크라이(cry) 살충단백질 생성균(bacillus thuringiensis)에 의한 토양...

발 간 등 록 번 호

11-1480523-001767-01 NIER-RP2013-346

크라이(Cry) 살충단백질 생성균(Bacillus

thuringiensis)에 의한 토양미생물 영향 평가

환경건강연구부 바이오안전연구팀

박응로, 김선정, 허문석, 김용현, 송해룡, 최지은, 정현미, 서재화

Impact of Cry insecticide produced by Bacillus

thuringiensis on microbial population in soil

Eung-Roh Park, Sun-Jung Kim, Moonsuk Hur, Yong-Hyeon Kim, Hae-Ryong

Song, Ji-Eun Choi, Hyen Mi Chung, Jae-Hwa Suh

Biosafety Research Team

Environmental Health Research Department

National Institute of Environmental Research

2013

목 차❚

i

목 차

목차 ······························································································································ⅰ

표목차··························································································································ⅲ

그림목차······················································································································ⅳ

Abstract ·······················································································································ⅴ

Ⅰ. 서 론 ····················································································································· 1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 ······························································································ 3

1. 토양성분분석 ·······································································································3

가. 토양 채취 ·······································································································3

나. 토양 성분 분석 ·····························································································3

2. Cry 살충단백질 생성균(Bacillus thuringiensis)에 의한 토양미생물 영향

분석 ························································································································3

가. 사용균주 및 배양조건 ·················································································3

나. 시간경과 및 온도 차에 따른 토양미생물 영향 분석 ···························4

다. Cry 단백질 정량 ···························································································4

라. 수소이온농도(pH), 총유기탄소(TOC), 총질소(TN) 분석 ······················4

마. 토양미생물 군집 확인 ·················································································5

(1) 배양법 ············································································································5

(2) 분자생물학적 분석법 ··················································································6

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ······························································································ 8

1. 토양 채취 ···········································································································8

2. 토양 성분 분석 ·································································································9

3. Cry 단백질에 의한 토양미생물 영향 분석 ·················································9

가. 배양법을 이용한 세균 확인 ·······································································9

목 차❚

ii

(1) 일반세균 ········································································································9

(2) 섬유소분해세균 ··························································································10

(3) 단백질분해세균 ··························································································11

나. 시간, 온도차에 따른 토양분석 ································································12

다. 토양 내 Cry 단백질량 측정 ·····································································14

라. 토양 내 미생물군집 특성 분석 ·······························································16

(1) 문(phylum) 수준에서 토양 내 세균 군집 비교 ·································16

(2) 계통학적 정보에 기초한 토양 내 세균 군집 분석 ····························16

(3) UPGMA tree를 기반으로 한 다양성분석(PCoA) ······························20

Ⅳ. 결 론 ················································································································· 26

참고문헌 ···················································································································· 27

목 차❚

iii

표 목 차

<Table 1> Medium composition for heterotrophic bacteria isolation ···········5

<Table 2> Medium composition for cellulolytic bacteria isolation ···············5

<Table 3> Medium composition for proteolytic bacteria isolation ···············6

<Table 4> Results of the soil analysis ··································································9

<Table 5> Changes in growth of aerobic heterotriphic bacteria (CFU/g) ···· 10

<Table 6> Changes in growth of cellulolytic bacteria (CFU/g) ··················11

<Table 7> Changes in growth of proteolytic bacteria (CFU/g) ··················11

<Table 8> pH changes by time and temperature ···········································13

<Table 9> TOC changes by time and temperature ·········································13

<Table 10> TN changes by time and temperature ·········································14

<Table 11> Change of Cry protein amount according to incubation period

(ng/g-soil) ·····························································································15

목 차❚

iv

그 림 목 차

<Figure 1> Soil sampling site (National Academy of Agricultural Sciences)

··················································································································8

<Figure 2> Changes of microbial community incubated at 4 ℃ (control group) ·····················································································17

<Figure 3> Changes of microbial community incubated at 20 ℃ (control group) ·····················································································17

<Figure 4> Changes of microbial community incubated at 4 ℃ (Bacillus subtilis inoculation group) ················································18

<Figure 5> Changes of microbial community incubated at 20 ℃ (Bacillus subtilis inoculation group) ················································18

<Figure 6> Changes of the microbial community incubated at 4 ℃ (Bacillus thuringiensis inoculation group) ·······································19

<Figure 7> Changes of the microbial community incubated at 20 ℃ (Bacillus thuringiensis inoculation group) ·······································19

<Figure 8> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 4 ℃ ···············21

<Figure 9> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 20 ℃ ·············21

<Figure 10> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 4 and 20 ℃ ·· 22

<Figure 11> Three-dimensional graph of 4 ℃ incubation group ···············24

<Figure 12> 3D-correlation analysis of incubation at 4 ℃ ···························24

<Figure 13> Three-dimensional graph of 20 ℃ incubation group ·············25

<Figure 14> 3D-correlation analysis of incubation at 20 ℃ ·························25

Abstract❚

v

Abstract

In Korea, there are 104 authorized LMO (Living Modified Organisms)

products and 60 of them are with pesticidal activity. Bacillus thuringiensis is

a soil bacterium with pesticidal effect. Genes coding the Cry protein

produced by Bacillus thuringiensis are commonly used for developing

pest-resistant organisms. The Cry protein produced by Bacillus thuringiensis

acts by coupling with certain receptors of insects where they make pores in

the insect's digestive tracts eventually killing them.

The Cry proteins are released to soil ecosystem with the possibility of

effecting the soil microbial community. Therefore, investigation of the risk by

effect evaluation is needed. However, standard guidelines on the effect of

pest-resistant LMO to the soil ecosystem has not established yet.

It is generally known that there are approximately 108～109 of bacteria in a

fertile soil. Traditionally, microbial community has been analyzed by

culturing them. However, it is insufficient to rely on culturing techniques for

the analyses of diverse variety of microorganisms in environmental samples.

