『輸血のための検査マニュアル』の要点3）交差適合試験と不規則抗体検査...
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『輸血のための検査マニュアル』の要点
日本輸血・細胞治療学会北海道支部会
認定輸血検査技師協議会
平成２５年１月２９日（火曜日）道央地区
輸血研修会
１．目的
• 日本輸血・細胞治療学会は、わが国の輸血医療の安全を担保するために、関連学会および団体と協力して輸血検査を担当する技師の教育を推進する。
• そのために、標準的対応を決定し、教育体制を整備するとともに、実技講習会の支援事業を開始する。
委員会のコンセプト
１）すべての施設において日頃輸血検査に携わらない技師でも夜間対応ができる
２）自動輸血検査装置のトラブル発生時に用手法でできる
３）異常反応の出現時にも輸血対応が可能である
４）技師会や企業などが行う全ての輸血検査研修会の土台となる基本条件
２．事業内容１）輸血検査の標準化と適正な対応を指導し、輸血医療の安全を
向上２）学会の認定する技術講習会を受講した者により、輸血検査が実
施３）各種講習会の内容を検定し、認定技師制度における取得単位
を認定４）講習会の目的を明確にして、体制を整備５）標準的輸血検査手技を、全国で等しく教育６）各地域で実施される、実技講習会を支援７）認定輸血検査技師制度の受験者の育成および合格率向上８）知識および高度技術の取得で、認定輸血検査技師の自己啓発
用手法マニュアル
「輸血のための検査マニュアル」Ⅰ．基本操作Ⅴ．患者検体Ⅵ．器材と試薬
Ⅰ．基本操作１．３～５％赤血球浮遊液の作製法
１）検体は、多本架遠心機で1,200G(3,000rpm)5分間遠心
し、患者名を明記した試験管に血清（血漿）を分取する。
２）患者氏名（または識別番号）を明記した赤血球浮遊液用の試験管に生理食塩液約1mLを入れ、スポイトで赤血球沈査1滴（約50μL）を加える。
３）よく混和後、洗浄ビンで7～8分目まで満たす。
４）判定用遠心機で900～1,000G、1～2分遠心。
５）赤血球沈査が流れ出ないように生食を素早く捨てる。
６）生理食塩液を約1mL再添加し3～5%赤血球浮遊液に調
製する。
注1.生食の分注はスポイト、マイクロピペット等でも良い。
注2.赤血球浮遊液の濃度は、赤血球試薬の色調や自動血球計数装置のHt値を参考にしても良い。
注3.スポイトの1滴量≒約50μL。バラツキがあるため予め
確認しておく。
＊一般的に樹脂製スポイトは傾斜して操作すると、垂直で操作したときよりも1滴の容量は減少する。
約1mL
約1mL
約1mL約1mL約1mL
約1mL
２．試薬・検体の分注１）検査用試験管の準備
(1)検査用試験管に患者名（識別番号）や試薬名を明記する。
(2)分注ミスを避けるため、検査用試験管は識別番号や試薬名がよく見えるように管
口をきちんとそろえて試験管立てに準備する。
２）赤血球試薬と赤血球浮遊液
(1)赤血球試薬や赤血球浮遊液は必ず使用時にピペットでよく混和し、濃度を均一に
してから用いる。
(2)赤血球濃度を一定に保つため、分注後にスポイト内に残った試薬はすべて元の浮
遊液へ戻す。
３）試薬・検体の分注操作手順と留意点
(1)分注忘れを目視確認できるよう、被検血清（血漿）や抗体試薬は赤血球試薬よりも
先に添加する。血清・解離液が溶血している場合は、赤血球試薬・赤血球浮遊液を先に添加する。
(2)試薬や検体の分注では、スポイトの先端が試験管に触れないように注意し、管底
へ直接滴下する。
(3)試薬と検体の分注状態は、次のステップへ移る前に必ず目視確認する。
(4)インキュベーションは、試験管をよく振って十分に混和してから行う。
３．凝集反応の見方＊試験管は目の高さ以下で操作し、白色（光）を背
景にして判定する。
１）凝集と背景の色調の観察
(1)試験管を判定用遠心機で900～1,000G（3,400回転）15秒または100～125G（1,000回転）1分遠心する。
(2)遠心後、まず溶血の有無を確認する。
(3)試験管を傾けて赤血球沈査を流し、試験管を
揺らしながら凝集の有無を確認する。
(4)赤血球沈査を流すのは試験管の2/3までとし、
凝集塊の大きさから反応強度を判定する。
(5)赤血球沈査が均一に再浮遊するまで（３）（４）
を繰り返す。
反応の強さは、試験管を小刻みに揺ら
し、赤血球沈渣をほぐしながら、凝集
塊の大きさや数、背景の色調（非凝集
赤血球の濁り）を基準にして分類する
遠心後、白色(光)を背景にし、まず上清
の溶血の有無を確認する
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
①遠心後、はく色（光）を背景にし、上清の溶血の有無を確認する。②引き続き試験管を傾け、赤血球沈査が流れ出す際に認められる凝集塊や非凝集赤血球の有無を観察する.＊陰性では、凝集してない赤血球が糸状に流れ出す
③反応の強さは、試験管を小刻みに揺らし、赤血球沈査をほぐしながら、凝集塊の大きさや数、背景の色調（非凝集赤血球の濁り）を基準にして分類する.
