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Entwicklung eines vaskularisierten Lebermodells

Dr. Johanna SchanzFraunhofer IGB26. Oktober 2009

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Zellsysteme und Tissue Engineering

Biomaterialien

Bioreaktorentwicklung

Avaskuläre Gewebemodelle

Vaskularisierte Gewebemodelle

GMP Produktion von Advanced TherapeuticalMedicinal Products (ATMP)

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Biotransformationvon Xenobiotika

Bildung von Gerinnungsfaktoren

Beeinflussung desImmunsystems

Regelung des Hormon-gleichgewichts

Entgiftung von Stoffwechselprodukten

Energiequelle des Körpers

Funktionen der Leber

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Ausgangssituation

Durch die Metabolisierung von Medikamenten in der Leber können Abbauprodukte entstehen, die andere Eigenschaften als der Ursprungstoff haben

Hepatotoxizität ist der häufigste Grund dafür, dass Medikamente vom Markt genommen werden oder in den klinischen Studien versagen

Probleme in präklinischen Bewertung von Medikamenten:

Ergebnisse von Tierversuchen nicht uneingeschränkt auf den Menschen übertragbar

Bisherige humane in vitro Testsysteme meist nur über Stunden oder Tage einsetzbar

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Humane CYP und UGT Supersomen

Humane Lebermikrosomen

Humanes Leber Cytosol

Humane Leber S9 Fraktion

Humane Leberzelllinien

Transgene Zelllinien

Primäre Hepatozyten

Leberschnitte

Isolierte perfundierte Leber

Ko

mp

lexität

Gut für Studien von Metabolismus-mechanismen

Schneller Vitalitäts-und Funktionsverlust der Hepatozyten

Aber:

Kein komplexes organoidesTestsystem für Langzeitstudien

Humane in vitro Lebermodelle/Testsysteme

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Mikroumgebung der Hepatozyten in vivo

Siegenthaler, Blum: Klinische Pathophysiologie (2006), p. 860, Georg Thieme Verlag KG

■ Optimale Versorgung durch direkte Assoziation mit Sinusoiden

■ Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Zellen der Leber

■ Extrazelluläre Matrix Komponenten

■ Polarisierung/ 3D Kultur

■ Mechanische Stimuli

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Mikroumgebung der Hepatozyten in vivo

Ladewigfärbung- Zellkerne braun, Plasma rosa, Bindegewebe blau

■ Optimale Versorgung durch direkte Assoziation mit Sinusoiden

■ Co-Kultur mit nicht-parenchymalen Zellen der Leber

■ Extrazelluläre Matrix Komponenten

■ Polarisierung/ 3D Kultur

■ Mechanische Stimuli

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Perfusionsbioreaktoren

Hohlfaserreaktoren (z.B. Modular Extracorporeal Liver Support MELS von der Charité Berlin)

Membranreaktoren

Perfundierte Trägerstrukturen

Suspensionskulturen eingekapselter Zellen

Optimierte Zellversorgung

Verlängerung der Kultivierungszeit

Weniger komplex als Blutgefäßsystem

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Idee der Biologischen Vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc)

Verwendung einer natürlichen Matrix mit Blutgefäßsystem aus porcinen Jejunum für den Aufbau von vaskularisierten Gewebemodellen

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Kollagen I, III

Elastin, Fibronektin

Proteoglykane

Herstellung der BioVaSc (Biological Vascularised Scaffold)

Perfusion mit Tensidlösung über das Gefäßsystem und durch das Darmlumen

Behandlung mit DNase

Spülung mit Kochsalzlösung

γ - Bestrahlung

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Histologische Überprüfung der Azellularisierung

Histologische Analyse Hämalaun-Eosin und Feulgen Färbung

Verifikation durch Bestimmung der Rest-DNS

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Histologische Überprüfung der Azellularisierung

Histologische Analyse Hämalaun-Eosin und Feulgen Färbung

Verifikation durch Bestimmung der Rest-DNS

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Jan HansmannHugo Geiger Preis 2006Lewa Preis 2006

Bioreakorsystem für die Kultivierung vaskularisierter Gewebe

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Bioreaktor

Messkarte

Schlauchpumpe

Druck-sensor

PC für Steuerung und Überwachung

Arterieller Druck [mmHg]

60

100

10

0 1 2 3 4 5

Given value

Measured pressure

Zeit [s]

