TUGAS MIKROBIOLOGI INDUSTRI

Pembuatan Insulin Manusia dengan Teknik DNA Rekombinan Sebagai

Salah Satu Aplikasi Mikrobiologi dalam Bidang Kesehatan

Gede Mas Teddy Wahyudhana (0808505010)

Ni Made Ayu Suartini (0808505015)

Enny Laksmi Artiwi (0808505018)

Ni Putu Martiari (0808505023)

\

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2011

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes melitus atau penyakit kencing manis tergolong ke dalam salah satu penyakit

yang menimbulkan mortalitas dan morbiditas tinggi. Penyakit ini berkembang terutama karena

faktor genetik dan pola hidup yang tidak sehat, seperti terlalu banyak mengkonsumsi makanan

yang mengandung kolesterol tinggi, jarang berolahraga, dan sebagainya (Depkes RI, 2005).

Diabetes melitus (DM) didefinisikan sebagai suatu penyakit atau gangguan metabolisme

kronik dengan multi etiologi yang ditandai dengan tingginya kadar gula darah disertai dengan

gangguan metabolisme karbohidrat, lipid, dan protein sebagai akibat insufisiensi fungsi insulin.

Seseorang dikatakan menderita diabetes melitus jika kadar glukosa darah puasa lebih tinggi dari

126 mg/dL dan kadar glukosa darah 2 jam setelah makan lebih tinggi dari 200 mg/dL (Depkes

RI, 2005). Terdapat 2 tipe utama diabetes melitus, yaitu Insulin- Dependent Diabetes Mellitus

(IDDM) disebut juga diabetes melitus tipe 1 dan Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus

(NIDDM) yang disebut juga diabetes melitus tipe 2. Diabetes melitus tipe 1 terjadi karena

kekurangan insulin, sedangkan diabetes melitus tipe 2 terjadi karena insulin di dalam tubuh tidak

berfungsi dengan baik ((Wells et al., 2009).

Menurut Badan Kesehatan Dunia (WHO) jumlah penderita diabetes melitus di Indonesia

tergolong banyak, di mana pada tahun 2009 diperkirakan penderita diabetes melitus mencapai

mencapai 24 juta orang dan jumlah ini diperkirakan akan terus meningkat pada tahun yang akan

datang (Foster, 2006). Diabetes melitus yang tidak terkontrol dapat menyebabkan komplikasi

serius, terutama mengakibatkan kerusakan pada dinding pembuluh darah atau kapiler. Kerusakan

ini akan menyebabkan sumbatan yang bisa mengganggu aliran darah ke jaringan dan jika hal ini

berlangsung lama akan menyebabkan jaringan kekurangan oksigen hingga bisa berakibat fatal,

yaitu dapat menimbulkan kematian pada penderita (Darmono, 2005). Pengelolaan DM

memerlukan penanganan secara multidisiplin yang mencakup terapi non-obat dan terapi obat

(Soegondo, 2004).

Pada penderita diabetes melitus, fungsi insulin di dalam tubuhnya terganggu. Insulin

adalah hormon yang diproduksi oleh sel-sel beta pankreas dan memiliki fungsi penting dalam

tubuh. Insulin berfungsi untuk mengatur metabolisme glukosa menjadi energi dan mengkonversi

glukosa darah menjadi glikogen untuk selanjutnya disimpan di hati dan sel otot (MedStar, 2010).

Akibat terjadinya insufisiensi insulin, maka kadar glukosa darah akan meningkat melebihi kadar

normalnya, sehingga menimbulkan penyakit sindrom metabolik, yaitu diabetes melitus (Nita,

2007).

Pengobatan diabetes melitus, terutama diabetes melitus tipe 1, hampir selalu melibatkan

penggunaan insulin yang diberikan kepada pasien melalui injeksi. Adapun fungsi insulin yang

disuntikkan tersebut adalah untuk mengembalikan fungsi insulin di dalam tubuh yang mengalami

gangguan (Depkes RI, 2005). Pada mulanya sumber insulin untuk terapi diabetes melitus pada

manusia diperoleh dari pankreas sapi atau babi. Insulin yang diperoleh dari sumber tersebut

efektif bagi manusia karena identik dengan insulin manusia. Insulin pada manusia, babi, dan sapi

mempunyai perbedaan dalam susunan asam aminonya, namun aktivitasnya tetap sama. Namun,

dengan semakin banyaknya penderita, penggunaan insulin sapi atau babi sebagai pengganti

insulin manusia menjadi kurang relevan dan efektif karena harus tersedia banyak sapi atau babi

agar dapat diambil insulinnya, di mana insulin yang diekstraksi dari 1 babi hanya cukup untuk 1

orang selama 3 hari, padahal saat ini jumlah penderita diabetes melitus yang tergantung insulin

diperkirakan ada 60 juta orang di seluruh dunia dan jumlah tersebut diduga akan meningkat 5-6

% tiap tahunnya (Almazini, 2010).

Penggunaan insulin dari hewan untuk memenuhi kebutuhan insulin pada manusia dapat

menimbulkan dua masalah. Pertama, adanya perbedaan kecil dalam asam amino penyusunnya

dapat menimbulkan efek samping berupa alergi pada beberapa penderita. Kedua, memerlukan

prosedur pemurnian yang kompleks dan cemaran berbahaya dari hewan tidak selalu dapat

dihilangkan dengan sempurna. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, maka digunakan aplikasi

mikroorganisme dalam pembuatan insulin, yaitu melibatkan vektor bakteri Escherichia coli yang

telah dilemahkan melalui penerapan teknik DNA rekombinan atau teknik rekayasa genetika.

Dalam pembuatan insulin modern ini, gen insulin manusia diambil dari pulau Langerhans

pankreas manusia, kemudian disambungkan ke dalam plasmid bakteri, hingga membentuk

kimera (DNA rekombinasi). Kimera tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam sel target E. coli.

Bakteri E. coli yang telah mengandung DNA rekombinasi kemudian dikultur untuk

dikembangbiakkan (Rosalia, 2010). Insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek samping

yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang diperoleh dari ekstrak pankreas

hewan, tidak menimbulkan efek alergi, dan tidak mengandung kontaminan berbahaya (Wijaya,

2009). Selain itu, dengan rekayasa genetika pada E. coli, peneliti dapat memproduksi insulin

secara tidak terbatas dan tanpa tergantung pada hewan (Anonim, 2011). Pentingnya peranan

mikroorganisme di bidang kesehatan, terutama dalam pembuatan insulin di tengah banyaknya

insidensi diabetes melitus, menjadi faktor pendorong penyusunan makalah ini.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah tahapan pembuatan insulin dengan menggunakan bakteri E.coli melalui

teknik DNA rekombinan ?