凝集反応の分類
反応強度
4+
3+
2+
1+
w+
0
mf
H(PH)
スコア
12
10
8
5
2
0
特徴と外観
1個の大きな凝集塊
数個の大きな凝集塊
中程度の凝集塊
小さな凝集塊
ごくわずかな微小凝集
凝集も溶血も見られない
部分凝集
完全溶血（部分溶血）
背景の色調
透 明
透 明
透 明
赤く濁る
赤く濁る
赤く濁る
赤く濁る
赤く透明(濁る)
mf：mixed field agglutination、H：hemolysis、PH：partial hemolysis＊Technical Manual 16th．AABBから一部改変して引用
反応強度
4+
3+
2+
1+
w+
0
mf
H(PH)
スコア
12
10
8
5
2
0
特徴と外観
1個の大きな凝集塊
数個の大きな凝集塊
中程度の凝集塊
小さな凝集塊
ごくわずかな微小凝集
凝集も溶血も見られない
部分凝集
完全溶血（部分溶血）
背景の色調
透 明
透 明
透 明
赤く濁る
赤く濁る
赤く濁る
赤く濁る
赤く透明(濁る)
mf：mixed field agglutination、H：hemolysis、PH：partial hemolysis＊Technical Manual 16th．AABBから一部改変して引用
Ⅴ．患者検体
１．採血1）採血管ラベルは1患者分準備する。
（ラベル貼り違えを回避するため、複数の患者ラベルを連続して印刷しない）
２）EDTA入り採血管または分離剤無しプレイン採血管を用いる。
３）ラベリングされた採血管は、1患者毎にまとめる（他患者用採血管が
混入しないこと）。
４）採血時の注意
(1)リストバンド（ベッドネームなど）と採血管ラベルの患者ID および
患者氏名の照合を必ず行う。
(2)EDTA加採血管は、採血後、ゆっくりと4～5回転倒混和する。
２．検体１）ABO血液型の確定には、異なる時点に別々に得られた患者検体
が少なくとも2本必要である。
２）過去3ヶ月以内に輸血や妊娠歴のある患者では、予定輸血日の3日前を目安に採血する。
３）連日にわたって輸血を受けている患者では、少なくとも3日（72時
間）ごとに検体を採血する。
４）検査後の患者血清(血漿)は輸血副作用等の発生に備え、冷凍保存用サンプルチューブに入れて、-20℃以下で3ヶ月以上可能な限り（2年間を目安に）保存する。
５）検査後の患者赤血球沈渣と赤血球製剤のセグメントチューブも溶血性輸血副作用発生時の抗原検査に備え、4℃で少なくとも2週間程度保存するのが望ましい。
Ⅵ．器材・器具・試薬１．主な器材類（※は必要に応じて準備する器材）１）遠心分離器
（１）多本架遠心機：血清(血漿)分離、赤血球洗浄
（２）判定用遠心機：凝集判定、赤血球洗浄
（３）自動血球洗浄遠心機：直接･間接抗グロブリン試験の自動洗浄、凝集判定
２）恒温槽（37～60℃）： 交差適合試験・不規則抗体検査、熱解離、補体不活化など
３）冷蔵庫・冷凍庫
（１）冷蔵庫（2～８℃）：試薬の保管や1～2週間程度の患者検体(赤血球と血清/血漿)の保管
（２）冷凍庫（-20℃以下）：凍結が必要な試薬や患者検体(血清/血漿)の長期保管
《 輸血用血液製剤の保管は、自記温度記録計および警報装置付の専用保冷庫を用いなけれ
ばならない。検査試薬と検体は冷蔵保管するが、その際輸血用血液製剤と同一の保冷庫に保管してはならない。また、試薬や検体用の保冷庫も自記温度記録計および警報装置付が望ましい。》
※４）イムノビューア：凝集判定
※５）顕微鏡（×100～×200）：凝集と連銭形成の鑑別など
※６）拡大鏡（凹面鏡）：凝集判定
※７）自動輸血検査装置
２．主な器具類
１）試験管：Φ12×75mm（またはΦ10×75mm）、ガラス製
２）試験管立て：上記の試験管が立てられるもの
３）スポイト：約50μL/滴、樹脂製（採用前に1滴の量を確認する）
４）洗浄ビン：500mLの生理食塩液が入る樹脂製のもの
５）温度計：恒温槽の実温度測定
６）タイマー
３．主な試薬類（※は必要に応じて準備する試薬）１）ABO血液型
（１）オモテ検査用試薬：抗A試薬、抗B試薬
（２）ウラ検査用試薬：3～5%のA1赤血球、B赤血球、※O型赤血球
２）Rh(D)血液型
（１）抗D試薬
（２）Rhコントロール（抗D試薬の添付文書に従う）
３）交差適合試験と不規則抗体検査
（１）不規則抗体スクリーニング用赤血球（Dia抗原陽性の赤血球含む）
（２）不規則抗体同定用パネル赤血球
（３）反応増強剤
① ポリエチレングリコール液(PEG)と② 低イオン強度溶液(LISS)のうち、少 なくとも1種類、
※③ ウシ(重合)アルブミン液
（４）酵素溶液：不規則抗体同定用補助試薬として
① ブロメリン液、② フィシン液、③ パパイン液のうち、少なくとも1種類
（５）抗ヒトグロブリン試薬
① 多特異、② 抗IgG（PEG-IAT法や直接抗グロブリン試験）、※③ 抗補体
（６）3～5％IgG感作赤血球
（７）0.85%生理食塩液
４．機器および試薬の精度管理機器や試薬の精度管理は、あらかじめ作成した精度管理手順書に沿って定期的に実施し、記録を残す。
１）判定用遠心機の管理
（１）回転数、（２）タイマー、（３）異常音、バランス
２）自動血球洗浄遠心機
（１）ノズル、ボトル、ラインなどのメンテナンス
（２）生理食塩液の分注量や洗浄後の残量の点検
（３）洗浄遠心機の設定条件の確認
３）恒温槽
（１）サーモスタットの温度コントロールの動作状態
（２）別の温度計による温度点検と記録
４）輸血用血液製剤の専用保冷庫
（１）自記温度記録計がない場合の温度管理：始業時、終業時の2回の温度点検と記録
（２）自記温度記録計が付いている場合：保冷庫の表示温度と記録用紙の温度確認
