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長時間の単一分子観測に耐えうる高発光蛍光プローブ
富山大学大学院医学薬学研究部富山大学大学院医学薬学研究部薬化学研究室薬化学研究室
水溶性ロタキサン型水溶性ロタキサン型蛍光色素蛍光色素
藤本和久藤本和久
特願特願 20082008--225739225739
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研究背景:研究背景:1分子からの蛍光イメージング1分子からの蛍光イメージング
単一分子蛍光観測の意義単一分子蛍光観測の意義
多分子からの蛍光多分子からの蛍光 1分子からの蛍光1分子からの蛍光
蛍光標識された蛍光標識された分子の分布として観測分子の分布として観測
個々の輝点として観測個々の輝点として観測→動きを観測→動きを観測
30 30 μμmm 30 30 μμmm
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単一分子観測用蛍光標識剤単一分子観測用蛍光標識剤 -代表例--代表例-
量子ドット量子ドット
蛍光色素蛍光色素 蛍光タンパク質蛍光タンパク質
シアニン系色素シアニン系色素
Green Fluorescent ProteinGreen Fluorescent Protein
励起波長:励起波長: 488 nm488 nm、発光波長:、発光波長: 512 nm512 nm
励起波長:励起波長: 489489--743 nm743 nm、発光波長:、発光波長: 506506--767 nm767 nm
直径:数~十直径:数~十 nmnm
ZnSZnS (Shell)(Shell)
CdSeCdSe (Core)(Core)
発光波長は粒径に依存発光波長は粒径に依存非常に鋭いスペクトル非常に鋭いスペクトル
いずれにも問題ありいずれにも問題あり
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単一分子観測用蛍光標識剤に要求される性質単一分子観測用蛍光標識剤に要求される性質
量子ドット量子ドット
○△ ×
×× △
△○ ×
×○△
△ ×○
○△ △
蛍光色素蛍光色素 蛍光タンパク蛍光タンパク
発光の明るさ発光の明るさ
光褪色・ブリンキング光褪色・ブリンキング
分子サイズ分子サイズ
細胞毒性細胞毒性
標識率標識率
溶解度溶解度
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本技術の着想本技術の着想
最も改変しやすいのは最も改変しやすいのは 蛍光色素蛍光色素 ←← 有機合成有機合成
しかしながら、しかしながら、特に光褪色特に光褪色 (酸素)(酸素) ・ブリンキングの問題・ブリンキングの問題
光に透明な光に透明な ““防弾ガラス防弾ガラス”” でで蛍光色素を包む蛍光色素を包む
ロタキサン型にロタキサン型に
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ロタキサン型蛍光色素ロタキサン型蛍光色素 -過去の研究例--過去の研究例-
H. L. AndersonH. L. Anderson((オックスフォード大)オックスフォード大)
B. D. SmithB. D. Smith((ノートルダム大)ノートルダム大)
アントラセンがアントラセンがββ--CDで包接されているCDで包接されている
中性水溶液に難溶である中性水溶液に難溶である一つのみのラベル化部位の導入が難しい一つのみのラベル化部位の導入が難しい光安定性がそれほど高くない光安定性がそれほど高くない
Chem. Eur. J. 2006, 12, 4684-4590Chem. Commun. 2007, 2387-2389
四角酸が環状アミドで包接されている四角酸が環状アミドで包接されている
電荷を有している電荷を有している一つのみのラベル化部位の導入が難しい一つのみのラベル化部位の導入が難しい蛍光量子収率が低い蛍光量子収率が低い
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本技術の基礎となる研究本技術の基礎となる研究
高蛍光量子収率かつ酸素による消光を受けにくい疎水性色素:
アルキニルピレン
①① プロトン性溶媒中では蛍光量子収率が低いプロトン性溶媒中では蛍光量子収率が低い ((蛍光シグナルが弱い蛍光シグナルが弱い))
②② 酸素酸素による蛍光の消光を受けやすいによる蛍光の消光を受けやすい
③③ ピレンの励起波長は比較的ピレンの励起波長は比較的短波長短波長であり、であり、励起光の透過性低下や励起光の透過性低下や他の生体分子の光吸収による影響他の生体分子の光吸収による影響が大きいが大きい
蛍光発色団としてのピレン蛍光発色団としてのピレン のの 問題点とは?問題点とは?
