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試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2反 応 系 に お け る

鉄 分 離 に 関 す る 研 究

第3編

Hb-KCN-H2O2反 応 系 に お け る 所 謂

易 分 離 鉄(G. Barkan)の 検 討

岡山大学医学部第一内科教室(主任:小 坂 教 授　指導:九 州大学　山岡教授)

藤 原 拓 一

〔昭和34年9月5日 受稿〕

緒 言

G. Barkan1)に よ り提 唱 され たHbO2-KCN-H2O2

反 応系 がR. Lemberg2) 3)に よ り提 唱 され たHbO2-

1-Ascorbin酸-O2反 応 系 と な らん で,血 色 素 よ り

胆 汁色 素 へ の生 成 過 程研 究 の模 型 実 験 と して 重 要 視

され て い る.

G. BarkanはHbO2-KCN-H2O2反 応 系 に生 ず る

中間産 物 をpseudohemoglobin,鉄 の 側 よ り易分 離

鉄 と呼 称 し, 2価 の鉄 を有 す るもの をE, 3価 の 鉄

を有 す るもの をE´ に分類 し,互 に還 元 ・酸 化型 を示

す 同位 の 物 質 と 考え た.一 方R. LembergはHbO2-

1-Ascorbin酸-O2反 応 系 に 於 いて 中間 産 物chole

globin→verdohemoglobinな る過 程 を 考 え て お り,

上代4)も ま た630, 670mμ 物 質 な る二 段 階反 応 を

考 えて い るが,教 室 尼子5),垂 水6)ら は630, 670mμ

物質 は二 段 階物 質 で は な くて,同 位 に あ る物 質 と考

え,教 室 竹 田7)はG. Barkanと 同一 反 応 系 に 於 い

て も,同 様 に 同位 の2つ の吸 収 極 大 を もつ物 質 の存

在 を証 明 して い る.

そ こで著 者 は 易 分 離 鉄 の 立 場 か らG. Barkanの

調 うE, E´ の本 態 に つ き検 討 を 加 え,そ の反 応機

序 を明 らか に しよ う と試 み た.

実 験 材 料 並 び に 方 法

1. 還 元hemoglobinの 調 製 法

牛 血液 か らM. Engel8)の 方 法 に従 つ て 調製 した

oxyhemoglobinをSbrenenのM/15燐 酸 塩 緩 衝 液

でpH 7.2と し,且 つ その 濃 度 を0.5g%と した も

のを 容量200ccの 広 口 瓶 に80ccと り,こ れ に 市

販 の 窒 素 ガ ス ボ ンペ か ら通 気 した.窒 糸ガ ス は 予ーめ

20% pyrogallol苛 性 曹達溶 液 中 を2回, 20%過 マ

ンガ ン酸 加 里 苛性 曹達 溶 液 中 を1回,水 中を1回 通

過 させ た もの を 口径5mmの 硝 子 管 を通 じ毎 分 数 千

気 泡宛 約60分 間 通 気 した 後, BeckmanDK型 自 記

分 光 光 度 計 に よ り 完 全 に 還 元hemoglobinに な つ

て い るこ とを確 認 した 後使 用 した.

2. COガ スの 調製

濃 硫 酸 に蟻 酸 を 滴 下 しな が ら加 温 して 発生 せ しめ

た もの を, 20% pyrogallol苛 性 曹 達溶 液 中 を2回,

20%.過 マ ンガ ン酸 加 里苛 性 曹達 溶液 中を1回,水 中

を1回 通過 させ た もの を使 用 した.

3. CO-hemoglobinの 調 製 法

M. Engelの 方 法 に よ つ て 牛 血 液 か ら調 製 した

0.5g%のogyhemoglobin溶 液 に前 項 に於 いて 述 べ

た 方法 に よ り発生 させ たCOガ スを 口径5mmの 硝

子 管 か ら毎 分200気 泡 宛約45分 間通 気 し, Beckman

DK型 自記 分 光 光 度 計 で, oxyhemoglobinの 吸 収

極 大 の消 失 とCO-hemoglobinの 吸収 極 大 を確 認 し,

更 にNa2S2O4で 還 元 し て も還元hemoglobinの 吸

収 極 大 を示 さな く なつ た もの をCO-hemogl0binと

して使 用 した.

