UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA
VIROLOGIA GENERALE
Replicazione virale
Classificazione e struttura
Patogenesi virale
Diagnosi delle infezioni da virus
Farmaci antivirali
“…a piece of bad news enwrapped in a protein coat”
(D. Baltimore)
1500 AC: prime evidenze della presenza di virus
Primo virus identificato: foot and mouth disease
(picornavirus), 1898
segni sul viso:
vaiolo
deformità della gamba:
poliomielite
COSA SONO I VIRUS?i virus sono....
• Mancano dell'informazione genetica che codifica l'apparato
necessario per la generazione di energia metabolica (ATPasi)
o per la sintesi di proteine (ribosomi) e sono quindi
assolutamente dipendenti dalla cellula ospite per queste
funzioni
• Si tratta di particelle prodotte dall'assemblaggio di
componenti preformati: non crescono e non si dividono
(gli altri organismi aumentano la somma dei propri componenti
e poi si replicano per divisione)
• Possono infettare animali, piante e batteri
.... parassiti endocellulari obbligati
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10
1 cm 1 mm 1 mm 1 nm 1 Å
cellule
animali batteri virus proteine atomi
microscopio ottico
microscopio elettronico
raggi-X
NMR
DIMENSIONI RELATIVE DI VIRUS E BATTERI
LE DIMENSIONI VARIANO
da 20-30nm a 300nm
(1nm è uguale a 10-6mm
= un milionesimo di mm)Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Microbiology 5th Ed. 1997
1.0 mm
al microscopio:
al microscopio ottico si
osservano le cellule infette
al microscopio elettronico si
osservano le particelle virali
I VIRUS SONO ORGANISMI SUB-CELLULARI
ESSENZIALMENTE COSTITUITI DA:
• ACIDO NUCLEICO
• INVOLUCRO PROTEICO (CAPSIDE)
ALCUNI HANNO UN RIVESTIMENTO ESTERNO
CHIAMATO
• ENVELOPE o MANTELLO o PEPLOS o PERICAPSIDE
Le particelle virali o “virioni” presentano in superficie
antirecettori che riconoscono i recettori sulle cellule
bersaglio
STRUTTURA DEI VIRUS
CAPSIDE
(proteico)
VIRIONE
RIVESTIMENTO
CORE
INTERNO
ENVELOPE
(lipidico)
AC. NUCLEICO
PROTEINE
(enzimi)
ACIDO NUCLEICO
strettamente impacchettato nel capside:
• RNA oppure DNA
• a singola catena o a doppia catena
• nonsegmentato o segmentato
• lineare o circolare
• associato a ioni + o a proteine basiche (virali o cellulari) per neutralizzare le cariche negative dei gruppi fosfato
PROTEINE VIRALI
Si distinguono:
• Proteine funzionali che permettono ad es. all’acido
nucleico virale di replicarsi (DNA- o RNA-polimerasi)
• Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle
virali come costituenti del capside o come strutture
particolari (es. le emoagglutinine) presenti
nell’envelope
• Proteine strettamente associate agli acidi nucleici
• Proteina di matrice o proteina M nei virus con
envelope sono le proteine con funzione strutturale, situate
proprio al di sotto dello strato fosfolipidico•Bersaglio di farmaci antivirali come amantadina e
•rimanatadina
CAPSIDE (RIVESTIMENTO PROTEICO)
Funzione: protezione,
riconoscimento recettori,
Struttura: strutture regolari a
partire da subunità irregolari
Definisce la SIMMETRIA: binaria,
elicoidale, icosaedrica,
complessa
Le forze che legano insieme i
protomeri sono non covalenti.
SIMMETRIA:
Le proteine del capside
caratterizzano la
simmetria :
• cubica o icosaedrica
• elicoidale
• complessa
• binaria
Simmetria CUBICA
o ICOSAEDRICA:
ICOSAEDRO: figura solida con
• 20 facce identiche (triangoli
equilateri)
• 12 vertici
• 30 spigoli
simmetria rotazionale 5:3:2Vertici, facce spigoli
Simmetria CUBICA
o ICOSAEDRICA
• Le unità strutturali proteiche
(protomeri) si dispongono in
raggruppamenti simmetrici detti
CAPSOMERI.
