entre los dos experimentos
(p<0.05)
100
Figura 34. Correlación N-NH4 Vs tiempo de observación entre triple 15 y control biótico.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1 2 3 4 5 6
Meses
N-N
H4
ppm
T15 CB
La figura 35 muestra que la dispersión de datos en cada uno de los meses es baja, tanto
para el grupo 1, como para el grupo 2. Además se puede observar que en ambos grupos
existe una diferencia significativa entre los valores de los meses de experimentación
Figura 35. Valores medios de amonio durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico.
101
5.2.4.3 Nitratos N-NO3 La figura 36 muestra el comportamiento del N-NO3. En la cual
se puede observar su crecimiento exponencial en el grupo 1, con valores comprendidos
entre 95 ppm y 1200 ppm, presentando disminuciones entre el mes 2 y 3; por el contrario,
los valores del grupo 2 decrecen desde 95 ppm hasta 44 ppm, aunque presentan un
aumento al finalizar el mes 4.
Este comportamiento inversamente proporcional entre los dos grupos de trabajo,
evidencia diferencias significativas entre ellos (P<0.05).
Figura 36. Correlación del N-NO3 vs tiempo de observación en las UE de triple 15 y control biótico
0200400600
800100012001400
0 1 2 3 4 5 6Meses
N-N
O3
ppm
T15 CB
Figura 37. Valores medios de nitrato durante el tiempo de observación en triple 15 y control biótico.
102
En la figura 37 se puede observar que el en grupo 1, las observaciones 2, 4 y 5 presentan
una alta dispersión en sus datos. Existe una diferencia estadísticamente significativa entre
los datos de los diferentes meses de observación para este mismo grupo. Por el contrario,
en el grupo 2, no hay dispersión de datos, ni se presenta una diferencia significativa entre
los datos de los diferentes meses de observación.
5.2.4.4 Correlación Entre Nutrientes
5.2.4.4.1 Triple 15. En la figura 38 se puede observar que la tendencia de todos los
nutrientes analizados para las Unidades experimentales que contenían triple 15 (grupo1)
fue creciente, a pesar de existir algunas fluctuaciones en sus valores; presentando
diferencias significativas entre ellos (p<0.05)
Figura 38. Correlación de nutrientes según tiempo de observación en triple 15
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1 2 3 4 5 6
Observaciones
ppm
P(Fósforo) N-NH4 N-NO3
103
5.2.4.4.2 Control Biótico. En la figura 39 se puede observar que de los nutrientes
analizados en las unidades experimentales, solo el N-NO3 presento un comportamiento
decreciente, inversamente proporcional al comportamiento que presentó el P y el N-NH4.
existen diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes nutrientes en este
grupo (p<0.05).
Figura 39. Correlación de nutrientes según tiempo de observación en control biótico
-100
0
100
200
300
400
500
600
0 1 2 3 4 5 6
Observaciones
ppm
P(Fósforo) N-NH4 N-NO3
Tabla 13. Datos promedio de nutrientes obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
Nutrientes
MES 0 1 2 3 4
Nutriente P NH4 NO3 P NH4 NO3 P NH4 NO3 P NH4 NO3 P NH4 NO3
T15 120 2 95 224 884 528 226 694 532 479 1349 731 658 1915 1141
T15 120 2 95 203 928 673 228 727 544 619 1344 655 538 1873 1058
T15 120 2 95 221 735 537 237 709 556 591 1300 656 544 1887 1179
CA 120 2 95 104 120 70 138 204 100 228 346 46 160 383 67
CA 120 2 95 113 163 70 134 223 73 213 341 44 159 479 68
CA 120 2 95 108 173 74 133 226 74 228 333 55 164 432 82
104
5.3 COMPORTAMIENTO MICROBIOLÓGICO
5.3.1 Heterótrofos totales. Como se observa en la figura 40, durante el tiempo de
experimentación, el conteo de heterótrofos totales del suelo de estudio presentó un
aumento progresivo desde 104 hasta 106 en ambos grupos de observación, sin presentar
una diferencia significativa entre ellos (p=NS), sin embargo, los valores obtenidos en el
grupo 1 fueron mayores que los del grupo 2; con un incremento poblacional que inicia en
los meses 2 y 4 respectivamente.
Tabla 14. Datos de conteo de heterótrofos totales obtenidos a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
Mes TRIPLE 15 CONTROL BIÓTICO 0 474368 474368 1 593840 3000000 2 4736667 3000000 3 14154500 1009083 4 69363175 63583333
Figura 40. Correlación del comportamiento de heterótrofos totales vs tiempo de observación en UE de triple 15 y control biótico
20000
10020000
20020000
30020000
40020000
50020000
60020000
70020000
80020000
0 1 2 3 4 5
Meses
UFC
/ g d
e su
elo
T15 CB
105
5.3.2 Numero Más Probable. Como se observa en la figura 41 los microorganismos
degradadores de hidrocarburos presentaron un comportamiento creciente para el grupo 2,
con valores logarítmicos comprendidos entre 5 y 9; y decreciente para el grupo 1 entre los
meses 2 y 4 de experimentación con valores logarítmicos que varían de 1.7 a 6.
Los valores representados en logaritmos varían desde cientos hasta millones de UFC/ g
de suelo, y debido a que su dispersión es demasiado amplia se busca suavizar la serie
mediante la aplicación de logaritmos.
La correlación entre ambos grupos de experimentación fue de r= -0.72, lo cual significa
que el comportamiento de sus datos es inversamente proporcional.
Figura 41 Correlación entre numero mas probable vs tiempo de observación en UE de triple 15 y control biótico
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 1 2 3 4 5
Meses
Loga
ritm
o de
NM
P
Triple 15 CB
Tabla 15. Datos de Log de NMP obtenido a lo largo del tiempo de experimentación para UE de triple 15 y control biótico
Log NMP MES 1 2 3 4 T15 5 5 4 3 T15 6 6 5 2 T15 5 6 5 2 CA 6 4 8
106
CA 6 5 8 CA 6 5 8
Las tablas mostradas en cada uno de las variables, expresan los valores medios de la
totalidad de datos recolectados en laboratorio. Estos datos se muestran en detalle en el
anexo 9 y los soportes estadísticos del análisis de las variables en estudio se muestran en
el anexo 11.
5.3.3 Aislamiento de microorganismos
Los resultados del aislamiento de los microorganismos degradadores de hidrocarburos
en los dos grupos de experimentación, se muestran en la siguiente tabla:
Tabla16. Resultados de aislamiento de microorganismos.
NOMENCLATURA TINCIÓN DE GRAM MORFOLOGÍA T15 1 A Gram positivo Bacilo T15 2 A Gram positivo Levadura
T15 2 A 1 Gram negativo Bacilo T15 2 A 12 Gram positivo Bacilo T15 2 E 2 Gram negativo Bacilo
T15 2 E 31 Gram positivo Bacilo CB 1 A 11 Gram positivo Bacilo CB 1 A 12 Gram positivo Bacilo CB 1 A 2 Gram positivo Bacilo CB 2 A Gram positivo Levadura CB 3D1 Gram positivo Bacilo
La tabla 16. presenta las diferentas cepas encontradas para cada uno de los tratamientos.
Aquellas que fueron identificadas como gram positivas fueron inoculadas en BBL cristal,
con el fin de identificarlas taxonómicamente. Al llevar a cabo este procedimiento solo se
pudo identificar tres de las cepas que presentaban un cultivo puro. Los resultados se
muestran a continuación y los registros pueden observarse en el anexo 11.
107
Tabla 17. Resultados de identificación taxonómica –BBL cristal
Nomenclatura Identificación taxonómica T15 1 A Corynebacterium propinquum T15 2 E 31 Bacillus brevis CB 1 A 11 Bacillus brevis
Las figuras 42 y 43 muestran las fotografías de la tinción de gram de los microorganismos
identificados taxonómicamente:
Figura 42. Tinción de gram. CB 1 A 1
Figura 43. tinción de gram. T15 1 A
108
6 ANÁLISIS DE FACTIBILIDAD
Para el desarrollo de un proyecto de biorremediación después de tener claro su dimensión
y alcance, es muy importante analizar las diferentes alternativas de tratamiento, sus
ventajas y desventajas, costos, aplicabilidad, efectividad y alteraciones e impactos que
genera al medio ambiente y a la comunidad. Con base en esto, a continuación se
profundiza sobre aquellas temáticas que pueden ser determinantes a la hora de
seleccionar el método más conveniente para un proceso de biorremediación de suelos
contaminados con petróleo.
6.1 TRATAMIENTOS A NIVEL “IN SITU” Y “EX-SITU ”
Antes de empezar un proyecto de biorremediación se recomienda realizar un estudio de
factibilidad para caracterizar las propiedades del sitio. Hay dos aspectos a tener en
cuenta: 1) caracterización de las propiedades físico-químicas del sustrato (suelo, lodo,
sedimento) y del contaminante y 2) determinación del potencial de los microorganismos
del sitio para descomponer los hidrocarburos. La caracterización fisicoquímica consiste en
la determinación de parámetros como pH, textura, carbono orgánico, nutrientes y
concentración de hidrocarburos.
El estudio de biodegradación mas intensivo trata de simular las condiciones de campo en
el laboratorio, mediante el montaje de contenedores en los cuales se mantienen estables
las condiciones de nutrientes, aireación y humedad. Se desarrollan diferentes
tratamientos para probar su eficiencia mediante monitoreos periódicos y así determinar
cuales son las mejores condiciones para la biodegradación de hidrocarburos en un sitio
109
en particular162 ; y con base en los diferentes procedimientos y técnicas empleadas en el
proyecto llevado a cabo en laboratorio se pueden conocer las características y por
supuesto costos que implican desarrollar este mismo proyecto a nivel ex-situ e in-situ.
El tratamiento se desarrolla a nivel in-situ principalmente por dos razones: la primera
porque la cantidad de suelo contaminado es demasiado, dificultando así su traslado; y la
segunda porque retirar el suelo contaminado afecta a gran escala el ecosistema; cuando
estas razones no representan un obstáculo, se desarrolla un tratamiento ex-situ.
Debido a las grandes cantidades de terreno que se manejan en un tratamiento in-situ el
análisis de costos se calcula para 1 hectárea del terreno, para lo cual se necesitan
herramientas, operarios y muestreos con los cuales se pueda abarcar el total de área
tratada. Un muestreo adecuado requiere la división del área en unidades de suelos
uniformes en color, textura, topografía y profundidad, permitiendo así, bajo estas
condiciones, tomar 35 muestras por hectárea163. Como se puede ver en el anexo 12 los
costos para este tratamiento son elevados debido al uso de maquinaria pesada; cantidad
de fertilizante empleado y los análisis de laboratorio que deben ser llevados a cabo en
laboratorios certificados en donde se emplean procedimientos estandarizados que
aseguran la calidad y veracidad de los análisis.
