eda puntarić utjecaj nanočestica srebra na vodenu lećudigre.pmf.unizg.hr/3978/1/eda.pdflijekova,...
TRANSCRIPT
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Eda Puntarić
Utjecaj nanočestica srebra na vodenu leću
(Lemna minor L.)
Diplomski rad
Zagreb, 2014.
Ovaj rad je izrađen u Laboratoriju za Fiziologiju bilja na Botaničkom zavodu Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom doc. dr. sc. Sandre Radić
Brkanac. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra struke znanosti o okolišu.
Posebno i veliko hvala mentorici doc. dr. sc. Sandri Radić Brkanac jer bez njezinog
odobrenja i dobre volje ne bi ni bilo ovog diplomskog. Hvala na neizmjernom
strpljenju, vedrom raspoloženju, na stručnim, ali i na onim malo manje stručnim
savjetima.
Puno hvala i prof. Valeriji Vujčić na potpori i velikoj pomoći u labaratoriju i ugodnom
društvu.
Hvala mojoj obitelji koja je bila cijelo vrijeme uz mene. Hvala tati na savjetima i trudu
oko čitanja, a mami, Idi i Adi na moralnoj potpori.
Hvala i mojim prijteljima i kolegama koji su mi uljepšali studenske dane.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad
UTJECAJ NANOČESTICA SREBRA NA VODENU LEĆU (Lemna minor L.)
Eda Puntarić
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska Nanočesticama smatramo tvari čije su sve tri dimenzije manje od 100 nm. Zbog veće aktivne površine po masi, nanočestice su se pokazale biološki aktivnije od njihovih "većih dvojnika" (čestice mikrometarskih dimenzija) istog kemijskog sastava. Povećano korištenje nanočestica rezultira otpuštanjem istih u okoliš. U ovom je radu istražen učinak nanočestica srebra u rasponu koncentracija 0,1, 0,5, 1, 2 i 5 mg L-1 na vodenu leću (Lemna minor L.) koja je često korištena testna biljka. Primijenjen je statički oblik standardiziranog Lemna-testa (test inhibicije rasta) u trajanju od sedam dana koji se temelji na stopama rasta. Osim rasta, određen je sadržaj srebra u biljkama i podlogama, sadržaj klorofila a i b, karotenoida, te pojedini pokazatelji oksidacijskog stresa u vodenoj leći. Nanočestice srebra značajno su smanjile stopu rasta broja listića i mase svježe tvari te sadržaj mjerenih fotosintetskih pigmenata. S druge strane, taj je metal uzrokovao povećanje oksidacijskog oštećenja lipida te promjene u aktivnosti antioksidacijskih enzima (superoksid dismutaze, askorbat peroksidaze i katalaze). Dobiveni rezultati ukazuju na toksičnost nano čestica srebra za vodenu leću što je vjerojatno posljedica povećanog nakupljanja nanočestica u biljnom tkivu. Rezultati također pokazuju da je oksidacijski stres uključen u mehanizam toksičnosti nanočestica srebra.
(39 stranica, 10 slika, 2 tablice, 59 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: nanočestice, srebro, vodena leća, toksičnost, oksidacijski stres
Voditelj: Doc. dr. sc. Sandra Radić Brkanac Ocjenjitelji: Doc. dr. sc. Sandra Radić Brkanac Izv.prof. Renata Matoničkin Kepćija Izv.prof. Blanka Cvetko Tešović Izv.prof. Danijel Orešić Rad prihvaćen: 28.11.2014.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology Graduation Thesis
THE EFFECT OF SILVER NANOPARTICELS ON DUCKWEED (Lemna minor L.)
Eda Puntarić
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia Nanoparticles are substances with all three dimensions less than 100 nm. Due to the larger active surface area per mass, nanoparticles have proven to be biologically active than their "larger duplicates" (particles of micrometer dimensions) of the same chemical composition. Increased use of nanoparticles results in their release into the environment. This thesis examines the effect of silver nanoparticles in the concentration range of 0.1,0.5,1,2 and 5 mg L-1) on duckweed (Lemna minor L.), which is often used as a test plant. A static test design of the standardized Lemna toxicity test (a growth inhibition test) based on growth rates in the duration of seven days was applied. In addition to growth, Ag content of media and plant material, chlorophylls, carotenoids and certain indicators of oxidative stress in duckweed have been determined. Silver nanoparticles significantly reduced growth rate and content of photosynthetic pigments. On the other hand, metal nanoparticles caused oxidative damage to lipids as well as the modulation of antioxidant enzyme activities (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase). The obtained results confirm the toxicity of silver nanoparticles to duckweed, which is probably due to increased accumulation of silver nanoparticles in plant tissue. Furthermore, the results indicate that oxidative stress is involved in the toxicity mechanism of silver. (39 pages, 10 figures, 2 tables, 59 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: nanoparticles, silver, duckweed, toxicity, oxidative stress
Supervisor: Dr. Sandra Radić Brkanac, Asst. Prof. Reviewers: Dr. Sandra Radić Brkanac, Asst. Prof., Dr. Renata Matoničkin Kepćija, Assoc. Prof. Dr. Blanka Cvetko Tešović, Assoc. Prof. Dr. Danijel Orešić, Assoc. Prof. Thesis accepted: November 28th, 2014
Sadržaj
1.UVOD ................................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Toksičnost nanočestica srebra za bakterije ................... Error! Bookmark not defined.
1.2. Toksičnost nanočestica srebra za stanice sisavaca in vitro .......... Error! Bookmark not
defined.
1.3. Toksičnost nanočestica srebra za biljke ........................ Error! Bookmark not defined.
1.2. Toksičnost nanočestica srebra na okoliš ....................... Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Utjecaj na zajednice u tlu ....................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Utjecaj na vodene ekosustave ................................ Error! Bookmark not defined.
1.3. Oksidacijski stres ........................................................... Error! Bookmark not defined.
1.3.1 Lipidna peroksidacija .............................................. Error! Bookmark not defined.
1.4. Antioksidacijski sustav .................................................. Error! Bookmark not defined.
1.4.1. Enzimski antioksidacijski sustav ............................ Error! Bookmark not defined.
1.4.1.1. Superoksid dismutaza .......................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.1.2. Katalaza ............................................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.1.3. Peroksidaze .......................................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.2. Neenzimski antioksidacijski sustav ........................ Error! Bookmark not defined.
1.4.2.1. Karotenoidi .......................................................... Error! Bookmark not defined.
1.4.2.2. Glutation .............................................................. Error! Bookmark not defined.
2. CILJ ISTRAŽIVANJA ........................................................ Error! Bookmark not defined.
3. MATERIJALI I METODE .................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1. Vodena leća (Lemna minor L.) ..................................... Error! Bookmark not defined.
3.2. Kultura vodene leće (Lemna Minor L.) u uvjetima in vitro ......... Error! Bookmark not
defined.
3.3. Lemna-test i biokemijski pokazatelji u vodenoj leći ..... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Lemna-test (ISO 20079) - stopa rasta vodene lećeError! Bookmark not defined.
3.3.2. Određivanje sadržaja srebra u vodenoj leći i hranjivim podlogama ............... Error!
Bookmark not defined.
3.3.2.1. Priprema uzoraka za mjerenje tehnikom ICP-OES ............ Error! Bookmark not
defined.
3.3.2.2. Određivanje sadržaja metala tehnikom ICP-OES Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Određivanje sadržaja pigmenata u vodenoj leći ..... Error! Bookmark not defined.
3.3.4. Određivanje sadržaja malondialdehida u vodenoj leći .......... Error! Bookmark not
defined.
3.3.5. Određivanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći ...... Error! Bookmark not
defined.
3.3.6. Ekstrakcija topivih proteina i aktivnost antioksidacijskih enzima u ............. Error!
Bookmark not defined.
vodenoj leći ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4. Statistička obrada podataka ........................................... Error! Bookmark not defined.
4. REZULTATI ........................................................................ Error! Bookmark not defined.
4.1. Stopa rasta vodene leće ............................................... Error! Bookmark not defined.
4.2. Sadržaj srebra u vodenoj leći ....................................... Error! Bookmark not defined.
4.3. Sadržaj pigmenata ........................................................ Error! Bookmark not defined.
4.3.1. Sadržaj klorofila ..................................................... Error! Bookmark not defined.
4.3.2. Sadržaj karotenoida ................................................ Error! Bookmark not defined.
4.4. Sadržaj malondialdehida .............................................. Error! Bookmark not defined.
4.5. Sadržaj neproteinskih tiola ........................................... Error! Bookmark not defined.
4.6. Sadržaj ukupnih proteina .............................................. Error! Bookmark not defined.
4.7. Aktivnost antioksidacijskih enzima .............................. Error! Bookmark not defined.
4.7.1. Aktivnost superoksid dismutaze ............................. Error! Bookmark not defined.
4.7.2. Aktivnost askorbat peroksidaze ............................. Error! Bookmark not defined.
4.7.3. Aktivnost katalaze .................................................. Error! Bookmark not defined.
5. RASPRAVA ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
5.1. Učinak nanočestica srebra na rast i funkcionalnost fotosinteze vodene leće ......... Error!
Bookmark not defined.
5.2 Učinak nanočestica srebra na pokazatelje oksidacijskog stresa u vodenoj leći ...... Error!
Bookmark not defined.
6. ZAKLJUČAK ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
7. LITERATURA ..................................................................... Error! Bookmark not defined.
Uvod 1
1. UVOD
Nanotehnologija je postala brzo rastuća znanost koja se bavi proizvodnjom i
korištenjem nanočestica. Sinteza nanočestica ima primjenu u raznim područjima znanosti i
tehnologije, posebice na polju biomedicine i prirodnih znanosti (genska terapija, unos
lijekova, mikrokirurška tehnologija, kontrastni agensi, DNA probe, fluorescentne oznake),
agronomije (nanokapsulirani herbicidi i pesticidi) optike i elektronike; nanočestice su našle
primjenu u mnogim proizvodima široke potrošnje uključujući elektroničke komponente,
kozmetiku (kreme za sunčanje), prehrambene proizvode (nanokapsulirani vitamini i
antioksidansi), proizvode za čišćenje, filtere za cigarete, antimikrobna vlakna i sprejeve kao i
tekstil otporan na mrlje i samočisteće staklo (Savolainen i sur., 2010.). Nanočesticama
smatramo tvari čije su sve tri dimenzije manje od 100 nm. Zbog veće aktivne površine po
masi, nanočestice su se pokazale biološki aktivnije od njihovih "većih dvojnika" (čestice
mikrometarskih dimenzija) istog kemijskog sastava.
Nanočestice srebra su jedan od najčešće korištenih nanomaterijala koje su našle
upotrebu u elektroničkim napravama, u pakiranju prehrambenih proizvoda, u tekstilnim
proizvodima koji djeluju baktericidno, u medicinskim uređajima, u zavojima te kao
dezinficijens za vode, kao lijek za liječenje mentalnih bolesti, ovisnosti o nikotinu, a gel na
bazi nanočestica srebra koristi se za liječenje opeklina, gastroenteritisa i zaraznih bolesti
poput sifilisa i gonoreje. Na stotine proizvoda koje sadrže nanočestice srebra su trenutno na
tržištu i njihov broj ubrzano raste. No, nanočestice srebra nisu toksične samo za nama
"štetne" (patogene) bakterije već i za korisne bakterije. Također je dokazano da su nanočestice
srebra vrlo toksične za stanice mozga, jetre i matične stanice, a dugotrajno izlaganje tim
česticama uzrokuje kožne bolesti (Chen i Schluesener, 2008.) . Ove nanočestice su prijetnja i
za život u vodi, kada se kao ostatak i otpad ispuštaju u vodene recipijente. Od posebnog je
interesa činjenica da bi nanočestice srebra potencijalno mogle negativno utjecati i na korisne
bakterije u okolišu, osobito u tlu i vodi. Kao snažan baktericid nanočestice srebra prijete
bakterijama koje podupiru normalno funcioniranje ekosustava. Korisne bakterije su od vitalne
važnosti za tlo, biljake i životinje. Bakterije u tlu igraju važnu ulogu u fiksiranju dušika i
razgradnji organske tvari, a neke ulaze u simbiotske odnose s biljkama iz porodice mahunarki.