• Disposizione spaziale dei
protomeri in modo da formare
un solido regolare cavo che più
si avvicini alla sfera:
un ICOSAEDRO
• 3 assi di simmetria rotazionali
passanti al centro dell’icosaedro.
• PENTONI (5 protomeri) ai VERTICI
• ESONI (6 protomeri) sulle FACCE
Adenovirus
Simmetria ELICOIDALE
• I protomeri non si
raggruppano in
complessi, ma si
dispongono con un
andamento a spirale per
formare il capside
cilindrico nella cui cavità
si trova l’acido nucleico
• Questa simmetria ha un
solo asse di simmetria
rotazionale che coincide
con l’asse longitudinale
del cilindro
acido nucleico
proteine
Paramyxovirus umano tipo 1
Simmetria
COMPLESSA
è la simmetria dei
Poxvirus (forma a
mattone) e dei
Rhabdovirus (forma
a proiettile)
Simmetria BINARIA
è la simmetria dei fagi
(virus batterici)
MANTELLO
• è presente su tutti i virus a
simmetria elicoidale ed in
alcune famiglie con capside
a simmetria icosaedrica
(herpes, hepadna,
togavirus(RNA+),
retrovirus (RNA+)
• natura chimica del mantello:
lipidica o glicolipidica
• i virus acquisiscono il
mantello nella fase tardiva
del ciclo d’infezione, dopo
l’assemblaggio del
nucleocapside
Il mantello origina dalla:
• membrana nucleare
(herpes)
• membrana citoplasmatica
(virus a RNA)
Sul mantello sono presenti
GLICOPROTEINE virali come
l’emagglutinina (HA)
che permettono
l’adsorbimento
del virione sulle
cellule sensibili HIV gemmante
CAPSIDE NUDO(HPV,poliovirus )
Proprietà
Resistente a:
alte temperature, acidi, detergenti,
essiccamento
E’ rilasciato dalla cellula per lisi
Conseguenze:
Facilmente diffuso (su oggetti, da
una mano all’altra, con la polvere
o piccole gocce d’acqua)
Può essere essiccato e
mantenere l’infettività
Può sopportare le diverse
condizioni dell’intestino
Può resistere ai detergenti e alle
acque di scolo trattate
blandamente I virus con envelope sono
più fragili (in genere…)
CAPSIDE CON ENVELOPE:
Proprietà
Distrutto da: acidi, detergenti,
essiccamento, calore
Modifica le membrane cellulari durante
la replicazione (fusione)
E’ rilasciato per gemmazione, talvolta
per lisi cellulare
Conseguenze:
Deve rimanere in ambiente umido
Si diffonde con gocce d’ acqua,
secrezioni, trapianti d’organi e
trasfusioni di sangue
Non sopravvive nel tratto gastro-
intestinale
Non uccide necessariamente la cellula
per diffondersi
From Principles of Virology Flint et al ASM Press
virus ad RNA
HAV polio
rinovirus ,
•
•Rosolia
dengueMorbillo
parotite
Virus ad RNA
Picorna
Calici
Norwalk
Toga
Flavi
Corona
Rhabdo
Paramyxo
Bunya
Arena
ReoRotavirus
subclinical Retro
Virus ad RNA e struttura del loro genoma
Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del
genoma ed alla morfologia del virione
(RNA+) (RNA -) (RNA +/-) (RNA +
via DNA)
(N) (E) (E) (E)(Doppio capside)
Orthomyxo
(Morbillo -Virus respiratorio sinciziale)
•Genome:
•Segmented, d/s RNA
Infections cause endemic/epidemic gastroenteritis and
infantile diarrhoea is an a important cause of death in the
developing world:
•Reovirus-Rotavirus
Virus a DNA
Pox Herpes Hepadna Parvo
Adeno
Virus a DNA
Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del
genoma ed alla morfologia del virione
Papova
Rivestiti Con capside nudo
Classificazione tassonomica dei virus
Criteri:
• acido nucleico (DNA o RNA)
• simmetria del capside (icosaedrica, elicoidale, complessa)