Regelung Bioreakorsystem

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PC-gesteuertes BioreaktorsystemBiologische vaskularisierteTrägerstruktur

Primäre Zellen

Hepatozyten

Endothelzellen

Isolation + 2 D Kultur

Besiedelung Dynamische 3 D Co-Kultur

Aufbau des Lebermodell mit Blutgefäßsystem

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vascularised matrix

arterial pedicle

culture media + mEC

inflowreturn

venous pedicle

BA

arterialpedicle

venouspedicle

mEC seededcapillary

tissuespecific

cells

Scaffoldlumen

C

Prinzip der vaskularisierten 3D Gewebemodelle

Fraunhofer „Technik für den Menschen“ Preis 2009

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Biomaterials 2005; 26: 6610-6617

Besiedelung der vaskulären Strukturen

FLK-1 x100

Life-dead Färbung eines Blutgefäßquerschnittes

CD 31

Verifikation• RT-PCR• Western Blot• FDG PET

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Besiedelung des DarmlumensAnti-CKLP34

X630 Amplification

X400 Amplification X1000 Amplification

X 630 Amplification

Anti-Hepatozyte

X630 Amplification

Anti VEGF

Anti-ZO-1Anti-Ki67 (MIB-1)

X 630 Amplification

Pan Cadherin

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Funktionsnachweise

Harnstoffsynthese

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0 5 10 15 20 25Zeit [d]

Kon

zent

ratio

n [m

g/m

l]

BR 2BR 3BR 4

Harnstoffsynthese

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0 5 10 15 20 25Zeit [d]

Kon

zent

ratio

n [m

g/m

l]

BR 12BR 13BR 14BR 15

Schweinemodell Humanmodell

MedienwechselMedienwechsel

MedienwechselMedienwechsel

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Albuminsynthese

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 5 10 15 20 25

Zeit [d]

Kon

zent

ratio

n [µ

g/m

l]

BR 12BR 13BR 14

MedienwechselMedienwechsel

Linke K, Schanz J, Hansmann J, Walles T, Brunner H, Mertsching H: Engineered liver-liketissue on a capillarized matrix for applied research” - Tissue Engineering 2007; 13, 1-9

Laktatbildung

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0 5 10 15 20 25

Zeit (d)

Kon

zent

ratio

n (m

g/m

l)

BR 3BR 1BR 2BR 5

Medienwechsel Medienwechsel

Funktionsnachweise

Schweinemodell Humanmodell

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0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25

BR17

Albuminsynthese Bioreaktor

Kon

zent

ratio

n m

g/m

l

Zeit [d]

0

50

100

150

0 5 10 15 20 25

BR17

DextrorphanDextrorphan-Glucuronidid3-Hydroxymorphinan

Kon

zent

ratio

n pm

ol/m

l

Zeit [d]

Getestete Parameter:

Laktatdehydrogenase

AST/ALT

Laktatbildung

Harnstoffsynthese

Albuminsynthese

Gallensäureproduktion

VEGF Expression

DextrometorphanMetabolismus

Stoffwechselaktivität des Lebermodells

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Lebermodell

CFDA x400

Pan-Cadherin x 1000

Na-Ca-ATPase

Vaskularisierung• mit Endothel ausgekleidete Blutgefäße

Physiologische Kultur• Simulation des natürlichen Blutflusses

Funktionalität• Harnstoff, Albumin, Gallensäuren und Laktat Synthese

über drei Wochen• Phase I und II Metabolismus von Dextrometorphan

über drei Wochen

Potential• Substanzapplikation über das Gefäßsystem• Mehrfachapplikationen• Langzeitstudien

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Ausblick

Testung verschiedener relevanter Arzneimittel (z.B. Cyclosporin, Valproinsäure, Acetaminophen, Troglitazon) und Vergleich mit Tiermodell

Verlängerung der Kulturzeit

Testung kryokonservierter Hepatozyten?

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Danksagung

Prof. Dr. Heike Walles

Dipl. Ing. (FH) Kirstin Linke

Prof. Dr. Thomas Hirth

Prof. Dr. Herwig Brunner

Prof. Dr. Andreas Nüssler und AGTechnische Universität München

Dr. Martin Schenk Eberhard Karls Universität Tübingen

Prof. Dr. Armin WolfProf. Dr. Peter EndNovartis Pharma AG

dem ZS Team