Cytomics, BCKK

臨床における臨床におけるフローサイトメーターの応用フローサイトメーターの応用

ベックマン・コールター株式会社

バイオメディカルリサーチ本部

測定原理の概略

臨床検査におけるFCM応用例

標準化と精度管理

Cytomics, BCKK

• 細胞や粒子の特性を調べる

• （光を当てた時に）細胞から出る光の強さを分析

• 散乱光強度 ----- 細胞の大きさや内部構造

• 蛍光強度　 -----　細胞の性状（予め試料を染色）

フローサイトメーター（フローサイトメーター（FCMFCM））

サイトミクスFC500

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FCMFCMが苦手なことが苦手なこと

⇒　共焦点レーザー顕微鏡　　　イメージサイトメーター　　　免疫組織化学染色などで解析　

分子の細胞内局在や移動の検出

組織の構造や細胞の位置関係の把握

鈴木，丹羽： MBL研究試薬誌より引用

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Flow Cytometer

・Flow 流れる・Cyto 細胞・-meter 測定機械（-metry　測定技術）

フローサイトメーター（フローサイトメーター（FCMFCM））

Flow Cytometry （フローサイトメトリー）

血球計数機と共通の起源（コールターカウンター；1953年）

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FCMFCMで測定可能なサンプルで測定可能なサンプル

• 粒子の懸濁液（細胞浮遊液）• 細胞（粒子）のサイズは0.3～40μm

• 血液の細胞（ヒト，動物）

• 他の組織の細胞

• 植物の細胞

• 微生物

• プランクトン

• ビーズ

汎用性

• サンプル処理が必要• 細胞分離、赤血球除去（溶血処理）

• 蛍光染色（免疫染色、核染色など）

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細胞表面マーカー（表面抗原）分析－ 免疫蛍光法 （蛍光抗体法）－

細胞表面マーカー（表面抗原）分析細胞表面マーカー（表面抗原）分析－－ 免疫蛍光法免疫蛍光法 （蛍光抗体法）－（蛍光抗体法）－

細胞固有の目印となる糖タンパク（マーカー分子）に結合する蛍光標識モノクローナル抗体で細胞を光らせる

細胞に目印を付ける

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ＣＤ番号ＣＤ番号細胞表面マーカーの国際名称細胞表面マーカーの国際名称

Cluster of Differentiation

集まり （細胞の）分化　

ヒト白血球分化抗原に関する国際会議（HLDA）

CD1a～CD247まで約300種類（第1回～第7回HLDA会議）

2004年12月に第8回HLDA会議開催

⇒CD339まで決定

FCMFCMの測定原理の測定原理

• サンプル浮遊液をフローセルに押し出す

• レーザー光を細胞が一個ずつ通過

レーザーレーザー

細胞細胞

• 細胞がレーザー光を通過する際に生じる散乱光と蛍光を光学フィルタで分別

• 細胞１個ごとに　散乱光と蛍光の　強さを解析

• 統計ヒストグラムデータを作り、　　プロットと計算結果を出力

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側方散乱 SS

（顆粒密度等）

MoGr

Ly前方散乱FS

（大きさ）

個々の細胞シグナルをヒストグラム解析個々の細胞シグナルをヒストグラム解析

レーザー

細胞

　個数（ドットの濃淡または等高線で表示）

２方向の散乱光 （白血球を分別）

蛍光

蛍光（抗原量など）

個数

蛍光陽性

Cytomics, BCKK

SS

FS

目的の細胞に解析ゲート設定（この例ではリンパ球領域）

ゲーティングゲーティング（特定の細胞に限定したデータ解析操作）（特定の細胞に限定したデータ解析操作）

目的とする細胞に正しくゲーティングすることが重要

蛍光強度

個数

強

ゲート：　リンパ球領域

抗体陽性リンパ球

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結果の判定（陽性率）結果の判定（陽性率）1パラメータ（1カラー）

ヒストグラムの高さ＝細胞数の多少

PE

FITC-/+

+/- +/+

-/-

2パラメータ（2カラー）

ドットの濃淡や等高線で細胞数の多少を表現

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ Ｙ

ＹＹ

Ｙ

ＹＹ

ＹＹダブルポジティブ

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蛍光ヒストグラムの解釈（＋とーの判定）蛍光ヒストグラムの解釈（＋とーの判定）

