dp tomaskova z

UNIVERZITA PAVLA JOZEFA ŠAFÁRIKA

Prírodovedecká fakulta

Ústav fyzikálnych vied

SLOVENSKÁ AKADÉMIA VIED

Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky

Mgr. Zuzana TOMÁŠKOVÁ

ŠTÚDIUM PERMEAČNÝCH VLASTNOSTÍ

INTRACELULÁRNYCH Ca2+

KANÁLOV

IZOLOVANÝCH ZO SRDCA POTKANA

DIZERTAČNÁ PRÁCA

Školiteľ: Mgr. Marta GABURJÁKOVÁ, PhD.

Bratislava 2009

Čestne prehlasujem, že predloženú prácu som vypracovala samostatne a všetku použitú

literatúru uvádzam v zozname.

8.12.2008, Bratislava ____________________

Zuzana Tomášková

Ďakujem mojej školiteľke Mgr. Marte Gaburjákovej, PhD., za odborné vedenie, cenné

rady a pripomienky počas štúdia a pri vypracovávaní tejto práce. Ďakujem tiež kolegyni

Mgr. Janke Gaburjákovej, PhD. za pomoc a praktické rady. V neposlednom rade patrí

poďakovanie aj mojim blízkym a priateľom, a predovšetkým manželovi Milanovi, za

ich všestrannú podporu.

Obsah

1 Úvod......................................................................................................... 9

2 Teoretický prehľad..................................................................................... 11

2.1 Ryanodínový receptor.............................................................................. 11

2.1.1 Spriahnutie excitácie s kontrakciou...................................................... 11

2.1.1.1 Izoformy RyR kanálov a ich výskyt................................................. 15

2.1.1.2 Usporiadanie RyR kanálov na membráne SR.................................... 15

2.1.2 Primárna štruktúra RyR kanálu............................................................. 17

2.1.3 Priestorová štruktúra RyR kanálu.......................................................... 22

2.1.4 Porovnanie srdcovej a kostrovej izoformy RyR kanálu............................ 24

2.1.5 Korelácia medzi lokalizáciou oblastí divergencie a subdomén RyR

kanálu.............................................................................................

25

2.2 Teórie vodivosti iónových kanálov a aplikácie........................................... 26

2.2.1 Teoretické modely pre popis toku iónov cez iónový kanál....................... 29

2.2.1.1 Bariérová teória............................................................................. 29

2.2.1.2 Vlastnosti viac-iónových kanálov.................................................... 33

2.2.1.3 Bariérový model RyR2 kanálu........................................................ 35

2.2.1.4 Difúzna teória – „Poisson-Nernst-Planck“ (PNP) teória...................... 36

2.2.1.5 PNP model RyR2 kanálu................................................................. 38

2.2.1.6 AMFE teória............................................................................... 44

2.2.2. Model vodivého póru RyR kanálu......................................................... 45

2.2.3 Vodivostné vlastnosti, selektivita a obsadenosť RyR2 kanálu.................... 51

2.2.3.1 Vodivosť a selektivita RyR2 kanálu................................................. 51

2.2.3.2 Obsadenosť selektívneho filtra RyR2 kanálu jedno- a dvojmocnými

iónmi........................................................................................

54

3 Ciele práce................................................................................................ 55

4 Metódy....................................................................................................... 56

4.1 Izolácia vezikúl zo sarkoplazmatického retikula......................................... 56

4.1.1 Roztoky na izoláciu vzoriek.................................................................. 56

4.2 Roztoky..................................................................................................... 57

4.2.1 Lipidové roztoky.................................................................................... 57

4.2.2 Roztoky elektrolytov................................................................................ 58

4.2.3 Korekcia potenciálu na kvapalnom rozhraní........................................ 62

4.3 Metóda rekonštitúcie iónového kanálu do umelej lipidovej membrány........ 63

4.4 Analýza dát.......................................................................................... 66

5 Výsledky................................................................................................... 70

5.1 AMFE experimenty................................................................................ 70

5.1.1 Meranie Kd pre koncentračnú závislosť prúdu dvojmocných a

jednomocných iónov cez RyR2 kanál...............................................

70

5.1.2 Hľadanie AMFE javu v zmesi dvoch dvojmocných iónov.................... 72

5.1.3 Hľadanie AMFE javu v zmesi dvojmocného a jednomocného iónu........ 75

5.1.3.1 AMFE experimenty pre pomer koncentrácií cis/trans = 12............... 75

5.1.3.2 AMFE experimenty pre pomer koncentrácií cis/trans = 1................ 77

5.1.4 Hľadanie AMFE v zmesi dvoch jednomocných iónov.......................... 79

5.1.5 Zhrnutie vodivostných parametrov RyR2 kanálu získaných z AMFE

experimentov................................................................................

83

5.2 Meranie reverzného potenciálu................................................................. 84

5.2.1 Koncentračná závislosť reverzného potenciálu..................................... 84

5.3 Porovnanie I-V závislostí RyR2 kanálov a mitochondriálnych aniónových

kanálov.................................................................................................

89

Príloha: I-V krivky vo vybraných iónových podmienkach.................................. 92

6 Diskusia.................................................................................................... 95

7 Záver........................................................................................................ 100

9 Literatúra......................................................................................................... 102

Zhrnutie..................................................................................................... 116

Zoznam použitých skratiek

3D trojrozmerný

A/D analógovo-digitálny

AEBSF 4-(2-aminoetyl)-benzénsulfonylfluorid hydrochlorid

AK aminokyselina

Ala aminokyselina alanín

AMFE anomálny mólový frakčný efekt

AMP-PCP nehydrolyzovateľný ekvivalent ATP

Arg aminokyselina arginín

Asp aminokyselina kyselina asparagová

ATP adenozíntrifosfát

BLM umelá lipidová dvojvrstva (bilayer lipid membrane)

CCD CCD kamera (charge-coupled device)

CICR Ca2+

-indukované uvoľnenie Ca2+

D oblasť divergencie

DFT teória funkcionálu hustoty (density functional theory)

DHPR dihydropyridínový receptor

EGTA kyselina etylénglykoltetraoctová

Erev reverzný potenciál

G vodivosť kanála

GHK Goldman-Hodgkin-Katz

Glu aminokyselina kyselina glutámová

Gly aminokyselina glycín

HEK293 ľudské embryonálne obličkové bunky

HEPES kyselina 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsírová

i0 amplitúda prúdu pri nulovom napätí

Ile aminokyselina izoleucín

iTM model póru s i transmembránovými segmentami

I-V prúdovo-napäťový

KcsA K+ kanál zo Streptomyces lividans

Kd väzbová konštanta

LJP potenciál na kvapalnom rozhraní (liquid junction potential)

LSQ (metóda) najmenších štvorcov (least squares (method))

M mol.l-1

Mi i-ty transmembránový segment

MTSEA+ etylamóniummetántiosíran

Pi koeficient permeability iónu i

PNP Poisson-Nernst-Planck

R plynová konštanta

RTG röntgenový

RyR ryanodínový receptor

RyR1 kostrová izoforma RyR kanálu

RyR2 srdcová izoforma RyR kanálu

RyR3 mozgová izoforma RyR kanálu

SD štandardná odchýlka (standard deviation)

SR sarkoplazmatické retikulum

T absolútna teplota

Trp aminokyselina tryptofán

Tyr aminokyselina tyrozín

Val aminokyselina valín

Abstrakt

Ryanodínový receptor (RyR) je vnútrobunkový Ca2+

kanál, ktorý je dôležitou

súčasťou procesu spriahnutia excitácie s kontrakciou vo svalových bunkách.

Sprostredkuváva transport Ca2+

iónov z vnútrobunkových zásobární do cytosolu.

Mechanizmus, akým ióny prechádzajú cez pór RyR kanálu je však stále nejasný.

V súčasnosti existujú dva matematické modely permeácie iónov cez RyR kanál –

bariérový model a PNP/DFT model. Každý z nich je založený na inej fyzikálnej teórii.

Bariérový model doteraz predpokladal jedno-iónový mechanizmus permeácie cez RyR

kanál. Naproti tomu, PNP/DFT model predpovedá prítomnosť viacerých, vzájomne sa

ovplyvňujúcich iónov v selektívnom filtri RyR kanálu.

Metódou rekonštitúcie iónových kanálov do umelej lipidovej dvojvrstvy sme

sledovali aktivitu individuálnych ryanodínových receptorov zo srdca potkana. Po prvé,

hľadali sme anomálie (AMFE jav) troch vybraných vodivostných parametrov:

reverzného potenciálu (Erev), vodivosti a amplitúdy prúdu pri nulovom napätí

v závislosti od relatívneho zastúpenia iónov v zmesi dvoch iónov. Použili sme rôzne

zmesi a rôzne jednomocné a dvojmocné ióny. V 2/9 zmesí sme zistili výskyt anomálie

vodivosti (Cs+-Na

+; Li

+-Ca

2+). Po druhé, zistili sme koncentračnú závislosť Erev pri

konštantnom pomere koncentrácií iónov cez membránu. Závislosť bola prítomná pri

všetkých troch testovaných pomeroch: 1,5 a12. Najvýraznejšia bola pri koncentračnom

pomere 12.

Naše výsledky, interpretované bariérovou teóriou, podporujú viac-iónový

mechanizmus permeácie iónov cez RyR kanál. Prítomnosť minima vodivosti v zmesi

Cs+-Na

+ bola vypočítaná PNP/DFT modelom RyR kanálu. Jej experimentálnym

nameraním sme prispeli k overeniu PNP/DFT modelu. Získané výsledky môžu pomôcť

pri odhaľovaní mechanizmu permeácie iónov cez RyR kanál a tiež pri ďalšom vývoji

matematických modelov permeácie cez tento kanál.

9

1 Úvod

Ryanodínový receptor (RyR) je významný vnútrobunkový iónový kanál. Vo

svalových bunkách tvorí súčasť mechanizmu spriahnutia excitácie s kontrakciou bunky.

Novodobé výsledky ukazujú na súvislosť RyR kanálov s niektorými srdcovými chorobami

(napr. arytmia, syndróm náhlej srdcovej smrti) a ochoreniami kostrového svalu (napr.

malígna hypertermia). V dnešnej dobe sa výskum vo svete stále viac zameriava na štúdium

RyR kanálov, a to nie len v natívnej, ale aj v geneticky modifikovanej forme. Už takmer 20

rokov je známa celá sekvencia DNA pre RyR kanál z rôznych organizmov. Približne

v rovnakom čase sa začala skúmať aj priestorová (3D) štruktúra RyR kanálu. Ťažiskovou

metódou, použitou pri skúmaní 3D štruktúry RyR kanálu, bola a dodnes je elektrónová

mikroskopia. RyR kanál je membránový proteín, čo prináša problémy s kryštalizáciou

a preto v súčasnosti nie je zatiaľ možné použiť röntgenovú štruktúrnu analýzu. Pri takomto

metodickom obmedzení sa podarilo získať 3D štruktúru RyR kanálu len s malým

rozlíšením. Avšak rozvoj počítačových metód na spracovanie obrazu významne prispel

k zväčšeniu rozlíšenia. Ale ani to nie je dostačujúce na objasnenie základnej vlastnosti RyR

kanálu, a tou je permeácia iónov cez kanál. Jeden spôsob, ako získať informácie

o permeácii iónov je na základe kryštalografickej štruktúry daného kanálu. To však

v prípade RyR kanálu nie je zatiaľ možné. K slovu sa preto dostávajú špeciálne

elektrofyziologické metódy, vďaka ktorým sa dajú získať indície vedúce k mechanizmu

permeácie. Od začiatku 90-tych rokov bolo publikovaných niekoľko prác zameraných na

permeáciu a vodivostné vlastnosti RyR kanálu. Dnes existujú dva teoretické modely a

každý z týchto modelov využíva iné fyzikálne teórie na popis vodivostných vlastností RyR

kanálu. Každý z nich prináša iný pohľad na to, akým spôsobom dochádza k presunu iónov

cez RyR kanál. Starší, bariérový model popisuje difúziu iónov cez iónový kanál ako

diskrétne preskakovanie iónov cez energetické bariéry vo vodivom póre. Novší, Poisson-

Nernst-Planckov (PNP) model uvažuje kontinuálny pohyb iónov v elektrickom poli

vodivého póru. V súčasnosti sa uvažujú dva spôsoby permeácie iónov cez iónový kanál.

Každý ión môže prechádzať samostatne, v póre sa zdrží charakteristicky dlho a difunduje

ďalej v smere svojho elektrochemického gradientu. Kanál, ktorým ióny prechádzajú

10

takýmto spôsobom, je jedno-iónový. Druhá možnosť je, že ióny sa vo vodivom póre

ovplyvňujú. V takomto tzv. viac-iónovom kanáli je prítomnosť viacerých iónov súčasne

potrebná na to, aby ióny získali dostatočnú energiu na vystúpenie z vodivého póru. Aj keď

sú teoretické modely permeácie iónov cez kanál len hrubé aproximácie toho, čo sa

v skutočnosti deje v póre kanálu, sú veľmi cenné na pochopenie základných princípov

permeácie iónov v kanáli. Podľa bariérovej teórie bolo navrhnutých niekoľko typov

experimentov, na základe ktorých je možné získať informácie o iónovej obsadenosti póru

kanálu. Bariérový model doteraz silno podporoval jedno-iónový charakter RyR kanálu.

Táto predstava vznikla na základe niekoľkých experimentálnych výsledkov. Naproti tomu,

neustále sa vyvýjajúci PNP model (PNP/DFT) predpovedá viac-iónový charakter RyR

kanálu. Len nedávno PNP/DFT model RyR kanálu ukázal, že niektoré vodivostné

vlastnosti závisia od voľby experimentálnych podmienok (výber iónov, koncentrácia

iónov). Nevhodne zvolenými podmienkami teda môžeme dospieť k nesprávnemu záveru.

Predložená práca obsahuje výsledky, ktoré napomáhajú k objasneniu mechanizmu

permeácie iónov cez RyR kanál. Získané experimentálne výsledky sú v súlade s najnovším

PNP/DFT modelom a zároveň podporujú viac-iónovú povahu RyR kanálu z pohľadu

bariérového modelu.

11

2 Teoretický prehľad

2.1 Ryanodínový receptor

Ryanodínový receptor (RyR) je vnútrobunkový iónový kanál, cez ktorý sa uvoľňujú

Ca2+

ióny z vnútrobunkových zásob. Získal svoje pomenovanie po rastlinnom alkaloide

ryanodíne. Vysoká afinita ryanodínu k RyR kanálu bola využitá pri jeho izolácii

z membrány sarkoplazmatického retikula. Prvú izoláciu RyR kanálu urobili Inui a kol.

v roku 1987 (z kostrového svalu - Inui a kol., 1987a; zo srdca - Inui a kol., 1987b).

2.1.1 Spriahnutie excitácie s kontrakciou

RyR kanál má významnú úlohu predovšetkým vo svaloch. RyR kanály sa

nachádzajú na membránach sarkoplazmatického retikula (SR) (Pessah a kol., 1985; Inui

a kol., 1987a,b). V lumene SR sa hromadia Ca2+

ióny potrebné na kontrakciu svalových

vlákien. RyR kanály interagujú s napäťovo-závislými Ca2+

-kanálmi, dihydropyridínovými

receptormi (DHPR), ktoré sú lokalizované v invagináciách sarkolemy, nazývaných T-

tubuly (transverzálne tubuly; Fosset a kol, 1983; Ríos a Brum, 1987). V miestach

priblíženia T-tubulov k membráne SR dochádza k prenosu signálu šíriaceho sa vo forme

akčného potenciálu po sarkoleme do vnútra bunky, kde Ca2+

ióny majú úlohu druhého

posla pri kontrakcii svalových vlákien. Tento proces sa nazýva spriahnutie excitácie

s kontrakciou (Sandow, 1952). K spriahnutiu excitácie s kontrakciou dochádza v úzkych

štrbinách, kde sú membrány T-tubulov a SR od seba vzdialené približne 10-12 nm

(Franzini-Armstrong a kol., 1999). Elektrický impulz šíriaci sa po sarkoleme aktivuje

DHPR kanály a ich aktivácia má za následok aktiváciu RyR kanálov. Aktivované RyR

kanály uvoľnia ióny Ca2+

z terminálnych cisterien SR do priestoru štrbiny. Odtiaľ Ca2+

difunduje ďalej do cytosolu, kde vytvorí komplex s troponínom C. Molekuly troponínu C

sa nachádzajú na aktínových vláknach. Naviazaním Ca2+

sa uvoľnia väzbové miesta pre

12

myozínové hlavičky na aktínových vláknach. Pri kontake aktínových a myozínových

vlákien dochádza k hydrolýze ATP na myozínovej hlavičke a uvoľnuje sa tým energia na

vykonanie práce – stiahnutia svalového vlákna. Spriahnutie excitácie s kontrakciou môže

prebiehať na rôznych typoch spojení: v triádach (väčšinou v kostrových svaloch, 1 T-tubul

a dve terminálne cisterny SR, Obr.2.1.1.; Porter a Palade, 1957; Franzini-Armstrong,

1970), v dyádach (prevažne v srdcovom svale, 1 T-tubul a 1 terminálna cisterna SR; Jewett

a kol., 1971) alebo v periférnych spojeniach (sarkolema v blízkosti cisterny SR; Johnson

a Sommer, 1967).

Obrázok 2.1.1. Triáda z kostrového svalu. T-tub označuje

T-tubul, TC označuje terminálnu cisternu SR. V oblasti

priblíženia sarkolemy vo forme T-tubulu k terminálnym

cisternám SR dochádza k spriahnutiu excitácie s kontrakciou.

Táto triáda bola zobrazená metódou kryo-elektrónovej

mikroskopie (Wagenknecht a kol., 2002).

Počas evolúcie sa vyvinuli dva rôzne spôsoby interakcie RyR kanálov s DHPR

kanálmi (Di Biase a Franzini-Armstrong, 2005): prvý spôsob je charakteristický pre

kostrové svaly bezstavovcov, hladké svaly a srdcový sval stavovcov. Počas ~100 ms

trvajúceho akčného potenciálu na sarkoleme dochádza k aktivácii DHPR kanálov (Fill

a Copello, 2002). Aktivované DHPR kanály prepustia z vonkajšieho prostredia Ca2+

ióny

do štrbiny medzi membránou T-tubulu a SR. RyR kanály prítomné v tejto štrbine sú týmto

Ca2+

aktivované a uvoľnia Ca2+

z terminálnych cisterien SR. Tento mechanizmus sa nazýva

Ca2+

-indukované uvoľnenie Ca2+

, CICR („calcium induced calcium release“; Obr.2.1.2.,

Fabiato a Fabiato, 1975). RyR kanály zo srdca (RyR2) sú na membráne SR usporiadané do

pravidelnej mriežky (Bossen a kol., 1978; Sun a kol., 1995), zatiaľčo rozmiestnenie DHPR

kanálov je náhodné. Pomer počtu RyR2 k DHPR kanálom v srdcovom svale sa môže

v jednotlivých živočíšnych druhoch líšiť, napr. u králika je to 3,7; u potkana 7,3 alebo u

fretky 10,2 (Bers a Stiffel, 1993).

13

V kostrovom svale sa uplatňuje kvalitatívne iný mechanizmus uvoľnenia Ca2+

zo

SR. Prenos signálu medzi sarkolemou a membránou SR je podstatne rýchlejší. Akčný

potenciál je kratší , trvá približne 2 ms (Fill a Copello, 2002). Konformačné zmeny DHPR

kanálov sa pravdepodobne prenášajú na RyR kanál priamou interakciou (Obr.2.1.3., Block

a kol., 1988). RyR kanály z kostrového svalu (RyR1) sú na membráne SR tiež usporiadané

do pravidelnej mriežky, podobne ako v srdci. (Ferguson a kol., 1984). Vzájomné

usporiadanie RyR1 a DHPR kanálov v kostrovom svale je pravidelné a na každý druhý

RyR1 kanál pripadá jedna tetráda DHPR kanálov, teda pomer počtu RyR1 k DHPR

kanálom je 0,5. Tetrády DHPR kanálov sú umiestnené nad stredmi štyroch monomérov

tvoriacich jeden homotetramérny RyR1 kanál (Obr.2.1.4., Block a kol., 1988).

Obrázok 2.1.2. Schéma procesu Ca2+

-indukovaného uvoľnenia Ca2+

(CICR) prebiehajúceho

v srdcovom svale. Akčným potenciálom aktivovaný DHPR kanál prepustí z vonkajšieho

prostredia Ca2+

ióny, ktoré aktivujú najbližší RyR2 kanál. Následne uvoľnené Ca2+

ióny aktivujú

okolité RyR2 kanály nachádzajúce sa na membráne SR. Cez otvorené RyR2 kanály vychádzajú

Ca2+

ióny z terminálnej cisterny SR do cytosolu. Je to jedna z možných schém procesu CICR.

Inou z možností je spriahnutá aktivácia RyR2 kanálov nachádzajúcich sa v zhluku okolo prvého

aktivovaného kanálu. Plné šípky v schéme predstavujú aktiváciu, prerušované šípky tok iónov.

14

Obrázok 2.1.3. Schéma mechanizmu aktivácie RyR1 kanálov v kostrovom svale. DHPR

kanály sú, rovnako ako v srdci, aktivované akčným potenciálom. Predpokladá sa, že

konformačné zmeny na DHPR kanáloch v dôsledku aktivácie sú prenášané priamou interakciou

na RyR1 kanál, s ktorým je tetráda DHPR kanálov v kontakte. RyR1 kanál sa následne aktivuje

a otvorí. Tým sa do štrbiny dostane Ca2+

. Tento môže aktivovať susedné RyR1 kanály, ktoré nie

sú v kontakte s tetrádou DHPR. Plné šípky predstavujú aktiváciu, prerušované šípky tok iónov.

A B

Obrázok 2.1.4. (A) Tetráda DHPR kanálov v kostrovom svale. Štyri DHPR kanály tvoria

tetrádu nad jedným RyR1 kanálom. Kanály sú situované nad jednotlivými monomérmi jedného

RyR1 kanálu. (B) Vzájomná poloha RyR1 a DHPR kanálov v kostrovom svale. Tetrády DHPR

kanálov sa nachádzajú nad každým druhým RyR1 kanálom. Takéto zoskupenie je charakteristické

pre kostrové svaly, v srdcovom svale sú DHPR kanály rozložené náhodne.

15

2.1.1.1 Izoformy RyR kanálov a ich výskyt

V cicavcoch sa exprimujú tri izoformy RyR kanálov označené ako RyR1, RyR2

a RyR3. RyR1 sa najviac vyskytuje v kostrových svaloch a v Purkyňovych bunkách

v mozočku (Furuichi a kol., 1994). RyR1 sa nazýva aj kostrová izoforma. RyR2, srdcová

izoforma, je v najväčšom množstve prítomná v srdcovom svale a v mozgu (Otsu a kol.,

1990; Murayama a Ogawa, 1996). RyR3 sa nazýva mozgová izoforma. Okrem mozgu sa

vyskytuje (Murayama a Ogawa, 1996) aj v hladkých svaloch (Neylon a kol., 1995)

a lymfocytoch (Hosoi a kol., 2001).

2.1.1.2 Usporiadanie RyR kanálov na membráne SR

RyR kanály nie sú na membráne SR rozložené náhodne. Na obrázkoch

z elektrónového mikroskopu sú viditeľné pravidelné zoskupenia RyR1 kanálov

v kostrovom svale (Obr.2.1.5.A, Wagenknecht a kol., 2002; Liu a kol., 2004). Jednotlivé

RyR1 kanály sú usporiadané do dvoch alebo troch radov v pravidelných rozostupoch od

seba (Block a kol., 1988; Ferguson a kol., 1984). RyR2 kanály v srdcovom svale sú

rovnako usporiadané do pravidelnej mriežky (Protasi a kol., 1996). Schematicky sa dá

povedať, že tetraméry RyR sú uložené vedľa seba ako políčka jednej farby na šachovnici.

Susedné RyR kanály sa nedotýkajú rohmi, ale sú voči sebe mierne natočné a stranami sa

prekrývajú na dĺžke ~12 nm, čo je takmer polovica dĺžky strany (Saito a kol., 1988).

Na základe pozorovaní z elektrónového mikroskopu boli navrhnuté dve možnosti

uloženia RyR kanálov na membráne SR (Wagenknecht a kol., 1997). Prvá možnosť je, že

k interakcii medzi susednými RyR kanálmi dochádza na subdoménach 6 a 10

cytoplazmatickej domény každého tetraméru (Obr.2.1.5.B, bližšie v časti 2.1.2 Primárna

štruktúra RyR kanálu). Druhá možnosť predstavuje interakciu na subdoménach 9 a 10.

Pozorované natočenie kanálov v tejto mriežke (Protasi a kol., 1996; Yin a Lai, 2000;

Wagenknecht a kol., 2002) je v súlade s prvou z možností (Liu a kol., 2004), teda so

zapojením subdomén 6 a 10. Subdoména 6 obsahuje tzv. oblasť divergencie (D2), ktorá je

prítomná u izoforiem RyR1 a RyR2. Táto oblasť predstavuje úsek primárneho reťazca

16

aminokyselín, ktorý je málo konzervovaný medzi jednotlivými izoformami RyR kanálu.

RyR3 kanál túto oblasť neobsahuje, čo má pravdepodobne za následok iný spôsob

A

B

Obrázok 2.1.5. (A) Zoskupenie RyR1 kanálov

v kostrovom svale. RyR1 kanály sa vzájomne

dotýkajú v oblastiach rohov. Biele body označujú

stredy jednotlivých RyR1 kanálov. Kanály sú

zobrazené z cytosolickej strany. Obrázok vznikol

metódou tomografickej rekonštrukcie (Wagenknecht

a kol., 2002). V dolnej časti obrázku je počítačová

rekonštrukcia štruktúry RyR1 kanálu.

(B) Subdomény srdcového RyR2 kanálu. Subdomény označené bielymi číslicami majú

pravdepodobnú úlohu v usporiadaní RyR2 kanálov

na membráne SR do mriežky. V súčasnosti sa

predpokladá, že k interakcii jednotlivých RyR2

kanálov dochádza v oblastiach 6. a 10. subdomény

(Sharma a kol., 1998).

interakcie medzi susednými kanálmi. RyR3 kanály sú, podobne ako zvyšné dve izoformy,

pravidelne usporiadané do mriežky, ktorá sa však signifikantne líši od mriežky pre RyR1 a

RyR2 kanály (Protasi a kol., 2000). Yin a Lai (2000) ukázali, že vytvorenie pravidelnej

štruktúry na ploche membrány SR je prirodzená vlastnosť RyR kanálov, ktorá je

podmienená jeho primárnou štruktúrou. In vitro pozorovali vznik takéhoto usporiadania

purifikovaných RyR1 kanálov vložených do roztoku KCl s koncentráciou menšou ako 250

mM. Mriežku RyR1 kanálov pozorovali pod elektrónovým mikroskopom a určili veľkosť

vektorov mriežky je a=b= 31,5 ± 1,1nm, vektorový uhol (medzi vektormi r a a je 62,6º.

Vektory a a b sú na seba kolmé (Obr.2.1.6., Yin a Lai, 2000).

10nm

10nm

17

Obrázok 2.1.6. Mriežka RyR1

kanálov podľa Yina a Laia (2000).

Každý štvorec predstavuje jeden RyR1

kanál, bod označuje stred kanálu.

Vzdialenosť stredov od seba je a = b =

31,5 ± 1,1nm. Vektor r s mriežkovým

vektorom a zviera uhol 62,6o. RyR1

kanály sa dotýkajú na dĺžke takmer 12

nm, čo predstavuje približne polovicu

strany kanálu.

RyR kanály sa na membráne SR zoskupujú do zhlukov („clusters“), čím vytvárajú

funkčné jednotky, v ktorých dochádza k procesu uvoľnenia Ca2+

. Okraje susedných

zhlukov sú od seba vzdialené približne 100 nm v rýchlych zášklbných kostrových svaloch

a približne 700 nm v pomalých svaloch. V srdci potkana a myši je vzdialenosť medzi

krajmi zhlukov asi 300-400 nm (Franzini-Armstrong a kol., 1999). Veľkosť jedného zhluku

je podľa výsledkov Chen-Izu a kol. (2006) približne 250x250 nm. Odhaduje sa, že

v takomto zhluku by sa mohlo nachádzať asi 80 až 100 RyR kanálov (Chen-Izu a kol.,

2006). Predpokladá sa, že rozloženie zhlukov RyR kanálov má úlohu v kontrole

mechanizmu uvoľňovania Ca2+

iónov. Dostatočne veľká vzdialenosť medzi zhlukmi

zabezpečí, že aktivácia RyR kanálov je lokálna a nešíri sa v bunke, čo by mohlo mať

patologický dôsledok (Keizer a kol., 1998).

2.1.2 Primárna štruktúra RyR kanálu

RyR kanál je najväčší doteraz izolovaný iónový kanál s veľmi zložitou štruktúrou.

Je tvorený štyrmi identickými monomérmi, pričom celková molekulová hmotnosť je

približne 2,3 MDa (Liu a Wagenknecht, 2005).

18

Primárna štruktúra RyR kanálu bola zmapovaná na prelome 80. a 90. rokov

minulého storočia (Takeshima a kol., 1989; Zorzato a kol., 1990). Pre izoformy RyR

kanálu je charakteristická vysoká homológia primárnej štruktúry, až 66-70 % (Rossi

a Sorrentino, 2002), pričom najvyššia zhoda je v oblasti C-konca (Xu a kol., 2006). Gén pre

každú izoformu kóduje približne 5000 aminokyselín (RyR1 kanál – Takeshima a kol.,

1989; Zorzato a kol., 1990; RyR2 kanál - Nakai a kol., 1990; Tunwell a kol., 1996; RyR3

kanál - Hakamata a kol., 1992). Napriek vysokej homológii existujú v génoch RyR kanálu

výrazne rozdielne oblasti, tzv. oblasti divergencie (Tab.2.1.1., Sorrentino a Volpe, 1993).

Tieto oblasti pravdepodobne predstavujú miesta, ktoré dávajú jednotlivým izoformám

špecifické vlastnosti (Rossi a Sorrentino, 2002). V kostrových svaloch vtákov, plazov a

obojživelníkov boli nájdené dve izoformy RyR kanálu, ktoré sa označujú ako RyRα

a RyRβ (Fill a Copello, 2002). Sú to ekvivalenty cicavčích izoforiem, pričom v pároch

RyRα –RyR1 a RyRβ – RyR3 existuje 86 % homológia (Ottini a kol., 1996).