Cuando se realiza ex-situ el suelo transportado se debe disponer para su posterior
tratamiento en un terreno baldío para no alterar ni afectar un ecosistema, y que presente
un horizonte B arcilloso para así evitar las infiltraciones de lixiviados producto del
tratamiento; sobre esta superficie dependiendo de la cantidad de suelo a tratar se diseñan
diferentes parcelas con un área y volumen determinado; esto en caso de que se coloque
directamente sobre el suelo receptor, lo cual disminuye los costos como se puede ver en
162 Adams S. Randy H, Rodriguez D. Verónica I. Y Garcia H. Leonardo. Potencial de la biorremediación de suelo y agua impactados por petróleo en el trópico mexicano. Marzo de 1999. 163 Suelos y Fertilización. Manuales para educación agropecuaria. Editorial Trillas. p. 52. 2002
110
el anexo 13; de lo contrario se debe contar con un geotextil o cualquier otro material
impermeable, o con contenedores para impedir la infiltración de lixiviados; aumentando
así los costos del tratamiento.
Estas dos formas para biorremediar el suelo, requieren métodos para controlar variables
que afectan el proceso tales como humedad, temperatura, pH, oxigeno, TPH`s y
nutrientes. El análisis de nutrientes es necesario antes de dar inicio al proceso para
conocer la cantidad de fertilizante que se debe adicionar, y al final para determinar el uso
posterior del suelo biorremediado, por lo cual también se recomienda hacer un análisis de
metales pesados. El análisis de TPH`s, por supuesto, indica el porcentaje de remoción del
contaminante y es el principal parámetro para conocer si el tratamiento fue efectivo.
Es importante tener en cuenta que los costos de los dos tratamientos mostrados en los
anexos 12 y 13, fueron obtenidos a partir de los costos de la presente investigación, los
cuales se muestran en el anexo 14.
6.2 TRATAMIENTOS PARA LA BIORRECUPERACIÓN DE SUELOS
La recuperación biológica de suelos contaminados con hidrocarburos se puede llevar a
cabo por medio de diferentes tratamientos ya sean in situ o ex situ. Los tratamientos más
aplicados a nivel mundial son: Bioventing, compostaje en Biopilas, Bioaumentación y la
Biolabranza, como se explicó en el numeral 1.4.3.
Como se ve en el anexo 15 el tratamiento de biolabranza presenta grandes ventajas en
comparación con los demás tratamientos por ejemplo: puede ser aplicado tanto In situ
como Ex situ, siendo mas recomendado el tratamiento in situ debido a que presentan
menores costos de ejecución, lo que no sucede con el tratamiento de biopilas el cual
implica la remoción y transporte del suelo contaminado. En cuanto a los requerimientos
técnicos, el tratamiento de biolabranza necesita laboreo y riego constantes pero no una
estructura adicional como ocurre con el bioventing para el cual se construyen pozos de
111
inyección de aire; en el caso de las biopilas, aun cuando no requieren la construcción de
estructuras si necesita terrenos amplios en los que se puedan disponer el suelo
contaminado y la materia orgánica además de un acondicionamiento del mismo para
evitar los problemas de lixiviación y en el caso de la bioaumentación se debe contar con
un laboratorio dotado con equipo de microbiología ya que este tratamiento se basa en el
aislamiento de microorganismos degradadores de hidrocarburos.
La biolabranza puede ser aplicada en la recuperación de suelos contaminados con casi
cualquier tipo de hidrocarburos, al igual que la bioaumentación, pero este no es el caso
del bioventing o las biopilas ya que dichos tratamientos presentan buenos resultados con
fracciones ligeras de hidrocarburos en su mayoría alifáticos. En cuanto a las condiciones
del medio para la aplicación de los distintos tratamientos, se encontró que los rangos de
pH, temperatura, % de humedad y cantidad de nutrientes no presentan variaciones muy
marcadas entre uno y otro, debido a que todos los tratamientos están basados en la
degradación microbiana de los hidrocarburos.
La biodegradación de hidrocarburos en suelos depende en gran medida de las
características del mismo; tratamientos como la biolabranza y la bioaumentación, han sido
probados en suelos de tipo arenoso, limoso y arcilloso con excelentes resultados, lo que
no pasa en el caso del bioventing y las biopilas que requieren de suelos con bajos
contenidos de arcilla y textura uniforme para lograr su recuperación. En el caso del
contenido de microorganismos del sustrato a remediar, se requiere en general más de
110 UFC/g. de suelo para iniciar la biodegradación de los hidrocarburos, dicho número
aumenta durante el periodo de tratamiento de acuerdo con los contenidos de nutrientes y
% humedad del mismo.
En cuanto a la duración de los tratamientos, se encontró que la biolabranza y las biopilas
requieren los periodos más cortos para la recuperación del suelo y con respecto a los
112
costos dependen de características particulares de cada uno de los tratamientos pero en
general la biolabranza y la bioaumentación son los más económicos.
113
7. DISCUSIONES
Tanto la humedad como la temperatura de las unidades experimentales se
mantuvieron en un rango constante relacionado con las condiciones climáticas del
laboratorio de Microbiología del Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad
De La Salle. El rango de variación de los datos de temperatura se mantuvo entre 13 y
17 ºC presentando una gran similitud con la temperatura media del Zipaquirá (12ºC),
es decir que se conservó el rango de temperatura óptima de crecimiento al cual se
encontraban adaptados los microorganismos del suelo de estudio, esto permitió un
desarrollo satisfactorio de la biota microbiana, ya que a dicha temperatura se
presentan las tasas más elevadas de crecimiento y reproducción166. De igual forma el
porcentaje de humedad se mantuvo dentro del rango establecido para el proyecto (30-
60%) lo cual proporcionó las condiciones necesarias para el tratamiento de
biolabranza.
El volteo del suelo contenido en las UE fue importante ya que este proceso aumenta la
biodisponibilidad de los hidrocarburos y nutrientes para los microorganismos, puesto
que al evitar la formación de terrones se aumenta la superficie de contacto para la
acción microbiana167 y se impide la generación de condiciones anóxicas en el medio.
El pH, a lo largo de la experimentación, disminuyó notablemente para las unidades de
triple 15 (grupo 1) y las de control biótico (grupo 2), debido a que los materiales
orgánicos del suelo son transformados continuamente por los microorganismos, en
ácidos orgánicos, CO2 y agua, para formar finalmente ácido carbónico, lo cual
166 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R.. Op cit. p.283 167 CUNNINGHAM C. J. Y PHILP J. C. Op. cit.
114
contribuye a que el suelo sea más acido.168 Por otro lado el N-NH4 al reaccionar con el
oxigeno del suelo, produce N-NO3 durante el proceso de nitrificación, liberando
hidrógenos169 y produciendo ácido nitroso170 lo cual incrementa la acidez del suelo.
Al final de la investigación se presentó un alto contenido de nutrientes (N-NO3, N-NH4
y P) en las unidades experimentales debido a que eran sistemas cerrados, y por ende
no presentaron procesos de lixiviación; además no se encontraban plantas que
pudieran asimilar los nutrientes inorgánicos disponibles para ellas.
En cuanto al N-NO3 y N-NH4, se presentó un aumento de estos nutrientes en ambos
grupos de observación a lo largo de la investigación. En las UE de Triple 15 este
comportamiento se debió principalmente a la adición del fertilizante en los meses 0, 2
y 3, ya que al aumentar en el medio las concentraciones de N orgánico se estimularon
los procesos de mineralización de materia orgánica y biodegradación de los
hidrocarburos, a través de los cuales los microorganismos obtienen la energía y los
nutrientes esenciales para su desarrollo, (específicamente el N es utilizado para
construir los bloques de proteínas en sus células); cuando han usado todos los
nutrientes que necesitan, el exceso es liberado al suelo en forma inorgánica
generando altas concentraciones de este nutriente en el medio. Los comportamientos
decrecientes para N-NO3 y N-NH4 se debieron a la asimilación por parte de los
microorganismos de la totalidad del nitrógeno adicionado, por lo tanto no se presentó
una liberación de N en forma inorgánica al medio.
168 Conceptos de fertilidad y productividad del suelo. Agropstar. p.12 169 Conceptos de Fertilidad y Productividad del suelo. Op. cit. p. 28 170 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Microbial ecology: Fundamentals and Applications. 2da ed. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA. p. 419. 1987.
115
Teniendo en cuenta que en las unidades experimentales de control biótico no hubo
adición de nutrientes, el N-NH4 presenta un incremento que se le atribuye a los
procesos de mineralización, ya que el primer producto resultante de la transformación
de la materia orgánica es el NH4, proveniente de la descomposición de proteínas,
aminoácidos y otros compuestos que contienen nitrógeno en forma orgánica,
regresando así gradualmente a una forma disponible cuando los microorganismos
mueren y sus células se descomponen.171
En el caso del NO3, este proviene en su mayoría de la trasformación del NH4 que
llevan a cabo las bacterias nitrificantes, dentro del proceso de nitrificación. 172 Gracias
a este proceso el NO3- queda disponible de forma inmediata para uso de las plantas y
microorganismos del suelo173. Los iones de nitrato se pueden incorporar a la materia
orgánica por gran variedad de organismos mediante un proceso conocido como
reducción asimilatoria del nitrato, la cual no causa la acumulación de cantidades
elevadas de iones de NH4 extracelulares, ya que el amonio se incorpora de una
manera relativamente rápida a la materia orgánica.174
En las UE de control biótico la cantidad de NO3 presenta una disminución que pudo
deberse a un proceso de reducción asimilatoria del nitrato. Se considera que no hubo
un exceso de NH4 ya que este causaría un efecto de retroalimentación negativa que
interrumpiría la reducción del NO3175. La disminución del NO3 posiblemente puede ser
atribuida a la baja cantidad de microorganismos nitrificantes capaces de metabolizar
todo el NH4 resultante de la mineralización de la materia orgánica.
171 Conceptos de Fertilidad y Productividad del suelo. Op. cit. p.28 172 Ibid 173 Ibid p. 29 174 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Op. cit., p. 420. 175 Ibid.
116
En general el comportamiento del fósforo en las UE de triple 15 y control biótico fue
creciente, a lo largo del tiempo de experimentación. Este comportamiento se debe a
que en los procesos de mineralización de materia orgánica y degradación de
hidrocarburos, además de liberarse los excesos de N-NO3 y N-NH4, se liberan los
excesos de fósforo asimilable y otros compuestos que no serán utilizados por los
microorganismos en la formación de biomasa; por otra parte, se presenta una
transformación continua del fósforo orgánico contenido en los componentes celulares
de los microorganismos que mueren, para reintegrarlo al medio en forma asimilable.
En las UE de Triple 15 se presentaron concentraciones de fósforo mucho mayores que
las de control biótico debido a que al adicionar un fertilizante compuesto como el
Triple 15, se agrega la misma cantidad tanto para nitrógeno, como para fósforo,
aunque las necesidades de este último fueran menores. Esto no se vio reflejado en los
resultados de los análisis de nutrientes a lo largo de la experimentación ya que las
concentraciones de fósforo siempre fueron menores a las del nitrógeno.
