小麦 (ハルユタカ) 粒中のプロテインジスルフィドイソメラー …小麦...
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小麦 (ハルユタカ) 粒中のプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI) の分離精製
誌名誌名 日本食品保蔵科学会誌
ISSNISSN 13441213
著者著者
野口, 智弘新井, 智美野口, 治子内野, 昌孝髙野, 克己
巻/号巻/号 37巻5号
掲載ページ掲載ページ p. 245-248
発行年月発行年月 2011年9月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat
-
245
ド
[研究ノート〕
(ハルユタカ)粒中のプロテインジスルフイ
イソメラーゼ (PDI)の分離精製
2011 NO.5 VOL. 37 日本食品保政科学会誌
小麦
( 31 )
野口智弘*1 ~ .新井智美*2・野口治子叫
内野昌 孝 ヰ 高 野 克 己*2
* 1 東京農業大学};t、m生物科学部食品加工技術センター* 2 東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科
Grain (Haruyutaka)
NOGUCHI Tomohiro*l~ , ARAI Satomi*2, NOGUCI-II HarukoぺUCI-!INO Masataka叫 andTAKANO Katsumi*2
Wheat Disulfide Isomerase from of Protein Purification
Food Processing CenteJ; Facu!tア ofApplied Biosoence,あわoUniversity of Agriじu!tw'e,
J -J -J Sakuragaoka, Setagava-kll, Tokyo J 56-8502
Department (ゲAppliedBio!ogy and Chemi,¥-rr); Facu!ty ol App!ied Biosoenι'e, Tokyo University of Agricu!ture,
J -J -J Sakuraga口ka,Setagaya-ku,五?kyo 156-0-8502
* 1
* 2
The protein disulfide isomerase (PDI) enzyme is involved in th巴 formationof disulfide bonds. Here
we attempted to purify PDI from wheat grain (Triticumaestivum cv. Haruyutaka). As a. result of
DEAE-Sepharose Fast Flow and affinity chromatography purification, 30. 74units of PDI activity/100g
of wheat grain were observed in the adsorbed fraction from the affinity chromatography column. The
molecular weight of this fraction was63kDa as determined by SDS-PAGE analysis. N-terminal amino
acid sequencing of this63 -kDa protein showed that the sequences of wPDI and this63 -kDa protein
shared79%identity, On the basis of this result, we assumed that the63 -kDa protein that we purified
from wheat (Haruyutaka) grain is the same as wPDI, which we used for genetic information, and that
our expression of this protein was sL1ccessful.
CReceiv巴dMal¥31, 2011 ; Accept巴dJ ul. 21, 2011)
山川出生
Key words : Pnρtein Disu(fide Jsomerase, PDJ, Wheat, Disulfide Bond, Dough
プロテインジスルフィドイソメラーゼ, PDI,小麦,ジスルフィド結合,
タンパク質のリフォールデイングを触媒する酵素であるo
PDIは様々な生物でその存在が明らかにされており,小
麦のPDIについても様々な研究が行われている。近年,
小麦粉内在PDIをコードするcDNAが分離され,1さらに
小麦PDIについてその種類や詳細な遺伝子解析が行われ
ている九一方で、,小麦より部分精製されたPDIとアス