D1 D2 D3

RyR1 kanál 4254 - 4631 1342 – 1403 1872 – 1923

RyR2 kanál 4210 - 4562 1353 – 1397 1852 – 1890

RyR3 kanál 4100 - 4400 - -

Tabuľka.2.1.1. Oblasti divergencie RyR izoforiem (Sorrentino a Volpe,

1993). Oblasť D2 sa v RyR3 kanáli nenachádza. O oblasti D3 na RyR3

izoforme nie sú dostupné žiadne informácie.

Analýzou hydrofóbnosti aminokyselín bolo definovaných niekoľko

transmembránových segmentov RyR kanálu. Ich počet je v rozmedzí 4 až 12 (Obr.2.1.7.).

Jeden z prvých modelov navrhol Takeshima a kol. (1989). Podľa neho má RyR1 kanál 4

transmembránové zoskupenia (M1-M4). Tento model sa označuje ako 4TM model. Ďalší

model navrhli v roku 1990 Zorzato a kol. (1990). Použitím podobného experimentálneho

prístupu ako Takeshima a kol. (1989) predpovedali celkovo 12 transmembránových

segmentov (M’, M’’, M1-M10) v primárnej štruktúre RyR1 kanálu. Ich model sa označuje

ako 12TM model. M5, M6, M8 a M10 sú úseky s najväčším indexom hydrofóbnosti. Práve

tieto 4 transmembránové segmenty sa zhodujú so segmentami navrhnutými v 4TM modeli

19

(Obr.2.1.8., Williams a kol., 2001). Okrem hydrofóbnych úsekov sa v poslednej C-

terminálnej pätine nachádzajú aj silne nabité aminokyselinové (AK) sekvencie, ktoré

pravdepodobne smerujú do vnútra terminálnych cisterien. V roku 1992 Brandt a kol.

navrhli model s 8 transmembránovými segmentami. Štyri z týchto úsekov sú lokalizované

v poslednej pätine aminokyselinového reťazca (Obr.2.1.8., Brandt a kol., 1992). Iný

prístup na sledovanie topológie makromolekuly RyR1 kanálu zvolili Grunwald a Meissner

(1995), ktorí použili špecifické protilátky na označenie krátkych segmentov RyR1 kanálu.

Týmto prístupom identifikovali 2 luminálne slučky („lumenal loops“): prvá v rozsahu AK

4581-4640 a druhá 4860-4884. Prvá slučka sa vyskytuje aj v 12TM aj v 4TM modeli. Táto

sekvencia je ale slabo zachovaná medzi izoformami (~20% medzi RyR1 a RyR2

izoformami, a podobne medzi RyR1 a RyR3 izoformami). Takeshima a kol. (1989) aj

0 1000 2000 3000 4000 5000

4TM0 1000 2000 3000 4000 5000

12TM

0 1000 2000 3000 4000 5000

6TM

0 1000 2000 3000 4000 5000

8TM

Obrázok 2.1.7. Lokalizácia transmembránových segmentov primárneho reťazca RyR

kanálu podľa rôznych modelov. Najviac transmembránových, hydrofóbnych, segmentov sa

nachádza prevažne v poslednej pätine reťazca. Podľa modelov 8TM (Brandt a kol., 1992)

a 12TM (Zorzato a kol., 1990) sa vyskytujú transmembránové úseky aj v tej časti reťazca, ktorá

sa označuje ako cytosolická (0-4000 AK).

20

Brandt a kol. (1992) popísali druhú slučku ako luminálnu. Zorzato a kol. (1990) ju však

popisuje ako cytosolickú. Oblasť druhej luminálnej slučky je dobre zachovaná vo všetkých

troch izoformách a má pravdepodobne úlohu ako súčasť vodivej cesty. Výsledky

Grunwalda a Meissnera (1995) podporujú najjednoduchší model so štyrmi

transmembránovými segmentami (Takeshima a kol., 1989).

4TM

4000 4200 4400 4600 4800 5000

8TM

4000 4200 4400 4600 4800 5000

6TM

4000 4200 4400 4600 4800 5000

12TM

4000 4200 4400 4600 4800 5000

Obrázok 2.1.8. Modely výskytu transmembránových segmentov v intervale 4000 – 5000 AK. 4TM (Takeshima a kol., 1989), 6TM (Tunwell a kol., 1996), 8TM (Brandt a kol., 1992), 12TM

(Zorzato a kol., 1990). Na obrázku sú zobrazené transmembránové segmenty nachádzajúce sa

v poslednej pätine aminokyselinového reťazca. V 8TM modeli sa v tejto oblasti nachádzajú iba 4

z 8 navrhnutých segmentov. V 4TM, 8TM a 12TM modeloch RyR1 kanálu sa prekrývajú štyri

segmenty s najväčším indexom hydrofóbnosti (prerušovaná čiara). 6TM je model RyR2 kanálu

a transmembránové segmenety sa významne neprekrývajú s modelmi RyR1 kanálu.

21

Analýzou hydrofóbnosti aminokyselín bolo na RyR2 kanáli identifikovaných 6

potenciálnych transmembránových úsekov (M1-M6, Tunwell a kol., 1996). V 12TM modeli

podľa Zorzata a kol. (1990) je vnútorná závitnica tvorená posledným transmembránovým

úsekom (M10) a pór samotný je tvorený susedným úsekom M9 (Obr.2.1.9.B). Súčasťou

závitnice póru je aj selektívny filter. Vonkajšia závitnica, ktorá je v kontakte s lipidovou

A

B

Obrázok 2.1.9. Uloženie RyR kanálu v membráne. (A) 4TM model RyR kanálu. V 4TM

modeli je závitnica póru lokalizovaná medzi tretím (M3) a štvrtým (M4) transmembránovým

segmentom (prerušovaná šípka). (B) 12TM model RyR kanálu. V 12TM modeli sa predpokladá,

že závitnica póru je tvorená priamo transmembránovým segmentom M9 (podľa Du a kol., 2002).

Dĺžka slučky tvoriacej závitnicu póru je porovnateľná v oboch modeloch. Slučka medzi M3 a M4

v 4TM modeli je tvorená 59 AK, v 12TM modeli pozostáva slučka medzi M8 a M10 z 67 AK.

22

membránou, je tvorená transmembránovým úsekom M8 (Dulhunty a Pouliquin, 2003). Táto

predstava vznikla na základe porovnávania RyR2 kanálu s KcsA draslíkovým kanálom

(bližšie popísané v časti 2.2.2 Model vodivého póru RyR kanálu). V 4TM modeli tvorí

vonkajšiu závitnicu transmembránový úsek M4 a vnútornú závitnicu úsek M3. Závitnica

póru spolu so selektívnym filtrom je tvorená slučkou medzi nimi (Obr.2.1.9.A, Dulhunty

a Pouliquin, 2003).

2.1.3 Priestorová štruktúra RyR kanálu

Keďže existuje približne 70% homológia na aminokyselinovej úrovni medzi tromi

cicavčími izoformami RyR kanálu, neočakávali sa výrazné rozdiely v trojrozmernej (3D)

štruktúre kanálu. Prvé 3D-rekonštrukcie všetkých troch izoforiem s rozlíšením elektrónovej

mikroskopie tento predpoklad potvrdili.

Priestorová štruktúra RyR1 kanálu bola najskôr skúmaná metódou klasickej

elektrónovej mikroskopie (rozlíšenie nie je uvedené; Saito a kol., 1988). Táto metóda

pomohla získať hrubú predstavu o tvare a veľkosti kanálu. Detailnejší pohľad sa dosiahol

až použitím kryo-elektrónovej mikroskopie v kombinácii s počítačovou tomografiou.

Týmto spôsobom sa dosiahlo rozlíšenie približne 3 nm (Obr.2.1.10., Radermacher a kol.,

1994; Sharma a kol., 1998; Serysheva a kol., 1999). Všetky izoformy RyR kanálu sú

tetraméry a vykazujú štvornásobnú symetriu (Sharma a kol., 1998 - RyR2 kanál;

Radermacher a kol., 1994 - RyR1 kanál; Jeyakumar a kol. 1998, Sharma a kol. 2000 -

RyR3 kanál). Všetky tri izoformy RyR kanálu majú charakteristický tvar, ktorý pripomína

hríb, pričom “klobúčik” predstavuje cytoplazmatickú časť a “hlúbik” transmembránovú

časť (napr. Serysheva a kol., 1995, Sharma a kol., 1998, Sharma a kol.,2000).

Cytoplazmatické zoskupenie tvorí viac ako 4/5 hmotnosti kanálu (Wagenknecht a Samso,

2002) a pritom ~50% objemu, ktorý zaberá, je vyplnený okolitým roztokom (Radermacher

a kol., 1994). Táto časť RyR kanálu má tvar kvádra so štvorcovou podstavou s hranou

približne 29 nm a výškou 13 nm. Menšia, transmembránová časť má tvar kvádra s

podstavou 12x12 nm a výškou 7 nm (Obr.2.1.11., Liu a Wagenknecht, 2005).

23

Cytoplazmatická doména každého monoméru je zložená z minimálne 10 globulárnych

subdomén („cap“), ktoré sú označené číselne od 1 po 10 (Obr.2.1.10., Radermacher a kol.,

1994). Subdomény 5 až 10 sa nachádzajú na rohoch cytoplazmatickej oblasti a nazývajú sa

Obrázok 2.1.10. Počítačová rekonštrukcia RyR2 kanálu na základe obrázkov získaných

kryo-elektrónovou mikroskopiou. Na ľavej strane je pohľad na RyR2 kanál z cytosolickej

strany, v strede z luminálnej strany a napravo je bočný pohľad. TA označuje transmembránovú

časť, číslicami sú označené jednotlivé subdomény cytoplazmatickej domény. (Sharma a kol.,

1998)

svorky („clamps“). Subdomény 3 tvoria rukoväte („handles“) a nachádzajú sa po stranách

cytoplazmatickej časti. Subdomény 2 obklopujú centrálnu dutinu s priemerom 4-5 nm.

Subdoména 1 pravdepodobne spája transmembránovú oblasť s cytoplazmatickou (Liu

Obrázok 2.1.11. Rozmery

RyR2 kanálu. V ľavej časti

obrázku je pohľad na RyR2

kanál z luminálnej strany.

Dobre je viditeľné natočenie

transmembránovej časti

kanálu oproti väčšej,

cytoplazmatickej časti. Na

pravej strane je bočný

pohľad na RyR2 kanál.

Medzi rozmermi cicavčích

izoforiem RyR1, RyR2

a RyR3 kanálov nie sú

rozdiely (Liu a

Wagenknecht, 2005; obrázok

RyR2 kanálu podľa Sharma

a kol., 1998).

24

a Wagenknecht, 2005). Transmembránová časť je natočená približne o 40º okolo osi rotácie

kolmej na membránu SR vzhľadom na cytoplazmatickú časť (Serysheva a kol., 1995).

V roku 2005 sa podarilo autorom Serysheva a kol. získať štruktúru RyR1 kanálu

s rozlíšením 1,4 nm. Toto rozlíšenie dosiahli pomocou nového softvéru, ktorý vďaka

vylepšenému algoritmu umožnil detailnejšie spracovanie dát z predchádzajúcich

rekonštrukcií. Ich práca potvrdila prítomnosť centrálnej dutiny viditeľnej

z cytoplazmatickej strany, ale nedala jednoznačný dôkaz, že ide o vodivý pór. Pri 1,4 nm

rozlíšení sa ukázala zložitá štruktúra svoriek, napovedajúca o možnej interakcii s okolitými

molekulami. Napriek detailnejšej štruktúre RyR1 kanálu sa nepodarilo získať informáciu

o počte transmembránových segmentov. Ako píše Serysheva a kol. (2005), na to bude

pravdepodobne potrebné rozlíšenie 0,8 – 1 nm.

2.1.4 Porovnanie srdcovej a kostrovej izoformy RyR kanálu

RyR1 a RyR2 kanály sú veľmi podobné z hľadiska priestorového usporiadania.

Rozdiely sa ukazujú len pri bližšom pohľade na veľkosť a tvar jednotlivých domén

proteínu. Obidve izoformy obsahujú rovnaké subdomény v cytoplazmatickej oblasti, ale

veľkosť niektorých z nich je rozdielna. Konkrétne subdomény 8, 9 a 10, nachádzajúce sa

v rohových častiach (svorkách), sú väčšie v RyR2 ako v RyR1 izoforme. Naopak,

subdoména 7 je menšia. Na RyR1 kanáli je medzi subdoménou 5 a 6 zvýšená hustota

atómov a vytvára isté premostenie. Na RyR2 kanáli toto premostenie nebolo nájdené.

Predpokladá sa, že rohové oblasti cytoplazmatickej časti sú miestom interakcie RyR1 a

DHPR kanálov v kostrových svaloch. Preto rozdielne usporiadanie v rohových oblastiach

môže byť jednou z príčin rozdielneho mechanizmu spriahnutia excitácie s kontrakciou v

kostrových svaloch. (Sharma a kol., 1998).

V transmembránovej časti RyR1 kanálu Radermacher a kol. (1994) pozorovali

otvor s priemerom 2-3 nm (kryo-elektrónový mikroskop, rozlíšenie 3,1-3,3 nm,

Radermacher a kol., 1994). Na RyR1 kanáli udržiavanom v zatvorenom stave tento otvor

nebol pozorovaný (kryo-elektrónový mikroskop, rozlíšenie 3 nm; Serysheva a kol., 1995).

Serysheva a kol. v roku 1999 sledovali v kryo-elektrónovom mikroskope zmeny v štruktúre

25

RyR1 kanálu spôsobené čiastočnou aktiváciou 100μM Ca2+

a úplnou aktiváciou

v prítomnosti 100μM Ca2+

a 1mM AMP-PCP. Najvýraznejšie zmeny pozorovali

v transmembránovej časti, kde sa po čiastočnej aktivácii objavil centrálny otvor

s priemerom 0,7 nm. Pri úplnej aktivácii sa priemer otvoru zväčšil (Serysheva a kol., 1999),

ale nedosiahol priemer 1,8 nm ako v prítomnosti Ca2+

a ryanodínu (Orlova a kol., 1996).

Týmito prácami sa potvrdila lokalizácia vodivého póru v transmembránovej časti RyR

kanálu.

2.1.5 Korelácia medzi lokalizáciou oblastí divergencie a subdomén RyR kanálu

Divergentná oblasť D1 (jej cytoplazmatická časť) sa nachádza na subdoméne 3

(„rúčke“). Predpokladá sa, že D1 obsahuje jeden z transmembránových segmentov

(aminokyselinové zvyšky 4499-4519; Liu a kol., 2002). Oblasť D2 bola identifikovaná na

subdoméne 6. Je to jedna zo subdomén tvoriacich tzv.svorky na cytoplazmatickej oblasti.

Na základe umiestnenia D2 na trojrozmernej štruktúre RyR2 aj RyR1 kanálu sa usudzuje,

že by mohla mať úlohu pri zmenách konformácie počas vrátkovania kanálu. Význam

oblasti D2 bol ukázaný pri delécii príslušnej sekvencie z génu RyR1 kanálu. Takto

vzniknuté mutanty stratili schopnosť reagovať na excitáciu v kostrovom svale. D2 oblasť sa

takmer vôbec nenachádza v RyR3 kanáli (Liu a kol., 2004). Tretia oblasť divergencie, D3,

sa nachádza na cytoplazmatickej subdoméne 9 RyR2 kanálu. Na základe homológie medzi

izoformami sa predpokladá, že rovnako bude umiestnená aj v RyR1 a RyR3 kanáli.

Subdoména 9 je, podobne ako subdoména 6, súčasťou „svoriek“ na cytoplazmatickej

doméne (Zhang a kol., 2003). Hayek a kol. (2000) ukázali, že oblasť D3 sa podieľa na

regulácii RyR1 kanálu iónmi Ca2+

a Mg2+

, čo je úzko prepojené so spriahnutím excitácie

s kontrakciou.

26

2.2 Teórie vodivosti iónových kanálov a aplikácie

Medzi základné permeačné charakteristiky iónového kanálu patrí vodivosť a iónová

selektivita. Kanál v otvorenom stave poskytuje iónom vhodné prostredie (vodivý pór

kanálu) pre prechod cez lipidovú membránu v smere ich elektrochemického gradientu.

Prostredie póru určuje rýchlosť prechodu iónov cez kanál ako aj selektivitu. Podstatou

týchto dvoch javov je interakcia medzi prechádzajúcimi iónmi a aminokyselinami

kanálového proteínu.

Experimentálne môžeme merať vodivosť, ktorá odráža rýchlosť permeácie iónov,

a pomer koeficientov permeability pre dva ióny, ktorý určuje selektivitu kanálu pre jeden

typ iónu voči druhému. Vodivosť kanálu je daná smernicou napäťovej závislosti amplitúdy

prúdu prechádzajúceho cez kanál.

Mnohé iónové kanály sú schopné uprednostňovať niektoré typy iónov.

Diskriminácia medzi iónmi nastáva vo vnútri póru, konkrétne v selektívnom filtri (Fill and

Copello,2002). Selektivita kanálu sa zisťuje viacerými spôsobmi. Jednou z možností je

určenie selektivity z hodnoty reverzného potenciálu, pri ktorom je hodnota

makroskopického prúdu cez kanál nulová. Pri tomto potenciáli sú toky iónov cez kanál

v oboch smeroch vyvážené. Reverzný potenciál sa najčastejšie meria v podmienkach, kedy

sa na oboch stranách membrány nachádzajú maximálne dva typy iónov. Tieto podmienky

sa nazývajú bi-ionické podmienky. Výpočet pomeru koeficientov permeability sa

zjednoduší, ak sa na jednej strane membrány bude nachádzať len jeden typ iónu a na druhej

strane iný typ iónu. Pri výpočte pomeru koeficientov permeability z hodnoty reverzného

potenciálu sa vychádza zo vzťahu pre prúd, ktorý sa dá odvodiť Nernst-Planckovej

elektrodifúznej rovnice (2.1 /1) a z podmienky konštantného poľa, ktorá hovorí, že gradient

potenciálu cez membránu je konštantný:

(2.1) )/exp(1

)/exp(22

RTFVz

RTFVzcc

RT

VFzPI

mk

mkoimkk

k ,

1 Z rozmerovej analýzy rovnice (2.1) vyplýva, že uvedený vzťah vyjadruje prúd na jednotku plochy.

27

kde Ik je prúd k-teho iónu, Pk je jeho koeficient permeability, zk jeho náboj, ci jeho

koncentrácia na vnútornej strane membrány, co na vonkajšej strane. Vm je membránový

potenciál, F je Faradayova konštanta, R je plynová konštanta a T je absolútna teplota. Pri

membránovom napätí rovnom reverznému potenciálu (Erev) Vm=Erev platí podmienka pre

celkový prúd cez membránu:

(2.2) k

kI 0

Na základe teoretických výpočtov podľa Goldmana (1943), Hodgkin a Katz (1949)

získali empirický vzťah medzi pomerom koeficientov permeability a reverzným

potenciálom pre monovalentné ióny Na+, K

+ a Cl

-. Tento vzťah sa nazýva Goldman-

Hodgkin-Katzova (GHK) rovnica (Hodgkin a Katz, 1949):

(2.3) iCloNaoK

oCliNaiKrev

ClPNaPKP

ClPNaPKP

F

RTE

][][][

][][][ln

kde Erev, R, T, F, PK, PNa a PCl majú predchádzujúce významy, v hranatých zátvorkách sú

koncentrácie iónov, indexy i a o označujú stranu membrány (i-vnútorná, „inside“, o-

vonkajšia, „outside“). GHK rovnica pre jeden ión prechádza na Nernstovu rovnicu

rovnovážneho potenciálu.

Z rovníc (2.1) a (2.2) sa odvodzuje vzťah medzi membránovým potenciálom

a pomerom koeficientov permeability pre dva rôzne ióny s rovnakou alebo rôznou

mocnosťou. V najjednoduchších bi-ionických podmienkach má výraz pre pomer

koeficientov permeability dvoch iónov s rovnakou mocnosťou tvar:

(2.4) i

n

revo

n

B

A

A

RTFzEB

P

P

][

)/exp(][

kde z = zA = zB. V bi-ionických podmienkach pre jednomocný ión X+ (prítomný len na

vonkajšej strane membrány s koncentráciou [X+]o) a dvojmocný ión Y

2+ (prítomný len na

vnútornej strane membrány s koncentráciou [Y2+

]i) má rovnica pre pomer koeficientov

permeability tvar:

(2.5) )/exp(

)/exp(1

][4

][2

2

RTFE

RTFE

Y

X

P

P

rev

rev

i

o

X

Y

pričom hodnota Erev sa zisťuje experimentálne (Fatt a Ginsborg, 1958).

28

Ďalší spôsob určenia selektivity kanálu je meranie nasýtenej vodivosti pre rovnaké

koncentrácie rôznych iónov (Eisenman and Horn, 1983). Selektivita určovaná pomerom

vodivostí G sa však nemusí zhodovať s pomerom koeficientov permeability určeného z

Goldman-Hodgkin-Katzovej rovnice. Gillespie a Eisenberg (2002) zisťovali pomocou PNP

teórie (bližšie o nej bude v časti 2.2.1.4 Difúzna teória – „Poisson-Nernst-Planck“ (PNP)

teória) fyzikálnu podstatu rôznych spôsobov merania selektvity iónového kanálu a príčinu

toho, prečo sa rôznymi meraniami pri rovnakých podmienkach môžu získať rozdielne

výsledky. Podľa tejto teórie k selektivite kanálu prispieva hlavne náboj iónov, difúzny

koeficient iónov Di(x) a prídavný („excess“) chemický potenciál μiex

(x), ktorý predstavuje

rozdiel chemického potenciálu medzi ideálnym a skutočným roztokom. Gillespie

a Eisenberg (2002) ukázali, že pri meraní nasýtených vodivostí Gi pre dva typy iónov

v rovnakých podmienkach sa pomer týchto vodivostí rovná pomeru difúznych koeficientov

iónov vo vnútri kanálu:

(2.6) kanal

kanal

D

D

G

G

2

1

2

1

V experimentoch, kde sa meria reverzný potenciál, z ktorého sa potom určuje

pomer koeficientov permeability, sa ukázalo, že tento pomer je daný nie len pomerom

difúznych koeficientov vo vnútri kanálu ale aj pomerom aktivitných koeficientov oboch

iónov v roztoku aj vo vnútri kanálu podľa vzťahu:

(2.7) 11

22

1

2

kanal

kanal

D

D

P

P

kde Pi je koeficient permeability iónu i, Dikanal

je difúzny koeficient vnútri kanálu a λi určuje

pomer aktivitných koeficientov (γ) iónov v roztoku k iónom vnútri kanálu (λi = γroztok/γkanal).

Aktivitný koeficient je exponenciálne závislý od prídavného chemického potenciálu.

Gillespie a Eisenberg (2002) okrem spomínaných dvoch spôsobov merania

selektivity testovali aj tretí, málo používaný spôsob, ktorým sa meria vodivosť dvoch typov

iónov súčasne prítomných v roztoku. Pri definovanej celkovej koncentrácii iónov sa zmeria

vodivosť každého typu iónu samotného a pri ich rôznom relatívnom zastúpení v roztoku.

Na základe experimentu sa určí pomer koncentrácií týchto dvoch typov iónov, kedy sa

vodivosť rovná priemernej hodnote získanej zo saturovaných vodivostí pre jednotlivé ióny.

29

Ak je priemerná vodivosť dosiahnutá pri pomere 1:1, potom kanál medzi iónmi neselektuje.

Ak je pomer iný, potom kanál preferuje ten ión, ktorý je v roztoku menej zastúpený. Podľa

Gillespie a Eisenberga, takto určená selektivita kanálu je definovaná len aktivitnými

koeficientami iónov vnútri kanálu. Z ich práce vyplýva, že každý spôsob merania

selektivity kanálu dáva do popredia inú zložku definujúcu skutočnú selektivitu kanálu.

2.2.1 Teoretické modely pre popis toku iónov cez iónový kanál

2.2.1.1 Bariérová teória

Pasívny transport iónov cez iónový kanál je jav, o objasnenie ktorého sa snaží

niekoľko fyzikálnych (fyzikálno-chemických) teórií. Jednou z prvých je bariérová teória,

ktorá vychádza z Eyringovej teórie reakčných rýchlostí („Eyring rate theory“; Glasstone

a kol., 1941). Podľa tejto teórie sa pór modeluje ako sled energetických bariér a jám

(Obr.2.2.1.; Zwolinski a kol., 1949). Energetické jamy predstavujú väzbové miesta, teda

miesta energeticky výhodné pre ión.

Obrázok 2.2.1. Energetický

profil póru. Energetické hladiny

bariér sú vyjadrené ako násobky

RT. Relatívna vzdialenosť je

dĺžka, na ktorej dochádza

k potenciálovému spádu vo vnútri

póru. Obrázok je podľa Tinker

a kol., 1992b.

Bariéry môžu byť čisto elektrostatickej povahy, alebo môžu obsahovať navyše aj

príspevok od konformačnej energie kanálu súvisiacej s presunom iónu vo vnútri kanálu.

Tok iónov sa deje v diskrétnych a okamžitých skokoch cez bariéry. Výška energetickej

bariéry je relatívna voči energii iónu v okolitom vodnom prostredí. Z Eyringovej teórie

30

reakčných rýchlostí vyplýva definícia rýchlostnej konštanty ki [s-1

] pre prechod iónov

energetickou bariérou:

(2.8) )/exp( # RTGh

kTk iii

kde κi je transmisný koeficient, k je Boltzmannova konštanta, T je absolútna teplota, h je

Planckova konštanta, R je plynová konšanta a ΔGi# je štandardná Gibbsova voľná energia

aktivácie (výška bariéry). V tomto poslednom člene je zahrnutý aj príspevok od

aplikovaného vonkajšieho elektrického poľa. Läuger vylepšil Eyringov model iónového

transportu tým, že zahrnul do tohto modelu aj nasýtenie póru iónmi a teda nasýtenie

vodivosti kanálu pre daný ión. Hille (1975) aplikoval Eyringovú teóriu reakčných rýchlostí

na Na+ kanál z nervu žaby. Vytvoril špecifický štvor-bariérový model pre permeáciu cez

Na+ kanál, ktorý uspokojivo popísal iónovú selektivitu, saturáciu prúdu a napäťovo-závislý

blok iónmi. Hill predpokladal, že v kanáli sa v danom čase môže nachádzať len jeden ión,

ktorý postupne preskakuje medzi saturovateľnými väzbovými miestami. Vytvorený model

ďalej ukázal, že selektívny filter kanálu je možné modelovať ako energetickú bariéru, za

ktorou hneď nasleduje väzbové miesto pre daný ión. Hille a Schwarz (1978) vytvorili

bariérový model pre K+ kanály s usmerneným tokom, kde uvažovali prítomnosť viacerých

iónov v póre súčasne. Predpokladali, že ióny sa v póre nepredbiehajú („single-file“ pór,

Hodgkin a Keynes, 1955) a rýchlosť ich skokov medzi väzbovými miestami závisí od

výšky bariér, membránového potenciálu a repulzie medzi iónmi. Viac-iónový model

úspešne vysvetľuje vodivostné vlastnosti K+ kanálov, keď sú vstupné bariéry väčšie ako

bariéry vo vnútri póru a keď sa uvažuje repulzia medzi iónmi. Eisenman a Horn (1983) sa

zamerali na popis selektivity kanálu z pohľadu bariérového modelu. V prvom priblížení

predpokladali časovo-nezávislý energetický profil. Energetický profil úzko súvisí so

selektivitou kanálu. Počet bariér v profile, energetická hladina bariér a ich lokalizácia

ovplyvňuje celkovú selektivitu póru. V prípade, že pór kanálu môže naraz obsahovať viac

iónov, treba brať do úvahy aj zmenu veľkosti a lokalizácie jednotlivých bariér a jám pre

jednotlivé typy iónov. Selektivitu tiež ovplyvňujú energetické jamy svojou afinitou

k jednotlivým iónom, avšak primárne určujú selektivitu rozdiely energetických hladín

bariér pre jednotlivé ióny. O energetickom profile pre daný typ iónu je možné usudzovať

31

z charakteru prúdovo-napäťovej (I-V) závislosti meranej v symetrických podmienkach. Pri

nízkych koncentráciách iónu sa získava informácia o výške a polohe bariér a pri vysokých

koncentráciách o energetických hladinách bariér a jám. Odchýlenie I-V závislosti od

lineárnej funkcie (priamky) naznačuje, ktorá z bariér je najdôležitejšia v transporte iónov

cez kanál. Vplyv aplikovaného napätia na selektivitu kanálu súvisí so zmenou významnosti

jednotlivých bariér energetického profilu. Najvyššia bariéra, ktorá pred aplikáciou napätia

určovala rýchlosť prechodu iónov cez pór, stratí svoju funkciu na úkor inej, inde

lokalizovanej bariéry. Výška bariér, a teda ich významnosť v transporte, však môže byť

rozdielna pre každý typ iónu. Napäťová závislosť pomeru koeficientov permeability môže

viesť k zdanlivej koncentračnej závislosti pomeru koeficientov permeability. Ak sa

koncentrácie iónov na oboch stranách membrány nemenia rovnakým spôsobom, mení sa

potenciál vo vnútri póru. V dôsledku toho môžu nastať zmeny vo významnosti jednotlivých

bariér, čo sa prejaví zmeneným reverzným potenciálom a teda aj pomerom koeficientov

permeability. Skutočná koncentračná závislosť pomeru koeficientov permeability sa môže

prejaviť len pre kanál, ktorý obsahuje viac iónov v póre súčasne. Ako už bolo spomenuté,

samotné experimentálne podmienky môžu ovplyvniť výsledok určenia selektivity kanálu

z meraní reverzného potenciálu. V súčasnosti sa používajú štyri protokoly na meranie

koncentračnej závislosti reverzného potenciálu:

1. Bi-ionické merania - na každej strane membrány je jeden typ iónu, pričom

koncentrácia iónov je rovnaká.

2. Merania pri konštantnom pomere koncentrácií - na každej strane membrány je jeden

typ iónu ako v bi-ionických podmienach, ale koncentrácia iónov nie je rovnaká.