Recently, molecular techniques using community DNA are known to be

appropriate in identifying microbial diversity in various environmental

samples. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), TGGE

(Temperature Gradient Gel Electrophoresis) and T-RELP(Terminal Restriction

Fragment Length Ploymorphism) are representative techniques used for the

analyses of microbial community DNAs. Such techniques use amplified 16S

rRNA genes and fingerprinting methods are used by analyzing electroporesis

patterns. This study used pyrosequencing technique to analyze 16S rRNA

gene sequences and microbial community was identified to the species level.

In this study, Bacillus thuringiensis containing pest resistant gene was

inoculated to soil. After then, time and temperature dependent community

profile was analyzed by pyrosequencing techniques. Result of this study

Abstract❚

vi

could be used as data supporting policies for the prevention of release or

diversion of imported LMOs and as a ground data for the evaluation of

risks posed by pest-resistant LMOs to the soil ecosystems.

Ⅰ. 서 론❚

1

Ⅰ. 서 론

국내에 사료용·식품용으로 승인된 유전자변형생물체(living modified organisms,

LMO)는 104개 제품으로 이 중 약 60개가 해충저항성 특성을 가지고 있다1.

그람 양성 세균인 Bacillus thuringiensis는 살충 효과를 가진 토양미생물로서

건조중량의 25% 이상의 살충단백질을 생성할 수 있어 상업적으로 널리 쓰이는

미생물 살충제 중 하나이다2. 이 세균이 생성하는 Cry 단백질은 특정 곤충의 수

용체와 결합하여 소화관에 구멍을 뚫어 곤충을 죽인다3. 이러한 특성으로 인하

여 해충저항성을 가진 유전자변형생물체 개발에 이 유전자가 이용되고 있다.

Cry 단백질은 해충저항성 LMO로부터 토양생태계로 방출되므로 토양미생물

군집에 영향을 미칠 수 있어 이에 대한 위해성 판단은 LMO의 자연생태계 위

해성 평가에 중요한 요소로 인식되고 있다. 그러나 해충저항성 LMO가 토양생

태계에 미치는 영향에 대한 표준가이드라인이 확립되어 있지 않아서 이에 대

한 평가 기준의 확립이 시급한 실정이다.

토양미생물은 질소고정 등 토양생태계에 중요한 역할 수행하고 있다. 뿌리혹

박테리아 외에 땅 속에 사는 클로스트리디움(Clostridium), 아조토박터(Azotobacter),

슈도모나스(Pseudomonas) 등이 질소를 고정하여 단백질을 만든다. 이렇게 고정

된 질소 화합물은 암모니아로 바뀌게 되고 암모니아는 아질산균(Nitrosomonas

등)에 의해 아질산으로, 아질산은 질산균(Nitrobacter 등)에 의해 질산이 된다.

질산염은 이온 형태로 식물 뿌리에서 흡수되어 잎으로 운반되며, 그 안에서 다

시 암모니아로 바뀐 다음 단백질의 합성 재료가 된다. 이와 같이 세균류와 그

밖의 균류는 질소의 순환 및 다른 여러 원소의 순환에 관여함으로써 생태계의

평형을 유지하는데 매우 역할을 담당하고 있다4,5.

일반적으로 비옥한 토양 1 g에는 세균이 108～109 개가 존재한다고 알려져 있

다6. 미생물 군집은 전통적으로 배양법을 통해 분석하였으나 선택배지를 사용

하는 특징 때문에 다양한 미생물 군집을 확인하기에는 어려움이 있었다. 반면

최근에는 분자생물학적 방법이 발달함에 따라 환경시료에서 DNA를 추출하여

염기서열로 미생물 군집 구조를 확인하고 있다. DGGE (Denaturing Gradient

Ⅰ. 서 론❚

2

Gel Electrophoresis), TGGE(Temperature Gradient Gel Electrophoresis),

T-RELP(Terminal Restriction Fragment Length Ploymorphism) 등은 16S rRNA

유전자를 증폭한 후 전기영동 패턴을 확인하는 핑거프린트 방법으로 적은 비용

으로 많은 시료를 분석할 수 있으나, 결과를 데이터베이스화하기 어렵다는 문

제점이 있다. 본 연구에 이용된 pyrosequencing은 16S rRNA 유전자를

sequencing한 후 분석하는 방법으로 미생물의 종(Species) 수준까지 확인할 수

있는 방법이다7,8,9.

국내에서는 이기종 등(2012)8이 유전자변형 작물이 토양 미생물상에 미치는

영향을 확인하는 방법을 정리하였으며, 손수인 등(2010)10은 분자생물학적 분석을

이용하여 유전자변형 작물이 토양미생물상에 미치는 영향에 관하여 보고하였다.

본 연구에서는 해충저항성 유전자를 가진 Bacillus thuringiensis를 토양에

접종하여 시간과 온도에 따른 미생물 군집 변화를 배양법과 pyrosequencing을

이용하여 확인하였다. 이 결과는 수입·유통 LMO의 방출 또는 비의도적 유출로

야기되는 위해 방지를 위한 정책지원, 해충저항성 LMO의 자연생태계 위해성

평가 시 토양미생물상에 미치는 영향에 대한 심사의 근거 자료로 활용이 가능

할 것이다.

Ⅱ. 연구내용 및 방법❚

3

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 토양성분분석

가. 토양 채취

2013년 9월 30일 경기도 수원시 국립농업과학원 농업생명자원부 생물안

전성과 GMO 포장시험장에서 Non-GM 콩 재배 토양을 채취하였다. 표층

토양을 2~3 ㎝ 걷어낸 후 10개 이상 콩 식물체 뿌리 근처 토양을 20 ㎏ 채취하여 실험실로 운반하였다. 토양은 2 ㎜ 표준망체를 이용하여 걸러

낸 후 균질하게 혼합하였다11.

