학 사학

새 운 RecQ helicase Hrq1 돌연변 에 한 연

Genetic studies of hrq1 mutation, a new member of RecQ helicase family in

Saccharomyces cerevisiae

2012 02월

하 학 학원

생 과학과

학 사학 청

새 운 RecQ helicase Hrq1 돌연변 에 한 연

Genetic studies of hrq1 mutation, a new member of RecQ helicase family in

Saccharomyces cerevisiae

2012 02월

하 학 학원

생 과학과

지도 수

사학 업

사학 업 함

2012 2월

주심

심

원

- 1 -

목차

목차 1

2

Abstract 3

List of Figure 4

5

1. DNA 수리 5

2. DNA helicase 6

3. RecQ helicase 능 7

재료 11

1. 균주 지 11

2. 스트 스 항 실험 11

3. 염색체 재 합 빈도 12

4. 삼핵산 복 가 빈도 균주 12

5. 삼핵산 복 가 빈도 사 15

6. 생 연 사 14

7. 연 돌연변 빈도 15

8. 도 돌연변 빈도 15

결과 고찰 17

1. HRQ1 삭 균주 스트 스 항 사 17

2. HRQ1 삭 균주 염색체 내 재 합 빈도 21

3. HRQ1 삭 균주 삼핵산 복 가 빈도 23

4. HRQ1 삭 균주 생 연 사. 25

5. HRQ1 삭 균주 연 생 돌연변 빈도 28

6. HRQ1 삭 균주 EMS 도돌연변 빈도

참고 헌 32

- 2 -

List of Figures

Fig. 1. Hrq1, Sgs1, RecQ4 helicase domain

염 열 상동 10

Fig. 2. HRQ1 삭 돌연변 균주 도민감 18

Fig. 3. HRQ1 삭 돌연변 균주 4-NQO 민감 19

Fig. 4. HRQ1 삭 돌연변 균주 산 스트 스

민감 20

Fig. 5. HRQ1 삭 돌연변 균주 염색체 내 재 합

빈도 22

Fig. 6. HRQ1 삭 돌연변 균주 삼핵산 복

가빈도 24

Fig. 7. HRQ1 삭 돌연변 균주 생 연 26

Fig. 8. HRQ1 삭 돌연변 균주 연 생 돌연변

빈도 29

Fig. 9. HRQ1 삭 돌연변 균주 도 돌연변 빈도 31

- 3 -

간 Werner's 후 , Bloom's 후 , Rothmund-Thomson's

후 각각 WRN(RecQ2) BLM(RecQ3) 그리고 RecQ4 helicase

하는 에 돌연변 가 생겼 생하는 질병

다. Saccharomyces cerevisiae 경우 Sgs1 한 RecQ

helicase 다. Sgs1 삭 시킨 경우 DNA 상

주는 질들에 민감 나타내는 것 었고 DNA 재 합과 돌

연변 생 가하는 것 었다. 본 연 에 는 염

열 에 간 RecQ4 helicas 상동 가진 Hrq1 견하 다.

HRQ1 삭 돌연변 균주는 도(39℃) 4-nitroquinoline

1-oxide에 해 민감 나타내었다. Hrq1△Sgs1△ 돌연변

균주는 hydrogen peroxide에 민감 나타내었고 포 생 5

후 격 감 하는 것 할 수 었고 돌연변 생 빈도

가 가하는 것 찰 하 다. 러한 결과는 HRQ1 포 생

지에 한 역할 할 가능 시하고 다.

- 4 -

Abstract

Human disorder Werner's, Bloom's and Rothmund-Thomson's

syndromes are caused by mutations in the genes encoding

WRN(RecQ2), BLM(RecQ3) and RecQ4 helicase, respectively.

Sgs1 is the only RecQ helicase in Saccharomyces cerevisiae.

Yeast cells lacking Sgs1 are sensitive to treatment with a variety

of DNA damaging agents and increased recombination and mutation

frequency. in this study, we found that Hrq1 is homologous to

RecQ4 helicase by homology search in yeast genome database.

