Maša Petko
VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH
SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA
Diplomska naloga
Maribor, september 2015
2
VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH
SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA
Diplomska naloga univerzitetnega študijskega programa
Študent: Maša Petko
Študijski program: univerzitetni študijski program Kemijska tehnologija
Smer: biokemijska tehnika
Predvideni strokovni naslov: uni. dipl. inž. kem. tehn.
Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb
Somentor: doc. dr. Mateja Primožič
Maribor, september 2015
3
4
IZJAVA
S temi besedami izjavljam, da sem diplomo izdelala sama in da so sposojeni prispevki
primerno označeni.
Maribor, september 2015 Maša Petko
5
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Maji Leitgeb
in somentorici doc. dr. Mateji Primožič, za nasvete in
pomoč pri izdelavi diplomskega dela. Zahvala gre tudi
mladi raziskovalki Gordani Hojnik Podrepšek in vsem
strokovnim sodelavcem Laboratorija za separacijske
procese in produktno tehniko za nesebično pomoč pri
izvedbi eksperimentalnega dela.
Zahvalila bi se rada babici, dedku in partnerju za vse
spodbudne besede in pomoč med šolanjem. Diploma je
posvečena staršema, katera sta mi omogočila študij in
mi z vso ljubeznijo in potrpljenjem stala ob strani.
Najlepša hvala vsem!
6
VPLIV PARAMETROV NA SINTEZO ZAMREŽENIH ENCIMSKIH
SKUPKOV (CLEAs) IZ ENCIMA CELULAZA
POVZETEK
V diplomskem delu je opisana sinteza encimskih skupkov ali agregatov iz encima celulaza,
katere na kratko imenujemo CLEAs (Crosslinked enzyme aggregates). Zamrežene encimske
skupke smo pripravili po že znanem postopku, ki je sestavljen iz dveh ključnih delov. Prvi del
predstavlja oboritev encima s pomočjo obarjalnega reagenta, ki je lahko organsko topilo ali
raztopina anorganske soli. Temu sledi zamreženje oborjenega encima s pomočjo
zamrežitvenega reagenta. Glutaraldehid je organska molekula in se najpogosteje uporablja kot
zamrežitveni reagent, predvsem zaradi enostavne uporabe in relativno nizke nabavne cene. Pri
sintezi CLEAs smo optimirali parametre z namenom izboljšanja relativne aktivnosti
encimskih agregatov. V fazi obarjanja smo ugotavljali, kateri so tisti obarjalni reagenti, ki
nam ne povzročijo ireverzibilne denaturacije, saj s tem deaktiviramo encim in izgubimo
nativno aktivnost encima. Na koncu smo določili tudi stabilnost sintetizirane CLEAs, s
poskusi ponovne uporabe imobiliziranega encima.
Z eksperimentalnim delom smo uspešno sintetizirali zamrežene encimske skupke iz encima
celulaze. Sintezo smo izvajali pri sobni temperaturi z uporabo pufra PBS (20 mM in pH = 7),
s koncentracijo albumina γalbumin = 17 mg/mL in z Vrazt. celulaze = 100 µL. Za obarjanje smo
uporabili 90 % delež topil, ki smo mu smo dodali 10 % delež encima celulaze. Uporabljeni
obarjalni reagenti so: metanol, etanol, propanol, 2-propanol, aceton, amonijev sulfat,
tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid, polietilen glikol (PEG 1500, 6000, 20000), kloroform, n-
heptan, heksan, dimetileter, butanol, acetonitril in dekanol. V stopnji zamreženja smo
uporabili tiste obarjalne reagente, kjer je bilo obarjanje uspešno. Zamreženje je potekalo
3 ure. Ugotovili smo, da je bila najvišja aktivnost CLEAs pri uporabi obarjalnega reagenta
etanola in pri koncentraciji glutaraldehida ϕ = 0,0625 %. Končni produkt sinteze CLEAs je
bila motna suspenzija, kjer je bila povprečna velikost agregatov 43 µm. Kljub visoki
aktivnosti smo ugotovili, da CLEAs ni stabilna, saj dobimo razpolovno dobo encima že po 2.
ciklu. V začetni fazi raziskave smo sintetizirali CLEAs s sicer nižjo aktivnostjo, vendar so bili
dobljeni agregati stabilnejši. S tem smo ovrgli trditev, da je aktivnejša CLEAs tudi stabilnejša.
Ključne besede: zamreženi encimski skupki, CLEAs, celulaza, mrežni povezovalec,
7
glutaraldehid, obarjalni reagenti.
UDK: 577.151.5(043.2)
INFLUENCE OF PARAMETRS ON SYNTHESIS OF CROSS-LINKED AGGREGATES
(CLEAs) OF CELLULASE
ABSTRACT
In this work we described the synthesis of cross-linked aggregates of enzyme cellulase;
shortly CLEAs. We prepared cross-linked aggregates within two major steps: precipitation
and cross-linking. The first step is precipitation. As precipitating reagents we can use organic
solvents or solutions of an inorganic salts. The second step is cross-linking with cross-linking
reagent, which is usually glutaraldehyde. Glutaraldehyde is an organic molecule that is easy to
work with and it is relatively cheap. We changed parameters in synthesis of cross-linked
enzyme aggregates in the way of getting better results; higher activity of cross-linked enzyme
aggregates. In precipitation phase, we needed to find precipitating reagents, which didn't
cause irreversible reaction. The aim of this work is to find out how stable is synthesized
CLEAs, because stability is one of the most important advantage of immobilized enzyme.
We successfully synthesized CLEAs with enzyme cellulase. The parameters of synthesis
were: room temperature, albumin concentration γ=17 mg/mL, volume of enzyme solutio V=
100 µL and PBS buffer (20 mM, pH=7). As precipitating reagents we used many solvents and
in the phase of cross-linking we used those reagents with successfully precipitation. Cross-
linking of enzyme took 3 hours. We synthesized CLEAs with the highest activity with ethanol
as solvent and gluteraldehyde concentration ϕ= 0,0625 %. As result we got cloudy suspension
with 43 µm of average size of the aggregates. Despite high activity we showed that CLEAs
wasn't stable, because we got enzyme half-life after second cycle. During our research we
proved that CLEAs with the highest activity isn't necessary also the most stable, because we
synthesized CLEAs with lower activity and it was more stable than CLEAs with the highest
activity
Keywords: cross-linked aggregates, CLEAs, cellulase, cross-linking reagent, glutaraldehyde,
precipitating reagents.
UDK: 577.151.5(043.2)
8
KAZALO
1. UVOD ............................................................................................................................... 15
2. TEORETIČNI DEL........................................................................................................... 16
2.1. IMOBILIZACIJA ...................................................................................................... 16
2.2. METODE IMOBILIZACIJE ..................................................................................... 17
2.2.1. ADSORPCIJA .................................................................................................... 17
2.2.2. UJETJE ............................................................................................................... 18
2.2.3. INKAPSULACIJA ............................................................................................. 18
2.2.4. KOVALENTNA VEZAVA ............................................................................... 19
2.2.4.1. Metode imobilizacije z nosilcem................................................................. 19
2.2.4.2. Metode imobilizacije brez nosilca............................................................... 20
2.3. ENCIMI ..................................................................................................................... 23
2.4. CELULOZA .............................................................................................................. 26
2.5. CELULAZE ............................................................................................................... 27
2.6. MREŽNI POVEZOVALEC – GLUTARALDEHID ................................................ 28
2.7. OBARJANJE IN OBARJALNI AGENSI .................................................................. 31
3. REAGENTI IN METODE ................................................................................................ 35
4. EKSPERIMENTALNE METODE ................................................................................... 37
4.1. PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST ......................................... 37
4.2. PRIPRAVA PROSTEGA ENCIMA IN SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH
SKUPKOV (CLEAs) ............................................................................................................ 39
4.3. DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE .............................................. 41
4.4. DOLOČANJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI KATALIZATORJA .......................... 43
4.5. STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA ..................................................... 46
5. REZULTATI ........................................................................................................................ 47
5.1. VPLIV PUFRA NA AKTIVNOST ENCIMA CELULAZE ...................................... 47
5.2. UPORABA RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV ....................................... 48
9
5.3. DOLOČANJE AKTIVNOSTI RESUSPENDIRANEGA ENCIMA PO OBARJANJU . 50
5.4. SINTEZA CLEAs Z UPORABO RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV ...... 51
5.4.1. Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in
aktivnost zamreženih encimskih skupkov ......................................................................... 51
5.4.2. Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih
encimskih skupkov ............................................................................................................ 52
5.4.3. Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost ob
uporabi različnih obarjalnih reagentov .............................................................................. 54
5.4.4. Opazovanje in primerjanje velikosti CLEAs z uporabo različnih obarjalnih
reagentov pod optičnim mikroskopom .............................................................................. 55
5.5. VPLIV KONCENTRACIJE MREŽNEGA POVEZOVALCA (GA) ........................ 59
5.5.1. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
metanola ............................................................................................................................ 59
5.5.2. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
etanola ............................................................................................................................... 60
5.5.3. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
propanola ........................................................................................................................... 61
5.5.4. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalenga reagenta
amonijevega sulfata ........................................................................................................... 62
5.6. STABILNOST CLEAs Z NAJVIŠJO AKTIVNOSTJO ........................................... 63
6. ZAKLJUČKI ..................................................................................................................... 64
7. PRILOGE .......................................................................................................................... 65
UMERITVENA KRIVULJA – BRADFORD .................................................................. 65
TABELE Z REZULTATI ................................................................................................. 66
8. LITERATURA .................................................................................................................. 71
10
KAZALO SLIK
Slika 1: Vrste imobilizacije ...................................................................................................... 17
Slika 2: a) Ujetje v matriksu, b) Ujetje v mikrokapsulah ......................................................... 18
Slika 3: Shematski prikaz inkapsulacije ................................................................................... 19
Slika 4: Imobilizacija encima brez nosilca ............................................................................... 20
Slika 5: Sinteza CLEAs ............................................................................................................ 22
Slika 6: Potek encimskih reakcij .............................................................................................. 23
Slika 7: Encimska hidroliza celuloze........................................................................................ 26
Slika 8: Povezava dveh molekul celuloze s prečnimi vodikovimi vezmi ................................ 27
Slika 9: Shematski prikaz celulaze ........................................................................................... 28
Slika 10: Sinteza GA ................................................................................................................ 29
Slika 11: Oblike GA v vodni raztopini ..................................................................................... 29
Slika 12: Potek obarjanja .......................................................................................................... 32
Slika 13: CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom, spiranja in pufer PBS ............................ 40
Slika 14: Prikaz obarvanosti spiranj z Bradfordovim reagentom. Od leve proti desni si sledijo
slepi vzorec (PBS), supernatant in spiranja. ............................................................................. 42