Pomer koncentrácií je ľubovoľný, ale rôzny od 1. Sú to vlastne bi-ionické merania

v asymetrických koncentráciách iónov.

3. Test na prítomnosť anomálneho mólového frakčného efektu (AMFE)- koncentrácia

iónu na jednej strane membrány sa udržuje konštantná, pričom na druhej strane

membrány je zmes dvoch ďaľších iónov. Celková koncentrácia zmesi sa zachováva,

mení sa len relatívne zastúpenie zvolenej dvojice iónov.

32

4. Merania s asymetrickým pridávaním - na obidvoch stranách membrány je ten istý

ión s rovnakou koncentráciou. Na jednej strane membrány sa potom postupne

zvyšuje koncentrácia ďaľšieho vybraného iónu.

Eisenman a Horn (1983) pomocou simulácií zistili, v akých podmienkach možno

pozorovať zmeny reverzného potenciálu podmienené zmenou koncentrácie iónov.

Uvažovali ten najjednoduchší – dvoj-bariérový model jedno-iónového kanálu. Použili osem

rôznych modifikácií energetického profilu (pre dva typy iónov), od symetrických bariér

s rovnakou výškou až po úplne asymetrický tvar bariér a odlišný rozdiel výšok

korešpondujúcich bariér pre rôzne typy iónov (Obr.2.2.2.).

Obrázok 2.2.2. Modelové energetické

profily dvoj-bariérového jedno-

iónového kanálu. Tieto modely boli

použité pri sledovaní vplyvu

experimentálnych podmienok na hodnotu

reverzného potenciálu, meranú podľa

rôznych protokolov.

Energetické profily:

A) úplne symetrický,

B) symetrický tvar bariér a konštantný

rozdiel výšok bariér,

C) iba symetrický tvar bariér,

D) asymetrický tvar bariér a konštantý


E) iba asymetrický tvar bariér,

F) rovnaká výška všetkých bariér

a rozdielna lokalizácia bariér,

G) rôzna lokalizácia bariér a konštantný


H) úplne asymetrický.

Výsledky ukázali, že iba profily A, B a D

nezávisí hodnota reverzného potenciálu

od zvoleného protokolu. Obrázok

prevzatý z Eisenman a Horn (1983).

Ukázalo sa, že reverzný potenciál sa nemení v závislosti od koncentrácie pre jedno-

iónový kanál v bi-ionických meraniach ani v meraniach pri konštantnom pomere

koncentrácií väčšom ako 1. A toto platí ako pre úplne symetrický tak aj pre úplne

asymetrický profil jedno-iónového kanálu. V takýchto podmienkach totiž nedochádza

33

k zmenám energie na bariérach, ktoré sa pozorujú len ako dôsledok zmeny pomeru

koncentrácií. Túto vlastnosť jedno-iónových kanálov teoreticky dokázal Läuger už v roku

1973. Naopak, v experimentoch s asymetrickým pridávaním alebo pri testovaní prítomnosti

anomálneho mólového frakčného efektu môže byť v niektorých prípadoch pozorovaná

zmena reverzného potenciálu v dôsledku zmeny koncentrácie. Iba v troch rôznych

modifikáciách energetického profilu ostáva reverzný potenciál koštantný vo všetkých

štyroch typoch experimentov. Platí to pre úplne symetrický profil (Obr.2.2.2.A) a pre dva

profily s konštantným rozdielom výšky (energií) definovaných bariér pre rôzne typy iónov,

nezávisle od symetrie tvaru bariéry (Obr.2.2.2.B a D).

Mechanizmus selektivity vo viac-iónových kanáloch je z fyzikálneho hľadiska

rovnakej podstaty, ale je komplikovanejší. Selektivita už nie je len dôsledok rozdielu

energetických hladín danej bariéry pre jednotlivé ióny, ale je určená aj energetickými

hladinami jám v energetickom profile a repulziou (Hille a Schwarz, 1978). Zmeny

reverzného potenciálu v závislosti od koncentrácie použitých iónov v bi-ionických

podmienkach alebo v podmienkach s konštantným pomerom koncentrácií sú jednou

z vlastností viac-iónových kanálov. Význam simulácií Eisenmana a Horna je v tom, že

ukázali, za akých podmienok je výhodnejšie merať selektivitu kanálu, pokiaľ chceme

získať aj informáciu o jeho obsadenosti. Použitie nevhodných podmienok totiž môže viesť

k nesprávnej interpretácii experimentálnych výsledkov.

2.2.1.2 Vlastnosti viac-iónových kanálov

Podľa bariérovej teórie existujú štyri charakteristiky viac-iónových kanálov

(Eisenman a Horn, 1983):

1) exponent n’ vo výraze:

(2.9) )/'exp(][

]['

RTzFVnX

X

J

Jm

n

o

i

X

X

34

pre pomer jednosmerných tokov iónov je väčší ako 1. Hodnota n’ väčšia ako 1 naznačuje,

že cez pór prechádza multimér jednotlivých iónov. V kanáli, kde sa ióny nemôžu

predbiehať, sa tak deje len ak pór obsahuje viac iónov naraz (Hodgkin a Keynes, 1955).

2) za prejav viac-iónového charakteru kanálu sa považuje existencia maxima v

koncentračnej závislosti vodivosti kanálu (Eisenman a kol., 1978; Hille a Schwarz, 1978).

Vodivosť jedno-iónových kanálov sa s rastúcou koncentráciou monotónne nasycuje.

3) pomer koeficientov permeability pre dané ióny závisí od ich absolútnej koncentrácie.

Takúto závislosť popísali napr. Hill a kol. (1989) na K+ kanáli zo srdcového SR. V bi-

ionických podmienkach pozorovali maximum pomeru koeficientov permeability iónov Cs+

voči iónom K+.

4) blokovanie kanálu iónmi má výraznú napäťovú závislosť. Závislosť veľkosti prúdu

(i/ikontrola) od napätia na membráne sa dá popísať vzťahom (Woodhull, 1973; Hagiwara

a Takahashi, 1974):

(2.10) RT

FVz

K

Bi

i m

b

kontrola

exp

)0(

][1

1

kde [B] je koncentrácia blokujúceho iónu, Kb(0) je disociačná konštanta pri nulovom

membránovom potenciáli Vm, z je mocnosť iónu a δ je relatívne umiestnenie blokujúceho

väzbového miesta v napäťovom spáde. Produkt zδ sa nazýva efektívny náboj („effective

valence“). Hodnota zδ môže byť väčšia ako 1,0 len pre viac-iónové kanály (Hille

a Schwarz, 1978).

Prítomnosť AMFE sa dodnes na základe teoretickej práce Hilleho a Schwarza

(1978) považuje za jednu z typických vlastností viac-iónových kanálov, a to aj napriek

tomu, že Eisenman a Horn (1983) ukázali, že AMFE jav sa môže za určitých podmienok

vyskytnúť aj v prípade jedno-iónového kanálu. Podľa Hilleho a Schwarza (1978), so

zmenou mólového frakčného pomeru koncentrácií dvoch rôznych iónov môže nastať

zmena vodivosti alebo reverzného potenciálu. Pri týchto experimentoch sa celková

koncentrácia zmesi udržiava konštantná, na druhej strane membrány sa nachádza rovnaká

zmes alebo len jeden typ iónu. Závislosť vodivosti od mólového frakčného pomeru je

monotónna pre kanál obsahujúci maximálne jeden ión. Vo viac-iónovom kanáli môže pri

35

niektorých pomeroch koncentrácií iónov nastať zmena vodivosti oproti hodnotám vodivostí

kanálu pre jednotlivé ióny. Toto správanie sa nazýva anomáliou. Ak má kanál vyššiu

afinitu pre ión s nižšou permeabilitou, tento ión sa bude v póre zdržiavať dlhšie. Tým

zabráni prechodu druhého typu iónu s vyššou permeabilitou. Druhý typ iónu je

odpudzovaný iónom, ktorý sa zdržiava v kanáli a vracia sa späť do roztoku. Ión rovnakého

typu, ale s nižšou permeabilitou sa preto môže naviazať do póru rýchlejšie (Hille

a Schwarz, 1978). V tomto prípade pozorujeme zníženie celkovej vodivosti cez kanál pri

zmesi týchto dvoch typov iónov.

2.2.1.3 Bariérový model RyR2 kanálu

O modelovanie vodivosti RyR2 kanálu pomocou bariérovej teórie sa pokúsili

Tinker a kol. v roku 1992(b). Keďže I-V závislosť RyR2 kanálu v symetrických

podmienkach je lineárna pre jednomocné ióny a pre dvojmocné sa od linearity odchyluje

len pri vysokých amplitúdach napätiach, navrhli symetrický energetický profil.

Vychádzajúc aj z výsledkov experimentov napäťovo-závislého bloku K+ prúdu

tetraalkylamóniovými iónmi (Tinker a kol.,1992a) zvolili model so štyrmi energetickými

bariérami a tromi väzbovými miestami (energetické jamy). Predpokladali, že väzbové

miesta v krajných energetických jamách majú fixnú energetickú hladinu. Ich model

predpovedal selektivitu kanálu pre jednotlivé jednomocné a dvojmocné ióny. Selektivita

bola daná výškou energetickej hladiny bariér pre konkrétny typ iónu. Čím je energia vyššia,

tým je ión menej uprednostňovaný v póre. Energie jednotlivých energetických bariér a jám

určili ako redukovanú energiu v tvare E/RT (Tab.2.2.1.). Tento bariérový model sa dobre

zhoduje s výsledkami ich experimentov (Tinker a kol., 1992b).

36

Tinker a kol., 1992b

energetická hladina [násobky RT]

ión energetické

bariéry 1-4

energetická

jama 1

energetická

jama 2 -

stredná

energetická

jama 3

Cs+ 6,15

-2,35

-2,35

-2,35

K+ 5,50 -3,25

Na+ 5,50 -4,00

Li+ 5,50 -5,00

Ca2+

3,00 -9,50

Ba2+

3,25 -9,15

Sr2+

3,00 -9,45

Mg2+

3,00 -9,80

Tabuľka 2.2.1. Parametre energetického profilu pre RyR2 kanál. Tento model bol

navrhnutý skupinou Tinker a kol. (1992b). Všetky štyri energetické bariéry majú

rovnakú výšku, definovanú pre daný typ iónu. Stredná energetická jama má nižšiu alebo

rovnú energiu v porovnaní s bočnými jamami 1 a 3.

2.2.1.4 Difúzna teória – „Poisson-Nernst-Planck“ (PNP) teória

V 90-tych rokoch sa začala vyvíjať nová teória popisujúca transport iónov cez

iónový kanál. Fakt, že elektrodifúzia v živých organizmoch sa deje v kvapalnom prostredí,

kde jedna molekula je ovplyvnená okolitými molekulami, respektíve silovým poľom, ktoré

na ňu vyvýjajú, podnietil vedcov hľadať inšpiráciu v inej teórii ako bola teória kinetiky

plynov (Eyringova teória reakčných rýchlostí) (Eisenberg, 1996). Základom novej teórie sa

stala teória elektrodifúzie, používaná vo fyzike tuhých látok na popis prúdov a rôznych

vlastností polovodičov (Ashcroft a Mermin, 1976). Nová teória, na rozdiel od bariérovej

teórie, sa na iónový transport pozerá ako na kontinuálny proces. Na začiatku tejto teórie

bola elektrodifúzia v kanáli popísaná ako interakcia medzi nábojom (prechádzajúcim

iónom) a dielektrikom (stenami kanálu; Chen a kol., 1992). Neskôr Chen a Eisenberg

(1993) zohľadnili aj účinok permanentných nábojov na stene kanálu. Novší model

iónového kanálu obsahuje nerovnomerné, ale fixné rozloženie permanentných nábojov

(Chen a Eisenberg, 1993). Toto rozloženie sa nemení, pokiaľ kanál ostáva v jednom

37

konformačnom stave. Ióny sú aproximované bodmi plávajúcimi v kvapaline. Takéto ióny-

body sa môžu predbiehať, narozdiel od bariérového modelu. Základné rovnice PNP teórie

sú Poissonova rovnica a Nernst-Planckova rovnica elektrodifúzie. Poissonova rovnica

popisuje závislosť elektrostatického poľa od rozloženia náboja:

(2.11) ),,(),,(0 RxRxdivE

kde ε0 je permitivita vákua, E je elektrostatické pole, ρ je hustota náboja. x, R a θ sú

cylindrické súradnice. Do celkovej hustoty náboja ρ prispievajú náboje permanentné,

indukované a voľné (Chen a Eisenberg, 1993). Pre permanentné náboje sa uvažuje len ich

pozícia v priestore. Sú to tie náboje, ktoré sa identifikujú z RTG kryštalografických

obrazov (Creighton, 1983; Cowley, 1984). Pre indukované náboje sa uvažuje nie len

pozícia v priestore, ale aj elektrické pole v danom mieste a v iónovom kanáli pristupuje aj

membránový potenciál. Pre voľné náboje sa berie do úvahy pozícia v priestore a profil

elektrostatického poľa v celom póre. Voľné náboje sa môžu pohybovať na úrovni

vzdialeností, kde je už potrebné elektrostatické pole definovať vo viacerých bodoch

priestoru. Tok týchto voľných nábojov, iónov, je popísaný Nernst-Planckovou

elektrodifúznou rovnicou:

(2.12) ),,().,,()),,((),,( RxERxckT

ezRxcgradDRxJ k

kkkk

kde Jk je tok k-teho typu iónu, Dk je jeho difúzny koeficient, ck je koncentrácia, zk je náboj

iónu v jednotkách elementárneho náboja, k je Boltzmannova konštanta, T je absolútna

teplota a E je elektrostatické pole. Vstupnými dátami do PNP teórie sú štruktúrne parametre

póru (dĺžka a priemer póru, dielektrické konštanty, permanentný náboj a difúzne

koeficienty) a experimentálne parametre (koncentrácie iónov v roztokoch, membránový

potenciál). Výstupom je I-V závislosť. Ak sú raz známe štruktúrne parametre póru, potom

je možné získať I-V závislosť v ľubovoľných experimentálnych podmienkach. Na rozdiel

od bariérovej teórie, energetický profil póru iónového kanálu je jedným z výstupov PNP

teórie a je ovplyvnený experimentálnymi podmienkami, teda koncentráciou a aplikovaným

membránovým potenciálom (Eisenberg R., 1996).

Interpretácia anomálií vo vodivostných charakteristikách kanálu PNP teóriou sa

významne líši od bariérovej teórie. Nonner a kol. (1998) tiež ukázali, že AMFE sa môže

38

vyskytnúť aj u jedno-iónového kanálu. Prítomnosť AMFE vysvetlili tým, že naviazanie

jedného typu katiónu na väzbové miesto v póre spôsobí vypudenie ostatných katiónov

(oboch typov) z oblasti väzbového miesta. Tým dochádza k lokálnemu zníženiu

koncentrácie iónov a teda aj k zníženej vodivosti kanálu. Podľa PNP teórie je AMFE

dôsledok zmien vo veľkosti zóny so zníženou koncentráciou iónov. Základný predpoklad

AMFE podľa PNP teórie je existencia lokalizovaného väzbového miesta (Nonner a kol.,

1998).

2.2.1.5 PNP model RyR2 kanálu

Chen a kol. (1997) ako prví použili PNP teóriu na modelovanie transportu iónov cez

RyR2 kanál. Použili veľký rozsah koncentrácií, od 25 mM do 2M KCl, I-V závislosť merali

v symetrických aj asymetrických podmienkach. Všetky pozorované I-V závislosti boli

lineárne. Výsledky modelovania boli v dobrom súlade s experimentálnymi dátami, okrem

experimentov s vysokými koncentráciami. Vstupné parametre a odhady niektorých ďalších

parametrov, použitých v modeli RyR2 kanálu, sú zhrnuté v tabuľke 2.2.2. Hodnota

dielektrickej konštanty proteínu a lipidov εp nemala vplyv na výsledok modelovania

v rozsahu hodnôt εp= 2-10. Aj najjednoduchší model, s rovnomerným rozložením

permanentného náboja, dobre popisoval experimentálne dáta. Na prvý pohľad

nerozlíšiteľný, avšak štatisticky významne lepší popis I-V závislostí bol získaný s

nerovnomerným rozdelením permanentného náboja, P(x). Chen a kol. (1997) zistili, že na

predpovedanie I-V charakteristiky kanálu postačuje len niekoľko parametrov (Tab.2.2.2)

a hlbšie detaily proteínu na úrovni atómov nie sú v tomto prípade potrebné. Pri modelovaní

I-V závislosti PNP teória určí aj profil koncentrácie iónov a profil elektrického potenciálu

vo vnútri kanálu. Na základe koncentračných profilov zistili, že selektivny filter RyR

kanálu je v daných podmienkach (KCl) obsadzovaný prevažne K+ iónmi. V závislosti od

použitých koncentrácií a napätia bola obsadenosť K+ iónmi v rozsahu 0,96 až 1,04.

Teória použitá pri tomto prvom modelovaní sa neskôr začala označovať ako PNP0

teória. Postupne sa totiž PNP0 teória vyvíjala a vznikli dve rozšírené verzie PNP1 (Chen,

39

1997; Nonner a kol., 1998) a PNP2 (Nonner a Eisenberg, 1998). Rozdiel medzi PNP0

a PNP1 je vo výraze pre elektrochemický potenciál. Okrem príspevku od elektrického

potenciálu a koncentrácie prispieva v PNP1 teórii k celkovému elektrochemickému

potenciálu aj prídavný („excess“) chemický potenciál. Tento je funkciou typu iónu

Chen a kol., 1999

Parametre PNP1 modelu RyR2 kanálu

Tabuľka 2.2.3. Parametre PNP1

modelu RyR2 kanálu podľa

Chena a kol. (1999). Rovnako ako

v PNP0 modeli RyR2 kanálu boli

do modelu zadané pevné

parametre. Chen a kol. získali

PNP1 teóriou odhady hodnôt

difúzneho koeficientu vo vnútri

kanálu pre jednotlivé jednomocné

ióny z Ia skupiny.

pevné parametre

dĺžka selektívneho filtra 1 nm

priemer selektívneho filtra 0,7 nm Å

dielektrická konštanta

proteínu a lipidov εp

5

odhady parametrov

profil permanentného náboja

P(x) = P0

-4,38 M

difúzny koeficient DLi 0,32.10-6

cm2.s

-1

difúzny koeficient DNa 0,78.10-6

cm2.s

-1

difúzny koeficient DK 1,3.10-6

cm2.s

-1

difúzny koeficient DRb 1,1.10-6

cm2.s

-1

difúzny koeficient DCs 0,83.10-6

cm2.s

-1

Chen a kol., 1997


Tabuľka 2.2.2. Parametre PNP0

modelu RyR2 kanálu podľa Chena

a kol. (1997). Do modelu boli zadané

pevné parametre - rozmery

selektívneho filtra a dielektrická

konštanta proteínu a lipidov εp. PNP0

teóriou sa získali odhady hodnôt

difúzneho koeficientu vo vnútri

kanálu pre jednotlivé ióny a tiež

rozloženie permanentného náboja

P(x), pričom sa predpokladalo, že P(x)

je konštantné.

pevné parametre


priemer selektívneho filtra 0,7 nm

dielektrická konštanta

proteínu a lipidov εp

5

odhady parametrov


P(x) = P0

-4,2 M


cm2.s

-1

difúzny koeficient DCl 3,87.10-6

cm2.s

-1

40

a priestorovej súradnice x (v 1D priblížení). Modelovaniu I-V charakteristík RyR2 kanálu

pomocou rozšírenej teórie PNP1 v podmienkach s rôznymi jednomocnými alkalickými

kovmi sa venovali Chen a kol. (1999, Tab.2.2.3.).

Teória PNP1 bola použitá aj pri modelovaní permeácie Ca2+

a Mg2+

iónov cez

RyR2 kanál (Chen a kol., 2003, Tab.2.2.4.). Modelovali I-V závislosti v 250 mM a 125

mM symetrických koncentráciách K+ iónov s asymetrickým pridávaním rôznych

koncentrácií Ca2+

alebo Mg2+

na luminálnu stranu kanálu. Ich výsledky predpovedajú

obsadenosť selektívneho filtra rovnú 1 pre Ca2+

ión, čo je v zhode s jedno-iónovým

mechanizmom permeácie cez RyR kanál. Nonner a Eisenberg (1998) rozšírili PNP1 teóriu

a označili ju PNP2. Rozšírenie predstavuje okrem prídavného chemického potenciálu

zavedenie parametrov závislých od lokalizácie pozdĺž póru a rozšírenie domény

zohľadnenej pri výpočtoch z cylindrického póru aj na kužeľovité ústia kanálu a polguľové

zóny v okolitom roztoku (Nonner a Eisenberg, 1998). Túto však použili len na modelovanie

permeácie cez napäťovo-závislý Ca2+

kanál.

Chen a kol., 2003


Tabuľka 2.2.4. Parametre

PNP1 modelu RyR2 kanálu

podľa Chena a kol. (2003). Autori do modelu vložili nie len

rozmery selektívneho filtra

a dielektrickú konštantu εp, ale aj


P(x). Pri modelovaní zisťovali

hodnoty difúzneho koeficientu vo

vnútri kanálu pre dvojmocné

ióny Ca2+

a Mg2+

a hodnoty

chemického potenciálu pre tieto

ióny.

pevné parametre


priemer selektívneho filtra 0,7 nm

dielektrická konštanta proteínu

a lipidov εp

5


P(x) = P0

-4,1 M

odhady parametrov

difúzny koeficient DCa 8,4.10-8

cm2.s

-1

chemický potenciál μCa -91 mV

difúzny koeficient DMg 5,4.10-8

cm2.s

-1

chemický potenciál μMg -53 mV


cm2.s

-1

chemický potenciál μK 0 mV

Gillespie a kol. (2005) použili nový prístup pri modelovaní permeácie cez RyR2

a RyR1 kanál. Ióny sú modelované nabitými pevnými guľami a nie ako body, molekuly

41

vody sú modelované nenabitými pevnými guľami. Na modelovanie prúdov použili

zovšeobecnenie PNP2 teórie (tzv.PNP/DFT, kombináciu PNP2 teórie a teórie funkcionálu

hustoty, „density functional theory“), ktorá popisuje pohyb iónov – pevných gúľ v smere

gradientu ich chemického potenciálu. V modeli RyR kanálu boli zahrnuté aj aminokyseliny

dôležité pre permeáciu iónov – Asp4899 a Glu4900 a záporné aminokyselinové zvyšky

neurčeného pôvodu v cytosolickom ústí kanálu. Rovnaký model použili pre RyR1 aj RyR2

kanál. Selektívny filter valcového tvaru s dĺžkou 1 nm a priemerom 0,8 nm bol obklopený

kužeľovitými ústiami dlhými 2 nm a zvierajúcimi uhol 45º s osou selektívneho filtra

(Obr.2.2.3.A).

A B

Obrázok 2.2.3. (A) Model póru RyR1 kanálu podľa Gillespie a kol. (2005). V tomto modeli sú

zahrnuté aj aminokyseliny dôležité pre permeáciu iónov cez RyR kanál – kyselina asparagová

(Asp4899) a kyselina glutámová (Glu4900). Ich lokalizácia v póre je naznačená čiarami (Asp _____

;

Glu -----). Na cytosolickej strane póru je bodkami naznačená lokalizácia záporných nábojov

aminokyselinových zvyškov. (B) Model póru RyR1 kanálu podľa Gillespie (2008) je zložitejší

v porovnaní s (A). Na cytosolickej strane pribudla dutina s priemerom 1,4nm. K aminokyselinám

Asp4899 a Glu 4900 na luminálnej strane selektívneho filtra pribudli celkovo ďalšie 3

aminokyseliny na jeden monomér RyR. Tiež sa predĺžil selektívny filter na 1,5nm.

Ióny v tomto modeli mali konečný rozmer a nemohli sa v póre predbiehať. Tieto

informácie boli postačujúce na to, aby zvolený prístup popísal permeáciu iónov cez RyR

kanál. Ukázalo sa, že Asp4899 je aminokyselina, ktorá určuje vodivostné vlastnosti

a selektivitu kanálu. Gillespie a kol. (2005) modelovali I-V závislosti v bi-ionických

podmienkach pri rôznych pomeroch koncentrácií iónov s jednomocnými katiónmi K+, Na

+,

Cs+, Li

+ a Rb

+. Vo väčšine prípadov model dobre popisoval namerané dáta. Okrem

natívneho RyR2 kanálu sledovali vodivostné vlastnosti dvoch mutovaných RyR1 kanálov

42

s bodovými mutáciami Asp4899Asn respektíve Glu4900Gln. Bolo ukázané, že

aminokyseliny Asp4899 a Glu4900 sú podstatné pre vodivosť a selektivitu RyR1 kanálu

(Gao a kol., 2000; Wang a kol., 2005). Modely I-V závislostí RyR1 kanálu s mutáciami

Asp4899Asn a Glu4900Gln boli v súlade v experimentálnymi údajmi. Gillespie a kol.

(2005) modelovali tiež závislosť vodivosti od mólového zlomku daného jednomocného

iónu v zmesi s iným jednomocným iónom, teda zisťovali prítomnosť AMFE javu. Použili

symetrické podmienky s celkovou koncentráciou iónov 250 mM. Model umožnil otestovať

všetky možné kombinácie mólových frakcií s vyššie uvedenými jednomocnými iónmi aj

vďaka krátkemu výpočtovému času. Prekvapujúce bolo, že navrhnutý model predpovedal

prítomnosť AMFE efektu len pre jednu z testovaných zmesí jednomocných iónov a to zmes

Na+-Cs

+ s celkovou koncentráciou 250 mM. Tento jav vysvetlili Gillespie a kol. (2005)

pomocou tzv. nábojovo-priestorovej kompetície (Nonner a kol., 2000). Podľa Nonnera

a kol. (2000) selektivita kanálu súvisí s potrebou kompenzácie záporného náboja póru

kladnými iónmi a tiež s tým, ako sa tento kompenzujúci náboj umiestni v obmedzenom

priestore selektívneho filtra. Z toho vyplýva, že ak sú v roztoku prítomné dva typy iónov

s rovnakým nábojom, tak v selektívnom filtri sa bude dlhšie zdržiavať ten ión, ktorý má

menší priemer. Na+ ión je menší ako Cs

+ ión, ale ich vodivosti sú porovnateľné (Tab.2.2.6.

na strane 53). Prítomnosť Na+ iónov spôsobila spomalenie toku Cs

+ iónov a tým poklesla

celková vodivosť kanálu. V prípade zmesi Li+-K

+ nebol AMFE efekt pozorovaný

a Gillespie a kol. (2005) to pripisujú veľkému rozdielu vodivostí pre K+ a Li

+ ióny.

Experiment predpoveď AMFE efektu pre Na+-Cs

+ zmes potvrdil. Podľa PNP teórie AMFE

nemusí byť nutne prejav viac-iónového mechanizmu permeácie (Nonner a kol., 1998).

Model RyR kanálu podľa Gillespie a kol. (2005) ale predpovedá obsadenosť selektívneho

filtra viacerými iónmi. V symetrických 250 mM roztokoch KCl sa podľa modelu

nachádzajú v selektívnom filtri 3 ióny K+. Keď sa na luminálnu stranu pridával roztok

CaCl2, už pri 10mM Ca2+

sa počet Ca2+

iónov v selektívnom filtri blížil k dvom, čo podľa

autorov naznačuje, že RyR kanál by mohol byť viac-iónový kanál pre jedno aj dvojmocné

ióny. Túto hypotézu však treba podporiť ďaľšími experimentálnymi dátami. Ak sa dokáže,

že v selektívnom filtri RyR kanálu sa môže nachádzať naraz viac iónov, potom pre RyR

kanál bude viac-iónový charakter póru sprevádzaný existenciou AMFE. Pretože RyR kanál

43

funguje v bunke ako Ca2+

kanál, je centrom záujmu práve nameranie I-V charakteristík pre

dvojmocné ióny a zistenie, či sú v súlade s navrhnutým PNP modelom.

Najnovšie vylepšenie modelu RyR kanálu priniesol Gillespie (2008), čo mu

umožnilo preskúmať energetické pomery súvisiace so selektivitou RyR1 a RyR2 kanálu

v prospech Ca2+

iónov. Vodivý pór už nebol modelovaný ako valec (Obr.2.2.3.B), ale na

cytosolickej strane sa rozširoval do dutiny s priemerom 1,4 nm. Ústia póru ostali

nezmenené, s uhlom 45º. Zvýšil sa počet aminokyselín, okrem Glu4900 (rozhranie

luminálneho ústia a selektívneho filtra) a Asp4899 (selektívny filter) sa na cytosolickom

ústí nachádzala Asp4945, v dutine Asp4938 a na luminálnej strane Glu4902 (Obr.2.2.3B).

Modelovanie bolo zamerané na analýzu energetiky iónovej väzby v póre RyR kanálu. Pri

tejto analýze autor sledoval rôzne zložky chemického potenciálu i-teho iónu μi(x)

v závislosti od polohy v póre, x. Výraz pre μi(x) bol sumou 4 členov:

(2.13) )()()()(

ln.)(3

xxxezx

kTxHS

i

SC

ii

i

ii

kde ρi(x) je hustota iónov i, Λi je de Broglieho vlnová dĺžka, zi je mocnosť iónu i, e je

elementárny náboj, φ(x) je priemerný elektrostatický potenciál daný Poissonovou rovnicou.

μiSC

(x) je chemický potenciál tienenia („screening“), teda udáva schopnosť iónu i tieniť

náboje ostatných iónov. μiHS

(x) predstavuje energiu potrebnú na vloženie nenabitej pevnej

gule („hard sphere“) do prostredia obsahujúceho nenabité pevné gule, pričom koncentrácia

(hustota) týchto gúľ je rovná ρi(x). Tento posledný člen teda berie do úvahy konečný

rozmer iónov a molekúl a fakt, že na jednom mieste sa nemôžu naraz nachádzať dve telesá

konečných rozmerov. Tak ako v prvom modeli podľa Gillespieho a kol. (2005), aj tu boli

ióny modelované nabitými pevnými guľami a molekuly vody nenabitými pevnými guľami.