• envelope (si o no)
• architettura del genoma
• modalità replicative
• polimerasi associata al virione
• diametro virione (nm) e numero
dei capsomeri
• dimensioni genoma (kb)
herpesviridae
betaherpesvirinae
cytomegalovirus
International Committee on Taxonomy of Viruses
(ICTV)
Classificazione tassonomica dei virus
per esempio:
Nuovi ceppi virali possono originare dal ceppo
parentale o selvatico per mutazioni
Nuovi ceppi possono emergere anche per:
• ricombinazione (tra virus a DNA come HSV1 e 2)
• riassortimento (virus influenzali)
Denominazione dei virus
STRUTTURADIMENSIONI, MORFOLOGIA E TIPO DI ACIDO NUCLEICO
ad es.: PICORNAVIRUS = PICCOLI VIRUS AD RNATOGAVIRUS = VIRUS CON MANTELLO
CARATTERISTICHE BIOCHIMICHESTRUTTURA E TIPO DI REPLICAZIONE (SISTEMA CORRENTE PER LA CLASSIFICAZIONE TASSONOMICA DEI VIRUS)
MALATTIEad es.: VIRUS DELLE ENCEFALITI, VIRUS DELLE EPATITI
CELLULA OSPITE (SPETTRO D’OSPITE)ANIMALI (uomo, topo, uccelli),
TESSUTO OD ORGANO (TROPISMO)ad es.: ADENOVIRUS, ENTEROVIRUS
TIPO DI TRASMISSIONEad es.: ARBOVIRUS VIRUS = ARTHROPOD-BORNE VIRUS( enc )
FASI DELLA REPLICAZIONE VIRALE
1. RICONOSCIMENTO della cellula target
2. ADSORBIMENTO
3. PENETRAZIONE
4. DENUDAMENTO
5. SINTESI MACROMOLECOLARI
(mRNA precoci e proteine non strutturali
- REPLICAZIONE DEL GENOMA –
mRNA tardivi e proteine strutturali)
6. ASSEMBLAGGIO
7. RILASCIO
PERIODO
DI
ECLISSI
Nel ciclo di replica virale c’è una
1. Fase precoce
• Riconoscimento
• Penetrazione
• Rilascio del genoma
2. Fase tardiva
• replica
• sintesi macromolecolari
• assemblaggio
• rilascio Ogni cellula infetta può produrre fino a100000 particelle virali ma solo 1-
10% sono dotate di infettività
EBV: gp220-gp350
HIV: gp120
Influenza HA
Morbillo(paramyxovirus) H
Rhinovirus(picornavirus):VP1
-VP2-VP3 ( VP4 è interna)
CR2 (CD21)(Tand B
cells) - C3dR
CD4
Gp contenenti acido
sialico
CD46 ( B cells)
ICAM-1 cellule
epiteliali
RECETTORI CELLULARI
A) RICONOSCIMENTO-ATTACCO
Contatto virus-cellula (spettro d’ospite)
La cellula bersaglio suscettibile definisce il tropismo tissutale
ANTIRECETTORI VIRALI (viral attachment protein: VAP)
Virus senza mantello:
internalizzazione mediante:
a) endocitosi (o viropessi, mediata da clatrina, pH
neutro o acido) e trasferimento all’interno del
citoplasma in una vescicola endocitica
b) fagocitosi
B) PENETRAZIONE
VIRUS SENZA MANTELLO : PICORNAVIRUS
Molte proteine usate come recettori appartengono alla
superfamiglia delle Immunoglobuline
(ICAM = intracellular adhesion molecule).
Il Poliovirus si lega solo al recettore PVR( poliovirus
recettore) o CD155 espresso dai primati che ne determina
così lo spettro d’ospite
Virologia
generale• B) Penetrazione
• Virus senza mantello:
• a) adsorbimento
• Virus con mantello.
• A) per fusione dell’inviluppo
lipoproteico con la membrana
cellulare esterna
• azione delle
proteasi sul
capside proteico
• azione degli enzimi
lisosomiali sulle
strutture proteiche
• resistenza degli
acidi nucleici agli
enzimi nucleolitici
cellulari
(DNasi, RNasi).
C) DENUDAMENTO
•Virus a DNA (bicatenario)( Herpes virus)
•Utilizza trascrittasi virale
•L’assemblaggio avviene nel nucleo
•(Poxvirus si replicano nel citoplasma)
Genoma a RNA monocatenario positivo ( picornavirus
togavirus) che funziona da messaggero.