2. Apa saja parameter-parameter yang harus diperhatikan dalam pembuatan insulin ?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui tahapan pembuatan insulin dengan menggunakan bakteri E.coli

melalui teknik DNA rekombinan.

2. Untuk mengetahui parameter-parameter yang harus diperhatikan dalam pembuatan

insulin.

1.4 Manfaat

1. Memperluas pengetahuan mahasiswa mengenai cara pembuatan insulin dengan

memanfaatkan mikroba melalui teknik DNA rekombinan, sehingga dapat diaplikasikan

dalam bidang kesehatan.

2. Mengetahui parameter yang harus diperhatikan ketika akan memproduksi insulin,

sehingga nantinya akan dapat dihasilkan produk sesuai dengan yang diinginkan dan dapat

meminimalisasi kerugian dalam proses produksinya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikrobiologi Industri

Mikrobiologi industri atau bioteknologi mikroorganisme adalah usaha memanfaatkan

mikroba sebagai komponen industri atau melibatkan mikroba dalam proses industri. Beberapa

tahun terakhir ini mikrobiologi industri sudah diperbaharui dengan adanya penambahan teknik

rekayasa genetika. Mikrobiologi industri awalnya dimulai dengan proses fermentasi alkohol,

seperti pada pembuatan “beer” dan “wine” (minuman dibuat dari buah anggur). Selanjutnya,

Proses mikrobial dikembangkan untuk produksi bahan farmasi seperti antibiotika, produksi

makanan tambahan seperti asam amino, serta produksi enzim, dan produksi industri kimia seperti

butanol dan asam sitrat. Semua proses industri yang digambarkan sudah membuktikan

kemampuan suatu mikroorganisme. Namun sekarang, dengan hadirnya teknologi gen kita berada

dalam era baru bioteknologi mikroorganisme (Zaenab, 2009). Teknologi gen memungkinkan

suatu pendekatan baru secara lengkap terhadap bioteknologi mikroorganisme yang menggunakan

mikroorganisme hasil rekayasa genetika untuk menghasilkan suatu substansi atau bahan yang

secara normal tidak dapat dihasilkan. Sebagai contoh, proses pembuatan hormon insulin,

dikembangkan dengan menyisipkan gen insulin manusia ke dalam suatu bakteri. Bioteknologi

mikroorganisme dapat dipisahkan menjadi dua fase yang berbeda, yaitu :

1. Teknologi mikroorganisme tradisional, yang melibatkan pembuatan produk berskala

besar oleh mikroorganisme yang dilakukan secara normal melalui proses fermentasi.

Dalam proses bioteknologi ini, ahli mikrobiologi pada awalnya memodifikasi organisme

atau proses sehingga produk yang diharapkan dapat diperoleh dalam jumlah yang

terbanyak.

2. Teknologi mikroorganisme dengan rekayasa genetika, yang melibatkan penggunaan

mikroorganisme yang sudah diberi sisipan gen asing. Dalam bioteknologi baru ini, ahli

mikrobiologi industri bekerja secara teliti dengan teknik rekayasa genetika dalam

mengembangkan mikroorganisme yang sesuai, sehingga dalam hal ini mikrooganisme

tidah hanya dapat menghasilkan produk yang menarik tetapi juga dapat dibiakkan dalam

skala besar yang dibutuhkan secara komersial.

Mikrobiologi industri mencakup pengkajian tentang sifat dan peranan mikroorganisme

dalam bidang industri, baik industri makanan maupun farmasi. Penggunaan mikroroganisme

dalam industri pengolahan bahan makanan ditujukan untuk meningkatkan kualitas makanan dan

mencegah kerusakan bahan pangan.Penggunaan mikroorganisme dalam dunia kedokteran dan

farmasi ditujukkan untuk menggali obat-obatan baru yang memiliki daya antimikroba yang

tinggi, serta ditujukkan untuk mencegah berbagai penyakit dengan pembuatan vaksin dan

antibodi. Perkembangan baru dalam bidang rekayasa genetika menghasilkan produk-produk baru

untuk proses industri, terutama dalam bidang kedokteran dan farmasi, seperti produksi hormon,

antibodi, zat antikanker, dan sebaginya (Kusnadi, 2005; Zaenab, 2009).

2.2 Syarat Mikrobioorganisme Industri

Selain harus mampu menghasilkan substansi yang menarik, mikroorganisme yang

dianggap layak untuk digunakan dalam industri juga harus tersedia sebagai biakan murni, sifat

genetiknya harus stabil, dan tumbuh dalam biakan berskala-besar. Biakan juga harus dapat

dipelihara dalam periode waktu yang sangat panjang di laboratorium dan dalam ‘plant’ industri.

Karakteristik penting yang harus dimiliki mikroorganisme industri yaitu harus tumbuh cepat dan

menghasilkan produk yang diharapkan dalam waktu yang relatif singkat, karena alasan sebagai

berikut :

1. Alat-alat yang digunakan pada industri berskala besar termasuk mahal, hal tersebut tidak

menjadi masalah (secara ekonomi) jika produk dapat dihasilkan dengan cepat

2. Jika mikroorganisme tumbuh dengan cepat, maka kontaminasi fermentor akan berkurang

3. Jika mikroorganisme tumbuh dengan cepat, maka akan lebih mudah mengendalikan

berbagai faktor lingkungan dalam fermentor.

Sifat penting lain yang harus dimiliki mikroorganisme industri antara lain :

1. Tidak berbahaya bagi manusia, dan secara ekonomik penting bagi hewan dan tumbuhan

2. Harus nonpatogen dan bebas toksin, atau jika menghasilkan toksin, harus dapat cepat

diinaktifkan.

3. Mudah dipindahkan dari medium biakan. Di laboratorium, sel mikroorganisme pertama

kali dipindahkan dengan sentrifugasi, tetapi sentrifugasi bersifat sulit dan mahal untuk

industri skala-besar.

4. Mikroorganisme lebih disukai jika berukuran besar, karena sel lebih mudah dipindahkan

dari biakan dengan penyaringan (dengan bahan penyaring yang relatif murah). Karena

alasan ini, fungi, ragi, dan bakteri berfilamen, lebih disukai untuk digunakan dalam

mikrobiologi industri.

5. Terakhir, mikroorganisme harus dapat direkayasa secara genetik. Dalam bioteknologi

mikroorganisme tradisional peningkatan hasil diperoleh melalui mutasi dan seleksi.

Mutasi akan lebih efektif untuk mikroorganisme dalam bentuk vegetatif, haploid, dan

bersel satu. Pada organisme diploid dan bersel banyak, mutasi yangdilakukan pada salah

satu genom tidak akan menghasilkan mutan yang mudah diisolasi. Untuk fungi

berfilamen, lebih disukai yang menghasilkan spora, karena filamen tidak mampu

mempermudah rekayasa genetika. Organisme juga diharapkan dapat direkombinasi

secara genetik. Rekombinasi genetik memungkinkan penggabungan genom tunggal sifat

genetik dari beberapa organisme. Teknik yang sering digunakan untuk menciptakan

hibrid, bahkan tanpa siklus seksual adalah fusi/penggabungan protoplasma.