Autor zisťoval zmeny jednotlivých členov μi(x) v symetrických podmienkach (150 mM

XCl, kde X je jednomocný ión K+, Li

+, Na

+ alebo Cs

+) a s narastajúcou koncentráciou Ca

2+

iónov (0-50 mM) na luminálnej strane kanálu. Model ukázal, že selektivita Ca2+

versus X+

v RyR2 kanáli je určená mechanizmom nábojovo-priestorovej kompetície. Ca2+

ión dokáže

v porovnaní s jednomocnými iónmi najlepšie vykompenzovať záporne nabité –COO-

skupiny, ktoré voľne vyčnievajú do malého priestoru selektívneho filtra, obsadením

menšieho priestoru pri väčšej hodnote náboja. Výsledky modelovania teda ukázali, že

44

základ selektivity v RyR kanáli je elektrostatickej povahy, pretože elektrostatický potenciál,

ktorý Ca2+

ióny cítia a ich schopnosť tienenia sú dostačujúce na to, aby prekonali jedinú

výhodu jednomocných iónov v modelovaných podmienkach a tou je ich väčší počet a tým

väčšia dostupnosť v selektívnom filtri. Vhodnosť vytvoreného modelu bola overená

experimentálne. Model podľa Gillespieho (2008) totiž predpovedal, že pridávanie Ca2+

na

luminálnu stranu kanálu v symetrických roztokoch jednomocných iónov NaCl alebo CsCl

spôsobí pokles prúdu pri 1 mM [Ca2+

]lumen. Pri ďalšom zvyšovaní koncentrácie Ca2+

bude

prúd opäť narastať. Toto minimum bolo pozorované v 100 mM symetrických podmienkach

s NaCl respektíve CsCl. Na+ prúd bol znížený Ca

2+ iónmi na 42% a Cs

+ prúd na 65%

(Gillespie, 2008). V rovnakých podmienkach model predpovedá výskyt výrazného minima

K+ prúdu pri 1 mM [Ca

2+]lumen a len malé minimum Li

+ prúdu. Tieto predpovede neboli

zatiaľ potvrdené experimentálne.

2.2.1.6 AMFE teória

V roku 2008 sa skupina Gillespie a kol. zamerali na zistenie fyzikálnej podstaty

AMFE pomocou syntetických nanopórov. Póry vytvorené do polyetylén tereftalátu boli

záporne nabité, od stredu sa kužeľovito rozširovali a v najužšom mieste mali priemer 5 nm.

V takomto širokom póre sa môžu ióny navzájom predbiehať. Experimenty na nanopóroch

ukázali, že podmienkou existencie AMFE je iónová selektivita. Nanopóry medzi

jednomocnými iónmi neselektovali a experimenty neukázali anomáliu vodivosti pre rôzne

zmesi týchto iónov. AMFE pozorovali len pre zmesi Ca2+

s jednomocnými iónmi, keďže

nanopóry preferovali ióny Ca2+

. Naviac, minimum vodivosti bolo tým výraznejšie, čím sa

hodnoty vodivosti kanálu pre dané ióny v zmesi menej líšili. Podľa tejto AMFE teórie je

minimum vodivosti dôsledok toho, že so zmenou mólového pomeru iónov v zmesi sa odpor

v rôznych oblastiach póru nemení rovnomerne. Počítačové modelovanie ukázalo, že

v takom prípade sa so zmenou mólového pomeru mení koncentrácia iónov v póre

nelineárne (Gillespie a kol., 2008).

45

2.2.2 Model vodivého póru RyR kanálu

Dutina v transmembránovej doméne naznačuje lokalizáciu vodivého póru RyR

kanálu. Detailnejšie sa pomocou dostupných experimentálnych zobrazovacích metód do

vnútra póru RyR kanálu zatiaľ nepodarilo nahliadnuť. Hlavnou príčinou je, že RyR kanál sa

zatiaľ nepodarilo kryštalizovať. Dôvodov je niekoľko. Na kryštalizáciu je potrebné

dostatočné množstvo ultračistej vzorky proteínu. Problémom tiež ostáva veľká molekulová

hmotnosť RyR kanálu (2,3 MDa), pretože pri takejto veľkosti kanálu je interpretácia

difrakčného obrazu nejednoznačná a tým problematická (Yin a kol., 2005). Preto

v súčasnosti jediný spôsob ako získať, síce obmedzené, informácie o architektúre vodivého

póru je nepriamy a to meraním vodivostných charakteristík kanálu a zároveň počítačovým

modelovaním a modifikovaním známej 3D štruktúry iného iónového kanálu, ktorý

má podobnú primárnu štruktúru ako skúmaný kanál.

Ako základ pre určovanie štruktúry póru veľkých katiónových kanálov sa používa

štruktúra K+ kanálu izolovaného zo Streptomyces lividans, KcsA (Doyle a kol., 1998).

Doyle a kol. (1998) pozorovali pomocou RTG kryštalografie 4 identické podjednotky

tvoriace tento kanál. Dosiahli rozlíšnie 0,32 nm, zatiaľ čo pre RyR kanál je najvyššie

dosiahnuté rozlíšenie metódou kryo-elektrónovej mikroskopie spojenej s počítačovou

analýzou 1,4 nm (Serysheva a kol., 2005). KcsA kanál má vodivý pór dlhý 4,5 nm

(Obr.2.2.4.). Z cytoplazmatickej strany sa pór začína 1,8 nm dlhým tunelom, ktorý potom

prechádza do dutiny s priemerom 1 nm. Táto dutina umiestená približne v strede póru

pomáha prekonať iónom maximum energetického profilu - energetickú bariéru. Steny

tunela aj dutiny sú prevažne hydrofóbnej povahy. Doyle a kol. (1998) predpokladajú, že

hydrofóbne steny tunela predstavujú pre prechádzajúci ión prostredie, s ktorým tento

(hydratovaný) ión neinteraguje. Doyle a kol. si myslia, že ak by bol celý pór polárnej

povahy (ako je selektívny filter), tak by nebolo možné dosiahnuť vysokú priepustnosť pre

K+ ióny.

46

Obrázok 2.2.4. Schématický

nákres vodivého póru KcsA

kanálu. Pór má tri základné oblasti.

Tunel, ktorým vstupujú K+ ióny do

póru, prechádza do centrálnej dutiny

vyplnenej vodou. Za dutinou sa

nachádza selektívny filter, cez ktorý

K+ ióny prechádzajú bez

hydratačného obalu. Ten sa obnoví,

až keď ión opustí selektívny filter

pri extracelulárnom ústí kanálu.

Na ceste do extracelulárneho prostredia musia ióny prejsť ešte cez 1,2 nm-dlhý

selektívny filter. Tu dochádza k diskriminácii medzi jednotlivými typmi iónov. Doyle a kol.

(1998) navrhli aj model selektivity KcsA kanálu. Do selektívneho filtra môžu naraz vstúpiť

dva K+ ióny, ktorých interakčné miesta sú vzdialené od seba 0,75 nm, tretí ión ostáva

v dutine a má stále hydratačný obal. Pri vstupe K+ do selektívneho filtra dochádza k takmer

úplnej strate hydratačného obalu tohto iónu. Na kompenzáciu energetických strát

spôsobených dehydratáciou sa interakcia s molekulami H2O nahradí interakciou s COO-

skupinami. Selektívny filter, lemovaný atómami kyslíka v COO- skupinách, má rigidnú

štruktúru. Pravdepodobne je to preto, aby sa nemohol prispôsobiť menšiemu priemeru Na+

iónu. Doyle a kol. (1998) teda predpokladajú, že selektívny filter priťahuje a koncentruje

K+ ióny. Keď sa v selektívnom filtri nachádza len jeden ión, je silne viazaný stenami filtra.

Vstup druhého K+ iónu do filtra odpudí prvý ión (do vzdialenosti 0,75 nm). Odpudivá sila

medzi K+ iónmi vyváži príťažlivú silu selektívneho filtra a tým sa umožní pohyb K

+ von

z kanálu. Pre selektívny filter KcsA kanálu je charakteristická sekvencia Val-Gly-Tyr-Gly.

Bočné reťazce aminokyseliny valín (Val) a tyrozín (Tyr) tvoria spolu s

okolitými tryptofánovými (Trp) zvyškami závitnice póru komplex, ktorý pravdepodobne

stabilizuje veľkosť póru (Doyle a kol., 1998).

Vysoký stupeň homológie primárnej štruktúry transmembránovej oblasti medzi

KcsA kanálom a RyR2 kanálom dovoľuje použiť 3D štruktúru póru KcsA kanálu pri

modelovaní priestorovej štruktúry póru RyR2 kanálu (Welch a kol., 2004). Sekvencia

analogická sekvencii selektívneho filtra KcsA kanálu (Val-Gly-Tyr-Gly) sa našla aj v

47

aminokyselinovom reťazci RyR1 kanálu (Gly-Gly-Ile-Gly) a nachádza sa práve v oblasti

membránovej domény (Balshaw a kol., 1999).

Predpokladá sa, že hydrofóbna oblasť membránového úseku, predstavujúca

sekvenciu 4808-4831 (v primárnom reťazci myšieho RyR2 kanálu), je oblasť tvoriaca pór

kanálu (Zhao a kol., 1999). Nachádza sa v nej motív Gly-Val-Arg-Ala-Gly-Gly-Ile-Gly-

Asp, obsahujúci sekvenciu selektívneho filtra Gly-Gly-Ile-Gly (Zhao a kol., 1999). Bodová

mutácia Gly4824Ala na myšom géne pre RyR2 kanál spôsobila pokles vodivosti kanálu pre

K+ ióny na 3% oproti natívnemu RyR2 kanálu (Zhao a kol., 1999). Rovnaký výsledok

pozorovali aj Gao a kol. (2000), keď exprimovali RyR1 kanál s bodovou mutáciou

Gly4894Ala. Aminokyselina Gly4894 sa nachádza pred charakteristickým motívom

selektívneho filtra Gly-Gly-Ile-Gly. Bhat a kol. (1997) ukázali, že mutant zajačieho RyR1

kanálu, ktorý neobsahuje aminokyselinovú sekvenciu 183 - 4006, je schopný prepúšťať Cs+

ióny s porovnateľnou vodivosťou v smere lumen SR cytosol (G=407 ± 16 pS) a aj

kinetikou vrátkovania podobnou ako natívny kanál. V symetrických podmienkach mutant

vykazoval usmernenie toku iónov v smere cytosol lumen SR, čo nebolo pozorované pre

natívny kanál (G=332 ± 18,9 pS). Získané výsledky naznačujú, že úsek posledných ~1000

aminokyselín stačí na to, aby vznikol funkčný Ca2+

kanál senzitívny na aktiváciu

cytosolickým Ca2+

, avšak citlivosť tohto kanálu bola znížená (Kd≈2-20 μM) oproti

natívnemu kanálu (Kd≈0,25μM). Čo je zaujímavé, mutovaný kanál úplne stratil citlivosť na

Ca2+

inaktiváciu, ktorá pri natívnom RyR1 kanáli nastupuje v mM koncentráciách.

Pri konštruovaní modelu póru RyR2 kanálu (z králika) na základe štruktúry KcsA

kanálu identifikovali Welch a kol. (2004) štyri časti tvoriace vodivý pór – selektívny filter,

závitnica póru, vnútorná a vonkajšia závitnica (Obr.2.2.5.). Tieto časti sú pre RyR2 kanál

kódované v poslednej pätine aminokyselinového reťazca a iba táto časť primárnej štruktúry

bola použitá na vytvorenie modelu. Každý monomér pozostáva z dvoch

transmembránových závitníc a jednej luminálnej slučky. Táto slučka vytvára v membráne

závitnicu póru a selektívny filter.

48

Obrázok 2.2.5. Porovnanie štruktúry vodivého póru RyR2 a KcsA kanálu. Štruktúra KcsA

kanálu bola použitá ako vzor na vytvorenie modelu póru RyR2 kanálu. Obidva kanály majú

vodivý pór zo 4 častí – vnútorná a vonkajšia závitnica, závitnica póru a selektívny filter.

Selektívny filter v modelovom póre RyR2 kanálu je širší v porovnaní s KcsA kanálom. Schéma

prevzatá z Welch a kol. (2004).

Zo štyroch monomérov bol vytvorený tetramérny pór RyR2 kanálu topograficky

podobný póru KcsA kanálu. Očakávalo sa, že najväčšie rozdiely v štruktúre budú hlavne

v oblasti závitnice póru a selektívneho filtra. Porovnanie modelov ukázalo dva principiálne

rozdiely. Po prvé, rozloženie slučiek, ktoré spájajú na luminálnej strane vonkajšiu závitnicu

so závitnicou póru a závitnicu póru s predpokladaným selektívnym filtrom. Po druhé, iná

priestorová štruktúra selektívneho filtra (Obr.2.2.5.). V oboch modeloch je dutina

z cytosolickej strany vystlaná aminokyselinami tvoriacimi vnútornú závitnicu. Závitnica

póru je v obidvoch prípadoch uložená tak, že jej C-koniec je nasmerovaný na luminálny

(RyR2 kanál) resp.extracelulárny (KcsA kanál) koniec dutiny. Závitnica póru RyR2 kanálu

je o niečo dlhšia a presahuje až na luminálnu stranu póru. Kruhy záporných nábojov sa

nachádzajú na oboch ústiach póru, kde je vyššia hustota nábojov oproti strednej časti póru.

Ústia póru RyR2 kanálu sú celkovo viac nabité ako v KcsA kanáli (Welch a kol., 2004).

49

Simuláciou toku iónov cez RyR2 kanál sa zistilo, že za rovnakých podmienok ióny K+

prechádzajú cez pór rýchlejšie ako ióny Ca2+

. Simulácia toku Ca2+

cez pór z lumenu do

cytosolu ukázala, že Ca2+

ióny ostávajú pri prechode selektívnym filtrom stále hydratované,

avšak mení sa počet molekúl vody na vnútornej hydratačnej vrstve iónu. Priblíženie 4

vnútorných závitníc vytvára bránu pre vstup iónov do póru a ich C-koniec tvorí miesto

interakcie s katiónmi. Je pravdepodobné, že podobne ako v KcsA kanáli, aj v dutine RyR2

kanálu sa nachádza minimálne jeden úplne hydratovaný katión (z cytosolu), ktorý je

stabilizovaný okolitými molekulami vody a dipólmi helixov tvoriacich závitnicu póru.

Najviac sa modely KcsA a RyR2 kanálov odlišujú v štruktúre selektívneho filtra. Ióny K+

prechádzajúce selektívnym filtrom KcsA kanálu interagujú predovšetkým s atómami

kyslíka z COO- skupín peptidovej kostry. Zatiaľčo KcsA kanál má selektívny filter

s polomerom približne 0,15 nm, selektívny filter RyR2 kanálu má podstatne väčší polomer

(0,35 nm, Tinker a Williams, 1993). Spomínaný typ interakcie iónu so selektívnym filtrom

sa v RyR2 kanáli uplatňuje v menšej miere, pričom prevažuje interakcia iónov s COO-

skupinami štyroch Glu4832 na luminálnom konci filtra (Welch a kol., 2004). Wang a kol.

(2005) nedávno poukázali na prítomnosť motívu Asp-Glu v blízkosti selektívneho filtra

RyR1 izoformy. Záporne nabité aminokyseliny tohto motívu sa nachádzajú v sekvencii

spájajúcej predpokladaný selektívny filter (Gly-Gly-Ile-Gly motív) a závitnicu póru.

Mutáciou aminokyselín Asp4899 a Glu4900, ktorá viedla k neutralizácii záporného náboja

sa ukázalo, že prítomnosť týchto nabitých aminokyselín zabezpečuje vysokú priepustnosť

póru kanálu pre ióny ako aj jeho selektivitu. Podobným spôsobom identifikovali Xu a kol.

(2006) ďalšie záporne nabité aminokyseliny Asp4938 a Asp4945 na cytosolickej strane

póru RyR1 kanálu, ktoré hrajú úlohu, podobne ako Asp-Glu motív, v udržiavaní rýchlosti

permeácie iónov.

Rozmery vodivého póru RyR kanálu sú zatiaľ určené len prostredníctvom

nepriamych metód. V roku 1993 publikovali Tinker a Williams (1993) výsledky meraní

vodivostných vlastností RyR2 kanálu, pričom použili rôzne veľké organické katióny. Na

základe týchto meraní odhadli minimálny polomer póru RyR2 kanálu na 0,33 – 0,35 nm.

Tieto hodnoty sú v súlade s rozmermi iónov, ktoré už takmer neprechádzajú cez RyR2

kanál, ako sú napr. trietanolamín (N(CH2-CH2-OH)3) alebo trietylamín (N(CH2-CH3)3).

50

Tinker a Williams (1993), s použitím rôzne dlhých jedno- a dvojmocných derivátov

trimetylamóniového iónu (NH(CH3)3+), merali vzdialenosť, na ktorej dochádza k

potenciálovému spádu vnútri vodivého póru. Podstata tohto experimentu spočíva v tom, že

sa použijú rôzne dlhé alkány s trimetylamóniovou skupinou na každom konci molekuly.

Takéto dvojmocné ióny spôsobujú napäťovo-závislé zablokovanie RyR2 kanálu. Prvý

koniec molekuly s N+ iónom sa nachádza na mieste, kde dochádza k blokovaniu prúdu cez

kanál, druhý koniec s N+ iónom sa nachádza na rôznych miestach potenciálového spádu,

podľa dĺžky použitej molekuly. Porovnaním vodivosti kanálu v prítomnosti blokujúceho

iónu oproti kontrole sa dá zistiť tzv. efektívny náboj blokovania („effective valence“, zδ),

ktorý odráža mieru napäťovej závislosti blokovania kanálu. Použitím jednomocných

derivátov sa dá usudzovať o lokalizácii blokovacieho miesta v póre kanálu. Tinker

a William (1993) zistili, že deriváty blokujúce K+ prúd sa viažu na väzbové miesto

situované v oblasti ~90% poklesu napätia, bližšie k luminálnej strane póru. Za predpokladu,

že potenciálový spád je lineárny, odhadli dĺžku poklesu na 1,04 nm. (Tinker a Williams,

1995).

To, či sa na formovaní jedného spoločného vodivého póru RyR kanálu podieľajú

štyri monoméry alebo každý monomér má vlastný nezávislý pór, nie je doteraz známe.

Existencia jedného spoločného póru bola navrhnutá dvomi experimentálnymi prístupmi.

Zhao a kol.(1999) exprimovali v HEK293 bunkách RyR2 kanály, ktoré mali rôzny počet

mutovaných a nemutovaných podjednotiek. Cieľom tejto štúdie bolo mutáciou Gly4824Ala

výrazne znížiť vodivosť kanálu a zistiť ako prítomnosť rôzneho počtu mutovaných

monomérov v RyR2 kanáli vplýva na celkovú vodivosť kanálu. Ukázalo sa, že vodivosť

RyR2 kanálov s jedným alebo s dvomi mutovanými monomérmi sa nedá získať spočítaním

príslušných hodnôt vodivostí nemutovaných a mutovaných monomérov RyR2 kanálu, ako

by sa dalo čakať v prípade, že každý monomér má vlastný vodivý pór. Existenciu jedného

spoločného póru ďalej podporili Anyatonwu a kol. (2003), ktorí sledovali blokovanie NH4+

prúdov cez RyR2 kanál etylamóniummetántiosíranom (MTSEA+). Aplikovaním MTSEA

+

dochádza k postupnej kovalentnej modifikácii aminokyselín v oblasti póru RyR2 kanálu, čo

sa prejavuje postupným zúžením póru a tým zmenou vodivosti kanálu. Celkový počet

stavov kanálu s menšou vodivosťou závisel od veľkosti amínového iónu. Pre najväčší

51

použitý ión - trimetylamín sa neukázali žiadne podvodivé stavy, čo sa zhoduje s hypotézou,

že RyR2 kanál má jeden spoločný centrálny pór. Ak by mal kanál štyri nezávislé póry,

ktorými prechádza trimetylamín, museli by sa pozorovať aj pre tento ión podstavy

vyvolané účinkom MTSEA+.

2.2.3 Vodivostné vlastnosti, selektivita a obsadenosť RyR2 kanálu

2.2.3.1 Vodivosť a selektivita RyR2 kanálu

RyR2 kanál patrí medzi iónové kanály s vysokou vodivosťou pre katióny a relatívne

malou selektivitou pre dvojmocné katióny vzhľadom na jednomocné. V porovnaní s inými

iónovými kanálmi, napr. DHPR alebo KcsA kanálmi, RyR2 kanál menej rozlišuje medzi

iónmi. DHPR kanál tisícnásobne preferuje dvojmocné ióny pred jednomocnými (Lee

a Tsien, 1984). Avšak táto zvýšená selektivita kanálu sa dosiahla na úkor vodivosti.

Maximálna vodivosť DHPR kanálu pre Ca2+

ióny je ~15-20 pS, čo je asi päťkrát menej

ako je vodivosť RyR2 kanálu (Smith a kol., 1987; Yue a Marban, 1990). KcsA kanál je

schopný selektovať medzi jednomocnými iónmi, pričom približne 1000-krát viac

uprednostňuje K+ ióny pred Na

+ (LeMasurier a kol., 2001).

RyR2 kanál je málo priepustný pre anióny, pomer koeficientov permeability K+

k Cl- iónom je približne 20 (Williams, 1992). Naopak, kanál prepúšťa mnoho organických

aj anorganických jedno- a dvojmocných katiónov (K+, Na

+, Li

+, Ca

2+, Ba

2+, NH4

+,

NH3CH3+, NH(CH3)3

+ a iné; Williams a kol., 2001).

Lindsay a kol. (1991) stanovili vodivosť RyR2 kanálu v roztoku jednomocných

iónov. V symetrických podmienkach (210 mM) stanovili postupnosť vodivosti pre katióny

Ia skupiny: K+>Rb

+>Na

+=Cs

+>Li

+, v rozsahu 215 pS (Li

+) až 723 pS (K

+). S rastúcou

koncentráciou použitého katiónu dochádza k „nasýteniu“ vodivosti. Pre K+ ióny je

maximálna vodivosť 900 pS. Najnižšia maximálna vodivosť je 248 pS pre Li+ ióny , pre

Na+ ióny je maximum vodivosti 516 pS (Lindsay a kol., 1991). Vodivostné vlastnosti

všetkých izoforiem RyR kanálu sú veľmi podobné (Fill a Copello, 2002), napríklad

52

maximálna vodivosť pre K+ ióny RyR1 kanálu purifikovaného z kostrového svalu zajaca je

1 nS (Smith a kol., 1988).

Vodivosť RyR kanálu pre jednomocné ióny je niekoľkonásobne vyššia ako pre

dvojmocné ióny a to aj napriek tomu, že fyziologická úloha RyR kanálu spočíva v

pasívnom transporte Ca2+

iónov. Tinker a Williams (1992) stanovili vodivosť RyR2 kanálu

a určili jej postupnosť pre dvojmocné katióny alkalických zemín v symetrických roztokoch

(210 mM). Vodivosť klesala v postupnosti Ba2+

>Sr2+

>Ca2+

>Mg2+

a namerané hodnoty boli

v rozsahu od 89 pS (Mg2+

) po 202 pS (Ba2+

, Tab.2.2.5.). Tinker a kol. (1992b)

predpovedali pomocou bariérového modelu hodnotu Kd koncentračnej závislosti vodivosti

dvojmocných iónov v mikromolárnej oblasti (Tab.2.2.5.). V prípade organických katiónov

odvodených od amóniových iónov (NH4+

) je kanál v symetrických podmienkach (210mM)

najviac vodivý pre NH4+ ióny (594 pS). S rastúcim počtom metylových skupín

(substituentov) na atóme dusíka vodivosť klesá (59 pS – trimetylamín, N(CH3)3). Pre väčšie

Tinker a Williams, 1992

RyR2, 210 mM X2+

/ 210 mM K+

Tinker a kol., 1992b

RyR2,

210 mM X2+

/ 210 mM

K+

typ

iónu

pomer

koeficientov

permeability

PX2+/PK+

pomer

koeficientov

permeability

PX2+/PBa2+

vodivosť G

[pS]

Kd (G)

[mM]

Ba2+ 5,8 1,0 202 0,165

Sr2+ 6,7 1,1 166 0,123

Ca2+ 6,5 1,1 135 0,116

Mg2+ 5,9 1,1 89 0,086

Tabuľka 2.2.5. Permeačné charakteristiky dvojmocných iónov. Tinker a Williams (1992)

zatiaľ ako jediní určili pomer koeficientov permeability dvojmocných iónov k iónu K+ a tiež

relatívne k dvojmocnému iónu Ba2+

. Hodnoty uvedené v tabuľke ukazujú, že RyR2 kanál dáva

prednosť dvojmocným iónom pred jednomocnými. Maximálne hodnoty vodivosti pre dvojmocné

ióny, merané v symetrických podmienkach, sú menšie v porovnaní s vodivosťou RyR2 kanálu

pre jednomocné ióny (Tab.6). V poslednom stĺpci sú uvedené hodnoty Kd pre vodivosť

dvojmocných iónov, predpovedané bariérovým modelom.

53

deriváty - N(CH2-CH2-OH)3 alebo N(CH2-CH3)3 je kanál vodivý len veľmi málo, G< 10 pS

(Tinker a Williams, 1993).

Veľkosti vodivosti a pomer koeficientov permeability pre jednomocné ióny určovali

v symetrických podmienkach (250mM) aj Chen a kol. (1999). Postupnosť vodivosti z ich

experimentov je nasledovná: K+>Rb

+>Cs

+>Na

+>Li

+, a je v zhode s výsledkami skupiny

Lindsay a kol. (1991) (Tab.2.2.6.). Tinker a kol. (1992b) zmerali nasycovanie vodivosti

jednomocných iónov. Príslušné hodnoty Kd sú uvedené v tabuľke 2.2.6. Výsledky Tinkera

a Williamsa (1992, Tab.2.2.5.) ukazujú, že RyR2 kanál približne 6-krát viac prepúšťa

dvojmocné ako jednomocné ióny. Avšak v rámci skupiny jednomocných a dvojmocných

iónov výrazne neselektuje (Tab.2.2.5 a Tab.2.2.6).

Lindsay a kol., 1991 RyR2, symetrické

podmienky, 210 mM

Chen a kol., 1999 RyR2, symetrické podmienky,

250 mM

Tinker a kol.,

1992b

RyR2, symetrické

podmienky,

210 mM

typ

iónu

pomer

koeficientov

permeability

PX+/PK+

vodivosť

Gmax [pS]

pomer

koeficientov permeability

PX+/PK+

vodivosť

Gmax [pS]

Kd (G)

[mM]

K+ 1,00 723 1,00 812 20

Na+ 1,15 446 1,00 502 18

Cs+ 0,61 460 0,69 541 34

Rb+ 0,87 621 0,83 716 -

Li+ 0,99 215 1,00 205 9,1

Tabuľka 2.2.6. Permeačné charakteristiky jednomocných iónov a porovnanie výsledkov

skupín Lindsay a kol. (1991) a Chen a kol. (1999). Obidve skupiny merali vodivosť RyR2

kanálu pre jednomocné ióny Ia skupiny v symetrických podmienkach. Pri použitých

koncentráciách (210 resp. 250 mM) je vodivosť kanálu nasýtená. Pomery koeficientov

permeability boli určované relatívne k K+ iónu. V poslednom stĺpci sú uvedené experimentálne

zistené hodnoty Kd, teda koncentrácie, pri ktorej je G=0,5.Gmax.

54

2.2.3.2 Obsadenosť selektívneho filtra RyR2 kanálu jedno- a dvojmocnými iónmi

Za účelom zistenia, koľko iónov naraz sa môže nachádzať v selektívnom filtri

kanálu, boli na RyR2 izoforme urobené rôzne typy vodivostných experimentov. V bi-

ionických podmienkach s rovnakými koncentráciami K+ a Ca

2+ iónov Tinker a Williams

(1992) sledovali závislosť reverzného potenciálu od absolútnej koncentrácie K+ iónov,

pričom pomer koncentrácií K+ k Ca

2+ bol držaný na hodnote 1. V rozsahu koncentrácií 50

mM až 400 mM nezistili žiadne signifikantné zmeny reverzného potenciálu. Meranie

vodivosti v závislosti od mólového frakčného pomeru iónov v zmesiach dvojmocných

(Ba2+

-Mg2+

a Ba2+

-Ca2+

; Tinker a Williams, 1992) a jednomocných iónov (Na+-K

+ a Li

+-

K+; Lindsay a kol., 1991) ukázali monotónnu závislosť bez prítomnosti extrémov, čo

naznačuje, že RyR2 kanál je jedno-iónový kanál. Saturácia vodivosti jednomocných

(Lindsay a kol., 1991) aj dvojmocných iónov (Tinker a kol., 1992b) vykazuje jednoduchú

kinetiku typu Michaelis-Mentenovej. Ďalším zo spôsobov zistenia obsadenosti selektívneho

filtra iónmi je určenie počtu väzbových konštánt pri blokovaní toku jednomocných iónov

dvojmocnými. Tinker a kol. (1992b) porovnali odhad väzbovej konštanty z experimentov

blokovania monovalentného toku divalentnými iónmi (Kd=170 μM pre blok K+ prúdu Ba

2+

iónmi) s väzbovou konštantou nasýtenia vodivosti (Kd=165 μM pre Ba2+

vodivosť). Zistili,

že tieto konštanty sú rádovo rovnaké, narozdiel od viac-iónového Ca2+

kanálu L-typu

(DHPR kanál), u ktorého sa tieto konštanty 1000-násobne líšia (Tsien a kol., 1987).

Väčšina doposiaľ publikovaných výsledkov naznačuje, že RyR kanál patrí medzi jedno-

iónové kanály. Výnimkou je práca Gillespieho a kol. z roku 2005, kde použitý PNP model

vypočítal prítomnosť viacerých iónov v selektívnom filtri RyR2 kanálu. Naviac,

experimentálne bola potvrdená prítomnosť anomálie, predpovedanej týmto modelom. Tým

sa opäť otvorila diskusia o charaktere vodivého póru RyR kanálu. Proti sebe dnes stoja dva

rôzne modely, každý s iným záverom.