나. 토양 성분 분석

토양은 서울대학교 농생명과학공동기기원에 의뢰하여 수소이온농도

(pH), 총유기탄소(total organic carbon, TOC, %), 총질소(total nitrogen,

TN, %), 토성(soil texture), 중금속(카드뮴, 구리, 납, 비소, 수은, 6가크롬,

아연, 니켈)을 분석하였다12,13. TOC는 Walkley-Black법, TN은 Kjeldahl 법,

토성은 Pipet법으로 분석하였으며 금속류 중 카드뮴, 구리, 납, 비소, 아연,

니켈은 유도결합플라즈마발광광도계(ICP), 수은은 냉증기/원자흡수분광광

도법으로 수은분석기(Murcury Analryzer)를 이용하였으며, 6가크롬은

자외선/가시선분광광도계(UV)를 이용하여 측정하였다.

2. Cry 살충단백질 생성균(Bacillus thuringiensis)에 의한 토양미생물 영향 분석

가. 사용균주 및 배양조건

ATCC(American Type Culture Collection)에서 실험균주 Bacillus

thuringiensis subsp. Kurstaki (Bt; ATCC33679)와 진대조군 균주 Bacillus

subtilis (Bs, ATCC 6051)를 분양받았다. 균주는 ATCC medium 1209

NSMP (Casamino Acids, 5.0 g; Glucose, 2.0 g; KH2PO4, 0.86 g; K2HPO4․

3H2O, 0.72 g; Sodium citrate, 0.6 g; MgCl2, 0.201 g; CaCl2, 0.1 g; MnCl2․


4

4H2O, 0.016 g; ZnCl2, 0.007 g; FeCl3, 0.003 g; D.W., 1 ℓ; pH 6.5) 배지에

1%(v/v) 접종하여 30℃, 250 rpm에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양된

세균은 4℃, 8000 rpm, 10분간 원심 분리하여 균체를 모으고

PBS(Phosphate Buffered Saline)에 희석하여 비옥한 토양의 일반 세균수인

108~109/㎖로 맞춘 후 토양에 접종하였다. Bacillus thuringiensis를 접종한 것

(이하 Bt균)을 시험군, Bacillus subtilis를 접종한 것(이하 Bs균)을 진대조군으로

하였으며 균주를 접종하지 않고 PBS를 첨가하여 수분 농도만 맞춘 것으로

가대조군으로 사용하였다.

나. 시간경과 및 온도 차에 따른 토양미생물 영향 분석

균주를 적용한 실험군(PBS에 Bt균 접종), 진대조군(PBS에 Bs균 접종),

가대조군(PBS only) 토양을 4 ℃와 상온(20 ℃)에서 정치배양하면서 0, 3,

7, 14, 21, 28, 35일에 토양 시료를 채취하였다. 채취한 토양 시료에서 Cry

단백질량과 토양미생물 군집을 분석하였다.

다. Cry 단백질 정량

세균내 Cry 단백질 정량은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,

효소면역측정)법을 이용하여 확인하였다12. 세균 pellet과 1× extraction

buffer 1 mL를 넣어 초음파기로 세균을 용해(lysis) 시킨 후 16,000 g에서 5

분간 원심분리하여 상층액을 ELISA로 분석하였다. 토양 내 Cry 단백질 정

량은 토양시료 0.5 g을 정량하여 1× extraction buffer 1.5 ml를 넣어 30초

간 진동기(IKA. T10basic)로 분산시킨 후 16,000 g에서 5분간 원심분리하여

상층액을 ELISA 분석하였다. 토양내 Cry 단백질 정량을 위해 Fitzgerald사의

ELISA kit(55R-BTCRY1-KT)를 사용하여 프로토콜에 따라 Cry 단백질을 정량

하였다.

라. 수소이온농도(pH), 총유기탄소(TOC), 총질소(TN) 분석

시간경과와 온도차에 의한 토양 내 pH, TOC(g/kg), TN(g/kg)의 변화를

확인하기 위하여 0, 14, 35일에 확인하였다. 분석방법은 위의 토양분석


5

방법과 동일하게 진행하였다.

마. 토양미생물 군집 확인

토양미생물 군집을 분석하는 방법에는 배양법과 비배양법이 있다. 그러나

배양법이건 비배양법이건 어느 한 가지 방법만으로는 토양미생물 군집의

동태를 파악하기 어려워 여러 방법을 병합 사용하는 것이 권장되고 있다14.

따라서 본 연구에서도 배양법과 비배양법인 분자생물학적 분석법을 동시에

사용하였다.

(1) 배양법

배양법은 일반세균, 섬유소분해세균, 단백질분해세균을 배양하여 생균수

(CFU/mL)를 확인하였다. 0일(초기), 14일(중기), 35일(말기)에 토양시료 1 g을

채취하여 PBS를 9 ml 첨가하여 고르게 섞어준 후 10배씩 연속 희석하여 100 μl

를 고체 배지에 도말하여 30 ℃에서 1일 정치 배양한 후 생균수를 확인하였다.

각 배지 조성은 다음과 같다(Table 1, 2, 3).

<Table 1> Medium composition for heterotrophic bacteria isolation

King's B medium (pH 7.0) 3 g

Cycloheximide(200 ㎎/㎖ EtOH) 10 ㎖Agar 15 g

D.W. 1 ℓ

<Table 2> Medium composition for cellulolytic bacteria isolation

CMC 5 g

Tryptic Soy Broth 3 g

Agar 18 g

D.W. 1 ℓ


6

<Table 3> Medium composition for proteolytic bacteria isolation

Skim milk 10 g

Tryptic Soy Broth 3 g

Agar 18 g

D.W. 1 ℓ

섬유소분해세균은 배양 후 0.1 % congo red 용액을 뿌리고 30분 후 1 M

NaCl로 세척하고 붉은색으로 탈색된 원형을 계수한다. 단백질분해세균은

배지가 반투명한 우윳빛이기 때문에 집락 주위가 투명해지면 계수한다.

(2) 분자생물학적 분석법

기존 배양법을 보완하기 위해 분자생물학적 기법을 사용하였다15. 본 실험

에서는 실시간 염기다형성분석법을 이용하여 미생물 군집을 분석하였다.