(Zaenab, 2009).

2.3 Escherichia coli

Klasifikasi Escherichia coli :

Divisio : Protophyta

Kelas : Shizomycetes

Ordo : Eubacteriaceae

Famili : Enterobacteriaceae

Suku : Escherichiaeae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Gambar 2.1 Bakteri Gram Negatif, Escherrichia coli, Penghuni Alami Saluran

Pencernaan Manusia (Sumber : Rosalia, 2010; Yalun. 2008).

Escherichia coli yang ditemukan oleh Theodor Escherich pada tahun 1886 merupakan

salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. E. coli yang hidup di dalam usus besar manusia

termasuk ke dalam keluarga Enterobacteriaceae. Enterobacteriaceae merupakan kelompok

bakteri batang gram negatif yang heterogen, dengan habitat alami di saluran intestinal manusia

dan binatang. Escherichia coli merupakan bakteri yang berbentuk batang pendek (kokobasil),

gram negatif, tidak berkapsul, umumnya mempunyai fimbiria, dan bersifat motil. Bakteri E. coli

memiliki ukuran panjang ± 1-3 µm dan lebar ± 0,4-0,7 µm (Pelczar dkk, 2005).

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet

ketika dilakukan proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan

mikroskop. Dinding sel bakteri gram negatif memiliki struktur yang lebih kompleks

dibandingkan bakteri gram positif, di mana pada bakteri gram negatif dinding selnya tersusun

atas membran luar, peptidoglikan, dan membran dalam. Kurang lebih 1% dinding sel bakteri

gram negatif terdiri dari peptidoglikan. Peptidoglikan berfungsi untuk mencegah lisis sel di

dalam media hipotonis, sehingga menyebabkan sel menjadi kaku dan memberi bentuk kepada

sel. Membran luar bakteri E. coli terdiri atas lipida amfifatik, lipopolisakarida, dan protein.

Bagian proteinnya terutama terdiri dari protein porin yang berperan dalam jalur pengangkutan

dan sekaligus sebagai perintang bagi molekul-molekul yang akan melewati membran sebelah

luar (Feriyanto, 2009). Struktur membran luar bakteri E. coli mirip dengan struktur membran sel.

Hal yang membedakan kedua membran tersebut adalah membran luar terdiri atas fosfolipid pada

lapisan dalam dan lipopolisakarida pada lapisan luar, sementara pada membran sel terdiri atas

dua lapis fosfolipid (Anonim, 2010).

Gambar 2.2 Dinding Sel Bakteri Gram Negatif (Sumber : Anonim, 2010).

E. coli pada umumnya diketahui hidup secara normal pada alat pencernaan. Namun, E.

coli juga dapat bersifat oportunis dengan menyebabkan penyakit pada manusia apabila jumlah E.

coli terlalu banyak atau berada di luar usus, misalnya pada infeksi saluran kemih dan infeksi luka

(Hardiansyah dan Rimbawan, 2001). E.coli mempunyai antigen O, H, dan K. Pada saat ini telah

ditemukan sekitar 150 tipe antigen O, 90 tipe antigen K, dan 50 tipe antigen H. E. coli memiliki

waktu generasi yang cukup singkat yaitu berkisar 15-20 menit (Pratiwi, 2008).

Bakteri yang secara tipikal mesofilik ini dapat tumbuh pada rentang suhu sekitar 7-50ºC,

dengan suhu optimum 37ºC; dan pada rentang pH 4,4-8,5. Bakteri E. coli tidak bisa bertahan

pada tempat yang kering dan akan mati pada suhu 60ºC selama 30 menit. Bila dilihat dibawah

mikroskop maka kumpulan E. coli berwarna merah, sedangkan secara makroskopik terlihat kilau

metalik disekitar media (Tim Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003).

Escherichia coli relatif peka terhadap panas, di mana bakteri ini akan segera hancur oleh

suhu pasteurisasi dan pemanasan. Proses pembekuan (0ºC) tidak akan dapat membunuh bakteri

ini, sehingga E.coli dapat hidup dalam suhu yang rendah dalam jangka waktu yang relatif

panjang. Pembekuan dalam freezer, yaitu pada suhu 0ºC dapat menghambat pertumbuhan

bakteri, tetapi tidak membunuh bakteri. Namun pengaruh pembekuan dalam deep freezer storage

pada suhu -17,8ºC sampai -34,4ºC atau kurang dari -10ºC dapat menurunkan jumlah populasi

E.coli secara drastis dan mematikan bakteri ini secara perlahan (Pratiwi, 2008).

Hampir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi dan mikrobiologi industri selalu

melibatkan E. coli karena bakteri ini memiliki struktur genetik yang sederhana dan mudah untuk

direkayasa. Bakteri ini juga merupakan media kloning yang paling sering dipakai, terutama

dalam teknik DNA rekombinan. Banyak industri kimia mengaplikasikan teknologi fermentasi

yang memanfaatkan E. coli misalnya dalam produksi obat-obatan (insulin, antiobiotik) dan

bahan kimia berniali tinggi (1-3 propanediol, laktat). Secara teoritis, ribuan jenis produk kimia

dapat dihasilkan dengan cara melakukan rekayasa genetika yang sedemikian rupa pada bakteri

ini guna menghasilkan jenis produk tertentu yang diinginkan. Jika mengingat besarnya peranan

ilmu bioteknologi dalam aspek-aspek kehidupan manusia, maka tidak bisa dipungkiri juga betapa

besar manfaat E. coli bagi kita (Yalun, 2008).

Salah satu peranan E. coli di bidang kesehatan adalah sebagai bahan dalam pembuatan

insulin untuk pengobatan diabetes mellitus melalui proses rekayasa genetika atau teknik DNA

rekombinan. Ketika E. coli bereproduksi, gen insulin akan direplikasi bersama dengan plasmid

bakteri. Beberapa alasan penggunaan E. coli dalam pembuatan insulin antara lain :

- E. coli memiliki rentang umur pendek

- Jumlah generasinya banyak

- Susunan genetiknya mudah dimodifikasi

- Lingkungan luar E. coli dapat dengan mudah dimodifikasi untuk mempengaruhi ekspresi

gen

- Menghasilkan produk yang hampir mendekati dengan yang diinginkan (menyerupai

insulin yang dihasilkan sel pankreas).

(Rosalia, 2010).