（３））別の温度計による温度点検（温度計による庫内温度と内蔵温度センサーによる外部表示温度の点検）
（４）警報装置がある場合はアラームテストと警報システムの確認
（５）エアーフィルターの汚れ確認
『輸血のための検査マニュアル』
Ⅱ．検査法
「血液型、交差適合試験、不規則抗体検査」
Ⅱ．検査法1．ABOとRh(D)血液型
1）操作手順（1）患者検体は1,200G(3,000rpm) 5分遠心し、患者名を明記した試験管に血清
(血漿)を分取する。（2）試験管7本（赤血球浮遊液用：1本、検査用：６本）を準備する。（3）赤血球浮遊液用と検査用の試験管に患者氏名（または検体番号）と試薬名を
明記する。（4）赤血球浮遊液用試験管に3～5％患者赤血球浮遊液を作製する。（5）抗A、抗B、抗D、Rhコントロール(Rh cont)の試験管に各試薬を１滴ずつ滴下
する。（6）ウラ検査用試験管に血清(血漿)を2滴ずつ滴下する。（7）患者血清(血漿)や抗体試薬の分注もれを確認する。（8）（5）のオモテ検査およびRh(D)検査用試験管に3～5％患者赤血球浮遊液を1滴
ずつ滴下する。（9）ウラ検査用試験管によく混和したA1赤血球とB赤血球の各試薬を1滴ずつ滴下
する。（10）患者赤血球浮遊液や赤血球試薬の分注漏れを確認し、よく混和する。（11）試験管を900～1,000G(3,400rpm)15秒または100～125G(1,000rpm)1分
遠心する。（12）凝集や溶血の有無を観察し、判定結果を記録する。
注１：Rhコントロールは、その代用となるものがあれば省略できる（試薬の添付文書
に従う）。
【P】⇒
【P】⇒
【P】⇒
【P】⇒
【P】⇒ ポイント
【P】⇒
抗Ｂ 1滴赤血球浮遊液 1滴
抗Ｄ 1滴赤血球浮遊液 1滴
血清(血漿) 各2滴A1、Ｂ赤血球 各1滴
3～5%患者赤血球浮遊液患者血清(血漿)
抗Ａ 抗ＢRh
cont
混和後、900～1,000G(3,400rpm)15秒
＊図中、1、2、3、4は分注の順番を示す
抗ＤＡ1
赤血球Ｂ
赤血球
Rhｺﾝﾄﾛｰﾙ 1滴血球浮遊液 1滴
判 定
Rh(D)検査
ウラ検査
オモテ検査
抗A 1滴赤血球浮遊液 1滴
1 1
3 3
1 1
3 3 4 4
2 2
抗Ｂ 1滴赤血球浮遊液 1滴
抗Ｄ 1滴赤血球浮遊液 1滴
血清(血漿) 各2滴A1、Ｂ赤血球 各1滴
3～5%患者赤血球浮遊液患者血清(血漿)
抗Ａ抗Ａ 抗Ｂ抗ＢRh
cont
混和後、900～1,000G(3,400rpm)15秒
＊図中、1、2、3、4は分注の順番を示す
抗ＤＡ1
赤血球Ｂ
赤血球
Rhｺﾝﾄﾛｰﾙ 1滴血球浮遊液 1滴
判 定
Rh(D)検査
ウラ検査
オモテ検査
抗A 1滴赤血球浮遊液 1滴
1 1
3 3
1 1
3 3 4 4
2 2
1.分注順番
血清→血球
2.試験管の並べ順
決まりではない
ポイント
2）ABO血液型判定
抗A 抗B 判定 A1赤血球 B赤血球 判定
＋ 0 A型 0 ＋ A型 A型
0 ＋ B型 ＋ 0 B型 B型
0 0 O型 ＋ ＋ O型 O型
＋ ＋ AB型 0 0 AB型 AB型
オモテ検査総合判定
ウラ検査
注1：採血時の取り違いや誤判定を防止するため、原則として異なる時点で採血された2検体でそれぞれ検査を行い、両方の結果が一致することを確認し、血液型を確定する。
注2：抗M、抗P1や抗Lewisなどの低温反応性の抗体が、オモテ・ウラ不一致に関与して
いる場合がある。注3：オモテ検査で部分凝集(mf：mixed field agglutination)を認めた場合は、異型輸血
後や造血幹細胞移植後の可能性も考えられるため、必ず輸血歴や移植歴を確認する。
注4：オモテ検査とウラ検査の結果が一致しない場合は、判定を保留しその原因を精査する（Ⅳ-1オモテ・ウラ不一致、参照）。なお、ウラ検査ではBombay(Oh)型やparaBombay(Ah、Bh)型患者が保有する自然抗体(抗Hや抗HI)の有無などを確認するため、必要に応じてO型赤血球を用いて検査する。
３）Rh(D)血液型判定
注１：「判定保留 ※１」を確定するためには、直後判定後、引き続き「D陰性確認試験」を行う。
注２：Rhコントロールが陽性となった場合は判定保留 ※２ とし、その原因を精査する。（Ⅳ－3 参照）
注３：反応時間については、試薬の添付文書に従う。注４：ＩｇＭ単独の抗Ｄ試薬はＤ陰性確認試験に使用できない。
抗D試薬 Rhｺﾝﾄﾛｰﾙ 判 定 抗D試薬 Rhｺﾝﾄﾛｰﾙ 判 定
＋ 0 D陽性
0 0 D陰性
＋ 0 weak D
＋ ＋ 判定保留※2
直後判定 D陰性確認試験
不要
0 0 判定保留※1
900～1,000G(3,400rpm) 15秒
または100～125G(1,000rpm) 1分
抗DとRhｺﾝﾄﾛｰﾙの２本の試験管を37℃ 15～60分間加温*
生理食塩液で3～4回洗浄
抗ヒトグロブリン試薬を２滴ずつ滴下する
判 定
抗Ｄ Rh
cont
陰性の場合は、3～5％IgG感作赤血球を1滴加えて再遠心し、凝集することを確認する
900～1,000G(3,400rpm) 15秒
または100～125G(1,000rpm) 1分
抗DとRhｺﾝﾄﾛｰﾙの２本の試験管を37℃ 15～60分間加温*
生理食塩液で3～4回洗浄
抗ヒトグロブリン試薬を２滴ずつ滴下する
判 定
抗Ｄ Rh
cont
陰性の場合は、3～5％IgG感作赤血球を1滴加えて再遠心し、凝集することを確認する
【D陰性確認試験】
【P】⇒
Ⅱ．検査法2．交差適合試験
２．交差適合試験交差適合試験は受血者と供血者間の血液型不適合輸血を防止するために行う。生理食塩液法はABO血液型の不一致（主・副試験）、間接抗グロブリン試験（主試験）は37℃で反応する臨床的意義のある抗体や低頻度抗原に対する抗体を検出する。より