The hrq1△ mutant strain was sensitive to high temperature(39℃)

and treatment with 4-nitroquinoline 1-oxide and The hrq1△sgs1

△ mutant strain was sensitive to exposure to hydrogen peroxide,

and exhibited decreased chrolonogical survival and increased

mutation frequency. These results suggest that Hrq1 may play an

important role in maintenance of viability of yeast cells.

- 5 -

1. DNA 수리

생 살 가 DNA는 산 나 과 같 질에 해 다

한 상 게 다. 러한 상 DNA가 상 보

시키지 못하여 생 동에 많 향 끼 게 다. 러한

상들 생 염 들 공 결합 변 어 염 열

변 나 DNA 복 상보 지 염 결합, 복 체

가 는 DMA 가닥 상, 염 끼리 상 보 결합 다.

러한 다 한 상 생 에 DNA수리 과 역시 여러 가지

가 재하게 다(1). 상 염 직 수리하거나 상 염

단 해 복 하는　 (Base excision repair; BER), 뉴클 티드 주

단 해 복 하는 (Nucleotide excision repair; NER),

복 (Mismatch repair), 끊어진 가닥 복 (Double strand

break repair; DSBR)가 다(2)(3).

어 상 염 나 뉴클 티드 거시키지 고 복

다. 가 진 는 DNA photolyase에 한 해 진 는

cyclobutane pyrimidine dimer에 한 직

(photoreactivation) 다. Photolyase는 빛 수하는

색단(chrompohore) 용하는 2가지 가지고 다. 그

하나는 FADH2 고 나 지는 엽산(folate) 다. 에 사용 는 에

지는 빛 에 지 균 photolyase에 2가지 색단

5,10-methenyltetrahydrofolate FADH2는 빛

수할 수 다. 빛 에 지 엽산에 해 수 어 FADH2

달 다. 여 상태(excited form) FADH2는 하나

pyrimidine dimer 달하 그 결과 pyrimidine dimer는 해

monomeric pyrimidine 해 다.

또 다 는 alkylating agent가 재할 는

O6-methylguanine 복 다. O6-methylguanine 직 복

- 6 -

는 O6-methylguanine-DNA methyltransferase에 해 수행 다.

는 O6-methylguanine 틸 그룹 신 특 Cys

동시킨다.

상 염 단 복 하는 DNA에 비 상 염 가 재

할 경우, DNA glycosylase는 N-glycosyl bond 단함 해당

염 거한다. DNA glycosylase 용 염 가 결여

apurinic 또는 apyrimidinic site abasic 또는 AP site라 다.

후 AP endonuclease가 AP site 근에 는 phosphodiester 골격

단한다. 그러 DNA polymerase I nick free 3′-OH

상 가닥 거하 새 운 가닥 합 하 것 상 지

DNA 지도 체시킨다. 합 후에 남 는 틈 DNA 합

에 해 합 다.

DNA 나 에 거 한 그러짐 하는 DNA 상 뉴클

티드 단하는 수리에 해 복 다. 균에 한 는

uvrA, uvrB, uvrC 산 들 3개 수 단 가진

ABC exonuclease 다. 가 상 DNA 에 결합하게

상 5'쪽 8 째 phosphodiester bond 그리고 3'쪽 4

째 또는 5 째 phosphodiester bond가 단 다. 게 exonuclease

는 상 염 포함하는 12~13bp 도 짧 뉴클 티드

거하 , 그 결과 생 틈 DNA 합 에 해 합 다.

새 복 DNA 검사하는동 , 못 짝지 견 수리 과

들 복 DNA 가닥에 못 짝지 염 만 하여

못 염 는 고 원래 염 열 복 게 한다.

2. DNA helicase

DNA복 , 사, 역, 재 합, 수리 등 과 같 많 포과 에

DNA가닥 리 는 과 필 하다. Helicase는 ATP 가수 해하

여 생 에 지 사용하여 뉴클 티드 염 사 에 수 결합 끊

- 7 -

어 DNA 어내는 다. Helicase는 DNA 결합해 는 동

수많 염 짝지 (base pairing) 다. DNA 복 과 에 여하

는 고리 hexameric DNA helicase는 진행 갖는다.