Slika 15: Hidroliza celuloze ..................................................................................................... 43
Slika 16: Slika stresalnika......................................................................................................... 44
Slika 17: Vpliv pufra na aktivnost prostega encima ................................................................. 47
Slika 18: Prikaz pozitivnih reakcij obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti ...................... 48
Slika 19: Prikaz reakcij obarjanja, kjer celulaza v stiku z obarjalnim reagentom ni tvorila
oborine. ..................................................................................................................................... 49
Slika 20: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju ..................................................... 50
Slika 21: Prikaz produkta sinteze CLEAs ob uporabi različnih obarjalnih reagentov ............. 51
Slika 22: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z uporabo različnih
obarjalnih reagentov ................................................................................................................. 52
11
Slika 23: Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo CLEAs ob uporabi
različnih obarjalnih reagentov .................................................................................................. 53
Slika 24: Vpliv večkratne uporabe CLEAs na preostalo aktivnost ob uporabi različnih
obarjalnih reagentov ................................................................................................................. 54
Slika 25: CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata, kjer smo dobili velik in
sprijet agregat. .......................................................................................................................... 58
Slika 26: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z obarjalnim reagentom
metanolom v odvisnosti od koncentracije GA ......................................................................... 59
Slika 27: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
etanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ........................................................... 60
Slika 28: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
propanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ....................................................... 61
Slika 29: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
amonijevim sulfatom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida ........................................ 62
Slika 30: Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnostjo ................................................................... 63
12
KAZALO TABEL
Tabela 1: Razdelitev encimov v skupine glede na tip reakcije: ............................................... 25
Tabela 2: Fizikalne lastnosti glutaraldehida ............................................................................. 30
Tabela 3: Uspešnost obarjalnih reakcij ..................................................................................... 49
Tabela 4: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju .................................................... 50
Tabela 5: Razpolovna doba CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov ....................... 55
Tabela 6: CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov, gledana pod optičnim
mikroskopom ............................................................................................................................ 56
Tabela 7: Povprečna velikost delcev CLEAs pri uporabi različnih obarjalnih reagentov........ 57
13
UPORABLJENE KRATICE
KRATICA
CLEs zamreženi raztopljeni encim
CLEAs zamreženi encimski skupki
CLECs zamreženi encimski kristali
CSDEs zamreženi posušeni encim
PEG polietilenglikol
DMSO dimetil sulfoksid
PBS fosfatni pufer
HCl klorovodikova kislina
NaOH natrijev hidroksid
(NH4)2SO4 amonijeva sol/amonijev sulfat
MC mikrocentrifugirka
(C6H10O5)n celuloza
C6H12O6 glukoza
CH2(CH2CHO)2 glutaraldehid (GA)
Na2H2PO4* H2O natrijev dihidrogenfosfat monohidrat
CH3COONa natrijev acetat
C6H8O7 citratna kislina
PEHA
U/mL
ADP
ATP
β-NAD
β-NADH
G-6PDH
G-PH
pentaetilen heksamin
enote/mL encima
adenozin 5 -difosfat
adenozin 5 -trifosfat
β-nikotinamid adenin dinukleotid, oks. oblika
β-nikotinamid adenin dinukleotid, red. oblika
glokoza-6-fosfat dehidrogenaza
6-fosfo-D-glukonat
14
UPORABLJENI SIMBOLI
SIMBOL ENOTA
T temperatura ˚C
γ masna koncentracija mg/mL
t čas min, h
M molska masa g/mol
m masa mg, g
V volumen mL
IU aktivnost encima µmol/min
Φ prostorninski delež % (v/v)
pH pH raztopine /
c množinska koncentracija mmol/L, mol/L
Λ
λ
absorbanca
valovna dolžina
nm
nm
n hitrost stresanja rpm
ρ
df
gostota
faktor redčenja
g/mL
/
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
15
UVOD
Pri biokatalizi uporabljamo katalizatorje, s katerimi povzročimo kemijske pretvorbe v
organskih spojinah. Pri tem lahko uporabljamo encime, ki so izolirani iz celic, ali pa
uporabimo celico, ki vsebuje encim. V preteklosti so biokatalizatorje uporabljali v
prehrambeni industriji (sir, pivo, vino, kis, kvas), v zadnjem času pa se vedno bolj uporabljajo
tudi v kemični in farmacevtski industriji. Prednost biokatalizatorjev je neškodljivost okolju in
delovanje pri nižjih temperaturah. Na aktivnost encima vplivajo: temperatura, količina
substrata, inhibitorji in pH okolja, kjer reakcija poteka.1
Encimi so beljakovinske molekule, ki katalizirajo reakcije v živih celicah. Brez encimov bi
večina biokemijskih reakcij potekala tako počasi, da se v celicah ne bi mogli izvajati osnovni
življenjski procesi. Encimi so prav tako specifični katalizatorji, kar pomeni, da deluje
določen encim na določen substrat in ker se encimi v kemijskih reakcijah ne spremenijo, jih
lahko uporabimo večkrat. Prednosti imobilizacije encimov sta ponovna in večkratna uporaba
encima. Z imobilizacijo encima dosežemo tudi večjo stabilnost encimov.2
CLEAs so zamreženi encimski skupki, ki so oblika imobiliziranega encima, kjer ne
potrebujemo nosilca. Sinteza CLEAs je precej enostavna metoda imobilizacije, kjer lahko
spreminjamo več parametrov, s čimer želimo doseči optimalno aktivnost imobiliziranega
encima. Prednosti kovalentne imobilizacije brez nosilca so:
– preprostost izvedbe (gre za reakcijo v dveh stopnjah: obarjanje in zamreženje),
– čistost produkta,
– uporaba za širok spekter encimov,
– nizki stroški proizvodnje.3
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
16
1. TEORETIČNI DEL
2.1. IMOBILIZACIJA
Imobiliziran encim je encim, ki je lokaliziran oz. fizično zaprt, s čimer se mu ohranijo
katalitične lastnosti. Zgodovino imobilizacije lahko razdelimo v tri časovna obdobja. Začetek
prvega obdobja sega v 19. stoletje, ko so uporabljali encime pri čiščenju odpadne vode. Druga
prelomnica predstavlja leto 1960, ko se pojavi prva imobilizacija encima, in sicer proizvodnja
L-aminokislin (iz α-keto kislin v L-aminokisline s pomočjo L-aminokislinske dehidrogenaze)
in izomerizacija glukoze. Tretje obdobje predstavljata letnici 1985 in 1995, ko se je pojavila
multiencimska imobilizacija, ki je vključevala kofaktorje in celično imobilizacijo.4
Organizmi izločajo številne encime, ki nimajo ekonomičnega efekta, če se lahko v kemijskem
procesu uporabijo le enkrat. Imobilizacija encima nam omogoča, da lahko encim večkrat
uporabimo. To je vodilo v razvoj več tehnik imobilizacije.
Prednosti imobilizacije so: zaporedna večkratna uporaba encima, nižji stroški procesa, krajši
reakcijski čas, manj nečistoč v produktu, višja stabilnost procesa, večji nadzor nad procesom,
omogoča višje razmerje encim : substrat.4
Slabosti imobilizacije: morebitna izguba ali poslabšanje katalitičnih lastnosti po
imobilizaciji.4
Prednost imobiliziranega encima je ponovna uporaba biokatalizatorja in je najboljši pristop za
stabilizacijo encimov. Za imobilizacijo encimov obstaja več metod, kjer so metode v veliki
meri odvisne od nosilnega materiala, ki je lahko organski ali anorganski. Skozi razvoj tehnik
imobilizacije so znanstveniki ugotovili, da ni za nobeno metodo imobilizacije (adsorpcija,
ujetje, kovalentna vezava, inkapsulacija) določena specifična vrsta nosilnega materiala. Pri
izbiri metode imobilizacije in nosilca moramo upoštevati kemijske in fizikalne lastnosti
nosilnega materiala in encima. Prav tako pa moramo paziti na stabilnost, ekonomičnost in
reaktivnost nosilnega materiala in encima.5
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
17
1.2. METODE IMOBILIZACIJE
Slika 1 prikazuje shematski prikaz metod imobilizacije in njihovo delitev na kemijske ali
fizikalne metode.
Slika 1: Vrste imobilizacije6
1.2.1. ADSORPCIJA
Adsorpcija je najenostavnejša metoda imobilizacije encima. Encim se nekovalentno
imobilizira na površino netopnega nosilnega materiala ali pa se veže na mineralne delce, kot
sta aluminijev oksid in glina. Delci, kamor se encim veže, so lahko tudi organskega izvora,
kjer je najpogostejši predstavnik škrob.
Pri adsorpciji so prisotne nizkoenergijske Van der Waalsove interakcije. Pri imobilizaciji
encima na notranjo površino nosilnega materiala je encim zaščiten pred zunanjimi vplivi in se
tako lahko tvorijo bolj stabilne vezi. Vez med encimom in nosilnim materialom je lahko
ionska ali kovalentna, lahko pa je kombinacija obeh vrst vezi.
Prednosti adsorpcije: metoda je enostavna, poceni in predstavlja reverzibilen proces.
Slabosti adsorpcije: tvorba šibkih vezi, imobilizacija poteka počasi.7
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
18
1.2.2. UJETJE
Gre za fizikalno metodo imobilizacijo, kjer se encim ujame v polimerno matrico ali v
membrano nosilnega materiala. Velikost por matriksa je določena glede na posamezno vrsto
encima. Pri tej metodi imobilizacije poznamo dva načina ujetja encima: ujetje v gelu in ujetje
v mikrokapsulah. Ujetje encima se razlikuje od kovalentne vezave encima v tem, da se encim
pri ujetju ne veže v gel ali membrano. Nevezava encima v gel ali na membrano je prednost, ki
se kaže v širokem spektru uporabe te metode. Slika 2a predstavlja encim, ki se je ujel v
intersticijskih mestih polimera. Najpogostejša sintetična polimera, ki sta uporabljena za
imobilizacijo encima, sta poliakrilamid in polivinil alkohol, najpogosteje uporabljen naravni
polimer je škrob. Slika 2b nam predstavlja ujetje encima v »kapsulo polimera«, ki ima
polprepustno oziroma semipermeabilno membrano. Priprava mikrokapsul je nadzorovan
laboratorijski proces, ki zahteva stroge kemijske in fizikalne pogoje.8
Slika 2: a) Ujetje v matriksu, b) Ujetje v mikrokapsulah8
1.2.3. INKAPSULACIJA
Pri inkapsulaciji gre za postopno dodajanje raztopine encima skozi polprepustno membrano
kapsule. Kapsula je narejena iz celuloznega nitrata, najlona ali drugih materialov. Metoda
inkapsulacije je enostavna in poceni, uspešnost pa je odvisna od stabilnosti posameznega
encima. Katalizator se nahaja znotraj kapsule, kar lahko vidimo na sliki 3. Ta tehnika se
uporablja le v zdravstvene namene. Pri inkapsulaciji je mogoče imobilizirati velike količine
encima.9
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
19
Slika 3: Shematski prikaz inkapsulacije9
1.2.4. KOVALENTNA VEZAVA
Encim, ki je imobiliziran na nosilec ali pa je imobiliziran brez nosilca, opisujemo z dvema
parametroma: nekatalitični in katalitični parametri. Nekatalitični parametri predstavljajo
fizikalne in kemijske lastnosti encima: oblika in velikost, medtem ko katalitični parametri
predstavljajo aktivnosti in stabilnost encima.10
1.2.4.1. Metode imobilizacije z nosilcem
Kovalentna vez se ustvari med funkcionalnima skupinama encima in prenosnika. Kovalentne
vezave se lahko poslužujemo pri encimih v širokem spektru pH. Postopek imobilizacije se
prične s pritrditvijo pripajalnega agensa, ki mu sledi pripenjanje funkcionalne skupine in na
koncu sledi pripenjanje encima. Kot nosilce lahko uporabimo ogljikove hidrate, proteine ali
anorganske nosilce. Kovalentna vezava poteka na točno določeni skupini (aminska ali
hidroksilna skupina) na površini encima. Slabost kovalentne vezave je morebitna deaktivacija
encima zaradi sprememb v konformaciji molekule, ki lahko nastane med reakcijo na aktivnih
mestih encima. To lahko preprečimo z uporabo substrata ali kompetitivnega inhibitorja
oziroma proteaze. Najpogosteje uporabljani aktivirni polimeri so celulaze ali poliakrilamidi,
kjer so vključene -diazo in -azidne funkcionalne skupine.4, 10
Različne metode kovalentne imobilizacije so:
– tvorba peptidne vezi med amino ali karboksilno skupino nosilca in encima,
– polifunkcionalni reagenti, kjer uporabimo bifunkcionalni ali večnamenski reagent za
tvorbo vezi med amino skupinama prenosnika in encima.4
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
20
1.2.4.2. Metode imobilizacije brez nosilca
Imobilizacija encima na nosilec lahko povzroči izgubo encimske aktivnosti tudi do 50 %,
posebej še, če gre za velike količine prostega encima. Zato je veliko več zanimanja za
imobilizacijo encimov brez nosilca, kot so CLEs (ang. cross-linked dissolved enzyme),
CLECs (ang. cross-linked enzyme crystals) in CLEAs (ang. cross-linked enzyme aggregates).
Pri naštetih metodah lahko uporabljamo visoke koncentracije encima, stroški proizvodnje so
nizki, imobilizirani encimi imajo višjo stabilnost v primerjavi z imobilizacijo na nosilec.10
Na sliki 4 so predstavljene različne tehnike imobilizacije encima brez nosilnega materiala.