(가) 토양 genomic DNA 추출

실시간 염기다형성분석(pyrosequencing)을 수행하기 위하여 토양의 전체

DNA(gDNA)를 추출하였다. gDNA 추출에는 상업화된 제품인 MP Bio사의

토양용 DNA 추출 키트를 이용하였다.

(나) 실시간 염기다형성분석(pyrosequencing)

실시간 염기다형성분석은 (주)천랩에서 수행하였으며 그 과정은 다음과

같다. 세균의 16S rRNA 유전자에서 V1에서 V3 부분을 타겟으로 하는

두 개의 전방향 프라이머 B16S-F, Bif16S-F와 한 개의 역방향 프라이머

B16-7-1을 사용하여 추출된 gDNA로부터 분석에 사용될 부분만을 증폭

하였다. 중합효소연쇄반응은 각 프라이머 1 μl(20 pM/uL), DNA 1 μl,

dNTPs 1 μl(100 mM/uL), 10× Buffer에 녹인 MgCl2 5 μl(10×), Taq

Polymerase(Roche) 0.25 μl(5U/μL)를 넣은 후 증류수로 최종부피가 50 μl

가 되도록 혼합하고 PCR(PTC-200, Peltier Thermal Cyclerm, PharmaTech

& GeneAmpPCR System 9700, Applied Biosystems)을 수행하였다.

반응 조건은 94 ℃에서 5분 동안 초기 변성, 94 ℃ 30초간 변성, 55 ℃에


7

서 45초 결합, 72 ℃ 1분 30초 신장의 과정을 30회 반복하였다. 풀링

(pooling)한 DNA는 전기영동하여 300 bp 미만의 DNA는 elution과정에서

QiAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)을 이용하여 제거하였다. DNA

샘플은 94 ℃에서 4분 동안 초기 변성 후, 94 ℃ 30초간 변성, 58 ℃에

서 4분 30초 결합, 68 ℃ 30초 신장의 과정을 50회 반복하여

emPCR(emulsion-based clonal amplification)을 실시한 후 1 mg의 PCR

산물을 Genome Sequencer(GS) FLX Titanium(Roche-454 Life Science)을

사용하여 염기서열을 분석하였다.

(다) 16S rRNA 유전자의 염기서열 동정 및 군집 조사

시료별 고유의 염기서열들을 구분하기 위하여 PCR 프라이머에 삽입하

였던 시료 고유 바코드 서열을 이용하여 염기서열들을 분리하였다. 염기

서열 양쪽에서 바코드 염기서열, 연결자(linker), PCR 프라이머 염기서열에

해당되는 부분들을 제거한 뒤 그 결과로 얻어진 염기서열들 중 길이가 300 bp

미만인 염기서열들을 추가적으로 제거하였다. BLASTN 검색(expectation

value of >e-5)을 사용하여 16S rRNA 유전자 데이터베이스에 매치되지

않는 것들도 제거하였다. 키메릭 염기서열(chimeric sequence)들을 확인

하기 위하여 개별 염기서열을 절반으로 나누어서 앞부분과 뒷부분 사이

의 유사도가 세균의 목(phylum, 目) 수준에서 다르게 나타날 때 이를 키

메라(chimera)로 간주하고 분석대상에서 제거하였다. 실시간 염기다형성

분석 결과들을 계통분류하기 위해서 표준균(type strain)의 16S rRNA 유

전자 염기서열정보를 가지고 있는 종정보가 확장된 형태의 데이터베이스

(EzTaxon-extended, http://www.eztaxon.org)를 사용하였다. 실시간

염기다형성 분석 결과들은 데이터베이스의 염기서열을 기준으로 먼저

BLASTN 검색 후 1:1의 유사성비교(pairwise similarity comparison)를

이용하여 동정하였으며 시험 그룹 간의 비교는 (주)천랩에서 개발한

CLCommunity 프로그램을 사용하였다.

Ⅲ. 연구결과 및 고찰❚

8

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 토양 채취

질소고정세균 등 토양미생물의 변화를 조사하기 위하여 식물 뿌리에 의해 미

생물이 영향을 받는 토양인 근권 토양을 중심으로 시료 채취가 이루어져야 한

다. 본 실험에서는 뿌리혹 박테리아 등 토양미생물의 작용이 활발할 것으로 예

상되고, 연구자에 의해 체계적으로 관리되고 있는 국립농업과학원의 콩 시험포

장지에서 시료를 채취하였다(Figure 1). 2013년 9월 30일, 경기도 수원시 국립농

업과학원 농업생명자원부 생물안전성과 GMO 포장시험장 내 non-GM 콩 재배

지에서 표층 토양을 2～3 cm 걷어낸 후 10개 이상 콩 식물체 뿌리 근처 토양을

20 kg 채취하여 실험실로 운반하였다. 토양은 2 mm 표준망체를 이용하여 걸러

낸 후 균질하게 혼합하였다.

<Figure 1> Soil sampling site (National Academy of Agricultural Sciences).


9

2. 토양 성분 분석

시험에 사용한 토양의 pH, TOC, TN, 토성, 중금속(카드뮴, 구리, 납, 비소, 수은,

6가크롬, 아연, 니켈)을 분석하였다. 실험에 사용한 토양은 모래(sand) 23.93 %,

미사(silt) 62.96 %, 점토(clay) 13.11 %로 조성된 미사질 양토(微砂質壤土, silt

loam)로 분석되었으며 중금속 함량은 Table 4와 같이 나타나 토양오염우려기준16

이하로 나타났다.

pHTOC(%)

TN(%)

Soil texture(%) Heavy metals(㎎/㎏)

Sand Silt Clay Cd Cu Pb As Hg Cr+6 Zn Ni

7.63 2.33 0.20923.93 62.96 13.11

1.62 24.8 43.7 7.54 ND ND 75.8 15.9silt loam

<Table 4> Results of the soil analysis

3. Cry 단백질에 의한 토양미생물 영향 분석

가. 배양법을 이용한 세균 확인

(1) 일반세균

대조군은 4 ℃ 배양시, 4.9×106±5.7×105 cfu/g에서 14일 후 1.3×107±

1.2×106 cfu/g으로 증가하였다가 35일 후에는 4.2×106±4.6×106 cfu/g으로

감소하였다. 20 ℃에서는 14일 후 1.8×106±3.4×105 cfu/g으로, 35일 후에는

1.6×106±2.1×105 cfu/g으로 계속 감소하였다.