Denitrifikacijske bakterije imaju važnu ulogu u održavanju čiste vode uklanjanjem nitrata iz
vode koja je zagađena prekomjernom uporabom umjetnih gnojiva. A zbog sve veće uporabe
1
Uvod 2
nanočestica srebra postoji opravdan rizik od nastanka otpornosti patogenih bakterija na
srebro, ali i na nekolicinu trenutno korištenih antibiotika (Bharadwaj Punita, 2012.).
1.1. Toksičnost nanočestica srebra za bakterije
Većina znanstvenih istraživanja o nanočesticama srebra istraživala su njihove učinke
na bakterije. Nanočestice srebra vrlo su otrovne za nekoliko sojeva bakterija, uključujući
gram pozitivne bakterije kao što su Staphylococcus aureus i Streptococcus pneumoniae, te
gram negativne bakterije, uključujući E. coli i Pseudomonas aeruginosa. Na ovaj način
nanočestice srebra su odgovorne za liječenje infekcija koje su se odupirale uobičajenim
antibioticima.
Otpornost bakterija na konvencionalne antibiotike prijeti ljudskom zdravlju diljem
svijeta. Povećana reakcijska površina nanočestica zaslužna je za uspješno uništenje bakterija i
drugih mikroba. Stvarni mehanizam kojim nanočestice srebra utječu na bakterije još je
nejasan. Neka istraživanja ukazuju da nanočestice srebra oštećuju bakterijske stanice
uništavajući enzime koji pomažu pri transportu hranjivih tvari u stanicu i oslabljuju stanične
membrane, što dovodi do povećanja propusnosti stanica i konačno smrti stanice. Međutim
drugi istraživači vjeruju da nanočestice srebra uništavaju sposobnost bakterijske DNA da se
replicira (Bharadwaj Punita, 2012.).
1.2. Toksičnost nanočestica srebra za stanice sisavaca in vitro
Pored učinkovitog baktericidnog djelovanja, nanočestice srebra toksične su za stanice
sisavaca in vitro. Otkriveno je (Hussain i sur., 2005.) da su nanočestice srebra vrlo otrovne za
jetrene stanice BRL3A kod štakora. Funkcija mitohondrija se značajno smanjila u stanicama
koje su bile izložene djelovanju nanočestica srebra od 5-50 μg/ml dok drugi metalni oksidi
nisu pokazali mjerljiv učinak na tim dozama. Također je otkriveno da su nanočestice srebra
toksične za uzgojene linije neuroendokrinih stanica (fenotip PC-12), koji se koristi kao in
vitro model za moždane stanice. Proučavana je morfologija stanica, funkcija mitohondrija i
razina dopamina nakon 24 sata izlaganja nanočesticama srebra. Razina dopamina bila je na
visokoj, citotoksičnoj razini (50 lg/ml). Mitohondrijska aktivnost je smanjena u rasponu od 10
do 50 lg/ml u usporedbi s neobrađenim stanicama. Morfologija stanica se također promijenila.
Nanočestice srebra su toksične i za reproduktivne matične stanice sisavaca u in vitro
istraživanjima. Kada se nanočestice srebra koriste kao antimikrobni agens u cementu za kosti
2
Uvod 3
i drugim implantacijskim materijalima, utvrđeno je da mogu toksično djelovati na okolne
stanice i tkiva (Bharadwaj Punita, 2012.).
1.3. Toksičnost nanočestica srebra za biljke
Biljke pružaju potencijalni put za transport nanočestica u okoliš i služe kao važan put
za bioakumulaciju nanočestica u hranidbenom lancu. Biljna stanična stijenka djeluje kao
barijera za lak unos bilo kojeg vanjskog agensa uključujući tako i ulazak nanočestica u biljne
stanice. Promjer pora stanične stijenke u rasponu je od 5 do 20 nm pa prema tome u biljne
stanice mogu lako ući samo nanočestice ili nanočestični agregati promjera manjeg od
promjera pora stanične stijenke. Osim kroz staničnu stijenku nanočestice mogu ući u stanicu i
pomoću proteinskih nositelja ili kroz ionske kanale. Ulaskom u citoplazmu, nano čestice se
mogu vezati na različite organele i utjecati na metaboličke procese na tom mjestu.
Nakupljanje nanočestica na fotosintetski aktivnoj površini uzrokuje zagrijavanje listova što
može rezultirati modifikacijama u izmjeni plinova i začepljenju puči (Nair i sur., 2010.).
1.4. Toksičnost nanočestica srebra na okoliš
1.4.1. Utjecaj na zajednice u tlu
Do sada je rađeno vrlo malo istraživanja o utjecaju nanočestica srebra na mikrobne
zajednice tla in situ. Istraživanja su pokazala da srebro, čak i u obliku čestica većih dimenzija,
inhibira rast mikroba. Srebro pokazuje toksični učinak i na heterotrofne i kemotrofne bakterije
u tlu. Ovi organizmi osiguravaju mnoge ključne hranjive tvari koje su bitne u nastanku tla.
Pokazujući potencijalni toksični učinak na denitrificirajuće bakterije, srebro narušava
denitrifikacijske procese. Nanočestice srebra čak i u vrlo niskim koncentracijama od 0,14
µg/ml pokazuju toksičan učinak za nekoliko vrsta nitrifikacijskih bakterija.
Zbog sve veće upotrebe nanočestica srebra u potrošačkim proizvodima, od perilice
rublja, tkanina za čišćenje u kućanstvu i slično postoji opravdan rizik da će ovaj materijal biti
pušten u kanalizaciju, u postrojenja za pročišćavanje vode i na kraju u rijeke, potoke i jezera.
Uz navedeno otkriveno je da su nanočestice srebra izuzetno toksične te da uništavaju
dobroćudne vrsta bakterija koje se koriste za obradu otpadnih voda (Bharadwaj Punita,
2012.). Osim toga, nanočestice srebra povećavaju stvaranje reaktivnih oblika kisika koje
također mogu inhibirati rast bakterija koje se koriste za obradu otpadnih voda. Otpadni mulj
3
Uvod 4
nastao tim putem se često koristi kao gnojivo na poljima pa bi i tim načinom nanočestice
srebra mogle dospjeti u hranidbene lance.
1.4.2. Utjecaj na vodene ekosustave
Zbog sve veće primjene nanočestica srebra primjećuju se i sve veće količine srebrnih
nanočestica u otpadnim vodama, a na kraju i u rijekama i potocima, što rezultira
neočekivanim toksičnim učinkom na vodni ekosustav. Dokazan je akutni toksični učinak Ag+
u slatkovodnih riba, prvenstveno na škrgama, pri čemu dolazi do inhibicije aktivnosti
bazolateralne Na+- i K+-ATP-aze. Rezultati ispitivanja toksičnosti na makro beskralješnjacima
u zaljevu San Francisca pokazali su da srebro negativno utječe na zdravlje estuarijskog
sustava.
Dva neovisna istraživanja na slatkovodnoj ribi Danio rerio (zebrica) pokazala su da
izloženost riba nanočesticama srebra veličine 5-46 nm te u koncentracijama nižim od 5 μg/ml
rezultira povećanom smrtnošću, povećanim brojem srčanih malformacija te drugim razvojnim
deformacijama. Istraživan je i učinak nanočestica srebra na vodeni ekosustav zaljeva
Chesapeake, te je utvrđeno da su vrste Daphnia magna (vodenbuha), Lumbriculus variegatus
(kalifornijski crv), Paleomonetes sp. vrlo brzo uginule pri koncentraciji nano srebra od 27 ppb
(Pand, 2006.).
Također je uočeno da nanočestice srebra pokazuju sekundarnu toksičnost. In vitro
ispitivanja utvrdila su da su kalifornijski crvići izloženi nanočestima srebra doveli do smrti
jedinki Paleomonetes sp koje su hranjene bilo živim ili mrtvim kalifornijskim crvićima.
Sekundarna toksičnost koja ima mogućnost utjecati na organizme u svim segmentima
prehrambenog lanca, može biti čak i gora od primarne toksičnosti jer sekundarna toksičnost
može utjecati na organizme koji u pravilu nisu izvorno izloženi zagađivaču. Nanočestice
srebra u koncentraciji od 27 ppb pokazale su i jako alergeno svojstvo (Bharadwaj Punita,
2012.).
1.5. Oksidacijski stres
Biljke su na svom prirodnom staništu često izložene stresnim uvjetima uslijed
djelovanja različitih čimbenika kao što je suša, ekstremne temperature, nedostatak ili suvišak
vode u tlu, povećan salinitet, izloženost ozonu, teškim metalima, herbicidima i drugim štetnim
spojevima, napad patogena i dr. (Wang i sur., 2005.). U stresnim uvjetima fotosintetski aparat
4
Uvod 5
apsorbira više svjetlosti nego što može koristiti za fiksaciju ugljika. Apsorbirana energija se
prenosi na molekule kisika i nastaju kratko živuće vrste aktiviranog kisika (ROS) poput
superoksidnog radikala (O2-), hidroksilnog radikala (•OH), vodikovog peroksida (H2O2) i
singletnog kisika (1O2) koje mogu nespecifično djelovati s biomolekulama u stanici i oštetiti
ih. Kloroplasti su posebno pogođeni slobodnim radikalima jer sadrže relativno visoku
koncentraciju kisika koji se reducira elektronima što "pobjegnu" iz fotosustava pretvarajući ga
u superoksidni radikal. Izvori ROS u biljnim stanicama, su i transportni lanci elektrona u
mitohondrijima. Glioksisomi i peroksisomi također produciraju velike količine reaktivnih
oblika kisika, posebice H2O2. Superoksidni radikal nastaje na nivou membrane u većini
biljnih organela dok vodikov peroksid nastaje kao produkt enzimske reakcije superoksid
dismutaze i različitih oksidaza u peroksisomu (Noctor i Foyer, 1998.). Hidroksilni radikal
može nastati u željezom kataliziranoj Haber-Weiss reakciji, a singletni kisik uglavnom nastaje
u u kloroplastu. Superoksidni radikal i vodikov peroksid nastaju u velikim količinama u
normalnom metabolizmu jer su uključeni u sva područja aerobne biokemije (disanje,
fotosintetski elektronski transport, oksidaciju različitih supstrata). Njihova toksičnost temelji
se na mogućnosti da započnu kaskadu reakcija koja će rezultirati nastankom vrlo opasnog
hidroksilnog radikala koji može reagirati sa skoro svim staničnim komponentama te
uzrokovati denaturaciju proteina, mutaciju DNA i peroksidaciju lipida.