アルキニルピレン骨格
Chem. Eur. J. 2006, 12, 824-831PCT/JP2005/19514
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高蛍光量子収率型高蛍光量子収率型アルキニルアルキニルピレン誘導体ピレン誘導体紫外可視吸収スペクトル
2 3 4
1 23 4
1.0 ×10-5 M in aerated EtOH
蛍光スペクトル(モノマー)
4
3
2
1
OD = 0.01 in degassed EtOHExcitation wavelength337, 361, 366, 393 nm for 1-4, respectively
ピレン
1
S
250 300 350 400 4500
0.2
0.4
0.6
Abs
orba
nce
Wavelength (nm)400 500 600
0
100
200
300
400
Wavelength (nm)
Rel
ativ
e In
tens
ity (a
.u.)
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compound蛍光量子収率
Φf
酸素下での蛍光量子収率
Φf (O2)蛍光寿命
τs (ns)kf
(s-1)kisc + knr
(s-1)
0.32
0.78
0.55
0.90
0.019
0.56
0.49
0.83
377
7.72
1.96
1.65
8.49 ×105
1.01 ×108
2.81 ×108
5.45 ×108
1.80 ×106
2.89 ×107
2.29 ×108
6.11 ×107
ピレンならびにアルキニルピレン誘導体の光物性ピレンならびにアルキニルピレン誘導体の光物性
in EtOH
Φf
の
増
大
酸素下でも高いΦf
ピレン1
2
3
4
Φf = kf.τs τs = 1 / (kf + kisc + knr + kq[O2])
S
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水溶性ロタキサン型蛍光色素開発に向けて水溶性ロタキサン型蛍光色素開発に向けて (1)(1)
水溶性アルキニルピレンとシクロデキストリンとの会合挙動水溶性アルキニルピレンとシクロデキストリンとの会合挙動
水溶性水溶性アルキニルピレンアルキニルピレン
permethylpermethyl--αα--CDCDγγ--CDCD
0 0 eqeq
0.5 0.5 eqeq
1 1 eqeq
2 2 eqeq
4 4 eqeq
0 0 eqeq
99 88 77 ppmppm 99 88 77 ppmppm
11H NMR H NMR スペクトルスペクトル (ピレン領域)(ピレン領域) [[アルキニルピレンアルキニルピレン] = 3 ] = 3 mMmM in Din D22OO
permethylpermethyl--αα--CDCD γγ--CDCD
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水溶性ロタキサン型蛍光色素開発に向けて水溶性ロタキサン型蛍光色素開発に向けて (2)(2)
水溶性アルキニルピレンとシクロデキストリンとの会合挙動水溶性アルキニルピレンとシクロデキストリンとの会合挙動
permethylpermethyl--αα--CDCD γγ--CDCD
水溶性水溶性アルキニルピレンアルキニルピレン
permethylpermethyl--αα--CDCDγγ--CDCD
蛍光蛍光 (励起波長(励起波長: 406 nm: 406 nm)) 蛍光蛍光 (励起波長(励起波長: 450 nm: 450 nm))
紫外可視紫外可視 紫外可視紫外可視
0 0 eqeq2244
404000 550000 660000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
550000 660000 770000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
00
5050
150150
100100
200200
Rel
ativ
e In
tens
ity (
Rel
ativ
e In
tens
ity ( a
.ua.u .
).)
00
5050
150150
100100
Rel
ativ
e In
tens
ity (
Rel
ativ
e In
tens
ity ( a
.ua.u .
).)
