双视角光片荧光显微镜的介绍李玥
倒 置 光 片 荧 光 显 微 镜 ( inverted Selective Plane Illumination
Microscopy,iSPIM)作为倒置排列装置的一种,最初由美国国立卫生研究院
(National Institutes of Health,NIH)的 Shroff实验室最先提出,该显微
镜在普通的倒置显微镜上改装而成,生物样本不需要经过特殊的处理,便可以
直接加载在普通的载玻片上。而后该装置又进一步发展为双视角倒置光片荧光
显微镜(dual-view inverted Selective Plane Illumination Microscopy,
diSPIM)。diSPIM 主要通过两只物镜交替地激发荧光和成像采集,在样品固
定的情况下,实现了双视角成像,并且对两个视角的图像进行融合,重建出一
幅空间分辨率各向均匀的图像。下面简单介绍其总体装置、激发光路和数据采
集过程。一、 总体装置
diSPIM系统的整体装置如图 1所示,是以倒置的荧光显微镜为基座改装而
成。系统采用两个 NA均为 0.8的水浸物镜(分别对应于 A视角和 B视角),
两个物镜相互垂直并且与水平平面成 45°夹角。两个物镜分别和机械臂相连,
整个机械臂挂载在 z升降平台上。激发光从后端进入机械臂并经双色镜反射,
经过物镜之后激发样品,激发的荧光被另一只物镜采集并成像到该侧的
sCMOS相机上。整个机械臂可以通过升降平台精密移动,以调节物镜和样品
的距离。底端的倒置显微镜,可以对样品的初步观察,方便样品准备和仪器操
作。
图 1 diSPIM整体装置图
二、 激发光路该系统通过扫描高斯激光光束产生扫描式的光片,整个激发光路如图 2所
示。488 nm 和 561 nm 的光束通过双色镜相汇合,通过声光调制器
(AOTF)之后分别通过透镜对组成的 4f系统(L1和 L2,L3和 L4,L5/L6和
OBJ A/OBJ B)。扫描振镜GALVO1和物平面共轭,通过扫描光束,可以使光
束绕物平面旋转,以消除条纹影响。扫描振镜 GALVO2和物镜的后焦面共轭,
通过扫描光束,可以生成虚拟的光片。扫描振镜 GALVO3同样和物镜后焦面共
轭,但是其扫描作用使光片沿成像物镜的光轴平移,从而实现三维体积的荧光
激发和成像。
图 2 diSPIM的激发光路图三、 数据采集在一个数据采集周期内(图 3),假定先用 A视角进行成像,则此时 B视
角将产生光片,激发荧光被 A视角物镜采集。采集完一个平面后,光片沿着 A
视角光轴移动一个脚步(一层切片的厚度);同时 OBJA也有压电陶瓷控制,
同步移动,保证光片始终在 OBJA的焦平面上。在 A视角采集完一个 3D数据
之后,切换成 A视角激发荧光,B视角采集数据,同样采集完一个 3D数据。
如此完成了双视角的一次采集。对两个 3D数据进行配准和联合去卷积之后,
就可以得到 diSPIM 各向分辨率均匀的图像。
图 3 双视角采集流程
四、 非对称双视角倒置光片荧光显微系统diSPIM显微镜由于样品准备简单,并且不需旋转样品就可以获得空间各向
均匀的分辨率,开始在活体生物样品的长时间三维成像中获得越来越广泛的应
用。然而该系统采用相同数值孔径(NA)的两个物镜,难以使用更大的数值孔
径,限制了两个视角横向分辨率的进一步提高。因而采用非对称设计的双视角
光片荧光显微系统,以进一步提高显微镜的横向分辨率。根据阿贝准则,光学显微镜的分辨率定义为用显微镜可以分辨出来的两个
同等亮度的点光源之间的最小距离,而此分辨率的极限是由光的衍射特性所决
定的.无论是宽场显微镜还是共聚焦显微镜,其在阿贝准则下的横向分辨率极
限与光波的波长 及物镜的数值孔径 有如下关系:
(1)
这也成为显微镜分辨率的衍射极限,是理想状态下显微镜所能达到的最大
分辨能力。虽然 diSPIM通过联合去卷积之后的图像可以达到各向同性的分辨率,但
是由于其两个视角采用相同的配置,同时由于两个视角光轴的遵循 90°夹角,
加上物镜的外壳带来的限制,目前能用上的水浸物镜的最大 NA只能达到
0.8。这也意味着其横向极限分辨率只能达到 313nm(对于 =500nm)。而
如果采用不对称的两个视角,通过稍微牺牲一只物镜的 NA来提高另一只物镜
的 NA,这样至少会在大 NA 的视角上获得更高的横向分辨率。例如采用
1.1NA物镜和 0.7NA物镜的组合。这样对于 1.1NA的物镜,其横向分辨率极
限可以达到 227nm,而对于 0.7NA物镜的横向分辨率则降低到了 357nm。这样的非对称物镜组合,在应用到倒置显微镜中时,由于两个物镜的张角
不一样,则不能像原来的装置一样与水平面 45°角摆放,而必须倾斜摆放,才
可以避免 1.1NA的物镜碰触载玻片,如图 4所示。这导致物镜的整个机械臂一
起倾置,如图 5所示。由于系统架构的非对称性,这种系统称为非对称双视角
倒置光片荧光显微镜(asymmetrical dual-view inverted Selective Plane
Illumination Microscopy, adiSPIM)。
图 4 不同物镜组合的位置摆放
图 5 机械结构的倾置
通过实验证明,由于采用非对称的、数值孔径高低搭配的物镜组合,与
diSPIM系统相比(各向均匀的分辨率:0.33 μm),adiSPIM以牺牲少量轴
向分辨率的代价,将横向分辨率提高到了 0.26 μm。