2.4 Diabetes Melitus

Diabetes melitus (DM) adalah serangkaian penyakit terkait di mana tubuh tidak dapat

mengatur jumlah gula (secara spesifik, glukosa) dalam darah. Diabetes melitus adalah gangguan

metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia yang berhubungan dengan abnormalis

karbohidrat, lemak, dan protein yang disebabkan oleh penurunan sekresi insulin, atau keduanya

dan menyebabkan komplikasi kronis mikrovaskular, makrovaskular, dan neuropati

(Sukandar,dkk., 2008). Seseorang dikatakan menderita diabetes melitus jika kadar glukosa darah

puasa lebih tinggi dari 126 mg/dL, kadar glukosa darah 2 jam setelah makan lebih tinggi dari 200

mg/dL, dan nilai HbA1c ≥ 8%. Jika kadar glukosa 2 jam setelah makan > 140 mg/dL tetapi lebih

kecil dari 200 mg/dL dinyatakan glukosa toleransi lemah (Depkes RI, 2005)

Berdasarkan klasifikasi dari WHO, diabetes mellitus dibagi menjadi beberapa tipe, yaitu :

a. Diabetes mellitus tipe 1, Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM) yang dahulu dikenal

dengan nama Juvenil Onset Diabetes (JOD), yaitu tipe diabetes mellitus di mana pasien

tergantung pada pemberian insulin untuk mencegah terjadinya ketoasidosis dan

mempertahankan hidup. Biasanya pada anak-anak atau usia muda dapat disebabkan karena

keturunan. Sering disebut diabetes tergantung insulin dan diabetes–mulai kecil, di mana

tubuh tidak dapat memproduksi insulin atau memproduksi insulin hanya dengan jumlah

yang sedikit. Gejala yang timbul biasanya datang secara tiba-tiba, terutama pada individu

yang berumur dibawah 20 tahun. Diabetes tipe 1 digolongkan sebagai penyakit kekebalan

tubuh karena sistem kekebalan tubuh (sistem yang terdiri dari organ, jaringan dan sel yang

membunuh organisme dan membuang zat-zat yang menimbulkan penyakit) menyerang dan

menghancurkan sel yang menghasilkan insulin, yang dikenal sebagai sel beta dalam pulau

Langerhans di pankreas.

b. Diabetes mellitus tipe 2, Non Insulin Dependen Diabetes Mellitus (NIDDM), yang dahulu

dikenal dengan nama Maturity Onset Diabetes (MOD). Diabetes tipe 2 ini disebabkan

karena kurangnya produksi insulin dari sel beta pankreas, tetapi biasanya akibat resistensi

aksi insulin pada jaringan perifer. Diabetes ini biasanya terjadi pada orang tua (umur lebih

40 tahun) atau anak dengan obesitas. Pada diabetes tipe ini, kemampuan tubuh untuk

menyelaraskan antara insulin yang dihasilkan dengan kemampuan sel untuk menggunakan

insulin menjadi buruk. Karakteristik gejala yang ditimbulkan pada tipe 2 sama seperti gejala

yang terjadi pada tipe 1, termasuk infeksi yang berulang atau luka di kulit yang lama

sembuh atau tidak sama sekali, kelelahan dalam arti umum, dan kesemutan atau rasa kebal

di tangan dan kaki.

Tabel 1. Perbedaan Diabetes Melitus Tipe I dan Tipe II

Diabetes Mellitus tipe 1 Diabetes Mellitus tipe 2

Penderita menghasilkan sedikit insulin atau

sama sekali tidak menghasilkan insulin

Pankreas tetap menghasilkan insulin, kadang

kadarnya lebih tinggi dari normal. Tetapi tubuh

membentuk kekebalan terhadap efeknya,

sehingga terjadi kekurangan insulin relatif

Umumnya terjadi sebelum usia 30 tahun, yaitu

anak-anak dan remaja.

Bisa terjadi pada anak-anak dan dewasa, tetapi

biasanya terjadi setelah usia 30 tahun

Para ilmuwan percaya bahwa faktor lingkungan

(berupa infeksi virus atau faktor gizi pada masa

kanak-kanak atau dewasa awal) menyebabkan

sistem kekebalan menghancurkan sel penghasil

insulin di pankreas. Untuk terjadinya hal ini

diperlukan kecenderungan genetik.

Faktor resiko untuk diabetes tipe 2 adalah

obesitas dimana sekitar 80-90% penderita

mengalami obesitas. Tipe 2 merupakan suatu

proses jangka panjang dalam tubuh dimana pola

hidup dan pola makan yang salah membuat

organ tubuh menjadi rusak, dan tidak mampu

berfungsi baik lagi.

90% sel penghasil insulin (sel beta) mengalami

kerusakan permanen. Terjadi kekurangan insulin

yang berat dan penderita harus mendapatkan

suntikan insulin secara teratur

Diabetes Mellitus tipe 2 juga cenderung

diturunkan secara genetik dalam keluarga

c. Diabetes melitus tipe lain.

1.) Diabetes melitus akibat beberapa sebab, seperti kelainan pankreas, kelainan

hormonal, diabetes karena obat/zat kimia, kelainan reseptor insulin, kelainan

genetik dan lain-lain.

2.) Diabetes melitus akibat obat-obat yang dapat menyebabkan hiperglikemia, antara

lain furosemid, diuretik tiazid, glukortikoid, dan asam hidotinik.

3.) Diabetes Gestasional (diabetes kehamilan) akibat intoleransi glukosa selama

kehamilan. Diabetes ini terjadi karena pada pertengahan kehamilan sekresi hormon

pertumbuhan dan Hormon Chorionik Somatomamotropin (HCS) meningkat

Hormon ini meningkat untuk mensuplai asam amino dan glukosa ke fetus,

sehingga kadar glukosa darah menjadi meningkat.

2.5 Insulin

Sejarah peneluan insulin diawali pada tahun 1891, di mana Frederick Banting yang lahir

di Alliston, Ontario dan lulusan sekolah kedokteran Universitas Toronto pada 1916 mulai

tertarik mempelajari diabetes setelah melakukan pelayanan pada perang dunia I. Pada tahun

1919, Musa Barron, seorang peneliti dari Universitas Minnesota, menunjukkan penyumbatan

saluran yang menghubungkan dua bagian utama dari pankreas menyebabkan pengkerutan dari

kedua jenis sel. Banting percaya bahwa dengan mengikat duktus pankreas dapat menghancurkan

sel-sel asinar, dia bisa menjaga hormon dan ekstrak dari sel-sel islet (Anonim, 2011).

Awal Mei 1921, Banting dan Best megikat saluran pankreas pada anjing sehingga sel-sel

asinar akan atrofi, kemudian menghilangkan pankreas untuk mengekstrak cairan dari sel-sel islet.