것 러한 helicase는 DNA 러싸 다. 그러므

helicase가 DNA에 어 나가 해 는 고리 가 열 한다.

그러나 러한 경우는 드 다. 그러므 러한 helicase는 DNA 가닥

끝에 도달하 DNA에 어 나간다(4).

DNA helicase는 DNA 5′→3′ 향 또는 3′→5′ 한 향

만 동하는 극 갖는다.

Helicase는 6가지 상과(superfamilies) 다(SF1-SF6). SF1

과 SF2 helicase는 매우 견 고 monomer 다. 그리고

DNA, RNA (manipulation)에 참여한다. 에 다 상과

는 hexamer 링 한다. 든 helicase는 개

recA-like domain 사 공간에 NTP 결합시키고 가수 해한다.

러한 결합 는 Walker A(P-loop) Walker B 포함하고 다

(5).

3. RecQ helicase 능

DNA 수리 하는 단 질 그룹 하나가 RecQ helicase 다.

RecQ helicase는 원핵생 에 고등진핵생 지 보 어 다.

RecQ helicases는 고등생 에 경우 다 한 RecQ helicase가

DNA수 에 참여한다. 간과 에 는 RecQ1, BLM, WRN, RecQ4,

RecQ5 라는 5가지 RecQ helicase가 재하는 것 다.

3가지 결함 체 , 다 한 , (premature

aging)같 나타나게 한다. Werner syndrome(WS) WRN

결함 해 생하고, Bloom syndrome(BS)는 BLM 결함

해 생한다. 그리고 Rthmund Tomson(RTS), RAPADILINO

and Baller Gerold syndromes 는 RecQ4 결함과 다.

- 8 -

에 RecQ1, RecQ5는 직 어 한 병과 는지 지지

다. 하지만 것들 또한 체 에 한 역할 하는 것

다(6). RecQ 그룹 다 helicase 그룹 다 그룹과 별 할

수 는 들 가지고 다. 400개 도 미 산

루어진 helicase domain, RecQ C-terminal(RQC) 그리고

DNA helicase/RNaseD C-terminal(HDRC) domain 다. BLM

helicase는 생 학 DNA topoisomerase III 상 용 한다.

그리고 단 질 포 포에 함께 함 었다.

러한 상 용 Sgs1과 열 Rqh1에 Top3

상 용 하는 태 보 어 다. 런 보 RecQ-Top3

복합체는 hyper-recombination 막는 역할 한다고 생각 다. 그러

나 생 체들 사 에 RecQ helicase가 보 어 에도 하고,

런 들 하는 들 포가 살 남는

에 필수 지는 다. 생 학 료들 RecQ helicases는

가닥말단(blunt end) 가지거나 내 끊어짐 가진, 또는 3′에

5′쪽 한 가닥 사슬 리 가진 들 가진

나 DNA 경우는 거 또는 지 못한다(7). 그러나 가

닥 말단 에 울 (bubble) 가지고 는 경우는 DNA 수

다(8). 그리고 BLM과 WRN 경우 Holiday junction과 사하게 합

한 X-junctions과 G4 나 (G-quadruplex) DNA 과

는 것 었다. 리 RecQ5 helicase

Sgs1 Holiday junction과 지 복 (stalled replication

fork)과 사하게 합 3-,4-way junctions 시킨다(9).

RecQ helicase는 염 단 수리(base excision repair), DNA 가닥

단(DNA double strand break repair), DNA 사슬간 차결합 수

(intra-stand cross link repair), 지 복 복 그리고

미어 과 진행 에 어 다(10).