Bs균 접종군은 초기에 8.6×107 cfu/g으로 매우 높은 수로 시작하여 4 ℃ 배양시에는 14일 후 1.1×108 cfu/g까지 증가하였다가 35일 후에는 5.5×107

cfu/g으로 감소하였다. 20 ℃ 배양시에는 지속적으로 감소하여 35일 후에

는 3.0×107 cfu/g으로 나타났다. Bt 접종군도 대조군과 유사한 경향을 나타

내고 있으며 4 ℃, 20 ℃ 배양군 모두 35일 후에는 초기 수준인 5.5∼6.3×106 cfu/g 수준을 유지하였다.

토양 시료 채취 후 체를 치는 과정 등에서 통기 효과에 의해 일시적으로


10

배양 미생물의 수가 증가할 수 있는 것으로 알려졌는데17, 본 실험 결과 모두

초기보다 미생물 수가 감소한 것은 이러한 효과 때문인 것으로 추정된다.

Tem.(℃)

Control/Experimental

group0d 14d 35d

4

Control 4.9E+06(±5.7E+05) 1.3E+07(±1.2E+06) 4.2E+06(±4.6E+06)

Bs 8.6E+07(±1.0E+07) 1.1E+08(±3.5E+06) 5.5E+07(±5.3E+06)

Bt 8.0E+06(±1.1E+06) 1.8E+07(±1.8E+06) 5.5E+06(±3.5E+05)

Tem.(℃)


group0d 14d 35d

20

Control 4.9E+06(±5.7E+05) 1.8E+06(±3.4E+05) 1.6E+06(±2.1E+05)

Bs 8.6E+07(±1.0E+07) 5.9E+07(±2.0E+07) 3.0E+07(±3.1E+06)

Bt 8.0E+06(±1.1E+06) 2.9E+07(±4.9E+06) 6.3E+06(±4.0E+05)

<Table 5> Changes in growth of aerobic heterotriphic bacteria (CFU/g)

(2) 섬유소분해세균

대조군은 2.7×105 cfu/g에서 지속적으로 감소하여 35일 후에는 1.3×105

cfu/g으로 감소하였다(4 ℃). 20 ℃에서도 6.7×105 cfu/g 수준으로 증가하

다가 35일 후에는 2.6×105 cfu/g으로 다시 감소하였다.

Bs균 접종군은 4 ℃에서 배양시 5.2×107 cfu/g에서 2.1×105 cfu/g,

1.3×105 cfu/g으로 급격히 감소하였으며, 20 ℃에서 배양한 경우도 3.3×105

cfu/g, 1.3×105 cfu/g으로 같은 양상을 보였다.

Bt균 접종군은 4.5×106 cfu/g에서 14일 후 4 ℃ 배양군에서는 1.2×107

cfu/g, 20 ℃ 배양군에서는 1.7×107 cfu/g으로 증가하였다.

결론적으로 Bt균 접종시에만 섬유소분해세균의 개체수가 증가하였는데,

이는 LM옥수수에서 nonLM옥수수 근권 토양보다 섬유소분해세균의 개체

수가 많았다는 국립환경과학원의 연구결과18와도 상통하였다.


11

Tem.(℃)


group0d 14d 35d

4

Control 2.7E+05(±1.5E+04) 2.1E+05(±1.6E+04) 1.3E+05(±6.6E+04)

Bs 5.2E+07(±1.4E+07) 2.1E+05(±3.9E+04) 1.0E+05(±5.2E+04)

Bt 4.5E+06(±3.5E+05) 1.2E+07(±5.1E+05) -

Tem.(℃)


group　0d 14d 35d

20

Control 2.7E+05(±1.5E+04) 6.7E+05(±5.8E+03) 2.6E+05(±6.8E+04)

Bs 5.2E+07(±1.4E+07) 3.3E+05(±7.0E+04) 1.3E+05(±4.1E+04)

Bt 4.5E+06(±3.5E+05) 1.7E+07(±5.7E+05) -

<Table 6> Changes in growth of cellulolytic bacteria (CFU/g)

(3) 단백질분해세균

대조군은 4 ℃에서 배양했을 때, 초기 1.7×105 cfu/g에서 14일, 35일이 지

나면서 2.6×105 cfu/g, 3.3×105 cfu/g으로 소폭 증가하였다. 20 ℃에서 배양

한 경우도 4.0×105 cfu/g, 3.8×105 cfu/g 수준을 유지하였다.

Tem.(℃)


group　0d 14d 35d

4

Control 1.7E+05(±1.7E+04) 2.6E+05(±4.2E+04) 3.3E+05(±4.4E+04)

Bs 7.0E+04(±1.0E+04) 2.7E+07(±2.3E+06) 4.9E+07(±8.0E+06)

Bt 8.3E+04(±1.2E+04) 1.4E+07(±5.5E+06) 9.7E+06(±3.5E+06)

Tem.(℃)


group0d 14d 35d

20

Control 1.7E+05(±1.7E+04) 4.0E+05(±5.0E+04) 3.8E+05(±4.9E+04)

Bs 7.0E+04(±1.0E+04) 3.7E+07(±4.7E+06) 3.5E+07(±3.6E+06)

Bt 8.3E+04(±1.2E+04) 2.4E+07(±2.5E+06) 5.0E+06(±3.2E+05)

<Table 7> Changes in growth of proteolytic bacteria (CFU/g)


12

Bs균 접종군은 초기 7.0×104 cfu/g에서 4 ℃ 14일, 35일 배양 후 각각

2.7×107 cfu/g, 4.9×107 cfu/g으로 급격히 증가하였으며, 20 ℃ 배양군에서

는 3.7×107 cfu/g으로 증가하였다가 3.5×107 cfu/g 수준을 유지하였다.