Kada se razina ROS-a neznatno poveća, uključuje se antioksidativni sustav koji ih
učinkovito razgrađuje, ali kada stanica izgubi kontrolu nad njihovim stvaranjem i
razgradnjom, nastupaju velika stanična oštećenja. Biljke stoga posjeduju veoma učinkovit
antioksidativni sustav kojim se regulira razina ROS-a u stanicama (Cassells i Curry, 2001.).
Oksidacijski stres je uzrokovan neravnotežom između aktivnosti oksidansa i antioksidansa i u
normalnim uvjetima unutarstanične razine ROS se održavaju na niskim razinama uz pomoć
različitih enzimskih i neenzimskih sustava.
1.5.1. Lipidna peroksidacija
Lipidna peroksidacija je jedan od pokazatelja oksidacijskog stresa u biljnom
organizmu do kojeg dolazi kada stvaranje toksičnih oblika kisika premaši mogućnosti
mehanizama za uklanjanje tih spojeva. Stresni uvjeti uzrokuju promjene u staničnoj
membrani, a time utječu i na procese vezane uz provođenje signala i stvaranje energije. U
normalnim biološkim uvjetima, molekula kisika neenzimatskom oksidacijom povremeno
oduzima elektrone drugim molekulama, što uzrokuje nastanak slobodnih radikala. Višestruko
5
Uvod 6
nezasićene masne kiseline (PUFA) često su meta stvorenih slobodnih radikala kao glavne
sastavnice staničnih membrana, što posljeduje lipidnom peroksidacijom. Reaktivni oblici
kisika, prije svega hidroksilni radikal, imaju sposobnost da izdvoje atom vodika iz
metilenskih (-CH₂-) skupina nezasićenih masnih kiselina koji pokreće niz peroksidacijskih
reakcija (Štefan i sur., 2007.). Lanac reakcija radikala lipidne peroksidacije prekida se
neenzimskim i enzimskim načinom. Vrlo važan antioksidans je tokoferol (vitamin E), sastojak
membrana topiv u lipidima, koji prekida lanac lipidne peroksidacije i popravlja radikale
masnih kiselina.
1.6. Antioksidacijski sustav
Antioksidansi su kemijske tvari koje sprečavaju oksidaciju spojeva podložnih
oksidaciji. Biljke posjeduju vrlo učinkovit enzimski i neenzimatski antioksidativni obrambeni
sustavi koji štite biljne stanice od oksidativnog oštećenja koje vežu ROS kad su oni u štetnom
suvišku tj. kad je koncentracija slobodnih radikala veća nego što je potrebno za odvijanje
normalnih fizioloških procesa (Sarvajeet i Narendra, 2010). Antioksidansi inaktiviraju
djelovanje slobodnih radikala donirajući im elektrone pa tako zaustavljaju lančanu reakciju
stvaranja novih radikala i sprječavaju njihovo štetno djelovanje. Antioksidacijski mehanizmi
nisu ograničeni samo na stanične organele, već su prisutni u manjoj mjeri i u citoplazmi i
apoplastu. Komponente antioksidacijskog obrambenog sustava dijele se na enzimske i
neenzimske antioksidanse. Najdjelotvorniji enzimski antioksidansi u biljakama obuhvaćaju
superoksid-dismutazu, katalazu i enzime glutation-askorbatnog ciklusa. Neenzimski
antioksidansi uključuju askorbat, tokoferol, karotenoide, tiolne antioksidanse (glutation,
tioredoksin i lipoičnu kiselinu), flavonoide te druge fenolne spojeve (Arora i sur. 2002, Gill i
Tuteja 2010).
1.4.1. Enzimski antioksidacijski sustav
1.4.1.1. Superoksid dismutaza
Superoksid dismutaza (SOD) pripada skupini metaloenzima, a živi organizmi su
razvili tri tipa SOD-a, koji se razlikuju po metalnim kofaktorima (Štefan i sur. 2007.).
Superoksid dismutaza štiti stanice od slobodnih radikala obrambenim mehanizmom koji
uključuje katalizu reakcije dismutacije superoksida:
6
Uvod 7
2O2•- + 2H+ → H2O2 + O2.
Spontana dismutacija je vrlo brza. Među enzimima SOD ima najveći pretvorbeni broj čime je
naglašena izuzetna biološka važnost dismutacije (Šmuc, 2009.). Kako je superoksidani radikal
prvi produkt jednovalentne redukcije kisika i također prvi oblik koji se formira u mnogim
biološkim sustavima, SOD se smatra primarnom obranom protiv kisikovih radikala.
Lokaliziran je u kloroplastima, citosolu, mitohondrijima i peroksisomima (Vranova i sur.,
2002.).
1.4.1.2. Katalaza
Katalaza (KAT) je biokatalizator koji pospješuje raspadanje vodikova peroksida na
kisik i vodu. Brza razgradnja vodikova peroksida potrebna je jer je on snažan oksidans koji
može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati poremećaje u metabolizmu stanice.
Vodikov peroksid nastaje kao produkt u procesu fotosinteze, fotorespiracije i staničnog
disanja, a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što je superoksid dismutaza.
Katalaza se nalazi u gotovo svim živim organizmima koji su izloženi kisiku, a nalaze se u
organelima koji se zovu peroksisomi (Rogić i Štimac, 2009.).
2 H2O2 → O2 + 2 H2O
1.4.1.3. Peroksidaze
Peroksidaze (oksidoreduktaze vodikovog peroksida) su enzimi koji kataliziraju H2O2 i
oksidiraju različite supstrate. Nalazimo ih u životinjama, biljkama i mnogim
mikroorganizama gdje su uključene u brojne biološke procese (Begović, 2013.).
Biljne peroksidaze su glikoproteini sačinjeni od jednog polipeptidnog lanca. S
obzirom na fiziološku ulogu i supstratnu specifičnost peroksidaze su podijeljene u dvije
skupine (Asada, 1992.). U jednoj skupini su peroksidaze koje koriste vodikov peroksid za
različite oksidacijske procese u stanici i čija je karakteristika slaba supstratna specifičnost.
Zbog slabe supstratne specifičnosti kao donor elektrona mogu poslužiti pirogalol, gvajakol
(GPOD), siringaldazin i drugi fenolni spojevi. Ova skupina uključena je u procese biosinteze
7
Uvod 8
lignina i suberina, razgradnje auksina, zaraštavanje rana, obrane od patogena i uklanjanje
toksičnih spojeva peroksida (Hiraga i sur., 2001.).
Druga skupina su peroksidaze kojima je glavna uloga uklanjanje vodikovog peroksida
i organskog peroksida, a među kojima su askorbat i glutation peroksidaza. Za redukciju
toksičnog vodikovog peroksida potreban je reducirajući supstrat koji je uglavnom askorbat.
Peroksidaze za redukciju H2O2 koriste reducirajući supstrat, a u biljaka je to uglavnom
askorbat. Da bi se jedna molekula H2O2 reducirala potrebne su dvije molekule askorbata.
Produkt ove reakcije su dvije molekule vode i dvije molekule monodehidroksiaskorbata
(MDHA):
2 askorbat + H2O2 → 2 MDHA + 2 H2O
Askorbat peroksidaza se većinom nalazi u kloroplastima, a rjeđe u citosolu i glioksisomima
(Asada, 1992.).
1.4.2. Neenzimski antioksidacijski sustav 1.4.2.1. Karotenoidi Karotenoidi imaju karakterističnu žuto-narančastu boju, a najjače apsobriraju svjetlost
valnih duljina između 380 i 550 nm, proširujući tako spektar boja koje mogu pokretati
fotosintezu. Karotenoidi imaju također i zaštitnu ulogu. Naime, velike količine energije koju
apsorbiraju pigmenti mogu oštetiti fotosintetske membrane, ako se ta energija ne pohrani
fotokemijski. Ako pobuđeno stanje klorofila brzo ne prestane, dolazi do reakcije s
molekulskim kisikom, nastaje singletni kisik koji je vrlo reaktivan i može oštetiti mnoge
stanične sastojke, osobito lipide. Karotenoidi djeluju zaštitno tako da brzo ugase pobuđeno
stanje klorofila. Pobuđeno stanje karotenoida nema dovoljno energije za nastanak singletnog
kisika i brzo se vraća u osnovno stanje, otpuštajući višak energije u obliku topline (Pevalek-
Kozlina, 2003.).
1.4.2.2. Glutation
Glutation (GSH), u svom reduciranom obliku je tripeptid (γ-glutamil-cistein-glicin) sa
slobodnom sulfhidrilnom (tiolnom) grupom (-SH) koja potječe od cisteinskog ostatka. Upravo
je slobodna –SH skupina redoks-aktivna te je odgovorna za antioksidacijska svojstva
glutationa (može se reverzibilno oksidirati i reducirati). Osim što sudjeluje u uklanjanju
8
Uvod 9
slobodnih radikala, glutation može konjugirati ksenobiotike te na taj način potpomaže njihovo
uklanjanje. Zbog visoke stanične koncentracije te uloge u održavanju redoks stanja stanice,
glutation je jedan od najvažnijih antioksidansa posebice u animalnim stanicama. Naime u
biljnim stanicama, askorbat je kvantitativno dominantan antioksidans.
Glutation ima vrlo važnu ulogu i u toleranciji biljaka na teške metale i njihovoj
kompartmentalizaciji u vakuolu (Zhu i sur., 1999.; Zeng i sur., 2009.). Naime, GSH je
prekursor fitohelatina, peptida s općom strukturom [(γ-Glu-Cys)n-Gly (n ≥ 2) koji na sebe
vežu metale i „odvoze“ ih u vakuolu. Metali se vežu na –SH helirajuću grupu cisteina i
nastaju kompleksi čime je sprječena slobodna cirkulacija metala u citosolu.
Reducirani glutation je najzastupljeniji neproteinski tiol u biljnoj stanici i čini preko
90 % sadržaja neproteinskih tiola, dok se ostatak od 10 % odnosi na ostale tiolne spojeve
niske molekularne mase kao što su cistein, metionin, fitohelatini, metalotioneini, defenzini i
sl. (Zenk, 1996.; Mulier i sur., 1998.). Spoj 5,5-ditio-bis-nitrobenzojeva kiselina (DTNB) koji
služi kao glavni reagens u metodi za dokazivanje neproteinskih tiola primijenjenoj u ovom
radu vezuje se ne samo na –SH skupinu reduciranog glutationa, već i na one cistena glutamil
cisteina i drugih neproteinskih tiola, no zna se da većina detektiranih sulfhidrilnih grupa
potječe od GSH (Liszewska i sur., 2001.).
9
Cilj istraživanja 10
2. CILJ ISTRAŽIVANJA
Cilj ovog rada bio je procijeniti učinke nanočestica srebra u rasponu koncentracija 0,1-
5 mgL-1 na vodenu leću (Lemna minor L.).
Učinak nanočestica srebra pratila sam putem:
• Lemna-testa (test inhibicije rasta) pri čemu je stopa rasta biljaka izražena na temelju
dva pokazatelja (broj listića, masa svježe tvari) praćenih tijekom sedam dana,
• sadržaja klorofila a i b, te ukupnih karotenoida,
• stupnja lipidne proksidacije u vodenoj leći,
• sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći,
• promjene u aktivnosti antioksidacijskih enzima katalaze, askorbat peroksidaze i
superoksid dismutaze
10
Materijali i metode 11
3. MATERIJALI I METODE
3.1. Vodena leća (Lemna minor L.)
Vodene leće spadaju u porodicu Lemnaceae koja obuhvaća četiri roda: Lemna,
Spirodela, Wolffia i Wolffiella. Ova porodica je obično na margini botaničkih zanimljivosti jer
spadaja u najjednostavnije i najmanje cvjetnice. No usprkos sitnoj i jednostavnoj građi vodena
leća je bitna slatkovodna vrsta. Porodica Lemnaceae razmnožava se vegetativno, što
osigurava genetičku homogenost organizama, a njihov brz rast (30-40 h za novu biljku) te
relativno jeftin i jednostavan način održavanja u kulturi čini ovu porodicu pogodnim
laboratorijskim subjektom u istraživanjima fotoperioda, morfogeneze lista, toksikološkog
učinka raznih tvari, utjecaja UV zračenja, oštećenja na biljkama uzrokovana ozonom i sl.