55

3 Ciele práce

Skutočnosť, že doteraz nepoznáme 3D štruktúru RyR kanálu, limituje naše snahy

o pochopenie vodivého mechanizmu, ktorý sa uplatňuje pri transporte iónov cez vodivý pór

tohto kanálu. V súčasnosti jediným možným spôsobom ako získať aspoň určitú predstavu

o prenose iónov cez kanál sú experimenty, ktorými sa systematicky skúmajú vodivostné

charakteristiky kanálu špeciálnymi elektrickými metódami. Z doterajších experimentálnych

výsledkov vyplýva, že RyR2 kanál patrí do skupiny jedno-iónových kanálov (Tinker

a Williams, 1992; Lindsay a kol., 1991). Súčasné počítačové modely však naznačujú, že

v póre RyR2 kanálu sa môže nachádzať viac iónov naraz (Gillespie a kol., 2005). Našou

úlohou je rozšíriť databázu experimentálnych údajov o vodivostných vlastnostiach RyR2

kanálu izolovaného zo srdca potkana s cieľom prispieť k hlbšiemu pochopeniu obsadenosti

selektívneho filtra RyR2 kanálu rôznymi typmi iónov.

Naše konkrétne ciele sme zhrnuli do nasledovných bodov:

1. Zistiť, či sa vyskytujú anomálie v závislostiach iónovej vodivosti RyR2 kanálu,

reverzného potenciálu a amplitúdy prúdu pri 0 mV od mólového zlomku vybraného

iónu v zmesi s iným iónom. Sústredili sme sa na zmesi dvoch dvojmocných iónov,

jednomocného a dvojmocného iónu, a dvoch jednomocných iónov. Celková

koncentrácia iónov v zmesi bola blízka hodnote Kd pre závislosť prúdu cez kanál od

koncentrácie prechádzajúcich iónov. Pri navrhovaní experimentálnych podmienok

sme vychádzali zo súčasnej teórie AMFE javu.

2. Zistiť, či reverzný potenciál meraný v asymetrických bi-ionických podmienkach

vykazuje koncentračnú závislosť pri konštantnom pomere koncentrácií iónov na

cytosolickej a luminálnej strane kanálu. Túto závislosť sme sledovali pri rôznych

pomeroch koncentrácií. Koncentrácia iónu na luminálnej strane RyR2 kanálu bola

rovná alebo väčšia ako Kd pre závislosť prúdu cez kanál od koncentrácie

prechádzajúcich iónov.

56

4 Metódy

4.1 Izolácia vezikúl zo sarkoplazmatického retikula

Izolácia natívnych vezikúl zo sarkoplazmatického retikula zo srdca potkana bola

robená podľa Bucka a kol. (1999). Použili sa samci potkanov rodu Wistar s hmotnosťou

200-250g. Izolácia sa robila v chladenej miestnosti pri teplote +4oC. Použité chemikálie

pochádzali od firmy Sigma (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Nemecko), ak nie

je napísané inak.

4.1.1 Roztoky na izoláciu vzoriek

- homogenizačný pufor: 1M KCl, 10 mM Tris-maleát, + KOH, pH = 7,0

- resuspendačný pufor: 10 mM Tris-maleát, 10% sacharóza, 0,9% NaCl, + KOH,

pH = 6,8

- inhibítory proteáz (Roche Slovensko s.r.o., Diagnostics Division, Bratislava, SR) ,

pridávané tesne pred izoláciou do homogenizačného pufra:

1mM benzamidín

5 g/ml pepstatín A

5 g/ml leupeptín

1 M inhibítor kalpaínu I

1 g/ml aprotinín

1mM AEBSF (4-(2-aminoetyl)-benzénsulfonylfluorid hydrochlorid)

Rozmrazené srdcové komory potkanov (4 kusy) sa rozstrihali nožničkami na

menšie kúsky v homogenizačnom pufri s inhibítormi proteáz pri teplote +4oC. Následne sa

57

homogenizovali elektrickým homogenizátorom (Polytron) 3x 30s pri 20 000 otáčkach za

minútu (medzi točeniami 30s prestávky) na ľade. Nasledovalo niekoľko stupňov

centrifugácie, všetky prebiehali pri teplote +4 o

C v ultracentrifúge typu Beckman L7-55

Ultracentrifuge a s rotorom Ti 80.

Homogenát sa centrifugoval 20 minút pri 10 000 x g. Získaná peleta sa

rozhomogenizovala v homogenizačnom pufri a centrifugovala 20 minút pri 6 000 x g pri

4oC. Supernatant sa odsal a centrifugoval 25 minút pri 24 000 x g. Získaný supernatant sa

ďalej centrifugoval 120 minút pri 41 000 x g. Vzniknutá peleta sa resuspendovala

z resuspendačnom pufri v sklenenom homogenizátore (10x cyklus piestika), rozdelila do

skúmaviek typu ependorf a zmrazila v tekutom dusíku. Vzorky boli uskladňované

v hlbokomraziacom boxe pri teplote -70 oC.

4.2 Roztoky

4.2.1 Lipidové roztoky

Zásobné roztoky lipidov v chloroforme, s koncentráciou 10 mg/ml, boli uchovávané

pri teplote -20oC. Z nich sa pripravovali vybrané zmesi lipidov. Najskôr sme pomocou

vákuovej pumpy odparili chloroform a potom sme vysušené lipidy rozpustili v n-dekáne.

Lipidové zmesi, ktoré sme používali v experimentoch, mali výslednú koncentráciu 25

mg/ml.

-lipidový roztok I

dioleát fosfatidyl cholín : dioleát fosfatidyl serín v pomere 3:1

Na zlepšenie stability membrány bol niekedy do zmesi pridávaný aj difytanoát-fosfatidyl

cholín v pomere 1:1 s dioleoát fosfatidyl cholínom, pričom celkový pomer cholín : serín bol

3:1.

-lipidový roztok II

dioleát fosfatidyl etanolamín : dioleát fosfatidyl serín v pomere 3:1

Lipidy pochádzali od firmy Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA).

58

4.2.2 Roztoky elektrolytov

Pri meraní prúdov cez iónové kanály definujeme roztoky cis a trans. V prípade

RyR2 kanálov trans roztok obmýval luminálnu stranu kanálu a cis roztok stranu

cytosolickú.

- meranie Kd koncentračnej závislosti prúdu Ca2+

a Li+ iónov

Pre meranie nasýtenia amplitúdy prúdu dvojmocných iónov a určenia koncentrácie

Kd, pri ktorej je prúd rovný polovici maximálneho prúdu, sme si zvolili Ca2+

ióny.

Koncentráciu Ca2+

v trans roztoku sme menili (Tab.4.1.) od 5 do 53 mM (Tab.4.2.). Pre

meranie nasýtenia amplitúdy prúdu jednomocných iónov a určenia hodnoty Kd sme zvolili

meranie Li+ prúdu. Koncentráciu Li

+ iónov v trans roztoku sme menili od 50 do 400 mM

(Tab.4.3.). Na cis strane bol v týchto experimentoch použitý len jeden typ roztoku

(Tab.4.1.). Tento cis roztok obsahoval okrem iného 0,5 mM CaCl2 a 1 mM koncentráciu

chelátoru dvojmocných iónov, EGTA. Výsledná koncentrácia voľného Ca2+

na cis strane,

vypočítaná v programe Winmax32 v2.50 (http://www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html),

bola rovná 89 nM. Prítomnosť voľného Ca2+

na cytosolickej strane kanálu bola potrebná

na to, aby bol kanál citlivý na aktiváciu kofeínom. Kanály boli aktivované kofeínom

v rozsahu 2-5 mM. Zásobný roztok kofeínu s koncentráciou 50 mM bol pripravený

v príslušnom cis roztoku.

Tabuľka 4.1. Roztoky použité pri určovaní Kd pre koncentračnú závislosť

prúdu Ca2+

a Li+ iónov.

cis roztok trans roztok Ca2+

trans roztok Li+

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

250 mM HEPES

125 mM Tris

pH = 7,35

Ca(OH)2 podľa Tab.4.2.

+ HEPES

pH = 7,35

LiOH podľa Tab.4.3.

+ HEPES

pH = 7,35

[Ca(OH)2]trans

[mM]

Tabuľka 4.2. Koncentrácie

Ca(OH)2 v trans roztoku,

použité pri určovaní Kd pre

koncentračnú závislosť

prúdu Ca2+

.

[LiOH]trans

[mM]

Tabuľka 4.3. Koncentrácie

LiOH v trans roztoku,

použité pri určovaní Kd pre

koncentračnú závislosť

prúdu Li+.

5 50

8 100

10 200

20 300

53 400

http://www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html

59

- experimenty AMFE

V experimentoch, kde sme testovali prítomnosť AMFE, bol v cis roztoku prítomný

jednomocný ión Li+ (roztok cis 96Li

+, Tab.4.4.). Na trans strane sa nachádzala zmes dvoch

typov iónov (Tab.4.4. a Tab.4.5.) v rôznych definovaných pomeroch (Tab.4.6.) s celkovou

koncentráciou iónov v zmesi rovnou 8 mM alebo 96 mM. Možnosť použitia takýchto tri-

ionických podmienok pri hľadaní AMFE zdôvodnili Yue a Marban (1990). V tri-ionických

podmienkach sa vodivosť a iné vodivostné parametre určujú len z tej časti I-V krivky, ktorá

zodpovedá prúdu iónov v zmesi (Yue a Marban, 1990). Prítomnosť AMFE sme testovali

pre 7 rôznych dvojíc iónov na trans strane. Zvolené koncentrácie pre dvojmocné (8 mM) a

jednomocné ióny (96 mM) sú blízke hodnote Kd pre koncentračnú závislosť prúdu Ca2+

respektíve Li+ iónov. Anomálie vodivosti, reverzného potenciálu a amplitúdy prúdu pri 0

mV sme pre zmesy Ca2+

s jednomocnými iónmi (zmesi 4 a 5 v Tab.4.5.) hľadali aj v

podmienkach s [Li+]cis=8mM (roztok cis 8Li

+, Tab.4.4.).

Tabuľka 4.4. Roztoky použité v AMFE experimentoch.

roztok cis 96Li+ roztok cis 8Li

+ trans roztoky

96 mM LiOH

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

+ HEPES

pH = 7,35

8 mM LiOH

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

+ HEPES

pH = 7,35

hydroxid vybraného iónu podľa Tab.4.5

+ HEPES

pH = 7,35

Vodivosť kanálu bola určovaná zo smernice priamky preloženej prúdovo-

napäťovou (I-V) závislosťou v oblasti kladných prúdov (i 0 pA; smer trans cis).

V experimentoch v zmesi Cs+-Na

+ bola určovaná vodivosť aj pre tok iónov v smere

cis→trans. Táto bola určovaná z oblasti záporných prúdov. Reverzný potenciál bol

vypočítaný z rovnice priamky popisujúcej I-V závislosť. Spôsob určovania vodivosti

a výpočtu reverzného potenciálu je bližšie popísaný v časti 4.4 Analýza dát.

60

Tabuľka 4.5. Použité trans zmesi a ich

koncentrácia.

Tabuľka 4.6

Relatívne zastúpenie

iónu X v zmesi X+Y. zmes hydroxid koncentrácia

zmesi

[mM]

1 Ca(OH)2 8 [X] / ([X]+[Y])

Ba(OH)2

2 Ca(OH)2 8 0

Sr(OH)2 0,125

3 Ba(OH)2 8 0,25

Sr(OH)2 0,375

4 Ca(OH)2 8 0,5

CsOH 0,625

5 Ca(OH)2 8 0,75

LiOH 0,875

6 NaOH 96 1

CsOH 7 NaOH 96

LiOH

- meranie reverzného potenciálu

Prúdy cez iónové kanály boli merané v bi-ionických podmienkach s konštantným

pomerom koncentrácií iónov cis/trans. Použili sme tri rôzne pomery koncentrácií. Ca2+

ióny sa nachádzali v trans roztoku (Tab.4.7.). Jednomocné katióny, Li+ alebo Na

+, sa

nachádzali v roztoku cis (Tab.4.7.). Pomer koncentrácií jednomocných katiónov k

dvojmocným (cis/trans) bol konštantný (1, 5 alebo 12). Pre každé experimentálne

podmienky bola odmeraná I-V závislosť. Maximálny rozsah aplikovaných napätí bol od -

80 po +80 mV, s krokom 5 mV. Časť I-V závislosti, obsahujúca prúdy i>0 pA, bola

preložená priamkou a následne bola vypočítaná hodnota reverzného potenciálu (bližšie

popísané v časti 4.4 Analýza dát).

Tabuľka 4.7. Roztoky použité pri meraní koncentračnej závislosti Erev.

cis roztok trans roztok

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

LiOH alebo NaOH podľa Tab.4.8.

+ HEPES

pH = 7,35

Ca(OH)2 podľa Tab.4.8.

+ HEPES

pH=7.35

61

Tabuľka 4.8. Koncentrácie Ca2+

, Li+ a Na

+ iónov v roztokoch použitých

pri meraní reverzného potenciálu v asymetrických bi-ionických

podmienkach.

[Ca(OH)2]trans

[mM]

[LiOH]cis alebo [NaOH] cis [mM]

pomer 12:1 pomer 5:1 pomer 1:1

5 60 25 5

8 96 40 8

10 120 50 10

12 144 60 12

21 252 105 21

30 360 150 30

40 480 200 40

53 636 265 53

- porovnanie I-V závislostí RyR2 kanálov a mitochondriálnych aniónových kanálov

I-V závislosti RyR2 kanálov boli merané v symetrických a asymetrických

podmienkach v prítomnosti Li+ iónov (Tab.4.9.). Koncentrácie Li

+ boli zvolené rovnako

ako koncentrácie cholín chloridu pri meraní I-V závislostí mitochondriálnych aniónových

kanálov (Tab.4.10., bližšie popísané v článku Tomášková a kol. 2007).

Tabuľka 4.9. Roztoky pre meranie I-V závislostí RyR2 kanálu pre Li+ ión.

symetrické podmienky

asymetrické podmienky

cis roztok trans roztok cis roztok trans roztok

150 mM LiOH

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

+HEPES

pH=7,35

150 mM LiOH

+HEPES

pH=7,35

250 mM LiOH

0,5 mM CaCl2

1 mM EGTA

+HEPES

pH=7,35

50 mM LiOH

+HEPES

pH=7,35

Tabuľka 4.10. Roztoky pre meranie I-V závislostí aniónových kanálov pre Cl- ión.

symetrické podmienky

asymetrické podmienky

cis roztok trans roztok cis roztok trans roztok

150 mM cholín

chlorid

10 mM HEPES

5 mM Tris

2mM MgCl2

0,1 mM CaCl2

pH=7,40

150 mM cholín chlorid

10 mM HEPES

5 mM Tris

2mM MgCl2

1 mM EGTA

0,4 mM CaCl2

pH=7,40

250 mM cholín

chlorid

10 mM HEPES

5 mM Tris

2mM MgCl2

0,1 mM CaCl2

pH=7,40

50 mM cholín chlorid

10 mM HEPES

5 mM Tris

2mM MgCl2

1 mM EGTA

0,4 mM CaCl2

pH=7,40

62

4.2.3 Korekcia potenciálu na kvapalnom rozhraní

Pred každým experimentom bolo pomocou operačného zosilňovača korigované

napätie, vznikajúce na rozhraní dvoch roztokov. Toto napätie sa nazýva potenciál na

kvapalnom rozhraní (LJP, „liquid junction potential“). Príčinou jeho vzniku je to, že ióny

v roztokoch majú odlišnú pohyblivosť a rôznu koncentráciu. Pomocou operačného

zosilňovača sa na elektródy naloží konštatné napätie s rovnakou amplitúdou ako LJP,

ale opačného znamienka. Po vytvorení membrány sa preruší kontakt medzi roztokmi,

a teda LJP=0 mV, avšak operačný zosilňovač udržuje korekciu. To znamená, že aj pri

napätí 0 mV je na membránu naložené napätie s veľkosťou –LJP. Toto napätie treba

zobrať do úvahy, aby sme získali skutočné hodnoty napätia na membráne. V použitom

experimentálnom zoskupení sa nachádzajú dve rôzne rozhrania roztokov. Jedno rozhranie

je medzi agarovými mostíkmi a roztokmi a druhé je medzi roztokmi cis a trans. Hodnota

LJP vznikajúceho na rozhraní agarového mostíku a meracieho roztoku bola pre všetky

použité podmienky vypočítaná pomocou programu JPCalc (Barry, 1994). Tento program

je súčasťou programu Clampex 10.1 (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA,

www.axon.com). LJP na tomto rozhraní dosahoval hodnoty do +1,5 mV. Príspevok

z týchto rozhraní do celkovej hodnoty LJP bol zanedbateľný. Podstatný príspevok do

celkovej hodnoty LJP pochádzal z rozhrania roztokov cis/trans. LJP bol zmeraný a

automaticky kompenzovaný pomocou operačného zosilňovača (Bilayer Clamp Amplifier

BC-525D, Warner Instrument, Hamden, CT, USA). Na obrázkoch 4.1. a 4.2. sú ukázané

niektoré hodnoty LJP, ktoré boli experimentálne odmerané. Všetky I-V krivky, grafy a

záznamy ukázané v časti 5 Výsledky sú upravené príslušným spôsobom o hodnotu LJP.

http://www.axon.com/

63

[Ca2+

]trans [mM]

0 10 20 30 40 50 60

ko

rekcia

LJP

[

mV

]

0

5

10

15

20

25

[Li]/[Ca]=1 [Li]/[Ca]=5 [Li]/[Ca]=12

ko

rekcia

LJP

[

mV

]

0

5

10

15

20

Obrázok 4.1. Amplitúda LJP, potenciálu

vznikajúcom na rozhraní roztokov.

Ukážka korekcie pre [Li+]cis/[Ca

2+]trans = 5.

Medzi dvoma roztokmi obsahujúcimi rôzne

ióny a/alebo rôzne koncentrácie týchto

iónov vzniká napätie (tzv. liquid junction

potential, LJP). Pred každým meraním bolo

toto napätie kompenzované pomocou

prístroja. Veľkosti LJP sú ukázané v grafe.

Tieto hodnoty sa pri danom pomere

koncentrácií nemenili (ANOVA, P=0,814).

Obrazok 4.2. Amplitúda LJP pre 8mM

[Ca2+

]trans a ióny Li+ na strane cis a rôzne

pomery koncentrácií cis/trans. Hodnoty

LJP boli podobné aj pre Na+/Ca

2+. So

zvyšujúcim sa pomerom koncentrácií

cis/trans veľkosť LJP narastala. Amplitúda

LJP v žiadnom experimente nepresiahla 20

mV.

4.3 Metóda rekonštitúcie iónového kanálu do umelej lipidovej membrány

Začiatky metódy siahajú do 60. rokov dvadsiateho storočia, kedy Mueller a kol.

prvýkrát urobili stabilnú lipidovú dvojvrstvu na otvore v prepážke ponorenej v roztoku

elektrolytov (Mueller a kol., 1962). Keď ju pozorovali v optickom mikroskope, videli

čiernu škvrnu, z čoho vznikol názov – „black lipid membrane“, BLM – čierna lipidová

membrána. Dnes sa skratka BLM častejšie interpretuje ako „bilayer lipid membrane“, teda

lipidová dvojvrstva. Metóda rekonštitúcie iónového kanálu do BLM sa používa na meranie

prúdu prechádzajúceho cez jeden kanál – „single-channel current“.

Na prípravu umelej lipidovej membrány bola použitá teflónová komôrka s dvoma

prepojenými oddeleniami (cis a trans) a sklíčkom na prednej stene, aby sa umožnilo

pozorovanie formovania membrány pod mikroskopom. Do trans časti sa vkladá

64

polystyrénový pohárik s otvorom (priemer 30-80 m, Obr.4.3.), na ktorom sa formuje

BLM. Otvor v polystyrénovom poháriku sa najskôr potrie lipidovým roztokom I a nechá sa

voľne sušiť na vzduchu 15 až 20 minút. Po usušení sa vloží pohárik s otvorom do trans

oddelenia meracej komôrky (Obr.4.4.) a pridajú sa roztoky cis a trans tak, aby sa hladina

roztokov dostala 3-5mm nad otvor.

Pred každým experimentom sa pomocou

operačného zosilňovača koriguje potenciál

LJP, vznikajúci na rozhraní dvoch roztokov.

Potom sa otvor potrie lipidovým roztokom II

a na obrazovke počítača sa pozoruje časový

priebeh prúdu. Po sformovaní dvojvrstvy je

meraný prúd nulový a po aplikácii

striedavého trojuholníkového napätia

s amplitúdou 100 mV môžeme určiť

kapacitu lipidovej dvojvrstvy pomocou

počítačového programu BLM Analyzer

(Novak a kol., 2007). Oddelenia trans a cis

sú prostredníctvom agarových mostíkov

obsahujúcich 1 M KCl vodivo pripojené

k argentochloridovým elektródam.

Elektródy sú napojené na operačný zosilňovač tak, že kladný vstup, do ktorého prichádza

elektróda z cis oddelenia, je uzemnený a na zápornom vstupe je spätná väzba s odporom

nastaveným na prevod 100mV/pA. V operačnom zosilňovači je zabudovaný

dolnopriepustný, 4-pólový Besselovský filter nastavený na medznú frekvenciu 1 kHz

(Bilayer Clamp Amplifier BC-525D, Warner Instrument, Hamden, CT, USA). Filtrovaný

signál sa ďalej digitalizuje analógovo-digitálnym (A/D) prevodníkom (DigiData 1322 A,

Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA) a so vzorkovacou frekvenciou f = 4 kHz a

zaznamenáva do počítača (model pentium) pomocou programu AxoScope (Axon

Instruments, Inc. Foster City, CA, USA, Obr.4.5.).

Obrázok 4.3. Otvor v polystyrénovom

poháriku na vytvorenie umelej lipidovej

dvojvrstvy. Veľkosť tohto otvoru (šípka) je

40μm. Snímka bola získaná pomocou

optického mikroskopu (zväčšenie 20x) a CCD

kamery na Katedre experimentálnej fyziky

Fakulty matematiky, fyziky a informatiky

Univerzity Komenského.

65

Obrázok 4.4. Schéma meracej aparatúry použitej na rekonštitúciu

iónového kanálu do BLM. V trans poháriku je otvor, na ktorom sa formuje

umelá membrána. Do cis oddelenia sa pridávajú vezikuly, ktoré fúzujú

s umelou dvojvrstvou. Perfúzna sústava slúži na výmenu roztokov v cis

oddelení.

Po ustálení parametrov BLM sa pridá do oddelenia cis meracej komôrky pomocou

mikropipety 1 l z mikrozomálnej vzorky. Na vyvolanie fúzie vezikúl s BLM sa pridáva do

cis roztoku nasýtený roztok KCl (do 600μl zo zásobného roztoku) a CaCl2 (do 10 mM

celkovej koncentrácie). Po fúzii sa vytvorený gradient KCl odstráni premytím oddelenia cis

Obrázok 4.5. Schéma prístrojového usporiadania. Signál z elektród prechádza

operačným zosilňovačom so zabudovaným dolnopriepustným filtrom, ktorý odstraňuje

rušivé vysoké frekvencie. Signál sa digitalizuje v A/D prevodníku a vstupuje do počítača,

kde sa zaznamenáva a ďalej spracúvava.

pôvodným meracím roztokom a ďalej sa meria v definovanom pomere koncentrácií

cis/trans. Rekonštituované RyR2 kanály boli aktivované kofeínom rozpusteným

66

v príslušnom cis roztoku (50 mM zásobný roztok). Experimenty sa uskutočnili pri izbovej

teplote 22-24oC.

Pomocou opísanej metódy sa dá skúmať funkcia jednotlivých vnútrobunkových

iónových kanálov, ktorých lokalizácia neumožňuje použiť metódu patch-clamp. Výhoda

metódy BLM je v tom, že dokážeme sledovať funkciu jednej makromolekuly a máme

možnosť úplnej kontroly experimentálnych podmienok ako je prítomnosť a koncentrácia

iónov a iných látok v meracích roztokoch ako aj veľkosť aplikovaného napätia na

membráne. Nevýhoda tejto metódy je, že kanál v bunke, vo svojom prirodzenom prostredí,

môže byť ovplyvnený zatiaľ neznámymi látkami a faktormi, ktoré sa v umelom prostredí

nenachádzajú alebo neprejavia, a tým interpretácia výsledkov z fyziologického hľadiska

môže byť limitovaná.

4.4 Analýza dát

Prúdové záznamy iónových kanálov boli analyzované použitím programového

balíku pCLAMP 5.5, v jeho podprogramoch Fetchan a pSTAT (Axon Instruments, Inc.,

Foster City, CA, USA). V programe Fetchan boli záznamy filtrované digitálnym

dolnopriepustným filtrom s medznou frekvenciou 500 Hz. Amplitúda prúdu pri

jednotlivých napätiach bola určovaná z amplitúdových histogramov („all-point amplitude

histogram“). Tieto histogramy boli v podprograme pSTAT fitované sumou dvoch (n=2)

gaussovských kriviek (4.1) metódou Marquardt-LSQ:

(4.1)

n

i

x

i

i i

i

eC

y1

.2

)(2

2

.2.

kde Ci je konštanta zohľadňujúca výšku vrcholu gaussovskej krivky, i udáva x-ovú

súradnicu vrcholu a i je štandardná odchýlka rozdelenia popísaného danou gaussovskou

krivkou. Rozdiel polôh vrcholov zodpovedajúcich zatvorenej a otvorenej hladine kanálu

udáva veľkosť amplitúdy prúdu i (Obr. 4.6).

67

prúd [pA]

-4 -2 0 2 4 6

po

cetn

ost

0

1000

2000

3000

4000

iC O

Obrázok 4.6. Amplitúdový histo-

gram. Amplitúda prúdu i bola

určovaná rozdielom x-ových

súradníc vrcholov gaussovských

kriviek. Vrcholy zodpovedajú

zatvorenej (C) a otvorenej (O)

hladine kanálu.

Vodivosť kanálu bola určovaná zo smernice priamky preloženej I-V závislosťou:

(4.2) 0. iVGi

kde i je amplitúda prúdu, V je aplikované napätie, i0 je prúd pri nulovom napätí a G je

vodivosť kanálu. Keďže zmes iónov sa v AMFE experimentoch nachádzala iba na trans

strane membrány, vodivosť bola určovaná z tej časti I-V krivky, kde je i 0 (tok iónov v

smere trans cis). Rovnako bola určovaná vodivosť aj v experimentoch v bi-ionických

podmienkach, kde nás zaujímal tok Ca2+

iónov. Hodnota reverzného potenciálu Erev bola

získaná extrapoláciou priamky fitujúcej I-V závislosť až k nulovému prúdu, i = 0 pA,

výpočtom podľa vzťahu:

(4.3) G

iEV rev

0

Vo výsledkoch uvedené hodnoty Erev boli získané z rovnice priamky preloženej

časťou I-V závislosti fitujúcou len kladné prúdy, ako je znázornené na obrázku 4.7.

Po úprave hodnôt Erev o hodnotu LJP bola na základe rovnice (4.3) spätne

vypočítaná amplitúda prúdu i0.

68

napätie [mV]

-20 -10 0 10 20 30 40

am

pli

túd

a p

rúd

u

[p

A]

-2

0

2

4

6

Obrázok 4.7. Spôsob určovania reverzného

potenciálu a vodivosti RyR2 kanálu. Namerané I-V závislosti boli prekladané

priamkou. Smernica priamky udáva vodivosť

kanálu, reverzný potenciál, Erev, bol určený

priesečníkom osi x a priamky prekladajúcej

kladné prúdy. Ukázaná I-V závislosť bola

meraná v prítomnosti 53 mM Ca2+

v trans

roztoku (smer kladného prúdu- trans→cis).

Výsledné hodnoty v grafoch a tabuľkách sú uvedené ako priemer ± štandardná

odchýlka (SD) z počtu N hodnôt. Priemery boli vypočítané z N=3-8 hodnôt. Grafy

a prekladanie priamiek cez I-V závislosti boli robené v programe SigmaPlot 8.0 (Systat

Software Inc., Richmond, CA, USA).

Závislosť amplitúdy prúdu i od koncentrácie iónov bola v programe SigmaPlot 8.0

prekladaná krivkou typu Michaelis-Mentenovej v tvare:

(4.4) trans

n

d

trans

n

XK

Xii

][

][.max

kde [Xn+

]trans je koncentrácia iónu Xn+

s veľkosťou náboja n rovnou 1 alebo 2, imax je

amplitúda nasýteného prúdu a Kd je koncentrácia iónu Xn+

, pri ktorej je i=imax/2.

Zakrivenie I-V závislosti sme prekladali Goldman-Hodgkin-Katzovou rovnicou

prúdu, aby sme zistili, do akej miery je toto zakrivenie spôsobené prítomnosťou gradientu

iónov:

(4.5)

1

][.][....

22

RT

VFz

cisRT

VFz

trans

XXXX

X

e

XeX

RT

FVzPI

kde Ix je prúd iónu X, zx je jeho náboj, Px koeficient permeability, [X] koncentrácia iónu X,

V napätie na membráne. F je Faradayova konštanta, R plynová konštanta a T je absolútna

teplota. Voľný parameter pri prekladaní I-V krivky touto rovnicou bol koeficient

69

permeability, Px (Overholt a kol., 1993; Osmanovic a Shefner, 1990). Prekladanie dát

rovnicou (4.5) bolo robené v programe Origin 6 (OriginLab Corporation, USA).

Korelačná analýza bola robená v programe SigmaPlot 8.0 (Systat Software Inc.,

Richmond, CA, USA) pomocou lineárnej regresie. Získaný koeficient R predstavuje

Pearsonov korelačný koeficient a znamienko korelačného koeficientu sa odvodzuje od

znamienka smernice výslednej priamky. Ak je hodnota R blízka ±1, korelácia medzi

premennými je silná. Ak je hodnota R blízka nule, premenné sú považované za nezávislé.

Štatistické porovnanie dvoch skupín dát bolo robené t-testom pomocou internetovej

stránky: http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm. Štatistická analýza viacerých

skupín naraz bola robená jednorozmerným ANOVA testom v programe Mathematica 5.0

(Wolfram Research, www.wolfram.com). Hladina významnosti bola pri všetkých

štatistických analýzach rovnaká, =0,05. Ak bola pravdepodobnosť P , boli výsledky

považované za signifikantne odlišné. Vzájomné porovnanie jednotlivých skupín bolo

následne robené post-testom („multiple comparison test”) tiež v programe Mathematica

5.0.

http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm

http://www.wolfram.com/

70

5 Výsledky

5.1 AMFE experimenty

Prítomnosť anomálneho mólového frakčného efektu - AMFE sme testovali spolu v

deviatich rôznych podmienkach (sedem rôznych zmesí iónov na trans strane membrány).