Existen varias razones por las cuales el fósforo se presentó en concentraciones
menores que las de nitrógeno en ambos grupos de observación; una de ellas es que el
fósforo adicionado se adsorbe fuertemente por el complejo del suelo y en parte resulta
inactivo176, por otra parte las características ácidas del medio (5.2) desencadenaron
una fuerte fijación de los aniones sobre todo el fosfato que, se incorpora a las arcillas
del suelo de estudio177; este hecho provoco una inmovilización definitiva del mismo
durante el mes 4 cuando el pH llegó a ser demasiado ácido (4) interviniendo en el
grado de solubilidad del fósforo y por consiguiente en su aprovechabilidad 178,
impidiendo así la presencia de fósforo asimilable analizado en la investigación.
176 SALAMANCA SANABRIA, RAFAEL. Suelos y fertilizantes. Universidad Santo Tomas. Edit. Usta1990. p.135. 177 Programa de Edafología: Primer curso de ciencias ambientales [online] Op.cit 178 SALAMANCA SANABRIA, RAFAEL iOp. cit. p,99
117
El comportamiento de las comunidades microbianas no presentó una diferencia
significativa entre las unidades experimentales de triple 15 y control biótico a lo largo
del tiempo de experimentación, notándose un mayor aumento en las unidades
formadoras de colonia (UFC) en el grupo 1, debido a la aplicación de nutrientes
inorgánicos, lo cual estimuló el crecimiento de los microorganismos autóctonos del
suelo en estudio y aceleró de manera significativa el proceso de biorremediación179.
En el grupo 2, se presentó un comportamiento similar al del grupo 1, aunque el
aumento de unidades formadoras de colonias no fue tan marcado, presentando un
comportamiento estable durante los tres primeros meses de experimentación, y
durante el último mes un aumento significativo en el conteo de heterótrofos totales;
esto demuestra que la abundancia de fuentes de carbono presentes en el sustrato al
contaminar el suelo con hidrocarburo, puede intensificar la actividad microbiana, pero
las bajas concentraciones de nutrientes retrasan los procesos de biodegradación de
dichos contaminantes.
Al inicio de la investigación, una vez se contaminó el suelo, el comportamiento de los
heterótrofos totales en ambos grupos de observación se mantuvo casi constante; esto
se presentó por la adición del petróleo y nutrientes (en el caso de Triple 15) al
sustrato generando un cambio repentino en las condiciones del medio de crecimiento.
Cuando se presentan este tipo de cambios, los microorganismos requieren de un
periodo de adaptación en el cual se observa un enriquecimiento selectivo de la
población y modificaciones genéticas que causan una mayor proporción de bacterias
degradadotas de hidrocarburos180. La adición de nutrientes en el grupo 1, favoreció la
reducción en la duración del periodo de adaptación a un mes, en cambio en el grupo
2, la carencia de altas concentraciones de nutrientes prolongó el periodo a 3 meses.
179 BROCK, T.D. Y MADIGAN, M.T. Op. cit., p. 583. 180 LEAHY J. G. y Collwell, R. R. Op.cit.
118
Durante el periodo de adaptación, los heterótrofos totales presentes en el suelo
contaminado, utilizan como fuente de carbono la materia orgánica presente en el
medio debido a que los elementos que la componen no son tan complejos como los
hidrocarburos, una vez se agotan estos materiales, se inicia la biodegradación del
crudo, por lo cual las comunidades de degradadores de hidrocarburos aumentan su
densidad poblacional. Esto se ve representado en los conteos de número más
probable; en el caso del grupo 1 el aumento de los degradadores de hidrocarburos se
dío muy rápidamente, casi a partir de la contaminación, lo que no sucedió en el grupo
2, en el cual el aumento de degradadores de hidrocarburos se empezó a evidenciar a
partir del mes 3.
Este comportamiento se puede explicar a partir de las relaciones C:N que se
presentaron en las unidades experimentales de ambos grupos. Para las UE de
Triple 15 las relaciones C:N en los 2 primeros meses de experimentación fueron de
tipo alto por lo tanto las tasas de mineralización fueron bajas, esto quiere decir que
durante los dos primeros meses los microorganismos degradadores de hidrocarburos
consumieron solamente los nutrientes necesarios para aumentar su tamaño celular y
lograr dividirse hasta tener una densidad poblacional alta. En los siguientes meses las
relaciones C:N fueron de tipo bajo, es decir que las tasas de mineralización fueron
altas, lo que se evidencia en la reducción de TPH, que alcanzó el mayor porcentaje de
remoción entre los meses 2 y 3; durante este mismo periodo las poblaciones de
microorganismos degradadores de hidrocarburos de las UE de Triple 15 empezaron a
disminuir de manera directamente proporcional a la cantidad de hidrocarburos en el
medio.
En control biótico, las relaciones C:N fueron altas durante todo el tiempo de
experimentación presentando pequeñas disminuciones mes a mes; por lo tanto las
119
tasas de mineralización fueron bajas, los microorganismos sólo consumían lo
necesario para suplir sus requerimientos metabólicos sin presentar un aumento en su
densidad poblacional; los porcentajes de remoción de hidrocarburos durante este
periodo también fueron bajos, demostrando que la fuente de carbono utilizada por los
microorganismos era la materia orgánica propia del suelo. Una vez se agotaron las
fuentes de carbono simples, se inició una degradación intensiva de los TPH´s que se
vió reflejada en el crecimiento poblacional y en el aumento de los porcentajes de
remoción de TPH´s.
Por otra parte, dentro de la degradación de hidrocarburos los microorganismos que
crecen sobre el sustrato pueden oxidar innecesariamente otras sustancias que no
puede asimilar como nutrientes o como fuente de energía, dejándolas disponibles en
el medio para otras poblaciones microbianas, proceso al que se le denomina
cometabolismo181, con el cual se puede justificar el aumento de los heterótrofos totales
en las unidades experimentales durante los últimos meses de experimentación. Los
procesos cometabólicos y actividades bioquímicas sinérgicas en consorcios
microbianos pueden conducir al reciclado total de compuestos relativamente
recalcitrantes182.
Por medio del aislamiento de los microorganismos degradadores de hidrocarburos se
pudo evidenciar la presencia de diferentes cepas bacterianas capaces de utilizar el
hidrocarburo como única fuente de carbono en el suelo de estudio. Las diferentes
cepas encontradas se desarrollaban simultáneamente en cooperación mutua, con lo
cual se logro comprobar que la degradación de hidrocarburos requiere de la presencia
de poblaciones mixtas con amplias capacidades enzimáticas para la degradación de
181 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Microbial ecology: Fundamentals and Applications. 2da ed. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA. 1987. p. 68. 182 ATLAS, R. M. Y BARTHA, R. Op. cit. p. 531. 1987.
120
mezclas complejas de hidrocarburos (petróleo crudo) en suelo183, ya que los
microorganismos individuales pueden metabolizar solo un limitado rango de sustratos
de hidrocarburos184.
Durante el tiempo de experimentación los TPHs en las unidades experimentales de
Triple 15 y Control biótico presentaron una disminución considerable, debido a los
procesos de mineralización como se explicó anteriormente, por esta razón la
disminución de TPHs fue mayor para las unidades experimentales de triple 15 en
comparación con las de control biótico.
Ya que los microorganismos del suelo tienen la capacidad para degradar las
fracciones recalcitrantes de los TPH´s como los PAH´s se realizaron análisis de
cromatografía líquida de alta resolución utilizando un estándar aprobado por la U.S.
Environmental Protection Agency (USEPA), el cual contenía 16 compuestos como se
describió en el numeral 4.9.2.3. De dichos compuestos, el naftaleno, aceftileno,
acenafteno, fluoreno, fenantreno, antraceno, y fluoranteno, conforman una fracción
volátil dentro de los PAH estudiados, por lo cual al analizar los cromatogramas
obtenidos para cada una de las UE, no hubo presencia de estos compuestos; por otro
lado, el criseno, DB(a,h) antraceno, B(g,h,i) perileno e indeno no fueron analizados
debido a que la sensibilidad del método de análisis no era suficiente para detectarlos y
sus concentraciónes en las muestras estudiadas eran muy bajas en comparación con
las de los demás compuestos. Finalmente los PAH´s analizados en ambos grupos de
estudio a lo largo del tiempo de experimentación fueron: pireno, B(a) antraceno, B(b)
fluoranteno, B(k) fluoranteno y B(a) pireno, ya que estos se encontraron en los
cromatogramas de todas las muestras. 183 BOSSERT, I. y BARTHA, R. The fate of petroleum in soil ecosistems. Citapo por LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R. Microbial Degradation of Hidrocarbons in the Enviroment. Microbiological Reviews. 1990. p. 308.
184 BRITTON, L.N. Microbial degradation of aliphatic hydrocarbons, citado por LEAVY, JOSEPH G. Y COLWELL RITA R. Microbial Degradation of Hidrocarbons in the Enviroment. Microbiological Reviews. 1990. p. 308.
121
Al analizar los cromatogramas de ambos grupos de experimentación, se encontraron
disminuciones bajas en las concentraciones de los compuestos analizados lo cual
evidencia la degradación de los mismos a lo largo del tiempo de investigación. Las
bajas tasas de degradación se atribuyen a que los procesos de biodegradación de
este tipo de compuestos son muy complejos y requieren mayores tiempos de
tratamiento que los TPH´s.
En el desarrollo de la presente investigación solamente se llevaron a cabo las
determinaciones de hidrocarburos (TPHs), nutrientes y microorganismos, a partir de
las cuales se obtienen datos que solo permiten realizar un análisis independiente para
cada variable y no un análisis general del proceso. Por esta razón no es posible llevar
acabo un balance de masas en cada una de las UE, ya que es necesario conocer las
cantidades específicas de cada una de las variables que compone la ecuación
bioquímica de la degradación de hidrocarburos, que se muestra en el anexo 7.
122
8 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en la evaluación de la atenuación natural demostraron que la
degradación de hidrocarburos por esta técnica requiere de un periodo de tratamiento
mayor al evaluado para lograr una reducción de los TPH hasta niveles que no afecten
la salud pública.
Los altos niveles de remoción de hidrocarburos obtenidos en el tratamiento de
biolabranza demostraron que la adición de nutrientes inorgánicos, en combinación con
altos porcentajes de humedad y condiciones aeróbicas agilizan los procesos de
biodegradación de hidrocarburos totales de petróleo en suelo.
La disminución en el porcentaje de remoción de hidrocarburos después de llevar a
cabo los procesos de biolabranza y atenuación natural en el suelo de estudio, se le
atribuye específicamente a la cantidad de nutrientes con la cual fueron tratados, ya
que los dos se mantuvieron bajo los mismos parámetros de humedad, temperatura y
aireación.
Los conteos de microorganismos heterótrofos totales del suelo de estudio, permitieron
evidenciar, a lo largo del tiempo de experimentación, los diferentes comportamientos
que esta comunidad microbiana presentó ante el evento de contaminación por
hidrocarburos; resaltando como los más representativos del proceso, el periodo de
adaptación a las nuevas condiciones del medio y la degradación intensiva del
contaminante.