Najčešće se rabe vrste: Lemna minor, Lemna gibba, Spirodela polyrrhiza i Wolffia arrhiza. U
ovom radu korištena je Lemna minor (Les i sur., 2002.)
Vodene leće u prirodi žive na staništima koja imaju pH vrijednost prirodne vode u
rasponu od 3,5 do 10,5 (Landolt, 1986.). Optimalna pH vrijednost ovisi o mnogim
čimbenicima, npr. je li izvor dušika u obliku amonijaka ili nitrata te o stupnju raspoloživosti
mikroelemenata, što osim njihove koncentracije u mediju, ovisi i o nazočnosti helatnih tvari
poput EDTA i citrata, no obično iznosi 6,5-7,8. Temperaturni optimum za većinu vrsta iz
porodice Lemnaceae je između 20 i 30°C, a ovisi o intenzitetu svjetlosti i sastavu podloge
(osobito o sadržaju šećera). Temperaturni minimum za ovu vrstu je između 4 i 18°C a
maksimum između 30 i 32°C (Hillman, 1961.).
Vodena leća je nezahtjevna biljka kojoj odgovara mirna voda pa je zato u prirodi
najčešće susrećemo u jezerima, barama i mirnijim potocima. Rasprostranjena je po cijelom
svijetu do nadmorske visine od 2 000 m. Obično ima 3-5 listića koji u promjeru imaju 2-3 mm
i plutaju na površini vode, a iz listića izravno raste i korjenčić. Listići su najčešće simetrično
raspoređeni i eliptičnog oblika. Imaju glatku površinu i jarke zelene su boje (slika 1).
11
Materijali i metode 12
Slika 1. Vodena leća (Lemna minor L.) (http://delta-intkey.com/angio/www/lemnacea.htm, 21.11.2014)
3.2. Kultura vodene leće (Lemna minor L.) u uvjetima in vitro
Lemna minor je sakupljena u Botaničkom vrtu Prirodoslovno–matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu. Prilikom uvođenja vodene leće u kulturu in vitro 1995. godine biljke
su sterilizirane etanolom i živinim kloridom postupkom po Kranjčiću i Devidéu (1980) i dalje
uzgajane u akseničnim uvjetima. Za dugotrajnu kultivaciju vodene leće korištena je
modificirana Pirson-Seidel (PS) hranjiva podloga (Pirson i Seidel 1950), a za eksperimentalnu
analizu hranjiva podloga po Steinbergu (1946) koje su sterilizirane autoklaviranjem pri
temperaturi od 120 ˚C i tlaku od 0,15 MPa u trajanju od 20 minuta. Sastav hranjivih podloga
prikazan je u Tablici 1. Biljke sam na modificiranoj Pirson-Seidel podlozi uzgajala u uvjetima
dugog dana (16 sati osvjetljenja i 8 sati tame) na temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih
fluorescentnih svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.
Prije izvođenja pokusa, biljke sam radi bolje adaptacije (predkultivacija) presadila na
Steinbergovu podlogu i tijekom dva tjedna uzgajala u uvjetima kontinuiranog osvjetljenja na
temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih fluorescentnih svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.
Za izvođenje pokusa, pojedinačne zdrave kolonije s 10 listića (praćenje rasta -
Erlenmeyerove tikvice od 100 mL sa po 60 mL hranjive podloge) ili veći broj kolonija
12
Materijali i metode 13
(određivanje biokemijskih pokazatelja - Erlenmeyerove tikvice od 300 mL sa po 130 mL
hranjive podloge) presadila sam na hranjive podloge po Steinbergu koje su sadržavale nano
čestice srebra promjera manjeg od 100 nm (Sigma-Aldrich) u koncentracijama 0; 0,1; 0,5; 1;
2 i 5 mg L-1. Tijekom jednotjedne kultivacije za Lemna-test, biljke su također uzgajane u
uvjetima kontinuiranog osvjetljenja na temperaturi 24±1 ˚C uz rasvjetu bijelih fluorescentnih
svjetiljki (90 μEm-2s-1) u klima–komori.
Uzorke biljnog tkiva za određivanje sadržaja srebra i biokemijskih pokazatelja uzimala
sam iz svih tikvica nakon tjedan dana pokusa.
3.3. Lemna-test i biokemijski pokazatelji u vodenoj leći
3.3.1. Lemna-test (ISO 20079) - stopa rasta vodene leće
Rast biljaka pratila sam određivanjem broja frondova tj. listića i mase svježe tvari nakon
tjedan dana izlaganja nano česticama srebra. Pri tome sam brojila svaki pa i najmanji listić
vidljiv golim okom. Dobivene podatke uvrštavala sam u slijedeći izraz:
Tablica 1. Sastav hranjivih podloga po Pirsonu i Seidelu (1950) i Steinbergu (1946).
MAKROELEMENTI mg/L mmol/L MAKROELEMENTI mg/L mmol/LKNO3 400 3,95 KNO3 350 3,46
KH2PO4 200 1,47 KH2PO4 90 0,66K2HPO4 12,6 0,072
MgSO4 x 7H2O 300 1,21 MgSO4 x 7H2O 100 0,41CaCl2 x 2H2O 804 5,46 Ca(NO3)2 x 4H2O 295 1,25
MIKROELEMENTI mg/L mmol/L MIKROELEMENTI mg/L mmol/LMnCl2 x 4H2O 300 1,5 MnCl2 x 4H2O 180 0,91
H3BO3 500 8,1 H3BO3 120 1,94Na2 – EDTA x 2H2O 1860 4,99 Na2 – EDTA x 2H2O 1500 4,03
željezni citrat 5000 20 FeCl3 x 6H2O 760 2,81Na2MoO4 x 2H2O 44 0,18
ZnSO4 x 7H2O 180 0,63ORGANSKI DODACI g/L mmol/L
saharoza 10 29,2asparagin 0,1 0,66
Pirson i Seidel Steinberg
13
Materijali i metode 14
= t1-t2ln x t1 - ln x t2
x t1 – vrijednost promatranog parametra u vremenu t1 (dani) x t2 – vrijednost promatranog parametra u vremenu t2 (dani) t2-t1 – vremenski period između dana uzimanja uzorka i početnog dana
Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost stope rasta broja biljaka ili mase svježe
tvari u pet Erlenmeyerovih tikvica ± standardna devijacija.
3.3.2. Određivanje sadržaja srebra u vodenoj leći i hranjivim podlogama
3.3.2.1. Priprema uzoraka za mjerenje tehnikom ICP-OES
Uzorci hranjivih podloga su uzimani prije i poslije nasađivanja biljaka, a prije samog
mjerenja su zakiseljeni. Uzorke vodene leće uzela sam nakon tjedan dana pokusa i osušila do
konstantne mase na 80 0C tijekom 24h. Svaki uzorak vodene leće (između 50 i 90 mg)
razorila sam metodom mokre digestije u smjesi 10 mL koncentrirane dušične kiseline
(Kemika) i 1 mL vodikovog peroksida (Kemika) u mikrovalnom sustavu za digestiju i
ekstrakciju otapalima CEM Mars Xpress, nakon čega sam ekstrakt kvantitativno prenesla u
odmjernu tikvicu od 50 mL, te je nadopunila do oznake s 1% (v/v) dušičnom kiselinom.
Parametri digestije podešeni na mikrovalnom sustavu bili su:
digestija uzorka koncentriranom dušičnom kiselinom kroz 5 minuta na 70 0C, 5 minuta
na 130 0C, 4 minute na 150 0C
nakon dodatka uzorku 1 mL vodikovog peroksida digestija 5 minuta na 85 0C, 4
minute na 130 0C
3.3.2.2. Određivanje sadržaja metala tehnikom ICP-OES
Određivanje sadržaja metala u uzorcima hranjivih podloga i vodene leće izvela sam
tehnikom optičke emisijske spektroskopije uz induktivno spregnutu plazmu (ICP-OES) na
instrumentu Thermo Elektron IRIS Intrepid II XSP prema normi HRN EN ISO 11885:2010.
Provela sam eksternu kalibraciju standardnim otopinama koncentracija 0, 0,05, 0,5 i 5 mg L-1.
Stopa rasta
14
Materijali i metode 15
Uzorak se u plazmu injektira u obliku aerosola u uski prolaz unutar cirkularne struje
plazme argona pri čemu argon služi i kao nosač uzorka. Ovakav način unosa osigurava optički
vrlo tanak izvor emisije, te kemijski inertnu atmosferu. Atomizacija elemenata u uzorku
postiže se na temperaturama od 5500 do 8000 K. Ovako visoke temperature osim što
minimaliziraju kemijske interakcije u uzorku dodatno ioniziraju argon koji je prethodno
preveden u plazmu strujanjem kroz radiofrekvencijsko polje.
Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost dvije replike.
Tehničke specifikacije:
RF snaga: 1150 W
Protok plina u raspršivaču: 25,0 PSI
Protok plina za uzorak: 1,0 L min.-1
Protok uzorka: 2,40 mL min.-1
Prikupljanje podataka: kompjutorski program TEVA
Broj mjerenja: 5 mjerenja po uzorku
Uvođenje uzoraka: peristaltička pumpa
Skraćenice:
ICP-OES = induktivno spregnuta plazma-optička emisijska spektrometrija (eng. Inductively
Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry)
ISO = Međunarodna organizacija za standardizaciju (eng. The International
Organisation for Standardisation)
TEVA = Thermo Electron Validated Analysis
XSP = Extra Stability Platform
3.3.3. Određivanje sadržaja pigmenata u vodenoj leći
Sadržaj pigmenata odredila sam spektrofotometrijski (UV/VIS spektrofotmetar
Specord, Analytik Jena). Uzorke svježeg tkiva (30 mg) ekstrahirala sam u 80%-tnom hladnom
acetonu (1,5 mL) i centrifugirala (5000 g / 10 min) u rotoru 12154H visokookretajne
centrifuge (Sigma 3K18) pri temperaturi +4 oC. Nakon toga sam mjerila i očitavala
apsorbancije za svaki uzorak na tri valne duljine: 663, 646 i 470 nm (Arnon, 1949.). Sadržaj
fotosintetskih pigmenata određen je prema Lichtenthaleru (1987).
15
Materijali i metode 16
Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija i
izrazila u odnosu na kontrolu.