4. KCN及 びH2O2中 の 溶存 酸素 の駆 逐 法

KCN及 びH2O2に 上 記 の如 くに し て 窒 素 ガ ス を

通 気 して駆 逐 した.

5. 塩酸 中 の溶 存 酸 素 の駆 逐 法

濃 塩 酸 を再 蒸 溜水 にて1.2%に した もの に上 記 の

如 く窒 素ガ ス を通 気 した.

6. 反 応液 中 の鉄 定 量 法

反 応 液 に1.2%の 塩 酸 を加 え, 37℃, 16時 間放 置

7572　 藤 原 拓 一

した後に, 20%三 塩 化酷酸2.5ccを 加えて除蛋白

し,こ れを東洋濾紙No. 6で 濾過し,得 た濾液を第

2編 で述べた方法で吸光係数を決定 し, A(γ%)=

0.91×(E-E0)×Dで 求 め る易 分離鉄量を計算 し

た.こ のさい盲検液には反応液 の代 りに再蒸溜水

5ccを 用い,爾 後の操作は同様にした.

実 験 成 績

1. Hb-KCN-H2O2反 応 系を 窒素ガス下で観察

する場合の易分離鉄の消長(図1)

還元hemoglobinを 口径の 一定 した容量200cc

の広 口瓶 に80ccと り,こ れ に 予 め溶 存酸 素 を駆 逐

した0.01MKCN及 び0.01 M H2O2を 夫 々10cc

加 え,瓶 の 中 の 空 気 を 窒 素 ガ ス で 置換 した後,

tolueneを 重 層 して 反 応 系 を 完 成 させ,そ の後1, 5,

10, 20, 30, 45及 び60分 目 に反 応 液 を5cc空 気 に

接 触 す る こと の な い よ う に注 意 して と り,こ れ に

1.2%塩 酸2.5ccを 加 え, tolueneを 重 層 して空 気

を遮 断 し, 37℃ の 恒 温 槽 に16時 間 放 置 した後 に 易

分離 鉄 を 測定 した.

第1図　 Hb-KCN-H2O2反 応 系 を窒 素 ガス 下

で 観 察 した時 の 易分 離 鉄 の 消 長

その結果反応開始後時間の経過と共に易分離鉄の

収量は徐々に増加 し,反 応30分 後に至つてほぼ一定

した値を示すようになり,反 応は一応停止する.こ

の時期を待つて反応液に分子酸素を口径5mmの 硝

子管から毎分80気 泡宛通気してみると,再 び易分離

鉄の増加が認められ,反 応の進行が再開されたこと

を知る.而 してその後は時間の経過と共に増加を示

し,通 気開始後60分 に至つて約倍量の易分離鉄収量

が得 られた.

2. oxshemoglobinと 溶存酸素を駆 逐 したH2O2

及びKCNを 用いて反応を進めた時の易分離鉄の消

長(図2)

濃度0.01 M KCN及 び同濃度のH2O2の 溶 存酸

素を予め駆逐し,こ れ をoayhemoglobinに 作用さ

せて反応の進行に伴 う易分離鉄の消長を眺めてみる

と,反 応開始後約20分 で易分離鉄の収量はほぼ一定

の値となり,そ の後は一定の値を持続 し,反 応の停

止す るのがみられる.こ の時期に分子酸素を毎分80

気泡宛通気 して易分離鉄の収量を測定 してみると,

その収量は酸素を通気す る前の値とほぼ同 じ位で著

明な増加を認め難い.而 して時間の経過と共に増加

す ることも殆んどなく,ほ ぼ一定の値を示 した.

