11. Analýza částic
Velikost částic
Příprava předmětu byla podpořena
projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
• Usazování je jednou z nejstarších metod pro určování velikosti
farmaceutických pevných látek v suspenzích nebo v proudu
vzduchu.
• Principem je rozdílná rychlost usazování částic podle jejich
hmotnosti a velikosti v kapalném nebo plynném mediu. Tuto
techniku lze použít také při zjišťování distribuce velikostí částic.
• Usazování sférické částice ve viskózním prostředí vlivem
gravitace se řídí Stokesovým zákonem.
• Pro prostředí s malými Reynoldsovými čísly (laminární proudění)
je rychlost usazování částic závislá na rozdílu hustoty prostředí
a částic, na viskozitě prostředí a velikosti částic.
2
Usazování
• Na částici působí gravitační sila Fg a vztlaková síla Fd.
• Mezní rychlostí je označován stav, kdy jsou Fg a Fd v rovnováze.
• Pro sférické částice, které mají stejnou hustotu, lze odvodit
následující vztah:
𝐹𝑔 =𝜋𝑑𝑠𝑡
3
6𝜌𝑆 − 𝜌𝑓 𝑔
dst je průměr částice
S je hustota pevné látky
f je hustota kapaliny
• Podle Stokesova zákona je vztlaková síla dána vztahem
𝐹𝑑 = 3𝜋𝜇𝑑𝑠𝑡
kde je viskozita prostředí a je relativní rychlost částice vzhledem
k médiu.
3
Usazování
• Za předpokladu Fg = Fd platí:
= t = 𝑑𝑠𝑡
2
18𝜇𝜌𝑆 − 𝜌𝑓 𝑔
• Z tohoto vztahu plyne, že mezní rychlost je funkcí druhé mocniny
průměru částice.
• Sedimentaci lze rozdělit na metody kumulativní a inkrementální
techniky.
• Kumulativní techniky spočívají v měření rychlosti usazování
částic, které je prováděno vážením částic v určité hloubce
v průběhu času.
• Inkrementální technika slouží ke stanovení změny koncentrace
nebo hustoty materiálu v určité hloubce v průběhu času. Při
těchto měření se používají rentgenové paprsky.
• Z důvodů snazší automatizace, rychlosti a přesnosti měření jsou
komerčně více rozšířeny inkrementální techniky měření.
4
Usazování
• Nejrozšířenější je RTG sedimentace (XGS). Tenký horizontální
svazek RTG záření měří částice v dané hloubce v průběhu času
a absorpce RTG záření je přímo úměrná koncentraci (hmotnosti)
částic s průměrem menším než dst spočteným podle Stokesovy
rovnice.
• Při sedimentaci je možné počítat pouze s jedinou hodnotou
hustoty částic, což způsobuje chyby měření velikosti částic
různého složení.
• Další chyby měření jsou způsobeny nepravidelným tvarem
částic, který ovlivňuje rychlost usazování.
• U měření malých částic (ve vodě 1 m) se uplatňuje Brownův
pohyb, což významně ovlivňuje měření.
• Dolní limit uváděný výrobci přístrojů je 0,2 m, avšak při měření
částic pod 1 m jsou měření zatížená velkou nejistotou.
• Koncentrační rozsah měření XGS je 1 – 5 % (w/V). 5
Usazování
• Nejrozšířenější metoda pro určení velikostí aerodynamických
částic.
6
Inerciální zaklínění
Schéma inerciálního zaklínění částic ve vznosu
• Při průtoku částic zařízením působí na částici dvě síly. První je
síla, která pohání částici kupředu a druhou silou je odpor
okolního vzduchu. Větší částice jsou usazovány a menší částice
pokračují v proudu vzduchu
• Pravděpodobnost dopadu částice na povrch je funkcí Stokesova
čísla, které nabývá hodnot 0 až 1. Čím je vyšší, tím
pravděpodobněji nastane depozice částice.
𝑆𝑡𝐾 =𝜌𝐶𝑉𝑑2
9𝜇𝐷𝑗
kde StK je Stokesovo číslo, je hustota částic, C je
Cunninghamův korekční faktor skluzu, V je rychlost, d je průměr
částice, viskozita kapaliny, Dj je průměr trysky.
7
Inerciální zaklínění
• Cunninghamův korekční faktor skluzu je dán vztahem:
𝐶 = 1 +1,6 ∗ 10−5
𝑑𝑝
• Vyjadřuje snížení střední dráhy letu částice v plynu.
• V praxi se používá StK50, což vyjadřuje 50% pravděpodobnost
depozice částice. Hodnota d50 odpovídá velikosti částic
𝑑50 =9𝜇𝐷𝑗
𝜌𝐶𝑉𝑆𝑡𝐾50
• Částice s velkým průměrem nebo vysoký průtok plynu zvyšují
pravděpodobnost depozice částic.