Postopki se med seboj razlikujejo v dodatku mrežnih povezovalcev, ki jih uporabljamo za
zamreženje encima.
Slika 4: Imobilizacija encima brez nosilca10
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
21
CLEs
Višjo termostabilnost lahko dosežemo z zamreženjem raztopljenega encima, pri čemer
potrebujemo dobro razmerje med količino zamrežitvenega agensa, temperaturo, pH in ionsko
močjo encima. Intramolekularno zamreženje raztopljenega encima ima slabosti, in sicer nizko
stabilnost in precej nižjo aktivnost imobiliziranega encima (aktivnost imobiliziranega encima
je po navadi pod 50 % aktivnosti prostega encima). Višjo stabilnost raztopljenega encima
dobimo z ujetjem CLEs ali z zamreženjem raztopljenega encima v gelu ali z adsorpcijo
encima na inertni nosilec ali membrano. Metoda CLEs se običajno ne uporablja zaradi slabih
mehanskih lastnosti, med katerimi je najpogostejša slaba aktivnost imobiliziranega encima.10,
13
CLECs
Zamreženi encimski kristali imajo precej višjo termo in mehansko stabilnost v primerjavi z
CLEs. CLECs so stabilni v širokem spektru pH. Dobljeni kristali so lahko različnih velikosti.
Dokazano je, da zmanjšanje velikosti kristalov privede do višje aktivnosti imobiliziranega
encima. Altus Biologics je v letu 1990 prvi raziskal industrijski pomen CLECs, saj so bili ti
kristali odpornejši na temperaturo in so imeli posledično nižjo stopnjo denaturacije
imobiliziranega encima v primerjavi s prostim encimom. Produkt imobilizacije so robustni
kristali z visoko aktivnostjo. Njihova velikost je 1–100 µm. Postopek imobilizacije zahteva
visoko čistost končnega produkta, kar pomeni visoke obratovalne stroške.10, 14
Tehnika CLECs temelji na zamreženju encimskih kristalov z bifunkcionalnim reagentom, ki
je običajno glutaraldehid. Kot produkt dobimo trde kristale, ki so netopni v organskih in
vodnih raztopinah. Ker so kristali netopni, jih lahko odstranimo s filtracijo ali z odlitjem
tekočega medija.13
CLSDs
Sušenje z razprševanjem encima je blaga in cenovno ugodna metoda imobilizacije, pri kateri
dobimo kot produkt posušen in razpršen encim. Uporablja se za stabilizacijo temperaturno
občutljivih snovi (encimi in probiotične bakterije). Čeprav je sušenje z razprševanjem encima
uveljavljena metoda, se v industriji raje poslužujejo sušenja encima z zmrzovanjem. Razlog
za to so optimalni pogoji sušenja, kjer se izognemo morebitnim toplotnim poškodbam encima,
ki lahko vodi do izgube aktivnosti encimov ali do zmanjšanega preživetja bakterij.15
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
22
ZAMREŽENJE ENCIMSKIH SKUPKOV ali »cross-linking«
Gre za kovalentno vezavo med različnimi molekulami encima s polifunkcionalnimi reagenti,
kot sta glutaraldehid ali diazonijeva sol. Tehnika je preprosta in poceni, ne moremo pa je
uporabljati pri uporabi čistih proteinov, saj dobimo le malo imobiliziranega encima, kateri
ima visoko aktivnost. Tehniko uporabljamo v komercialne namene. CLEAs so zamreženi
encimski skupki, ki jih dobimo z obarjanjem in zamreženjem proteinskih agregatov (slika 5).
Ta postopek omogoča čiščenje in imobilizacijo v eni stopnji. Skupki, ki nastanejo pri
imobilizaciji, so makromolekule, ki so povezane s kovalentnimi vezmi in se ponovno
suspendirajo ob dodatku vodne raztopine z ustreznim pH. Postopek v prvi fazi temelji na
obarjanju, hkrati pa je potrebno poiskati obarjalni reagent, ki ne bo povzročil ireverzibilne
denaturacije encima. Obarjanje je postopek, pri katerem želimo ločiti encim iz reakcijske
zmesi. Pri tem uporabljamo različna topila. Ko se encim obori, preide v netopno obliko. V tej
stopnji nastanejo skupki, ki se v naslednji fazi zamrežijo z ustreznimi zamrežitvenimi
reagenti.11
Slika 5: Sinteza CLEAs12
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
23
1.3. ENCIMI
Encimi pospešujejo biokemijske reakcije v živih organizmih, sami pa se pri reakcijah ne
spremenijo. Brez encimov večina reakcij ne bi mogla potekati, saj omogočajo pretvorbo
energije in metabolično razgradnjo ali sintezo. Tako poznamo katalizirane in nekatalizirane
reakcije. Potek encimskih reakcij je prikazan na sliki 6. Pri nekataliziranih reakcijah poteka
reakcija po shemi: (S – substrat, P – produkt), kjer imamo visoko aktivacijsko energijo
in nizko reakcijsko hitrost. Pri reakcijah, ki so katalizirane z encimom, pa poteka reakcija po
shemi: (E – encim, S – substrat, P – produkt), pri kateri imamo nizko
aktivacijsko energijo, vendar visoko reakcijsko hitrost. Reakcijski mehanizem poteka preko
intermediatov.16
Slika 6: Potek encimskih reakcij17
Encimska kataliza se vedno začne z vezavo substrata na encim. Velikost molekule substrata je
običajno manjša od velikosti molekule encima. Za vezavo substrata na encim obstaja na
encimu točno določeno mesto, ki ga imenujemo aktivno mesto. Aktivno mesto je vdolbina ali
žepek v molekuli encima, kjer poteka kataliza.16
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
24
Za aktivna mesta velja:
aktivno mesto je specifično, kar pomeni, da aktivno mesto prepozna točno določeno
molekulo substrata iz velike množice substratov. Obliki molekule substrata in
aktivnega mesta sta skoraj zrcalni sliki, kar pomeni, da se bo molekula substrata
ujemala z obliko aktivnega mesta na encimu;
aktivno mesto predstavlja le majhen tridimenzionalen prostor na molekuli encima;
substrat se v prvi fazi veže na molekulo encima s šibkimi nekovalentnimi
reverzibilnimi interakcijami, kot so hidrofobne interakcije, vodikove in ionske vezi.16
Predstavo o kompleksu ES je prvi razložil Emil Fischer, leta 1890. Ta princip je poimenoval
ključ : ključavnica. Aktivno mesto na encimu je bilo predstavljeno kot ključavnica, substrat
pa kot ključ. Ta model je predvideval, da je aktivno mesto neprilagodljivo. Leta 1958 je
Daniel Koshland izpopolnil obstoječi model ključ : ključavnica in predstavil model inducirane
prilagoditve. Znano je, da so encimi 3D-oblike in se zaradi njihove oblike lažje prilagajajo in
premikajo glede na aktivno mesto. Model inducirane prilagoditve pravi, da je aktivno mesto
na encimu pred vezavo substrata nedoločene oblike. Šele ob vezavi substrata na aktivno
mesto zavzame aktivno mesto na encimu dokončno obliko in zgradbo. Z rentgensko
kristalografijo je bilo dokazano, da se med nastankom kompleksa ES dogajajo konformacijske
spremembe na molekuli encima. Zadnji model vezave encima in substrata predstavlja model
analog prehodnega stanja, kjer se poudarja lastnost encimov kot katalizatorjev.16
Encimi so za lažje prepoznavanje in iskanje v bazi encimov definirani s štirimi številkami,
npr. EC 2.7.1.1 (ang. Enzyme Commission number), kjer nam prvo število pove, v katerega
izmed šestih razredov uvrščamo encim, drugo število je podrazred encima, tretje število
podpodrazred encima in četrto število je serijska številka encima v podpodrazredu. Encimi
imajo skupno končnico -aza (celulaza, hidrolaza, reduktaza ...).18
V tabeli 1 so prikazane
skupine encimov, ki jih delimo glede na tip reakcije.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
25
Tabela 1: Razdelitev encimov v skupine glede na tip reakcije:
Encimi s svojo katalitično funkcijo niso omejeni le na reakcije v celicah. Uporabljamo jih v
prehrambeni, tekstilni in kemični industriji. Encimi se vedno bolj uporabljajo v zdravstvu in
za odstranjevanje odpadnih snovi. V zdravstvu uporabljajo encim deoksiribonukleazo za
zdravljenje cistične fibroze. V prehrambeni industriji uporabljajo amilazo, ki povzroča razpad
škroba. Ta lastnost se izkorišča pri proizvodnji nizkokaloričnega piva in za bistrenje sokov in
vina. Motnost sadnih sokov povzročata škrob in celuloza, ker so molekule zaradi svoje
velikosti delno topne v vodi. Encima amilaza in celulaza povzročita razpad škroba in celuloze.
Pri tem nastanejo vodotopni polisaharidi in glukoza. V kmetijstvu se poslužujejo encima
fitaze, katerega dodajajo krmi za živali. Fitaza povzroči sprostitev fosfata iz fitinske kisline in
zato je potrebno krmi dodati manj anorganskega fosfata kot sicer.16
Razred Opis reakcije Reakcijska shema
oksidoreduktaze EC1 prenos elektronov
transferaze EC2 prenos skupin iz ene
molekule na drugo
hidrolaze EC3 razcep vezi s hidrolizo
liaze EC4 adicija na dvojno vez
izomeraze EC5 premestitev skupine znotraj
molekule, da dobimo drugo
izomerno obliko
ligaze EC6 nastanek kovalentnih vezi
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
26
1.4. CELULOZA
Celuloza je snov, ki je brez vonja in okusa ter netopna v vodi in v večini organskih topil.
Celuloza je strukturni polisaharid in spada v skupino ogljikovih hidratov. Celuloza je
predstavljena s formulo (C6H10O5)n. Molekulo sestavlja linearna veriga 1,4-β-D-glukoznih
enot, ki so med seboj povezane v ekvatorialni verigi z –OH skupino na C1 in C4 ogljikovem
atomu. Molekula celuloze je kiralna molekula in ima širok spekter uporabnosti. Naravna
celuloza vsebuje tako kristalinična kot amorfna področja. Stopnja kristaliničnosti je odvisna
od vira celuloze in vsebnosti kristaliničnih regij, ker na teh delih težje poteče hidroliza.
Celulozni materiali so za industrijo zanimivi zaradi nizkih stroškov nabave. Znotraj molekule
obstajata dve vrsti vodikovih vezi: inter in intra vezi, ki vplivata na obliko molekule.
Intramolekularne vezi vplivajo na oblikovanost in togost glavne verige. Povprečna velikost
molekule celuloze ima 10 000 do 15 000 glukoznih ostankov. Celuloza je glavna komponenta
celične stene rastlin, rastline pa skupaj predstavljajo 33 % vse biomase. Biosinteza celuloze
poteka tudi v bakterijah in glivah.19
Na sliki 7 je prikazana shema encimske hidrolize
celuloze. Slika 8 nam prikazuje dve verigi celuloze, ki sta med seboj povezani s prečnimi
vodikovimi vezmi.
Slika 7: Encimska hidroliza celuloze19
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
27
Slika 8: Povezava dveh molekul celuloze s prečnimi vodikovimi vezmi16
1.5. CELULAZE
Celulaze spadajo v razred encimov, ki jih v glavnem proizvajajo glive, bakterije in protozoje,
prav tako pa tudi rastline in živali. Celulaze cepijo molekulo celuloze do osnovnih molekul
glukoze.
Celulaze lahko drugače poimenujemo tudi endoglukanaze, endo-1,4-β-glukanaze,
karboksimetil celulaze (ang. carboxymethyl cellulase; CMCase), endo-1,4-β-D-glukanaze, β-
1,4-glukanaze ali celudekstrinaze.