에 언 한 같 Sgs1 RecQ helicase 한

다. SGS1 돌연변 균주 경우는 수 짧 진다는

것 고 DNA에 상 도하는 질들 metyl

- 9 -

methanesulfonate (MMS), hydroxyurea (HU)에 민감하다는

것 고(11) 2 체 포 SGS1 돌연변 균주에 는 UV

나 X-ray에 간에 민감 다는 것 다(12). sgs1

또한 감수 열 동 염색체 차 막는다. SGS1 삭 차

가하는 것 견 었다(13). 또한 Sgs1 매염색체간

(inter-sister chromatid) 나 다 염색체(multi-chromatid) 차

막는 도 여한다.

본 연 에 는 HRQ1 가 간 RecQ4 helicase 상동

견하 다.(figure 1.) 또한 연 에 Hrq1

한 결과 helicase 할 수 었다. Hrq1

RecQ helicase 비슷하고 능 helicase 가지고

다는 볼 Hrq1 yeast 새 운 RecQ helicase 것 라고

가 우고 HRQ1 삭 돌연변 균주 Hrq1△Sgs1△ 돌연

변 균주 용해 어 한 나타나는지 보는 실험

Hrq1 역할 해 보 다.

- 10 -

- 11 -

재료

균주 지

본 연 에 사용한 YPH499 다 과 같다; MATa

ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200

leu2-Δ1.

균주에 Hrq1 HIS 시킨 균주(Hrq1△) 과

Sgs1 가 HIS 균주(Sgs1△) HRQ1 SGS1 가

각각 HIS TRP 균주(Hrq1△Sgs1△) 가지고 실험

진행하 다.

사용한 지는 YPD(yeast extract peptone dextrose)

SD(Synthetic drop-out) 사용하 다.

스트 스 항 실험

도민감 경우 2 동 YPD 체 지에 25℃에 1~2

한 후에 순차 하여 YPD 고체 지에 spotting 한 후 각각

25℃ 39℃ 경에 1~2 도 하 다.

4-Nitroquinoline 1-oxide(4-NQO)에 한 민감 경우 2 동

YPD 체 지에 25℃에 한 후 순차 하여 0.1μg/ml

4-NQO가 들어간 YPD 고체 지에 spotting 한 후 25℃ 경에

2~3 도 하 다.

H2O2 민감 경우 2 동 YPD 지에 25℃에 한 후

OD600 2가 도 20mM potassium phosphate(pH 7.4) 충용 에

한 후 100mM H2O2 처리하여 30 동 25℃에 들

후에 균수 2 척하고 순차 하여 YPD고체 지에

spotting 하고 25℃에 1~2 동 하 다.

- 12 -

염색체내 재 합 빈도(intrachromosomal recombination frequency)

염색체 내 재 합 빈도 하 해, 동 한 염 열 LYS2

사 에 URA3 가 들어가 는 pRS306 염색체 상에 삽

시킨 균주에 HRQ1 삭 한 균주 용하 다. 만들어진 균주

SD 체 지 3ml에 2 도 키운후 YPD plate 지에 streaking하

여 2 도 30℃에 한 후 하나 colony SD 체 지에 고

OD600 =1.0 었 지 30℃에 하 다. 그 후 2×107

도 도 원심 리 용하여 13000rpm 수 한 후 마커

1mg/ml 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 가 들어 는 SD 지에 도말하

여 30℃ 에 3~4 도 하 다. 비 하

해 당하게 하여 YPD고체 지에 도말하여 30℃에 하 다.

게 해 나 colony 숫 어 재 합 빈도 하 다.

삼핵산 복 열 빈도 하 한 균주

우 질 탕 포가 필 한 생

HRQ1 삭 돌연변 균주 내에 포함 어 지 는 마커 첨가

해 체 SD 지 3ml에 하 다. 30℃에 2 가량 하

다. 2 간 해 포 상태 같 체 SD 지 200ml

OD600 값 0.1~0.3 도 어 다 OD600에

0.7~1.0 도 30℃에 하 다. 50ml짜리 시험 용

하여 5 간 3000rpm 원심 리 사용하여 득하 다.