コルビン酸を同時に添加することで,生地の物性がl合L仁
することも示されている九 筆者らは,これまでに小麦
mRNAからリコンビナントPDI(wPDI)の発現・精製
に成功し,その性状を報告している6110 しかしながら,
小麦より PDIを分離精製し取得した報告は,これまでに
ない。そこで,匡l内産小麦のハルユタカを用い小麦粒か
らのPDIの分離精製を試みた。
小麦は主に製粉され小麦粉として利用されている。小
麦粉は水を加えて練ることで,他の穀類にはみられない
独特のあliiJit('I~I: を示す生地を形成することから, パ ンや麺,
菓子など株々な食品に加工されている。この生地は小麦
の主要構成タンパク質であるグリアジンとグルテニンに
水を加えて混担することで形成するグルテンによるもの
である。
グルテンの形成は,犠々な分子間相互作用や結合が関
与 していると考えられているが,中でもジスルフィド結
合が最も主要であると考えられている。しかしながら,
生地視担時の物理的作用のみでジスルフイド結合が形成
されるとは考えにくい。
Protein Disulfide Isomerase lま(PDI ; EC5. 3.4.1)
干156-8502 東京都世田谷灰桜丘 1-1 -1
Corresponding author. E-mail: [email protected] 〒156-8502 東京都世間谷区桜丘 1-1 -1
ームPAvdη/】
*
*
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246 日本食品保蔵科学会誌 VOL. 37 NO.5 2011 ( 32 )
試料および実験方法
1. 試 事ヰ
試料には,北海道産ハルユタカ (1トitIιlImaestIvlIm cv
Haruyutaka) をよFJいた。
2.酵素の抽出
酵素の抽出はKMl¥UMt¥OI (1998) らの方法を用いた。
小麦全粒を,マルチビーズショッカーにて破砕し 4倍
容 (w/v)の 5mMジチオトレイトール (DTT), 50mM
~k~化ナトリウム, 10mMエチレンジアミン-N.N, N, N-
テトラ商ド西空(EDTA), 2 mMフッイヒフェニルメチルス
ルホニル (PMSF),0.1% (w/v) Triton X-100を合む
50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)を加え,ヒストコロ
ン(日本医理科機械製作所製)にてさらに破砕し,遠心
分離(10,000rpm,20min, 4'C) により得られた上澄
液を粗tJtlI:lJ,液 (F1 )とした。F1を20%飽和硫酸アン
モニウムにて塩析し,氷冷下で 1fJ寺問静置した後,遠心
分離 (15,000rpm,20分間, 4 'C)後,得られた上澄液
を分間分子量25,000の透析!院を別い, 20mMトリス血酸
(pH8.0) にて 1晩 (4'C)透析することで, PDI活性
に近似した活性を 示 す分子量13,000のタン パ ク質
Thioredoxin')や低分子の還元物質を取り除き,遠心分離
(15,000rpm, 20分間, 4 'C)後の上澄液を粗酵素 (F
2 )とした。
3. 小麦POIの精製
PDIの分離精製は, 20mMトリス塩般緩衝液 (pH
8.0) にて平衡化したDEAE-SepharoseFast Flowカラ
ム(中20x 160rnrn, GEヘルスケア社製)に, F 2を供し
た。溶I:U条件は1.Orne/min, 5.0rne/tubeにて行い,未l段
着回分をi容1:1:'1後,吸着画分をNaClを含む同緩衝液にて
ステッフ。ワイズ (0.1, 0.2, 1. OM) を行った。PDIi舌
性が確認された 匝l分は,さらにお'LPDI抗イ本 (mouse
Antiserum to wPDI) を用いたアフイニティークロマ
トグラフイーに供し精裂を行った。カラムにはHiTrap
NHS-activated HP (5 rnQ, GEヘルスケア社製)を用い,
遺伝子情報より発現調製した小麦リコンビナント PDIJl
を抗原として作成したPDIポリクローナル抗体をリガン
ドとして用いた。先のDEAE-SepharoseFast Flowに
てPDIの活性の得られた匝l分を20mMリン酸, 0.15M
NaCl, pH7.0にて平衡化したカラムにアプライ後,未
吸着画く分を溶出させた後, 1.0Mグリシン一塩酸, 0.5
M NaCl, pH4.0にてi容出を行った。なお, i容出は1.OrnQ
!min, 2.0rne/tubeにて行い,酵素活性の保持のため,
あらかじめフラクションチューブに1.0Mトリス塩酸緩
衝液 (pH7.0) を1.OrnQ入れi容出した。
4. POI活性測定法
PDIの活性測定は, ARNEらの方法汁叫に従いのインス
リンを用いた方法にて行った。基質である 1% (w/v)
インスリン溶液はインスリン(和光純薬社製)を50mM