Obstaja več vrst celulaz, ki cepijo celulozo v β-glukozo:
Endoglukanaze (EC 3.2.1.21), eksoglukanaze (EC 3.2.1.74), celibiohidrolaze (EC 3.2.1.91) in
β-glukozidaze (EC 3.2.1.21):
– endo-β-1,4-glukonaze: cepijo vezi naključno in vlakna razdelijo v več delov;
– celobiohidrolaze: hidroliza celuloze poteka na koncih verige. Pri tem nastanejo
celobiozne enote;
– endo-β-1,4-glukozidaze: razgradijo celobiozne enote v glukozne molekule.19
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
28
Razgradnja celuloze je večstopenjski hidrolitičen proces. Celulaze (slika 9) se uporabljajo v
industriji in tekstilstvu. V industriji tekstilstva uporabljajo celulaze za odstranjevanje nečistoč,
obdelavo jeansa ali kot dodatek k detergentom za belilni učinek. Z encimi lahko delujemo na
barvana, viskozna ali regenerirana celulozna vlakna.20
Slika 9: Shematski prikaz celulaze21
1.6. MREŽNI POVEZOVALEC – GLUTARALDEHID
Glutaraldehid (GA, pentandial) s kemijsko formulo CH2(CH2CHO)2 je organska spojina, ki
smo jo uporabili pri zamrežitvi oborjenega encima in vsebuje aldehidni skupini. Nahaja se v
obliki prozorne oljnate tekočine z ostrim in sladkim vonjem. Prvo poročanje o molekuli
glutaraldehida je bilo s strani dveh znanstvenikov (C. Harries in L. Frank), ki sta sintetizirala
dialdehid iz ciklopentena, kjer sta dobila več produktov, med katerimi je bil tudi
glutaraldehid. Ker je do takrat molekula GA neraziskana, so se znanstveniki usmerili v
raziskovanje le-te. Danes uporabljamo GA kot fiksativ v elektronski mikroskopiji, kot mrežni
povezovalec za encime in kot razkužilo zdravstvene in zobozdravstvene opreme. GA
uporabljamo tudi kot konzervans, kjer je koncentracija raztopine med 0,1 % in 1,0 %. V
glavnem je na voljo kot vodna raztopina.22
Zamrežitvenih agensov je več, vendar se glutaraldehid uporablja v veliki večini zaradi
enostavne uporabe in nizke nabavne cene.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
29
1.1 Sinteza glutaraldehida
Industrijska proizvodnja glutaraldehida, ki ga prikazuje slika 10, poteče v dveh fazah, kjer
pride do reakcije med akroleinom in vinil etil etrom, kjer nastane etoksi dihidropiran, ki v
reakciji z vodo razpade na glutaraldehid in etanol.
Slika 10: Sinteza GA22
GA, ki se uporablja v komercialne namene, se nahaja v obliki vodne raztopine. Z uporabo
magnetne resonance so ugotovili, da so v vodni raztopini prisotne enake količine hemiacetata,
dihidrata in cikličnega hemiacetala (slika 11).23
V tabeli 2 so napisane fizikalne lastnosti
glutaraldehida.
Slika 11: Oblike GA v vodni raztopini23
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
30
Tabela 2: Fizikalne lastnosti glutaraldehida24
Fizikalne lastnosti:
tališče –6 °C
vrelišče 189 °C pri tlaku 101,3 kPa
gostota 947 kg/m3
topnost voda, etanol, kloroform, ocetna kislina, eter
in druga organska topila
uporaba kot razkužilo in kot zamrežitveni reagent
nevarnosti močni hlapi, ki dražijo nos, oči in kožo
vnetljivost ne
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
31
2.7. OBARJANJE IN OBARJALNI AGENSI
Kemijsko obarjanje vključuje dodajanje snovi, katerim se v stiku dveh raztopin spremeni
fizikalna struktura raztopljenih in neraztopljenih snovi. Neraztopljene snovi se pri tem
posedejo na dno. Obarjanje proteinov je postopek, kjer ločujemo encim iz reakcijske zmesi s
pomočjo ustreznega topila, ki povzroči, da encim preide v netopno obliko (slika 12).
Vrste obarjanja:
– S solmi, kjer visoka koncentracija soli vpliva na vodne molekule, ki se nahajajo v okolici
proteinov. S tem se spremenijo elektrostatske sile, ki vplivajo na topnost encimov. Z
amonijevim sulfatom lahko učinkovito koncentriramo encim in zato je amonijev sulfat
najbolj uporabljen obarjalni reagent. Optimalno koncentracijo soli za obarjanje moramo
določiti eksperimentalno, vrednost koncentracije je lahko 20–80 % nasičenosti.
– Z organskimi topili nastane redukcija dielektrične konstante medija, pri katerem poteka
reakcija. Hidratacija vodnih molekul okoli encima se spremeni in posledično pride do
povečane interakcije s proteini. Kot topili se običajno uporabljata etanol ali aceton. Paziti
moramo le na koncentracijo topila in temperaturo, pri kateri reakcija poteka.
– S polimeri, pri katerih običajno uporabljamo polietilenimine in polietilenglikole z
različnimi molskimi masami. Način obarjanja je podoben obarjanju z organskimi topili,
razlikuje se le v hidrataciji vodnih molekul okoli encima.
– Obarjanje v izoelektrični točki. Proteini vsebujejo kislo in bazično skupino. Na topnost
proteinov izrazito vpliva pH okolja in zato je topnost najnižja v IP, kjer je neto naboj
enak 0.25
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
32
Slika 12: Potek obarjanja
2.7.1. OBARJALNI REAGENTI
Za obarjanje smo uporabili naslednje obarjalne reagente:
– metanol,
– etanol,
– propanol,
– 2-propanol,
– aceton,
– amonijev sulfat,
– tetrahidrofuran,
– DMSO,
– PEG 1500,
– PEG 6000,
– PEG 10000,
– PEG 20000,
– kloroform,
– n-heptan,
– heksan,
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
33
– dimetileter,
– butanol,
– acetonitril,
– dekanol.
Nadaljnje sledi opis obarjalnih reagentov, pri katerih je bilo obarjanje uspešno in z uporabo
katerih smo uspešno sintetizirali CLEAs.
METANOL:
– molekulska formula: CH30H;
– je najenostavnejši alkohol in je pri standardnih pogojih lahko hlapna, prozorna in hitro
vnetljiva tekočina, ki ima podoben vonj kot etanol. Metanol nastaja kot stranski
produkt anaerobnega metabolizma pri določenih vrstah bakterij;
– druga imena za metanol: metilni alkohol, hidroksimetan, lesni alkohol (nekoč so
metanol pridobivali z destilacijo lesa);
– uživanje metanola lahko povzroči pri ljudeh komo ali smrt, saj se le-ta v človeških
prebavilih spremeni v mravljično kislino in njene soli, ki so za osrednji živčni sistem
strupene;
– uporablja se kot topilo za ekstrakcijo.26
ETANOL:
– molekulska formula: C2H5OH;
– pri sobni temperaturi je prozorna, vnetljiva in lahko hlapna tekočina, značilnega vonja;
– etanol velikokrat imenujemo kar alkohol in se pojavlja v alkoholnih pijačah;
– uporabljamo ga kot topilo in razkužilo;
– majhne količine etanola znižujejo holesterol, preprečujejo infarkt in diabetes;
– etanol v večjih količinah deluje kot strup.26
PROPANOL:
– molekulska formula: C3H7OH;
– je prozorna, lahko vnetljiva in hitro hlapna tekočina;
– hlapi propanola so težji od zraka, zato se hlapi zbirajo pri tleh;
– uporablja se kot topilo v proizvodnji barv in kozmetike, kot tudi v črnilu (tiskarskem);
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
34
– uporabljajo ga v proizvodnji pesticidov;
– izpostavljenost propanolu lahko povzroči glavobol, zaspanost in vnetja oči, nosu ter
žrela.26
ACETON:
– molekulska formula: C3H6O;
– najenostavnejši keton;
– prozorna, lahko hlapna in lahko vnetljiva tekočina;
– tekočina, značilnega vonja;
– pomembno industrijsko in laboratorijsko topilo, saj se meša s skoraj vsemi organskimi
topili;
– v majhnih količinah ga najdemo v človeškem telesu, saj nastaja pri razgradnji maščob
in ogljikovih hidratov.26
AMONIJEV SULFAT:
– molekulska formula: (NH4)2SO4;
– nahaja se v trdnem stanju, v obliki majhnih belih granul in je vodotopen;
– čistost uporabljenega laboratorijskega amonijevega sulfata je 99,5 %;
– raztopino amonijevega sulfata smo si pripravljali sproti, saj je spojina higroskopna in
vpija vodo iz zraka.27
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
35
2. REAGENTI IN METODE
REAGENTI:
– aceton,
– butanol,
– 2-propanol,
– metanol,
– etanol,
– PEG 1500,
– PEG 6000,
– PEG 20000,
– DMSO,
– kloroform,
– n-heptan,
– heksan,
– acetonitril,
– dimetilster,
– tetrahidrofuran (THF),
– dekanol,
– albumin iz kokošjih jajc, Sigma,
– glutaraldehid, Sigma,
– PBS (fosfatni pufer),
– citratni pufer,
– acetatni pufer,
– encim celulaza,
– PEHA,
– NaBH3CN,
– acetatni pufer,
– Bradfordov reagent,
– Coomasie Brilliant Blue barvilo (Merck),
– glukoza,
– amonijev sulfat,
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
36
– miliQ voda,
– Sigmacell solution.
LABORATORIJSKA OPREMA:
– tehtnica, Rotamix 550 MMH,
– vorteks (Mikro+Polo),
– avtomatska pipeta (Transferpette),
– pH meter,
– UV-VIS spektrofotometer (Varian, Cary 50 Probe),
– centrifuga (Ependorf Centrifuge 5804R),
– stresalnik (Heidolph Unimax 1010),
– centrifugirka,
– epruveta,
– mikrocentrifugirka,
– termometer,
– merilni valj,
– ultrazvočna kopel,
– parafinska kopel.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
37
3. EKSPERIMENTALNE METODE
4.1. PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST
PRIPRAVA RAZTOPINE PEHA:
Ker je raztopina PEHA zelo viskozna tekočina, moramo biti pri pipetiranju zelo previdni.
Pripravili smo 0,1 M raztopino. V 40 mL miliQ vode smo odpipetirali 1,22 mL PEHA, dobro
premešali in z miliQ vodo dopolnili do 50 mL. Z 1 M HCl smo znižali pH na 6,4.
PRIPRAVA RAZTOPINE NaBH3CN:
Priprava NaBH3CN poteka v digestoriju z obvezno uporabo rokavic. Ker smo želeli 0,1 M
raztopino, smo zatehtali 0,3142 g NaBH3CN in ga raztopili v 50 mL miliQ.
PRIPRAVA REAGENTOV ZA AKTIVNOSTNI TEST:
REAGENT A: v čašo smo nalili 500 mL miliQ vode in dodali 50 mM natrijevega acetatnega
pufra. Najprej smo zatehtali 2,05 g brezvodnega natrijevega acetata, dodali 400 mL vode,
dodali magnetno mešalo in segreli na 37 °C. Nato smo umerili pH meter po standardnem
postopku in po kapljicah dodajali 1 M HCl do pH 5. Vsebino čaše smo prelili v bučko in
dopolnili z miliQ do končnega volumna 500 mL.
REAGENT B: V čašo smo zatehtali 10 g Sigmacell Solution (5 % v 200 mL) in ga razredčili
z reagentom A do oznake v 200-mL bučki.
REAGENT C: tekoča celulaza.
REAGENT D (glukoza): reagent (v prahu) smo raztopili v 20 mL miliQ vode.
RAZTOPINA AMONIJEVEGA SULFATA: uporabili smo 95 % raztopino amonijevega
sulfata. V 50 mL miliQ vode smo zatehtali 20,66 g (NH4)2SO4.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
38
PRIPRAVA PUFROV:
Pufrne raztopine so pomembne, saj v organizmih uravnavajo pH okolje za encime. Mnogo
encimov je aktivnih le pod strogo določenimi pogoji. Če se pogoji delovanja encimov
spremenijo, lahko pride do upočasnjenih reakcij ali celo do denaturacije encima, kjer izgubi
encim vso svojo aktivnost. V večini bioloških poskusov uporabljamo pufer PBS pri pH =
7,4.28
Pri laboratorijskem delu smo uporabili tri vrste pufrov:
ACETATNI PUFER (50 mM, pH 5)
Pripravili smo acetatni pufer z množinsko koncentracijo 50 mM in pH 5. Za 500 mL raztopine
smo potrebovali 2,05 g natrijevega acetata (CH3COONa). V čašo smo nalili 400 ml miliQ
vode in dodali natrijev acetat. Nato smo dodali mešalo in segreli raztopino na 37 °C. pH
raztopine smo znižali z dodajanjem 1 M HCl do pH 5. Končno raztopino smo vlili v valj in
dodali miliQ vodo do oznake 500 ml.