安全な輸血のためには、あらかじめ不規則抗体スクリーニングを行うことが望ましい。ただし、日赤血液センターの製剤を用いる場合には副試験は必ずしも行わなくてよい。また、既にABO血液型が確定し不規則抗体がない場合には、交差適合試験はコンピュータ・クロスマッチで代用できる。 コンピュータ・クロスマッチの詳細は「新輸血検査の
実際」を参照する。
１）患者検体の採血（１）検体取り違えによるABO不適合輸血を防止するため、交差適合試験には血液型検査
とは別の時点で採血された検体を用いる。原則として、輸血前3日以内に新たに採取さ
れた検体で実施する。（２）連日にわたって輸血を受けている患者では、検体は少なくとも3日（72時間）ごとに採血
する。
2）輸血用血液の選択（１）原則として、患者とABO血液型が同型の血液製剤を用いる。（２）Rh(D)陰性患者にはRh(D)陰性の血液製剤を用いる。（３）患者が37℃反応性の臨床的に意義のある同種抗体を保有している場合には、対応抗
原陰性血を用いる。また、このような抗体を過去に保有していて、現在陰性化している患者に対しても２次免疫応答による遅発性溶血性輸血副作用を防止するため、可能な限り対応抗原陰性血を用いる（Ⅲ-1、参照）。
４）胎児・新生児のための交差適合試験と適合血の選択母親がO型で児がA型やB型である場合、児は母親由来のIgG型抗Aや抗Bを保有することがある。
そのため、同型の赤血球濃厚液を輸血する場合には必ず間接抗グロブリン試験による交差適合試験(主試験)を行う。主試験が陽性となったら、まず母親由来のIgG型抗Aや抗Bを疑い、赤血球濃厚液を同型からO型へ切り替える。引き続き交差適合試験を行い、主試験が陰性となれば輸血できる。
しかし、Ｏ型赤血球でも主試験が陰性とならない場合は、他の移行抗体（同種抗体）の存在を考慮する。通常、母親に臨床的意義のある同種抗体がなければ、児への輸血は安全に行うことができる。そのため、母親の不規則抗体検査の情報は大変重要であり、可能な限り入手に努める。また、児の検体が入手困難な場合、児が母親と異なる血液型であっても母親と適合する組み合わせであれば、母親血で代用できる。
５）緊急時及び大量輸血の場合時間的余裕がない場合には交差適合試験を省略し、O型またはABO同型の赤血球濃厚液を用いる
ことができる（Ⅲ-３、参照）。ただし、ABO同型または異型適合にかかわらず未交差で出庫した製剤については、輸血と平行して交差適合試験を実施する。ABO同型血が不足し異型適合血を用いる場合には、｢危機的出血への対応ガイドライン｣や「輸血療法の実施に関する指針(平成21年改定)」を参照する。
３）結果の解釈原則として、主試験が間接抗グロブリン試験で「陰性」の場合のみを適合とする。
しかし、交差適合試験では以下の場合に生じる患者と供血者の不適合を検出できないことがある。（１） 患者が量的効果を示す抗原に対する抗体を保有し、供血者赤血球の当該抗原がヘテロ接合体
であると、抗体価が低い場合には結果が陰性となることがある。注：量的効果を示す抗原については、Ⅳ-2-3)を参照。
（２）患者または供血者のRh(D)誤判定や事務的ミス。
約1mL約1mL約1mL
3～5％赤血球浮遊液副試験用
（１）患者(被検)検体の前処理
① 血清 (血漿 )，患者赤血球浮遊液と赤
血球製剤本数分の 試験管を準備し，
患者氏名（または識別番号）を付記
する 。
② 患者 検体（ EDTA 加血又は凝固血 ）
を遠心後 、 上清 を分離し 主試験に
用いる 。
③ 患者 (被検 )赤血球の一部を 採取し 、
予め生 理食塩液を約 1ｍ lL入れ た
試験管に１ 滴滴下する 。
④ よく混和後、 洗浄ビンで生理食塩
液を飛び散らないよう勢いよく入
れ 、 試験管の 7～8分目まで満たす 。
⑤ 900 ～1,000 G (3,400rpm) で
1～2分 遠心する。
⑤ 900 ～1,000 G (3,400rpm) 1～2分
①
③ ④
⑥
⑦
約1mL
②
〔 主試験用 〕
⑦ 生理食塩液約 1mL を添加して、
3～5% 赤血球浮遊液とし、副試
験に用いる。
⑥ 赤血球沈渣が流れ出ないよう試験
管を傾け，素早く生理食塩液を捨
てる（スポイトなどを用いてもよ
い）。
⑥
③
3～5%供血者赤血球浮遊液
〔主試験用〕
① ②
〔副試験用〕
⑤
前処理：血液バックからセグメントチュー
ブを切り離す。チューブ内の血液
が赤血球と血漿によく分離されて
いない場合は，チューブを試験管
に入れ、遠心してから用いる。
① 赤血球製剤本数分の試験管を準備
し、製造番号(または識別番号)を
明記する。
血漿側のチューブの先端をハサミ
で切り、親指の爪を立てて赤血球
沈渣の流出を止めながら、もう一
方の親指と人差し指で血漿側のチ
ューブを押して，副試験用試験管
に血漿を2滴滴下する。
② 次に、血漿と赤血球沈渣の境界を
切断し、予め生理食塩液を約1ｍL
入れた試験管に、赤血球沈渣1滴
を押し出す。
③ よく混和後、洗浄ビンで生理食塩
液を飛び散らないよう勢いよく入
れ、試験管の7～8分目まで満たす。
⑤ 赤血球沈渣が流れ出ないよう試験
管を傾け，素早く生理食塩液を捨
てる（スポイトなどを用いてもよ
い）。
④ 900～1,000G (3,400rpm) で
1～2分遠心する。
④ 900～1,000G (3,400rpm) 1～2分
注：副試験を省略する場合は，②から
開始する．
⑥ 生理食塩液約1mL(一横指)を添加
して、3～5%赤血球浮遊液とし、
主試験に用いる。
約1mL
約1mL約1mL
主試験 副試験
患者血清(血漿) 2滴
3～5％供血者赤血球浮遊液 1滴
判 定
PEG または LISS 2滴