第2図　 HbO2と 溶存 酸素を駆遽 したH2O2

及びKCNを 用 いて反応を進めた時

の易分離鉄の消長

3. 還元hemoglobinにKCN及 びH2O2を 窒

素ガス非通気のままで反応させた場合(図3)

反応系各組成の調製法及び濃度は前述の如 くにし,

窒素ガスの通気 も前述の如 くにした.

第3図　 Hbに 窒 素 ガス非通 気のKCN及 び

H2O2を 作用させた時の易 分離鉄収量

の変化

厳密に空気遮断下に反応を進行 させて,時 間毎に

易分離鉄の収量を測定 してその消長をみると反応開

始後約5分 で急激に易分離鉄の収量が増加し,次 い

でその後は緩徐な増加を示すのが認められ,反 応開

試験管内HbO2-KCN-H2O2反 応系における鉄分離に関する研究　 7573

始後60分になつてもなお多少の増加があつた.こ の

時期に毎分80気泡宛の分子酸素を通気 して,反 応系

を好気性の条件として易分離鉄の消長をみると,通

気開始後徐々に易分離鉄の収量は増加してゆき,酸

素通気開始後約60分 で通気前の60分 値の約1.4倍 の

易分離鉄の量を得た.

4. 血 色素 とH2O2に は窒素 ガ スを通気し,

KCNの み非通気として反応 を進めた時の易分離鉄

の消長(図4)

反応系の調製及び通気条件は前述の如 くにして反

応系を完成させ,反 応を進行 させて時間毎に易分離

鉄を測定してみると,反 応開始後約30分 で易分離鉄

はほぼ一定の値を示すようになり,一 応反応が停止

するのを知つた.之 の状態の反応系に分子酸素を毎

分80気泡宛通気しなが ら再び経時的に易分離鉄を測

定してみると,酸 素通気開始後約5分 頃から徐々に

易分離鉄の収量が増加 し始め,そ の後は時間の経過

と共にやや緩徐な増加を示 し, 60分 後1.4倍 の収量

を得た.

第4図　 HbO2とH2O2に は 窒素 ガ スを 通 気 し,

KCNの み 非 通 気 と して反 応 を 進 め た

時 の 易 分 離鉄 の 消 長

5. 血 色素 とKCNに は窒 素 ガスを通気 し,

H202の み窒素非通気 として反応を進 めた時の易分

離鉄収量の消長(図5)

反応系の各組成の調製法及び濃度,窒 素ガス通気

条件等は前述の如 くにした.反 応系を完成させて,

反応を進行させると,反 応開始後約1分 にして既に

易分離鉄の収量はほぼ最高値に近 くなり,そ の後は

時間の経過にかかわらずほぼ一定の値を示すが,前

実験よりやや低値を示 した.こ の状態の反応系に分

子酸素を毎分80気 泡宛通気 して易分離鉄を測定 し,

その消長を酸素通気前の値と比校してみると,酸 素

通気後約5分 頃から比1的 著明な易分離鉄収量の増

加が始まり,時 間の経過と共に漸次収量増加の傾向

が認められた.而 して酸素通気開始後約60分で通気

前の値の大約1.5倍 の収量を得た.

第5図　 血色素とKCNに は窒素ガスを通し,

H202の み窒素非通気として反応を進

めた時の易分離鉄の消長

6. 試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2系 に 於 け る反 応

液 にCOガ ス を通 気 し た 際 の易 分 離 鉄収 量 の 消長

(図6)

0.5g%血 色 素7溶液, 0.01 M KCN及 びH2O2を

使用して反応系を調製 し,厳 密に空気遮断の下に反

応を進行させ,反 応開始後1分, 5分, 10分, 20分,

30分, 45分 及び60分 に夫々反応液を5ccと り,こ

れに上述 の如 くに して発生させたCOガ スを口径

3mmの 硝子管から毎分100気 泡宛約10分 間通気 し

た後に溶存酸素を駆逐 した1.2%の 塩酸2.5ccを 加

え, 37℃ の恒温槽に約16時 間放 置 して易分離鉄を

測定した.

