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Dra. Florencia Giliberto ([email protected]) “Laboratorio de Distrofinopatías” Cátedra de Genética Facultad de farmacia y Bioquímica. UBA INIGEM CONICET-UBA

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Page 1: Dra. Florencia Giliberto - Bioquimica · 2000 exones ≈ 50 genes 180 000 exones 6 billion bp of DNA 20 000 genes cobertura≈90% cobertura≈ 99% reads ≈50x reads ≈≥500x No

Dra. Florencia Giliberto

([email protected])

“Laboratorio de Distrofinopatías”

Cátedra de Genética

Facultad de farmacia y Bioquímica. UBA

INIGEM CONICET-UBA

Page 2: Dra. Florencia Giliberto - Bioquimica · 2000 exones ≈ 50 genes 180 000 exones 6 billion bp of DNA 20 000 genes cobertura≈90% cobertura≈ 99% reads ≈50x reads ≈≥500x No

SANGER

1975

2017

mejoras revolucionarias!

Bioinformática

RobóticaNanobiología

2005

NGS

Lectura masiva en paralelo

High thoughput DNA seq

SALUD

Diagnóstico

Era de las Omicas

Dra. Florencia Giliberto

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Exoma/Panel

Dra. Florencia Giliberto

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2000 exones≈ 50 genes

180 000 exones20 000 genes6 billion bp of DNA

cobertura≈ 99%cobertura≈90%

reads ≈ 50x reads ≈ ≥500x

No para Diagnóstico!

single gen sequencing

Dra. Florencia Giliberto

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Promedio de variantes encontradas

• Paneles: 2-3 variantes por gen. (DMD 10 a 30)

• Exoma: 30.000-85.000 variantes

• Genoma: 3.000.000-4.000.000 variantes

Dra. Florencia Giliberto

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VARIANTE DEFINICIÓN EJEMPLO IMPACTO INFORME

Patogénica Mutación causante de

patología

Frame-shifting

variant / stop codon

Diagnóstico Si

Polimorfismo

benigno

Variación de sec. sin efecto adverso conocido

Variante presente en dbSNP con alta frecuencia

Podría ser un modificador genético en estudios futuros.

No/Si

VOUS/VUS Variante de significado incierto o desconocido

Variante Missense en una zona conservada evolutivamente

Podría cambiar a ser patogénica con estudios adicionales

Si

Incidental

findings

Variante que ha sido asociada con riesgo para desarrollar otra enfermedad, pero no es relevante para el diagnóstico específico del paciente.

Mutación en otro gen Ej: CFTR

No es diagnóstico. Evaluar si está indicado en ACMG con un accionar clínico definido. (American College of Medical Geneticsand Genomics)

Si, si hay accionar clínico/No

Genetic

modifier

Variante que modifica el estado de una enfermedad, ubicada en un 2do gen.

Variante en un 2do gen que hipotéticamente aumenta o disminuye la expresión de mi gen.

Modificadores genéticos de enfermedades monogénicasaún son pocos.

No/Si

http://circgenetics.ahajournals.org/ by guest on July 8, 2017 (Jaya Punetha, MS; Eric P. Hoffman, PhD)Dra. Florencia Giliberto

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Dra. Florencia Giliberto

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Es conveniente secuenciar por NGS?

Cuando…

SI NO Depende

Dra. Florencia Giliberto

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El profesional tiene clara sospecha de cual es la patología.

La enfermedad está bien caracterizada a nivel molecular.

En que casos es conveniente secuenciar?

Conozco el modo de herencia. (AD, AR, ligX, lig Y)

La enfermedad es monogénica! Y se conoce el gen.

Dra. Florencia Giliberto

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Existen bases de datos para mi patología?

Que tipo de mutaciones están reportadas en el gen?

Puntuales deleciones Duplicaciones (CNV)

GE

N

DMD

Dra. Florencia Giliberto

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ExomaAprox 1-2% codificante

(180.000 exones ~ 30.000.000 pb)

Cubre el 85% de las variantes

implicadas en patologías

Dra. Florencia Giliberto

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Análisis de Secuenciación de Exoma Completo (WES)

¿Dónde voy a buscar la variante de secuencia que pueda ser la causante de la patología?

DMD

¿Cómo puedo saber lo que es normal y lo que es variante de secuencia?

¿Qué hago con todo eso?

Dra. Florencia Giliberto

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Caso 1Secuenciación de Exoma Completo

18 Variantes de secuencia en el gen DMD Variantes intrónicas

DMD MLPA normal

Impact:

High!NM_004006.2:c.7096C >A, p.Gln2366Lys

Mal nomenclada!!!

Dra. Florencia Giliberto

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TGG>TAG

UGG>UAG

No fue reportada en 1000 genomas, Hapmap ni ExAc

Paciente candidato para tratamiento de terapia Génica con Ataluren

Variante corroborada por SANGER!Dra. Florencia Giliberto

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DMD

c.2407C>T

p.Gln803*

MLPA normal

MLPA normal

Caso 2Secuenciación de Exoma Completo

Dra. Florencia Giliberto

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Dra. Florencia Giliberto

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SEGREGACIÓN

TRÍO VUS/VOUS

MISSENSE

WES

Dra. Florencia Giliberto

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SEGREGACIÓN

Como puedo corroborar si una variante tiene efecto patogénico?

AGA/del

c.10101_10103 del

AGA/del

AGA/del

delAGA AGA AGA

WES: Variante: c.10101_10103delAGA

Prog bioinf: patogénica

Dra. Florencia Giliberto

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Autosómica Recesiva Autosómica Dominante

VUS1

VUS2

VUS1

VUS2

VUS2VUS1

Wt/VUS

Wt/Wt Wt/Wt

de novo!

Wt/VUS

Con las VUS missense es más difícil asesorar a la familia.

TRIO

S

Dra. Florencia Giliberto

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Casos que quedan sin resolver

?

VUS (variante de significado incierto) Genes de significado inciertoVariantes que se encuentran en genes que aun

no han sido asociados con ese fenotipo. Sin

embargo, tienen variantes altamente

patogénicas (ej, stop codon).

En una Enfernedad Autosómica Recesiva

se encuentra una única mutación

Sin resultados concluyentes

No se encuentra ninguna variante

candidata.

Dra. Florencia Giliberto

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Quien interpreta estos informes !!!!!????

Sabrá que hacer con esa información!!!!????

Hoy por hoy tenemos muchas más preguntas o interrogantes

que respuestas. En especial con la interpretación de un estudio

de NGS…

Dra. Florencia Giliberto

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E X P E R T Oa

c

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B

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I

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E

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B oD ductivo

d

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a f o

Dra. Florencia Giliberto

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Leonela Luce,MS

PhD student

Florencia Giliberto, PhD

[email protected]

Laboratorio de Distrofinopatías

Cátedra de Genética

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Universidad de Buenos Aires

Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo

(INIGEM) CONICET-UBAChiara Mazzanti

Estudiante de BioquímicaMicaela Carcione

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