123
El desempeño de los microorganismos degradadores de hidrocarburos es optimo
cuando en el medio se presentan las condiciones ambientales y nutricionales
adecuadas, las cuales generan en los microorganismos una capacidad de respuesta
rápida a eventos de contaminación.
El análisis de factibilidad representa una importante herramienta para determinar bajo
que condiciones debe realizarse el tratamiento de biorremediación, aun cuando a partir
de este no se puedan cuantificar los beneficios ambientales.
La elección de un tratamiento para biorremediar el suelo contaminado con
hidrocarburo no depende solo de la disponibilidad económica, sino también de las
características propias del terreno, del contaminante y del impacto ambiental negativo
que pueda este pueda generar.
La disminución en las concentraciones de los PAH a lo largo del tiempo de
experimentación fue muy baja debido a que este tipo de compuestos presentan poca
degradabilidad y volatilidad, por lo tanto tienen un alto grado de persistencia en el
medio.
124
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda el desarrollo de procesos de biorremediación de suelos contaminados
con hidrocarburos por la técnica de biolabranza y adición de nutrientes inorgánicos
(Triple 15) in situ con el fin de comprobar su efectividad en condiciones de campo.
Se recomienda el desarrollo de proyectos de investigación sobre otras técnicas para la
biorremdiación de suelos contaminados con hidrocarburos como los son: el bioventing,
las biopilas, y la bioaumentación entre otras, con el fin de determinar cual de ellos
presenta más eficacia y eficiencia en el tratamiento de este tipo de sustratos.
Se recomienda aplicar la técnica de biolabranza con adición de nutrientes inorgánicos
(Triple 15) en diferentes tipos de suelos en Colombia, con lo cual se puedan elaborar
tablas de transferencia tecnológica que permitan la evaluación e implantación de estos
tratamientos en campo de una manera más sencilla y a costos más bajos.
Se recomienda que en el desarrollo de investigaciones sobre la biorremediación de
suelos contaminado con petróleo se cuantifique las cantidades de biomasa, agua,
hidrocarburos, nutrientes y CO2 a partir de las cuales se pueda llevar a cabo un
análisis de entradas y salidas para conocer a fondo la dinámica del proceso de
degradación de hidrocarburos.
Se recomienda que en futuros proyectos de investigación se determine la capacidad
de remoción de hidrocarburos de cada uno de los aislamientos obtenidos en la
presente investigación.
BIBLIOGRAFIA
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Anexo 1. Descripción de algunos artículos sobre biorremediación bajo diferentes condiciones de suelo y contaminantes. AUTOR TITULO TECNICAS TIPO DE SUELO
Belloso Claudio et
al,1998
“Biodegradación de hidrocarburos
en suelos contenidos en
terrarios”
XXVI congreso interamericano de
Ingeniería Sanitaria y Ambiental
Obtención de un suelo de landfarming de una refinería; trasladado a 11 terrarios metálicos, cada uno con 30 Kg.
Aislamiento de tres cepas diferentes del suelo de landfarming e inoculadas de nuevo en los diferentes terrarios por separado.
Aplicación de dos diferentes fertilizantes de tipo NPK.
Cada terrario contenía: suelo, uno de los fertilizantes y un inoculo bacteriano.
Uno de los terrarios fue un control abiótico al cual se le adicionó HgCL2.
A lo largo de todo el estudio se hicieron análisis de:
• pH por suspensión de suelo en CaCl2 • Humedad por secado a 105°C • Contenido de hidrocarburos gravimetricamente por soxhlet. • Recuento de microorganismos aerobios totales por recuento directo en placa • Microorganismos degradadores de hidrocarburos por NMP Tiempo de experimentación: 90 días
Suelo de landfarming con hidrocarburos: - Saturados 44% - Aromáticos 17% - Resinas 14% - Asfaltenos 25% Carbono orgánico inicial = 1.07%
Charles M. Reynolds, et
al, 1997
“Soil remediation demonstration
projetc: biodegradation of heavy fuel Oils”
Suelo obtenido en Alaska, fue contaminado una parte con diesel y otra parte con petróleo crudo. Se hizo un montaje de 8 unidades experimentales: 4 hacen parte del tratamiento de landfarming, en parcelas de 30 cm2 x 60 cm. Y 4 del tratamiento de Bioventing en parcelas de 4.5 m2 x 100 cm. Cada tratamiento contiene 2 parcelas con suelo contaminado con diesel y 2 parcelas con suelo contaminado con petróleo crudo. En donde una contiene fertilizante agrícola y la otra no para los dos casos. Se realizaron análisis de hidrocarburos totales de petróleo (TPHs). La extracción fue llevada a cabo por sonication, analizada por gravimetría y luego llevada a cromatografía gaseosa y detección de flama ionizada. Tiempo de estudio 362 días
El suelo contaminado con petróleo crudo fue obtenido de un relleno de grava cerca de la estación de bobeo número 10 del oleoducto de Alaska. El suelo contaminado con diesel fue un suelo arenoso utilizado en los tanques de almacenamiento de Ft Wainwright Alaska.
AUTOR TITULO TECNICAS
Joseph H. Salanitro et
al
“Crude oil hidrocarbon
Bioremediatión and soil ecotoxity
assesment”
Contaminación de dos tipos de suelo de características diferentes: Norwood y Norwood/ Baccto con tres tipos de petróleo: heavy, medium y light en montajes diferentes, para un total de 6 montajes con un tiempo de duración de12 meses.Adición de sales para una relación C:N:P 100:1:0.2 Análisis de: • BTEX método 8240 modificado con metanol usando cromatografía de gases. • Aceites y grasas y TPHs por método soxhlet 5520E y F utilizando freón. • Extracción de PAHs método 3550 EPA. • Metales pesados (Zn,Ni,V) método 6010 y 7471 EPA • Gravedad API. • Contenido de carbón orgánico • pH. Nutrientes.
Suelo Norwood: 15% arcilla, 60% sedimento, 0.3% materia orgánica, pH 8.2. Suelo norwood/Baccto: mezcla de dos suelos, el primero contiene 4% arcila, 20.3% materia orgánica y pH 4, y el segundo 4.65% d materia orgánica y pH 7.1
Lee Cheol-Hyo, et al.
Attenuation Of Petroleum
Hydrocarbons In Smear Zones: A
Case Study
Contaminación derivada de tanques de almacenamiento cuya extensión abarca 500 m desde la fuente. Para el estudio de dicha área las muestras de suelo fueron tomadas a varias profundidades (1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 y 6 m) localizando pozos de monitoreo (piezómetros) y una pantalla con longitud de 30 cm en cada una de ellas. Tres grupos de pozos de monitoreo fueron instalados a 20 m (serie A), a 30 m (serie B) y a 100 m (serie C). Durante todo el estudio se monitorearon: gas del suelo, tamaño de granos por ASTM, conductividad eléctrica por método de Hazen, permeabilidad del aire por método Massmann, contenido de carbón orgánico por método de dicromato de potasio, concentración de tolueno por cromatografía de gases con ionización de flama, gases del suelo por cromatografía de gases, O2, CO2 y CH4 por medio de instrumento portátil, hierro ferrroso Fe2
2- por HACH 2000, Nitratos (NO3
*) y sulfatos (SO42-) por cromatografía.
Estudio realizado en Korea, 45 Km al suroeste de Seoul. Caracterizado por acuífero no confinado de poca profundidad con alta amplitud. Abarca un área de 60000 m2 que muestra contaminación an agua y suelo con compuestos de hidrocarburos especialmente tolueno. El suelo sin contaminar tiene las siguientes características: O2=20.9%, CO2=<0.1%,
CH4 no se detecto. AUTOR TITULO TECNICAS
Dibble U.T and Bartha
R.
Effect of environmental
parameters on the biodegradation of
oil sludge.
Preparación del suelo, mezclando 10 g de este, 10 g de arena, agua y lodo de petróleo. Se realizaron tres pruebas, a las cuales se les adicionaron nutrientes NH4NO3 y K2HPO4 manteniendo las siguientes relaciones: • Prueba 1: CN 15:1, CP 200:1, CK 100:1 • Prueba 2: CN 60:1, CP 800:1, CK 400:1 • Prueba 3: CN 300:1, CP 4000:1, CK 2000:1 Otra prueba fue realizada como control a la que no se le adicionó nutrientes. Las tasas de lodo fueron variadas para cada prueba con valores de 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 y 3.0g Los monitoreos constaron de determinaciones de pH, capacidad de retención de agua, contenido de humedad, temperatura, niveles de fertilizantes inorgánicos, hidrocarburo residual y CO2. Los TPHs fueron determinados por gravimetría a partir de soxhlet y la separación de hidrocarburos por columna de cromatografía de silica gel suspendida en hexano.
Lodos de petróleo de refinería y suelo de probables sitios futuros de disposición para llevar a cabo landfarming de refinería de petróleo de New Jersey central; con las siguientes características: contenido orgánico=3.2%, Nitrógeno total=0.03%, pH=3.7, nutrientes: Mg=371, P=12, K=13, NO3
- =6, NH4
+=8.
Sanjeet Mishra, et
al.
Evaluation of inoculum addition to simulate in situ bioremediation of
oily-sludge contaminated soil.
Biorremediacion de suelos contaminados con lodos de petróleo en refinería de petróleo donde la población nativa de bacterias degradadoras de hidrocarburos fue muy baja. El proyecto consistió en inicialmente realizar un estudio de factibilidad durante 120 días en un área de 576 m2, dividida en 24 parcelas , que contenían cuatro replicas para cada tratamiento y cuya área era de 1m*1m y separadas entre si por 2 m. Los tratamientos fueron: 1)suelo contaminado y nutrientes, 2) suelo contaminado y el consorcio bacteriano, 3) suelo contaminado, bacterias y nutrientes, 4) suelo contaminado y dos bacterias del consorcio, 5) suelo contaminado, dos bacterias del consorcio y nutrientes, 6) suelo contaminado como control en el cual no se hizo ningún tratamiento. El tratamiento que arrojo resultados mas óptimos fue el que contenía suelo contaminado, consorcio bacteriano y nutrientes. Bajo estas condiciones se desarrollo el estudio a gran escala llevado a cabo en una hectárea “in situ” del mismo suelo contaminado con el cual se trabajo en es estudio de factibilidad. La hectárea fue dividida en tres parcelas A,B y C; de 4000, 5900 y 100 m2
Ambos estudios fueron realizados en la refinería Mathura, 150 Km al sur de Delhi. Este lugar contiene varios tipos de lodos de petróleo: lodos de tanques de crudo, efluente de planta de tratamiento de lodos y columna de destilación de lodos. El suelo es negro, con una densidad δ= 1.3 ± 0.2 g/cc, capacidad de retención de agua = 59 ± 4, pH = 7.4, carbón
respectivamente. A las unidades A y B se les adicionó 1 Kg de consorcio bacteriano y 50 litros de una mezcla de nutrientes por m2 y C fue un control. Las parcelas fueron aireadas y humedecidas periódicamente. Se hizo determinación de carbón orgánico, nitrógeno, fósforo disponible, potasio, % humedad, pH, metales pesados y TPHs (totales y fraccionamiento) antes y después de adicionar las bacterias, cada 45 días durante un año. El consorcio bacteriano fue obtenido de un pozo de petróleo localizado en India, este contiene 5 bacterias capaces de degradar alifáticos, aromáticos, NSO2, y asfalteno.
orgánico = 3.2 ± 0.15, nitrógenos total = 0.046 ± 0.02, potasio = 130 ± 8 mg/Kg, y fósforo disponible = 12 ± 0.5 mg / Kg.