第6図　 HbO2-KCN-H2O2反 応 系 に 於 け る 反

応 的 にCOガ スを通 気 した 時 の易 分 離

鉄 の 消 長

その成績は図6に 示す如 く,応 反開始後30分 まで

は徐々に易分離鉄の収量は増加を示し,そ の後はほ

ぼ一定の値となり,反 応は一応停止した如 くみられ

た.こ の際の易分離鉄収量はCOガ スの影響を被り,

COガ ス非通気時に較べ大約50%の 低値を示 した,

7574　 藤 原 拓 一

次にこの状態になつた反応系に分子酸素を毎分80

気泡宛通気しながら,通 気開始後1分, 5分, 10分,

20分,30分, 45分及び60分 目に反応液5ccを とり,

易分離鉄収量を測定してその消長をみると,酸 素通

気開始後60分 で約2倍 の収量が得 られた.

7. CO-hemoglobinと 溶存酸素を駆逐 したKCN

及びA2O2を 使用 して反応系を完成 させた場合の易

分離鉄の消長(図7)

反応組成中の溶存酸素の駆逐は前述の如 くにし,

反 応 に 使 用 した 容器 は前 項 の 実 験 に 使用 した もの と

同 一 の もの で あ る.以 上 の 如 くに して 調製 した反 応

系 各組 成 を 以 て反 応 系 を 完 成 させ,反 応 開 始後1分,

30分, 60分, 120分, 180分, 240分 及 び300分 に反 応

液 を 夫 々5ccと り,そ の 易 分 離 鉄 を 測 定 し,次 で

分 子 酸 素 を毎 分120気 泡宛 通 気 しな が ら酸素 通気 開

始 後1分, 15分, 30分, 45分, 60分, 90分, 120分,

180分, 240分 及 び300分 に 反 応 液5ccを と り,そ の

各 々の 易分 離鉄 を 測 定 した.

第7図　 HbCOと 溶存酸素を駆逐 したKCN及

びH2O2を 使用して反応を進めた時の

易分離鉄の消長

その成績は図7に 示す如 くで,何 れの時間に於い

てもほぼ同一の値を示 し,反 応は何 ら進行 していな

いのが認められた.こ の値は血色素にCOガ スを通

気 した時の値とほぼ一致 した.分 子酸素通気下に於

ける収量は通気開始後約45分 で軽度の増加を認め,

その後は大体一定の値を持続するのが認められた.

考 按

Hb-KCN-HZO2反 応系 と完全に窒素ガス下で進

行させ ると,易 分離鉄の収量は経時的に増加 し, 30

分後ほぽ反応は停止するが,次 で酸素を通気すると

60分 後 に は その倍 量 の 収量 を得 るに至 う. G. Barkan

は本反応系に生ずる易分離鉄をE, E´に分け, O2E

の形では0.4%の 塩酸 により容易に鉄を遊離するが,

COE又 はEの 形となると鉄 を遊離 しない.一 方E´

はその条件でも容易に鉄を遊離すると述べた.こ の

考えを肯定すれば,上 記の成績は窒素ガス下に於い

て生 じたE+E´ の中Eよ りの鉄 の分離のみであ

るが,酸 素 通気 によりO2E+E´ となり倍量の鉄の

遊離を認めるに至つたものと考えられよう.

同様な考えに従つて次の各実験についてみると,

HbO2にKCNとH2O2を 無酸素状態として作用さ

せた場合では既にO2E+E´ が生成 され,更 に酸素

を通気 しても鉄の遊離は増加しないと考えられ,還

元HbにKCNとH2O2を 作用 させた場合では,上

述の窒素ガス通気の場合よりやや鉄収量の多い状態コ リ

で反応は停止す るが,そ の際はE+E´ 以外に一部

O2Eの 生成がみられており,こ れに酸素を加えると

再び収量が増加して1.4倍 となつたものと考えられ,

HbにH2O2を 先 づ作用 させるが, KCNを 先づ作

用させ るかにより反応の進行に影響があるが,収 量

では大差はみられていない.