8
Inerciální zaklínění
• Dynamický rozptyl světla (DLS) neboli fotonová korelační
spektroskopie (PCS) neboli kvazielastický rozptyl světla (QELS).
• DLS je široce používanou technikou pro určení velikosti částic
menších než 1 m.
• K měření je požíván rozptyl laserového záření dopadajícího na
povrch částic pohybujících se Brownovým pohybem. Intenzita
rozptýlené záření měřená pod určitým úhlem závisí na difuzní
rychlosti částice, která souvisí s její velikostí.
• Difuzní koeficient (D) je popsaný Stokes-Einsteinovou rovnicí:
𝐷 = 𝑘𝐵𝑇
3𝜋𝑑
kde d je průměr částice, kB je Boltzmanova konstanta,
T je teplota, je dynamická viskozita rozpouštědla.
9
Dynamický rozptyl světla
• Pomocí DLS se měří hydrodynamický průměr částice, který
odpovídá průměru koule o stejném difuzním koeficientu jako má
měřená částice.
• V konvenčních DLS se rozptýlené záření snímá pod úhlem 90°.
Rozptýlené záření je převedeno na elektrický signál.
• Konečný výsledek ovlivňují především dva faktory. Prvním je
vzájemná interakce částic, která ovlivňuje jejich difuzní rychlost
a druhým je vícenásobný rozptyl. Z těchto důvodů je nutné
k měření používat vhodně zředěné vzorky.
• Tyto problémy lze částečně eliminovat snímáním rozptýleného
záření v úhlu 173°, což eliminuje vícenásobný rozptyl a umožňuje
měření roztoků o vyšších koncentracích.
• Zetasizer Nano umožňuje měřit částice v rozmezí 0,6 nm do
6 m.
10
Dynamický rozptyl světla
• Čítač jednotlivých částic (SPC) používá rozptýlené záření pro
určení počtu částic prošlých relativně malým objemem.
• Tyto čítače lze rozdělit na dva druhy, amplitudově závislé
a nezávislé.
• Amplitudově závislé čítače měří absolutní intenzitu rozptýleného
světla. Velikost částic se určí z Lorenz-Mieho teorie.
• Přístroj musí být kalibrován pomocí standardu.
• Používají se přístroje se dvěma štěrbinami různých šířek,
přičemž užší umožňuje měřit částice v rozsahu 0,5 až 2 m
a širší v rozsahu 3 m až několik set mikrometrů.
• Amplitudově nezávislé čítače – měření velikosti částic nezávisí
na intenzitě rozptýleného záření.
• Pro zjištění velikosti částic používají Dopplerovu metodu. Měří se
fázový rozdíl v rozptylu světla v minimálně dvou místech.
• Tímto způsobem lze měřit částice o velikosti 0,3 m do 8 mm
s přesností 5 %.
11
Čítač jednotlivých částic
• Povrch pevných látek může být definován jako:
a) viditelný nebo vnější povrch,
b) součet vnějších ploch neporézních částí,
c) celková plocha včetně pórů.
• Řada vlastností farmaceutických látek včetně biologické aktivity
může záviset na vlastnostech povrchu.
• Pro stanovení povrchových vlastností se proto používá řada
technik, například rtuťová porozimetrie, adsorpce plynu
a permeace plynu.
12
Měření velikosti povrchu
• Pro zjištění velikosti povrchu lze použít adsorpci inertních plynů
jako je dusík, helium nebo krypton, které vykazují BET izotermu.
• Principem metody je, že množství plynu absorbovaného na
povrch částic je přímo úměrné velikosti povrchu částice podle
následující rovnice
kde V je objem plynu absorbovaného na povrch při tlaku P, Vm
objem plnu adsorbovaného v monovrstvě, P0 je tlak nasycených
par za experimentální teploty, C je konstanta související
s entalpií adsorpce a kondenzace.
13
Adsorpce plynu
• Po vytvoření grafu závislosti P/V(P0-P) oproti P/P0 lze ze
součtu převrácené hodnoty směrnice této přímky a úseku
vypočítat Vm. Plochu vzorku lze spočítat podle následující
rovnice:
kde St je celková plocha vzorku, N0 je Avogadrovo číslo, Acs
průřezová plocha adsorbované molekuly, Mw je molekulová
hmotnost adsorbované molekuly.
• Specifický povrch lze spočítat z rovnice S = St / m , kde m je
hmotnost vzorku.
• Použití této metody zahrnuje řadu aproximací, nicméně
experimenty ukázaly, že touto metodou lze poměrně přesně
charakterizovat povrch řady materiálů.
• Dusík je použitelný pro povrchy s velikostí větší než
1,0 m2g-1, zatímco krypton by měl být použit pro menší povrchy.