37℃ 10～15分間
生理食塩液で3～4回洗浄
判 定
抗ヒトグロブリン試薬*2 2滴
供血者血漿 2滴
3～5％患者赤血球浮遊液 1滴
判 定
900～1,000G (3,400rpm) 15秒または100～125G (1,000rpm) 1分
凝集を確認する（凝集しない場合は無効）
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
反応増強剤無添加*1
3～5% IgG感作赤血球 1滴（ただし，陰性を呈した試験管のみ）
37℃ 60分間（時々よく攪拌する）
（３）交差適合試験
Ⅱ．検査法3．不規則抗体スクリーニング
３．不規則抗体スクリーニング臨床的意義のある37℃反応性の同種抗体を検出するため、不規則抗体スクリーニングでは必ず
間接抗グロブリン試験(indirect antiglobulin test、IAT)を実施する。以下に、生理食塩液法から反応増強剤を用いるIATの操作手順について示す。生理食塩液法の目的は低温反応性の抗体を積極
的に検出するためではなく、引き続き行う間接抗グロブリン試験で弱陽性を示した場合、その原因が低温反応性の抗体にあるかを推察するためである。
不規則抗体スクリーニングが同種抗体などによって陽性となった場合は、抗体を同定し適合血を選択する。抗体同定のための検査のポイントや手順については、Ⅳ-2を参照する。また、血清学的問題解
決の詳細、血液型抗体の反応態度や適合率については「新輸血検査の実際」（日本臨床衛生検査技師会出版）を参照する。
１）操作手順【生理食塩液法】（１）検体は1,200G(3,000rpm)、5分遠心し、血清(血漿)を患者名を明記した試験管に分取する。
（２）スクリーニング赤血球の本数分の検査用試験管を用意する（自己対照は省略可）。（３）検査用試験管に患者氏名（または識別番号）、スクリーニング赤血球の番号等を明記する。（４）検査用試験管に患者血清(血漿)を2滴ずつ滴下する。（５）患者血清(血漿)の分注もれを確認する。（６）スクリーニング赤血球（Dia抗原陽性を含む）をよく混和し、1滴ずつ滴下する。
（７）スクリーニング赤血球の分注漏れを確認し、よく混和する。（８）試験管を900～1,000G(3,400rpm)15秒または100～125G(1,000rpm)1分遠心する。
（９）凝集や溶血の有無を観察し、判定結果（反応強度）を記録する。
【間接抗グロブリン試験】（10）引き続き（７）の試験管に反応増強剤を2滴ずつ加え、よく混和後、37℃で10～15分加温する。（11）生理食塩液で3～4回洗浄する（最終洗浄後の生理食塩液は完全に除去する）。（12）洗浄後、抗ヒトグロブリン試薬（ＰＥＧ－ＩＡＴでは抗ＩｇＧ試薬）を2滴ずつ加え、よく混和する。（13）試験管を900～1,000G(3,400rpm)15秒または100～125G(1,000rpm)1分遠心する。（14）凝集や溶血の有無を観察し、判定結果（反応強度）を記録する。（15）陰性を呈した試験管に3～5％IgG感作赤血球を1滴ずつ加え、よく混和後、900～1,000G
(3,400rpm)15秒または100～125G(1,000rpm)1分遠心し、IgG感作赤血球が凝集すること
を確認する。
注1：自己対照は省略できる。ただし、抗体同定の際には陰性対照として必ず実施する。注2：試薬の添加量、反応時間や洗浄回数は試薬の添付文書に従う。注3：生理食塩液法で凝集を認めた場合は37℃で5～10分加温し、遠心後、凝集の有無を確かめ
る。凝集が減弱または消失した場合は低温反応性の抗体を疑う。注4：反応増強剤を用いる間接抗グロブリン試験では、低温反応性抗体の影響を受け陽性となるこ
とがある。しかし、反応増強剤無添加間接抗グロブリン試験で陰性化する抗体は、臨床的意義はない。
注5：母親の不規則抗体検査が陰性である場合は、胎児や新生児の不規則抗体検査は省略できる。ただし、ABO不適合妊娠の可能性がないにもかかわらず、胎児や新生児の溶血性貧血が疑わ
れる場合には、低頻度抗原に対する抗体による反応を疑い、精査が必要な場合がある。注6：Bombay(Oh)型やparaBombay(Ah、Bh)型の患者は自然抗体として抗Hや抗HIを保有するた
め、H抗原のあるＯ型赤血球と反応し，抗体スクリーニングでは陽性となる。
反応増強剤無添加*１
抗ヒトグロブリン試薬*2 2滴
3～5% IgG感作赤血球 1滴（ただし，陰性を呈した試験管のみ）
凝集を確認する（凝集しない場合は無効）
37℃ 10～15分間
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
900～1,000G(3,400rpm) 15秒または100～125G(1,000rpm) 1分
判 定
判 定
生理食塩液で3～4回洗浄
患者血清(血漿) 2滴3～5％スクリーニング赤血球 1滴（１本はDia陽性赤血球を含む）
PEG または LISS 2滴
37℃ 60分間（時々よく攪拌する）
PEG：polyethylene glycol，LISS：low-ionic-strength solution，IAT：indirect antiglobulin test
＊反応増強剤の特徴をよく理解し、日常検査ではいずれかを選択する。詳細は、「新輸血検査の実際」（日本臨床衛生検査技師会出版）を参照する。
【不規則抗体スクリーニング】
ⅢⅢ．輸血用血液の選択．輸血用血液の選択
『輸血のための検査マニュアル』
輸血用血液の選択輸血用血液の選択
•• 不規則抗体陽性患者不規則抗体陽性患者
•• Ｒｈ（Ｄ）陰性，Ｒｈ（Ｄ）陰性，weakweak Ｄ患者Ｄ患者
•• ＡＢＯが確定できない患者ＡＢＯが確定できない患者