Tieto sú rozdelené do troch skupín podľa typu zmesi. Keďže pri vysokých koncentráciách

iónov dochádza k nasýteniu póru iónmi, môže dôjsť k zamaskovaniu prípadného AMFE

javu (Rodriguez-Contreras a kol., 2002). Z tohto dôvodu boli merania prevádzané v

podmienkach, kedy je prúd iónov cez kanál rovný polovičnej hodnote maximálneho prúdu

pre daný ión. V prvom kroku sme preto potrebovali určiť hodnotu koncentrácie Kd, pri

ktorej je toto kritérium splnené.

5.1.1 Meranie Kd pre koncentračnú závislosť prúdu dvojmocných a jednomocných iónov

cez RyR2 kanál

Keďže RyR2 kanál funguje in vivo ako Ca2+

kanál, pre meranie nasýtenia prúdu

dvojmocných iónov sme zvolili práve Ca2+

ióny. Koncentráciu Ca2+

na trans strane

membrány sme menili v rozsahu 5-53 mM. cis roztok bol v týchto experimentoch vždy

rovnaký. Ca2+

prúd cez RyR2 kanál sa nasycoval s narastajúcou koncentráciou [Ca2+

]trans

(Obr.5.1.). Tento nárast bol dobre popísateľný krivkou typu Michaelis-Mentenovej

(rovnica 4.4). Preložením experimentálnych bodov touto krivkou sme získali teoretickú

hodnotu maximálneho prúdu imax = 3,54 ± 0,13 pA. Koncentrácia Ca2+

iónov na trans

strane, pri ktorej je prúd i = imax/2 je Kd = 8,8 ± 0,9 mM (R2

= 0,9948).

Z jednomocných iónov sme vybrali ióny Li+. Použili sme koncentrácie v rozsahu 50

- 400 mM a odmerali sme amplitúdu prúdu pri nulovom napätí. Rovnako ako Ca2+

prúd, aj

Li+ prúd sa s rastúcou koncentráciou nasycoval (Obr.5.2.). Preložením dát krivkou (4.4)

sme získali hodnotu Kd = 93,6 ± 18,0 mM a maximálnu hodnotu prúdu imax = 11,0 ± 0,6 pA

pri hodnote koeficientu determinácie R2=0,9953.

71

A B [Ca2+

]trans

[mM]

5

10

20

53

Obrázok 5.1. Nasýtenie prúdu Ca2+

iónov cez RyR2 kanál. (A) Preložením dát krivkou typu

Michaelis-Menten sme zistili teoretickú hodnotu nasýteného Ca2+

prúdu imax = 3,54 ± 0,13 pA.

Amplitúda prúdu i = imax/2 sa dosahuje pri koncetrácii Ca2+

rovnej Kd = 8,8 ±0,9 mM. (B) Prúdové

záznamy pri vybraných koncentráciách Ca2+

iónov na trans (luminálnej) strane membrány.

Prerušovaná čiara znázorňuje otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa

otvára smerom nahor.

72

A

B

[Li+]trans

[mM]

50

100

Obrázok 5.2. Nasýtenie Li+ prúdu

cez RyR2 kanál. S rastúcou

koncentráciou Li+ v trans roztoku

dochádzalo k nárastu amplitúdy

prúdu (A). Teoretická maximálna

hodnota prúdu je 11,0 pA; pri 93,6

mM [Li+]trans je amplitúda polovičná.

Prúdové záznamy (B) boli merané

vo vybraných koncentráciách

[Li+]trans. Prerušovaná čiara

znázorňuje otvorenú hladinu kanálu,

C označuje zatvorenú hladinu.

Kanál sa otvára smerom nahor.

200

400

5.1.2 Hľadanie AMFE javu v zmesi dvoch dvojmocných iónov

Prítomnosť AMFE sme testovali v podmienkach, kedy sa v trans oddelení menilo

relatívne zastúpenie iónov v roztoku (podľa Tab.4.6.). Zmena roztoku v trans oddelení sa

robila po uzemnení trans elektródy. Odobralo sa príslušné množstvo roztoku obsahujúceho

jeden typ iónu z trans oddelenia a rovnaký objem roztoku obsahujúceho iný typ iónu sa

pridal. Potom sa na membránu aplikovalo napätie a zmerala sa I-V závislosť. Takto sa

postupne menilo zloženie trans roztoku pokiaľ to dovolila stabilita membrány.

Najcennejšie boli experimenty, počas ktorých sa podarilo takýmto spôsobom určiť

73

vodivostné charakteristiky toho istého kanálu vo viacerých molárnych frakciách danej

zmesi iónov.

Celkovú koncentráciu zmesi dvojmocných iónov v trans oddelení sme zvolili 8

mM, teda blízku Kd pre koncentračnú závislosť prúdu Ca2+

iónov. Aby sme nemuseli na

membránu aplikovať príliš veľké napätie, ktoré ju destabilizuje a tým poškodzuje, nastavili

sme koncentráciu iónov cis roztoku tak, aby hodnota reverzného potenciálu bola nulová.

Výpočtom podľa rovnice (2.5), za predpokladu, že PCa2+/PLi+ = 6 (Tinker a Williams,

1992), sme získali hľadanú hodnotu [Li+]cis=96 mM.

Sledovali sme zmeny Erev, G a amplitúdy prúdu pri nulovom napätí (i0) v zmesiach

Ba2+

-Ca2+

(Obr.5.3.A,D,G), Sr2+

-Ca2+

(Obr.5.3.B,E,H) a Sr2+

-Ba2+

(Obr.5.3.C,F,I).

Hodnoty i0 boli vypočítané z hodnôt G a korigovaných hodnôt Erev pomocou vzťahu (4.3).

Štatistická analýza ukázala, že závislosť Erev od mólového pomeru koncentrácií iónov bola

vo všetkých troch zmesiach monotónna. Vodivosť G v zmesiach Ba2+

-Ca2+

a Sr2+

-Ca2+

narastá monotónne. V zmesi Sr2+

-Ba2+

dochádza k miernemu poklesu priemernej vodivosti

pri 87,5% zastúpení iónov Sr2+

v zmesi, ale post-test nepotvrdil prítomnosť štatisticky

významného minima v tejto závislosti. Amplitúda prúdu pri nulovom napätí i0 nevykazuje

prítomnosť anomálie v žiadnej z testovaných zmesí dvojmocných iónov. Na obrázku 5.4

sú ukázané charakteristické prúdové záznamy pri aplikovanom napätí +15 mV. Pôvodne

sme na membránu aplikovali externé napätie +30 mV a po korekcii o hodnotu LJP sme

získali uvedenú hodnotu. Vybrané záznamy boli získané v podmienkach s 50% zastúpením

iónov v trans zmesi.

74

Ob

rázo

k 5

.3.

Z

men

y E

rev,

G a

i0 v

závis

lost

i od

rel

atí

vn

eho z

ast

úp

enia

ión

ov

v z

mes

i d

vo

jmocn

ých

ió

no

v.

Gra

fy u

kaz

ujú

pri

ebeh

vybra

ných

vo

div

ost

ný

ch p

aram

etro

v:

Ere

v (

-●-)

, G

(-○

-) a

i0 (

-●-)

v z

ávis

lost

i od p

om

eru i

ónov v

zm

esia

ch B

a2+-C

a2+ (

A,D

,G),

S

r2+-C

a2+

(B,E

,H)

a S

r2+-B

a2+

(C,F

,I).

An

i je

den

z t

ých

to p

rieb

ehov

nev

ykaz

uje

anom

áliu

.

75

Ba2+

-Ca2+

Sr2+

-Ca2+

Sr2+

-Ba2+

Obrázok 5.4. Záznam prúdu cez RyR2 kanál získaný z experimentov v zmesiach dvojmocných

iónov. Zastúpenie Ba2+

aj Sr2+

v zmesi s Ca2+

je 50%. Celková kocentrácia použitých zmesí je 8 mM, čo

približne zodpovedá hodnote Kd pre koncentračnú závislosť Ca2+

prúdu. Prerušovaná čiara znázorňuje

otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa otvára smerom nahor. Na membránu

bolo aplikované napätie +15 mV.

5.1.3 Hľadanie AMFE javu v zmesi dvojmocného a jednomocného iónu

5.1.3.1 AMFE experimenty pre pomer koncentrácií cis/trans = 12

V týchto zmesiach sme v trans oddelení udržiavali 8 mM celkovú koncentráciu

iónov a na cis strane 96 mM koncentráciu Li+ iónov. Použili sme iónové zmesi Cs

+- Ca

2+ a

Li+- Ca

2+. V obidvoch prípadoch hodnoty Erev monotónne narastali s rastúcim zastúpením

jednomocného iónu v zmesi s Ca2+

(zmes Cs+-Ca

2+ Obr.5.5.A, zmes Li

+-Ca

2+ Obr.5.5.B).

Vodivosť v zmesi Cs+- Ca

2+ sa menila monotónne a výrazne vzrástla pri 100% zastúpení

Cs+ v zmesi (Obr.5.5.C). V prípade zmesi Ca

2+-Li

+ (Obr.5.5.D) sa vodivosť RyR2 kanálu

76

Obrázok 5.5. Závislosť Erev, G a i0 od relatívneho zastúpenia iónov v zmesi dvojmocného a

jednomocného iónu, pomer cis/trans=12. Grafy ukazujú priebeh vybraných vodivostných

parametrov v závislosti od zastúpenia iónov Cs+ (A,C,E) a Li

+ (B,D,F) v zmesi s Ca

2+: Erev (-●-),

G (-○-) a i0 (-●-). V žiadnej z týchto závislostí nie je prítomné štatisticky významné minimum.

77

nemenila (ANOVA, P=0,0894). Anomália sa nevyskytovala ani v závislosti i0 od

zastúpenia iónov Cs+ a Li

+ v zmesi s Ca

2+ (Obr.5.5.E,F). Prúdové záznamy z experimentov

sú ukázané na obrázku 5.6. Zastúpenie iónov Cs+ a Li

+ v trans zmesi s iónom Ca

2+ je 50%.

Cs+-Ca

2+

Li+-Ca

2+

Obrázok 5.6. Záznam prúdu získaný z experimentov v zmesiach dvojmocného a jednomocného

iónu pri pomere koncentrácií cis/trans=12. Zastúpenie jednomocných iónov Cs+ a Li

+ v zmesi s Ca

2+ je

50%. Celková koncentrácia použitých zmesí je 8 mM. Prerušovaná čiara znázorňuje otvorenú hladinu

kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa otvára smerom nahor. Napätie aplikované na membránu

bolo +15 mV .

5.1.3.2 AMFE experimenty pre pomer koncentrácií cis/trans = 1

Pre zmesi Cs+-Ca

2+ a Li

+-Ca

2+ bola predpovedaná prítomnosť anomálie prúdu

v podmienkach s pomerom koncentrácií cis/trans = 1 (Gillespie, 2008) a pre zmes Cs+-Ca

2+

bola anomália aj experimentálne overená použitím neštandardného experimentálneho

protokolu. Preto sme zopakovali merania s 8 mM Li+ na cis strane membrány. Reverzný

potenciál sa v oboch zmesiach menil monotónne (Obr.5.7.A,B). V zmesi Li+-Ca

2+ sa

vyskytovala minimálna priemerná hodnota vodivosti pri 87,5% zastúpení Li+ v zmesi

(Gmin=77,6±5,0 pS) a následný post-test potvrdil prítomnosť minima (Obr.5.7.D). V zmesi

Cs+-Ca

2+ sa nevyskytovalo minimum vodivosti RyR2 kanálu (Obr.5.7.C).

78

Obrázok 5.7. Zmeny Erev, G a i0 v závislosti od relatívneho zastúpenia iónov v zmesi

dvojmocného a jednomocného iónu, pomer cis/trans=1. Grafy ukazujú priebeh Erev (-●-)

v závislosti od zastúpenia Cs+ (A) a Li

+ (B) v zmesi s Ca

2+. Pre tento parameter sa anomália

nevyskytovala. Priebeh G (-○-) v meniacej sa zmesi Cs+-Ca

2+ (C) bol monotónny. Na grafe (D)

vidíme anomáliu vodivosti v zmesi Li+-Ca

2+. V prítomnosti 1mM Ca

2+ v zmesi s Li

+ (87,5% Li

+)

sa vyskytuje štatisticky významné minimum vodivosti, Gmin=77,6±5,0 pS (D). V závislosti

amplitúdy prúdu i0 od zloženia zmesí Cs+-Ca

2+ (E) a Li

+-Ca

2+ (F) sa anomália nevyskytovala.

79

Minimum nebolo pozorované ani pre hodnoty prúdu i0 (Obr.5.7. E,F). Prúdové záznamy

z experimentov sú ukázané na obrázku 5.8.

Cs+-Ca

2+

Li+-Ca

2+

Obrázok 5.8. Záznam prúdu získaný z experimentov v zmesiach dvojmocného a

jednomocného iónu pre pomer koncentrácií cis/trans=1. Zastúpenie jednomocných iónov Cs+

a Li+ v zmesi s Ca

2+ je 50%. Celková koncentrácia použitých zmesí je 8 mM. Prerušovaná čiara

znázorňuje otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa otvára smerom

nahor. Hodnoty napätia na membráne boli +27,5 mV pre Cs+-Ca

2+ a +20 mV pre Li

+-Ca

2+.

Pôvodne sme na membránu aplikovali externé napätie +30 mV a po korekcii o hodnotu LJP (pre

každú zmes iné LJP) sme získali uvedené hodnoty.

5.1.4 Hľadanie AMFE v zmesi dvoch jednomocných iónov

Z jednomocných iónov sme si zvolili zmesi Cs+-Na

+ a Li

+-Na

+. Koncentráciu iónov

v trans roztokoch sme vybrali rovnú koncentrácii Li+ iónov v cis roztoku. Je to

koncentrácia blízka hodnote Kd pre koncentračnú závislosť prúdu Li+ iónov cez RyR2

kanál. Priebeh Erev je v oboch zmesiach monotónny (Obr.5.9.A,B), pretože post-test

neukázal štatisticky významné minimum ani v jednej z týchto dvoch zmesí. V závislosti

80

vodivosti od mólového zlomku Cs+ v zmesi Cs

+-Na

+ sa vyskytuje minumum pri 75%

zastúpení Cs+ iónov v trans roztoku (Obr.5.9.C). Minimálna vodivosť je Gmin = 209 ±18

pS a predstavuje ~58% individuálnej vodivosti Cs+ (GCs+=357 ± 23 pS) aj Na

+ (GNa+=356 ±

24pS). Post-test potvrdil štatistickú významnosť tohto minima na hladine významnosti

=0,05.

Niektoré kanály boli v prítomnosti 96 mM Li+ na cis strane a jednomocných iónov

na trans strane aktivované vysokými koncentráciami kofeínu (až do 15 mM), pretože

v týchto podmienkach bola citlivosť RyR2 kanálu na kofeín znížená. Aktivitu kanálov sme

kvantifikovali určením pravdepodobnosti otvorenia Po, ktorá je definovaná ako pomer času,

ktorý kanál strávi v otvorenom stave k časovej dĺžke vyhodnocovaného úseku. Priemerná

pravdepodobnosť otvorenia RyR2 kanálu v Cs+-Na

+ zmesi bola relatívne nízka, Po = 0,21

+- 0,20. Pri nízkych pravdepodobnostich otvorenia sa môže stať, že zaznamenané udalosti

sú príliš krátke a kanál nedosiahne maximálnu úroveň otvorenia. Tým by mohlo dôjsť

k nesprávnemu určeniu vodivosti. Aby sme zistili možný vplyv pravdepodobnosti otvorenia

Po na určenie vodivosti kanálu, teda na výskyt AMFE, urobili sme korelačnú analýzu

(Obr.5.10.). Pearsonov korelačný koeficient pre tieto dáta má hodnotu R = -0,1143

Môžeme povedať, že neexistuje lineárny vzťah medzi Po a nameranými hodnotami

vodivosti v zmesi Cs+-Na

+. Zmeny vo vodivosti RyR2 kanálu sa vzťahujú len na tok iónov

v smere trans cis. Ako ukazuje obrázok 5.11., vodivosť RyR2 kanálu pre Li+ ióny,

tečúce v smere cis trans, nevykazuje štatisticky významné extrémy (ANOVA: P=0,0839;

=0,05). Priemerná hodnota vodivosti pre Li+ je GLi+=223±29 pS (N=31). Vodivosť

v zmesi Li+-Na

+ zodpovedajúca toku iónov v smere trans cis sa menila monotónne

v závislosti od zastúpenia týchto dvoch iónov v zmesi (Obr.5.9.D). Amplitúda prúdu i0

nevykazovala prítomnosť anomálie ani v jednej zmesi (Obr.5.9.E,F). Vybrané I-V krivky

z AMFE experimentov v zmesi Cs+-Na

+ sú ukázané na obrázku 5.12. Na obrázku 5.13. sú

ukážky prúdových záznamov, ktoré pochádzajú z AMFE experimentov v podmienkach,

kedy bolo zastúpenie jednotlivých iónov v trans zmesi 50%.

81

Obrázok 5.9. Zmeny Erev, G a i0 v závislosti od relatívneho zastúpenia iónov v zmesi

jednomocných iónov. Grafy ukazujú priebeh Erev (-●-) v závislosti od zastúpenia Cs+ (A) a Li

+

(C) v zmesi s Na+. Podľa štatistickej analýzy (post-test) sa v priebehu Erev ani v jednej z týchto

dvoch zmesí minimum nevyskytovalo. V zmesi Cs+-Na

+ sa vyskytuje výrazné minimum

(AMFE) vodivosti G (-○-; B), zatiaľ čo v zmesi Li+-Na

+ sa vodivosť mení monotónne (D). Ani

v jednej z týchto zmesí nebola pozorovaná anomália pre amplitúdu prúdu pri 0 mV, i0 (-●-): Cs+-

Na+ (E) a Li

+-Na

+ (F).

82

Obrázok 5.10. Vzťah medzi vodivosťou

a pravdepodobnosťou otvorenia RyR2

kanálu v zmesi Cs+-Na

+. Korelačná

analýza ukázala, že vodivosť

a pravdepodobnosť otvorenia sú nezávislé

vlastnosti RyR2 kanálu.

Obrázok 5.11. Vodivosť RyR2 kanálu

pre Li+ ióny na cis strane v závislosti od

pomeru koncentrácií Na+ a Cs

+ iónov

na trans strane. Za zvolených

experimentálnych podmienok prúdia Li+

ióny zo strany cis na trans stranu. V tomto

smere nedochádza k poklesu vodivosti

ako je tomu v smere trans cis.

Priemerná hodnota vodivosti pre Li+ je

223 ± 29 pS.

Obrázok 5.12. Vybrané I-V krivky pre

zmes Cs+-Na

+. Znázornené sú I-V krivky

pre trans koncentrácie: 96mM Cs+ (-■-),

96 mM Na+ (-▼-) a zmes 24mM Na

+ a

72mM Cs+ (-○-), v ktorej sa vyskytovalo

minimum vodivosti.

83

Cs+-Na

+

Li+-Na

+

Obrázok 5.13. Záznam prúdu získaný z experimentov v zmesiach jednomocných iónov.

Zastúpenie Cs+ aj Li

+ v zmesi s Na

+ je 50%. 96 mM celková koncentrácia vybraných zmesí je

blízka hodnote Kd pre koncentračnú závislosť prúdu Li+ iónov. Prerušovaná čiara znázorňuje

otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa otvára smerom nahor. Hodnota

napätia aplikovaného na membránu bola +32 mV.

5.1.5 Zhrnutie vodivostných parametrov RyR2 kanálu získaných z AMFE experimentov

V nasledujúcich tabuľkách sú zhrnuté hodnoty individuálnych vodivostí RyR2

kanálu, hodnoty Erev a i0 pre dvojmocné (Tab.5.1.) a jednomocné ióny (Tab.5.2.)

v použitých experimentálnych podmienkach 96 mM Li+

cis / [Xn+

]trans.

ión X2+

[X2+

]trans [mM] N GX2+ [pS] Erev(X2+

) [mV] i0 (X2+

) [pA]

Ca2+

8 8 102,6 ± 5,7 -46,0 ± 3,8 4.72 ± 0.20

Ba2+

8 5 142,4 ± 10,0 -46,3 ± 2,1 6.52 ± 0.55

Sr2+

8 5 134,7 ± 4,4 -39,3 ± 3,7 5.29 ± 0.52

Tabuľka 5.1. Vodivostné parametre RyR2 kanálu pre dvojmocné ióny. Uvedené hodnoty G,

Erev a i0 (priemer±SD) pochádzajú z experimentov, kedy sa na cis strane nachádzali Li+ ióny

v koncentrácii 96 mM.

84

Ión X+ [X

+]trans [mM] N GX+ [pS] Erev(X

+) [mV] i0 (X

2+) [pA]

Na+ 96 3 356,3 ± 24,0 11,7 ± 3,5 -4.07 ± 0.87

Cs+ 96 5 357,1 ± 23,7 32,6 ± 3,4 -11.64 ± 1.19

Li+ 96 3 187,0 ± 17,0 0,6 ± 3,1 -0.11 ± 0.35

Tabuľka 5.2. Vodivostné parametre RyR2 kanálu pre jednomocné ióny. Uvedené hodnoty G,

Erev a i0 (priemer±SD) pochádzajú z experimentov, kedy sa na cis strane nachádzali Li+ ióny

v rovnakej koncentrácii ako jednomocné ióny na trans strane.

5.2 Meranie reverzného potenciálu

5.2.1 Koncentračná závislosť reverzného potenciálu

V ďalších experimentoch sme testovali závislosť Erev od absolútnej koncentrácie

Ca2+

v trans oddelení, teda na luminálnej strane RyR2 kanálu. Merania boli robené v

podmienkach, kedy sa na každej strane membrány nachádzal len jeden typ iónu

prechádzajúceho cez RyR2 kanál. V trans roztoku boli prítomné len ióny Ca2+

a v cis

roztoku boli prítomné Li+ alebo Na

+ ióny. Zvolili sme si tri rôzne pomery koncentrácií

cis/trans: 1, 5 a 12. Absolútne koncentrácie iónov na obidvoch stranách boli menené tak,

aby pomer koncentrácií cis/trans ostal konštantný v danej sérii experimentov. Pri

najväčšom pomere koncentrácií, 12, sme zistili najvýraznejšiu závislosť Erev od

koncentrácie [Ca2+

]trans (Obr.5.14.). Zmeny boli pozorované v obidvoch testovaných

podmienkach, Li+/Ca

2+ aj Na

+/Ca

2+. Hodnota Erev dosahuje v oboch prípadoch minimum

pri 8 mM koncentrácii [Ca2+

]trans, čo zodpovedá hodnote Kd pre koncentračnú závislosť

Ca2+

prúdu cez RyR2 kanál. Minimálna hodnota Erev pri pomere 12 je v podmienkach

Li+/Ca

2+ rovná -44,1 ± 3,8 mV (N=8) a v podmienkach Na

+/Ca

2+ je to -45,6 ± 3,1 mV

(N=4). Pri zvyšujúcej sa koncentrácii [Ca2+

]trans sa hodnoty Erev ustalujú a dosahujú plató.

Minimum sa vytráca so znižujúcim sa pomerom koncentrácií (Obr.5.14.).V podmienkach

Na+/Ca

2+ sa pri pomere 12 vyskytuje ešte jedno minimum, a to pri 21 mM koncentrácii

[Ca2+

]trans. Toto minimum sa stráca už pri znížení pomeru koncentrácií na 5. Pri pomere 1

sa už výrazné minimum nevyskytuje, avšak koncentračná závislosť je stále prítomná.

85

Hodnoty priemerov Erev pri rôznych koncentráciách [Ca2+

]trans sú štatisticky významne

odlišné aj pri pomere 1 (Tab.5.3.).

Obrázok 5.14. Závislosť Erev od koncentrácie luminálneho Ca2+

pri rôznych pomeroch

koncentrácii cis/trans. V grafoch sú ukázané závislosti Erev od koncentrácie luminálneho Ca2+

([Ca2+

]trans). Na cis strane sa nachádzali ióny Li+ (A) alebo Na

+ (B) v koncentráciách, ktoré boli 1-

(-□-), 5- (-▼-) alebo 12-násobkom [Ca2+

]trans (--). Každý bod na grafe predstavuje priemer ± SD

z 3-8 hodnôt Erev.

[Li+] / [Ca

2+] P [Na

+] / [Ca

2+] P

1 1,1.10-6

1 1,6.10-4

5 1,9.10-4

5 1,2.10-4

12 8,6.10-15

12 6,3.10-9

Tabuľka 5.3. Štatistické porovnanie hodnôt Erev v rámci jednotlivých

sád experimentov. Dáta boli analyzované ANOVA testom s hladinou

významnosti =0,05. Všetky hodnoty P sú oveľa menšie ako , čo

znamená, že pri všetkých troch pomeroch koncentrácií v oboch iónových

podmienkach dochádzalo k zmene Erev.

Prúdové záznamy RyR2 kanálov v podmienkach Li+/Ca

2+ a Na

+/Ca

2+ s pomerom

koncentrácií 12 sú ukázané pri rôznych koncentráciách [Ca2+

]trans na obrázkoch 5.15. (8

mM [Ca2+

]trans) a 5.16. (53 mM [Ca2+

]trans). Vodivosť RyR2 kanálu pre Ca2+

ióny, získaná

zo všetkých meraní Erev, je zhrnutá na obrázku 5.17. Vodivosť nevykazuje žiaden extrém

v oblasti 8 mM Ca2+

v trans roztoku ani prípadné zmeny v dôsledku rôzneho gradientu

86

iónov cez membránu. Prúdové záznamy z experimentov s 53 mM [Ca2+

]trans a rôznymi

koncentráciami [Li+]cis sú na obrázku 5.18. Obrázok 5.19. ukazuje podobné záznamy pri

rôznych koncentráciách [Na+]cis. I-V krivky z vybraných experimentov sú ukázané na

obrázku 5.20.

-12 mV +7 mV

Li+/Ca

2+

Na+/Ca

2+

Obrázok 5.15. Prúdové krivky RyR2 kanálu získané v podmienkach 96 mM X+ / 8 mM Ca

2+.

V prvom stĺpci sú prúdové stopy pri aplikovanom napätí -12 mV, v druhom pri +7 mV (pôvodne

sme aplikovali napätie 0 mV a +20 mV). V hornom riadku je záznam v podmienkach Li+/Ca

2+,

v dolnom Na+/Ca

2+. Prerušovaná čiara znázorňuje otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú

hladinu. Kanál sa otvára smerom nahor.

-12 mV +7 mV

Li+/Ca

2+

Na+/Ca

2+

Obrázok 5.16. Prúdové krivky RyR2 kanálu získané v podmienkach 636 mM X+ / 53 mM

Ca2+

. V prvom stĺpci sú prúdové stopy pri napätí -12 mV a +7 mV (pôvodne sme aplikovali

napätie 0 mV a +20 mV). V hornom riadku je záznam v podmienkach Li+/Ca

2+, v dolnom

Na+/Ca

2+. Prerušovaná čiara znázorňuje otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu.

Kanál sa otvára smerom nahor.

87

Obrázok 5.17. Vodivosť RyR2

kanálov pre ióny Ca2+

z

experimentov zameraných na

meranie Erev. Použitie rôznych

pomerov [X+]/[Ca

2+] a rôzneho

iónu na cis strane nemalo vplyv na

Ca2+

vodivosť RyR2 kanálu.

Použité symboly: Li+/Ca

2+ - plné

symboly, Na+/Ca

2+ - prázne

symboly. Pomery sú odlíšené

tvarom symbolov: 1 -■-, 5 -●- a

12 -▲-.

[Li+]/[Ca

2+]

1

5

12

Obrázok 5.18. Prúdové krivky RyR2 kanálu v podmienkach s 53 mM [Ca2+

]trans a Li+

iónmi na cis strane kanálu. Na membránu bolo aplikované výsledné napätie (pôvodne 0 mV)

-5 mV (pomer 1), -10 mV (pomer 5) a -13 mV (pomer 12). Prerušovaná čiara znázorňuje

otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál sa otvára smerom nahor.

88

[Na+]/[Ca

2+]

1

5

12

Obrázok 5.19. Prúdové krivky RyR2 kanálu v podmienkach s 53 mM [Ca2+

]trans a Na+

iónmi na cis strane. Čísla na pravej strane obrázku predstavujú pomer koncentrácie Na+ na cis

strane ku koncentrácii Ca2+

iónov na strane trans. Na membránu bolo aplikované výsledné

napätie (pôvodne 0 mV) -7 mV (pomer 1), -11 mV (pomer 5) a -12 mV (pomer 12).

Prerušovaná čiara znázorňuje otvorenú hladinu kanálu, C označuje zatvorenú hladinu. Kanál

sa otvára smerom nahor.

Obrázok 5.20. I-V krivky RyR2 kanálu v podmienkach Li+/Ca

2+ (A) a Na

+/Ca

2+ (B), pomer

koncentrácii cis/trans=12. I-V krivky v podmienkach 8mM [Ca2+

]trans / 96mM [X+]cis sú

znázornené symbolmi -●-, a v 53mM [Ca2+

]trans / 636mM [X+]cis symbolmi -○-.

89

5.3 Porovnanie I-V závislostí RyR2 kanálov a mitochondriálnych aniónových kanálov

Počas experimentov sme si všimli ďalšiu zaujímavú vlastnosť RyR2 kanálov. Je

ňou tvar I-V závislosti. V symetrických 150 mM roztokoch obsahujúcich Li+ ióny má

RyR2 kanál lineárnu I-V závislosť a vodivosť 214,9 ± 11,9 pS (N=4). Rovnako má lineárnu

I-V závislosť aj v gradiente Li+ iónov (250/50 mM) a vodivosť 212,0 ± 9,2 pS (N=5,

Obr.5.21.A). Touto vlastnosťou sa odlišuje napríkad od mitochondriálnych aniónových

kanálov so srdca potkana (týmito kanálmi sme sa zaoberali v článku Tomášková a kol.,

2007). I-V závislosť týchto kanálov je zalomená v asymetrických podmienkach (250/50

mM cholín chlorid). Ich vodivosť je pri napätiach Erev rovná 96,5 ± 1,7 pS (N=3), avšak

pri napätiach Erev je vodivosť približne polovičná, 44,8 ± 4,2 pS (N=3). Vodivosť

spomínaných aniónových kanálov z mitochondrí v symetrickom 150 mM cholín chloride je

92 ± 14 pS (N=9, Obr. 5.21.B).