3.3.4. Određivanje sadržaja malondialdehida u vodenoj leći
Kako bih odredila sadržaj malondialdehida (MDA) krajnjeg produkta lipidne
peroksidacije, pomiješala sam 200 µL uzorka s 800 µL reakcijske smjese (0,25%
tiobarbiturna kiselina otopljena u 10%-tnoj trikloroctenoj kiselini). Kao slijepu probu koristila
sam reakcijsku smjesu. Uzorke i slijepu probu prelila sam u staklene semimikroepruvete te
sam ih zagrijavala u sušioniku 30 min na 95 oC. Zatim sam uzorke naglo ohladila na ledu te
centrifugirala 10 min na 10 000 g. Nakon toga očitavala sam apsorbancije uzoraka na 532 te
na 600 nm zbog korekcije na nespecifično zamućenje (Heath i Packer, 1968.). Tijekom
zagrijavanja reakcijske smjese niske pH vrijednosti dolazi do raspadanja lipidnih peroksida
nastalih kao posljedica stresa pri čemu nastaje malondialdehid. Jedna molekula MDA reagira
s dvije molekule TBA, a time se stvara crvenkasti kromogen kojemu se mjeri apsorbancija.
Koncentracija lipidnih peroksida izražena je kao MDA u jedinicama nmol/g sv. t uz
ekstinkcijski koeficijent ε532 = 155 mM-1cm-1.
Rezultate sam prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.
3.3.5. Određivanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći
Uzorci vodene leće mase 250 mg homogenizirani su u 1,0 mL 6,67% sulfosalicilne
kiseline te centrifugirani 10 min na 13 000 g u rotoru 12154H visokookretajne centrifuge
(Sigma 3K18) pri temperaturi +4 ºC. S ciljem određivanja sadržaja neproteinskih tiola, 900
μL Ellmanovog reagensa (120 mM Na-fosfatni pufer pH 7,5 koji sadrži 5mM EDTA i 0,6
mM 5,5-ditio-bis-nitrobenzojevu kiselinu (DTNB)) su pomiješani sa 100 μL supernatanta.
Kao slijepa proba korišten je alikvot istog uzorka (100 μL) pomiješan s 900 μL 120 mM Na-
fosfatnog pufera pH 7,5 koji sadrži 5mM EDTA. Kao korekciju za apsorbanciju reakcijske
smjese bez supernatanta korišteno je 100 μL 6,67% sulfosalicilne kiseline pomiješano s 900
μL Ellmanovog reagensa. Pripremljeni uzorci su inkubirani 15 min na sobnoj temperaturi.
Nakon inkubacije je slijedilo mjerenje sadržaja neproteinskih tiola uz reducirani glutation kao
standard. Sadržaj neproteinskih tiola koji se temelji na reakciji tiolnih skupina s DTNB,
određen je spektrofotometrijskim mjerenjem otopljenih uzoraka na valnoj duljini od 412 nm
16
Materijali i metode 17
(Ellman, 1959.). Količina nastalih tiola izražena je u nmol po gramu svježe tvari koristeći
ekstinkcijski koeficijent ε412 = 14,53 mM-1cm-1. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost
pet replika ± standardna devijacija i izraženi u odnosu na kontrolu.
3.3.6. Ekstrakcija topivih proteina i aktivnost antioksidacijskih enzima u vodenoj leći
Nakon tjedan dana pokusa, uzorke vodene leće (po 150 mg) homogenizirala sam u 50
mM kalij fosfatnom puferu (pH 7,0) uz dodatak 0,1 mM EDTA i netopivog
polivinilpolipirolidona te zatim centrifugirala (25000 g / 30 minuta) u rotoru 12154H
visokookretajne centrifuge (Sigma 3K18) pri temperaturi +4 ºC. Dio dobivenog supernatanta
iskorišten je za određivanje koncentracije proteina metodom Bradforda (1976), a drugi dio za
određivanje aktivnosti enzima. Bradfordova metoda temelji se na mjerenju apsorbancije
smjese proteinskog ekstrakta i reagensa pri valnoj duljini 595 nm. Koncentracija proteina u
pojedinim uzorcima određena je očitavanjem baždarne krivulje dobivene mjerenjem
apsorbancije otopina serumskog albumina iz goveda poznatih koncentracija (od 0,1 do 0,8
mg/mL).
Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) određivala sam spektrofotometrijski prema
metodi Giannopolitisa i Riesa (1977). Reakcijska otopina je sadržavala 50 mM kalij fosfatni
pufer (pH 7,8), 13 mM metionin, 75 mM nitrotetrazolijum plavila (NBT), 0,1 mM EDTA, 2
μM riboflavin te ekstrakcijski pufer ili enzimsku otopinu. Na 910 µL reakcijske otopine
dodala sam 80 µL ekstrakcijskog pufera (kontrola), dok je proba sadržavala isti volumen
enzimske otopine koja je dobivena miješanjem pufera i određenih volumena originalnih
enzimskih ekstrakata (30, 50 i 70 µL). Riboflavin sam dodala u reakcijsku smjesu neposredno
prije mjerenja. Uzorke sam promiješala i stavila ispod izvora svjetlosti (15 W) u zamračenom
prostoru. Reakcija se pokreće uključivanjem svjetla, te se nakon 10 min mjerenja svjetlo
ugasi. NBT se reducira u prisutnosti superoksidnih radikala u netopivi plavo obojeni formazan
koji pokazuje apsorpcijski maksimum na valnoj duljini od 560 nm.
Postotak inhibicije se mjeri prema sljedećoj jednadžbi:
% inhibicije = (uzorak A560 – kontrola A560) / kontrola A560
Jedna jedinica aktivnosti SOD-a izražava se kao ona količina enzima koja uzrokuje 50
% inhibicije redukcije NBT-a pri 560 nm u prisutnosti riboflavina na svjetlu.
17
Materijali i metode 18
Reakcijska otopina za katalazu (KAT) sadržavala je 50 mM kalij fosfatnog pufera (pH
7), 10 mM H2O2 (Aebi, 1984.) i uzorak (30 µL supernatanta vodene leće) te sam mjerila pad
apsorbancije (zbog razgradnje vodikovog peroksida) svakih 10 sekundi tijekom 2 minute pri
valnoj duljini od 240 nm. Aktivnost KAT izrazila sam kao količinu potrošenog H2O2 u µmolu
po minuti (jedna jedinica, 1 U) po miligramu proteina (U/mg proteina), a izračunala sam je uz
korištenje odgovarajućeg ekstinkcijskog koeficijenta (ε240= 40 mM-1cm-1). Rezultate sam
prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.
Reakcijska otopina za određivanje aktivnosti askorbat peroksidaze (APOD) sadržavala
je 50 mM kalij fosfatnog pufera (pH7), 0,2 mM askorbinske kiseline, 0,1 mM EDTA,12 mM
H2O2 (Nakano i Asada, 1981.) i supernatant (120 μL). Vodikov peroksid (10 μL) dodavala
sam u reakcijsku smjesu neposredno prije mjerenja te sam pratila pad apsorbancije zbog
oksidacije askorbinske kiseline svaku sekundu tijekom 15 sekundi. Aktivnost APOD
izračunala sam uz odgovarajući ekstinkcijski koeficijent (ε 290 = 2,8 mM-1cm-1). Rezultate sam
prikazala kao srednju vrijednost pet replika ± standardna devijacija.
3.4. Statistička obrada podataka
Svaki brojčani podatak prikazan grafikonom ili tablicom aritmetička je sredina
određenog broja replika. Usporedba kontrole i tretmana (pojedinačno i međusobno) provela
sam testom "Duncan’s New Multiple Range Test" za svaki pojedini dan (Duncan, 1955.).
Statistički značajnim smatrala sam rezultate koji su se razlikovali na razini p ≤ 0,05. Pri
statističkoj obradi podataka koristila sam računalni program STATISTICA 10.0 (Stat Soft
Inc., SAD).
18
Rezultati 19
4. REZULTATI
4.1. Stopa rasta vodene leće
Na slici 2. prikazana je stopa rasta biljaka izražena po dva parametra, broju listića i
masi svježe tvari, praćenih tijekom sedam dana.
Neovisno o koncentraciji, nanočestice srebra (n Ag) su, u usporedbi s kontrolnim
biljkama, statistički značajno inhibirale stopu rasta biljaka izraženu po broju listića pri čemu
je inhibicija rasta bila proporcionalna sa povećanjem koncentracije n Ag. Koncentracija n Ag
od 5 mg L-1 je uzrokovala gotovo potpunu inhibiciju stope rasta izraženu po broju listića.
Nanočestice srebra su u svim koncentracijama izazvale i statistički značajno smanjenje
stope rasta vodene leće izražene po masi svježe tvari (slika 2). Najniža koncentracija nano
srebra smanjila je stopu rasta mase svježe tvari za 22%, a najviša koncentracija za više od
70% u usporedbi s kontrolom.
Slika 2. Stopa rasta broja listića i mase svježe tvari vodene leće uzgajane tijekom tjedan dana na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Stop
a ra
sta
broj listića svježa masa
a
b
c
d
e
f
A
B
C
D
E
F
19
Rezultati 20
4.2. Sadržaj srebra u vodenoj leći
Većina vrsta roda Lemna posjeduje iznimnu sposobnost i potencijal za akumulaciju
teških metala iz vodenog okoliša. Sadržaj srebra u testnim podlogama prvog i sedmog dana
pokusa kao i nakupljanje tog metala u vodenoj leći izmjerena je ICP-OES metodom.
Sadržaj srebra u vodenoj leći pokazao je linearan porast s povećanjem koncentracije n
Ag u podlogama (Tablica 2). Sadržaj srebra u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji
nanočestica srebra bio je 52 puta veći u odnosu na kontrolu, dok je u onim izloženim
koncentracijama nanočestica srebra višim od 0,5 mg L-1 taj sadržaj bio oko 180 puta veći u
usporedbi s kontrolnim biljkama.
Tablica 2. Sadržaj srebra u testnim podlogama i u vodenoj leći izloženoj rastućim koncentracijama nano Ag (0,1 - 5 mg L-1) ili podlozi bez njegovog dodatka (K).
Ag - biljke (µg g-1)tretman 1.dan 7.dan 7.dan
K 27,4 4,16 4,42
n Ag 0,1 192 16,2 219
n Ag 0,5 617 25,8 429
n Ag 1 993 126 801
n Ag 2 1399 234 815
n Ag 5 1993 353 779
Ag - podloga (µg L-1)
20
Rezultati 21
4.3. Sadržaj pigmenata
4.3.1. Sadržaj klorofila
Sadržaj klorofila a u vodenoj leći izloženoj najnižoj koncentraciji nanočestica srebra u
periodu od sedam dana bilo je sličan sadržaju tog pigmenta u kontrolnim biljkama. Pri svim
ostalim koncentracijama n Ag zamijećeno je statistički značajno smanjenje sadržaja klorofila
a u odnosu na kontrolne biljke, a najniži sadržaj klorofila a zabilježen je očekivano pri
najvećoj koncentraciji 5 mg L-1 (slika 3).
Sadržaj klorofila b također se, izuzev pri koncentraciji 0,1 mg L-1 n Ag, smanjivao s
porastom koncentracije n Ag, ali promjene u sadržaju tog pigmenta nisu bile tako izražene u
usporedbi s promjenama sadržaja klorofila a. Najveće smanjenje klorofila b (38% u odnosu
na kontrolu) može se primijetiti pri najvišoj koncentraciji n Ag (slika 3).
Slika 3. Sadržaj klorofila a i b (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nano česticasrebra u koncentracijama: 0,1 i Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 i Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 i Ag (1 mg L-1 Ag), 2 i Ag (2 mg L-1 Ag), 5 i Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Sadr
žaj k
loro
fila
klorofil a klorofil ba a
b
c c
d
A AAB
BC C C
21
Rezultati 22
4.3.2. Sadržaj karotenoida
U slučaju karotenoida, pomoćnih pigmenata iz skupine terpena, uočena je vrlo slična
situacija kao i kod klorofila a i b odnosno utvrđeno je smanjenje sadržaja karotenoida u
vodenoj leći izloženoj nanočesticama srebra u koncentracijama višim od 0,1 mg L-1 n Ag.