CITRATNI PUFER (50mM, pH 4,8)
Pripravili smo citratni pufer s koncentracijo 50 mM in pH 4,8. Za 500 mL raztopine smo
potrebovali 4,8 g citronske (C6H8O7) kisline. V čašo smo nalili 400 mL miliQ vode, dodali
4,8 g citronske kisline in umerili pH na 4,8 z 1 M NaOH. Dobljeno raztopino smo prelili v
merilno bučko in jo dopolnili z miliQ vodo do 500 mL.
FOSFATNI/ PBS PUFER (20mM, pH 7)
Pripravili smo PBS pufer koncentracije 20 mM in pH 7. Za 500 mL raztopine smo potrebovali
1,38 g natrijevega dihidrogenfosfata-monohidrata (NaH2PO4 * H2O). V čašo smo nalili 400
mL miliQ vode, dodali 1,38 g NaH2PO4 * H2O in umerili pH na 7 z 1 M NaOH. Nato smo
prelili raztopino v merilno bučko in dopolnili z miliQ do 500 mL.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
39
3.2. PRIPRAVA PROSTEGA ENCIMA IN SINTEZA ZAMREŽENIH
ENCIMSKIH SKUPKOV (CLEAs)
1) Priprava prostega encima
Uporabljali smo encimski preparat Cellusoft Cellulase (EC 3.2.1.4, Novozymes A/S Danska)
v tekoči obliki. Pri aktivnostnem in Bradfordovem testu smo iz encimske raztopine
odpipetirali 100 µL vzorca in ga razredčili z 900 µL pufra PBS. Od tako pripravljene
raztopine prostega encima smo za Bradfordov test odpipetirali 20 µL. V aktivnostnem testu
smo uporabljali 1 mL encimske raztopine (900 L pufra in 100 L encima).
2) Sinteza zamreženih encimskih skupkov
Pripravili smo zamrežene encimske skupke iz encima celulaze. Potek dela je bil sestavljen iz
obarjanja in zamreženja. Pri postopku obarjanja smo najprej zatehtali v mikrocentrifugirko 17
mg albumina in dodali 1 mL pufra PBS pH 7,0. Albumin (EA) je ogrodni protein in poviša
stabilnost –NH2 skupin na molekuli. Prazne MC smo postavili na stojalo in vanje odpipetirali
100 µL raztopine encima in 100 µL raztopljenega albumina. Na magnetnem mešalu smo
mešali 20 minut. Po 20 minutah smo dodali 200 µL raztopine PEHA in ponovno mešali 20
minut. PEHA je snov, ki poveča število prostih –NH2 skupin na encimu. V prazne MC smo
odpipetirali 900 µL obarjalnega reagenta (metanol, etanol, propanol, aceton in amonijev
sulfat) in vanje po kapljicah dodajali raztopino albumina, encima in PEHA. Dobljeno
suspenzijo smo mešali nadaljnjih 40 minut. Postopku obarjanja je sledil postopek zamreženja,
kjer smo oborjeni raztopini albumina, encima in PEHA dodali 57 µL (1 %) GA in mešali 3
ure. Po 3 urah smo dodali 100 µL raztopine NaBH3CN in mešali dodatnih 40 minut.
NaBH3CN je reagent, ki nam zaključi reakcijo zamreženja oborjenega encima in kjer se
stabilizirajo intermolekularne vezi v nastalih agregatih, da CLEAs po centrifugiranju ne
razpade. Po končanem mešanju smo MC centrifugirali 10 minut pri 12000 rpm, kjer so se
trdni delci posedli na dno MC. Supernatant smo odlili v prazno MC, oborino encimskih
skupkov pa suspendirali v 1mL pufra PBS pH 7,0 in ponovno centrifugirali 10 minut. Sledil
je Bradfordov test, kjer smo določili koncentracijo proteinov v supernatantu in spiranjih, ter
aktivnostni test, kjer smo izmerili aktivnost prostega encima in jo primerjali z aktivnostjo
resuspendiranega encima po zaključeni reakciji obarjanja.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
40
CLEAs smo pripravili z različnimi začetnimi koncentracijami GA z namenom optimiranja
aktivnosti CLEAs. Potrebno koncentracijo GA smo izračunali po enačbi (1):
(1)
w … masni delež
0,25 … koncentracija glutaraldehida
1,3 … skupni volumen pred dodatkom glutaraldehida
x … količina glutaraldehida
Na sliki 13 so prikazane centrifugirke, v katerih smo imeli CLEAs z uporabo obarjalnega
reagenta etanola (skrajno levo), spiranja v sredini in pufer PBS (skrajno desno) za primerjavo.
Slika 13: CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom, spiranja in pufer PBS
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
41
3.3. DOLOČANJE UČINKOVITOSTI IMOBILIZACIJE
Koncentracijo proteinov smo določili po Bradfordovi metodi v raztopini prostega encima,
supernatantu in obeh spiranjih. Bradfordova metoda temelji na dejstvu, da se barvilo
Comassie brilant modro G-250 specifično veže na protein. Rdeča barva barvila se spremeni v
modro, s tem pa se spremeni absorpcijski maksimum barvila s 465 nm na 595 nm.
Absorbance smo merili pri 595 nm na UV-VIS spektrofotometru, s programom Advanced
reads.
Pred začetkom prvih meritev smo pripravili umeritveno krivuljo za Bradfordov reagent. To
smo storili tako, da smo zatehtali 10 mg albumina in ga razredčili z 1 mL miliQ vode. V 6
praznih MC smo pripravili naslednje vzorce:
1. 1000 µL miliQ vode
2. 980 µL miliQ vode + 20 µL albumina
3. 960 µL miliQ vode + 40 µL albumina
4. 940 µL miliQ vode + 60 µL albumina
5. 920 µL miliQ vode + 80 µL albumina
6. 900 µL miliQ vode + 100 µL albumina
Nato smo v šest praznih MC odpipetirali 1 mL Bradfordovega reagenta (sobna temperatura)
in v vsako MC dodali 20 µL ustreznega vzorca. Vzorce smo dobro premešali in jim po 5
minutah izmerili absorbance. Na podlagi dobljenih vrednosti smo narisali umeritveno krivuljo
(PRILOGA).
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
42
IZRAČUN UČINKOVITOSTI IMOBILIZIRANEGA ENCIMA
Pripravili smo zamrežene encimske skupke. Po končani sintezi smo po centrifugiranju
vzorcev dobili supernatant, spiranje 1 in spiranje 2. S pomočjo Bradfordovega reagenta smo
izmerili absorbanco vzorcev (supernatant in spiranja), kjer smo v 1mL Bradfordovega
reagenta dodali 20 µL posameznega vzorca, počakali 5 minut in na UV-VIS spektrofotometru
izmerili absorbanco pri valovni dolžini 595 nm.
Sledili so izračuni, kjer smo posamezne absorbance delili s koeficientom naklona umeritvene
krivulje Bradfordovega reagenta in dobili pripadajočo koncentracijo. To koncentracijo smo
odšteli od koncentracije vzorca proste celulaze in dobili koncentracijo CLEAs. Koncentracijo
CLEAs smo delili s koncentracijo celulaze in dobili učinkovitost v % (enačba 2).
Postopek:
(2)
Slika 14 nam prikazuje, kako se je spremenila barva vzorcev glede na vsebnost proteinov v
posameznem vzorcu.
Slika 14: Prikaz obarvanosti spiranj z Bradfordovim reagentom. Od leve proti desni si sledijo
slepi vzorec (PBS), supernatant in spiranja.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
43
3.4. DOLOČANJE SPECIFIČNE AKTIVNOSTI KATALIZATORJA
HIDROLIZA CELULOZE:
Slika 15: Hidroliza celuloze
Kjer je: ATP= adenozin-5 -trifosfat
ADP= adenozin-5 -difosfat
β-NAD= β.nikotinamid adenin dinukleotid, oksidirana oblika
β-NADH= β.nikotinamid adenin dinukleotid, reducirana oblika
G-6PDH= glukoza 6-fosfat dehidrogenaza
G-PG= 6-fosfo-D-glukanat
Slika 15 prikazuje hidrolizo celulaze, kjer celuloza razpade na D-glukozo, kjer pa ne moremo
direktno meriti nastale količine D-glukoze. D-glukozo merimo v reakcijah, kjer sodelujeta
heksokinaza in G-6PDH. Glukoza je fosfolizirana z adenozin trifosfatom v reakciji, ki jo
katalizira heksokinaza. D-glukoza 6-fosfat se oksidira v 6-PG v prisotnosti oksidiranega
NAD. Ta reakcija poteka v prisotnosti G-6PDH. Iz molekule NAD, nastane NADH. Pri
340nm pride do povišanje koncentracije NADH. Sama hidroliza celuloze temelji na dejstvu,
da več kot je v merjenem vzorcu prisotne D-glukoze, višja bo količina nastalega NADH in
posledično bo višja tudi izmerjena absorbanca. (Povzeto po Enzymatic Assay of Cellulase,
Sigma quality control test procedure)
Aktivnost prostega encima in CLEAs smo določali z merjenjem absorbanc na UV-VIS
spektrofotometru, s programom Kinetics pri valovni dolžini 340 nm. Aktivnostni test je bil
sestavljen iz dveh korakov. V prvem koraku smo v termostatirane centrifugirke (vodna kopel,
37 °C) odpipetirali 4 mL raztopine Sigmacella. V aktivnostnem testu smo merili tri vzorce:
CLEAs, raztopino prostega encima in slepi vzorec. V slepi vzorec smo odpipetirali 1 mL
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
44
pufrne raztopine PBS s pH 7.0, v drugi vzorec smo odpipetirali 1 mL raztopine prostega
encima, v zadnji vzorec pa smo odpipetirali 1 mL CLEAs. Centrifugirke smo vpeli na
stresalnik (slika 16), ki smo ga predhodno segreli na 37 °C. Stresanje je potekalo 2 uri pri 300
rpm. Po končanem stresanju smo centrifugirke dali takoj v ledeno kopel (ledena kopel
zaključi reakcijo) in jih centrifugirali 2-krat po 2 minuti pri 20 °C in 11000 rpm. Supernatant
smo prelili v epruveto. V drugem koraku aktivnostnega testa smo v prazne MC pripravili 750
µL reagenta D. Iz supernatanta, ki smo ga predhodno prelili v epruvete, smo odpipetirali 25
µL ter dodali k reagentu D. Vzorce smo premešali in izmerili absorbanco pri času 2,5 minute.
Slika 16: Slika stresalnika
Z izmerjeno absorbanco smo izračunali aktivnost encima po enačbi (3). Najpogosteje
uporabljena enota za izražanje aktivnosti encima je enota/mL encima (ang. U/mL enzyme;
IU – International Unit; enzyme unit). Enota/mL encima je definirana kot količina encima, ki
je potrebna za pretvorbo substrata v produkt in se meri v mikromolih encima na minuto. Pri
tej definiciji moramo opozoriti, da se enote encima nanašajo na količino transformiranega
substrata in ne na njegovo koncentracijo. Izraz specifična aktivnost uporabljamo pri
opisovanju čistosti in aktivnosti encima. Specifična aktivnost je definirana kot enota encima
na miligram proteina. Molekulska aktivnost encima pa je izražena kot enota encima na
mikromol encima. Če poznamo molekulsko maso encima in njegovo čistost, lahko
izračunamo molekulsko aktivnost s pomočjo specifične aktivnosti.29
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
45
(3)
Kjer je:
… absorbanca pri 340 nm
0,775 …. skupni volumen glukoze in vzorca pri merjenju aktivnosti
df … dilution factor ali faktor redčenja (v našem primeru 1)
6,22 … milimolarni koeficient β-NADH pri 340 nm
2 … faktor preračunavanja z 2 na 1 uro na enoto/ml encima
1 … volumen celulaze
0,025 …. volumen vzorca, ki smo ga merili pri aktivnostnem testu
IZRAČUN SPECIFIČNE AKTIVNOSTI CLEAs
Po končanem aktivnostnem testu smo izmerili absorbanco prostega encima in CLEAs pri
valovni dolžini 340 nm. Iz enačbe (4), kjer je delež raztopine prostega encima 100 %, smo
izračunali specifično aktivnost CLEAs v odstotkih.