Sementara itu, mereka menghilangkan pankreas dari anjing lain untuk menyebabkan diabetes,

kemudian disuntikkan cairan sel islet. Pada bulan Januari 1922, 14 tahun Leonard Thompson

menjadi manusia pertama yang berhasil mengobati diabetes dengan menggunakan insulin

(Anonim, 2011).

Pada 1980-an, peneliti menggunakan rekayasa genetika untuk memproduksi insulin

manusia. Pada tahun 1982, Perusahaan Eli Lilly menghasilkan insulin manusia yang menjadi

produk farmasi pertama yang dihasilkan dengan rekayasa genetika yang disetujui. Dengan

rekayasa genetika, peneliti dapat memproduksi insulin secara tidak terbatas dan tanpa tergantung

pada hewan. Menggunakan insulin yang berasal dari hewan juga menimbulkan kekhawatiran

terkait dengan terjadinya perpindahan penyakit yang potensial dari hewan ke manusia (Anonim,

2011). Menurut Eli Lilly Corporation, pada tahun 2001 sebanyak 95% pengguna insulin di

seluruh dunia menggunakan insulin manusia yang dibuat dengan rekayasa genetika dan saat ini

sebagian besar perusahan telah berhenti membuat insulin dari hewan, dan beralih ke sintesis

insulin manusia dan analog insulin dengan rekayasa genetika (Anonim, 2011).

Insulin merupakan suatu polipeptida yang mengandung dua rantai asam amino yang

dihubungkan oleh jembatan disulfida. Hormon ini disintesa di dalam retikulum endoplasma kasar

sel B pankreas, kemudian ditranspor ke apparatus golgi untuk dipaket dalam bentuk granul-

granul, yang bergerak ke membran sel dan akhirnya kandungan granul dilepaskan dengan cara

eksositosis. Insulin kemudian melewati laminal basal sel B dan kapiler dan fenestrata endotel

kapiler untuk mencapai aliran darah Insulin disintesa sebagai bagian dari preprohormon. Dosis

insulin dinyatakan dalam unit (U). Sediaan homogen human insulin mengandung 25-30 UI/mg.

Insulin diberikan secara subkutan dengan tujuan mempertahankan kadar gula darah dalam batas

normal sepanjang hari yaitu 80-160 mg% setelah makan. Untuk pasien usia di atas 60 tahun

batas ini lebih tinggi yaitu puasa kurang dari 150 mg% dan kurang dari 200 mg% setelah makan.

Insulin dapat segera diberikan dalam keadaan dekompensasi metabolik berat, misalnya

ketoasidosis, stress berat, berat badan yang menurun dengan cepat, adanya ketonuria

(Dinar,2009).

Peranan insulin sebagai hormon yang memodulasi ambilan glukosa secara umum telah

banyak diketahui. Dalam kaitan dengan fungsi kardiovaskular, ternyata insulin juga memiliki

peran penting dalam kondisi kardiovaskularm baik kondisi yang sehat maupun sakit. Insulin

berperan dalam penggunaan glukosa oleh sel tubuh untuk pembentukan energi. Apabila tidak ada

insulin maka sel tidak dapat menggunakan glukosa, sehingga proses metabolisme menjadi

terganggu. Proses pembentukan energi yang difasilitasi oleh insulin terjadi sebagai berikut.

Karbohidrat dimetabolisme oleh tubuh untuk menghasilkan glukosa, glukosa tersebut selanjutnya

diabsorbsi di saluran pencernaan menuju ke aliran darah untuk dioksidasi di otot skelet sehingga

menghasilkan energi. Glukosa juga disimpan dalam hati dalam bentuk glikogen kemudian

diubah dalam jaringan adiposa menjadi lemak dan trigliserida. Insulin akan meningkatkan

pengikatan glukosa oleh jaringan, meningkatkan level glikogen dalam hati, mengurangi

pemecahan glikogen (glikogenolisis) di hati, meningkatkan sintesis asam lemak, menurunkan

pemecahan asam lemak menjadi badan keton, dan membantu penggabungan asam amino

menjadi protein. Insulin merupakan protein kecil dengan BM 5808 pada manusia mengandung

51 asam amino yang tersusun dalam 2 rantai (A dan B) yang terhubung oleh jembatan disulfida,

di mana terdapat perbedaan spesies dalam dua rantai tersebut (Depkes RI, 2005).

Gambar 2.3 Struktur Kimia Insulin

Struktur kimia insulin :

Insulin merupakan polipeptida yang terdiri dari 2 rantai, yaitu rantai A dan rantai B

Rantai A terdiri dari 21 asam amino, rantai B terdiri dari 30 asam amino

Kedua rantai trsebut dihubungkan oleh jembatan disulfida, yaitu pada A7 dengan B7 dan

pada A20 dengan B19. Ada pula jembatan disulfida intra rantai pada rantai A yaitu pada

A6 dan A11. Posisi ketiga jembatan tersebut selalu tetap.

Kadang terjadi substitusi asam amino terutama pada rantai A posisi 8, 9, 10 namun tidak

mempengaruhi bioaktivitas rangkaian tesebut (Depkes RI, 2005).

2.6 Teknologi DNA Rekombinan

DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara

menyisipkan molekul DNA ke dalam suatu vektor, sehingga memungkinkannya untuk

terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan

sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan juga disebut sebagai rekayasa genetika atau

kloning gen. Prinsip dasar teknologi rekayasa genetika adalah memanipulasi atau melakukan

perubahan susunan asam nukleat dari DNA (gen) atau menyelipkan gen baru ke dalam struktur

DNA organisme penerima. Gen yang diselipkan dan organisme penerima dapat berasal dari

organisme apa saja. Pada proses rekayasa genetika organisme yang sering digunakan adalah

bakteri Escherichia coli. Bakteri Escherichia coli dipilih karena paling mudah dipelajari pada

taraf molekuler. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama,

dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan

tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan

diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada

produksi secara konvensional (Anonim, 2009).

Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama, yaitu :

1. Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisipkan, biasanya berupa plasmid, yaitu

lingkaran kecil AND yang terdapat pada bakteri. Plasmid diambil dari bakteri dan disisipi

dengan gen asing.

2. Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh bakteri akan

mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak plasmid yang direplikasi

makin banyak pula gen asing yang dicopy sehingga terjadi cloning gen.

3. Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim ini disebut enzim

endonuklease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu enzim endonuklease yang dapat

memotong ADN pada posisi dengan urutan basa nitrogen tertentu (Wijaya, 2009).

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui

teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan

tersebut antara lain isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul

DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan

fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan,

transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, dan seleksi rekombinan.

Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat

dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun

dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel.

Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium

bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan

deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada

eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus.