Microbios que
limpian el petróleo derramado
Aislamiento de microorganismos degradadores de hidrocarburo para desarrollar tratamientos de biodegradacion estimulada. Aplicado a 4000 m3 de lodos y tierras contaminadas. Inicialmente se aisla la cepa del suelo contaminado con el cual se prepara un caldo microbiano, preparado con una emulsión de una fuente de carbono (melaza), nutrientes simples y agua, y se adiciona a un suelo al cual se le ha dosificado nutrientes y ajustado su acidez (pH). Esta mezcla se adiciona al suelo o los lodos contaminados con el hidrocarburo.
Suelo contaminado con petróleo procedente del complejo industrial de Barrancabermeja de ECOPETROL.
“Guía para la biodegradación
natural de suelos contaminados con
crudo y de residuos aceitosos
en la recebera PG-32”
Lodos aceitosos acumulados de la recebera PG32 se mezclaron con tierra y se
ubicaron en 10 pilas longitudinales con alturas entre 0.6 y 1.5 m, con un 25%
en volumen de material de compostaje y con adición de nitrógeno y fósforo
como suplemento mineral. Fue necesario ajustar el pH entre 6-8 y la cantidad
de agua.
Se realizaron análisis de humedad, nutrientes, pH, hidrocarburos totales de petróleo por espectroscopia infrarroja y caracterización inicial mediante cromatografía de gases. Fueron realizados 11 muestreos para análisis en los meses 0,1,2,4,8,12,16,20,24,30 y 36.
ANEXO 2. Cálculos para determinar la cantidad de petróleo a adicionar al suelo
δ aparente del suelo 1 = 1.08 g/cc
Cantidad de suelo recolectado (finca san Javier) = 53 Kg/UE
Cantidad total de suelo recolectado = 53 Kg * 24 UE = 1272 Kg UE
Concentración de hidrocarburo al cual se quiere llevar el suelo = 20000mg/kg
Se realizan las multiplicaciones necesarias para averiguar la cantidad de petróleo que es necesario adicionar al suelo recogido.
Volumen de petróleo = 20000 mg * 1cc * 1 g * 1lt * 1272 Kg Kg 1.08 g 1000mg 1000 cc
Volumen de petróleo = 23.56 lt = 24 lt
ANEXO 3. Características del crudo castilla
ANEXO 4. Cálculo para la adición de fertilizante inorgánico triple 15.
Concentración fósforo = 120 ppm* Concentración nitratos = 94.9 ppm* Concentración amonio = 2.3 ppm*
Relación C:N:P 100:10:1
Concentración de hidrocarburos = 21481.5 mg peso seco Kg
Relación C:N:P 21481.5: 2148.15: 214.815
Fracción peso seco = 0.6596
Determinación de nitrógeno:
94.9 + 2.3 = 97.2 mg N peso húmedo * 0.6596 = 64.11312 mg peso seco (ps) Kg Kg
2148.15 mg N peso seco – 64.11312 mg peso seco = 2084.03688 mg N peso seco kg Kg Kg
δ aparente = 1.08 g/cc*
W = peso del suelo
A = área de UE = 2400 cm2
h = altura de suelo en cada UE
W = δa * A * h = 1.08 g/cc * 2400 cm2 * 13 cm W = 33696 g = 33.696 Kg
Se realiza una regla de tres para determinar la cantidad de agua presente en la muestra de suelo contaminado:
100 Kg suelo 34.04Kg H2O** 33.696 Kg suelo X
X = 11.47012 Kg H2O
** dato de humedad realizado en los laboratorios de la universidad de la salle
33.696 Kg suelo - 11.47012 Kg H2O = 22.2259 Kg de suelo ps
2084.03688 mg N peso seco * 22.2259 Kg suelo ps = 46.3196 g N Kg suelo ps
la cantidad que se necesita agregar a cada unidad experimental es de 46.3196 g Nitrógeno
Determinación de fósforo:
120 mg P peso húmedo (ph) * 0.6596 = 79.152 mg P ps Kg Kg
214.815 mg P ps – 79.152 mg P ps = 135.663 mg P ps Kg Kg Kg
135.663 mg P ps * 22.2259 Kg de suelo ps = 3.0152 g P
para determinar la cantidad de T15 a aplicar se hace una regla de tres:
100 g suelo 15 g N
X 46.3196 g
X = 308.7973 g de T15
Se adicionó a cada UE 308.7973 g de T15 que se aplicaron como se explico en el numeral 2.7; 50% (154g) durante el primer mes de experimentación, un 25% (77g) el segundo mes y el 25% restante en el tercer mes.
ANEXO 5. Determinación de % de recuperación de hidrocarburos mediante la prueba de spike
Porcentaje de recuperación (%R) de hidrocarburos del método de extracción por agitación y diclorometano como solvente. Determinación del Spike: La muestra inicial contenía una concentración de aproximadamente 10000 ppm de TPH y fue necesario aumentar dicha concentración hasta 60000 ppm por lo que se adicionaron a la muestra 0.06 g. de petróleo crudo de acuerdo con la siguiente relación:
TPH.g06.0TPHmg60.g1*g1000
suelokg1*suelo.kg1
TPH.mg60000==
Al pesar el suelo y el hidrocarburo para el spike se obtuvo teóricamente la siguiente concentración de hidrocarburos en la muestra problema:
suelokg/HCmg93.64753suelo.kg1
suelo.g1000*HC.g1
HCmg1000*suelo.g0038.1HC.g065.0
=
HC: Hidrocarburos Los datos obtenidos tanto para la muestra con spike como para la muestra sin spike fueron los que se presentan a continuación:
MUESTRA PESO MUESTRA
(g.)
GANANCIA W (g.)
F.P.S TPH (ppm)
Con spike 1.0038 0.0486 0.693 69864.38 Sin spike 1.0478 0.0078 0.7106 10475.89 Blanco 0.0014 Las ppm de TPH de cada muestra se determinaron de acuerdo con la ecuación 4 explicada en el numeral 3.8.3.2, del capitulo Materiales y Métodos. El porcentaje de recuperación de hidrocarburos se halló de acuerdo con la siguiente ecuación:
%71.91100*93.64753
89.1047538.69864R% =−
=
ANEXO 6. Datos analizados por prodycon.
ANEXO 8. Cromatogramas de PAHs.
ANEXO 7. Balance de masa
El fundamento bioquímico de la biodegradación de hidrocarburos se explica en la figura en la cual se puede ver que el proceso de biorremediación consiste en la destrucción de la estructura de los hidrocarburos para convertirlos en sustancias no toxicas como: dióxido de carbono, agua y biomasa.
Con los datos obtenidos en laboratorio no fue posible realizar un balance de masa al no tener valores reales de las demás variables que intervienen en el sistema.
Por medio de la figura se pueden observar las entradas y salidas de el proceso al cual fue sometido el suelo contaminado con petróleo en cada una de las unidades experimentales.
HIDROCARBURO 1. Microorganismos 2. Nutrientes 3. Oxigeno
Biomasa + H2O + CO2
Biomasa Nutrientes H2O CO2 Hidrocarburo
Hidrocarburo Nutrientes H2O O2
UE
Microorganismos Nutrientes
Las concentraciones de hidrocarburo, cuantificación microbiana y nutrientes fueron variables medidas en laboratorio, tanto a la entrada como a la salida del sistema, es decir, al principio y al final de los cuatro meses de experimentación. Esto permitió que, con base en los resultados mostrados en el anexo 9, se obtuvieran los % de remoción de TPH para cada uno de los meses de experimentación y para su totalidad, como se muestra en la siguiente tabla.
MES 1 mes 2 mes 3 entrada salida % remoción %remoción % remoción % remoción total T15 23280 19815 8 19815 6830 66 6830 6.151 10 71,4 T15 23280 18203 15 18203 7413 59 7413 7.044 5 67,2 T15 23280 22293 4 22293 7427 67 7427 5.375 28 76,9 T15 23280 22592 3 22592 7962 65 7962 4.899 38 79,0 T15 23280 21596 7 21596 4728 78 4728 2.028 57 91,3 T15 23280 21835 6 21835 5486 75 5486 3.420 38 85,3 CB 23280 21802 6 21802 15220 30 15220 8.261 46 64,5 CB 23280 22175 5 22175 15499 30 15499 9.269 40 60,2 CB 23280 22646 3 22646 9438 58 9438 8.309 12 64,3 CB 23280 23280 0 25227 9507 62 9507 8.049 15 65,4 CB 23280 23280 0 26620 20866 22 20866 14.714 29 36,8 CB 23280 23059 1 23059 14370 38 14370 11.206 22 51,9
23480 mg/Kg TPH
UE mg/Kg TPH
ANEXO 9. Datos recolectados en laboratorio.