(4)
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
46
3.5. STABILNOST IMOBILIZIRANEGA ENCIMA
Ugotavljali smo, ali lahko zamrežene encimske skupke v reakcijah večkrat uporabimo in
kolikokrat, da bo imobiliziran encim še vedno aktiven. Prednost imobilizacije je med drugim
večkratna uporaba imobiliziranega encima. Glede na to, da smo imeli več obarjalnih
reagentov, smo pripravili CLEAs z vsakim obarjalnim reagentom, kjer je v reakciji obarjanja
nastala oborina. Aktivnost encima smo merili v U/mL encima. Po aktivnostnem testu (2 h, 37
°C in 300 rpm) in centrifugiranju smo ves supernatant odstranili in tega nadomestili s 3,2 mL
acetatnega pufra. Količino acetatnega pufra smo predhodno določili tako, da smo v
centrifugirko odpipetirali 4 mL raztopine Sigmacell Solution, ga centrifugirali in odlili ves
supernatant. Prav tako pa smo dodali 1 mL PBS pufra, zaradi postopka priprave zamreženih
skupkov. Po dodatku obeh pufrov je ponovno sledil aktivnostni test (2 h, 37 °C in 300 rpm).
Vsak naslednji cikel je sledil enakemu postopku.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
47
5. REZULTATI
5.1. VPLIV PUFRA NA AKTIVNOST ENCIMA CELULAZE
Zanimalo nas je, ali različni pufri vplivajo na aktivnost celulaze. Pri raziskovanju vpliva pufra
na aktivnost celulaze smo uporabili acetatni (50 mM, pH 5), citratni (50 mM, pH 4,8) in PBS
(20 mM, pH 7) pufer. Aktivnostni test smo izvedli na stresalniku, kjer je test potekal 2 h pri
37˚ C s hitrostjo stresanja 300 rpm. Poskus smo izvedli tako, da smo v 975 µL pufra
odpipetirali 25 µL celulaze. Dobljene vrednosti smo podali v U/mL encima.
Ugotovili smo, da so odstopanja med aktivnostjo celulaze v različnih pufrih zelo majhna,
vendar dosežemo najvišjo aktivnost celulaze pri uporabi PBS pufra. Na sliki 17 vidimo, da je
bila aktivnost encima z uporabo PBS pufra 6,74 U/mL encima, z uporabo acetatnega pufra
6,66 U/mL encima in z uporabo citratnega pufra 6,55 U/mL encima. Zato smo za nadaljnje
reakcije uporabljali pufer PBS.
Slika 17: Vpliv pufra na aktivnost prostega encima
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
48
5.2. UPORABA RAZLIČNIH OBARJALNIH REAGENTOV
Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: aceton, metanol, etanol, propanol, 2-propanol,
butanol, raztopino amonijevega sulfata, DMSO, PEG 1500, PEG 6000, PEG 20000,
kloroform, n-heptan, heksan, dekanol, dimetileter, acetonitril in THF.
Rezultati obarjanja encima celulaze so prikazani v tabeli 3. Obarjanje je potekalo tako, da smo
v 900 µL obarjalnega reagenta odpipetirali 100 µL raztopine celulaze.
V tabeli smo kot rezultat obarjanja zabeležili da ali ne, kjer da pomeni tvorbo oborine (slika
18) in ne pomeni reakcijo, kjer ni prišlo do tvorbe oborine (slika 19). Tvorba oborine pomeni,
da smo po obarjanju dobili motno raztopino, kar smo videli pri uporabi obarjalnega reagenta
acetona, metanola, etanola, 2-propanola in amonijevega sulfata. Pri obarjanju celulaze v
kloroformu, n-heptanu, heksanu, dimetiletru in butanolu sta nastali dve ločeni fazi, ki se med
seboj nista mešali. Pri uporabi obarjalnih reagentov dimetil sulfoksida-DMSO, PEG 1500,
PEG 6000, PEG 20000 se je celulaza popolnoma raztopila in smo dobili eno˗fazni sistem. V
primeru uporabe obarjalnih reagentov acetonitrila in tetrahidrofurana-THF pa so nastali
sprijeti delci na dnu MC, katere je bilo težko ločiti.
Slika 18: Prikaz pozitivnih reakcij obarjanja z različnimi obarjalnimi reagenti
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
49
Slika 19: Prikaz reakcij obarjanja, kjer celulaza v stiku z obarjalnim reagentom ni tvorila
oborine.
Tabela 3: Uspešnost obarjalnih reakcij
OBARJALNI REAGENT TVORBA OBORINE (da, ne)
aceton da
metanol da
etanol da
propanol da
2- propanol da
butanol ne
amonijev sulfat da
DMSO ne
PEG 1500 ne
PEG 6000 ne
PEG 20000 ne
kloroform ne
n- heptan ne
heksan ne
dekanol ne
dimetileter ne
acetonitril ne
THF ne
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
50
5.3. DOLOČANJE AKTIVNOSTI RESUSPENDIRANEGA ENCIMA PO
OBARJANJU
Zanimala nas je aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju. Uporabili smo tiste
obarjalne reagente, kjer smo dobili oborino v reakciji obarjanja. Eksperiment je potekal tako,
da smo k 900 µL obarjalnega reagenta odpipetirali 100 µL raztopine celulaze. Dobljeno
suspenzijo smo centrifugirali, pri čemer smo supernatant zavrgli, oborino pa dvakrat sprali z 1
mL pufra PBS. Po spiranjih smo dodali 1 mL pufra PBS in tako dobljeno suspenzijo uporabili
v aktivnostnem testu (2h, 37 °C, 300 rpm). V tabeli 4 in na sliki 20 so predstavljeni rezultati
določanja aktivnosti resuspendiranega encima po obarjanju.
Tabela 4: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju
Obarjalni reagent Potek eksperimenta Aktivnost (%)
etanol 100 µL celulaze + 900 µL etanola 83,74
aceton 100 µL celulaze + 900 µL acetona 83,35
metanol 100 µL celulaze + 900 µL metanola 78,70
2-propanol 100 µL celulaze + 900 µL 2-propanola 82,68
Propanol 100 µL celulaze + 900 µL propanola 84,26
amonijev sulfat 100 µL celulaze + 900 µL amonijevega sulfata 79,25
Slika 20: Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
51
S slike 20 je razvidno, da je bila aktivnost nezamrežene celulaze visoka. Najnižja aktivnost
resuspendiranega encima po obarjanju je bila pri uporabi obarjalnega reagenta metanola 78,7
% in amonijevega sulfata 79,3 %. Najvišja aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju
je bila pri uporabi obarjalnega reagenta propanola 84,3 %. Aktivnost resuspendiranega encima
po obarjanju pri uporabi obarjalnega reagenta etanola je bila 83,7 %, pri uporabi acetona 83,4
% in pri uporabi obarjalnega reagenta 2-propanola 82,7 %
5.4. SINTEZA CLEAs Z UPORABO RAZLIČNIH OBARJALNIH
REAGENTOV
5.4.1. Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in
aktivnost zamreženih encimskih skupkov
V prvem delu smo pripravili zamrežene encimske skupke z začetno koncentracijo GA 1 %,
pri čemer smo uporabili različne obarjalne reagente: metanol, aceton, propanol, 2-propanol,
etanol in amonijev sulfat (slika 21). Iz rezultatov učinkovitosti imobilizacije (slika 22)
vidimo, da se je največ encima zamrežilo pri uporabi obarjalnega reagenta etanola, in sicer
80,9 %. Najmanj encima se je zamrežilo pri uporabi obarjalnega reagenta amonijevega
sulfata, kjer je bila učinkovitost imobilizacije samo 36,5 %. Aktivnost zamreženih skupkov je
bila precej nizka, in sicer najvišja pri uporabi obarjalnega reagenta propanola (55,5 %) in
najnižja pri uporabi obarjalnega reagenta acetona (2,2 %).
Slika 21: Prikaz produkta sinteze CLEAs ob uporabi različnih obarjalnih reagentov
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
52
Slika 22: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z uporabo različnih
obarjalnih reagentov
5.4.2. Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih
encimskih skupkov
V naslednjem koraku smo primerjali aktivnosti resuspendiranega encima in aktivnost
sintetizirane CLEAs (uporaba 1% GA, obarjalni reagenti: aceton, metanol, etanol, propanol,
2-propanol, amonijev sulfat). S slike 23 je razvidno, da so aktivnosti nezamreženega
resuspendiranega encima pri uporabi vseh obarjalnih reagentov višje, kot so aktivnosti
sintetiziranih CLEAs. Aktivnosti resuspendiranega encima po obarjanju so med 78 in 85 %,
medtem ko so aktivnosti CLEAs precej različne, od 2 do 55 %. CLEAs z najnižjo aktivnostjo
(2,2 %) smo sintetizirali z obarjalnim reagentom acetonom, CLEAs z najvišjo aktivnostjo
(55,5 %) pa z obarjalnim reagentom propanolom. Razlaga za tako veliko odstopanje
aktivnosti med resuspendiranim encimom in CLEAs je v tem, da so pri nezamreženem
encimu vsa prosta aktivna mesta lahko dostopna za reakcije, medtem ko se pri zamreženju
encima nekatera prosta aktivna mesta skrijejo v notranjost encimskih agregatov in zato ta
aktivna mesta ne morejo sodelovati v reakcijah.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
53
Med reagenti, kjer smo dobili oborino v fazi obarjanja, imamo več spojin, ki sodijo v skupino
alkoholov. Zanimalo nas je, ali obstaja kakšna povezava med številom C-atomov v verigi
alkohola in aktivnostjo CLEAs. Ali je CLEAs z uporabo alkohola z več C-atomi aktivnejša
kot CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta alkohola z manj C-atomi? Pri primarnih alkoholih
vidimo, da aktivnost CLEAs upada od verige z več C-atomi do verige z manj C-atomi
(propanol > etanol > metanol). V primeru uporabe sekundarnega alkohola kot obarjalnega
reagenta je aktivnost CLEAs nižja kot pri uporabi primarnih alkoholov (slika 23).
Slika 23: Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo CLEAs ob uporabi
različnih obarjalnih reagentov
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
54
5.4.3. Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost
ob uporabi različnih obarjalnih reagentov
Slika 24: Vpliv večkratne uporabe CLEAs na preostalo aktivnost ob uporabi različnih
obarjalnih reagentov
Na sliki 24 abscisa prikazuje število ponovitev reakcij, ordinata pa prikazuje preostalo
aktivnost CLEAs v U/mL encima. Na sliki 24 so prikazane preostale aktivnosti CLEAs, ki
smo jih pripravili z uporabo različnih obarjalnih reagentov, kjer je bila začetna koncentracija
GA 1%. Raztopino prostega encima smo pripravili tako, da smo v 900 µL odpipetirali 100 µL
raztopine celulaze.
Trdimo lahko, da so zamreženi encimski skupki z izbranimi obarjalnimi reagenti stabilni, saj
preostala aktivnost postopoma upada. Z uporabo obarjalnega reagenta propanola smo
sintetizirali CLEAs z najvišjo aktivnostjo, vendar ta CLEAs ni tako stabilna kot so CLEAs, ki
smo jih sintetizirali z ostalimi obarjalnimi reagenti, saj preostala aktivnost CLEAs z uporabo
propanola upada hitreje v primerjavi z drugimi CLEAs. Stabilnejši sta CLEAs z uporabo
metanola in etanola, kjer aktivnost CLEAs upada postopoma in ni tako velikih sprememb v
preostali aktivnosti CLEAs, kot pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola.