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya

pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi

menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan

dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein

dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse

untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian

dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi

kerapatan menggunakan CsC.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik

maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam

molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada

umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk

covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan

kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut

menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan

dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan

DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya

serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-

sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit

daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan

demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA

kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat

dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

Enzim Restriksi

Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik

maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya

sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi

virus atau bakteriofag lambda (λ). Virus λ digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli,

yakni strain K dan C. Jika λ yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut

dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh λ progeni

(keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi

pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke

strain C adalah 1. Namun, jika λ yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi

strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan λ progeni sebanyak

1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, λ yang diisolasi dari strain K

mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain

C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.

Pada waktu bakteriofag λ yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul

DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi

lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai

sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan

tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi

tersebut.

DNA bakteriofag λ yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus

infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim

restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir

putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag λ yang diinfeksikan dari strain K ke

strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.

Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.

Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA

baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.

Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini

dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak

enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.

Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan

ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim

tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari

475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah

menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe

II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut :

- Dapat mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa

di dalam molekul DNA

- Dapat memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat

tempat pengenalannya

- Menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Ligasi Molekul - molekul DNA

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus

menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA

genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah

berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA

secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi

menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau

lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan

untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket

maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu

pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal

homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan,

yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini

ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak

stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu,

ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang

diperpanjang (sering kali hingga semalam).

Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,

khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang

telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas

akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan

beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml),

perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’

pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor,

atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal

homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.

Transformasi Sel Inang

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik

dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan

teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA

genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA

rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak

dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul

DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak

terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini

dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu

setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A.

Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa

spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis

telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan

untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi

prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA

genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan melalui perantara

vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli.

Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid

(CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag λ.

Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang

diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi

tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu

0 hingga 5ºC. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang

diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan

frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah

efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.

Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaknya

transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel

bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya

sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan

membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel.

Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan.

Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan,

maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa

DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA

rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya

membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan,

yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang

dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor

rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan

antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel

inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa

kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan

kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang

hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan

bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui

cara yang dinamakan hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran

nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal

tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan

pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi

koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni

sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

(Sumarsih, 2010).

BAB III

PEMBAHASAN

3.1 Proses Pembuatan Insulin

Mensintesis insulin manusia adalah proses biokimia dengan banyak tahapan yang

tergantung pada teknik dasar DNA rekombinan dan pemahaman dari gen insulin. DNA berisikan

petunjuk tentang bagaimana tubuh bekerja dan satu segmen kecil DNA dari gen insulin akan

mengkode protein insulin. Pada dasarnya, proses produksi insulin dengan menggunakan bakteri

E. coli melalui teknik DNA rekombinan atau rekayasa genetika terdiri dari 5 tahapan sebagai

berikut.

a. Mengisolasi DNA insulin dan DNA plasmid

Isolasi DNA atau RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa

genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Isolasi DNA kromosom ataupun DNA

plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel; lisis dinding dan membran

sel; ekstraksi dalam larutan; purifikasi; dan presipitasi. Ketelitian dan kecermatan dalam

pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid.

Terdapat 3 langkah dalam pengisolasian bakteri, yaitu :

- Langkah pertama adalah dengan menumbuhkan sel bakteri yang mengandung plasmid

rekombinan untuk mendapatkan DNA plasmid. Setelah itu sel dipanen, dinding serta

membran sel dipecah, sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak ini kemudian

dipurifikasi.

- Langkah kedua adalah teknik isolasi DNA plasmid dengan cara mensentrifungasi koloni

bakteri dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil dan

ditambahkan CIAA dengan perbandingan 1:1

- Langkah ketiga adalah melakukan prosedur digesti kromosom, plasmid, dan pUC19

dengan Eco RI

b. Memotong DNA insulin

Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti

pisau bedah biologi, yang dapat mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misalnya mengenali

rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan pasangan

basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari kromosom

sebuah organisme, sehingga dapat memproduksi insulin.

Apabila DNA asing dimasukkan ke dalam suatu inang E.coli, DNA itu mungkin diserang

oleh sistem restriksi yang aktif di dalam sel inang. Benang-benang panjang dan tipis yang

menyusun molekul DNA duplet cukup kokoh untuk dapat diputuskan dengan mudah oleh

kekuatan pengguntingan dalam larutan. Pengguntingan yang lebih terkendali dapat diperoleh

melalui sentrifugasi. DNA dengan berat molekul tinggi digunting menjadi suatu populasi

molekul dengan ukuran rata-rata sekitar 8 kb, dengan pengadukan berkecapatan 1500

putaran/menit selama 30 menit. Pemutusan terjadi secara acak dilihat dari segi urutan DNA.

c. Menggabungkan molekul DNA

Setelah mendeskripsikan metode yang mungkin dipakai untuk memotong molekul DNA

insulin, maka harus dipertimbangkan tentang cara bagaimana agar fragmen DNA insulin dapat

digabungkan dengan DNA plasmid untuk menciptakan molekul rekombinan buatan. Di sini

DNA ligase berperan untuk menggabungkan DNA plasmid dengan DNA insulin yang telah

dipotong sebelumnya. DNA ligase adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik

dan pengelas ujung nukleotida. E.coli dan fag T4 mengkode suatu enzim ligase DNA yang

menutup takik unting tunggal di antara nukleotida yang berdekatan dalam untai DNA duplet.

Temperatur optimum untuk ligase DNA yang bertakik adalah 370 C. Tetapi pada temperatur ini

penggabungan ikatan nitrogen antara ujung-ujung yang berdekatan tidak stabil.

Gambar 3.1 Pemotongan dan Penggabungan DNA

Langkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai DNA yang membawa

sekuens nukleotida spesifik yang sesuai dengan karakteristik rantai polipeptida A dan B dari

insulin. Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua

rantai telah dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai A

dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang menandakan

pengakhiran sintesis protein. Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian

ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam

amino sel bakteri itu. Gen sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam

gen untuk enzim bakteri, yaitu B-galaktosidase, yang selanjutnya dibawa ke dalam plasmid

vektor tersebut. Pada tahap ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik

kompatibel dengan B-galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke

dalam sel E. coli.

d. Memasukkan DNA ke dalam sel hidup (vektor)

Teknik memasukkan DNA ke dalam vektor meliputi 3 proses, yaitu pemotongan plasmid

maupun DNA manusia dengan menggunakan enzim restriksi yang sama; pencampuran fragmen

DNA manusia dengan plasmid yang telah dipotong; dan penambahan enzim ligase untuk

membentuk ikatan kovalen antara keduanya.

Gambar 3.2 Penyisipan DNA manusia ke dalam plasmid bakteri

e. Mengembangkan vektor dengan sisipan DNA yang direkayasa

Praktis penggunaan teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia

membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin dalam

rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersamaan dengan saat sel

mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.