Genoma a RNA monocatenario negativo ( orthomyxovirus
paramyxovirus)
utilizzano trascrittasi virali
L’assemblaggio avviene nel citoplasma
•Genoma a RNA(2 molecole identiche)( HIV) viene
trascritto in DNA da una polimerasi virale ( DNA
polimerasi RNA dip) l’assemblaggio avviene nel citoplasma
D) ECLISSI
Sintesi delle
macromolecole virus
specifiche che consta
in 3 fasi:
1) trascrizione del
genoma virale in
mRNA
2) traduzione dei
messaggeri virali
in proteine
3) replicazione del
genoma virale
• la fase di eclissi dura per un periodo che va
da minuti a ore e dipende del tipo di virus .
In questa fase i virioni , perdendo la loro
integrità strutturale sembrano scomparire
alle comuni indagini immunologiche e
virologiche .
Per la replica del genoma occorre
DNA polimerasi - DNA dipendente
La trascrizione avviene nel nucleo
Per la sintesi dei mRNA viene usata
RNA polimerasi II - DNA dipendente cellulare
la replica del DNA virale avviene analogamente alla
replica del DNA cellulare
• i virus piccoli utilizzano la polimerasi cellulare
• i virus grandi codificano per una polimerasi virale
(adenovirus, herpesvirus)
Virus a DNA
Il genoma a RNA può essere:
• a RNA+ (cioè come un mRNA)
• a RNA- (cioè come un template per mRNA)
La trascrizione avviene nel citoplasma
Il genoma virale deve codificare per
la polimerasi
RNA polimerasi - RNA dipendente virale
Virus a RNA
. Virus a RNA+:
è come un mRNA, si lega ai ribosomi
per la sintesi delle proteine
C’è un intermedio a RNA-( stampo) per
la replicazione del genoma
enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente
. Virus a RNA-
: sulla sua base vengono sintetizzati gli
mRNA che codificano per le proteine
virali
C’è un intermedio a RNA+( stampo) per
la replicazione del genoma
enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente
E) ASSEMBLAGGIO
• assemblaggio delle copie del genoma virale e delle differenti proteine strutturali per formare i nuovi virioni
• tutti i virus a RNA si assemblano nel citoplasma delle cellule infettate
• i virus a DNA si assemblano nel nucleo tranne i Poxvirus (citoplasma)
F) LIBERAZIONE
Acquisizione del mantello:
in genere dalla membrana
cellulare
• herpesvirus (foglietto interno
della membrana nucleare)
liberazione:
la liberazione dei virus con
mantello avviene per
gemmazione
la liberazione dei virus senza
mantello avviene per
esocitosi
Retrovirus: l’RNA+ è convertito in
DNA che si integra con quello cellulare e viene trascritto come un gene cellulare
enzima: DNA polimerasi - RNA dipendente
o TRASCRITTASI INVERSA
PATOGENESI VIRALE
è il processo tramite il quale
l’infezione virale porta alla
malattia
INFEZIONE
Ingresso del virus nell’organismo
senza sintomi o con sintomi transitori locali
MALATTIA
il virus raggiunge gli organi target e
causa segni e sintomi associati
della malattia
Infezione / malattia
L’esito di un’infezione virale è determinato:
• dalla natura dell’interazione virus-ospite
• dalla risposta immune dell’ospite
• il ceppo virale
• la consistenza dell’inoculo
• Le condizioni generali di salute della persona
infettata determinano la gravità e la durata della
malattia
La risposta immune è uno dei fattori responsabili
della patogenesi di una infezione virale
Patogenesi delle infezioni virali:
a) impianto
b) diffusione
c) disseminazione
d) eliminazione
ingresso nell’organismo
iniziazione dell’infezione al sito primario
periodo d’incubazione (asintomatico o prodromi)
sintomi (organo bersaglio)
Virologia Generale
DIFFUSIONE DEL VIRUS
NELL’ORGANISMO
ORGANI
BERSAGLIO
Suscettibilità e
Permissività
INFEZIONE
DISSEMINATA
Malattie
(esantematiche) VIREMIA
SECONDARIA
VIREMIA
PRIMARIA
INFEZIONE
LOCALIZZATA
Virus influenzali, Virus enterici
REPLICAZIONE
PRIMARIA
PENETRAZIONE
REPLICAZIONE
SECONDARIA
• Cellula permissiva:
fornisce il complesso
biosintetico per sostenere
l’intero ciclo di replicazione
virale.