14
Adsorpce plynu
• Principem této metody je permeace tekutiny přes vrstvu prášku.
Velikost povrchu lze určit z odporu, který klade práškový materiál
tekutině podle Kozenyovy-Carmanovy rovnice:
Sv je povrch, P ztráta tlaku při tloušťce prášku L, A je plocha
vrstvy prášku kolmá na směr průtoku tekutiny, V je objem
tekutiny prošlý za čas t, viskozita tekutiny, porozita práškové
vrstvy, k je konstanta závisející na tvaru a drsnosti částic (pro
sférické částice k = 5).
• Výhodou je jednoduchá aparatura a rychlé měření.
• Lze měřit průtok kapalin i plynů. Při použití plynů jsou výsledky
o něco vyšší než v případě použití kapalin.
15
Permeační metody
• Patří mezi nejrozšířenější metody pro charakterizaci vnitřních
dutin pevných látek.
• Výhodou je, že se rtuť chová jako nesmáčivá kapalina
a neproniká tak skrz zkoumaný materiál.
• Měření využívá závislosti mezi aplikovaným tlakem a minimálním
průměrem otevřených pórů, který může rtuť zaplnit.
• Pro kruhové póry lze vypočítat jejich poloměr na základě
následujícího vztahu
kde r je poloměr póru v m, P je použitý tlak v psi.
• Při měření velikosti větších pórů je tedy třeba aplikovat malý tlak
a naopak.
• Při samotném měření se postupně zvyšuje tlak a sleduje se
množství rtuti zachycené v pórech.
16
Rtuťová porozimetrie
• Při snižování tlaku se naopak rtuť z pórů dostává pryč, ale část
v nich zůstává a výsledkem je proto hysterzní křivka.
• Z těchto měření lze odvodit řadu informací jako je poloměr pórů,
plocha pórů a plocha povrchu částic a dokonce i velikost částic.
• Tato metoda má také ale řadu omezení. Například předpokládá,
že póry jsou válcovitého tvaru. Dále může při vyšších tlacích
docházet k deformaci částic. Pro dosažení potřebné přesnosti
měření by měl být změřen kontaktní úhel rtuti se zkoumaným
povrchem a povrchová tenze par rtuti. Mezi další nevýhody patří
možnost měřit pouze otevřené póry.
• I přes zmíněné nevýhody poskytuje rtuťová porozimetrie
v kombinaci s dalšími metodami cenné informace o povrchové
struktuře farmaceutických látek.
17
Rtuťová porozimetrie
• Pro správnou funkci řady léčiv je důležitá velikost částic, která
ovlivňuje jejich rozpustnost, ale také jejich případné použití (např.
léčiva pro plicní použití musí mít vhodnou velikost částic).
• Metody zmenšování částic lze rozdělit na konvenční
a mechanické.
• Konvenční metody zahrnují sušení rozprašováním a krystalizaci.
• Mechanické metody zahrnují mletí, drcení a rozmělňování.
• Ve farmacii lze provádět různá mletí, používanou technikou je
např. mletí částic ve dvou navzájem protichůdných proudech
plynu, kdy nárazy částic způsobí jejich zmenšení. Pro separaci
požadovaných velikostí lze použít např. separace pomocí
cyklonu.
• Nevýhodou mechanického zpracování je, že se vždy ve vzorku
objevují po jeho provedení amorfní oblasti, které mají odlišné
fyzikálně-chemické vlastnosti. 18
Redukce velikosti částic
• Sušení rozprašováním je ve farmaceutickém průmyslu používáno
již dlouhou dobu. Vlastnosti vzniklých částic jsou ovlivněny
mnoha faktory, jako je koncentrace léčiva, gradient teplot atd.
Obecně lze říct, že tímto způsobem jsou připravovány sypké duté
kulovité částice s nízkou hustotou (ve srovnání z původním
materiálem). Tato metoda není vhodná pro tepelně nestálé látky.
• Vhodnou velikost částic lze zajistit také během krystalizace
volbou krystalizačních podmínek. V praxi se často používá
metoda přídavku vhodného srážedla.
• Nevýhodou krystalizace je energetická náročnost a tepelná
závislost celého procesu, kontaminace dalšími látkami a malý
výtěžek vzhledem k velkým objemům roztoků.
• Řadu těchto problémů lze odstranit superkritickou fluidní
krystalizací, která používá stlačené kapalné plyny (typickým
používaný plynem je např. dusík).
19
Redukce velikosti částic
• Měření velikosti částic zahrnuje správný odběr a přípravu vzorků
• Vlastní měření velikosti částic musí splňovat následující
předpoklady:
o Získaný vzorek musí být dostatečně reprezentativní.
o Příprava vzorku by neměla mít vliv na velikost částic.
o Je třeba zvolit vhodnou metodu pro určování velikosti.
o Přístroj musí být optimálně nastaven.
o Při měření by nemělo docházet ke změně tvaru a velikosti
částic.
o Získána data je nutno správně interpretovat.