Gambar 3.3 Perkembangbiakan Bakteri

Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu

rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-

galaktosidase dan dimurnikan.

Gambar 3.4 Penggabungan Rantai A dengan B-Galaktosidase

Kedua rantai dicampur dan dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk

jembatan silang disulfida, menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis).

Gambar 3.5 DNA Insulin

Secara umum, proses produksi insulin dengan vektor E. coli dijelaskan dalam skema berikut :

Gambar 3.6 Skema tahapan pembuatan insulin

Untuk dapat melakukan manufaktur insulin, maka produsen harus mengetahui urutan

yang tepat dari asam amino insulin. Produsen memasukkan asam amino insulin, dan mesin

sekuensing akan menghubungkan asam amino bersama-sama. Produsen memanipulasi prekursor

biologis terhadap insulin, sehingga dapat tumbuh di dalam bakteri sederhana, seperti E.coli.

Dalam mensintesis insulin juga diperlukan tangki besar untuk tempat pertumbuhan bakteri yang

berisi nutrisi yang diperlukan bagi bakteri untuk tumbuh. Beberapa instrumen yang diperlukan

untuk memisahkan dan memurnikan DNA seperti centrifuge, beberapa macam kromatografi dan

instrumen x-ray kristalografi (Anonim, 2011). Terdapat dua metode dasar untuk memproduksi

insulin manusia, yaitu:

1. Bekerja dengan insulin manusia

Gen insulin adalah suatu protein yang terdiri dari dua rantai asam amino yang

terpisah, dimana rantai A terletak di atas rantai B, yang terbentuk bersamaan dan

disatukan dengan suatu ikatan. Asam amino merupakan unit dasar yang membangun

semua protein. Insulin rantai A terdiri dari 21 asam amino dan rantai B memiliki 30

asam amino.

Sebelum menjadi sebuah protein insulin aktif, pertama kali insulin diproduksi

sebagai preproinsulin. Preproinsulin adalah protein tunggal rantai panjang dengan

rantai A dan B yang belum dipisahkan, di mana bagian tengah yang menghubungkan

kedua rantai dan urutan sinyal pada salah satu ujung protein sebagai penanda untuk

memulai mensekresi diluar sel. Setelah preproinsulin, rantai berevolusi menjadi

proinsulin. Proinsulin masih berupa rantai tunggal tetapi tanpa urutan sinyal.

Kemudian baru terbentuk insulin protein aktif, yaitu protein tanpa bagian yang

menghubungkan rantai A dan B. Pada setiap tahapan proses diperlukan protein

enzim yang spesifik (protein yang melaksanakan reaksi kimia) untuk menghasilkan

bentuk berikutnya dari insulin.

Memulai dengan rantai A dan B

Salah satu metode pembuatan insulin adalah untuk menumbuhkan dua rantai insulin

secara terpisah. Ini akan menghindari pembuatan masing-masing enzim khusus yang

dibutuhkan. Dalam hal ini, produsen membutuhkan dua mini-gen yang salah satunya

menghasilkan rantai A dan satunya lagi untuk menghasilkan rantai B. Karena urutan

DNA yang tepat dari masing-masing rantai telah diketahui, maka sintesis DNA dari

masing-masing mini gen dapat dilakukan di dalam mesin sekuensing asam amino.

Dua molekul DNA kemudian dimasukkan ke dalam plasmid dengan potongan

melingkar kecil DNA yang lebih mudah diambil oleh DNA inang.

Produsen memasukkan plasmid ke dalam jenis bakteri non-patogen, seperti E. coli.

Plasmid dimasukkan di samping gen lacZ. LacZ mengkode untuk 8-galaktosidase,

yaitu gen yang secara luas digunakan dalam proses DNA rekombinan karena mudah

ditemukan, dipotong, dan memungkinkan insulin dengan mudah dipisahkan dari

DNA bakteri. Selanjutnya disisipkan asam amino metionin untuk memulai

pembentukan protein.

Terbentuk rekombinan yang baru, kemudian plasmid dicampur dengan sel-sel

bakteri. Plasmid dimasukkan ke dalam bakteri dalam proses yang disebut transfeksi.

Produsen dapat menambah DNA ligase yaitu enzim yang bertindak sebagai perekat

untuk membantu menempelkan plasmid ke DNA bakteri.

Bakteri yang mensintesis insulin mengalami proses fermentasi. Mereka tumbuh pada

suhu yang optimal dalam tangki besar. Jutaan bakteri mereplikasi kira-kira setiap 20

menit melalui mitosis sel, dan masing-masing mengekspresikan gen insulin.

Setelah memperbanyak diri, sel-sel diambil dari tangki dan dipecah hingga terbuka

untuk mengekstrak DNA. Salah satu cara yang umum dilakukan adalah dengan

terlebih dahulu menambahkan campuran lysozome yang mencerna lapisan luar

dinding sel, kemudian menambahkan campuran deterjen yang memisahkan

membran dinding sel lemak. DNA bakteri ini kemudian ditambahkan sianogen

bromide yaitu, reagen yang memecah rantai protein pada residu metionin untuk

memisahkan rantai insulin dari sisa DNA.

Kedua rantai tersebut kemudian dicampur bersama-sama dan bergabung dengan

ikatan disulfida melalui reaksi reduksi-reoksidasi. Kemudian ditambahkan suatu

agen pengoksidasi (bahan yang menyebabkan oksidasi atau transfer elektron). Batch

kemudian ditempatkan dalam centrifuge, yaitu alat mekanik yang berputar cepat

untuk memisahkan komponen-komponen sel berdasarkan ukuran dan berat jenis.

Campuran DNA kemudian dimurnikan sehingga hanya tersisa rantai insulin.

Produsen dapat memurnikan campuran melalui beberapa kromatografi, atau teknik

pemisahan, yang mengeksploitasi perbedaan muatan molekul, ukuran, dan afinitas

terhadap air. Prosedur dapat menggunakan kolom pertukaran ion, kromatografi cair

kinerja tinggi reverse-fase, dan kromatografi kolom gel filtrasi. Produsen dapat

menguji batch insulin untuk memastikan tidak adanya protein bakteri E. coli yang

tercampur dengan insulin. Produsen biasanya menggunakan protein penanda yang

dapat mendeteksi DNA E. coli. Jika terdapat DNA bakteri, maka produsen akan

menentukan proses pemurnian lebih lanjut untuk menghilangkan.protein bakteri E.

coli (Anonim, 2011).

2. Proses Proinsulin

Pada tahun 1986, produsen mulai menggunakan metode lain untuk mensintesis

insulin manusia. Mereka mulai dengan prekursor langsung dari gen insulin, yaitu

proinsulin. Banyak tahapan yang sama seperti ketika memproduksi insulin dengan

rantai A dan B. Namun, dalam metode ini mesin mensintesis asam amino gen

proinsulin.