• Cellula non permissiva:
non permette la replicazione
di un particolare ceppo virale.
• Cellula semipermissiva:
quando è in grado di
sostenere alcune, ma non
tutte, le fasi della replicazione
virale.
TIPI DI INFEZIONE VIRALE A LIVELLO CELLULARE
TIPI DI INFEZIONE VIRALE:
1. abortiva (fallimento)
2. litica (morte cellulare)
3. persistente (infezione senza morte
cellulare)
Le infezioni persistenti comprendono le infezioni
3a. croniche (non litiche, produttive)
3b. latenti (sintesi di macromolecole, ma non di
nuovi virioni: ad es. herpes)
3c. ricorrenti
3d. trasformanti
Virologia Generale
PATOLOGIA VIRALE: progressione della malattia
• Infezione: il virus comincia a crescere nell’ospite
• Periodo di incubazione: periodo compreso fra l’infezione e la comparsa dei sintomi
• Fase prodromica: periodo di incubazione in cui possono manifestarsi sintomi non specifici
• Periodo acuto: picco della malattia e dei sintomi
• Periodo di declino: diminuzione dei sintomi, risoluzione dell’infezione
• Convalescenza: recupero
• Influenza
• Malattie da raffreddamento
• Herpes simplex
• Poliomielite
• Morbillo
• Rosolia
• Mononucleosi
• Rabbia
• Epatite A
• Epatite B
• AIDS
1-2 giorni
1-2 giorni
5-8 giorni
5-20 giorni
12-14 giorni
17-20 giorni
30-50 giorni
30-100 giorni
15-40 giorni
50-180 giorni
1-10 anni
Periodo d’incubazione delle più comuni infezioni virali
Infezioni persistenticondizione di parassitismo virale controllato
- produzione di Ag virali e di virus infettanti
• croniche (HBV, HCV)
INFEZIONI PERSISTENTI
= quando una cellula viene infettata, ma non uccisa, dal virus.
• possono essere infezioni latenti o trasformanti.
• infezioni latenti:herpesvirus
infezione primaria
fase di latenza
infezione riattivante
INFEZIONI
TRASFORMANTI:Virus oncogeni: alterazioni non
degenerative ma condizionanti la proliferazione anomala ed incontrollata delle cellule infette (trasformate).
Ad es: alcuni papillomavirus (HPV) possono inattivare delle proteine (p53, pRB105) che regolano il ciclo di replicazione delle cellule
DIFESE DELL’ORGANISMO CONTRO
LE INFEZIONI VIRALI
1. Barriere naturali anatomiche (epidermide, mucose)
2. Difese aspecifiche umorali (infiammazione, complemento
Interferon)
3. Difese aspecifiche cellulari (Cellule natural killer e
macrofagi)
4. Difese specifiche umorali (Anticorpi);
5. Difese specifiche cellulari (CTL e macrofagi).
6. Variabilità recettoriale (ad es: CCR5 variante allelica D32
e resistenza ad HIV)
INTERFERONE
Fattore che “interferisce” con la replicazione di molti virus
- prima difesa sia a livello locale che sistemico -
• blocco della replicazione virale nella cellula target
• attivazione dei linfociti T nel riconoscimento delle
cellule infettate
Type I
Type II
IFN-a
IFN-b
IFN-g
IFN-a B cells, monociti, macrofagi, DC immature
IFN-b fibroblasti
STATO ANTIVIRALE
gli IFN inducono la sintesi di due enzimi:
• 2’-5’ oligo-adenilato-sintetasi (2-5A)
• Proteina chinasi R (PKR)
RISULTATO:
blocco della sintesi proteica = no virus
IFN leucocitario
IFN fibroblastico
IFN-g T cells, NK IFN immune
INTERFERONE PRODOTTO DA:
Essendo “parassiti
endocellulari obbligati”
la propagazione dei
virus è possibile solo su
CELLULE VIVE
Possono essere
impiegati:
A) animali da
laboratorio
B) uova embrionate
di pollo
C) colture cellulari
A) Inoculazione negli
animali da laboratorio
è stato il primo metodo
usato per isolare i virus.