• Temperatura
CUADRO TEMPERATURA °C T15 CB TIEMPO
SEMANA UE1 UE2 UE3 UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2
S1 15 15 15 15 15 15 14 14 15 15 14 14S2 14 15 14 15 14 15 15 15 14 15 14 15S3 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14
MES 2
S4 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14S1 15 15 13 13 13 13 13 13 14 13 14 14S2 16 16 15 15 15 15 14 14 15 15 14 14S3 16 15 15 15 16 16 17 16 17 16 16 16S4 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14
MES 3
S5 15 15 15 14 15 15 15 14 14 14 14 15S1 15 15 16 16 15 15 16 16 16 16 16 16S2 17 17 16 16 16 16 16 16 15 15 15 15S3 16 16 15 16 16 16 17 17 16 16 17 17
MES 4
S4 14,5 15 14 14 15 15 15 15 15 15 15 15
• Humedad
% H T15 CB MES
SEMANA UE1 UE2 UE3 UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m20 52 52 52 52 52 52 52 52 52 52 52 52
S1 37 37 37 37 37 37 40 40 40 40 40 40S2 46 47 48 47 40 40 52 50 51 50 48 48S3 49 45 50 52 47 47 49 51 45 50 45 46
1
S4 47 48 38 46 46 41 39 44 43 43 42 45S1 50 55 58 56 54 52 57 61 61 55 67 542 S2 45 47 50 49 46 47 48 52 52 55 54 53S2 53 43 56 51 52 52 55 51 54 64 54 54S3 46 37 49 49 48 46 52 54 53 57 52 55S4 40 60 42 39 40 41 48 50 52 53 49 52
3
S5 55 37 50 48 53 50 42 49 43 49 51 49S1 41 41 53 48 52 52 49 49 48 54 46 48S2 46 38 46 41 47 46 44 45 41 45 46 44S3 49 39 47 41 48 50 42 43 45 46 45 45
4
S4 44 36 43 40 43 43 45 43 48 44 44 41
• pH
pH T15 CB TIEMPO
SEMANA UE1 UE2 UE3 UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2
MES 0 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2S1 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 6,1 6,1 6,1 6,1 6,1 6,1MES 1 S3 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 6,0 6,1 6,1 6,1 6,0 6,1S1 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0MES 2 S2 6,1 5,9 6,1 6,0 5,8 5,9 6,4 6,5 6,4 6,4 6,5 6,5S2 6,4 6,5 6,5 6,4 6,5 6,4 6,6 6,5 6,6 6,5 6,6 6,6S3 6,5 6,6 6,6 6,6 6,5 6,6 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8S4 5,0 5,0 5,5 5,0 5,0 5,0 5,4 5,4 5,4 5,5 5,3 5,4
S5 4,8 4,8 4,9 4,9 4,8 4,9 5,3 5,3 5,4 5,4 5,3 5,3S1 4,7 4,6 4,7 4,7 4,6 4,6 5,2 5,2 5,4 5,2 5,2 5,2S2 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 5,1 5,3 5,3 5,3 5,2 5,3S3 4,6 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 5,0 5,0 5,1 5,0 5,0 5,0
MES 4
S4 4,3 4,3 4,3 4,3 4,3 4,2 4,8 4,8 4,8 4,8 4,7 4,7
• TPHs
TIEMPO EXPERIMENTACIÓN T15
UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2
MES 1 21481,5 21481,5 23280 23280 23280 23280 MES 2 19815,28 18203,409 22292,55 22591,6 21595,794 21834,5MES 3 6829,813 7412,8375 7427,436 7961,54 4727,8948 5485,97MES 4 6150,509 7044,1265 5375,031 4898,72 2028,4435 3419,81TIEMPO
EXPERIMENTACIÓN CB
UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2
MES 1 23280 23280 23280 23280 23280 23280 MES 2 21802,1 22175,472 22646,17 25227,4 26619,899 23059,3MES 3 15219,89 15499,398 9437,86 9507,1 20865,949 14369,9MES 4 8261,418 9269,4101 8308,767 8049,43 14714,208 11206,1
• PAHs
Triple 15
MES Pireno B(a)
antraceno B(b)
fluoranteno B(k)
fluoranteno B(a) pireno 1 1,41 0,037 0,038 0,2 2 1,3 0,0476458 0,032 0,167 0,0619273 2 2,01626 0,0452596 0,0462917 0,179 0,0523111 2 1,68 0,0501352 0,0397265 0,176 0,0646291 2 1,00812 0,0380044 0,0378136 0,146275 2 1,04165 0,0414862 0,145263
1,409338333 0,0432552 0,03876636 0,168923 0,0596225 3 1,5691 0,0407999 0,0347983 0,149 3 1,09083 0,036595 0,1145 3 1,376 0,0493771 0,119 0,0509139 3 1,495 0,0423952 0,0444554 0,12 3 0,861408 0,0273218 0,02942 0,118625 3 0,91 0,0260614 0,0283576 0,107086 0,0656861
1,217056333 0,03709173 0,034257825 0,1213685 0,0583 4 0,7 0,032 0,0288 0,118 0,069933 4 0,67 0,0292796 0,0281743 0,102 0,0598259 4 1,28 0,0302003 0,0350566 0,12 0,039 4 1,18 0,038 0,035 0,115124 0,0418591 4 0,627 0,0244637 0,0939606 0,034423 4 0,738 0,0220161 0,0263938 0,083306 0,0351019
0,865833333 0,02932662 0,03068494 0,105398433 0,046690483
PAH`s CONTROL BIÓTICO
MES Pireno B(a)
antraceno B(b)
fluoranteno B(k)
fluoranteno B(a) pireno1 1,41 0,037 0,038 0,2 2 1,475 0,046 0,045 0,174 2 1,701 0,045 0,046 0,169 0,058 2 1,474 0,045 0,050 0,169 0,055 2 0,823 0,046 0,049 0,164 0,056 2 1,31958 0,0379296 0,044006 0,178795 0,0555562 1,29015 0,0394414 0,0460992 0,167576 0,0586518
1,35601543 0,04243781 0,04542883 0,17460071 0,056632563 1,370 0,043 0,036 0,139 0,045 3 1,347 0,034 0,036 0,121 0,043 3 1,340 0,041 0,046 0,142 0,056 3 1,364 0,044 0,042 0,136 0,058 3 1,28544 0,0355428 0,0390882 0,126688 0,05009753 1,28986 0,0321782 0,0347419 0,119643 0,0483616
1,333 0,038 0,039 0,131 0,0504 1,275 0,032 0,033 0,118 0,0324 1,173 0,031 0,0304 0,616 0,038 0,035 0,113 0,0534 0,033 0,031 0,105 0,0514 1,1285 0,0276 0,0271242 0,0776549 0,04491344 1,15 0,0227652 0,02989 0,071 0,0404
1,068 0,031 0,031 0,097 0,042
• Nutrientes
T15 CB MES NUTRIENTE UE1 UE2 UE3 UE1 UE2 UE3
m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 P(Fósforo) 85,95 86 86 85,95 85,95 85,95 85,95 86 86 86 86 86
N-NH4 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 0 N-NO3 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2 97,2
P(Fósforo) 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120N-NH4 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 0 N-NO3 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9
P(Fósforo) 225 223 203 203 219 223 92 115 106 120 98 117N-NH4 877,5 890 953 902,1 826,5 644,4 149,1 90,4 165 162 180 166N-NO3 626,8 430 689 657,3 604 470,4 74,1 65,4 73,8 66,8 74,1 73,5
1
N-mineral 1504 1320 1642 1559 1430,5 1115 223,2 156 238 229 254 240P(Fósforo) 227 225 235 220 221 253 137 139 131 136 135 131
N-NH4 745,9 641 741 713,3 712,1 706,4 192,4 215 216 231 221 232N-NO3 570,2 495 550 537,9 548,1 564,8 88,6 111 78,5 66,9 84,7 63,8
2
N-mineral 1316 1136 1291 1251 1260,2 1271 281 326 294 298 306 295P(Fósforo) 522,6 436 663 575 571,7 610,6 207,4 248 224 203 221 235
N-NH4 1399 1298 1327 1361 1365,6 1234 349,1 342 344 339 339 328N-NO3 730,8 675 635 658,4 695,5 616,7 45,6 47,2 44,1 44 53,2 56,6
3
N-mineral 2130 1972 1962 2019 2061,1 1851 394,7 389 388 383 392 385P(Fósforo) 658 657 601 474 613 474 197 123 158 160 124 204
N-NH4 1877 1952 1803 1943 1917,5 1856 360,3 406 432 525 457 407N-NO3 1065 1218 1012 1104 1181,5 1176 70,9 62,4 66,7 69,4 79,1 85,2
4
N-mineral 2943 3170 2815 3047 3099 3031 431,2 469 499 595 536 492
• Conteo de heterótrofos totales
muestra 10^-2
10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 10^-9 MES
O compuesta Inc Inc 47,4368 12,2298 1,4824 1,4824 1,1118 5,9296
10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 muestra 10^-2
10^-3 Rps*10^4 Rps*10^5 Rps*10^6 Rps*10^7
m1 Inc Inc 33,27 9,17 5,43 2,04 UE1 m2 Inc Inc 52,54 11,53 5,42 4,41 m1 Inc Inc UE2 m2 Inc Inc 28,93 9,52 5,29 1,76 m1 Inc Inc 42,58 27,92 8,03 1,75
T15
UE3 m2 Inc Inc 139,6 9,77 2,44 0,7 m1 Inc Inc Inc UE1 m2 Inc Inc Inc m1 Inc Inc Inc UE2 m2 Inc Inc Inc m1 Inc Inc Inc
MES 1
CB
UE3 m2 Inc Inc Inc
10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 muestra 10^-2
10^-3 Rps*10^4 Rps*10^5 Rps*10^6 Rps*10^7
m1 Inc Inc Inc 22,59 0,3423 2,74 UE1 m2 Inc Inc 96,87 17,46 2,74 2,4 m1 Inc Inc Inc 74,92 8,7 1,34 UE2 m2 Inc Inc Inc 22,07 10,37 3,34 m1 Inc Inc Inc 82,44 18,05 3,06
T15
UE3 m2 Inc Inc Inc 64,72 2,38 3,75 m1 Inc Inc Inc UE1 m2 Inc Inc Inc m1 Inc Inc Inc
MES 2
CB
UE2 m2 Inc Inc Inc
m1 Inc Inc Inc UE3 m2 inc inc inc
10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 10^-9 muestra 10^-2
10^-3 Rps*10^4 Rps-10^5 Rps*10^6 Rps*10^7 Rps*10^8 Rps*10^9
m1 Inc Inc Inc 236,71 11,98 0 0 0,71 UE1 m2 Inc Inc 43,70 29,24 26,08 2,82 0,71 3,52 m1 Inc Inc Inc 139,73 37,63 0,35 1,04 1,39 UE2 m2 Inc Inc 160,99 133,81 2,79 10,1 0,35 1,39 m1 Inc Inc 308,75 163,42 2,05 1,02 0,34 0,34
T15
UE3 m2 Inc Inc Inc 146,36 38,55 2,39 0,68 0,34 m1 Inc Inc 77,41 34,06 13,42 4,82 4,13 2,75 UE1 m2 Inc Inc 86,36 63,99 12,73 29,59 0,69 2,06 m1 Inc Inc Inc 62,24 3,76 2,74 4,79 1,71 UE2 m2 Inc Inc 51,30 22,57 15,73 6,84 2,74 9,23 m1 Inc Inc 47,69 32,02 5,67 7,34 3 3
MES 3
CB
UE3 m2 Inc Inc 42,69 23,34 8,67 13,67 3,33 7
10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 10^-9 muestra 10^-2
10^-3 Rps*10^4 Rps*10^5 Rps*10^6 Rps*10^7 Rps*10^8 Rps*10^9
m1 Inc Inc Inc Inc 55,27 8,92 0,36 1,07 UE1 m2 Inc Inc Inc Inc 49,21 1,07 0,36 0,36 m1 Inc Inc 167,75 Inc 50,50 7,06 1,06 1,41 UE2 m2 Inc Inc Inc Inc 71,69 16,24 1,06 1,41 m1 Inc Inc Inc Inc 98,48 8,73 0,70 1,39
T15
UE3 m2 Inc Inc Inc Inc 91,03 9,08 1,40 0,35 m1 Inc Inc Inc Inc 66,01 5,21 0,34 0,695 UE1 m2 Inc Inc Inc Inc 97,97 16,33 1,74 2,43 m1 Inc Inc Inc Inc 97,12 8,21 3,42 1,71 UE2 m2 Inc Inc Inc Inc 36,59 15,73 5,47 2,05 m1 Inc Inc Inc Inc 16,13 3,16 0,7 4,56
MES 4
CB
UE3 m2 Inc Inc Inc Inc 67,68 5,96 0,7 0,35
• Numero mas probable
NUMERO MAS PROBABLE NMP/g peso seco MES T15
UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 1 24000 58000 135220 850666 502135 43250 2 29814,33 352712,766 567320,846 907148,802 720789,75 688621,125 3 2703,2473 116766,941 356322,01 164118,955 347688,288 108392,364 4 463,358908 282,576972 59,639972 1351,257845 284,0666 140,3116205 CB UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 1 167898 765811 567320,846 907148,802 720789,75 688621,125 2 3 261247,36 8616608,32 275938,576 3662842,425 2461476,4 8982629,1094 71641622,95 771674923,44 109044132 178005100,6 253092177 5643923421
LOG NUMERO MAS PROBABLE MES T15
UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 1 4,38 4,76 5,13 5,93 5,70 4,64 2 4,47 5,55 5,75 5,96 5,86 5,84 3 3,43 5,07 5,55 5,22 5,54 5,03 4 2,67 2,45 1,78 3,13 2,45 2,15 CB UE1 UE2 UE3 m1 m2 m1 m2 m1 m2 1 5,23 5,88 5,75 5,96 5,86 5,84 2 3 5,42 6,94 5,44 6,56 6,39 6,95 4 7,86 8,89 8,04 8,25 8,40 7,75
ANEXO 10. Registros de resultados de BBL cristal.