득한 에 균수 50ml 어 5 간 3000rpm 원심 리

한 다 상 리고 다시 균수 어 동 한

끗하게 어주었다. 끗 에 1M lithium acetate 34μl,

50% polyethylene glycol 240μl, carrier DNA 10μl, H2O 질

- 13 -

시킬 DNA(pRS306-Lys2-CTG) 합쳐 90μl 가 도 고

40 간 42℃에 열 충격(heat-shock) 가했다. 그 후 원심 리

용해 13000rpm에 수 하 다. 수 한 시험 에

균수 150μl 첨가해 어주었다. 그런 다 생 에

필 한 마커 포함하고 는 SD 고체 지에 어주어 30℃ 에

2~3 간 했다.

그 후 DNA 하 해 TEN minute 용

하 다. 에 질 하여 얻어진 체 생 에 필

한 마커 포함하고 는 SD 체 지 3ml에 주하여 30℃에 2

간 하 다. 한 고 원심 리 용하여 균한

1.5ml tube에 수 하 다. 수 한 에 0.1ml 2% triton X-100,

1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-Cl(pH8), 1mM EDTA 0.1ml

phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 25 : 1) 가진

용 어주었다. 그 후 0.15g glass bead 어주고 12 동

vortexing 하 다. Vortexing 끝난 다 5 동 13000rpm 원

심 리하여 상 만 취해 DNA 리해 내었다.

리한 yeast DNA 용하여 질 었는지 하 해

PCR 수행하 다.

삼핵산 복 열 빈도 사

에 만들어진 균주 YPD 지에 도말하여 30℃에 2 동

한 후 하나 colony SD 체 지에 고 OD600 값 1.0

지 키운 후 2×107 cell 도 13000rpm 원심 리하여

수 한 다 마커 1μg/ml 5-FOA 가 들어 는 SD 지에 도말하여

30℃ 에 3~4 도 하 다. 비 하 해

당하게 하여 YPD고체 지에 도말하여 30℃에 하 다.

게 해 나 colony 숫 어 삼핵산 복 가 빈도

하 다.

- 14 -

시간 생

생 , hrq1△, sgs1△ 그리고 hrq1△,sgs1△ 균주 YPD

체 지에 2 동 25℃ 또는 30℃에 키운 다 1/500 비

SD 지에 후 25℃ 또는 30℃ 도에 포 상태 지 키웠다.

48시간마다 당 하여 YPD 지에 도말하고 colony가 개가

나 는지 하 다. 1 차 하 값 100% 간주하여

시간에 라 사망 하 다.

연 생 돌연변 빈도

연 생 돌연변 (spontaneous mutation) 빈도는 CAN1 돌연변

빈도 하 다. 생 , hrq1△, sgs1△ 그리고 hrq1△,sgs1

△ 균주 YPD 체 지에 2 동 25℃ 또는 30℃에 키운 다

1/500 비 SD 지에 후 25℃ 또는 30℃에 포

상태 지 키웠다. 48시간마다 당 하여 YPD 지에 도말하고

colony가 개가 나 는지 하 다. 그리고 canavanine 항

같는 돌연변 균주 하 해 에 키웠 한

포 수 (처 1 차에 2×107 cells)가 도 수 하여 균수

어 후 별 지(SD-arg, 60μg/ml L-canavanine sulfate)에 도말

하 다. 돌연변 체는 3~4 후에 숫 한다. 게 해

나 colony 숫 어 연 생 돌연변 빈도 하

다.

도 돌연변 빈도

도돌연변 빈도는 CAN1 돌연변 빈도 하 다.

생 hrq1△ 균주 2 동 30℃에 포 상태 지 키웠

다. 그 후 1/1000 도 비 YPD에 한 후 OD600 값 1.0

- 15 -

도 지 30℃에 하 다. 그 후 1ml 수 하여 균수

척 후 20mM sodium phosphate 충 1ml 고 어주었다.

그러고 나 Ethyl methanesulfonate(EMS) 20μl 어주고 1시간

동 30℃에 었다. 30 후 수 하여 균수 척 후 당

하여 YPD 지에 도말하고 colony가 개가 나 는지 하 다.