トリス塩酸緩衝i夜 (pH8.0) に懸濁し, 1 Nt昆般を加え
溶解後, 1 N水酸化ナトリウムにてpH8.0に調整後, 50
mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0) にて定谷し調製した。
試験管に0.4Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 0.25
rnQ, 8 mM EDT AO. 25rne,インスリンi容i夜O.1rnQ,純水
0.284rnQをとり,小麦粒から抽出した酵素溶液0.05rnQを
加えた後, 5 mM DTTO.066rnQを力11え, 会 長 を1.OrnQ
(終j農度:0.lM1)ン酸カリウム緩衝液 (pH7.5), 2 mM
EDT A, 1 rng/rnQインスリン, 0.33mM DTT) とし
て, 25'Cで60分間酵素反応を行った。生じたインスリン
の濁度を l吸収波長650nmにてiJW定した。酵素力伯iはpH
7.5, 25'CでDTT存花下において 1mg/rnQのインスリン
のA650を1分間に0.01変化させる 力価を 1Uとした。
なお,酵素i夜中のタンパク質量は, Coomassie'!!> Plus
Protein Assay Reagent Kit (PIERCE担:事:g)および
Lowryの改良法にて測定したD
5. SOS-PAGEおよびウエスタンブロットによる解析
アフィニティークロマトグラフィーで分離した四分は,
SDS-PAGEに供しタンパク質の分子量の解析を行うとと
もにウエスタンブロットにてPDIの4食出を1Tった。タンパク質の染色は銀染色(銀染色 Eキットワコー,和光純
薬工業社製)にて行い,ウエスタンプロットの検出には,
l次抗体に小麦PDIポリクローナル抗体 (mouse
Antiserum to wPDI)を用い 2次抗体は, MouesIgG,
I-Iorseradish Peroxidase Linked Whole antibody from
sheep (GE Healthcare社 製),検出試薬はAmersham
ECL Plus Western blotting reagent pack (GE
Healthcare社製)をmいて,引iられたシグナルを化学蛍光検問機 (Gel-DocBio Rad 社製)にて検出した。
6. N末端アミノ酸配列解析
SDS-PAGE後のゲルをセミドライブロッテイングによ
りPVDF膜に転写, CBB染色した。得られた精製酵素バ
ンドを切り出した後,プロテインシークエンサー (PPSQ
21/23, shimadzu社製)に供しEdmani.去にてN末端ア
ミノ酸配列を解析した。
結果および考察
1. 陰イオン交換体クロマトグラフィーおよび抗POI抗
体アフィニティーク口マトクラフィーを用いた小麦
POIの分離精製
DEAE-Sepharose Fast FlowカラムにF2を供し分離
精製を行った結果,未l段着画分 (A1)および吸着画分
(A 2, ~ 4) の計4つのタンパク質ピークが得られ
(Fig.l) ,これら各画分 (A1 ~ 4) のPDI活性を測定
したところ (Table1 ), A 3にて156.6units/小麦粒100
gと最も高し、活性を確認した。そこで,次に小麦PDIポ
リクローナル抗体 (mouseAntiserum to wPDI)をリ
ガンドさせたがしPDI抗体アフイニティークロマトグラフ
ィー (HiTrap NHS-activated HP) をmい, A 31由i分のさらなる精製を試みたところ,未l吸着画分 (C1)お
よび吸着回分 (C2) にタンパク質 ピークを確認した
-
( 33 )
3.5
3
2,5
〈号2
0,5
O
O
〔研究ノート〕 小麦粒PDIの分離精製 247
1.2
0,8 a
0,6 ~ Z
0,4
0,2
O
190
A-2 : A-4
A-3
50 100 150
Fraction No, (5 me!tub巴)
Fig. 1 DEAE -Sepharose chromatography of PDI
extracted from Haruyutaka grain
Column : DEAE-S巴pharoseFast Flow (中20x160mm)
BlIffer : 20miVl Tris-HCl bll任巴1・(pH8.0)
Speed : 1 me/min
20 m~句hosphate , O.lS 1.0 ¥,1 glycindlCI. 0,5 1.0 111 glycine-I-ICI. 0,5 M NaCI (pH iO) 111 l¥aCl (pH .¥0) ~l NaCI (pH 30)
.‘・
006F;
0,05
0,04
e、,‘,言a ・
0,02
0,01
O
O 5 10
'‘
15 20
Fraction No, (2mIVtube)
Fig. 2 Antibody affinity chromatography of poolcd