Obrázok 5.21. Porovnanie I-V kriviek RyR2 kanálu a mitochondriálnych aniónových

kanálov. (A) I-V závislosť RyR2 kanálu v symetrických (150 mM, -○-) a asymetrických

(cis/trans:250/50 mM , -●-) roztokoch obsahujúcich Li+ ióny . (B) I-V závislosť mitochondriálnych

aniónových kanálov v symetrických (150 mM, -○-) a asymetrických (250/50 mM, -●-) roztokoch

obsahujúcich cholín chlorid. U aniónových kanálov sa v asymetrických podmienkach I-V závislosť

zakrivuje, zatiaľ čo v prípade RyR2 kanálu ostáva závislosť lineárna. Body predstavujú priemer ±

SD z minimálne 3 hodnôt.

90

V prípade RyR2 kanálu dochádza k rektifikácii (zakriveniu I-V závislosti) až vtedy,

keď sa meria v iónových koncentráciách, v ktorých nie je vodivosť nasýtená. Tento prípad

je ukázaný na obrázku 5.22. V symetrickom 96 mM Li+ je I-V závislosť lineárna.

Zakrivuje sa, keď na jednej strane znížime koncentráciu Li+ na 8mM, čo je približne Kd

koncentračnej závislosti vodivosti pre Li+ ióny (Tinker a kol., 1992).

Príčiny rektifikácie prúdu môžu byť rôzne. Na úrovni individuálnych kanálov môže

byť rektifikácia spôsobená asymetrickými podmienkami (gradient iónov alebo prítomnosť

blokujúcich iónov na jednej strane kanálu) alebo asymetriou póru prípadne asymetrickým

potenciálovým profilom (Hille, 1992; Jackson, 2006). O Goldman-Hodgkin-Katzovej

(GHK) rektifikácii hovoríme vtedy, ak je zakrivenie I-V závislosti opísateľné GHK

rovnicou prúdu (4.5). Pri GHK rektifikácii je zakrivenie I-V krivky tým výraznejšie, čím

väčší je gradient prechádzajúcich iónov (Hille, 1992). Zakrivenie I-V závislosti

mitochondriálnych aniónových kanálov, ktoré sa ukázalo len v asymetrických

podmienkach, poukazuje na GHK rektifikáciu. GHK rovnica (4.5) dobre popisuje I-V

závislosť týchto kanálov (Obr.5.23.). Tento typ rektifikácie neberie do úvahy štruktúru

kanálu. V prípade RyR2 kanálov je príčinou zakrivenia pravdepodobne to, že koncentrácia

Li+ na trans strane bola blízko Kd pre koncentračnú závislosť vodivosti RyR2 kanálu.

V tejto oblasti vodivosť nie je nasýtená a preto v smere trans→cis bola menšia ako

vodivosť v smere cis→trans. Vodivosť RyR2 kanálu v 8 mM [Li+]trans iónov nie je

ovplyvnená prítomnosťou vysokej koncentrácie Li+ iónov na cis strane, pretože rovnaká

vodivosť bola nameraná aj v podmienkach s 8 mM Li+ na oboch stranách membrány.

Zakrivenie I-V závislosti RyR2 kanálu v podmienkach cis/trans: 96/8 mM Li+ teda nie je

zapríčinené prítomnosťou gradientu. Túto myšlienku podporuje aj fakt, že GHK rovnica

prúdu (4.5) nadokáže nameranú I-V závislosť popísať. Avšak na základe dostupných

informácií o GHK teórii nie je možné povedať, čo sa deje vo vodivom póre aniónových

kanálov, keď dochádza k rektifikácii, resp. čo sa deje v póre RyR2 kanálu, keď k nej za

analogických podmienok nedochádza.

91

Obrázok 5.22. Zakrivenie I-V závislosti

RyR2 kanálu v Li+ iónoch. Keď bola na

trans strane znížená koncentrácia Li+ na 8

mM, I-V závislosť sa zakrivila (-○-;

G96Li=190pS, G8Li=134pS). Príčinou

zakrivenia môže byť to že koncentrácia

Li+ na trans strane je blízko Kd pre

koncentračnú závislosť vodivosti RyR2

kanálu pre Li+. Body predstavujú priemer

± SD z minimálne 5 hodnôt.

Obrázok 5.23. Zakrivenie I-V

závislosti mitochondriálnych

aniónových kanálov. Experimentálne

získané hodnoty (●) sú preložené GHK

rovnicou prúdu (―). GHK rovnica

dobre popisuje zakrivenú I-V závislosť

mitochondriálnych aniónových

kanálov (cis/trans: 250/50 mM Cl-).

92

Príloha: I-V krivky vo vybraných iónových podmienkach

Zmesi dvoch dvojmocných iónov

93

Zmesi dvojmocných a jednomocných iónov

94

Zmesi dvoch jednomocných iónov

I-V krivky z meraní Erev pri 53 mM [Ca2+

]trans a rôznych pomeroch koncentrácii

cis/trans.

95

6 Diskusia

Predložená práca sa venuje popisu permeačných vlastností RyR2 kanálu zo srdca

potkana. Tieto vlastnosti odrážajú mechanizmus transportu iónov cez vodivý pór iónového

kanálu. RyR kanál patrí medzi najväčšie iónové kanály. Jeho fyziologickou úlohou je

uvoľňovanie Ca2+

iónov zo sarkoplazmatického retikula po stimulácii sprostredkovanej

napäťovo-závislým Ca2+

kanálom. Dôsledkom uvoľnenia Ca2+

iónov je kontrakcia

svalového vlákna.

Spôsob, akým ióny cez RyR kanál prechádzajú, je napriek dlhoročným snahám

nejasný. Dnes poznáme dva rôzne modely permeácie iónov pórom RyR kanálu, každý

z nich založený na inej fyzikálnej teórii. Starší model, tzv. bariérový model, je založený na

Eyringovej teórii reakčných rýchlostí (Tinker a kol., 1992b). Novší, PNP model využíva

Nernst-Planckovu rovnicu elektrodifúzie a Poissonovu rovnicu pre potenciál (napr. Chen

a kol., 1997 alebo Gillespie a kol., 2005). Napriek tomu, že stúpenci PNP modelu považujú

bariérový model za nesprávny (napr. Chen a kol., 1997; Gillespie, 2008), dodnes sa

bariérový model resp. bariérová teória využíva pri zisťovaní mechanizmu transportu iónov

cez iónový kanál. Dôvod je ten, že bariérová teória navrhuje a interpretuje niekoľko typov

experimentov, zameraných na obsadenosť selektívneho filtra iónového kanálu (Eisenman

a Horn,1983). Najčastejšie sa na zisťovanie počtu iónov v selektívnom filtri kanálu

využívajú AMFE experimenty (napr. Friel a Tsien, 1989; Yue a Marban, 1990; Sesti a kol.,

1995). Bariérová teória považuje testovanie koncentračnej závislosti Erev pri udržiavaní

konštantného pomeru koncentrácie iónov cis/trans za experimenty s rovnakou výpovednou

hodnotou ako AMFE experimenty (Eisenman a Horn, 1983), napriek tomu sa s nimi

v literatúre stretneme len zriedkavo.

Naším prvým cieľom bolo systematické hľadanie anomálneho správania sa

vodivosti a reverzného potenciálu. Na DHPR kanáli už bolo ukázané, že prítomnosť AMFE

javu môže byť ovplyvnená výberom experimentálnych podmienok, napr. koncentráciou

iónov v zmesi (Almers a McCleskey, 1984; Yue a Marban, 1990). V prípade DHPR kanálu

sa anomália vyskytuje v koncentráciách blízkych Kd pre koncentračnú závislosť vodivosti

a stráca sa v oblastiach nasýtenia vodivosti (Rodriguez-Contreras a kol., 2002). Keďže pre

96

RyR2 kanál je Kd pre koncentračnú závislosť vodivosti dvojmocných iónov menšia ako 1

mM, zvolili sme si koncentrácie v oblasti Kd pre koncentračnú závislosť prúdu. Za týchto

podmienok prechádza cez kanál polovičný počet iónov, ako pri koncentráciách, kedy je

prúd cez kanál nasýtený. V porovnaní s Tinkerom a Williamsom (1992) sme použili 26-

krát nižšiu koncentráciu zmesi dvojmocných iónov. Nepozorovali sme však anomáliu

vodivosti alebo reverzného potenciálu (Erev) ani v jednej z troch použitých dvojmocných

zmesí: Ba2+

-Ca2+

, Sr2+

-Ca2+

, Sr2+

-Ba2+

. Avšak anomália sa môže prejaviť vo viacerých

vodivostných parametroch alebo len v jednom z nich. Preto sme zisťovali, či sa v daných

podmienkach nevyskytne anomália amplitúdy prúdu pri 0 mV (i0), ktorá je súčinom

vodivosti a Erev. V dvojmocných zmesiach sa anomália tohto parametra nevyskytovala.

V prípade 8 mM zmesi Cs+-Ca

2+ s 96 mM Li

+ na cis strane sme nezistili výskyt anomálie

ani jedného z troch testovaných parametrov. Keďže AMFE experimenty sa štandardne

robia v podmienkach s rovnakými koncentráciami iónov na oboch stranách membrány

(Eisenman a Horn, 1983), zopakovali sme merania pri 8mM cytosolickom Li+. Vodivosť,

Erev aj i0 sa aj v tomto prípade menili monotónne. Je zaujímavé, že pre zmes iónov Cs+-Ca

2+

Gillespie (2008) predpovedal a experimentálne potvrdil výrazné minimum prúdu spôsobené

jednostranným pridaním 1mM Ca2+

do symetrických roztokov obsahujúcich 100mM Cs+.

Rozdiel medzi našimi a Gillespieho výsledkami bude pravdepodobne spôsobený výberom

experimentálnych podmienok a odlišným experimentálnym prístupom. My sme použili

štandardný prístup, na rozdiel od Gillespieho prístupu pre hľadanie AMFE javu, ktorý bol

modifikovaný. Rovnako Gillespie (2008) predpovedal pokles prúdu Li+ iónov v prítomnosti

1mM Ca2+

. V 8mM zmesi Li+-Ca

2+ zníženie Li

+ na cis strane z 96 na 8 mM odhalilo málo

výraznú anomáliu vodivosti RyR2 kanálu. Minimum vodivosti sa vyskytlo pri 12,5%

zastúpení Ca2+

v zmesi, čo predstavuje 1mM Ca2+

a 7mM Li+. Anomália sa však

v závislosti amplitúdy prúdu i0 od mólového pomeru týchto dvoch iónov v zmesi

neukázala. Naproti tomu, pre zmes jednomocných iónov Cs+-Na

+ sme potvrdili prítomnosť

výrazného minima vodivosti. Toto minimum sa, v zhode s PNP/DFT modelom RyR2

kanálu podľa Gillespieho a kol. (2005) a Gillespieho (2008), vyskytovalo pri 75%

zastúpení iónov Cs+ v zmesi na trans strane. Stojí za povšimnutie, že pokles vodivosti

nameraný v 96 mM zmesi je podstatne hlbší (pokles o 40%) ako v 250 mM zmesi (pokles

97

o 15%, Gillespie a kol., 2005). V druhej skúmanej zmesi jednomocných iónov, Li+-Na

+,

sme zistili monotónne závislosti všetkých troch sledovaných vodivostných parametrov:

vodivosti, Erev aj i0.

Interpertácia anomálie vodivosti v zmysle obsadenosti selektívneho filtra závisí od

modelu permeácie iónov cez kanál. Bariérová teória považuje AMFE za charakteristickú

vlastnosť viac-iónových kanálov, avšak nie každý viac-iónový kanál musí vykazovať

anomáliu vodivosti alebo Erev (Hille a Schwarz, 1978). PNP teória považuje AMFE za jav

nezávislý od obsadenosti selektívneho filtra (Nonner a kol., 1998). Dôležité je, že sme opäť

experimentálne potvrdili prítomnosť anomálie vodivosti v zmesi Cs+-Na

+, pretože táto

anomália bola predpovedaná PNP/DFT modelom (Gillespie a kol., 2005). Tento model

zároveň, na základe vypočítaného počtu iónov v selektívnom filtri, zaradil RyR2 kanál

medzi viac-iónové kanály (Gillespie a kol., 2005).

Naše výsledky sú v súlade s novou teóriou AMFE prezentovanou v roku 2008

skupinou Gillespieho a kol. Táto teória tvrdí, že ak sa pre daný kanál môže vyskytovať

AMFE jav vodivosti, bude možné túto anomáliu pozorovať len v určitých podmienkach.

Kanál by mal mať podobnú vodivosť pre oba ióny v zmesi a musí medzi nimi selektovať.

RyR2 kanál medzi dvojmocnými iónmi takmer neselektuje, ako ukazujú pomery

koeficientov permeability (Tinker a kol., 1992b): PBa2+/PCa2+= 0,89; PSr2+/PCa2+= 1,03

a PSr2+/PBa2+= 1,16. Preto podľa AMFE teórie by sa v týchto zmesiach nemala vyskytovať

anomália vodivosti, čo je v súlade s našimi experimentálnymi výsledkami. Z pohľadu

AMFE teórie podľa Gillespieho a kol. (2008), ak by RyR2 kanál vykazoval anomáliu,

výskyt minima by sme očakávali v závislosti vodivosti od zloženia zmesí Cs+-Ca

2+

(PCs+/PCa2+= 0,09), Li+-Ca

2+ (PLi+/PCa2+= 0,15) a Cs

+-Na

+ (PCs+/PNa+=0,53). Podľa kritérií

AMFE teórie, najvýraznejšie anomálie by sme očakávali práve v 8mM zmesiach

jednomocných iónov s Ca2+

. V týchto podmienkach RyR2 kanál spĺňa predpoklady AMFE

teórie pre prítomnosť anomálie, pretože medzi jednomocnými iónmi a iónmi Ca2+

RyR2

kanál selektuje najvýraznejšie v porovnaní s ostatnými použitými dvojicami, PLi+/PCa2+=

0,15 a PCs+/PCa2+= 0,09 (Tinker a kol., 1992b). Navyše, pomer vodivostí pre ióny Li+ k Ca

2+

(pri 8 mM koncentrácii) je 1. V prípade iónov Cs+ je tento pomer 1,5 až 2. Výskyt

AMFE v zmesi Cs+-Na

+ je v súlade s podmienkami výskytu anomálie podľa Gillespie

98

a kol. (2008), pretože pomer vodivostí je GCs+/GNa+ 1,1 a pomer koeficientov permeability

je PCs+/PNa+=0,53 (Tinker a kol., 1992b). Monotónne závislosti vodivosti, Erev a i0 v zmesi

jednomocných iónov Li+-Na

+ sú tiež v súlade s kritériami Gillespieho a kol. (2008), pretože

pre tieto ióny je pomer GNa+/GLi+ 2 a PLi+/PNa+= 0,86 (Tinker a kol., 1992b). Tieto

experimenty na RyR2 kanáli podporujú AMFE teóriu Gillespieho a kol. (2008). Je teda

pravdepodobné, že základné princípy AMFE teórie sa uplatňujú aj v RyR2 kanáli (tienenie

iónov, selektivita na základe náboja a iné). Táto teória bola úspešne aplikovaná aj na

napäťovo-závislý Ca2+

kanál (Gillespie a Boda, 2008).

Bariérová teória popisuje aj iné vlastnosti, ktorými sa dajú odlíšiť od seba jedno-

iónové a viac-iónové kanály. Jednou z nich je koncentračná závislosť Erev, meraného pri

konštantnom pomere koncentrácií iónov cez membránu. Ak pri takto navrhnutom

experimente dochádza k zmene Erev, podľa bariérovej teórie je možné takýto výsledok

interpretovať len viac-iónovým obsadením selektívneho filtra (Hille a Schwarz, 1978;

Eisenman a Horn, 1983). Napriek tomu bola táto závislosť pre RyR2 kanál skúmaná len

v jednom prípade - Tinker a Williams (1992) merali závislosť Erev v bi-ionických

podmienkach s iónmi K+ na cytosolickej strane a Ca

2+ na luminálnej strane kanálu. Použili

koncentrácie v rozsahu 50-400 mM, pričom pomer koncentrácií bol [K+]/[Ca

2+]=1. V

týchto podmienkach nezistili žiadne zmeny Erev. My sme sa zamerali na nižšie koncentrácie

iónov Ca2+

na luminálnej strane kanálu, začínajúc od koncentrácií v blízkosti Kd

koncentračnej závislosti Ca2+

prúdu. Keďže sme používali natívne vezikuly SR obsahujúce

veľa K+ kanálov, vymenili sme K

+ ióny za ióny Li

+ a Na

+. Vzhľadom na to, že bariérová

teória neobmedzuje pomer koncentrácií iónov v bi-ionických podmienkach, v ktorých sa

koncentračná závislosť Erev meria (Läuger, 1973; Hille a Schwarz, 1978; Eisenman a Horn,

1983), zvolili sme si tri rôzne pomery – 1, 5 a 12. Pre obidve dvojice iónov, Li+/Ca

2+ aj

Na+/Ca

2+, sme pozorovali pri všetkých troch pomeroch zmeny Erev. Najvýraznejšie zmeny

sme namerali pri pomere 12, kde minimum Erev pri 8mM [Ca2+

]trans bolo najhlbšie. Je

zaujímavé, že toto minimum bolo dosiahnuté práve pri koncentrácii zodpovedajúcej Kd

koncentračnej závislosti Ca2+

prúdu. Minimum nebolo spôsobené zmenou vodivosti RyR2

kanálu pre Ca2+

ióny. Na pochopenie toho, čo sa odohráva vo vodivom póre v týchto

99

podmienkach je potrebné interpretovať experimentálne výsledky dostupnými

matematickými modelmi.

Na základe našich výsledkov interpretovaných aplikovaním bariérovej teórie

môžeme povedať, že RyR2 kanál je pravdepodobne viac-iónovým kanálom. Tento záver je

v zhode s najnovším PNP/DFT modelom RyR2 kanálu z roku 2005 (Gillespie a kol.). Táto

práca tiež poukazuje na dôležitosť výberu experimentálnych podmienok. Ukazuje sa, že

prítomnosť AMFE závisí od výberu iónov (Gillespie a kol., 2005) a tiež od použitých

koncentrácií, ako sme ukázali v prípade AMFE v zmesi Na+-Cs

+, kedy pri nižšej

koncentrácii iónov v zmesi bolo minimum vodivosti výraznejšie v porovnaní s Gillespiem

a kol. (2005). Pri meraní v 8 mM jednomocných iónoch na cis aj trans strane sme sa dostali

na hranicu merateľnosti prúdov cez RyR2 kanál kvôli zníženému pomeru signálu k šumu.

Model, ktorý dostatočne dobre popisuje experimentálne údaje, nám preto môže ukázať ako

sa daný kanál správa aj v podmienkach, ktoré už nemožno experimentálne dosiahnuť (napr.

vo fyziologických podmienkach). Počítačový model iónového kanálu môže byť užitočný aj

pri hľadaní anomálií vo vodivostných vlastnostiach. Bez neho musí experimentátor

vyskúšať niekoľko rôznych podmienok, kým odhalí existujúcu anomáliu. Ale môže sa stať,

že práve v tých podmienkach, ktoré otestoval, žiadna anomália neexistuje, ako sa stalo

Tinkerovi a Williamsovi (1992). Na základe svojich výsledkov usúdili, že RyR2 kanál sa

nespráva anomálne v žiadnych podmienkach. Gillespie a kol. (2005) však ukázal, že AMFE

pre RyR2 kanál existuje, ale len v určitých podmienkach. K tomuto záveru prišiel pomocou

PNP/DFT modelu. Zdá sa, že toto je ten správny prístup pri hľadaní anomálií a iných

významných permeačných vlastností iónových kanálov. Predpoveď modelu sa potom

experimentálne potvrdí alebo vyvráti, čo následne prispeje k ďalšiemu zlepšeniu daného

modelu.

100

7 Záver

Cieľom predloženej práce bolo systematické preskúmanie permeačných vlastností

ryanodínového receptora (RyR2 kanálu) zo srdca potkana. Prúdy cez jednotlivé RyR2

kanály sme merali metódou rekonštitúcie iónového kanálu do umelej lipidovej dvojvrstvy

(BLM). Zamerali sme sa na hľadanie anomálií vo vybraných vodivostných/permeačných

vlastnostiach. V porovnaní s doteraz publikovanými prácami sme zvolili také

experimentálne podmienky, aby sme vylúčili stav, kedy je pór kanálu saturovaný iónmi.

Saturácia by mohla viesť k maskovaniu existujúcich anomálii a tým k nekorektným

záverom. Výsledky je možné zhrnúť do dvoch bodov:

1. Hľadali sme anomáliu (AMFE) vodivosti, reverzného potenciálu (Erev)

a amplitúdy prúdu i0 v deviatich rôznych zmesiach iónov. Použili sme tri zmesi

dvojmocných iónov, štyri zmesi jednomocného a dvojmocného iónu a dve

zmesi jednomocných iónov. Ukázali sme prítomnosť minima vodivosti v

zmesiach Li+-Ca

2+ pri pomere cis/trans = 1 a Cs

+-Na

+. Podali sme druhý

experimentálny dôkaz o prítomnosť minima v zmesi Cs+-Na

+, ktoré bolo

predpovedané PNP/DFT modelom RyR2 kanálu. Prispeli sme tak k overeniu

tohto matematického modelu. Anomálie v zmesiach dvojmocných iónov sme

nenašli ani v podmienkach, kedy vodivý pór RyR2 kanálu nie je saturovaný

iónmi. Či sa anomália niektorého vodivostného parametra vyskytuje v zmesiach

dvojmocných iónov za iných podmienok ako sme použili, môže ukázať

matematický model RyR2 kanálu. Naviac, naše výsledky podporujú

novovzniknutú AMFE teóriu. Z toho je možné usudzovať, že fyzikálne princípy,

z ktorých táto teória vychádza, sa uplatňujú aj v RyR2 kanáli.

2. Zistili sme výraznú koncentračnú závislosť reverzného potenciálu Erev,

meraného v bi-ionických podmienkach pri konštantnom pomere cis/trans

koncentrácií iónov. Závislosť Erev sa vyskytovala pre obe testované dvojice

iónov Li+/Ca

2+ aj Na

+/Ca

2+ a pre všetky tri testované pomery: 1, 5 a 12.

Naše výsledky, interpretované pomocou bariérovej teórie, naznačujú, že RyR2

kanál môže byť viac-iónový kanál. Experimentálne sme zistili prítomnosť anomálie

101

vodivosti v zmesi Cs+-Na

+, ktorá bola predpovedaná PNP/DFT modelom RyR2 kanálu.

Tento model, nezávisle na prítomnosti AMFE, vypočítal, že v selektívnom filtri RyR2

kanálu sa môže nachádzať niekoľko iónov súčasne. Každý z týchto modelov je založený na

inej fyzikálnej teórii, avšak z oboch modelov vyplýva, že RyR2 kanál pravdepodobne patrí

medzi viac-iónové kanály.

Predložená práca priniesla nové výsledky, ktoré by mohli významne pomôcť pri

odhaľovaní mechanizmu permeácie iónov cez vodivý pór RyR2 kanálu. Naviac, získané

výsledky môžu prispieť k overeniu a ďalšiemu vylepšeniu existujúcich modelov permeácie

iónov cez RyR2 kanál.

102

8 Literatúra

1. ALMERS, W. a MCCLESKEY, E.W. 1984. Non-selective conductance in calcium

channels of frog muscle; calcium selectivity in a single file pore. In: J. Physiol., 1984,

zv.353, s.585-608

2. ANYATONWU, G.I. - BUCK, E.D. a EHRLICH, B.E. 2003. Methanethiosulfonate

ethylammonium block of amine currents through the ryanodine receptor reveals

single pore architecture. In: J. Biol. Chem., 2003, zv.278, s.45528-45538

3. ASHCROFT, N.W. a MERMIN, N.D. 1976. Solid state physics. Harcourt Brace

College Publishers, New York, 1976

4. BALSHAW, D. - GAO, L. a MEISSNER, G. 1999. Luminal loop of the ryanodine

receptor: A pore-forming segment? In: Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, zv.96, s.3345-

3347

5. BARRY, P.H. 1994. J.P.Calc, a software package for calculating liquid junction

potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer

measurements and for correcting junction potential measurements. In: J. Neurosci.

Methods, 1994, zv.51, s.107-116

6. BERS, D.M. a STIFFEL, V.M. 1993. Ratio of ryanodine to dihydropyridine receptors

in cardiac and skeletal muscle and implications for E-C coupling. In: Am. J. Physiol.,

1993, zv.264, s.C1587-C1593

7. BHAT, M.B. - ZHAO, J. - TAKESHIMA, H. a MA, J. 1997. Functional calcium

release channel formed by the carboxyl-terminal portion of ryanodine receptor. In:

Biophys. J., 1997, zv.73, s.1329-1336

8. BLOCK, B.A. - IMAGAWA, T. - CAMPBELL, K.P. a FRANZINI-ARMSTRONG,

C. 1988. Structural evidence for direct interaction between the molecular components

of the transverse tubule/sarcoplasmic reticulum junction in skeletal muscle. In: J.

Cell. Biol., 1988, zv.107, s.2587-2600

9. BOSSEN, E.H. - SOMMER, J.R. a WAUGH, R.A. 1978. Comparative stereology of

the mouse and finch left ventricle. In: Tissue Cell., 1978, zv.10, s.773-779

103

10. BRANDT, N.R. - CASWELL, A.H. - BRANDT, T. - BREW, K. a MELLGREN,

R.L. 1992. Mapping of the calpain proteolysis products of the junctional foot protein

of the skeletal muscle triad junction. In: J. Membr. Biol., 1992, zv.127: s.35-47

11. BUCK, E.B. - LACHNIT, W.G. a PESSAH, I.N. 1999. Mechanism of

Hexachlorocyclohexane Toxicity: I. Relationship between altered ventricular myocyte

contractility and ryanodine receptor function. In: JPET, 1999, zv.289, s.477-485

13. CHEN, D.P. 1997. Nonequilibrium thermodynamics of transports in ion channels. In:

Progress of Cell research: Towards molecular biophysics of ion channels. Ed.

Sokabe M. - Auerbach A. a Sigworth F., Elsevier, Amsterdam, 1997, s.269-277

14. CHEN, D.P. - BARCILON, V. a EISENBERG, R. 1992. Constant fields and constant

gradients in open ionic channels. In: Biophys. J., 1992, zv.61, s.1372-1393

15. CHEN, D.P. a EISENBERG, R. 1993. Charges, currents and potentials in ionic

channels of one conformation. In: Biophys. J., 1993, zv.64, s.1405-1421

16. CHEN, D.P. - XU, L. - EISENBERG, R. a MEISSNER, G. 2003. Calcium ion

permeation through the calcium release channel (ryanodine receptor) of cardiac

muscle. In: J. Phys. Chem. B, 2003, zv.107, s.9139-9145

17. CHEN, D.P. - XU, L. - TRIPATHY, A. - MEISSNER, G. a EISENBERG, R. 1997.

Permeation through the calcium release channel of cardiac muscle. In: Biophys. J.,

1997, zv.73, s.1337-1354

18. CHEN, D.P. - XU, L. - TRIPATHY, A. - MEISSNER, G. a EISENBERG, R. 1999.

Selectivity and permeation in calcium release channel of cardiac muscle: alkali metal

ions. In: Biophys. J., 1999, zv.76, s.1346-1366

19. CHEN-IZU, Y. - MCCULLE, S.L. - WARD, C.W. - SOELLER, C. - ALLEN, B.M.,

RABANG, C. - CANNEL, M.B. - BALKE, C.W. a IZU, L.T. 2006. Three-

dimensional distribution of ryanodine receptor clusters in cardiac myocytes. In:

Biophys. J., 2006, zv.91, s.1-13

20. COWLEY, J.M. 1984. Diffraction physics. North Holland, Amsterdam, 1984, s.430

21. CREIGHTON, T.E. 1983. Proteins: Structure and molecular properties. W.H.

Freeman&Co., New York., 1983, s.515

104

22. DI BIASE, V. a FRANZINI-ARMSTRONG, C. 2005. Evolution of skeletal type e-c

coupling: a novel means of controlling calcium delivery. In: J. Cell. Biol., 2005,

zv.171, s.695-704

23. DOYLE, D.A. - CABRAL, J.M. - PFUETZNER, R.A. - KUO, A., GULBIS J.M. -

COHEN, S.L. - CHAIT, B.T. a MACKINNON, R. 1998. The structure of the

potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. In: Science,

1998, zv.280, s.69-76

24. DU, G.G. - SANDHU, B. - KHANNA, V.K. - GUO, X.H. a MACLENNAN, D.H.

2002. Topology of Ca2+

release channel of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum

(RyR1). In: Proc. Natl. Anal. Sci., 2002, zv.99, s.16725-16730

25. DULHUNTY, A.F. a POULIQUIN, P. 2003. What we don’t know about the structure

of ryanodine receptor calcium release channels. In: Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.,

2003, zv.30, s.713-723

26. EISENBERG, R. 1996. Computing the field in proteins and channels. In: J. Membr.

Biol., 1996, zv.150, s.1-25

27. EISENMAN, G. a HORN, R. 1983. Ionic selectivity revisited: the role of the kinetic

and equilibrium processes in ion permeation through channels. In: J. Membr. Biol.,

1983, zv.76, s.197-225

28. EISENMAN, G. - SANDBLOM, J. a NEHER, E. 1978. Interactions in cation

permeation through the gramicidin channel. Cs, Rb, K, Na, Li, Tl, H and effects of

anion binding. In: Biophys. J., 1978, zv.22, s.307-340

29. FABIATO, A. a FABIATO, F. 1975. Contractions induced by a calcium-triggered

release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. In:

J. Physiol. (London), 1975, zv.249, s.469-495

30. FATT, P. a GINSBORG, P.L. 1958. The ionic requirements for the production of

action potentials in crustacean muscle fibers. In: J. Physiol., 1958, zv.142, s.516-543

31. FERGUSON, D.G. - SCHWARTZ, H.W. a FRANZINI-ARMSTRONG, C. 1984.

Subunit structure of junctional feet in triads of skeletal muscle: a freeze-drying,

rotary-shadowing study. In: J. Cell. Biol., 1984, zv.99, s.1735-1742

105

32. FILL, M. a COPELLO, J.A. 2002. Ryanodine recpetor calcium release channels. In:

Physiol. Rev., 2002, zv.82, s.893-922

33. FOSSET, M. - JAIMOVICH, E. - DELPONT, E. a LAZDUNSKI, M. 1983.

[3H]nitrepidine receptors in skeletal muscle. In: J. Biol. Chem., 1983, zv.258, s.6086-

6092

34. FRANZINI-ARMSTRONG, C. 1970. Studies of the triad. I. Structure of the junction

in frog twitch fibers. In: J. Cell. Biol., 1970, zv.47, s.488-498

35. FRANZINI-ARMSTRONG, C. - PROTASI, F. a RAMESH, V. 1999. Shape, size and

distribution of Ca2+

release units and couplons in skeletal and cardiac muscles. In:

Biophys. J., 1999, zv.77, s.1528-1539

36. FRIEL, D.D. a TSIEN, R.W. 1989. Voltage-gated calcium channels: Direct

observation of the anomalous mole fraction effect at the single-channel level. In:

Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, zv.86, s.5207-5211

37. FURUICHI, T. - FURUTAMA, D. - HAKAMATA, Y. - NAKAI, J. - TAKESHIMA,

H. a MIKOSHIBA, K. 1994. Multiple types of ryanodine receptor/Ca2+

release

channels are differentially expressed in rabbit brain. In: J. Neurosci., 1994, zv.14,

s.4794-4805

38. GAO, L. - BALSHAW, D. - XU, I. - TRIPATHY, A. - XIN, C.L. a MEISSNER, G.

2000. Evidence for the role of the lumenal M3-M4 loop in the skeletal muscle Ca2+

release channel (ryanodine receptor) activity and conductance. In: Biophys. J., 2000,

zv.79, s.828-840

39. GILLESPIE, D. 2008. Energetics of divalent selectivity in a calcium channel: the

ryanodine receptor case study. In: Biophys. J., 2008, zv.94, s.1169-1184

40. GILLESPIE, D. a BODA, D. 2008. The anomalous mole fraction effect in calcium

channels: A measure of preferential selectivity. In: Biophus. J., 2008, zv.95, s.2658-

2672

41. GILLESPIE, D. - BODA, D. - HE, Y. - APEL, P. a SIWY, Z.S. 2008. Synthetic

nanopores as a test case for ion channel theories: an anomalous mole fraction effect

without single filing. In: Biophys. J., 2008, zv.95, s.609-619

106

42. GILLESPIE, D. a EISENBERG, R. 2002. Physical descriptions of experimental

selectivity measurements in ion channels. In: Eur. J. Biophys., 2002, zv.31, s.454-466

43. GILLESPIE, D. - XU, L. - WANG, Y. a MEISSNER, G. 2005. (De)constructing the

ryanodine receptor: modeling ion permeation and selectivity of the calcium release

channel. In: J. Phys. Chem., 2005, zv.109, s.15598-15610

44. GLASSTONE, S. - LAIDLER, K.J. a EYRING, H. 1941. The theory of rate

processes. McGrow-Hill Book Company, New York, 1941

45. GOLDMAN, D.E. 1943. Potential, impedance and rectification in membranes. In: J.

Gen. Physiol., 1943, zv.27, s.37-60

46. GRUNWALD, R. a MEISSNER, G. 1995. Lumenal sites and C terminus accessibility

of the skeletal muscle calcium release channel (ryanodine receptor). In: J. Biol.