또한 별 지(SD-arg 60μg/ml L-canavanine sulfate)에 도말하

다. 돌연변 체는 3~4 후에 숫 하 다. 게 해

나 colony 숫 어 연 생 돌연변 빈도 하 다.

- 16 -

결과 고찰

HRQ1 삭 돌연변 균주 스트 스 항 사

연 에 SGS1 돌연변 균주 경우 methyl methane

sulfonate(MMS), heat shock, hydroxyurea(HU), hydrogen

peroxide(H2O2), camptothecin(CPT)에 민감 보 는 것

었다(10). Hrq1 역시 RecQ helicase 에 SGS1 돌연변

균주 비슷한 민감 가지고 는지 하 해 여러 가지

경에 실험 진행하 다. 그 결과 hrq1 균주는 도(39°c)에

민감 보 다. 또한 hrq1△sgs1△ 돌연변 균주는 hrq1 균주

보다 민감하 다(Fig. 2). 또한 4-NQO 처리한 경에 실험

진행 하 다. 4-NQO는 질 DNA에 상 주어 가

DNA 수리 NER 도 할 수 는 질 다. 실

험결과 hrq1△ 균주에 sgs1△ 균주만큼 니지만 간 민감

갖고 는 것 볼 수 었다.(Fig. 3A). 실험 hrq1△/hrq1△

체(diploid) 돌연변 균주에 실험 해 보 다. 그 결과도 마찬가지

4-NQO 민감 보 다(Fig. 3B). H2O2 처리한 경에 도

실험해 보 다. H2O2 는 포에 산 스트 스(oxidative stress)

주는 질 다. hrq1△균주는 생 균주 별 다 차 가 없었

나, hrq1△sgs1△ 돌연변 균주는 민감 갖는 것

할 수 었다(Fig. 4). 그 MMS, HU, CPT 처리한 균주도 실

험해 보 나 hrq1△ 균주에 민감 나타나지 다.

- 17 -

Control (25°c) 39°c

Wild type

hrq1△

sgs1△

hrq1△ sgs1△

Figure 2 Hrq1 삭 돌연변 균주 도민감 .

Hrq1△ 균주 YPD 지에 한 후 10 균수 하여

spotting 하 다.

- 18 -

Wild type

hrq1△

sgs1△

hrq1△ sgs1△

WT/WT

hrq1△/hrq1△

control 4-NQO(0.1μg/ml)

control 4-NQO(0.1μg/ml)

Figure 3 Hrq1△ 균주 4-NQO 민감 .

Hrq1△균주 YPD 지에 한 후 YPD 지(Control) 별

지(4-NQO)에 10 균수 하여 Spotting 하 다. (A)

수체 균주, (B) 체 균주

A

B

- 19 -

Wild type

hrq1△

sgs1△

hrq1△ sgs1△

100mM H2O2control

Figure 4 Hrq1△ 균주 산 스트 스 민감

Hrq1△ 균주 YPD 지에 한 후 수 하여 100mM H2O2 30

처리 후 10 균수 하여 Spotting 하 다.

- 20 -

HRQ1 삭 돌연변 균주 염색체 내 재 합 빈도 .

Sgs1 경우 recombination에 여 한다고 고 sgs1△ 균

주에 DNA 재 합 빈도가 가한다는 사실 다. 그러므

hrq1△ 균주에 도 DNA 재 합 빈도가 가하는지 보 한 실

험 진행하 다. 상동 는 2개 LYS2 염 열 사 에 URA3

가 들어가 어 재 합 어 날 경우 URA3 가 사라

지 는 시스 가진 YPH499균주에 hrq1 삭 하여 실행하

다. 그 결과 hrq1△ 균주 생 균주 사 에 재 합빈도가 큰 차

가 나지 는 것 할 수 었다 (Fig. 5). 결과 볼

HRQ1 recombination에 여하지 는 것 다.

- 21 -

Figure 5 Hrq1△ 균주 염색체 내 재 합 빈도.

Hrq1△ 균주 재 합 빈도 하 해 URA3 쪽에 LYS2

가 재하여 recombination 어날 경우 URA3 거 어

지 는 시스 용하 다.