•• ＡＢＯ亜型患者ＡＢＯ亜型患者
•• 自己抗体保有患者自己抗体保有患者
不規則抗体陽性患者不規則抗体陽性患者
選択の必要性がある抗体群
これらの血液型に対する抗体を保有している場合は，必ず抗原陰性血液を選択するRh，Duffy，Kidd，Diego，S，s，Kell
選択の必要性が少ない抗体群
これらの抗原に対する抗体を保有していても，抗原陰性血液を選択することは少ないLeb（ほとんどLebH)，P1， A1，N，Xga，Bga，高頻度抗原に対する抗体（JMH, Knops, Cost，
Chido/Rodgers）
反応性によって選択の必要性あり
間接抗グロブリン試験が陽性（37℃で１時間加温後），または試験管内で溶血を示す場合は抗原陰性血液を選択するLea，M
専門機関に相談 その他高頻度，または低頻度抗原に対する抗体
新輸血検査の実際より
RhRh，，DuffyDuffy，，KiddKidd，，DiegoDiego，，SS，，ss，，KellKellに対する抗体を保有した場合の選択に対する抗体を保有した場合の選択
これらの抗原に対するこれらの抗原に対する抗体を保有している場合抗体を保有している場合
抗原陰性血を必ず選択する
間接抗グロブリン法が陽性
過去に臨床的意義のある抗体を過去に臨床的意義のある抗体を保有し消失した場合の選択保有し消失した場合の選択
•• RhRh，，DuffyDuffy，，KiddKidd，，DiegoDiego，，SS，，ss，，KellKellに対する抗体に対する抗体
を過去に保有した場合は，医師と相談し時間的余を過去に保有した場合は，医師と相談し時間的余裕があれば，可能な限り適合血を選択し，輸血を裕があれば，可能な限り適合血を選択し，輸血を行う．行う．
•• 間接抗グロブリン試験が陽性（間接抗グロブリン試験が陽性（3737℃℃で１時間加温で１時間加温後），または試験管内で溶血を示す場合の抗後），または試験管内で溶血を示す場合の抗LeLeaa，，MMに対しても抗原陰性血を選択する．に対しても抗原陰性血を選択する．
Ｍ，ＬｅＭ，Ｌｅａａに対する抗体をに対する抗体を保有した場合の選択保有した場合の選択
抗Ｍ，抗Ｌｅa
増強剤加クームス試験
抗原陰性血の
選択なし
抗原陰性血
凝集あり 凝集なし
３７℃，1時間クームス試験
凝集あり 凝集なし
ＤＴＴ処理後３７℃クームス
凝集あり 凝集なし可能な場合
はい
輸 血
ＡＢＯ，Rh (D)検査
はい
輸血予定患者輸血予定患者
不規則抗体スクリーニング検査不規則抗体
スクリーニング検査 陰性陽性
いいえ37℃反応性の抗Ｍ，抗Ｌｅａ
いいえ
Rh ，Kidd ，Duffy，Diego ，S ，s ，Kell
に対する抗体
反応増強剤無添加‐間接抗ｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ試験（37℃，60分）
陽性 陰性
血液製剤の納品
交差適合試験
抗原陰性血の必要性なし抗原陰性血の必要性あり
通常血を血液センターへ発注抗原陰性血を血液センタへー発注
フローチャートフローチャート
Ｒｈ（Ｄ）陰性，Ｒｈ（Ｄ）陰性，weak weak Ｄ患者Ｄ患者
分分 類類 直後判定直後判定Ｄ陰性Ｄ陰性
確認試験確認試験
選択すべき選択すべき
血液型血液型
Ｄ陽性Ｄ陽性 ＋＋Ｄ陽性Ｄ陽性
（Ｄ陰性も可）（Ｄ陰性も可）
Ｄ陰性Ｄ陰性
（Ｄ陰性疑い）（Ｄ陰性疑い） ００ ００Ｄ陰性Ｄ陰性
変異型変異型
Ｒｈ（Ｄ）Ｒｈ（Ｄ） ００ ＋＋
注：供血者(輸血用血液)がRh変異型(weak D)の場合は、
Rh(D)陽性として取り扱う。
ＡＢＯが確定できない患者ＡＢＯが確定できない患者
患者血液型患者血液型 赤血球赤血球 血漿血漿
血小板血小板
Ａ型Ａ型 Ａ＞Ａ＞ＯＯ Ａ＞ＡＢ＞ＢＡ＞ＡＢ＞Ｂ
Ｂ型Ｂ型 Ｂ＞Ｂ＞ＯＯ Ｂ＞ＡＢ＞ＡＢ＞ＡＢ＞Ａ
ＡＢ型ＡＢ型 ＡＢ＞Ａ＝Ｂ＞ＡＢ＞Ａ＝Ｂ＞ＯＯ ＡＢ＞Ａ＝ＢＡＢ＞Ａ＝Ｂ
Ｏ型Ｏ型 ＯＯ 全て全て
緊急時の場合
異常反応により決定できない場合
患者血液型患者血液型 赤血球赤血球 血漿血漿
血小板血小板
？？ ＯＯ ＡＢＡＢ
ＡＢＯ亜型患者ＡＢＯ亜型患者
分類分類
オモテ試験オモテ試験 ウラ試験ウラ試験 ウラ試験ウラ試験（間接抗グロブリン試験）（間接抗グロブリン試験） 吸着解離吸着解離
試験試験
血液製剤の血液型血液製剤の血液型
抗Ａ抗Ａ 抗Ｂ抗ＢＡＡ１１
赤血球赤血球
ＢＢ
赤血球赤血球
ＯＯ
赤血球赤血球
ＡＡ１１
赤血球赤血球
ＢＢ
赤血球赤血球赤血球赤血球
血漿血漿
血小板血小板
Ａ亜型Ａ亜型
＋＋ ００ ＋＋ ＋＋ ００ ＋＋ 不要不要 ＯＯ ＡＡ
＋＋ ００ ＋＋ ＋＋ ００ ００ 不要不要 ＡＡ ＡＡ
００ ００ ００ ＋＋ ００ 不要不要 不要不要 Ａ抗原Ａ抗原（＋）（＋）
ＡＡ ＡＡ
＋：不規則性の抗Aによる反応
自己抗体保有患者への選択自己抗体保有患者への選択
患者のRh抗原（可能であればKidd抗原）が確認できた場合、
同型の抗原陰性血を選択することが望ましい。（＊）
溶血
所見
自己抗体
特異性同種抗体 抗原陰性赤血球（＊）
なし考慮の
必要性なし
（－） 必要なし
（＋） 同種抗体の対応抗原陰性血
あり＊
なし（－） 必要なし
（＋） 同種抗体の対応抗原陰性血
あり（－） 自己抗体の対応抗原陰性血
（＋） 同種抗体の対応抗原陰性血
まとめまとめ
•• 不規則抗体陽性患者への輸血は，ＩｇＧ抗体を保有して不規則抗体陽性患者への輸血は，ＩｇＧ抗体を保有している場合のみ，対応する抗原陰性血を選択する．いる場合のみ，対応する抗原陰性血を選択する．
•• Ｄ陰性（Ｄ陰性疑い），変異型Ｒｈ（Ｄ）の患者への輸血は，Ｄ陰性（Ｄ陰性疑い），変異型Ｒｈ（Ｄ）の患者への輸血は，Ｄ陰性血を用いる．Ｄ陰性血を用いる．