eluates (A 3 ) from thc DEAE -Sepharos巴
25
chromatography column
Column : HiTrap :¥iHS-acti¥'at巴dIIP (5 me)
Speed : 1 me/min
Table 1 Purification summary of PDI fromHaruyutakagrain
PDI Activity Protein Step
(0) (mg)
Fl 642,2 2948.8
F2 323.9 1565.4
A1 N,D 714,8
A2 59. 1 259.8
A3 156.6 150.6
A4 N,D, 21. 1
C1 N,D, 8.5
C2 30.7 0.4
Specific Purifica tion Yield
actlvlty rate (%)
(U/mg)
0.22 1 100
0.21 0.95 50.4
0.23 1. 04 9.2
1. 04 4.77 24.4
74.8 341 4.8
(Bas巴don lOOg ¥Yh巴atgrain)
(Fig.2)0 C 1およびC2のPDIi丹性測定を行った結果 (Fig.4)。その結果, 63kDaタンパク質のN末端配列は,
(Table 1 ),アフィニティークロマトグラフィーの吸着 筆者らがi宣伝情報より発現に成功したリコンビナント小
l町分であるC2において30.74units/小麦粒100g の活'I~I: 麦PDI (wPDI)射の26残基白からと 79%の相向性を示し
がfljられた。 たことから, 63kDaタンパク質は,小麦粒1"1'に存在する
2. SDS-PAGEおよび‘ウエスタンフロットを用いた解析 PDIであることが明らかとなった。
アフィニティークロマトグラフィーによって伴られた
各画分をSDS-PAGE (Me +)に供し銀染色にてタンパ
ク質のf食出を行ったところ (Fig.3A), C 2にて50および、63kDaのタンパク質バンドを確認した。さらに,小麦
PDIおV木を用いたウエスタンブロ ットにて, PDIのシグ
ナルを官'(g認したところ (Fig.3B), 63kDaに強いシグナ
ルが得られ,この63kDaのバンドが小麦粒1-1:1のPDIであ
ることが示唆された。
3. N末端アミノ酸配列解析
SDS-PAGEおよびウエスタンブロッドにて確認した63
kDaタンパク質のN末端アミノ椴配列を解析 し た
要 約
囲内産パン用小麦で、あるハルユタカの小麦粒より,
Protein Disulfide Isomeraseの分離精製を試みたO
DEAE-Sepharose Fast Flowおよび子元PDHJtイ本アフイニ
ティークロマトにて4食言すを行ったところ,アフィニティークロマトグラフィーの吸着四分に, 30. 7 4uni ts/小麦
粒100gのPDI活性が得られた。さらに, SDS-PAGEおよ
びPDI抗体を用いたウエスタンブロットにより 63kDaの
タンパク質にPDIのシグナルが俄認された。また,この
63kDaタンパク質のN末端アミノ般配列を解析したとこ
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248 日本食品保蔵科学会誌 VOL. 37 NO.5 2011 ( 34 )
180 .回・・
= dl骨山 . ー'.崎|骨63kDa ..11 58 ー圃.=円を
39 ー・29
1・U圃.20
A
(kDa) C1 C2
ハHVA川U
ハ川VFhd
-hピh
d
n
U
7
4
つ41i1i
50
37
25
20
B
(kDa) おI C1 C2
(T=12.5% : Me+)
Fig. 3 SDS -PAGE (A) and western blot (B) of antibody affinity
chromatography ofHaruyutaka grain
;¥11: lvlolecular slandard. C 1 and C 2 Eluled fraclions by A.ntibody affinily chromatography
Puri五edPDI from Haruyutaka grain: C2 (63 kDa)
Recombinant PDI
N-terminal amino acid homology: 79%
Fig.4 N-Terminal amino acid sequ巴nceof recombinant PDI and pllrified PDI from
HaruYlltaka grain
ろ,小麦遺伝情報より取得したwPDIの配列と79%の相
向性がfぜられたことから,ハルユタカ粒より取得した63
kDaタンパク質は,小麦PDIであることが明らかとなっ
た。
文 献
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( rl~成23年 3 月 31 日 受付, 平成23年 7 月 21 日受理)