低　　　 　　　 高蛍光強度

細胞数

陰性 （弱）陽性 （強）陽性

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ

Ｙ Ｙ

ＹＹ

Ｙ

ＹＹ

ＹＹ

Ｙ

Ｙ

Ｙ

YＹＹ Ｙ

Ｙ

Ｙ

弱陽性（dim）の解釈

ポイント：　ヒストグラムの右側ほど蛍光強度が強い細胞　　　　　　　弱陽性（±）では陽性率が結果を正しく反映していない

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FCMFCMの（臨床）応用の（臨床）応用

• 細胞表面抗原や細胞内抗原による細胞解析

• リンパ球サブセット分析（リンパ球の働きを調べる）

• 白血病／リンパ腫フェノタイピング（白血病/リンパ腫細胞の由来を調べる）

• CD34陽性造血幹細胞測定（造血幹細胞移植をサポートする）

• 細胞周期（核DNA量）解析

• その他• 白血球機能の解析

• 抗血小板抗体などの検出

• アポトーシス検出

• 遺伝子発現解析

• 可溶性成分測定（ビーズアレイ）

• 細胞分取（セルソーティング）

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FCMFCM分析に用いられる臨床検体分析に用いられる臨床検体

• 末梢血

• 骨髄血

• リンパ節• 脳脊髄液、関節滑液などの組織液

• 肺気管支洗浄液

• 腹水、胸水

• 尿沈渣

• 病変部（腫瘍、炎症など）の組織

→ 固型組織は細胞を分散し浮遊液にする

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リンパ球サブセットの細胞機能に関連したマーカーが発現

BCD19CD19 CD20CD20

NKCD56CD56 CD16CD16

Th

CD3CD3

CD4CD4

CD2CD2CD5CD5CD7CD7

Tc

CDCD３３

CD8CD8

CD2CD2CD5CD5CD7CD7

リンパ球サブセット分析リンパ球サブセット分析リンパ球サブセット分析

各々の陽性率を指標に

疾患や病態に関連したサブセットの増減を調べる

（例：HIV感染症のCD4+リンパ球）

リンパ球

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リンパ球サブセット分析の臨床応用

HIV感染症リンパ球サブセット分析の臨床応用リンパ球サブセット分析の臨床応用

HIVHIV感染症感染症HIVがCD4陽性細胞に感染　→　ウィルス増殖に伴いCD4陽性リンパ球（ヘルパーT細胞）減少　→　免疫機能不全による日和見感染や発ガン（AIDS）　→　死亡

　　検査パラメータ　

・CD4リンパ球の比率（陽性率）

・CD4+細胞数

CD4のモニタリングで病態を把握

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白血病/リンパ腫タイピング（造血器悪性腫瘍細胞検査）

白血病白血病//リンパ腫タイピングリンパ腫タイピング（造血器悪性腫瘍細胞検査）（造血器悪性腫瘍細胞検査）

細胞型を細胞表面／細胞質内抗原（マーカー）で調べる

→　細胞系統（cell lineage）

　　分化段階（differentiation）

造血前駆細胞

造血幹細胞

T B NK

血小板

赤血球単球

リンパ球

顆粒球赤芽球

巨核球

マーカー発現プロファイルから

白血病／リンパ腫細胞の

細胞系統と分化段階を判断

Cytomics, BCKK

白血病白血病//リンパ腫タイピングに用いるマーカーの例リンパ腫タイピングに用いるマーカーの例

T細胞系CD1CD2CD3CD4CD5CD7CD8TCR

Ｂ細胞系CD19CD20CD22CD23CD79a

IgM(μ鎖)κ/λ(L鎖)

FMC7

骨髄系CD13CD14CD33CD34CD64CD65CD117MPO

その他CD10CD38CD56CD58

HLA-DRCD41/CD61

CD42bCD235a

白血病細胞のみが陽性となるマーカーはない

→ 複数のマーカーを組み合わせたパネルで細胞系統と分化段階を判断　　　　　　　

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急性白血病フェノタイピング急性白血病フェノタイピング

non-Ｔ細胞(B細胞)性　CD19+ cyCD79a+成熟B 　　　　 　 CD20+ sIgM+Pre-B 　　　　 　 CD10+ cyμ+Pro-B CD34+