- 22 -

HRQ1 삭 돌연변 균주 삼핵산 복 가 빈도 .

프 URA3 사 에 짧 CTG 복 열 갖고 는

플라 미드(pRS306-CTG) hrq1△ 균주 DNA에 끼워 어 실험하

다. 짧 CTG 복 열 갖고 경우 URA3 시킬 수

다. 하지만 체가 하게 CTG 복 열 가하여 URA

가 지 못하게 는 시스 다. 결과 WT 균주

hrq1△ 균주 사 에 큰 차 가 없는 것 하 다(Fig. 6).

- 23 -

Figure 6 Hrq1△ 균주 삼핵산 복 가 빈도.

Hrq1△ 균주 삼핵산 복 가 빈도 하 해 URA3

쪽에 CTG repeat 재하여 CTG repeat 가 경우

URA3 지 는 시스 용하 다.

- 24 -

HRQ1 삭 돌연변 균주 시간 생 .

실험 SD 지에 포 상태 지 키운 포 48시간마다 당

하여 YPD 지에 도말하 , colony 하는 숫

하여 실험하 다. 실험 glucose가 들어 는 지에 는

가 glucose 우 사용하게 고 그 결과 에탄 만들어진

다. 그 후 는 에탄 용하여 생 하게 다. 게

산 가 만들어지고 트산 만들어지 포에 스트 스가

가해지게 고 것 해 상 어 포가 죽게 다.

실험 결과 sgs1△ 균주, hrq1△ 균주는 생 균주 큰 차

나타내지 다. 하지만 hrq1△sgs1△ 돌연변 균주는 5 차

격 생 어드는 것 볼 수 었다(Fig. 7A). 실험

도 민감 한 25℃에 도 같 결과가 나타났다(Fig. 7B).

것 볼 hrq1△sgs1△ 돌연변 해 포가

하게 는 것 다. 것 볼 HRQ1 생 에

한 역할 하는 것 다.

- 25 -

0

20

40

60

80

100

120

1 3 5 7 9 11 13

time(day)

chro

nolo

gic

al surv

ival (%

)

wt

hrq1Δ

sgs1Δ

Δhrq1Δsgs1

0

20

40

60

80

100

1 3 5 7 9 11time(day )

chro

nolo

gic

al surv

ival (%

)

wt

hrq1Δ

sgs1Δ

hrq1Δsgs1Δ

A

B

- 26 -

Figure 7 Hrq1△ 균주 시간 생

Hrq1△ 균주 생 연 보 해 생 , Hrq1△ 균주,

Sgs1△ 균주, Hrq1△Sgs1△ 돌연변 균주 SD 지에

상 열 하지 지 키운 후 48시간 마다 당 하

여 YPD에 도말하여 생 는 colony 숫 하 다.

- 27 -

HRQ1 삭 돌연변 균주 연 생 돌연변 빈도 .

실험 CAN1(YEL063) 돌연변 가 어나는 지

하 다. CAN1 는 arginine 투과 한다. 실험

에 사용하는 시 L-canavanine arginine 과 사하지만 에

막는 역할 한다. CAN1 가 상 경우 arginine 투

과 에 해 L-canavanine 포 들어 가 랄 수

없게 다. 하지만 CAN1 에 돌연변 가 생 경우 arginine 투

과 가 망가 L-canavanine 포 들어 수 없어 포

가 살 수 다. 게 하여 CAN1 에 돌연변 가 생한 도

쉽게 할 수 다. 실험 생 연 실험과 같

식 진행하 다. SD 지에 포 상태 지 키운 포 48시간

마다 당 하여 YPD 지에 도말하 , colony 하는

숫 한다. 2×107 cell 도 수 하여 균수 어

후 별 지(SD-arg, 60μg/ml L-canavanine sulfate)에 도말 하

여 하 다. 그 결과 hrq1△ 균주에 돌연변 빈도가 가하는

것 할 수 었다. 또한 hrq1△sgs1△ 돌연변 균주는 5

차 후 격 살 는 포수가 어들어 5 차 지만 할 수

었다. 그 5 차 지 만 결과 보 hrq1△ 균주보다 돌연

변 생 도가 가하는 것 할 수 었다(Figure. 8). 것

보 HRQ1 체 여하는 것 다.