Najviša koncentracija n Ag upotrijebljena u ovom istraživanju izazvala je i najveće smanjenje
tih zaštitnih pigmenata u odnosu na kontrolu (slika 4) .
Slika 4. Sadržaj karotenoida (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Sadr
žaj k
arot
enoi
da
a a
bbc c
d
22
Rezultati 23
4.4. Sadržaj malondialdehida
Stupanj lipidne peroksidacije, kao jednog od pokazatelja oksidacijskog stresa u
biljaka, određuje se mjerenjem sadržaja malondialdehida, koji je jedan od produkata tog
procesa. Na slici 5 vidljiv je znatan porast sadržaja malondialdehida u vodenoj leći tretiranoj
koncentracijama nanočestica srebra 0,1 - 5 mg L-1 u odnosu na kontrolni uzorak. Taj je porast
najizraženiji u biljkama izloženim najvećoj koncentraciji n Ag (preko dva i pol puta veći u
odnosu na kontrolne biljke).
Slika 5. Sadržaj malondialdehida (nmol / g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1
Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1
Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
5
10
15
20
25
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Sadr
žaj m
alon
dial
dehi
da
c
bb
b
a
a
23
Rezultati 24
4.5. Sadržaj neproteinskih tiola
Na Slici 6. prikazan je sadržaj neproteinskih tiola koji su u biljnoj stanici najviše
zastupljeni u obliku reduciranog glutationa.
Sadržaj neproteinskih tiola u vodenoj leći uzgojenoj na podlogama s dodatkom
nanočestica srebra bio je statistički značajno povećan u odnosu na kontrolne vrijednosti pri
koncentracijama većim od 0,1 mg L-1.
Slika 6. Sadržaj neproteinskih tiola (μmol / g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1
Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1
Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Sadr
žaj n
epro
tein
skih
tiol
a
c
c
b
a a a
24
Rezultati 25
4.6. Sadržaj ukupnih proteina
Dvije najniže koncentracije n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nisu uzrokovale statistički značajno
smanjenje sadržaja ukupnih proteina u usporedbi sa kontrolom (slika 7). Sadržaj proteina u
vodenoj leći izloženoj koncentracijama nAg većim od 0,5 mg L-1 statistički se značajno
smanjio u usporedbi s kontrolom (najveće smanjenje sadržaja ukupnih proteina iznosilo je
33% u odnosu na kontrolne biljke).
Slika 7. Sadržaj ukupnih proteina (mg/g svježe tvari) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
1
2
3
4
5
6
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Sadr
žaj u
kupn
ih p
rote
ina
aa
ab
b b
25
Rezultati 26
4.7. Aktivnost antioksidacijskih enzima
4.7.1. Aktivnost superoksid dismutaze
Superoksid dismutaza katalizira razgradnju superoksidnih radikala u vodikov peroksid
i kisik. Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji n
Ag nije bila statistički značajno povišena u odnosu na listiće kontrolnih biljaka (slika 8).
Statistički značajno povećanje aktivnosti tog enzima zamijećeno je pri koncentracijama većim
od 0,1 mg L-1, a najveći porast aktivnosti (porast od 38% u odnosu na kontrolu) utvrđen je pri
koncentraciji n Ag od 2 mg L-1 srebra.
Slika 8. Aktivnost superoksid dismutaze (U / mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1
Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1
Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
5
10
15
20
25
30
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Akt
ivno
st s
uper
oksi
d di
smut
aze
c c
b ba
b
26
Rezultati 27
4.7.2. Aktivnost askorbat peroksidaze
Najniža koncentracija n Ag kao i koncentracija n Ag od 2 mg L-1 nisu bitno utjecale na
aktivnost askorbat peroksidaze u vodenoj leći dok su koncentracije n Ag od 0,2 i 1 mg L-1
izazvale statistički značajno povećanje aktivnosti askorbat peroksidaze u usporedbi s
kontrolom. Najviša koncentracija nanočestica srebra značajno je inhibirala aktivnost tog
antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolne vrijednosti (slika 9).
Slika 9. Aktivnost askorbat peroksidaze (U / mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1
Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 n Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1
Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
1
2
3
4
5
6
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Akt
ivno
st a
skor
bat p
erok
sida
ze
cbc
ab
a
bc
d
27
Rezultati 28
4.7.3. Aktivnost katalaze
Jedan od enzimskih mehanizama antioksidacijskog sustava koji sudjeluje u razgradnji
vodikovog peroksida je i enzim katalaza. Aktivnost katalaze u vodenoj leći tretiranoj nižim
koncentracijama n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nije bila statistički značajno povećana u odnosu na
kontrolne biljke. S druge strane koncentracije nano srebra više od 0,5 mg L-1 uzrokovale su
značajnu inhibiciju aktivnosti tog antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolu (slika 10).
Slika 10. Aktivnost katalaze (µmol / min mg proteina) u vodenoj leći nakon sedam dana rasta na podlogama s dodatkom nanočestica srebra u koncentracijama: 0,1 n Ag (0,1 mg L-1 Ag), 0,5 n Ag (0,5 mg L-1 Ag), 1 n Ag (1 mg L-1 Ag), 2 Ag (2 mg L-1 Ag), 5 n Ag (5 mg L-1 Ag) ili bez njihovog dodatka – kontrolne biljke (K). Na stupcima je označena standardna devijacija. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (p < 0,05).
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
K 0,1 n Ag 0,5 n Ag 1 n Ag 2 n Ag 5 n Ag
Akt
ivno
st k
atal
aze
a
a a
b
bc c
28
Rasprava 29
5. RASPRAVA
5.1. Učinak nanočestica srebra na rast i funkcionalnost fotosinteze vodene leće
Nanočestice srebra upotrijebljene u ovom radu nepovoljno su djelovale na rast i razvoj
vodene leće te su uzrokovale oksidacijski stres. Istraživan je utjecaj nanočestica srebra
promjera manjeg od 100 nm u koncentracijama od 0,1 do 5 mg L-1 na rast vodene leće, sadržaj
fotosintetskih pigmenata, malondialdehida, neproteinskih tiola te na aktivnost
antioksidacijskih enzima. Nakon sedam dana pokusa, najstariji listići pokazivali su znakove
kloroze što je jedan od vidljivih simptoma stresa na metaboličke procese u biljci (Bonnet i
sur. 2000.). Nanočestice srebra su pri višim koncentracijama izazvale inhibiciju stope rasta
biljaka za čak i više od 50% u odnosu na kontrolne vrijednosti. Te rezultate potvrđuje
istraživanja Jesus i sur. (2013.) gdje se stopa rasta vodene leće smanjila nakon izlaganja
nanočesticama srebra, s tim da je učinak bio izraženiji s povećanjem koncentracije ili vremena
izloženosti.
Zanimljivo je istraživanje Krishnaraj i sur. (2012.) koji su proučavali utjecaj srebra u
ionskom i nano obliku na klijavost biljke Bacopa monnieri. Utvrđeno je da nanočestice srebra
u koncentracijama od 10 i 100 μg L-1 te 10 i 100 mg L-1 nisu utjecale na klijavost dok je
tretman s AgNO3 u koncentraciji od 10 mg L-1 usporio, a u deset puta većoj koncentraciji
potpuno inhibirao klijanje. Nanočestice srebra u koncentraciji od 0,1 mg L-1 uzrokovale su
značajno smanjenje stope rasta broja listića u biljnoj vrsti Lemna gibba nakon tjedan dana
pokusa (Oukarroum i sur., 2013.). I u mom su radu utvrđeni slični rezultati jer je stopa rasta
vodene leće izražene po masi svježe tvari i po broju listića također bila znatno smanjena pri
koncentraciji od 0,1 mg L-1. Najviša koncentracija n Ag od 5 mg L-1 smanjila je stopu rasta
mase svježe tvari za više od 70%, a stopu rasta broja listića gotovo potpuno u usporedbi s
kontrolom. Inhibicija rasta vodene leće (broja listića i mase suhe tvari) tretirane s n Ag
promjera 5-20 nm ustanovljena je i u istraživanju Űçüncü i sur. (2014.) pri čemu je utvrđeno
da je najveća inhibicija rasta nastupila pri koncentraciji od 32 μg L-1 (58% smanjenja). U
istraživanju Gubbins i sur. (2011.) zabilježeno je smanjenje broja listića vodene leće izložene
tijekom sedam dana nanočesticama srebra (promjera manjeg od 100 nm) u koncentraciji od
160 μg L-1, no s ionskim srebrom smanjenje rasta bilo je značajno već pri koncentraciji od 5
μg L-1.
29
Rasprava 30
Woo-Mi i sur. (2012.) su proučavali bioakumulaciju nanočestica srebra promjera 5-25
nm te njihov utjecaj na rast mungo graha (Vigna radiata) i sirka (Sorghum bicolor). Sadržaj
nanočestica u biljnom tkivu se povećao s povećanjem koncentracije srebra u agaru, a rast se
proporcionalno smanjivao; rast klijanaca graha i sirka izloženih koncentraciji n Ag od 40 mg
L-1 iznosio je 20 odnosno 47% rasta kontrolnih biljaka. U ovom je radu sadržaj srebra u
biljkama dosegao maksimum pri koncentraciji od 2 mg L-1 a pri tome je sadržaj srebra u
vodenoj leći bio 184 puta veći u usporedbi sa sadržajem srebra u kontrolnim biljkama.
Primjetno smanjenje rasta vodene leće može biti uzrokovano smanjenjem
koncentracije fotosintetskih pigmenata, a time i fotosintetske sposobnosti vodene leće. Wang
(1990.) je ustvrdio da redukcija sadržaja fotosintetskih pigmenata može biti puno bolji
pokazatelj toksičnosti od stope rasta biljaka.
U radu Dewez i Oukarroum (2012.) učinak nano čestica srebra na fotokemijske
reakcije fotosinteze istraživan je pomoću testnog organizma - zelene alge Chlamydomonas
reinhardtii. Alge su izložene nanočesticama srebra u koncentraciji od 1, 5 i 10 μmol L-1 u
uvjetima svijetla i tame tijekom 6 sati. Kad su alge bile izložene nanočesticama srebra u
koncentracijama od 5 i 10 μmol L-1 dobiveni su rezultati koji pokazuju strukturalne promjene
reakcijskog centra fotosistema II i inhibiciju u prijenosu elektrona pri čemu je učinak bio veći
kod biljaka izloženih svjetlu. Pod tim uvjetima, nije došlo do aktiviranja fotozaštitnih
mehanizama kojim bi se riješio višak svjetlosne energije apsorbirane od strane antena
fotosistema II. Najveće pogoršanje strukturnog i funkcionalnog integriteta fotosistema II
opaženo je u stanicama algi izloženih 10 μmol L-1 n Ag tijekom 6 sati u uvjetima svjetlosti
(Dewez i Oukarroum, 2012.).