骨髄性　　　　　　　　　　CD13 and/or CD33+ MPO+未分化・低分化 　　 CD34+単球系 　　CD4+ CD14+ CD64+前骨髄球（APL）　　 HLA-DR- （他のAMLは通常DR+）赤芽球系 　　 CD235a（Glycophorin-A）+巨核球系 　　 CD41+ CD61+

T細胞性 　　　　CD2+ CD5+ CD7+ cyCD3+成熟（末梢）Ｔ 　sCD3+中間（胸腺）Ｔ 　CD1a+Precursor-T CD34+

（下線は細胞質内マーカー）

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急性リンパ性白血病（急性リンパ性白血病（ALLALL））分析例分析例

CD19のみ陽性 → B細胞性ALL

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慢性骨髄性白血病急性転化（慢性骨髄性白血病急性転化（CMLCML--BCBC）分析例）分析例

CD10陽性CD13/CD33陰性 → （B）リンパ性急性転化（注：　慢性期のCMLはタイピングの対象外）

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急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病（AMLAML））分析例分析例

CD34（幹細胞マーカー）が強陽性　

⇒未分化な骨髄系細胞の可能性　

HLA-DR CD13

CD33 CD34

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Cytomics, BCKK

白血病白血病//リンパ腫でみられるリンパ腫でみられる

ユニークなマーカー発現ユニークなマーカー発現

①正常ではみられないマーカー発現の組み合わせ　　（アベラント・マーカー発現）

・ AML M2 with t(8;21) におけるCD19, CD56発現

・ Ph1+ALLにおけるCD66c発現　など

②非常にマイナーな細胞集団の腫瘍化

・ B細胞性CLLやMCLにおけるCD5発現　など

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悪性リンパ腫（悪性リンパ腫（MLML）分析例）分析例

CD5陽性のB細胞 → MCL

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成人成人TT細胞白血病（細胞白血病（ATLATL）分析例）分析例

典型的なATL細胞は

CD4+ CD8-

CD2+ CD3+ CD5+ CD7-

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BiphenotypicBiphenotypic Acute LeukemiaAcute Leukemia (BAL)(BAL)

同一の白血病細胞に異なる系統の抗原が発現

→　2カラーFCM分析で同定（ダブルポジティブ検出）

骨髄系抗原

リンパ系抗原

CD19+（B）

CD

33+（M

y）

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PanPan--Ｔ細胞ﾏｰｶｰの反応特異性Ｔ細胞ﾏｰｶｰの反応特異性

Ｂ細胞 NK細胞 顆粒球単球

Ｔ細胞

未熟 成熟

－ ＋ － － －CD3

CD2CD5CD7

＋ ＋

＋ ＋

＋ ＋

－ －

－ －

－

＋/－

－/＋

＋ －/＋

リンパ球サブセット分析と異なり、未熟なT細胞も分析対象となる白血病タイピングでは、CD3のみでは不十分

→ 複数のマーカーを分析し総合的に判断

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BiphenotypicBiphenotypic Acute Leukemia Acute Leukemia 鑑別スコアリングシステム鑑別スコアリングシステム((EGIL)EGIL)

Bene MC, et al.: Leukemia (1995) vol. 9, 1783-86.

ポイント B細胞系 T細胞系 骨髄細胞系

2

1

0.5

CD79a CD3 MPOIgM 　 TCR-α/β 　(Lysozyme)CD22 　　 TCR-γ/δCD19 CD2 CD13CD10 CD5 CD33CD20 CD8 CD65

CD10 CD117 TdT TdT CD14CD24 CD1a CD15

CD7 CD64

B細胞系，T細胞系のいずれかと骨髄細胞系が2ポイント以上であればBAL

Bene MC, et al. : Blood (1998) vol. 92: 596-599.