Urutan yang mengkode proinsulin dimasukkan ke bakteri non-patogen, seperti E.

coli. Bakteri kemudian melalui proses fermentasi di mana bakteri tersebut akan

mereproduksi dan menghasilkan proinsulin. Kemudian urutan rantai penghubung

antara A dan B disambung lagi dengan enzim dan insulin yang dihasilkan

dimurnikan.

Pada akhir proses manufaktur, ditambahkan bahan untuk mencegah pertumbuhan

bakteri dan membantu menjaga keseimbangan asam dan basa ke dalam insulin.

Juga ditambahkan bahan yang dapat mengatur aktivitas insulin, baik insulin

intermediate atau insulin long-acting untuk menghasilkan jenis insulin dengan

durasi yang diinginkan. Ini adalah metode tradisional untuk memproduksi insulin

long acting. Produsen akan menambahkan bahan tersebut ke dalam insulin murni

untuk memperpanjang aktivitas insulin, seperti seng oksida. Zat ini akan

memperrlambat di penyerapan dalam tubuh. Zat aditif ini bervariasi pada jenis

insulin yang sama dengan merk yang berbeda (Anonim, 2011).

Kontrol Kualitas Produksi

Setelah sintesis insulin manusia, struktur dan kemurnian dari batch insulin diuji melalui

beberapa metode yang berbeda. Kromatografi cair kinerja tinggi digunakan untuk menentukan

ada tidaknya kontaminan di dalam insulin. Teknik pemisahan lainnya, seperti X-ray kristalografi,

filtrasi gel, dan sekuensing asam amino. Produsen juga menguji kemasan botol untuk

memastikan bahwa produk telah disegel dengan benar.

Manufaktur untuk insulin manusia harus mematuhi prosedur National Institutes of Health

untuk operasi skala besar dan The United States Food and Drug Administration harus

menyetujui semua insulin yang diproduksi (Anonim, 2011).

3.2 Parameter yang Harus Diperhatikan

BAB III

PENUTUP

2.1 Kesimpulan

1. Proses pembuatan insulin manusia dengan menggunakan vektor E. coli melalui teknik

DNA rekombinan pada dasarnya terdiri dari 5 tahapan, yaitu mengisolasi DNA insulin

dan DNA plasmid, memotong DNA insulin, menggabungkan DNA insulin dan DNA

plasmid, memasukkan DNA ke dalam vektor, dan mengembangkan vektor dengan

sisipan DNA yang direkayasa

2.

2.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai metode atau alat yang harus

dikembangkan untuk memproduksi insulin secara optimal.

DAFTAR PUSTAKA

Almazini. 2010. Membuat Insulin Manusia dengan Teknik Rekombinan. (cited : 2011, November

9) Available at : http://myhealing.wordpress.com/2010/12/11/pembuatan-insulin-

manusia-dengan-teknik-dna-rekombinan/

Anonim. 2009. Rekayasa Genetika. (cited : 2011, November 11). Available at :

http://id.shvoong.com/exact-sciences/1999578-rekayasa-genetika/#ixzz1M2ZdfDMn

Anonim. 2011. Escherichia coli. (cited : 2011, November 10) Available at :

http://id.wikipedia.org/wiki.

Anonim. 2011. Insulin, (cited 2011 October, 30). Available from:

http://www.madehow.com/Volume-7/Insulin.html

Darmono, 2005. Komplikasi Diabetes Melitus. Jakarta : Penerbit Rineka Cipta.

Depkes RI. 2005. Pharmaceutical Care Untuk Penyakit Diabetes Melitus. Jakarta : Ditjen Bina

Kefarmasian dan Alat Kesehatan Depkes RI.

Dinar.2009. Pola penggunaan Obat Hipoglikemik Oral (oho) Pada Pasien Geriatri Diabetes

Mellitus Tipe 2 Di Instalasi Rawat Jalan RSUD dr. Moewardi Surakarta Periode Januari

– Juli 2008. Available at : http://etd.eprints.ums.ac.id/5233/1/K100050250.pdf

Feriyanto,N.2009. Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Buah Jeruk Keprok terhadap

Bakteri Escherichia coli dan Stapylococcus aureus. Skripsi. Surakarta : Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Foster, A. 2006. Antropologi Kesehatan. Jakarta : UI Press.

Hardiansyah dan Rimbawan, 2001. Analisis Bahaya dan Pencegahan Keracunan Pangan.

Jakarta : Pergizi Pangan.

Hermaulina. tt. Produksi Hormon Insulin dari Bakteri, (cited 2011 October, 29). Available

from: http://www.scribd.com/doc/49187370/Hermaulina-insulin-2

Kusnadi. 2005. Mikrobiologi Pangan dan Industri. (Cited “ 2011, November 10). Available at :

http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/196805091994031-

KUSNADI/KULIAH,MIKROBIOLOGI_PANGAN_DAN_INDUSTRI.pdf

MedStar. 2010. Insulin. Washington DC : Health The MedStar Diabetes Institute.

Nita, S. 2007. Karakteristik Penderita DM Rawat Inap di RSU Permata Bunda Medan Tahun

2005. Skripsi. Sumatera Utara : Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sumatera

Utara.

Pelczar dkk. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi II. Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia.

Pratiwi. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Bandung : Penerbit Erlangga.

Rosalia. 2010. Pembuatan Insulin Manusia dengan Teknik Rekombinan sebagai Salah Satu

Pengembangan Bioteknologi dalam Bidang Kesehatan. Banda Aceh : Universitas Syiah

Kuala Darussalam.

Soegondo dkk. 2004. Penatalaksanaan Diabetes Mellitus Terpadu. Jakarta : FKUI.

Sukandar, E. Y., R. Andrajati, J. Sigit, K. Adnyana, P. Setiadi, Kusnandar. 2008. ISO

Farmakoterapi. Jakarta : PT. ISFI Penerbitan.

Sumarsih. 2010. Teknologi DNA Rekombinan. (cited : 2011, November 11). Available at :

http://sumarsih07.files.wordpress.com/2010/02/teknologi-dna-rekombinan.pdf

Tim Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. 2003. Bakteriologi Medik.

Malang : Bayumedia Publishing.

Wijaya. 2009. Produksi Insulin Menggunakan Bakteri. (cited : 2011, November 9). Available at :

http://juharrywijaya.blogspot.com/2009/10/produksi-insulin-menggunakan-bakteri-e.html

Yalun. 2008. Mengenal Bakteri Escherichia coli. (cited : 2011, November 10). Available at :

http://yalun.wordpress.com/2008/10/07/mengenal-bakteri-escherichia-coli/

Zaenab. 2009. Mikrobiologi Industri. (cited : 2011, November 10). Availablke at :

http://keslingmks.files.wordpress.com/2009/01/mikrobiologi-industri.pdf