Chem., 1995, zv.270, s.11338-11347

47. HAGIWARA, S. a TAKAHASHI, K. 1974. The anomalous rectification and cation

selectivity of the membrane of a starfish egg cell. In: J. Membr. Biol., 1974, zv.18,

s.61-80

48. HAKAMATA, Y. - NAKAI, J. - TAKESHIMA, H. a IMOTO, K. 1992. Primary

structure and distribution of a novel ryanodine receptor/calcium release channel from

rabbit brain. In: FEBS, 1992, zv.312, s.229-235

49. HAYEK, S.M. - ZHU, X. - BHAT, M.B. - ZHAO, J. - TAKESHIMA, H. -

VALDIVIA, H.H. a MA, J. 2000. Characterization of a calcium-regulation domain of

the skeletal muscle ryanodine receptor. In: Biochem. J., 2000, zv.351, s.57-65

50. HILL, J.A.Jr. - CORONADO, R. a STRAUSS, H.C. 1989. Potassium channel of

cardiac sarcoplasmic reticulum is a multi-ion channel. In: Biophys. J., 1989, zv.55,

s.35-46

51. HILLE, B. 1975. Ionic selectivity, saturation and block in sodium channels, a four

barrier model. In: J.Gen.Physiol., 1975, zv.66, s.535-560

52. HILLE, B. 1992. kapitoly 1. Introduction a 13. Selective Permeability: Independence.

In: Ionic channels of excitable membranes. 2.vyd. Sinauer Associates Inc.,

Sunderland, Massachusetts, USA, 1992, s.1-20, 337-361

107

53. HILLE, B. a SCHWARZ, W. 1978. Potassium channels as multi-ion single-file pores.

In: J. Gen. Physiol., 1978, zv.72, s.409-442

54. HODGKIN, A.L. a KATZ, B. 1949. The effect of sodium ions on the electrical

activity of the giant axon of the squid. In: J. Physiol., 1949, zv.108, s.37-77

55. HODGKIN, A.L. a KEYNES, R.D. 1955. The potassium permeability of a giant

nerve fibre. In: J. Physiol. (London), 1955, zv.128, s.61-88

56. HOSOI, E. - NISHIZAKI, C. - GALLAGHER, K.L. - WYRE, H.V. - MATSUO, Y. a

SEI, Y. 2001. Expression of the ryanodine receptor isoforms in immune cells. In: J.

Immunol., 2001, zv.167, s.4887-4894

57. INUI, M. - SAITO, A. a FLEISCHER, S. 1987a. Purification of the ryanodine

receptor and identity with feet structures of junctional terminal cisternae of

sarcoplasmic reticulum of fast skeletal muscle. In: J. Biol. Chem., 1987, zv.262,

s.1740-1747

58. INUI, M. - SAITO, A. a FLEISCHER, S. 1987b. Isolation of the ryanodine receptor

from cardiac sarcoplasmic reticulum and identity with the feet structures. In: J. Biol.

Chem., 1978, zv.262, s.15637-15642

59. JEWETT, P.H. - SOMMET, J.R. a JOHNSON, E.A. 1971. Cardiac muscle. Its

ultrastructure in the finch and hummingbird with special reference to the sarcoplasmic

reticulum. In: J. Cell. Biol., 1971, zv.49, s.50-65

60. JEYAKUMAR, L.H. - COPELLO, J.A. - O’MALLEY, A.M. - WU, G.M. -

GRASSUCCI, R. - WAGENKNECHT, T. a FLEISCHER, S. 1998. Purification and

characterization of ryanodine receptor 3 from mammalian tissue. In: J. Biol. Chem.,

1998, zv.273, s.16011-16020

61. JACKSON, M.B. 2006. kapitola 14. Ion permeation and channel structure. In:

Molecular and cellular biophysics. Cambridge University Press, New York, USA,

2006, s.367-399

62. JOHNSON, E.A a SOMMER, J.R. 1967. A strand of cardiac muscle: its ultrastructure

and the electrophysiological implications of its geometry. In: J. Cell. Biol., 1967,

zv.33, s.103-129

108

63. KEIZER, J. - SMITH, G.D. - PONCE-DAWSON, S. a PEARSON, J.E. 1998.

Saltatory propagation of Ca2+

waves by Ca2+

sparks. In: Biophys. J., 1998, zv.75,

s.595-600

64. LÄUGER, P. 1973. Ion transport through pores: a rate-theory analysis. In: Biochim.

Biophys. Acta, 1973, zv.311, s.423-441

65. LEE, K.S. a TSIEN, R.W. 1984. High selectivity of calcium channels in single

ventricular heart cells of the guinea pig. In: J.Physiol., 1984, zv.354, s.253-272

66. LEMASURIER, M. - HEGINBOTHAM, L. a MILLER, C. 2001. KcsA: It’s

a potassium channel. In: J. Gen. Physiol., 2001, zv.118, s.303-313

67. LINDSAY, A.R. - MANNING, S.D. a WILLIAMS, A.J. 1991. Monovalent cation

conductance in the ryanodine receptor-channel of sheep cardiac muscle sarcoplasmic

reticulum. In: J. Physiol., 1991, zv.439, s.463-480

68. LIU, Z. a WAGENKNECHT, T. 2005. kapitola 3. Three-dimensional reconstruction

of ryanodine receptors. In: Ryanodine receptor Structure, function and dysfunction in

clinical disease. Ed. Wehrens X.H.T a Marks A.R., Springer Science+Business

Media, New York, USA, 2005, s.25-34

69. LIU, Z. - ZHANG, J. - LI, P. - CHEN, W. a WAGENKNECHT, T. 2002. Three-

dimensional reconstruction of the recombinant type 2 ryanodine receptor and

localization of its divergent region 1. In: J. Biol. Chem., 2002, zv.227, s.46712-46719

70. LIU, Z. - ZHANG, J. - WANG, R. - CHEN, S.R.W. a WAGENKNECHT, T. 2004.

Location of divergent region 2 on the three-dimensional structure of cardiac muscle

ryanodine receptor/release channel. In: J. Mol. Biol., 2004, zv.338, s.533-545

71. MUELLER, P. - RUDIN, D.O. - TIEN, H.T. a WESCOTT, W.C. 1962.

Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an

excitable system. In: Nature, 1962, zv.194, s.979-980

72. MURAYAMA, T. a OGAWA, Y. 1996. Properties of RyR3 ryanodine receptor

isoform in mammalian brain. In: J. Biol. Chem., 1996, zv.271, s.5079-5084

73. NAKAI, J. - IMAGAWA, T. - HAKAMATA, Y. - SHIGEKAWA, M. -

TAKESHIMA, H. a NUMA, S. 1990. Primary structure and functional expression

109

from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel. In: FEBS,

1990, zv.271, s.169-177

74. NEYLON, C.B. - RICHARDS, S.M. - LARSEN, M.A. - AGROTIS, A. a BOBIK, A.

1995. Multiple types of ryanodine receptor/Ca++

release channels are expressed in

vascular smooth muscle. In: J. Biol. Chem., 1995, zv.215, s.814-821

75. NONNER, W. - CATACUZZENO, L. a EISENBERG, R. 2000. Binding and

selectivity in L-type calcium channels: a mean spherical approximation. In: Biophys.

J., 2000, zv.79, s.1976-1992

76. NONNER, W. - CHEN, D.P. a EISENBERG, R. 1998. Anomalous mole fraction

effect, electrostatics and binding in ionic channels. In: Biophys. J., 1998, zv.74,

s.2327-2334

77. NONNER, W. a EISENBERG, R. 1998. Ion permeation and glutamate residues

linked by Poisson-Nernst-Planck theory in L-type calcium channels. In: Biophys. J.,

1998, zv.75, s.1287-1305

78. NOVAK, P. - GABURJAKOVA, M. a ZAHRADNIK, I. 2007. BLM Analyzer: a

software tool for experiments on planar lipid bilayers. In: Biotechniques, 2007, zv.42,

s.334-6, 338-9, 341

79. ORLOVAE. V. - SERYSHEVA I.I. - VAN HEEL, M. - HAMILTON, S.L. a CHIU,

W. 1996. Two structural configurations of the skeletal muscle calcium release

channel. In: Nature Struct. Biol., 1996, zv.3, s.547-552

80. OSMANOVIC, S.S. a SHEFNER, S.A. 1990. γ-aminobutyric acid responses in rat

locus coeruleus neurons in vitro: a current-clamp and voltage-clamp study. In: J.

Physiol., 1990, zv.421, s.151-170

81. OTSU, K. - WILLARD, H.F. - KHANNA, V.K. - ZORZATO, F. - GREEN, N.M. a

MACLENNAN, D.H. 1990. Molecular cloning of cDNA encoding the Ca++

release

channel (ryanodine receptor) of rabbit cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. In: J.

Biol. Chem., 1990, zv.265, s.13472-13483

82. OTTINI, L. - MARZIALI, G. - CONTI, A. - CHARLESWORTH, A. a

SORRENTINO, V. 1996. α and β isoforms of ryanodine receptor from chicken

110

skeletal muscle are the homologues of mammalian RyR1 and RyR3. In: Biochem. J.,

1996, zv.315, s. 207-216

83. OVERHOLT, J.L. - HOBERT, M.E. a HARVEY, R.D. 1993. On the mechanism of

rectification of the isoproterenol-activated chloride current in guinea-pig ventricular

myocytes. In: J. Gen. Physiol., 1993, zv.102, s.871-895

84. PESSAH, I.N. - WATERHOUSE, A.L. a CASIDA, J.E. 1985. The calcium-ryanodine

receptor complex of skeletal and cardiac muscle. In: Biochem. Biophys. Res. Comm.,

1985, zv.128, s.449-456

85. PORTER, K.R. a PALADE, G.E. 1957. Studies on the endoplasmic reticulum. III. Its

form and distribution in striated muscle cells. In: J. Biophys. Biochem. Cytol., 1957,

zv.3, s.269-300

86. PROTASI, F. - SUN, X.H. a FRANZINI-ARMSTRONG, C. 1996. Formation and

maturation of the calcium release apparatus in developing and adult avian

myocardium. In: Dev. Biol., 1996, zv.173, s.265-278

87. PROTASI, F. - TAKEKURA, H. - WANG, Y.M. - CHEN, S.R.W. - MEISSNER, G.

- ALLEN, P.D. a FRANZINI-ARMSTRONG, C. 2000. RyR1 and RyR3 have

different roles in the assembly of calcium release units of skeletal muscle. In:

Biophys. J., 2000, zv.79, s.2494-2508

88. RADERMACHER, M. - RAO, V. - GRASSUCCI, R. - FRANK, J. - TIMERMAN,

A.P. - FLEISCHER, S. a WAGENKNECHT, T. 1994. Cryo-electron microscopy and

three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor

from skeletal muscle. In: J. Cell. Biol., 1994, zv.127, s.411-423

89. RÍOS, E. a BRUM, G. 1987. Involvement of dihydropyridine receptor in excitation-

contraction coupling in skeletal muscle. In: Nature, 1987, zv.325, s.717-720

90. RODRIGUEZ-CONTRERAS, A. - NONNER, W. a YAMOAH, E.N. 2002. Ca2+

transport properties and determinants of anomalous mole fraction effects of single

voltage-gated Ca2+

channels in hair cells from bullfrog saccule. In: J. Physiol., 2002,

zv.538, s.729-745

91. ROSSI, D. a SORRENTINO, V. 2002. Molecular genetics of ryanodine receptors

Ca2+

-release channels. In: Cell Calcium, 2002, zv.32, s.307-319

111

92. SAITO, A. - INUI, M. - RADERMACHER, M. - FRANK, J. a FLEISCHER, S.

1988. Ultrastructre of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum. In: J.

Cell. Biol., 1988, zv.107, s.211-219

93. SANDOW, A. 1952. Excitation-contraction coupling in muscular response. In: Yale

J. Biol. Med., 1952, zv.25, s.176-201

94. SERYSHEVA, I.I. - HAMILTON, S.L. - CHIU, W. a LUDTKE, S.J. 2005. Structure

of Ca2+

release channel at 14 Å resolution. In: J. Mol. Biol., 2005, zv.345, s.427-431

95. SERYSHEVA, I.I. - ORLOVA, E.V. - CHIU, W. - SHERMAN, M.B. - HAMILTON,

S.L. a HEEL, M.V. 1995. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to

visualize the skeletal muscle calcium release channel. In: J. Struct. Biol., 1995, zv.2,

s.18-24

96. SERYSHEVA, I.I. - SCHATZ, M. - VAN HEEL, M. - CHIU, W. a HAMILTON,

S.L. 1999. Structure of the skeletal muscle calcium release channel activated with

Ca2+

and AMP-PCP. In: Biophys. J., 1999, zv.77, s.1936-1944

97. SESTI, F. - EISMANN, E. - KAUPP, U.B. - NIZZARI, M. a TORRE, V. 1995. The

multi-ion nature of the cGMP-gated channel from vertebrate rods. In: J. Physiol.,

1995, zv.487, s.17-36

98. SHARMA, M.R. - JEYAKUMAR, L.H. - FLEISCHER, S. a WAGENKNECHT, T.

2000. Three-dimensional structure of ryanodine receptor isoform three in two

conformational states as visualized by cryo-electron microscopy. In: J. Biol. Chem.,

2000, zv.275, s.9485-9491

99. SHARMA, M.R. - PENZCEK, P. - GRASUCCI, R. - XIN, H.B. - FLEISCHER, S.

a WAGENKNECHT, T. 1998. Cryoelectron microscopy and image analysis of the

cardiac ryanodine receptor. In: J. Biol. Chem., 1998, zv.273, s.18429-18434

100. SMITH, J.S. - IMAGAWA, T. - MA, J. - FILL, M. - CAMPBELL, K.P.

a CORONADO, R. 1988. Purfied ryanodine receptor from rabbit skeletal muscle is

the calcium-release channel of sarcoplasmic reticulum. In: J. Gen. Physiol., 1988,

zv.92, s.1-26

101. SMITH, J.S. - MCKENNA, E.J. - MA, J.J. - VILVEN, J. - VAQHY, P.L. -

SCHWARTZ, A. a CORONADO, R. 1987. Calcium channel activity in a purified

112

dihydropyridine-receptor preparation of skeletal muscle. In: Biochemistry, 1987,

zv.26, s.7182-7188

102. SORRENTINO, V. a VOLPE, P. 1993. Ryanodine receptors: how many, where and

why? In: Trends Pharmacol. Sci., 1993, zv.14, s.98-103

103. SUN, X.H. - PROTASI, F. - TAKAHASHI, M. - TAKESHIMA, H. - FERGUSON,

D.G. a FRANZINI-ARMSTRONG, C. 1995. Molecular architecture of membranes

involved in excitation-contraction coupling of cardiac muscle. In: J. Cell. Biol., 1995,

zv.129, s.659-671

104. TAKESHIMA, H. - NISHIMURA, S. - MATSUMOTO, T. - ISHIDA, H. -

KANGAWA, K. - MINAMINO, M. - MATSUO, H. - UEDA, M. - HANAOKA, M. -

HIROSE, T. a NUMA, S. 1989. Primary structure and expression from

complementary DNA of skeletal muscle ryanodine receptor. In: Nature, 1989, zv.339,

s.439-445

105. THE AXON GUIDE 1993. kapitola 3. Instrumentation for measuring bioelectric

signals from cells. In: The Axon Guide for Electrophysiology and Biophysics

Laboratory Techniques. Ed. Sherman-Gold R., Axon Instruments, Inc., USA, 1993,

s.25-37

106. TINKER, A. - LINDSAY, A.R.G. a WILLIAMS, A.J. 1992a. Block of the sheep

cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+

-release channel by tetra-alkyl ammonium

cations. In: J. Membr. Biol., 1992, zv.127, s.149-159

107. TINKER, A. - LINDSAY, A.R.G. a WILLIAMS, A.J. 1992b. A model for ionic

conduction in the ryanodine receptor channel of sheep cardiac muscle sarcoplasmic

reticulum. In: J. Gen. Physiol., 1992, zv.100, s.495-517

108. TINKER, A. a WILLIAMS, A.J. 1992. Divalent cation conduction in the ryanodine

receptor channel of sheep cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. In: J. Gen. Physiol.,

1992, zv.100, s.479-493

109. TINKER, A. a WILLIAMS, A.J. 1993. Probing the structure of the conduction

pathway of the sheep cardiac sarcoplasmic reticulum calcium-release channel with

permeant and impermeant organic cations. In: J. Gen. Physiol., 1993, zv.102, s.1107-

1129

113

110. TINKER, A. a WILLIAMS, A.J. 1995. Measuring the length of the pore of the sheep

cardiac sarcoplasmic reticulum calcium-release channel using related

trimethylammonium ions as molecular calipers. In: Biophys. J., 1995, zv.68, s.111-

120

111. TOMASKOVA, Z. - GABURJAKOVA, J. - BREZOVA, A. a GABURJAKOVA, M.

2007. Inhibition of anion channels derived from mitochondrial membranes of the rat

heart by stilbene disulfonate – DIDS. In: J. Bioenerg. Biomembr., 2007, zv.39, s.301-

311

112. TSIEN, R.W. - HESS, P. - MCCLESKEY, E.W. a ROSENBERG, R.L. 1987.

Calcium channels: mechanisms of selectivity, permeation and block. In: Annu. Rev.

Biophys. Biophys. Chem., 1987, zv.16, s.265-290

113. TUNWELL, R.E.A. - WICKENDEN, C. - BERTRAND, B.M.A. - SHEVCHENKO,

V.I. - WALSH, M.B. - ALLEN, P.D. a LAI, F.A. 1996. The human cardiac muscle

ryanodine receptor-calcium release channel: identification, primary structure and

topological analysis. In: Biochem. J., 1996, zv.318, s.477-487

114. WAGENKNECHT, T. - HSIEH, C.E. - RATH, B.K. - FLEISCHER, S. a MARKO,

M. 2002. Electron tomography of frozen-hydrated isolated triad junctions. In:

Biophys. J., 2002, zv.83, s.2491-2501

115. WAGENKNECHT, T. - RADERMACHER, M. - GRASSUCCI, R. - BERKOWITZ,

J. - XIN, H.B. a FLEISCHER, S. 1997. Locations of calmodulin and FK506-binding

protein on the three-dimensional architecture of the skeletal muscle ryanodine

receptor. In: J. Biol. Chem., 1997, zv.272, s.32463-32471

116. WAGENKNECHT, T. a SAMSO, M. 2002. Three-dimensional reconstruction of

ryanodine receptors. In: Front. Biocsi., 2002, zv.7, s.d1464-d1474

117. WANG, Y. - XU, L. - PASEK, D.A. - GILLESPIE, D. a MEISSNER, G. 2005.

Probing the role of negatively charged amino acid residues in ion permeation of

skeletal muscle ryanodine receptor. In: Biophys. J., 2005, zv.89, s.256-265

118. WELCH, W. - RHEAULT, S. - WEST, D.J. a WILLIAMS, A.J. 2004. A model of the

putative pore region of the cardiac ryanodine receptor channel. In: Biophys. J., 2004,

zv.87, s.2335-2351

114

119. WILLIAMS, A.J. 1992. Ionic conduction and discrimination in the sarcoplasmic

reticulum ryanodine receptor/calcium release channel. In: J. Muscle Res. Cell Motil.,

1992, zv.13, s.7-26

120. WILLIAMS, A.J. - WEST, D.J., a SITSAPESAN, R. 2001. Light at the end of the

Ca2+

-release channel tunnel: structures and mechanisms involved in ion translocation

in ryanodine receptor channels. In: Q. Rev. Biophys., 2001, zv.34, s.61-104

121. WOODHULL, A.M. 1973. Ionic blockage of sodium channels in nerve. In: J. Gen.

Physiol., 1973, zv.61, s.687-708

122. XU, L. - WANG, Y. - GILLESPIE, D. a MEISSNER, G. 2006. Two rings of negative

charge in the cytosolic vestibule of type-1 ryanodine receptor modulate ion fluxes. In:

Biophys. J., 2006, zv.90, s.443-453

123. YIN, C.C. - HAN, H. - WEI, R. a LAI, A. 2005. Two-dimensional crystallization of

the ryanodine receptor Ca2+ release channel on lipid membranes. In: J. Struct. Biol.,

2005, zv.149, s.219-224

124. YIN, C.C. a LAI, F.A. 2000. Intrinsic lattice formation by the ryanodine receptor

calcium-release channel. In: Nature Cell. Biol., 2000, zv.2, s.669-671

125. YUE, D.T. a MARBAN, E. 1990. Permeation in the dihydropyridine-sensitive

calcium channel. Multi-ion occupancy but no anomalous mole-fraction effect between

Ba2+

and Ca2+

. In: J. Gen. Physiol., 1990, zv.95, s.911-939

126. ZHANG, J. - LIU, Z. - MASUMIYA, H. - WANG, R. - JIANG, D. - LI, F. -

WAGENKNECHT, T. a CHEN, S.R.W. 2003. Three-dimensional localization of

divergent region 3 of the ryanodine receptor to the clamp-shaped structures adjacent

to the FKBP binding sites. In: J. Biol. Chem., 2003, zv.278, s.14211-14218

127. ZHAO, M. - LI, P. - LI, X. - ZHANG, L. - WINKFEIN, R.J. a CHEN, S.R.W. 1999.

Molecular identification of the ryanodine receptor pore-forming segment. In: J. Biol.

Chem., 1999, zv.274, s.25971-25974

128. ZORZATO, F. - FUJII, J. - OTSU, K. - PHILIPS, M. - GREEN, N.M. - LAI, F.A. a

MEISSNER, G. 1990. Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms

of the Ca2+

release channel (ryanodine receptor) of skeletal muscle sarcoplasmic

reticulum. In: J.Biol.Chem., 1990, zv.265, s.2244-2256

115

129. ZWOLINSKI, B.I. - EYRING, H. a REESE, C.E. 1949. Diffusion and membrane

permeability. In: J. Phys. Colloid. Chem., 1949, zv.53, s.1426-1453

116

Zhrnutie

Ryanodínový receptor (RyR) je vnútrobunkový iónový kanál. Je súčasťou

mechanizmu spriahnutia excitácie s kontrakciou svalovej bunky. Jeho úlohou je uvoľnenie

Ca2+

iónov z lumenu sarkoplazmatického retikula. Mechanizmus, akým ióny prechádzajú

cez vodivý pór RyR kanálu je však stále nejasný. Vo všeobecnosti poznáme len dva

spôsoby transportu iónov a podľa toho sa kanály rozdeľujú na jedno-iónové a viac-iónové.

Tento názov sa odvodil od toho, koľko iónov je kanál schopný prijať naraz vo svojom

selektívnom filtri. V súčasnosti existujú dva modely permeácie iónov cez RyR kanál –

bariérový model a PNP/DFT model. Každý z týchto modelov je založený na inej fyzikálnej

predstave. Bariérový model doteraz zaraďoval RyR kanál medzi jedno-iónové kanály,

naproti tomu PNP/DFT model ho radí medzi viac-iónové.

Cieľom tejto práce bolo systematické skúmanie vodivostných vlastností RyR

kanálov zo srdca potkana (RyR2). Kanály boli zabudované do umelej lipidovej dvojvrstvy

a merali sme prúd cez individuálne RyR2 kanály v rôznych experimentálnych

podmienkach. Typy experimentov boli navrhnuté na základe existujúcich modelov

a príslušných teórií. Zamerali sme sa na dva typy experimentov – hľadanie anomálie

(AMFE javu) a meranie reverzného potenciálu (Erev) v bi-ionických podmienkach. V

bariérovej teórii sa využívajú tieto typy experimentov na zistenie obsadenosti selektívneho

filtra iónového kanálu, teda na rozlíšenie medzi jedno-iónovým a viac-iónovým

mechanizmom permeácie. Pre AMFE experimenty sme si zvolili koncentrácie iónov blízke

Kd koncentračnej závislosti prúdu Ca2+

resp. Li+ iónov. V literatúre sa doposiaľ stretneme

len s experimentami pri takých koncentráciách, kedy je prúd cez RyR2 kanál nasýtený

(Tinker a Williams, 1992). V prvej časti sme testovali prítomnosť anomálií (AMFE)

vodivosti, Erev a amplitúdy prúdu pri nulovom napätí v závislosti od relatívneho zastúpenia

iónov v zmesi dvoch vybraných iónov. Otestovali sme spolu 9 rôznych zmesí. Použili sme

viaceré zmesi dvoch dvojmocných iónov, jednomocného a dvojmocného iónu a dvoch

jednomocných iónov. V dvoch z týchto zmesí (Cs+-Na

+; Li

+-Ca

2+ pomer cis/trans=1) sme

ukázali anomáliu (minimum) vodivosti. V druhej časti sme merali koncentračnú závislosť

Erev v bi-ionických podmienkach pri konštantnom pomere koncentrácií iónov cez

117

membránu. Koncentrácie Ca2+

iónov na luminálnej strane ([Ca2+

]trans) kanálu boli v rozsahu

od Kd koncentračnej závislosti prúdu Ca2+

a vyššie. Použili sme tri rôzne pomery: 1, 5 a 12.

Pri všetkých troch pomeroch sme zistili štatisticky významné zmeny hodnôt Erev, pričom

najvýraznejšie boli zmeny pri najväčšom pomere – 12. Pri tomto pomere sa

v koncentračnej závislosti Erev vyskytuje zreteľné minimum potenciálu, a to pri

koncentrácii [Ca2+

]trans, zodpovedajúcej Kd koncentračnej závislosti prúdu Ca2+

iónov.

Prítomnosť anomálie vodivosti a koncentračná závislosť Erev v bi-ionických

podmienkach pri konštantnom pomere koncentrácií, podľa bariérovej teórie, odráža viac-

iónový charakter RyR2 kanálu. Naviac, ako druhí sme experimentálne potvrdili prítomnosť

anomálie vodivosti v zmesi jednomocných iónov (Cs+-Na

+), ktorá bola predpovedaná

PNP/DFT modelom RyR2 kanálu. Prispeli sme tak k nezávislému overeniu PNP/DFT

modelu RyR2 kanálu. Tento model vypočítal, že selektívny filter RyR2 kanálu môže

obsahovať viac iónov súčasne. V súhrne, naše výsledky podporujú hypotézu viac-iónového

charakteru RyR2 kanálu. Môžu tiež prispieť k vylepšeniu už existujúceho matematického

PNP/DFT modelu RyR2 kanálu. A naopak, tento matematický model pravdepodobne bude

môcť objasniť zistený priebeh koncentračnej závislosti Erev.

dp tomaskova z

Documents

terminlnych cisterien sr

pohadu barirovho modelu

oznauje zatvoren hladinu

je elektrostatick pole

je absoltna teplota

mitochondrilnych aninovch kanlov

zznam prdu zskan

je boltzmannova kontanta