Bt균 접종군은 두 온도군 모두 14일 후에는 증가하였다가 35일 후에는

감소하는 경향을 나타냈다. 4 ℃에서는 초기 8.3×104 cfu/g에서 1.4×107

cfu/g, 9.7×106 cfu/g으로 변화하였고, 20 ℃에서는 2.4×107 cfu/g으로 증가

하였다가 5.0×106 cfu/g 수준으로 감소하였다.

단백질분해세균은 모든 시험군에서 모두 증가하였으나 대조군에 비해 Bt

균, Bs균 접종시 증가비율이 월등히 높았으며, 섬유소분해세균과 단백질분

해세균이 LM 옥수수가 재배되는 토양에서 더 높은 밀도를 보였다는 보고

도 있는 바18, 실시간 염기다형성분석을 통해 종합적으로 분석할 필요가 있

는 것으로 판단되었다.

한편 일반세균, 섬유소분해세균, 단백질분해세균의 개체수에 대해 기존

에 보고된 결과를 살펴보면 토양 및 작물 등의 요인에 의해 달라지는데, 일

반세균의 경우 LM옥수수 근권토양에서 2.0×106∼1.6×107 cfu/g19, LM목화

근권토양에서 1∼3×105 cfu/g20, Cry 단백질을 처리한 실험에서 3.4×106∼4.3×107 cfu/g21, Cry 단백질 생산균주 접종시 2.5×107∼1.6×109 cfu/g22의

개체수를 보고한 바 있다. 섬유소분해세균은 Cry 단백질 생산균주 접종 시

험에서 6.3×104∼2.5×106 cfu/g22, 단백질분해세균은 역시 Cry 단백질 생산

균주 접종 시험에서 6.3×104∼1.6×106 cfu/g22으로 보고되었는데, 이와 비교

했을 때 본 실험에서는 전반적으로 높은 결과를 나타내었다.

나. 시간, 온도차에 따른 토양분석

시간과 온도차에 따른 토양시료의 pH, TOC, TN의 변화를 확인하였다. 토

양의 pH는 식물의 생육에 영향을 끼치는 토양의 화학적 특성 중에서 가장

중요한 인자 중 하나이다. 본 실험에 사용한 토양은 pH 7.6의 중성값을 나

타냈으며 모든 시험군에서 배양 35일 후에 pH7.2～7.3으로 약간 낮게 나타

났다(Table 8). 토양의 TOC는 초기 2.24~2.42에서 배양 35일 후에는 2.10∼2.21로 다소 감소하였으나 유의적인 값을 나타내지는 않았다(Table 9). TN은

초기 0.209∼0.230%에서 배양 35일 후 0.202∼0.214로 소폭 감소하였으나,


13

이 값은 일반적인 농경지 총질소농도 0.03∼0.4% 범위 내에 존재하며 Bt균

접종에 따른 특징적인 차이는 발견할 수 없었다(Table 10).

<Table 8> pH changes by time and temperature

Tem.(℃)


group

pH

0d 14d 35d

4

Control 7.6 7.2 7.3

Bs 7.2 7.2 7.2

Bt 7.2 7.2 7.3

Tem.(℃)


group

pH

0d 14d 35d

20

Control 7.6 7.2 7.3

Bs 7.2 7.2 7.3

Bt 7.2 7.3 7.2

<Table 9> TOC changes by time and temperature

Tem.(℃)

Experimentalgroup

TOC(%)0d 14d 35d

4

Control 2.33 2.17 2.15

Bs 2.24 2.21 2.18

Bt 2.42 2.26 2.17

Tem.(℃)

Experimentalgroup

TOC(%)0d 14d 35d

20

Control 2.33　 2.25 2.21

Bs 2.24 2.24 2.10

Bt 2.42 2.14 2.18


14

<Table 10> TN changes by time and temperature

Tem.(℃)

Experimentalgroup

TN(%)0d 14d 35d

4

Control 0.209 0.212 0.211

Bs 0.221 0.229 0.212

Bt 0.230 0.221 0.214

Tem.(℃)

Experimentalgroup

TN(%)0d 14d 35d

20

Control 0.209 0.214 0.210

Bs 0.221 0.217 0.202

Bt 0.230 0.213 0.210

다. 토양 내 Cry 단백질량 측정

접종한 Bacillus thuringiensys균에서 Cry 단백질이 생성되는지 확인하기 위

하여 토양 중 Cry 단백질량을 측정하였다. 세균을 접종한 시기를 0일로 하

여 각각 3일, 7일 이후 1주일 간격으로 토양의 Cry 단백질량을 측정한 결과,

대조군과 Bs균 접종군에서는 23.5∼49.0 ng/g-soil 수준으로 유지되었으나

Bt균 접종군에서는 초기 200 ng/g-soil에서 4℃ 21일째에는 595.5 ng/g-soil

까지 증가하여 접종한 Bt 균이 정상적으로 Cry 단백질을 생산하고 있음을

보여주었다(Table 11).