•• 緊急時を含めＡＢＯ血液型が決定できない患者へは，先緊急時を含めＡＢＯ血液型が決定できない患者へは，先ずはＯ型赤血球，ＡＢ型血漿，血小板を選択する．ずはＯ型赤血球，ＡＢ型血漿，血小板を選択する．
•• ＡＢＯ亜型患者は，不規則性の抗Ａ，抗Ｂを保有しているＡＢＯ亜型患者は，不規則性の抗Ａ，抗Ｂを保有している場合のみ選択に注意が必要である．場合のみ選択に注意が必要である．
Ⅳ．｢異常反応に対する考え方｣
『輸血のための検査マニュアル』
－ 血清学的異常反応への対応 －
1) 疾患名2) 検査データ3) 治療薬/検査薬4) 輸血歴/妊娠歴/移植歴
１．患者情報の収集
２ ．問題解決のための知識/技術
オモテ・ウラ不一致の原因
不規則抗体スクリーニング（生理食塩液法）
(－)
抗原減弱
オモテ検査 ウラ検査
・抗A1・抗B
・血液疾患i) 白血病
ii) MDSiii) ホジキン病
・先天性i) 亜型(Ax/Bx etc.)
反応の減弱/消失
・腫瘍i) 過剰の型物質
・BMT/PBSCTi) 抗A/B産生能消失
潜在/修飾
抗原
・重症感染症i) T抗原化ii) 獲得性B
連銭形成
・不規則抗体i) 抗M/N
ii) 抗P1 etc.
・寒冷凝集素i) 抗I/i
・高γグロブリン血症
ウラ検査
部分凝集
・ABO不適合i) 輸血
ii) BMT/PBSCT
・先天性i) 亜型(A3/B3 etc.)
ii) キメラ
抗体 抗体非特異的凝集
・寒冷凝集素病
オモテ検査
(＋)
抗原減弱
潜在/修飾抗原
部分凝集
反応性の減弱/消失
連銭形成
抗体
①臨床側へ疾患名/病態の問い合わせ，②亜型との鑑別
T抗原化/獲得性B：異なるモノクローナル抗体試薬で再検査
亜型とキメラの鑑別：輸血/造血幹細胞移植や二卵性双生児等の確認分別凝集法により分離した非凝集性赤血球の血液型を検査．
①過剰な型物質：患者赤血球をよく洗浄して除去．②免疫寛容状態：造血幹細胞移植歴の有無の確認
高γグロブリン：生理食塩液を1滴滴下し，連銭形成の消失確認．
①抗A1：A2赤血球との反応性②不規則抗体：抗Mや抗P1の同定し，対応抗原(-)赤血球で再検査③寒冷凝集素：患者赤血球と4℃で抗I/iを吸着除去し，再検査
非特異的凝集①寒冷凝集素：検体を37℃以下にならないよう保温して運搬/遠心
②非特異的凝集が消失するまで，温生理食塩液で赤血球を洗浄
【赤血球側の原因】
【血清(血漿)側の原因】
オモテ・ウラ不一致の対処法
モノクローナル抗B (-)
B
B3
(+) (-)部分凝集
≦3+ 4+
吸着解離試験(+) (-)
O
または
Bm Bel
糖転移酵素活性(+) (-)
唾液中和試験B，H H
（分泌型の場合）
Bx
抗原減弱
B，H H
（分泌型の場合）
1) オモテ･ウラ検査の不一致2) ウラ検査の反応減弱
（ 37℃反応性の抗Bを保有するB亜型患者には、O型赤血球を選択する）
時に(+) (-) (+)
血漿（血清）中の抗B
(+)
B亜型の血清学的鑑別法
唾液中和試験
または
時に(+)
モノクローナル抗A
(+) (-)
(-)
O
(+) (-)
Am Ael
≦3+
A1
A2
(+) (-)
A3 Ax
抗A1 (-)(+)
抗原減弱 唾液中和試験A，H H
1) オモテ･ウラ検査の不一致2) ウラ検査の反応減弱
部分凝集 吸着解離試験
糖転移酵素活性
または
または 4+
（分泌型の場合）
(+) (-) (+)
A亜型の血清学的鑑別法
（ 37℃反応性の抗A1を保有するA亜型患者には、O型赤血球を選択する）
Rhコントロール陽性への対応
１．直後判定時： 寒冷凝集素（IgM)による非特異的凝集（IgM/IgG抗D）
低力価：37℃温生理食塩液による洗浄
高力価：採血直後から検査までの間、検体が37℃以下にならないように保温。
上記の方法でRhコントロールが陰性化しない場合
スルフヒドリル試薬（DTT or ZZAP等）で患者赤血球上のIgM自己抗体を変性/破壊し，再検査。
２．D陰性確認試験時：HDFNの原因抗体(抗D)による被覆（IgM/IgG抗D）
抗D試薬: ＋ ＋/0Rh cont.: ＋ 0
抗D試薬: 0 ＋ ＋/0Rh cont.: 0 ＋ 0
直後 確認試験
クロロキン試薬で患者赤血球上の抗Dを解離後,再検査
直後
再検査
再検査
抗体特異性の推定
不規則抗体スクリーニング
1) 反応パターン2) 反応温度3) 凝集の強さ
反応態度（陽性のパネル赤血球）
消去法（陰性のパネル赤血球）
1) 量的効果
可能性の高い抗体
否定できない抗体
－ 不規則抗体スクリーニング陽性時への対応 －
■ ‘可能性の高い抗体’ とは？
陽性反応が抗原表のいずれかの抗原パターンと完全に一致する抗体（反応強度から2つ以上の抗体が推定できる場合も含む）
■ ‘否定できない抗体’ とは？
陽性反応が特定の抗原パターンに含まれてしまい，反応強度からもその特異性が確認できない抗体
1) 反応条件の変更（検体量，温度など）2) 反応性の単純化（酵素法併用，抗体中和，吸着解離試験etc.）3) 酵素または化学処理した赤血球との反応性
患者情報 1) 輸血歴・妊娠歴・抗体保有歴2) 当該抗原の有無
統計学 1) Fisher 確率計算法
追加試験
抗体同定
追加パネル
総合評価
1) 推定される複数抗体に対する抗原を１つもつパネル赤血球
抗体特異性の絞込み
パネル赤血球による不規則抗体検査
可能性の高い抗体
否定できない抗体
－ 抗体同定までの検査手順 －
（陽性の赤血球パネルの反応態度）
（陰性の赤血球パネルによる消去法）
－ 複数抗体の見逃しをなくすためのポイント －