Nell’animale si osserva la
capacità del virus di
provocare la morte o di
produrre lesioni o sintomi
clinici evidenti.
L’inoculazione in animali
è stata usata soprattutto
per l’isolamento di virus
neurotropi.
B) Inoculazione in uova
embrionate di pollo
• Sono batteriologicamente sterili
e non sviluppano nessun
meccanismo immunitario.
• Le uova sono di 10-12 gg.
Le vie d’inoculazione sono:
• Membrana corion-allantoidea:
(virus vaiolo, vaccinico, herpes)
• Cavità amniotica:
(virus influenzale, parotitico)
• Cavità corion-allantoidea:
(vaccini anti-influenza).
• Sacco vitellino:
(Rickettsia, Chlamydia)
C) Colture cellulari
Vengono distinte in:
• colture primarie
• colture secondarie
• colture in linea continua
L’isolamento virale in colture cellulari è il metodo attualmente più usato in laboratorio
Terreni per colture cellulari esistono molte preparazioni:
RPMI 1640
MEM
Dulbecco-modified MEM (DMEM)
ISCOVE
….etc.
Composizione:
H2O, aminoacidi essenziali, vitamine, sali, glucosio, ormoni,
acidi grassi, fonti di carbonio, composti azotati
Deve essere sempre presenti:
• SIERO FETALE BOVINO (FBS) al 10%
• antibiotici ed antifungini per evitare inquinamento
• un indicatore di pH
La crescita cellulare fa variare il pH verso l’acido e il
terreno da rosso-arancio diventa giallo
Colture primarie:
Derivano da un o tessuto o da un
organo prelevato da un animale
(ad esempio rene, polmone, fegato)
Il materiale viene processato in
modo da avere cellule che vengono
risospese in terreno liquido e
inserite in una fiasca dove
aderiscono e formano un
monostrato cellulare
Le preparazioni devono essere fatte in
condizioni di sterilità!!
Colture secondariedopo 7-15 giorni le colture si invecchiano e
occorre fare un “trapianto”:
• dalle colture primarie si elimina il terreno liquido.
• si lava il tappeto con tampone fosfato (PBS) e poi si ricopre
con un velo di tripsina ed EDTA • si mantiene la coltura per pochi minuti a 37°C per far agire
la tripsina
• la sospensione viene raccolta e centrifugata a 1800
rpm/ x 3 min.
• si elimina il sovranatante ed il sedimento
è ridistribuito su altri contenitori
• sopravvivenza per 2-3 mesi
con trapianti settimanali
A seconda del tipo di cellule sono
possibili 30-50 TRAPIANTI,
poi la coltura muore
Colture in linea continua:
• Sono cellule modificate o trasformate
(poliploidi, aneuploidi, eteroploidi)
• Hanno perso l’inibizione da contatto
• Sono in grado di moltiplicarsi nel tempo
senza alcun limite, con trapianti settimanali
.Esistono migliaia di linee cellulari
di tutte le origini istologiche
(HeLa EP utero), Hep-2( ep laringe), KB
(oral carcinioma) , LLCMK2, MDCK ep
rene), etc.
• Vantaggi: si propagano in maniera indefinita e
conservano la vitalità per diversi anni se
congelate in azoto liquido (-196°C) una volta
sospese in glicerolo o in dimetilsulfossido
(DMSO).
1) Effetto citopatico
morte cellulare
arrotondamento cellulare
degenerazione
aggregazione
perdita dell’attacco al substrato
2) Cambiamenti delle
caratteristiche
istologiche
corpi inclusi nucleari,
citoplasmatici
La moltiplicazione di un agente virale in una coltura
cellulare può essere evidenziata in modi diversi:
3) Formazione di sincizi
cellule giganti
polinucleate causate dalla
fusione cellula-cellula.