Preostala aktivnost se je po več reakcijah najmanj spremenila pri uporabi obarjalnega reagenta
metanola, kjer je preostala aktivnost po 10. reakciji upadla iz 1,6 U/mL encima na 0,7 U/mL
encima.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
55
V tabeli 5 so zapisane razpolovne dobe sintetiziranih CLEAs. Razpolovni čas oziroma
razpolovna doba je določanje postopnega razpadanja snovi. To je čas, v katerem se aktivnost
vzorca zniža za ½ začetne vrednosti.
Tabela 5: Razpolovna doba CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov
Obarjalni reagent Razpolovna doba
CLEAs etanol 8. cikel
CLEAs metanol 8. cikel
CLEAs propanol 7. cikel
CLEAs amonijev sulfat 6. cikel
5.4.4. Opazovanje in primerjanje velikosti CLEAs z uporabo različnih obarjalnih
reagentov pod optičnim mikroskopom
Po končanem postopku zamreženja encimskih skupkov smo ugotovili, da se CLEAs med
seboj razlikujejo po barvi in obliki skupkov. Odločili smo se, da CLEAs, pripravljene z
različnimi obarjalnimi reagenti, pogledamo pod optičnim mikroskopom (tabela 6) in jim
določimo povprečno velikost delcev.
Pri uporabi metanola kot obarjalnega agensa najdemo tako majhne kot velike agregate.
Večina agregatov meri približno 80 µm. CLEAs, sintetizirane z uporabo metanola kot
obarjalnega reagenta, so precej krhke in jih lahko brez problemov ločimo.
Pri CLEAs, kjer smo uporabili etanol kot obarjalni reagent, so dobljeni zamreženi skupki
približno enake velikosti in merijo v povprečju 43 µm. Po obliki in barvi sta CLEAs z
uporabo obarjalnih reagentov etanola in metanola precej podobni. CLEAs z uporabo
obarjalnega reagenta etanola je krhka in lahko skupke brez problema ločimo in zdrobimo.
Propanol je edini obarjalni reagent, kjer v povprečju opazimo enakomerno velikost agregatov.
Po obliki agregatov se CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola razlikuje od vseh
ostalih po zvezdasti obliki delcev.
CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola ima tako kot CLEAs z uporabo
obarjalnega reagenta propanola bolj zvezdasto obliko delcev, vendar je razlika v tem, da so
pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola prisotni tudi večji agregati.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
56
Zamreženi encimski skupki so pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta acetona krhki in jih
lahko zdrobimo in ločimo, medtem ko agregate pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
amonijevega sulfata težko ločimo, zaradi njihove čvrstosti. Oblika delcev je pri uporabi
obarjalnega reagenta acetona bolj zaobljena kot pri uporabi obarjalnih reagentov propanola in
2-propanola.
Tabela 6: CLEAs z uporabo različnih obarjalnih reagentov, gledana pod optičnim
mikroskopom
OBARJALNI REAGENT: SLIKA: POVPREČNA DOLŽINA
DELCA (µm):
Metanol:
87
Etanol:
43
Propanol:
26
2-propanol:
161
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
57
V tabeli 7 so v vrstnem redu po velikosti zapisane povprečne velikosti CLEAs, ki smo jih
sintetizirali z uporabo več obarjalnih reagentov. Najmanjše agregate smo izmerili pri CLEAs
z uporabo obarjalnega reagenta propanola, največje delce pa smo izmerili pri CLEAs z
uporabo obarjalnega reagenta 2-propanola.
Tabela 7: Povprečna velikost delcev CLEAs pri uporabi različnih obarjalnih reagentov
Iz rezultatov v tabeli 7 lahko ugotovimo, da CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta etanola
in CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta acetona sestavljajo agregati približno enake
velikosti. Velikost skupkov CLEAs se pri omenjenima obarjalnima reagentoma zelo malo
razlikuje. Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola dobimo najmanjše in najbolj
enakomerne skupke. Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta metanola in obarjalnega
reagenta 2-propanola pa najdemo agregate različnih velikosti. Iz tega bi lahko sklepali, da bo
imela CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta propanola najvišjo aktivnost, zaradi
enakomerne sestave agregatov.
Aceton:
46
propanol < etanol < aceton < metanol < 2-propanol
26µm < 43µm < 46µm < 87µm < 161µm
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
58
CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata:
Pri CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata nam ni uspelo določiti
velikosti posameznih delcev, ker smo dobili kot produkt en velik sprijet agregat (slika 25),
vendar smo kljub takšni strukturi določili z aktivnostnim testom dokaj visoko aktivnost
CLEAs.
Slika 25: CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta amonijevega sulfata, kjer smo dobili velik in
sprijet agregat.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
59
5.5 . VPLIV KONCENTRACIJE MREŽNEGA POVEZOVALCA (GA)
Zanimal nas je vpliv koncentracije GA na učinkovitost imobilizacije in aktivnost CLEAs z
uporabo različnih obarjalnih reagentov. Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: etanol,
metanol, propanol in amonijev sulfat. Za sintezo CLEAs smo potrebovali: pufer PBS, začetni
Vcelulaze = 100 µL, konc. albumina γ = 17 mg/mL, VPEHA = 200 µL, Vobar.reagenta = 900 µL,
VNaBH3CN = 100 µL, konc. GA pa smo spreminjali.
5.5.1. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
metanola
Pri CLEAs z obarjalnim reagentom metanolom smo uporabili naslednje začetne koncentracije
GA: 0,25 %, 0,375 %, 0,5 %, 1 % in 2 %. CLEAs z najvišjo aktivnostjo je bila pri začetni
koncentraciji GA 0,375 %, kjer je bila aktivnost CLEAs 62 %. Kljub najvišji aktivnosti
CLEAs je bila učinkovitost imobiliziranega encima le 69 %. Najvišjo učinkovitost
imobiliziranega encima 79 % smo dobili pri 2 % začetni koncentraciji GA. Kljub najvišji
učinkovitosti imobilizacije smo pri 2 % začetni koncentraciji GA sintetizirali CLEAs z
najnižjo aktivnostjo 10 %. Najnižja učinkovitost imobilizacije (66 %) je bila pri dodatku 0,25
% GA. Slika 26 nam prikazuje učinkovitost imobilizacije in aktivnost CLEAs v odvisnosti od
začetne koncentracije GA.
Slika 26: Primerjava aktivnosti CLEAs in učinkovitosti imobilizacije z obarjalnim reagentom
metanolom v odvisnosti od koncentracije GA
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
60
5.5.2. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
etanola
Aktivnost CLEAs z obarjalnim reagentom etanolom je bila najvišja pri uporabi začetne
koncentracije GA 0,0625 %, in sicer 94 %. CLEAs je bila prav tako zelo aktivna pri začetni
koncentraciji GA 0,125 %, kjer je bila aktivnost 91 %. Z višanjem koncentracije GA aktivnost
CLEAs upada. V primeru, kjer je bila koncentracija GA nižja kot 0,0625 % pade aktivnosti
CLEAs iz 94 % na 20 %, ker je bila v tem primeru prenizka koncentracija GA in ta
koncentracija GA ni zadostovala za zamreženje encima. Učinkovitost imobilizacije je najvišja
pri uporabi 0,0313 % GA, in sicer 86 % in najnižja pri uporabi 0,25 % GA, kjer je bila
učinkovitost imobilizacije 63 % (slika 27).
Slika 27: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
etanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
61
5.5.3. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta
propanola
CLEAs, ki smo jo sintetizirali z obarjalnim reagentom propanolom (slika 28) je bila najbolj
aktivna (84 %) pri koncentraciji GA 0,125 %. Aktivnost zamreženih encimskih skupkov je
upadala med 0,125 % in 2 % koncentracijo GA (aktivnosti CLEAs se gibajo med 35 % in 84
%). Pri koncentracijah 0,125 % in 0,0625 % GA smo opazili, da se je aktivnost CLEAs
znižala s 84 % na 20 %. Učinkovitost imobilizacije je bila najvišja (82 %) pri uporabi 0,0625
% GA, kjer je bila aktivnost CLEAs najnižja (20 %). Pri uporabi 0,25 % GA smo opazili, da
sta bili aktivnost CLEAs in učinkovitost imobilizacije enaki. Pri koncentraciji GA 0,125 %,
kjer je CLEAs najbolj aktivna (84 %), je bila učinkovitost imobilizacije 78 %. Najnižja
učinkovitost imobilizacije (66 %) je bila pri uporabi 1 % GA.
Slika 28: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
propanolom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
62
5.5.4. Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo obarjalenga reagenta
amonijevega sulfata
Amonijev sulfat je edini izmed štirih obarjalnih reagentov, s katerimi smo sintetizirali
CLEAs, kateri spada med anorganske spojine. 95 % raztopino amonijevega sulfata smo
pripravljali pred vsako sintezo CLEAs. Pri uporabi 2,5 % GA smo sintetizirali najbolj aktivno
CLEAs, katere aktivnost je bila 55 %. Pri uporabi 3 % GA se je aktivnost CLEAs zniža s 55
% na 25 %. S slike 29 je razvidno da je aktivnost CLEAs z nižanjem koncentracije GA
upadala. Najnižja aktivnost CLEAs je bila pri dodatku 0,5 % GA, kjer je bila aktivnosti
CLEAs 7 %. Učinkovitost imobilizacije je bila najnižja pri dodatku 1 % GA in najvišja pri
dodatku 2,5 % GA.
Slika 29: Primerjava učinkovitosti imobilizacije in aktivnosti CLEAs z obarjalnim reagentom
amonijevim sulfatom v odvisnosti od koncentracije glutaraldehida
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
63
5.6. STABILNOST CLEAs Z NAJVIŠJO AKTIVNOSTJO
CLEAs z najvišjo aktivnostjo smo sintetizirali z uporabo obarjalnega reagenta etanola pri
dodatku 0,0625 % GA, kjer je bila aktivnost CLEAs 94 %. Želeli smo ugotoviti, kako stabilna
je CLEAs z najvišjo dobljeno aktivnostjo (94 %). Poskus stabilizacije smo izvedli tako, da
smo v enem dnevu izvedli čim več reakcij. Na sliki 30 vidimo, da se je preostala aktivnost
CLEAs najbolj znižala v 1. in 2. ciklu. Začetna aktivnost CLEAs je 94 % oziroma 8,92 U/mL
encima. Po 3. ciklu pade aktivnost na 2,542 U/mL encima, kar pomeni, da se je aktivnost
znižala za 71 %. S slike 30 prav tako razberemo, da se je znižala preostala aktivnost CLEAs iz
1. cikla (8,92 U/mL encima) v 6. cikel (1,273 U/mL encima) 86 %. Razpolovno dobo pri
CLEAs z uporabo obarjalnega reagenta etanola smo dobili po 2. ciklu.
Slika 30: Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnostjo
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
64
6. ZAKLJUČKI
Namen diplomske naloge je bil sintetizirati CLEAs iz encima celulaza Cellusoft Cellulase
(EC 3.2.1.4, Novozymes A/S Danska), kjer smo spremljali vpliv reakcijskih parametrov
(vpliv koncentracije GA pri sintezi CLEAs in vpliv obarjalnih reagentov na celulazo). Ker je
sinteza CLEAs sestavljena iz obarjanja in zamreženja, smo v prvi fazi uporabili različne
obarjalne reagente, kjer smo spremljali, ali je nastala oborina ali ne. Pri obarjanju smo morali
paziti, da izbrani obarjalni reagenti niso povzročili ireverzibilne denaturacije, saj se s tem
izgubi aktivnost nativnega encima. Uporabljeni obarjalni reagenti so bili: metanol, etanol,
propanol, 2-propanol, aceton, amonijev sulfat, tetrahidrofuran, DMSO, PEG (1500, 6000,
20000), kloroform, n-heptan, heksan, dimetileter, butanol, acetonitril in dekanol. Kot
zamrežitveni reagent smo uporabili glutaraldehid.