更にHb-KCN-H2O2反 応を窒素ガス下に進行さ

せ,各 反応液にCOガ スを通気 して収量を求めると

E, E´はCOと の親 和性 が著しく,従 つてCOE+

COEの 生 成が考えられ,そ れ よりの収量と考えら

れ, COEは 鉄を遊離せず, COEは 容易に遊離す る

からE´ の収量を求めたの と同一である.次 に酸素

を通気するとO2E+E´ となり収量 は増加して倍量

に達するものと考えられる.

斯様にして 上記 の反 応系 の鉄収量の消長はG.

Barkanの 主張するHb-KCN-H2O2反 応系に生ず

るE, E´の性状を肯定す ることによつて矛盾な く

説明 しうることとなる.

教室の竹田はHb-KCN-H2O2反 応系に於いて窒

素ガス下に反応を進行させれば670mμ に吸収の山

を,こ れに酸素を通気すれば630mμ に吸収の山を

生 じ,若 しHbO2-KCN-H2O2を その まま進行させ

ると630mμ の吸収の山を生 じ, 670, 630mμ の吸

収極大を示す物質の補欠簇は全 く同一物質で,従 つ

てこれらは反応過程に於ける同位の物質と考え,上

代4) 9) 10)ら がHbO2-1-Ascorbin酸-O2反 応 系に於

いて認める670, 630mμ 物 質が2段 階の物質であ

るとの考えを否定した教室尼子の主張を支持 したが,

易分離鉄の立場よりするE, E´が 同位物質とする

G. Barkanの 説も以上の成績か ら妥当なものと考え

られ,鉄 の遊離 と云 う立場も,分 光化学的な立場も

全 くよく一致することが分 る,

なおCoHb-KCN-H2O2反 応 系は進行せず, Hb-

KCN-H2O2反 応系又はHbO2-KCN-H2O2反 応系よ

試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2反 応 系 に お け る鉄分 離 に関す る研 究　 7575

りは進 行す る が,こ れ はHb-1-Ascorbin酸-O2反

応 系 に 於 い て 教 室 の 垂 水 が 明 らか に した よ うに

COHbよ りの 反 応 はHb又 はHbO2に 変 化 して 初

めて進行 す るもの で あ る との結 論 と同様 で,本 反 応

系で もCOHbよ り直 接分 解 す るこ とは考 え られ な か

つた.

即 ちHb-KCN-H2O2反 応 系 もま たHb-1-Aacorbin

酸-O2反 応系 と同様 な機 序 の 下 に反 応 す る こ とが,

易分離 鉄 の立 場 か ら も明 らか にす る ことが 出来 た.

結 論

Hb-KCN-H2O2反 応 系 を 易 分離 鉄 の消 長 か ら,

窒素 ガ ス下 及 びCOガ ス下 で 検 討 を加 え,次 の結 果

を得た.

1. 本 反 応 系 を窒 素 ガ ス下 で検 討 す る と,易 分 離

鉄 の増 加 は30分 で停 止 す るが,こ れ に酸 素 を通 気 す

ると60分 後 に倍 量 の 収量 を得 る.

2. HbO2-KCN-H2O2反 応 系 のKCN, H2O2の

みを無 酸素 状 態 で 作用 させ た 場 合 は, 20分 で最 高 一

定 値 に達 し,爾 後 酸素 を 通 気 して も反 応 は進 行 しな

い.

3. 還 元hemoglobinにKCNとH2O2を 作用 さ

せ ると,約5分 で 急 激 に収 量 の 増 加 が見 られ,以 後

緩 徐 に60分 まて 進 行 す るが,そ の さい 酸 素 を通 気 す

る と収 量 は1.4倍 に 達す る。

4. Hb, H2O2を 窒 素 ガ ス 下 で 作用 させ,次 で

KCNを 作用 させ た場 合 と, Hb, KCNを 窒 素 ガ ス

下 で作 用 させ,次 い でH2O2を 作用 させ た場 合 で は

反 応 の遅 速 はあ るが,こ れ に分 子酸 素 を作 用 させ た

後 の収 量は60分 後 何 れ も1.5倍 で あつ た .