ANEXO 11. SOPORTE ESTADISTICO DEL ANALISIS DE LAS VARIABLES EN ESTUDIO • Humedad
Valores promedio de humedad (%) en Triple 15 y Control abiótico
N Media Desviación
típica Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Triple 15 Mes 0 6 51,60 ,00 51,6000 51,6000 51,60 51,60 Mes 1 24 43,52 5,08 41,3719 45,6681 36,85 52,03 Mes 2 12 50,87 4,20 48,2050 53,5516 44,69 57,69 Mes 3 24 47,35 6,18 44,7444 49,9710 37,19 60,21 Mes 4 24 44,76 4,60 42,8186 46,7078 36,26 52,53 Total 90 46,39 5,65 45,2101 47,5793 36,26 60,21Control biótico
Mes 0 6 51,6000 ,00 51,6000 51,6000 51,60 51,60
Mes 1 24 45,1200 4,31514 43,2979 46,9421 39,23 52,20 Mes 2 12 55,6958 5,15064 52,4233 58,9684 47,98 67,42 Mes 3 24 51,7523 4,36289 49,9100 53,5946 42,01 63,55 Mes 4 24 45,4359 2,87265 44,2229 46,6489 40,89 53,78 Total 90 48,8150 5,58002 47,6462 49,9837 39,23 67,42
ANOVA
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos 688,280 4 172,070 6,775 ,000Intra-grupos 2158,681 85 25,396
Triple 15
Total 2846,962 89 Inter-grupos 1423,469 4 355,867 22,445 ,000Intra-grupos 1347,690 85 15,855
Control abiótico
Total 2771,159 89
Triple 15 Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Tiempo N 1 2 3 Mes 1 24 43,5200 Mes 4 24 44,7632 Mes 3 24 47,3577 47,3577 Mes 2 12 50,8783 50,8783Mes 0 6 51,6000Sig. ,066 ,075 ,712 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 13,333. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados. Control abiótico Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Tiempo N 1 2 3 Mes 1 24 45,1200 Mes 4 24 45,4359 Mes 0 6 51,6000 Mes 3 24 51,7523 Mes 2 12 55,6958 Sig. ,838 ,922 1,000
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 13,333. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados. Descriptivos Humedad
N Media Desviació
n típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Triple 15 90 46,39 5,65 ,59618 45,210 47,57 36,26 60,21
Control abiótico 90 48,81 5,58 ,58819 47,64 49,98 39,23 67,42
Total 180 47,6 5,73 ,42726 46,76 48,44 36,26 67,42
ANOVA Humedad
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos 263,596 1 263,596 8,352 ,004 Intra-grupos 5618,121 178 31,562
Total 5881,717 179
• pH ANOVA PH
Suma de
cuadrados gl Media cuadrática F Sig. Triple 15 Inter-grupos 115331086
4,667 3 384436954,2 134,5 ,000
Intra-grupos 45712201,333 16 2857012,58
Total 1199023066,000 19
Control abiótico
Inter-grupos 640188468,667 3 213396156,22 22,6 ,000
Intra-grupos 150474721,333 16 9404670,08
Total 790663190,000 19
Triple 15 Duncan
Subconjunto para alfa = .05
Tiempo N 1 2 4,00 6 4819,500
0
3,00 6 6641,0000
2,00 6 21055,6667
,00 2 21481,5000
Sig. ,147 ,726 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 4,000.
b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados.
• Nutrientes Descriptivos de nutrientes
N Media Desviación
típica Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Fósforo ,00 7 85,95 ,00000 85,9500 85,9500 85,95 85,95 1,00 6 120,00 ,00000 120,0000 120,0000 120,00 120,00 2,00 6 216,00 10,25671 205,2362 226,7638 203,00 225,00 3,00 6 230,17 12,40027 217,1534 243,1800 220,00 253,00 4,00 6 563,15 77,77721 481,5278 644,7722 436,00 663,00 5,00 6 579,50 84,86872 490,4357 668,5643 474,00 658,00 Total 37 293,36 206,61650 224,4768 362,2556 85,95 663,00N-NH4 ,00 7 24,00 ,00000 24,0000 24,0000 24,00 24,00 1,00 6 2,30 ,00000 2,3000 2,3000 2,30 2,30 2,00 6 848,95 108,17827 735,4239 962,4761 644,40 953,00 3,00 6 709,95 37,41426 670,6861 749,2139 641,20 745,90 4,00 6 1330,8
8 58,65456 1269,3291 1392,4375 1234,30 1399,20
5,00 6 1891,40 57,11070 1831,466
0 1951,3340 1803,10 1952,40
Total 37 780,24 687,56285 550,9957 1009,4854 2,30 1952,40N-NO3 ,00 7 97,20 ,00000 97,2000 97,2000 97,20 97,20 1,00 6 94,90 ,00000 94,9000 94,9000 94,90 94,90 2,00 6 579,60 104,97975 469,4305 689,7695 430,10 689,00 3,00 6 544,28 27,06033 515,8853 572,6814 494,50 570,20 4,00 6 668,48 41,36131 625,0773 711,8894 616,70 730,80 5,00 6 1126,0
6 78,82862 1043,3411 1208,7922 1012,20 1217,60
Total 37 507,03 364,72160 385,4336 628,6421 94,90 1217,60N-mineral
,00 7 121,20 ,00000 121,2000 121,2000 121,20 121,20
1,00 6 97,20 ,00000 97,2000 97,2000 97,20 97,20 2,00 6 1428,5 188,98763 1230,219
6 1626,8804 1114,80 1642,00
3,00 6 1254,23 62,54933 1188,591
8 1319,8748 1135,70 1316,10
4,00 6 1999,36 95,26785 1899,389
2 2099,3441 1851,00 2130,00
5,00 6 3017,46 124,44323 2886,871
5 3148,0618 2815,30 3170,00
Total 37 1287,27 1047,04439 938,1764 1636,3804 97,20 3170,00
ANOVA
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Fósforo Inter-
grupos 1469298,757 5 293859,751 134,848 ,000
Intra-grupos 67554,808 31 2179,187
Total 1536853,565 36 N-NH4 Inter-
grupos 16919714,671 5 3383942,934 1059,385 ,000
Intra-grupos 99021,778 31 3194,251
Total 17018736,449 36 N-NO3 Inter-
grupos 4690397,957 5 938079,591 295,567 ,000
Intra-grupos 98388,590 31 3173,825
Total 4788786,547 36 N-mineral Inter-
grupos 39145916,108 5 7829183,222 756,197 ,000
Intra-grupos 320954,115 31 10353,359
Total 39466870,223 36 Fósforo Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Observación N 1 2 3 ,00 7 85,9500 1,00 6 120,0000 2,00 6 216,0000 3,00 6 230,1667 4,00 6 563,15005,00 6 579,5000Sig. ,210 ,599 ,544 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 6,146. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados.
N-NH4 Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Observación N 1 2 3 4 5
1,00 6 2,3000 ,00 7 24,0000
3,00 6 709,9500 2,00 6 848,9500 4,00 6 1330,883
3
5,00 6 1891,4000
Sig. ,506 1,000 1,000 1,000 1,000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 6,146. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados. N-mineral Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Observación N 1 2 3 4 5
1,00 6 97,2000 ,00 7 121,2000
3,00 6 1254,2333
2,00 6 1428,5500
4,00 6 1999,3667
5,00 6 3017,4667
Sig. ,682 1,000 1,000 1,000 1,000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 6,146. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados.
N-mineral Duncan
Subconjunto para alfa = .05 Observación N 1 2 3 4 5 1,00 6 97,2000
,00 7 121,2000 3,00 6 1254,233
3
2,00 6 1428,5500
4,00 6 1999,3667
5,00 6 3017,4667
Sig. ,682 1,000 1,000 1,000 1,000 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 6,146. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados. Descriptivos NUTRIENTES
N Media Desviació
n típica Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Fósforo Triple 1 36 299,12 206,5109 229,25 369,0010 85,95 663,00 Control biótico 36 138,81 47,312 122,80 154,8192 85,95 248,40 Total 72 218,96 169,240 179,19 258,7390 85,95 663,00N-NH4 Triple 1 36 801,24 685,16 569,41 1033,0749 2,30 1952,40 Control biótico 36 194,54 159,98 140,41 248,6715 2,30 525,10 Total 72 497,89 580,82 361,40 634,3816 2,30 1952,40N-NO3 Triple 1 36 518,42 363,16 395,54 641,3002 94,90 1217,60 Control Abiótico 36 77,73 18,36 71,52 83,9511 44,00 111,40 Total 72 298,08 338,25 218,59 377,5667 44,00 1217,60N-mineral
Triple 1 36 1319,66 1042,92 966,79 1672,5451 97,20 3170,00
Control Abiótico 36 272,28 147,86 222,25 322,3097 97,20 594,50 Total 72 795,97 908,34 582,52 1009,4248 97,20 3170,00
ANOVA NUTRIENTES
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos
462625,805 1 462625,80
5 20,614 ,000
Intra-grupos
1570982,298 70 22442,604
Fósforo
Total 2033608,103 71
Inter-grupos
6625649,361 1 6625649,3
61 26,768 ,000
Intra-grupos
17326741,057 70 247524,87
2
N-NH4
Total 23952390,418 71
Inter-grupos
3495632,405 1 3495632,4
05 52,873 ,000
Intra-grupos
4627952,288 70 66113,604
N-NO3
Total 8123584,693 71
Inter-grupos
19746422,722 1 19746422,
722 35,593 ,000
Intra-grupos
38834565,953 70 554779,51
4
N-mineral
Total 58580988,675 71
Correlaciones Fósforo N-NH4 N-NO3 N-mineral
Correlación de Pearson 1 ,683(**) -,703(**) ,650(**)
Sig. (bilateral) . ,000 ,000 ,000
Fósforo
N 35 35 35 35Correlación de Pearson ,683(**) 1 -,682(**) ,996(**)
Sig. (bilateral) ,000 . ,000 ,000
N-NH4
N 35 35 35 35Correlación de Pearson -,703(**) -,682(**) 1 -,613(**)
Sig. (bilateral) ,000 ,000 . ,000
N-NO3
N 35 35 35 35Correlación de Pearson ,650(**) ,996(**) -,613(**) 1
Sig. (bilateral) ,000 ,000 ,000 .