Sintezo CLEAs smo začeli z uporabo 1 % GA. Zraven aktivnosti nas je tudi zanimala
stabilnost sintetizirane CLEAs. Ugotovili smo, da CLEAs z najvišjo aktivnostjo ni nujno
najstabilnejša, kot smo dokazali pri CLEAs (obarjalni reagent propanol in uporaba 1 % GA),
kjer je bila aktivnost CLEAs 55 %. Dokazali smo, da upada preostala aktivnost CLEAs iz
cikla v cikel. Preostala aktivnost CLEAs je upadla s 4,7 U/mL encima na 1,4 U/mL encima po
10 ciklih. Najbolj stabilna CLEAs je bila pri uporabi 1 % GA in z uporabo obarjalnega
reagenta metanola, kjer je bila CLEAs 19 %. Preostala aktivnost je po 10 ciklih upadla z 1,6
U/mL encima na 0,7 U/mL encima. Iz tega smo sklepali, da bi lahko CLEAs (metanol, ϕGA= 1
%) v reakcijah uporabili še večkrat.
Ker se s spreminjanjem koncentracije GA spreminja tudi relativna aktivnost CLEAs, smo se
odločili, da spreminjamo koncentracijo GA z namenom, da sintetiziramo CLEAs z najvišjo
aktivnostjo. CLEAs z najvišjo aktivnostjo (94 %) je bila sintetizirana z uporabo obarjalnega
reagenta etanola in pri začetni koncentraciji GA 0,0625 %. Pri testu stabilnosti smo ugotovili,
da preostala aktivnost CLEAs upade z 8,92 U/mL encima na 1,3 U/mL encima. Razpolovna
doba je po 2.ciklu, kjer opazimo upad preostale aktivnosti z 8,92 U/mL encima na 4,95 U/mL
encima, kar pomeni padec aktivnosti za 55,5 % že po drugi reakciji.
V nadaljnjih raziskavah bi lahko dodatno raziskali vpliv reakcijskih parametrov na stabilnost
encima, tako, da bi bila najaktivnejša CLEAs tudi stabilnejša.
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
65
7. PRILOGE
UMERITVENA KRIVULJA – BRADFORD
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
66
TABELE Z REZULTATI:
Vpliv pufra na encim celulazo
Absorbanca (340 nm) Enote/mL encima
PBS 0,541 5,741
acetatni pufer 0,536 6,673
citratni pufer 0,526 6,554
Aktivnost resuspendiranega encima po obarjanju
Obarjalni reagent Absorbanca (340 nm) Enote/mL encima Aktivnost (%)
metanol 0,750 9,345 78,78
etanol 0,798 9,943 83,74
2-propanol 0,788 9,818 82,68
propanol 0,803 10,005 84,26
aceton 0,794 9,897 83,35
amonijev sulfat 0,755 9,410 79,25
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
67
Vpliv uporabe različnih obarjalnih reagentov na učinkovitost imobilizacije in aktivnost
zamreženih encimskih skupkov
Obarjalni reagent Absorbanca
(340 nm)
Enote/mL encima Učinkovitost
(%)
Aktivnost
(%)
metanol 0,248 3,093 73,3 18,88
etanol 0,238 2,965 80,9 33,27
2-propanol 0,086 1,067 77,8 8,97
propanol 0,594 7,401 65,83 55,5
aceton 0,021 0,262 74,43 2,2
amonijev sulfat 0,184 2,291 36,5 31,59
Primerjava aktivnosti resuspendiranega encima z aktivnostjo zamreženih encimskih
skupkov
Obarjalni
reagent
Abs res.
enc
(340 nm)
Enote/mL
enc
Akt. res.
enc (%)
Abs CLEAs
(340 nm)
Enote/mL
enc
Akt.
CLEAs
(%)
metanol 0,750 9,345 78,78 0,248 3,093 18,88
etanol 0,798 9,943 83,74 0,238 2,965 33,27
2-propanol 0,788 9,818 82,68 0,086 1,067 8,97
propanol 0,803 10,005 84,26 0,594 7,401 55,5
aceton 0,794 9,897 83,35 0,021 0,262 2,2
amonijev
sulfat
0,755 9,410 79,25 0,184 2,291 31,59
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
68
Proučevanje vpliva večkratne uporabe CLEAs na njegovo preostalo aktivnost ob
uporabi različnih obarjalnih reagentov
Ponovitev: CLEAs z
etanolom
CLEAs z
metanolom
CLEAs s
propanolom
CLEAs z
amonijevim
sulfatom
1 Absorbanca
(340nm)
0,224 0,127 0,374 0,213
Enote/mL encima 2,795 1,586 4,663 2,650
2 Absorbanca
(340nm)
0,219 0,105 0,356 0,182
Enote/mL encima 2,726 1,308 4,436 2,268
3 Absorbanca
(340nm)
0,211 0,096 0,333 0,158
Enote/mL encima 2,629 1,198 4,143 1,966
4 Absorbanca
(340nm)
0,205 0,100 0,318 0,134
Enote/mL encima 2,548 1,249 3,957 1,669
5 Absorbanca
(340nm)
0,157 0,083 0,257 0,108
Enote/mL encima 1,960 1,028 3,202 1,341
6 Absorbanca
(340nm)
0,145 0,070 0,209 0,119
Enote/mL encima 1,800 0,870 2,610 1,480
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
69
7 Absorbanca
(340nm)
0,168 0,088 0,223 0,100
Enote/mL encima 2,098 1,009 2,772 1,248
8 Absorbanca
(340nm)
0,135 0,067 0,179 0,09
Enote/mL encima 1,683 0,834 2,234 1,121
9 Absorbanca
(340nm)
0,083 0,062 0,162 0,054
Enote/mL encima 1,032 0,773 2,02 0,673
10 Absorbanca
(340nm)
0,096 0,054 0,109 0,059
Enote/mL encima 1,19 0,677 1,367 0,731
Optimizacija koncentracije GA pri sintezi CLEAs z uporabo različnih obarjalnih
reagentov
Obarjalni
reagent
Koncentracija
GA (%)
Absorbanca
(340 nm)
Enote/mL
encima
Aktivnost
(%)
Učinkovitost
(%)
metanol 0,25 0,354 4,793 35,47 65,74
0,375 0,595 7,414 61,66 69,65
0,5 0,517 6,446 48,89 77,53
1 0,248 3,093 18,88 75,27
2 0,109 1,362 9,63 79,27
etanol 0,0313 0,195 2,430 20,21 86,75
0,0625 0,907 11,296 93,95 78,05
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
70
0,125 0,879 10,952 91,09 72,00
0,25 0,759 9,139 79,9 63,2
0,5 0,555 6,914 45,58 80,9
1 0,238 2,965 33,27 77,45
2 0,262 3,258 23,04 78,22
propanol 0,0625 0,195 2,425 20,2 81,85
0,125 0,810 10,292 83,94 77
0,25 0,752 9,135 77,87 78,21
0,5 0,745 9,029 74,45 71,41
1 0,594 7,401 55,50 60,50
2 0,394 4,903 34,67 75,81
amonijev sulfat 0,5 0,079 0,982 6,94 54,84
1 0,184 2,291 31,59 36,5
2 0,578 7,208 50,97 53,22
2,5 0,530 6,604 54,92 60,74
3 0,273 3,498 24,52 57,10
Stabilnost CLEAs z najvišjo aktivnstjo 94% (CLEAs z etanolom in ϕGA = 0,0625 %):
Cikel 1 2 3 4 5 6
Absorbanca
(340 nm)
0,7161 0,3961 0,2040 0,1633 0,1120 0,1022
Enote/mL
encima
8,920 4,935 2,542 2,035 1,396 1,273
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
71
8. LITERATURA
1 http://sl.wikipedia.org/wiki/Biotransformacija, dostopano 16. februar 2015
2
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/whatis.htm, dostopano 16.
februar 2015
3
SHELDON, RA., Schoevaart R, Van Langen L., A novel method for enzyme
immobilization; Biocat. Biotrans, 2005
4 GUISAN Jose M, Immobilization of enzymes and cells, 2006, 2. izdaja
5
TISCHER Wilhelm, WEDEKIND Frank, Immobilized enzymes: Methodes and
apllications, 2000
6 http://www.hindawi.com/journals/er/2011/468292/fig1/, 1. marec 2015
7 ARORA Dilip K., Handbook of Fugal Biotechnology, 2004, 2. izdaja
8 http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/entrap.htm, 1. marec 2015
9
CAO Lingiu,Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design,
2005
10
CAO L., VAN LAGEN L., SHELDON R. A., Current Opinion in Biotechnology:
immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free?, 2003
11 http://www-06.all-portland.net/bst/035/1583/0351583.pdf, dostopano 1. marec 2015
12 http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageServic
e.svc/ImageService/Articleimage/2014/RA/c3ra45991h/c3ra45991h-f6_hi-res.gif, 1.
marec 2015
13
ILLANES A., Enzyme Biocatalysis, Principles and Applications, 2008
14 http://en.wikipedia.org/wiki/Cross-linked_enzyme_aggregate#cite_ref-2., dostopano
15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224412001100, dostopano 1.
marec 2015
16
BOYER, Rodney F., Temelji biokemije, Študentska založba 2005, 2. izdaja
17 http://mandevillehigh.stpsb.org/teachersites/laura_decker/enz_rxn_graphs_files/image002
.j pg., dostopano 1. marec 2015
18
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, dostopano 1. marec 2015
19 E. Adam Golan, Cellulase: Types and Action, Mechanism and Uses, 2011
20 TAVČAR Petra F., Celulaze: Osnovni postopki priprave tekstilij na plemenitenje, 2. del,
2001
Vpliv parametrov na sintezo CLEAs iz encima celulaza
72
21 http://www.c2biotechnologies.com/C2B_images/cellulase_enzyme.png, 1. marec 2015
22 G.P.Ellis, G.B.West, Progress in medicinal chemistry 13, 1976
23 Earl B. Whipple, Michael Ruta., „Structure of Aqueous Glutaraldehyde“ J. Org. Chem,
let. 1974
24
PATNAIK Pradyot, A Comprehensive Guide to the Hazardous Properties of Chemical
Substances, 2007, 3. izdaja
25
AEHLE W., WEINHEIM, Enzymes in Industry: Production and Applications, 3. izdaja,
2007 26
http://sl.swewe.net/word_show.htm/, dostopano 3. marec 2015
27 http://wtt-pro.nist.gov/wtt-pro/index.html?cmp=ammonium_sulfate, dostopano 3. marec
2015
28
http://sl.wikipedia.org/wiki/Pufer, dostopano 1. marec 2015.
29 MEYERS A. R., Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk
Reference, 1995
Curriculum vitae
73
DELOVNE IZKUŠNJE
(marec – oktober) 2013
Raziskava za praktični del v okviru diplomske naloge
Univerza v Mariboru, FKKT, Smetanova ulica 17, 2000 MB
▪ Priprava CLEAs in potrebnih raztopin, določanje aktivnosti katalizatorja, učinkovitosti imobilizacije in stabilnosti CLEAs
IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE
2008- 2015 Univerzitetni diplomirani inženir kemijske tehnologije
Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Slovenija
▪ Osvojeno znanje s področij biokemije, mikrobiologije, encimske kinetike, anorganske, organske, analizne in fizikalne kemije.
2004- 2008 Gimnazijski maturant
Prva gimnazija Maribor, Slovenija
.
1996- 2004 Osnovna šola Borisa Kidriča
OŠ Borisa Kidriča, Maribor, Slovenija
KOMPETENCE
Računalniške kompetence
Dobro poznavanje Microsoft Office™: Microsoft PowerPoint™, Microsoft Word™, Microsoft Excel™ .
OSEBNI PODATKI MAŠA PETKO
Kardeljeva cesta 77, 2000 Maribor
02/ 33 14 771
Spol: ženski | Datum rojstva: 10.04.1989 | Državljanstvo: slovensko
(oktober – november) 2012
Dvomesečna strokovna praksa
Univerza v Mariboru, FKKT, Smetanova ulica 17, 2000 MB
▪ Naloga je bila spoznati se z delom v laboratoriju. Določali smo aktivnost katalizatorja in učinkovitost imobilizacije. Delali smo z visokotlačnim reaktorjem in SCCO2.
Materni jezik slovenski jezik
Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE
Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno
sporazumevanje Govorno sporočanje
angleški B2 B2 B2 B2 B2