Istraživanje Mazumdar (2014) pokazuje značajno smanjenje sadržaja klorofila u vrsti
Brassica campestris izloženoj 0,5 i 1 mg L-1 n Ag u odnosu na kontrolu. Vrsta Vigna radiata
pokazala se nešto tolerantnija prema nanočesticama srebra od B. campestris jer je u toj vrsti
značajno smanjenje klorofila zabilježeno tek pri koncentraciji n Ag od 1 mg L-1 u odnosu na
kontrolu. U ovom je istraživanju utvrđeno da je vodena leća (kao i B. campestris) osjetljivija
na nanočestice srebra od mungo graha jer je sadržaj klorofila a u vodenoj leći bio znatno
smanjen pri koncentracijama n Ag većim od 0,1 mg L-1 (slika 3). U slučaju karotenoida,
pomoćnih pigmenata iz skupine terpena, uočena je vrlo slična situacija kao i kod klorofila,
odnosno utvrđeno je smanjenje sadržaja karotenoida u vodenoj leći izloženoj nano česticama
srebra u koncentracijama višim od 0,1 mg L-1 nanočestica srebra (slika 4). U vrsti Landoltia
punctata koja je tretirana nanočesticama bakrovog oksida (CuO) zabilježeno je značajno
30
Rasprava 31
smanjenje klorofila pri koncentraciji od 1 mg L-1, dok pri koncentraciji od 0,2 mg L-1 nisu
zabilježene takve promjene (Shi i sur. 2011.).
5.2 Učinak nano čestica srebra na pokazatelje oksidacijskog stresa u vodenoj leći
Izlaganje toksičnim koncentracijama metala često uzrokuje nakupljanje reaktivnih
oblika kisika, povišenu razinu lipidne peroksidacije i promjenu aktivnosti antioksidacijskih
enzima. U drugom dijelu istraživanja sam kao pokazatelje oksidacijskog stresa određivala
sadržaj malondialdehida i neproteinskih tiola, te aktivnost antioksidacijskih enzima katalaze,
askorbat peroksidaze i superoksid dismutaze.
U istraživanju Oukarroum i sur. (2013.) utvrđeno je značajno povećanje
unutarstanične koncentracije reaktivnih oblika kisika (ROS) u vodenoj leći Lemna gibba
izloženoj koncentracijama nanočestica srebra od 1 i 10 mg L-1. Također je utvrđena pozitivna
korelacija između oksidacijskog stresa i akumulacije nanočestica srebra u biljnim stanicama,
te oksidacijskog stresa i povećanja koncentracije nanočestica u podlozi. Rezultati istraživanja
upućuju na zaključak da suspenzija nanočestica srebra predstavlja potencijalni izvor
toksičnosti za vrstu L. gibba.
Peroksidacija lipidne membrane predstavlja jedan od najštetnijih učinaka
oksidacijskog stresa uzrokovan metalima (Bueno i Piqueres, 2002.). Stupanj lipidne
peroksidacije određuje se mjerenjem sadržaja malondialdehida, koji je jedan od krajnjih
produkata tog procesa. U ovom istraživanju je vidljiv znatan porast sadržaja malondialdehida
u vodenoj leći tretiranoj nanočesticama srebra (slika 5) u odnosu na kontrolni uzorak. Taj je
porast najizraženiji u biljkama izloženim koncentracijama nanočestica srebra od 5 mg L-1 i bio
je čak dva i pol puta veći u odnosu na kontrolne biljke. Ti rezultati također pokazuju da je u
biljkama izloženim n Ag došlo do oksidacijskog stresa jer je poznato da je direktna posljedica
povećanog stvaranja ROS i lipidna peroksidacija odnosno oštećenje lipidnih biomembrana.
Isti su rezultati utvrđeni i u istraživanju Glavaš Ljubimir i sur. (2012.).
Različiti stresni čimbenici djeluju na metaboličke procese ograničavajući rast i razvoj
biljaka. Prvi odgovor biljke je smanjenje normalne metaboličke aktivnosti, a time i sadržaja
proteina. Stoga, nizak sadržaj proteina predstavlja jasan pokazatelj stresa biljaka. Međutim,
sadržaj proteina može biti i povišen uslijed aktivacije različitih procesa u biljkama koji
uključuju sintezu proteina de novo, osmotsku regulaciju, antioksidacijsku obranu i druge
procese (Bonjoch i Tamayo, 2001.). U ovom istraživanju, nanočestice srebra u najnižim
primijenjenim koncentracijama (0,1 i 0,5 mg L-1) nisu uzrokovale statistički značajno
31
Rasprava 32
smanjenje sadržaja ukupnih proteina u usporedbi s kontrolom (slika 7). Sadržaj proteina u
vodenoj leći izloženoj koncentracijama srebra većim od 0,5 mg L-1 statistički se značajno
smanjio u usporedbi s kontrolom (najveće smanjenje sadržaja ukupnih proteina iznosilo je
33% u odnosu na kontrolne biljke).
Zbog visoke stanične koncentracije te uloge u održavanju redoks stanja stanice,
glutation je jedan od najvažnijih antioksidansa posebice u animalnim stanicama. Glutation
ima vrlo važnu ulogu i u toleranciji biljaka na teške metale i njihovoj kompartmentalizaciji u
vakuolu (Zhu i sur., 1999.; Zeng i sur., 2009.). Naime, GSH je prekursor fitohelatina, peptida
s općom strukturom [(γ-Glu-Cys)n-Gly (n ≥ 2) koji na sebe vežu metale i „odvoze“ ih u
vakuolu. Metali se vežu na –SH helirajuću grupu cisteina i nastaju kompleksi čime je
sprječena slobodna cirkulacija metala u citosolu. Dixit i sur. (2001.) su istraživali utjecaj
kadmija na grašak te su zaključili da je došlo do smanjenja razine GSH-a zbog njegovog
korištenja kao reducirajućeg supstrata u sintezi askorbata te tako i u zaštiti staničnih
membrana od lipidne peroksidacije. U ovom je radu sadržaj neproteinskih tiola, koji ukazuje
na sadržaj reduciranog glutationa, u vodenoj leći uzgojenoj na podlogama s dodatkom
nanočestica srebra bio statistički značajno povećan u odnosu na kontrolne vrijednosti pri
koncentracijama većim od 0,1 mg L-1 (slika 6).
U mom su istraživanju nanočestica srebra izazvale i promjene u aktivnostima
antioksidacijskih enzima u vodenoj leći – katalaze (CAT), askorbat peroksidaze (APOD) i
superoksid dismutaze (SOD). Bitnu ulogu u biljci ima katalaza koja neutralizira vodikov
peroksid čime zapravo utječe na redoks balans tijekom oksidacijskog stresa (Bowler i sur.
1992.). Iako je katalaza prisutna samo u peroksisomima, ima nezamjenjivu ulogu u razgradnji
visokih koncentracija ROS-a u stresnim uvjetima (Gupta i sur. 2009.). U ovom istraživanju
aktivnost katalaze u vodenoj leći tretiranoj nižim koncentracijama n Ag (0,1 i 0,5 mg L-1) nije
bila statistički značajno povećana u odnosu na kontrolne biljke. S druge strane koncentracije
nano srebra veće od 0,5 mg L-1 uzrokovale su značajnu inhibiciju aktivnosti tog
antioksidacijskog enzima u odnosu na kontrolu (slika 10). Song i sur. (2012.) su utvrdili
povećanu aktivnost katalaze i superoksid dismutaze u vodenoj leći izloženoj koncentracijama
nanočestica TiO2 nižim od 200 mg L-1 dok su veće koncentracije nanočestica uzrokovale
inhibiciju aktivnosti tih enzima. Jesus i sur. (2013.) primjetili su da različite veličine
nanočestica srebra drugačije utječu na aktivnost katalaze u biljci Lemna minor. Prilikom
tretiranja vodene leće nanočesticama srebra od 10 nm došlo je do povećane aktivnosti
katalaze iako je do statistički značajnog povećanja došlo samo pri najvišoj koncentraciji (0,32
mg L-1). Nanočestice srebra od 80 nm su pri koncentraciji od 0,02 mg L-1 uzrokovale lagano
32
Rasprava 33
smanjenje aktivnosti katalaze, pri koncentraciji od 0,05 aktivnost tog enzima je porasla, ali je i
dalje bila niža od aktivnosti katalaze u kontrolnim biljkama.
Askorbat peroksidaza, koja je visoko specifična tj. gotovo isključivo koristi askorbat u
razgradnji H2O2, pod utjecajem nižih koncentracija nanočestica srebra pokazala je porast
aktivnosti a pri najvišoj koncentraciji (5 mg L-1) i znatno smanjenje aktivnosti u usporedbi s
kontrolom (slika 9). U radu Hatami i sur. (2013.) procijenjen je učinak nanočestica srebra i
skladištenja u tamnom prostoru na sorte pelargonija 'Blue Wonder' i 'Antuna'. Aktivnost
askorbat peroksidaze (APOD) i gvajakol peroksidaze (POD) u pelargonijama tretiranim s 20-
60 mg cm-3 n Ag (nanočestice srebra primijenjene su folijarno) tijekom pet dana bila je
znatno povećana u odnosu na kontrolne biljke.
Superoksid dismutaza katalizira razgradnju superoksidnih radikala u vodikov peroksid
i kisik. Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) u biljkama izloženim najnižoj koncentraciji
nanočestica srebra nije bila statistički značajno povišena u odnosu na listiće kontrolnih biljaka
(slika 8). Statistički značajno povećanje aktivnosti tog enzima zamijećeno je pri
koncentracijama većim od 0,1 mg L-1, a najveći porast aktivnosti (porast od 38% u odnosu na
kontrolu) utvrđen je pri koncentraciji od 2 mg L-1 nanočestica srebra. U biljnoj vrsti Spirodela
polyrhiza tretiranoj nanočesticama srebra veličine 6 i 20 nm u koncentraciji od 10 mg L-1
aktivnost SOD i CAT te sadržaj GSH i MDA se nisu bitno razlikovali u usporedbi s
vrijednostima tih pokazatelja u kontrolnim biljkama (Jiang i sur., 2014.). S druge strane n Ag
u koncentracijama nižim od 10 mg L-1 značajno su povećali aktivnost svih mjerenih enzima
(SOD, CAT i POD) te glutationa ali usporedno s tim i povećanje ROS.
Na osnovu dobivenih rezultata može se zaključiti da su nanočestice srebra u
istraživanim koncentracijama negativno utjecale na rast vodene leće te su uzrokovale
okisdacijski stres iako su istovremeno potaknuti i obrambeni mehanizmi biljke.
33
Zaključak 34
6. ZAKLJUČAK
Na temelju dobivenih rezultata može se zaključiti da su nanočestice srebra toksične za
vodenu leću te da je u mehanizam njihove toksičnosti uključen oksidacijski stres jer su:
• uzrokovale smanjenje stope rasta broja listića i mase svježe tvari u vodenoj leći
• dovele do smanjenja sadržaja klorofila a i b, karotenoida u vodenoj leći
• povećale stupanj lipidne peroksidacije u vodenoj leći
• uzrokovale povećanje sadržaja neproteinskih tiola u vodenoj leći
• uzrokovale promjenu aktivnosti antioksidacijskih enzima (superoksid dismutaze,
askorbat peroksidaze i katalaze) u vodenoj leći
34
Literatura 35
7. LITERATURA
Aebi H., 1984. Catalase in vitro. Methods in Enzymology 105, 121-126. Arnon D.I., 1949. Copper enzymes in isolated chloroplast: polypheoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24, 1-15. Arora A, Sairam RK, Srivastava GC (2002) Oxidative stress and antioxidative system in plants. Curr Sci India 82: 1227-1238 Asada K., 1992. Ascorbate peroxidase – a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants. Physiologia Plantarum 55, 235-241. Begović L., 2013. Anatomski, fiziološki i molekularni biljezi lignifikacije u razvoju stabiljke jarog ječma (Hordelum vulgare L.). Doktorska disertacija: Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera, Sveučilište u Dubrovniku, Institut Ruđer Bošković, Sveučilišni poslijediplomski interdisciplinarni doktorski studij Molekularne bioznanosti. Bharadwaj Punita S., 2012. Silver or silver nanoparticle a safety or a risk. Journal of environmental research and development., 7(1A) 5, 452-456. Bonjoch N.-P., Tamayo P.-R., 2001. Protein content quantification by Bradford method U: Reigosa Roger, M. J. (ur) Handbook of Plant Ecophysiology Techniques. Kluwer Academic Publisher, Nizozemska, 283-295. Bonnet M., Camares O., Veisseire P., 2000. Effect of zinc and influence of Acremonium lolii on growth parameters, chlorophyll a fluorescence and antioxidant enzyme activities of ryegrass (Lolium perenne L. cv Apollo). Journal of Experimental Botany 51, 945-953. Bowler C., Van Montagu M., Inze D., 1992. Superoxide-dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43, 83-116. Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Analytical Biochmistry 72, 248-254. Bueno P., Piqueres A., 2002. Effect of transition metals on stress, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in tobacco cell cultures. Plant Growth Regulation 36, 161-167. Cassells A.C., Curry R.F., 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers. Plant, Cell Tissue and Organ Culture 64, 145-157. Chen X., Schluesener H.J., 2008. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicology Letters 176,1-12.