330000 350350 440000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
00
0.50.5
11
Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
330000 350350 440000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
00
0.20.2Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
0.40.4
0.60.6
0.80.8
0 0 eqeq0.50.5
22
0 0 eqeq2020
100100
0 0 eqeq10105050
水溶性アルキニルピレンの水溶性アルキニルピレンの紫外可視吸収紫外可視吸収 ((3 3 mMmM)) ならびに蛍光ならびに蛍光スペクトルスペクトル ((22 22 μμMM))
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予想される包接形態予想される包接形態
permethylpermethyl--αα--CDCD γγ--CDCD
凝集し、凝集し、エキシマー発光エキシマー発光濃度消光濃度消光
一分子包接一分子包接 二分子包接二分子包接
発光色が、発光色が、青紫色に変化青紫色に変化モノマー発光モノマー発光
発光強度が増大発光強度が増大濃度消光が解消濃度消光が解消エキシマー発光エキシマー発光
ストッパーを導入ストッパーを導入 →→ 水溶性ロタキサン型蛍光色素へ水溶性ロタキサン型蛍光色素へ
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水溶性ロタキサン型蛍光色素水溶性ロタキサン型蛍光色素
ストッパーストッパー
ストッパーストッパー
ストッパー
ストッパー
ストッパー
ストッパー
アルキニル
アルキニル
ピレン
ピレン
66
permethylpermethyl--αα--CDCD
細胞毒性細胞毒性 低低水溶性水溶性 高高 高いモル吸光係数と高いモル吸光係数と
蛍光量子収率蛍光量子収率
明るい発光明るい発光ブリンキングの抑制ブリンキングの抑制
完全にバルクから完全にバルクから遮蔽遮蔽
褪色され難い褪色され難い
フェノール性フェノール性水酸基水酸基
ラベル化部位のラベル化部位の導入が容易導入が容易
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光褪色実験光褪色実験 365 nm365 nm の光をの光を 7 7 時間照射時間照射
00
Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
0.0.55
11
330000 350350 440000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
445500330000 350350 440000Wavelength (nm)Wavelength (nm)
44550000
Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
0.0.55
11
1.1.55
ロタキサンロタキサン ダンベルダンベル (CD無し)(CD無し)
ほとんど変化無し
ほとんど変化無し
ほぼ完全に褪色
ほぼ完全に褪色
[[ロタキサンロタキサン] = 18 ] = 18 μμMMin Hin H22O O including 10% DMSOincluding 10% DMSO
ロタキサンロタキサン
[[ダンベルダンベル] = 18 ] = 18 μμMMin Hin H22O O including 10% DMSOincluding 10% DMSO
ダンベルダンベル
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長時間の単一分子観測に耐えうる長時間の単一分子観測に耐えうる蛍光標識剤ライブラリーへの展開蛍光標識剤ライブラリーへの展開
ストッパーストッパー
ストッパーストッパー
ラベル化ラベル化部位部位
CDCD
アルキニルアルキニル色素色素
ピレンピレンダイマーダイマー アントラセンアントラセン ペリレンペリレン クマリンクマリン
αα--CDCD ββ--CDCD γγ--CDCD メチル化CDメチル化CD
・・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・・
・・ ・・ ・・ ・・ ・・ ・・
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本技術の想定される用途本技術の想定される用途
単一分子蛍光観測用プローブとしての利用単一分子蛍光観測用プローブとしての利用例えば、例えば、蛍光相関分光法を利用してタンパク一分子の動きや蛍光相関分光法を利用してタンパク一分子の動きや大きさを観測する大きさを観測する
蛍光共鳴エネルギー移動蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)(FRET) におけるにおけるドナープローブとしての利用ドナープローブとしての利用
より長波長側に発光波長を有する蛍光色素や蛍光タンパクとより長波長側に発光波長を有する蛍光色素や蛍光タンパクと組み合わせて組み合わせて FRET FRET 観測をおこなう観測をおこなう
明るく、光安定性に優れておりドナープローブとして最適明るく、光安定性に優れておりドナープローブとして最適
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本技術が利用されると想定される業界本技術が利用されると想定される業界
試薬会社からプローブ分子として販売を想定試薬会社からプローブ分子として販売を想定
予想される購入層予想される購入層 : : 大学の研究室大学の研究室産学官の研究所産学官の研究所
予想される波及効果予想される波及効果 : : 新しい生命像の確立新しい生命像の確立難治疾患の原因解明難治疾患の原因解明新規薬剤の開発新規薬剤の開発 等等
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本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権
••発明の名称:水溶性ロタキサン型蛍光色素発明の名称:水溶性ロタキサン型蛍光色素
••出願番号出願番号 :特願:特願 20082008--225739225739
••出願人出願人 :国立大学法人富山大学:国立大学法人富山大学
••発明者発明者 :井上将彦・藤本和久・米永友樹:井上将彦・藤本和久・米永友樹
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お問い合わせ先お問い合わせ先
富山大学富山大学 杉谷(医薬系)キャンパス杉谷(医薬系)キャンパス
富山大学富山大学 TLO・リエゾンオフィスTLO・リエゾンオフィス
佐貫大三郎佐貫大三郎
TEL: 076TEL: 076--434434--71719696FAX: 076FAX: 076--434434--51385138EE--mail: mail: [email protected]@adm.u--toyama.ac.jptoyama.ac.jp