15

<Table 11> Change of Cry protein amount according to incubation period (ng/g-soil)

Tem.(℃)


group

Cry protein (Cry(ng)/soil(g))

0d 3d 7d 14d 21d 28d 35d

4

Control31.0

(±10.1)

41.7

(±0.1)

32.1

(±0.8)

36.4

(±4.7)

38.3

(±17.5)

28.4

(±0.8)

23.5

(±0.6)

Bs36.5

(±2.7)

39.5

(±3.7)

37.2

(±3.7)

30.6

(±8.5)

46.2

(±0.5)

27.2

(±1.2)

27.9

(±0.8)

Bt200.0

(±116.0)

328.5

(±209.9)

393.8

(±143.9)

460.8

(±184.4)

595.5

(±27.6)

507.1

(±17.1)

303.8

(±164.0)

Tem.(℃)


group

Cry protein (Cry(ng)/soil(g))

0d 3d 7d 14d 21d 28d 35d

20

Control31.0

(±10.1)

49.0

(±10.4)

34.4

(±1.0)

27.6

(±0.6)

41.8

(±1.4)

38.9

(±0.6)

28.8

(±2.6)

Bs36.5

(±2.7)

43.1

(±5.6)

35.3

(±0.2)

32.0

(±1.6)

37.9

(±0.4)

39.5

(±3.7)

27.0

(±5.4)

Bt200.0

(±116.0)

321.3

(±102.5)

449.0

(±217.1)

343.5

(±136.3)

422.2

(±134.1)

431.3

(±22.4)

400.4

(±32.5)


16

라. 토양 내 미생물군집 특성 분석

(1) 문(phylum) 수준에서 토양 내 세균 군집 비교

실험 시작 시기의 토양은 Proteobacteria(25%), Acidobacteria(22%),

Chloroflexi (12%), Actinobacteria(10%), Firmicutes(10%), Bacteroidetes(8%)

의 순으로 우점하고 있었으며 이 들 6개 문이 전체의 87%를 차지하고 있었

다(Figure 2, 3). Bs균과 Bt균 접종 토양에서는 접종 직후, Bacillus속(genus)

을 포함하는 Firmicutes가 각각 40 %와 46 % 수준으로 높았으나, 4 ℃에서

배양한 경우 7일 후에는 Bs균, Bt균 시험군은 각각 25 %, 19 %, 28일 후에

는 11 %, 22 %로 감소하였다(Figure 4, 6). 20 ℃에서 배양한 경우에도 유사

한 경향을 나타내어 7일 후에는 Bs균 시험군에서 14 %, 21일 후에는 Bt균

시험군에서 18 %, 28일 후에는 Bs균, Bt균 시험군에서 각각 11 %, 13 %로

감소하였다(Figure 5, 7). 이는 미접종 토양의 Firmicutes 비율 7∼10 %와

유사한 수준으로, Bs균, Bt균을 인위적으로 접종한 경우라도 시간이 지나면

서 미접종 토양의 미생물 군집 수준으로 회복되는 것을 알 수 있으며 이러

한 경향은 20 ℃에서 배양한 경우에 더 강하게 나타났다. 하지만 Bt균을 접

종하여 4 ℃에서 배양한 경우에는 35일 후까지도 Firmicutes 비율이 17～22 %로 Proteobacteria와 가장 높은 빈도를 차지하는 것으로 나타났는데,

Bs균 접종군도 이와 유사한 군집 양상으로 보이는 것으로 보아 저온에서

세균 미접종 토양의 미생물상으로 회복되는 진행도가 느린 때문인 것으로

판단된다. 그러나 Bt균을 접종한 후 문(phylum) 수준에서 특정 미생물군의

급격한 증가나 감소와 같은 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.

(2) 계통학적 정보에 기초한 토양 내 세균 군집 분석

계통수에 근거한 다양한 분석법이 미생물 군집 패턴을 보여주는데 효과

적인 것으로 알려져 있다23. 확장형 데이터베이스(EzTaxon)를 활용하여 시

료들 간의 계통분류(UniFrac) 후 지점별 공간적 다양성분석(PCoA,

principal coordinates analysis)을 수행하였다. 본 연구에서는 (주)천랩의

CLcommunityTM 프로그램을 이용하였다. 온도별 시험군 간의 미생물 군집

패턴을 UPGMA dendrogram으로 비교한 결과 4 ℃ 시험균에서 Bs균을


17

<Figure 2> Changes of microbial community incubated at 4 ℃ (control group).

<Figure 3> Changes of microbial community incubated at 20 ℃ (control group).


18

<Figure 4> Changes of microbial community incubated at 4 ℃ (Bacillus subtilis inoculation group).

<Figure 5> Changes of microbial community incubated at 20 ℃ (Bacillus subtilis inoculation group).


19

<Figure 6> Changes of the microbial community incubated at 4 ℃ (Bacillus thuringiensis inoculation group).

<Figure 7> Changes of the microbial community incubated at 20 ℃ (Bacillus thuringiensis inoculation group).


20

접종하여 14일, 28일 배양한 경우에 미접종 대조군과 유사한 미생물군집

패턴을 나타냈으나, Bs균 접종군과 Bt균 접종군은 각각 별도의 독립된

미생물군집 패턴을 보여주었다(Figure 8). Bs균 접종군은 7일 배양 때까

지는 Bt균 접종군과 유사한 패턴을 나타내었으나 28일이 경과하면서 미접종

토양과 유사한 패턴으로 변화가 있었다. 20 ℃ 시험군에서도 Bt균 접종군이

독립된 패턴을 나타내고 있었으나 Bs균과 Bt균 접종군이 28일 후 서로

유사한 패턴을 나타내었고, Bs균 접종 7일 배양군과 Bt균 접종 21일 배양

군이 다음으로 유사한 패턴을 나타내었다(Figure 9). 그러나 이들 접종군과

비접종 대조군과의 유사도가 4 ℃ 배양 시험군보다 전반적으로 큰 것으로

나타나, 미생물 군집이 비접종 대조군의 패턴으로 회복되고 있는 것으로

추측되었다. 이는 20 ℃에서 4 ℃에 비해 상대적으로 미생물의 생육속도가

빠르기 때문인 것으로 판단된다. 한편 전 시험군을 대상으로 dendrogram을

비교한 결과에서는 4 ℃ 배양군과 20 ℃ 배양군 사이에 특징적인 차이를

발견할 수 없었다(Figure 10).

(3) UPGMA tree를 기반으로 한 다양성분석(PCoA)

대조군과 Bs균, Bt균 접종군 사이에 공간적 다양성분석(PCoA)를 수행하였다.