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ＦＣＭＦＣＭによるタイピングによるタイピングが困難な検体が困難な検体

• 溶血、凝固の顕著な検体 （腫瘍細胞の生残率低下、凝集）

• 採血後著しく時間が経過している検体

（腫瘍細胞の生残率低下）

• 検体中の腫瘍の割合が低い検体 （正常細胞と腫瘍細胞との分別が困難）

大部分のﾏｰｶｰは正常細胞にも分布

散乱光強度が大きく違わない場合、正常細胞と腫瘍細胞を区別できない

　 ⇒　細胞形態の情報やゲーティングが重要

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CD45CD45蛍光強度によるゲーティング蛍光強度によるゲーティング

CD45＝白血球共通抗原（LCA）

白血球＝陽性

リンパ球＝強蛍光

単球，好酸球＝強～中蛍光

好中球＝中～弱蛍光

好塩基球，造血幹細胞＝ 中～弱蛍光

赤血球，血小板＝陰性

FS/SSとCD45/SSを併用

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白血病細胞のCD45ゲーティング白血病細胞の白血病細胞のCD45CD45ゲーティングゲーティング

急性白血病細胞はCD45発現がしばしば低い⇒　散乱光では正常リンパ球・単球と区別困難な

　　白血病細胞をCD45の蛍光強度で分別　

SS

CD45Ly Mo

Gr

SS

FS

Mo Gr

Ly

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急性白血病細胞急性白血病細胞CD45CD45ゲーティング例ゲーティング例（ALL患者末梢血　CD10-FITC／CD19-PE／CD45-PC5）

CD45/SS

FS/SS

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CD45/SSCD45/SSゲーティングがゲーティングが有効でなかった例有効でなかった例

悪性リンパ腫患者末梢血　κ-FITC／λ-PE／CD45-PC5

λ

SS

CD45

SS

κ

κ

FS

λ

CD45/SSCD45/SS

FS/SSFS/SS

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蛍光蛍光//FS FS ２２パラメータ解析によるパラメータ解析による正常細胞と白血病細胞の分別正常細胞と白血病細胞の分別

白血病細胞（FS＝大）

正常リンパ球（FS＝正常）

検体：　健常者末梢血にKM3細胞株（B細胞性白血病由来）を混合

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CD19CD19ゲーティングによるゲーティングによる免疫グロブリン免疫グロブリンκκ鎖鎖//λλ鎖の分析例鎖の分析例

検体：　健常者末梢血

CD19でB細胞のみにゲートすることで、

血漿由来の免疫グロブリンの影響を最少化

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骨髄腫細胞の骨髄腫細胞のCD38CD38ゲーティング例ゲーティング例

SS

CD38

CD49e

CD49e

CD56

CD56

CD38は様々な細胞に発現

形質細胞/多発性骨髄腫細胞はCD38が強陽性

多発性骨髄腫患者骨髄

　　CD49e-FITC

　　CD56 -PE

　　CD38 -PC5

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造血幹細胞／造血前駆細胞の測定造血幹細胞／造血前駆細胞の測定

全ての血液細胞の源造血幹細胞

T B NK

血小板

赤血球単球

リンパ球

顆粒球赤芽球

巨核球

特徴

CD34：陽性

CD45：弱陽性

側方散乱（SS）：低

有核細胞の0.01%（正常末梢血）～1%（骨髄，臍帯血）

造血前駆細胞

検体：

末梢血，PBSCH，骨髄，臍帯血

移植に十分な数かどうか？

（少ないので高い精度が必要）

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DR. Sutherland, et al. : J. Hematotherapy Vol. 5: 213-226, 1996（通称　ＩＳＨＡＧＥガイドライン）　　　　　

CD34抗体の選択（classⅢまたはPE標識classⅡ抗体推奨）

CD45/CD34の２カラー分析と階層化ゲーティング

白血球数（CD45+) 75000個以上で２回測定した平均値

M. Keeney, et al. : Cytometry vol. 34: 61-70, 1998

内部標準ビーズによるCD34陽性細胞数の直接測定　　　（single-platform ISHAGE法）

7-AADによる死細胞の除外（｢生｣CD34陽性細胞の測定）

CD34陽性造血幹細胞を精密かつ正確に測定するために

CD34CD34陽性細胞測定に関する陽性細胞測定に関するISHAGEISHAGEプロトコールプロトコール

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CD45+ CD34+ FS正常SS低

CD45dim絶対数測定用内部標準ビーズ

CD34CD34++細胞（造血幹細胞）測定細胞（造血幹細胞）測定（（Single Single --Platform ISHAGEPlatform ISHAGE法）法）