１．反応条件の変更1) 反応温度 ⇒ 4℃，20℃，37℃2) 検体量 ⇒ 2滴 → 4滴3) 反応時間 ⇒ double incubation
２．反応性の単純化1) 酵素法の併用 ⇒ 反応の一部消失2) 型物質による抗体中和 ⇒ 反応の一部消失3) 吸着解離試験 ⇒ 上清と解離液に抗体を分散
３．患者血液型のフェノタイピング ⇒ 産生可能な抗体を推定
－ 不規則抗体陽性（不規則抗体同定)への対応 －
・抗体同定におけるポイントと対処法
１．37℃反応性(IgG)と低温反応性(IgM)抗体の鑑別・ IgM：1) 反応性が37℃で減弱/消失，2) 2-ME/DTTで変性/破壊
２．単一抗体と複数抗体の鑑別1) 量的効果とは無関係な反応の強弱
2) ‘抗体同定までの検査手順’ で述べた消去法/追加試験/追加パネルを実施3) 産生しうる同種抗体の推定：ABO/Rh以外の血液型抗原を検査
３．自己抗体と同種抗体の鑑別・ 抗体に対する抗原の有無：(+)自己抗体，(-)同種抗体（但し，直近に輸血歴無）
４．自己抗体と共存する同種抗体の検出1) ZZAP or Glycine/HCl/EDTA-PEG法による患者赤血球自己抗体の変性/破壊
2) 処理赤血球による寒冷凝集素(4℃)/温式自己抗体(37℃)の吸着除去3) 寒冷凝集素が高力価の場合： 2-ME/DTTで抗Iを変性/破壊後，抗体スクリーニング
抗原/抗体の特徴を理解し，反応パターン，反応温度，凝集の強さから‘可能性の高い抗体’ と，
消去法によって‘否定できない抗体’ に分類すること．
【目的】
【ポイント】
抗体の見逃しを回避するため，パネル検査の結果から考えられる抗体特異性を明確化すること．
－ 消去法 －
CellNo. D C E ｃ e K k Fya Fyb Jka Jkb Lea Leb Xga M N S s P1 Dia Dib Sal AHG
Ⅰ ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ O ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ O O ＋ 0 0
Ⅱ ＋ O ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ ＋ O O O ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ O ＋ 0 2+
Ⅲ O O O ＋ ＋ O ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ O ＋ O ＋ ＋ ＋ 0 0
RhDuffyKidd MNS
－ 消去法の実例 －
(1) 量的効果のあるホモ接合体の抗原/量的効果を考慮しなくてよい抗原：『×』
(2) 量的効果のあるヘテロ接合体の抗原：『／』(3) 最終的に『×』が１つ以上ある場合：抗原表の抗原名に『×』
可能性の高い抗体：抗E否定できない抗体 ：抗Jka，抗ｓ
CellNo. D C E ｃ e K k Fya Fyb Jka Jkb Lea Leb Xga M N S s P1 Dia Dib Sal AHG ENZ
1 ＋ ＋ O O ＋ O ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ 0 0 0
2 ＋ ＋ O O ＋ O ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ ＋ ＋ O O ＋ 0 0 0
3 ＋ O ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ O O ＋ O ＋ ＋ O ＋ O ＋ 0 4+ 3+
4 ＋ O O ＋ ＋ O ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ O ＋ ＋ O ＋ 0 0 0
5 O ＋ O ＋ ＋ O ＋ O ＋ O ＋ O O O O ＋ ＋ ＋ ＋ O ＋ 0 2+ 0
6 O O ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ ＋ O ＋ O ＋ O ＋ O ＋ ＋ O ＋ 0 4+ 2+
7 O O O ＋ ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ O ＋ 0 2+ 0
8 O O O ＋ ＋ O ＋ ＋ O O ＋ O ＋ O O ＋ ＋ ＋ ＋ O ＋ 0 0 0
9 O ＋ O ＋ ＋ O ＋ ＋ O ＋ O O ＋ O ＋ O O ＋ O O ＋ 0 0 0
10 O O O ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ ＋ O ＋ O ＋ 0 1+ 0
11 ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ O O ＋ ＋ ＋ O ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 0 2+ 0
Auto 0 0 0
可能性の高い抗体：抗E，抗Fyb
否定できない抗体 ：抗K，抗Dia
－ 消去法の実例（２） －
－ 血清学的異常反応への対応 －
伝達講習会では，『考え方』のポイントを伝授
1) オモテ・ウラ不一致2) Rhコントロール陽性
3) 不規則抗体陽性
問題解決能力の向上をめざす
自己啓発の促進
マニュアルの目的 ⇒ 基礎的技術の習得
その他輸血検査業務に参考となる書籍は？
・新輸血検査の実際（日臨技）
・スタンダード輸血検査テキスト
（認定輸血検査技師制度協議会）