N-mineral
N 35 35 35 35** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
• TPHs Pruebas no paramétricas Estadísticos descriptivos
N Media Desviación típica Mínimo Máximo
TPH 40 14361,3500 7681,29147 2028,00 26620,00
Grupo 40 1,5000 ,50637 1,00 2,00
Prueba de Kruskal-Wallis Rangos
Grupo N Rango promedio
Triple 15 20 15,95Control Abiótico 20 25,05
TPH
Total 40
Estadísticos de contraste(a,b)
TPH Chi-cuadrado 6,065
gl 1 Sig. asintót. ,014
a Prueba de Kruskal-Wallis b Variable de agrupación: Grupo Descriptivos TPH
N Media Desviación
típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Mes 1 2 23280,0 ,00 ,00 23280,00 23280,00 23280,00 23280,00Mes 2 6 21055,6 1701,03 694,44 19270,54 22840,79 18203,00 22592,00Mes 3 6 6641,00 1263,97 516,01 5314,54 7967,458 4728,00 7962,00Mes 4 6 4819,50 1832,33 748,04 2896,58 6742,41 2028,00 7044,00Total 20 12082,85 8166,95 1826,18 8260,59 15905,10 2028,00 23280,00 ANOVA TPH
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos 122804087
7,717 3 409346959,239 166,897 ,000
Intra-grupos 39242996,833 16 2452687,3
02
Total 1267283874,550 19
TPH Tiempo N Subconjunto para alfa = .05 1 2 3 Duncan(a,b) Mes 4 6 4819,50 Mes 3 6 6641,0 Mes 2 6 21055,66 Mes 1 2 23280,00 Sig. ,12 ,06 Waller-Duncan(a,b,c)
Mes 4 6 4819,50
Mes 3 6 6641,00 Mes 2 6 21055,66 Mes 1 2 23280,00 Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 4,000. b Los tamaños de los grupos no son iguales. Se utilizará la media armónica de los tamaños de los grupos. Los niveles de error de tipo I no están garantizados. c Razón de seriedad del error de tipo 1/tipo 2 = 100 • Heterotrofos totales Descriptivos Heterotropos
N Media Desviació
n típica Intervalo de confianza para
la media al 95% Mínimo Máximo
Límite inferior
Límite superior
Triple 15 5 17864510,00 29321110,201
-18542456,92
54271476,9248 474368,0 69363175
Control abiótico 5 14213356,80 27622391,059
-20084371,72 48511085,3 474368,0 63583333
Total 10 16038933,40 26924221,363
-3221494,290 35299361,0 474368,0 69363175
ANOVA
Suma de
cuadrados gl Media
cuadrática F Sig. Inter-grupos 333272992
24675,580 1 33327299224675,580 ,041 ,844
Intra-grupos 6490895965112700,0
008
811361995639088,00
0
Total 6524223264337380,0
009
ANEXO 12. Costos De tratamiento in-situ por hectárea
Tratamiento "in situ" por ha
Actividad Herramienta Capacidad Costo Cantidad Necesaria Costo total
Aireación y homogenización del suelo
Retroscavadora grande tipo 200 200 m3/hr $ 60.000 160 $ 9.600.000
Riego Aspersor 7 m $ 9.000 204 $ 1.836.000 Riego Agua m3 $ 2.229,50 41,63 $ 92.814 fertilizante inorgánico K g T15 1 $ 1.000 12833,3 $ 12.833.300 muestreo Cuchara Muestreadora $ 20.000 1 $ 20.000 Operarios trabajo/día $ 15.000 32 $ 480.000 Ingeniero Ambiental Trabajo/mes $ 1.500.000 4 $ 6.000.000 Análisis TPHs $ 21.000 140 $ 2.940.000 Análisis nutrientes $ 31.500 140 $ 4.410.000 Analisis humedad $ 5.684 140 $ 795.760 pHmetro pH metro $ 1.440.000 Termómetro Termómetro suelo $ 100.000 TOTAL $ 40.547.874
ANEXO 13. Costos para tratamiento ex-situ por m3
Tratamiento "ex situ" por m3
Actividad Herramienta Capacidad Costo Cantidad Necesaria Costo total
Transporte suelo contaminado Volqueta 6 m3 $ 40.000 1 $ 40.000
Aireación y homogenización Pala $ 7.000 1 $ 7.000 Riego Aspersor 7 m $ 9.000 1 $ 9.000 Riego Agua m3 agua/ m3 suelo $ 2.229,50 $ 17.052
Fertilizante inorgánico K g T15 $ 1.000 0,086 $ 1.000 Operario trabajo/día $ 15.000 32 $ 480.000
Ingeniero Ambiental Trabajo/mes $ 1.500.000 4 $ 6.000.000 Análisis TPHs $ 30.000 8 $ 240.000
Análisis nutrientes $ 45.000 8 $ 360.000 Analisis humedad $ 8.120 8 $ 64.960
pHmetro $ 1.440.000 Termómetro $ 100.000
TOTAL $ 8.759.012
ANEXO 14. Costos del proyecto de Biorremediación a nivel laboratorio (presente investigación)
COSTOS DEL TRATAMIENTO Montaje laboratorio Unidad Costo Cantidad /UE No UE Cantidad Total Costo UE unidad $ 21.600 6 $ 129.600 volumen UE m3 0,0312 3 0,0936 T15 utilizado Kg T15/UE $ 1.000 0,308 3 0,924 $ 1.000 Agua utilizada m3 agua/UE $ 1.416,65 0,015 6 0,09 $ 17.052 Análisis TPHs muestra $ 30.000 8 6 48 $ 1.440.000 Análisis nutrientes muestra $ 45.000 8 6 48 $ 2.160.000
Análisis microbiológicos NMP muestra $ 47.000 8 6 48 $ 2.256.000
Analisis humedad muestra $ 8.120 30 6 180 $ 1.461.600 pH $ 1.440.000 Temperatura $ 100.000 $ 9.005.252
ANEXO 15. Tratamientos para la biorrecuperación de suelos
BIOVENTING BIOPILAS BIOAUMENTACIÓN BIOLABRANZA
Tipo de Tratamiento: In Situ
Tipo de Tratamiento: Ex Situ
Tipo de Tratamiento: In Situ o Ex Situ
Tipo de Tratamiento: In Situ o Ex Situ
Requerimientos: - Requiere construcción de pozos
de inyección de aire. - Control en el contenido de
nutrientes del suelo y flujo necesario de aire suministrado.
Requerimientos: - Requiere remoción y transporte
del suelo contaminado y grandes extensiones de terreno para la recuperación del suelo.
- Adición de materia orgánica para el composteo.
Requerimientos: - Se requiere el aislamiento de
microorganismos capaces de cometabolizar los hidrocarburos, y cultivarlos hasta obtener grandes cantidades de biomasa.
- Combinación con otros tratamientos.
Requerimientos: - Requiere un laboreo del suelo
constante (volteo y riego), adición de nutrientes y control del pH.
Tipo de hidrocarburos a tratar: Es más útil para los compuestos de cadenas cortas y lineales (<20 Carbonos) que los compuestos aromáticos.
Tipo de hidrocarburos a tratar: Es más eficaz para los hidrocarburos no halogenados de carácter ligero. Concentraciones < 50000 ppm
Tipo de hidrocarburos a tratar: Se utiliza para el tratamiento muchos tipos de hidrocarburos: TPH, BETX, PAH, entre otros.
Tipo de hidrocarburos a tratar: Permite una reducción de las concentraciones de casi todos los constituyentes de los productos del petróleo (fracción volátil: gasolina y fracción no volátil: aceites calientes y lubricantes)
Condiciones del medio: - pH: 6-8 - %H: 12-30 % - Tº: 0-40 ºC - Nutrientes:C:N:P 100:10:1
Condiciones del medio: - pH: 6-8 - %H: 40-85 % - Tº: 10-45 ºC - Nutrientes:C:N:P 100:10:1
Condiciones del medio: - pH: 6-8 - Nutrientes:C:N:P 100:10:1
%H, Tº y otras condiciones de acuerdo con los microorganismos utilizados y las características del suelo tratado.
Condiciones del medio: - pH: 4-8 - %H: 30-60 % - Tº: 10-45 ºC - Nutrientes:C:N:P 100:10:1 - Buena aireación
Características del suelo: Bajos contenidos de arcilla y de textura homogénea.
Características del suelo: Bajos contenidos de arcilla.
Características del suelo: Cualquier tipo de suelo.
Características del suelo: Cualquier tipo de suelo.
Biodisponibilidad de microorganismos: > 110 UFC / g de suelo
Biodisponibilidad de microorganismos: > a 1.000 UFC/ g. de suelo
Biodisponibilidad de microorganismos: < 110 UFC/g de suelo se necesita inocular.
Biodisponibilidad de microorganismos: > 110 UFC/g de suelo
Tiempo de remediación: Los tiempos de limpieza pueden variar desde algunos meses hasta varios años
Tiempo de remediación: Es una tecnología que puede llevar desde algunas semanas hasta varios meses.
Tiempo de remediación: Es una tecnología que puede durar varios meses o años.
Tiempo de remediación De 5 meses a un año.
Costos: Es una tecnología en la que sus costos de operación son medio- altos. Esta tecnología no requiere de equipo caro, pero los costos pueden variar en función de: • La permeabilidad del suelo. • Espacio disponible, número de
pozos • Velocidad de bombeo. (Van Deuren y col., 1997).
Costos: El costo del tratamiento depende de:
• La cantidad y fracción de suelo a tratar;
• Disponibilidad de agentes de volumen;
• Tipo de contaminantes y proceso;
• Necesidad de tratamientos previos y/o posteriores;
• Necesidad de equipos para control de COVs.
Los costos en general son altos.
Costos: Su utilización no implica mucho capital si se cuenta con los equipos y material de laboratorio apropiados y no genera costos de operación.
Costos: El tratamiento genera costos medios que dependen de: • Si es ex situ o in situ. • Las características del suelo a
tratar. • La concentración del
contaminante. • Disponibilidad de agua.