7AAD- CD34：陽性　CD45：弱陽性側方散乱（SS）：低

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CD34CD34++細胞（造血幹細胞）測定細胞（造血幹細胞）測定（（Single Single --Platform ISHAGEPlatform ISHAGE法）法）

CD45とCD34の階層化ゲートによる絞込みで精密測定（①～④）

②①

③ ④

検体：骨髄

⑤ ⑥

⑦

⑧

絶対数測定用内部標準ビーズによる直接測定（⑦）7-AAD核染色による死細胞除去（生CD34+細胞）測定（⑧）

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ISHAGEISHAGEプロトコールの拡張プロトコールの拡張第3蛍光，第4蛍光チャンネルの活用

◆ DNA色素（7-AAD）の併用

CD34+細胞の亜分画測定

T細胞（CD3+）の同時測定

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CD58CD58による白血病微少残存腫瘍検出による白血病微少残存腫瘍検出Chen JChen J--S et al.: S et al.: BloodBlood (2001) vol. 97, 2115(2001) vol. 97, 2115--2120.2120.

CD58（LFA-3）は、正常骨髄B前駆細胞にほとんど発現しないが、

同じステージ（CD10+CD19+CD34+）の白血病細胞には過剰発現

→　治療後の骨髄の残存腫瘍細胞をマルチカラーFCMで高感度に検出

　　染色体・遺伝子異常の有無に関係なく適用可能と考えられる

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白血病/リンパ腫タイピング検査の動向白血病白血病//リンパ腫タイピング検査の動向リンパ腫タイピング検査の動向

• リンパ腫や多発性骨髄腫への拡張

• マルチカラー化• 効率化• CD45ゲーティング法• MRD（微少残存腫瘍）の高感度検出（再発モニタリング）

• 細胞質内マーカーの併用

• 方法の標準化と自動化

MPO

CD

79a

CD45ゲーティング

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FCM検査の標準化の現状FCMFCM検査の標準化の現状検査の標準化の現状

外国 ：　

　　　各種ガイドライン，推奨パネル，共通プロトコル

日本 ：　

　JCCLSガイドライン　　　①リンパ球表面抗原検査（JCCLS H1）　改訂版（最終版）承認

　　　②造血器腫瘍細胞表面抗原検査（JCCLS H2）　委員会案公開中

③CD34+細胞測定　委員会案検討中

　サイトメトリー学会：　DNA量（細胞周期）解析　学会案検討中

　小児白血病免疫診断標準化ワーキンググループ（厚労省研究班）

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日本臨床検査医学会 HPにてJCCLSガイドラインH2-Pへのコメント募集中

http://www.jscp.org/news/release/relID=200411101.htm

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FCM検査の精度管理の現状FCMFCM検査の精度管理の現状検査の精度管理の現状

・内部精度管理

　　コントロール血球は複数メーカーより入手可能

　　精度管理用ツール（L-Jチャート等）自動作成

・外部精度管理

公的機関によるサンプルサーベイ：　CAPサーベイ（米）

メーカー運営の外部精度管理プログラム：　IQAP（日本）

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血球計数

臨床検査におけるFCMの位置付け臨床検査における臨床検査におけるFCMFCMの位置付けの位置付け

血小板 赤血球 白血球

白血病／リンパ腫細胞の由来を調べる

白血病／リンパ腫タイピング

リンパ球の働きを調べる

リンパ球サブセット分析

リンパ球

造血幹細胞

造血幹細胞移植をサポートする

CD34陽性細胞測定

３大アプリケーションは血球計数検査の拡張

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詳細、最新情報はサイトメトリー詳細、最新情報はサイトメトリーWebWebサイトへサイトへ

　http://www.bc-cytometry.com