4) Cambiamenti sulla
superficie cellulare
• Espressione degli Ag
virali
• Emoadsorbimento
5) Rilevamento di antigeni
virali mediante anticorpi
monoclonali marcati
con fluoresceina
6) Coltura rapida in
“SHELL-VIAL”
Centrifugazione del
campione su
monostrato cellulare
e immunofluorescenza
diretta dopo 24-48 ore
• Per la loro replica, i virus utilizzano le
strutture biosintetiche e gli enzimi della cellula
ospite: è difficile inibire la replicazione virale
senza provocare anche effetti tossici per la
cellula ospite
bersaglio degli antivirali:
le differenti fasi della replica
A) Attacco - Fusione
Distruzione del virione (Nonoxynol-9: detergente)
B) Penetrazione e Denudamento
C) Sintesi di RNA
D) Inibitori della DNA polimerasi
E) Trascrizione
F) Sintesi proteica
G) Biosintesi dei nucleotidi – analoghi
H) Recupero dei nucleotidi
L) Assemblaggio
I) Modificazione delle glicoproteine
A) Attacco
analoghi peptidici delle proteine
di adsorbimento -
destransolfato, eparina..,
Anticorpi neutralizzanti
Bloccano il legame tra
gp120 e CD4 (HIV)
Blocco del legame
al recettore
Enfuvirtide o T20 o Fuzeon®
Inibisce l’azione della proteina
di fusione GP 41 di HIV Blocco della
fusione
A) Attacco
Molecole che bloccano il
corecettore
(nel caso di HIV CCR5 o CXCR4)
Blocco del legame
al corecettore
recettore: CD4 corecettore: CCR5
per CCR5:
Maraviroc o Selzentry®
B) Penetrazione e
Denudamento
Amantadina e Rimantadina,
Tramantadina, Arildone.
Sono amine sintetiche
primarie che inibiscono la
replica virale legandosi alla
proteina della matrice M2 e
bloccando i canali protonici
L’attività antivirale limitata al
virus dell’influenza tipo A
Biosintesi dei nucleotidi:
analoghi nucleosidici
Ribavirina (--> RSV)
C) Sintesi di RNA
• IFN
• Poli I:C (induce IFN)
D) Replicazione del DNA
Inibitori della DNA polimerasi
• Analoghi nucleosidici:
ACICLOVIR - (HSV).
Agisce come analogo della
deossiguanidina trifosfato
• GANCICLOVIR, Adenosina
arabinoside, Citosina
arabinoside, Zidovudina,
Dideossinosina,
Dideossicitidina, Idossiuridina,
Trifluoridina.
E) Eclissi, Trascrizione
• interferone,
• poli I:C
F) Sintesi proteica
IFN-a e IFN-b
• Degradano l’mRNA virale e cellulare e viene bloccato il
legame dell’mRNA al ribosoma, impedendo la sintesi proteica
e la replicazione virale.
Usato soprattutto IFN alfa - PEGILATO: coniugato a PEG
(polietilenglicole) per lento rilascio
Impiegato nelle infezioni da:
virus epatite A, B, C (HAV, HBV, HCV), papillomvirus (HPV)
G) Biosintesi dei
nucleotidi: analoghi
nucleosidici
• ribavirina
• acyclovir
• gancyclovir
• AZT
H) Recupero dei
nucleotidi
timidina chinasi (analoghi
nucleosidici)
• Herpes, HIV, HBV
I) Modificazione delle glicoproteine
• anti-proteasi.
L) Assemblaggio
• inibitori delle proteasi
• indinavir, ritonavir, saquinavir….
attivi verso HIV (in HAART)
Blocco
dell’assemblaggio
Blocco
dell’esocitosi
Virologia generale
Oltre ai Virus “classici”, esistono altri agenti infettivi
studiati dalla virologia:
• Viroidi: piccole molecole di RNA circolare (200-400
nucleotidi), prive di capside e envelope. Associati
con alcune malattie delle piante. Sono parassiti
endocellulari obbligati
• Virusoidi: simili ai viroidi, ma più grandi, sono
molecole di RNA 'satellite' (circa 1000 nt). Per la loro
moltiplicazione dipendono dalla presenza di virus
che si replicano (da cui 'satellite'), e sono assemblati
nel capside virale come “passeggeri”. Presenti in
animali e piante, sono associated a malattia (virus
Delta epatite)
Virus: scoperta dei vaccini
On 14th May 1796, Edward Jenner used cowpox-infected material obtained from the hand of Sarah Nemes, a milkmaid from Berkley in Gloucestershire to vaccinate 8 year old James Phipps.On 1st July 1796, Jenner challenged the boy by deliberately inoculating him with material from a real case of smallpox !He did not become infected!