- 28 -

0

5

10

15

20

25

30

35

1day 3day 5day 7day 9day 11day 13day

muta

tion f

requency

can

r m

uta

nts

/10 6

cells

wt

hrq1Δ

sgs1Δ

Δhrq1Δsgs1Δ

Figure 8 Hrq1△ 균주 연 생 돌연변 빈도

Hrq1△ 균주 연 생 돌연변 빈도 보 해 생 ,

Hrq1△ 균주, Sgs1△ 균주, Hrq1△Sgs1△ 균주 25℃ 경에

SD 지에 상 열 하지 지 키운 후 48시간 마다

당 하여 YPD 별 지(CAN+)에 도말 하여 생 는

colony 숫 하 다.

- 29 -

HRQ1 삭 돌연변 균주 EMS 도돌연변 빈도 .

연 생 돌연변 달리 DNA에 상 주는 질 첨가하여 돌연

변 도하 경우 hrq1△ 균주가 생 균주 어 차 가 나

는지 보 해 EMS 용하여 도돌연변 빈도 하

다. 실험도 연 생 돌연변 같 CAN1(YEL063)

에 돌연변 가 생하는 빈도 하 다. hrq1△ 균주 YPD에

OD600: 1.0 지 한 후 수 하여 EMS 20μl 1시간 처

리 후 돌연변 가 어나는 포 별하 해 별 지

(SD-arg,60μg/ml L-canavanine sulfate)에 도말하고 살 는 포

수 하 해 당 하여 YPD 지에 도말하 다. 실

험 결과 생 균주보다 hrq1△ 균주가 돌연변 빈도가 2 도

가하 다. 그러나 연 생돌연변 빈도 역시 도 차 가 나타

나 에 EMS 처리한 경우는 hrq1△ 균주 돌연변 빈도

큰 향 주지 는 것 보 다(Fig. 9).

- 30 -

0

5

10

15

20

25

30

Muta

tion fre

quency

(Canr

muta

nts

/10-

6 c

ell)

W T

HRQ 1△

Figure 9 Hrq1△ 균주 도 돌연변 빈도

Hrq1△ 균주 생 연 보 해 생 과 Hrq1△ 균

주 30℃ 경에 지수 지 한 후 YPD 별 지

(CAN+) 도말 하여 생 는 colony 숫 하 다.

- 31 -

참고 헌

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Curr Biol 13: 1954-1962(1) Wood, R. D.(1996)

- 33 -

감사

실험실 생 하 신경도 많 쓰 게 하고 사고만 끌

어 주시고 가 쳐 주신 수님 말 감사드립니다. 그리고

어주시고 심사해주신 민경진 수님, 수님 감사드

립니다. 그리고 학 4학 , 학원 2 동 에게 많 것 가

쳐주신 재 수님, 병 수님, 강 수님, 수

님 , 민 식 수님, 창 수님, 수님, 천 수님,

수님께도 감사드립니다.

학 맹 들어 지 껏 사고만 는 에게 실험 가

쳐주신 2 째 지 훈 그리고 말 열심 공 하시고

실험하 “ 런 게 진 한 학원생 나” 느끼게 해주신 도

, 지 계시지만 하신 , 운 미누나, 그리고

지 에 가 는 랑 마 맞 지

말 감사하고 든 시 도하겠습니다.

그리고 우리 보 리들 량, 미 , , 민지 실험하느라 수고했

고 공 열심 하 란다.

그리고 나랑 만나느라 지고 는 우리 만 열심 해 훌

한 지컬 우가 란다. 마지막 지, 어 니 사랑합니

다. 건강하시고 래 사 . 그리고 우리 보라누나 열심 들 돌

보 행복하게 살 래.