그 결과 4 ℃ 배양군에서는 Bt균 접종군이 하나의 그룹으로 나타났다(Figure

11). 미접종 대조군 또한 별도의 그룹으로 나타났는데, Bs균 접종군의 경우

는 어디에도 속하지 않는 분산된 모양으로 나타났다. 이를 3차원 상관성

분석(3D-correlation)으로 비교해 본 결과 미접종 대조군과 Bt균 접종군은

별도의 그룹을 만들고 있었으나, Bs균 접종군은 고루 산재하고 있었다

(Figure 12). 그러나 Bs: 14(Bs균 접종 후 14일간 배양한 시료) 및 Bt: 28 (Bt

균 접종 후 28일간 배양한 시료)은 미접종 대조군 그룹에 근접해 있는 것으로

보아 Bs균 접종군은 미접종 대조군과 유사한 미생물군집 패턴으로 회복되고

있는 것으로 판단되었다.

한편 20 ℃ 배양군의 경우에는 Bt균 접종군이 별도의 그룹을 만들지 않고

미접종 대조군와 같은 그룹을 형성하는 것으로 나타났다(Figure 13). 다른

관점에서 판단하기 위해 3차원 상관성 분석을 한 결과, 미접종 대조군과

접종초기의 시료(Bt: 0, Bs: 0, Bs: 3)가 각각 별도의 그룹으로 나타났는데,


21

<Figure 8> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 4 ℃.

<Figure 9> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 20 ℃.


22

<Figure 10> UPGMA dendrogram analysis of incubation at 4 and 20 ℃.


23

대부분의 Bs균, Bt균 접종군이 이 두 그룹 사이에 산재하고 있었다. 그러나

Bs: 14, Bs: 28, Bt: 28은 미접종 대조군 그룹에 인접해 있는 것으로 보아 Bs균,

Bt균 접종군이 미접종 대조군과 같은 패턴으로 회복될 것이라 기대되었다.

이러한 결과는 Bacillus sp. 접종군의 경우 시간이 지나면서 접종 이전의

미생물군으로 회복될 것이라는, 문(phylum) 수준의 미생물군집을 분석한

결과와 유사하며 온도가 높을수록 미생물군의 회복 속도가 빠른 것으로

판단되었다. 그러나 Bs균 접종군과 Bt균 접종군의 미생물 군집 변화에는

다소 차이가 있는 것으로 나타났으며 Bt균 접종 후 4 ℃ 배양 결과에서

보여주는 Bt균의 그룹 패턴이 미접종 상태로 회복되는 단계의 일시적 현상

인지 Bt균 접종의 특징적인 결과인지에 대해서는 추가 조사를 통해 판단할

수 있을 것으로 생각된다.

본 시험에서는 질소고정균, 섬유소분해세균, 단백질분해세균 등 특정 미

생물군의 유의적인 변화를 관찰하지는 못하였다. 그러나 Bt균 그룹 패턴

분석과 더불어 식물성장 영향 시험 등을 동시에 수행한다면 Bt균의 토양

미생물에 대한 영향을 판단할 수 있을 것이라 판단된다.


24

<Figure 11> Three-dimensional graph of 4 ℃ incubation group.

<Figure 12> 3D-correlation analysis of incubation at 4 ℃.

․ Ctl: 미접종군․ Bs: Bacillus subtilis 접종군․ Bt: Bacillus thuringiensis 접종군․ 뒤의 숫자는 배양기간(day)


25

<Figure 13> Three-dimensional graph of 20 ℃ incubation group.

<Figure 14> 3D-correlation analysis of incubation at 20 ℃.

Ⅳ. 결 론❚

26

Ⅳ. 결 론

본 연구는 Cry 단백질이 토양미생물에 미치는 영향을 평가하여 해충저항성

LMO 개발시 사용되는 Bacillus thuringiensis 유래 유전자의 자연생태계위해성

평가 지침을 제공하는데 목적이 있다.

1. Cry 단백질 생성균(Bacillus thuringiensis)을 토양에 접종하고 4 ℃와 20 ℃

두 온도 조건에서 배양한 결과, 일반세균과 섬유소분해세균의 변화는 관

찰되지 않았다. 그러나 단백질분해세균은 Bacillus thuringiensis와 Bacillus

subtilis를 접종한 시험군에서 급격히 증가하였으며 14일 이후에는 다소 감소

하는 경향을 나타내었다.

2. 시간 및 온도에 따른 pH, TOC, TN도 분석하였으나 배양 후 35일이 지나도

특이한 변화는 관찰되지 않아 토양성분상에 영향을 미칠 정도의 유의적인

영향은 없는 것으로 판단되었다.

3. 실시간 염기다형성분석(pyrosequencing)을 이용하여 미생물 문(phylum)

수준에서 미생물 군집의 변화를 관찰한 결과, Bacillus thuringiensis 접종에

따른 특정 미생물군의 변화는 관찰되지 않았다. 시공간 분석, 3차원 상관성

분석 결과에서는 오히려 시간이 지날수록 미생물을 접종하지 않은 원래의

토양미생물군을 회복하는 것으로 관찰되었다. 그러나 대조군에 비해

Bacillus thuringiensis균 접종군에서는 미생물 군집에 다소 차이가 있는 것으

로 나타났으며, 이 패턴의 변화가 미생물군의 회복 단계에서 나타나는 일시

적 현상인지 Bt균 접종에 따른 특징적인 결과인지에 대해서는 추가 연구가

필요한 것으로 판단된다.

4. 본 시험에서는 질소고정균 등 특정 미생물군의 유의적인 변화는 관찰하지

못했지만 식물성장 영향 시험 등을 동시에 수행한다면 Baciluls thuringiensis

균의 토양미생물에 대한 영향을 더 정확히 판단할 수 있을 것이라 판단된다.

참고문헌❚

27

참 고 문 헌

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크라이(cry) 살충단백질 생성균(bacillus thuringiensis)에 의한 토양...

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