5. Hb-KCN-H2O2反 応 系 を 窒 素 ガ ス下 で進 行

させ,各 時 間 毎 の 反応 液 にCOガ スを 作 用 させ て,

易分 離 鉄 の 収量 を求 めて み ると,反 応 は30分 で 停止

す るが,こ れ に酸 素 を 通気 す る と収 量 は2倍 に達 す

る.

6. 以 上 の反 応 系 の進 行 はG. BarkanのE, E´

の概 念 及 び それ ら が 窒素 ガ ス下, COガ ス下 に於 け

る鉄 遊離 時 の状 態 等 に よ り矛 盾 な く説 明 され る.

7. 本 反 応 系 はHb又 はHbO2よ り 進 行 す る も

の でCOHbよ りの直 接 の 進行 はあ りえ な い.

文 献

1) G. Barkan & O. Schales: Z. physiol. Chem.

248, 96, (1937); 253, 83, (1938)

2) R. Lemberg, J. W. Legge & W. H. Lockwood:

Biochem. J. 35, 328, 339, 353, 363, (1941)

3) R. Lemberg & J. W. Legge.; Hematin com

paunds and bile pigments. Intersc. Publ.

N. Y. 1949.

4) 上 代:綜 合 医 学, 11巻, 844, (昭29)

5) 尼子:医 学 研 究, 27巻, 1584,(昭32)

6) 垂 水,未 発 表.

7) 竹 田:未 発 表.

8) M. Engel: Z. physiol. Chem. 266, 135, (1940)

9) Kikuchi, Makita, Saito: J. Biochem, 41,

227, (1954)

10) Kikuchi, Yamada: J. Biochcm. 41, 239, (1954)

7576　 藤 原 拓 一

Studies on the Isolation of Iron in the HbO-KCN-H2O2

Reaction system in Vitro

Part III. Studies on So-called Easy Split Iron (G. Barkan)

in the Hb-KCN-H9O2 Reaction system

By

Takuichi Fujiwara

The First Department of Internal Medicine, Okayama University Medical School

(Chief; Prof. K. Kosaka: Director: Prof. K. Yamaoka Kyushu University)

The Bb-KCN-H2O2 reaction system was observed on the presence of nitrogen gas and CO

gas, since the vicissitude of easy•Laplit iron. And the results were as follows.

1. Investigating this reaction system in the presence of nitrogen gas, the increase of

easy spilt iron stopped for 30 minutes, but its yielded dosis was twice at 60 minutes after

the aeration of oxygen.

2. Acting only KCN and H2O2 in the HbO-KCN-H2O2 reaction system under the non

oxygen condition, it reached up to the highest fixed value at 20 miuutes and the reaction

did not show any progress on the aeration of oxygen after 20 minutes.

3. Acting KCN and H2O2 to reduced hemoglobin, the increase of yielded dosis was

abruptly seen around 5 minutes and it progressed slowly untill 60 minnutes, but the yielded

dosis became 1.4 times on the aeration of oxygen at that time.

4. The slowness or quickness of reaction was observed on the action of IiCN after the

action of Hb and H2O2 in the presence of nitrogen gas and on the action of H2O2 after the

action of Hb and KCN in the presence of nitrogen gas, but the yielded dosis was both 1.5

times after the action of molecular oxygen to them.

5. The Hb-KCN-H2O2 reaction system was progressed in the presence of nitrogen gas,

CO gas was acted to the reaction solution in each time and then the yielded dosis of easy

split iron was observed, and the reaction etopped for 30 minutes, but the yielded dosis be

came twice on the aeration of oxygen to it.

6. The progress of the above reaction system could be explained without discrepancy

by the concept of E. E•Lby G. Barkan and the condition of them at the isolated time in the

presence of nitrogen gas or CO gas.

7. This reaction system progressed from Hb or HbO2 and the direct progress from

COHb could not be existed.