35
Literatura 36
Dewez D., Oukarraoum A., 2012. Silver nanoparticles toxicity effect on photosystem II photochemistry of the green alga Chlamydomonas reinhardtii treated in light and dark conditions. Toxicological and environmental chemistry 162, 1536-1546. Dixit, V., V. Pandey, Shyam, R., 2001. Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea. Journal of Experimental Botany 52, 1101-1109. Duncan D.B., 1955. Multiple range and multiple F tests. Biometrics 11, 1-42. Ellman G.L., 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemestry and Biophysics 82, 70-77.
Giannopolitis C. N., Ries S. K., 1977. Superoxide dismutase. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology 59, 309-314. Gill SS, Tuteja N (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol Bioch 48: 909-930 Glavaš Ljubimir K., Radić Brkanac S., Cvjetko P., Vujčić V., Ljubimir S., Pevalek-Kozlina B., 2012. Toxicity of silver nanoparticles in Duckweed (Lemna minor L.). International Conference-Plant Growth, Nutrition & Environment Interactions, Austrija, Beč. Gubbins E.J., Batty L.C., Lead J.R., 2011. Phytotoxicity of silver nanoparticles to Lemna minor L. Environmental Pollution 159, 1551-1559. Gupta D.K., Nicoloso F.T., Schetinger M.R.C., Rossato L.V., Pereira L.B., Castro, G.Y., Srivastava S., Tripathi R.D., 2009. Antioxidant defense mechanism in hydroponically grown Zea mays seedlings under moderate lead stress. Journal of Hazardous Materials 172, 479-484. Hatami M., Ghorbanpour M., 2013. Effect of nanosilver on physiological performance of Pelargonium plants exposed to dark stoge. Journal of Horticultural Research 21(1), 15-20. Heath R.L., Packer L., 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts.I- Kinetics and Stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemestry and Biophysics 125, 189- 198. Hillman W.-S., 1961. The Lemnaceae or duckweeds. Botanical Review 27, 221-287.
Hiraga S., Sasaki K., Ito H., Ohashi Y., Matsui H., 2001. A large family of class III peroxidases. Plant and Cell Physiology 42, 462-468.
Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M.,Geiss K.T. , Schlager J.J., 2005. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells. Toxicology in vitro. 19(1) 9, 975-983. Jesus F., Aguiar S., Ferreira M., Oliveira R., Pereira S., Nogueira Antonio J.A., 2013. Long-term effects of silver nanoparticles in Lemna minor: the influence of nanoparticles size. 8th International Conference on the Envionmental Effects of Nanoparticles and Nanomaterials, Aix-en-Provence, France, Abstract book.
36
Literatura 37
Jiang H.-S., Qiu X.-N., Li G.-B., Li W., Yin L.-Y., 2014. Silver nanoparticles induced accumulation of reactive oxygen species and alteration of antioxidant systems in the aquatic plant Spirodela polyrhiza. Environmental Toxicology and Chemistry 33(6), 1398-405. Krajnčić B., Devidé Z., 1980. Report on photoperiodie response in Lemnaceae from Slovenia. Ber. Geobot. Inst. ETH, Stiftung Rübel, Zürich, 47, 75-86. Krishanaraj C., Jagan E.G., Ramachandran R., Abirami S.M., Mohan N., Kalaichelvan P.T., 2012. Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri (Linn.) Wettst. plant growth metabolism. Process Biochemistry 47, 651-658. Landolt E, 1986. The family of Lemnaceae - a monografic study. Veröffentlichungen des Geobotanischen Institutes der Edig. tech. Hochschule, Stiftung Rübel. Zürich. 71. Heft. Les H.D., Crawford J.D., Landolt E., Gabel D.J., Kimball T.R., 2002. Systematic Botany 27(2), 221-240. Lichtennthalter H.K., 1987. Chlorophylls and caroteniods- pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148, 350-382. Liszewska F., Błaszczyk A., Sirko A., 2001. Modification of non-protein thiols contents in transgenic tobacco plants producing bacterial enzymes of cysteine biosynthesis pathway. Acta Biochimica Polonica 48, 647-656. Mazumdar H., 2014. The impact of silver nanoparticles on plant biomass and chlorophyll content. International Journal of Engineering and Science 4(7), 12-20. Mulier B., Rahman I., Watchorn T., Donaldson K., MacNee W., Jeffery P.-K., 1998. Hydrogen peroxide-induced epithelial injury: the protective role of intracellular nonprotein thiols (NPSH). European Respiratory Journal 11, 384-391. Nair R., Varghese S.H., Nair B.G., Maekawa T., Yoshida Y., Kumar D.S., 2010. Nanoparticulate material delivery to plants. Plant Science 179, 154-163. Nakano Y., Asada K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate- specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology 22, 867-880. Noctor G., Foyer C.H., 1998. Ascorbate and glutatione: keeping active oxygen under control. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 49, 249-279. Oukarraoum A., Barhoumi L., Pirastru L., Dewez D.,2013. Silver nanoparticle toxicity effect on growth and cellular viability of the aquatic plant Lemna gibba. Environmental Toxicology and Chemistry 32(4):902-907. Pand S., 2006. Environmental degradation due to the accumulation of perticulates. Journal of Environmental Research and Development, 1(1) 4: 22-25. Pevalek-Kozlina B., 2003. Fiziologija bilja, Profil International, Zagreb.
37
Literatura 38
Pirson A., Seidel F., 1950. Zell- und stoffwechselphysiologishe Untersuchungen an der Wurzel von Lemna minor unter besonderer Berücksichtigung von Kalium- und Kalziummangel. Planta 38, 431-473. Rogić T., Šimac M., 2009. Utjecaj solnog i osmotskog stresa na kaktus Mammillaria gracilis Pfeiff. u kulturi in vitro. Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet – Biološki odsjek rad izrađen u svrhu prijeve za natječaj za dodjelu Rektorove nagrade u akademskoj godini 2009/2010. Sarvajeet S.G., Narendra T., 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48, 909-930. Savolainen K., Alenius H., Norppa H., Pylkkänen L., Tuomi T., Kasper G., 2010. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies-A review. Toxicololgy 269: 92-104. Shi J., Abid A.D., Kennedy I.M., Hristova K.R., Silk K.W., 2011.To duckweeds (Landoltia punctata), nanoparticulate copper oxide is more inhibitory than the soluble copper in the bulk solution. Environmental Pollution 159(5), 1277-1282. Song G., Gao Y., Wu H., Zhang C., Ma H., 2012. Physiological effect of anatase TiO2 nanoparticles on Lemna minor. Environmental Toxicology and Chemistry 31(9), 2147-2152. Šmuc T., 2009. Kiselo-bazna svojstva Mn(III) meso-tetrakis((N-butil)piridin-2-il) porfirina u vodenom mediju. Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet – rad izrađen u svrhu prijeve za natječaj za dodjelu Rektorove nagrade u akademskoj godini 2008/2009. Štefan L., Tepešić T., Zavidić T., Urukalo M., Tota D., Domitrović R., 2007. Lipidna peroksidacija – uzroci i posljedice. Medicina. 10, 84-93. Steinberg R., 1946. Mineral requirenment of Lemna minor. Plant Physiology 21, 42-48. Űçüncü E., Őzkan A.D., Kurşungőz C., Űlger E., Őlmez T.T., Tekinay T., Ortaç B., Tunca E., 2014. Effect of laser ablated silver nanoparticles on Lemna minor. Chemosphere 108, 251-257. Vranova E., Inzé D., Breusegem F., 2002. Signal transduction during oxidative stress. Journal of Experimetal Botany 53, 1227-1236. Wang W., 1990. Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research 52, 7-22. Wang, F-Z., Wang, Q-B., Kwon, Suk-Yoon, Kwak, S-S., Su, W-A., 2005. Enhanced drought tolerance of transgenic rice plants expressing a pea manganese superoxid dismutase. Journal of Plant Physiology 162: 456-472. Woo-Mi L., Jin II K., Youn-Joo A.,2012. Effect of silver nanoparticles in crop plants Phaseolus radiatus and Sorghum bicolor: media effect on phytotoxicity. Chemosphere 86, 491-499.
38
Literatura 39
Zeng X., Ma L.-Q., Qiu R., Tang Y., 2009. Responses of non-protein thiols to Cd exposure in Cd hyperaccumulator Arabis paniculata Franch. Environmental and Experimental Botany 66: 242-248. Zenk M.-H., 1996. Heavy metal detoxification in higher plants – a review. Gene 179: 21-30. Zhu Y.-L., Pilon-Smits E.-A.-H., Tarun A.-S., Weber S.-U., Jouanin L., Terry N., 1999. Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressing γ-glutamylcysteine synthetase. Plant Physiology 121: 1169-1177.
http://delta-intkey.com/angio/www/lemnacea.htm, 21.11.2014
39
ŽIVOTOPIS 40
ŽIVOTOPIS
Eda Puntarić
OSOBNI PODACI:
Ime i prezime: Eda Puntarić
Datum i mjesto rođenja: 26.11.1990., Zagreb
Adresa: Zagrebačka 22a, 10 313 Graberje Ivanićko
Telefon: 01/2820-068
Mobitel: 098/1940-319
E-mail: [email protected]
Državljanstvo: Hrvatsko
OBRAZOVANJE:
1997.-2005. Osnovna škola „Josipa Badalića“, Graberje Ivanićko
2005.-2009. Srednja škola „Ivan Švear“, Ivanić Grad; smjer: opća
gimnazija
2009.-2012. Prirodoslovno - matematiči fakultet, Biološki odsjek,
smjer: Znanosti o okolišu – preddiplomski studij
(sveučilišna prvostupnica struke Znanosti o okolišu)
2012.- Prirodoslovno - matematiči fakultet, Biološki odsjek,
smjer: Znanosti o okolišu – diplomski studij
Zimski semestar 2013/2014 Demonstrator za izvođenje 45h praktikuma iz kolegija
„Osnove fiziologije bilja“
OSTALO:
- sudjelovanje na Smotri Sveučilišta 2011., 2012.
- sudjelovanje na manifestaciji „Noć biologije“ ( 2010., 2011., 2012., 2013.,2014.)
40