20
Hodnocení velikosti částic
a farmaceutický vývoj
• V praxi nelze měřit velké objemy vzorků, a proto je vždy nutné,
aby byly vybrané vzorky dostatečně reprezentativní.
• Pro odběr vzorku existuje řada technik.
• Objemy sypkých vzorků lze redukovat metodou kvartace, kdy se
z hromady sypkého materiálu odstraní vrchol. Zbytek prášku se
rozdělí na čtvrtiny a protilehlé strany se oddělí (viz obr.). Celý
postup lze opakovat až do získání optimálního množství prášku.
21
Vzorkování
• Po získání vhodného objemu vzorku musí být tento vzorek
připraven podle podmínek nutných pro provedení analýzy.
• Např. pro laserovou difrakci musí být pevný vzorek rozptýlen ve
vhodném rozpouštědle, ve kterém nedochází k rozpouštění
částic.
• Při mikroskopických pozorováních musejí být částice vhodně
zředěny, aby nedocházelo k jejich agregaci.
• V technikách jako je např. TOF, kdy jsou částice urychleny, může
docházet k nežádoucím změnám velikosti v důsledku působení
vysokých sil. Na druhou stranu vztah mezi velikostí částic
a aplikovaným tlakem vzduchu může poskytnout cenné
informace o soudržnosti původního materiálu.
22
Vzorkování
• Pro správné provedení analýzy je nutné postupovat podle
pokynů výrobce přístroje a tam, kde je to vyžadováno, provádět
pravidelnou kalibraci.
• Kalibrace představuje ověřování správnosti měření pomoci řady
standardů.
• Pro měření velikosti částic existují čtyři třídy referenčních
materiálů.
• První třídou jsou mezinárodní standardy délky.
• Druhou třídou jsou certifikované nebo standardní materiály.
• Třetí třídou jsou sekundární standardní materiály, které se
používají v metodách, jako je např. sítová analýza.
• Poslední typ představují terciální standardy, které jsou pro
kalibraci připravovány in situ.
23
Přístrojová kalibrace
a instrumentace
• Pro správný výběr techniky měření jsou rozhodující tyto
parametry: účel měření, přesnost a preciznost měření, časová
náročnost, reprodukovatelnost, snadnost provedení a cena.
Účel měření
• Účel měření odpovídá druhu informace, který má měření
poskytnout. Např. bude-li nás zajímat velikost a morfologie
částic, použijeme mikroskopická měření a obrazovou analýzu.
Bude-li nás zajímat aerodynamický průměr částic, použijeme
TOF. Pokud nás bude zajímat rychlost a velikost částic
v aerosolu, použijeme Dopplerovu fázovou analýzu, pro kontrolu
kvality produktů použijeme laserovou difrakci.
• Neexistuje univerzální metoda.
• Běžně se pro charakterizaci využívají alespoň dvě různé metody.
24
Výběr techniky pro určení
velikosti částic
• V ideálním případě by měla technika měření pokrýt celou škálu
velikostí vzorku. V následující tabulce jsou uvedeny rozsahy
měření jednotlivých technik.
25
Rozsah velikostí
26
Rozsah velikostí
Preciznost
• Těsnost shody mezi naměřenými hodnotami veličiny získanými
opakovanými měřeními na stejném objektu.
Přesnost
• Těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a pravou
hodnotou měřené veličiny.
Reprodukovatelnost
• Preciznost měření za podmínek reprodukovatelnosti měření (tedy
měřením různým způsobem - různými měřidly, personálem či na
různém místě a v různém čase).
Rozlišení
• Rozlišení metody: nejmenší změna veličiny, která způsobí
rozeznatelnou změnu v odpovídající indikaci (zjednodušeně jde
o nejmenší dílek na stupnici.
• Rozlišení přístroje: schopnost odlišit různé distribuce velikosti
částic, například při bimodální distribuci.
27
Vyhodnocení výsledků
28
Účinnost a cena
• Tyto faktory jsou zejména důležité při každodenním měření
velkého množství vzorků.
• Některé techniky, jako je například obrazová analýza
a sedimentace, jsou pomalé na provedení. Na druhou stranu
techniky, jako je rozptyl světla, jsou rychlé.
• Dalším kritériem je univerzálnost metody, která zohledňuje
omezení jednotlivých metod na určité typy částic. Například pro
sedimentaci je zapotřebí velké množství vzorku, pro elektronovou
mikroskopii nesmí vzorek za vakua sublimovat a pro analýzu
Coulterovým čítačem nesmí být částice rozpustné ve vodě.
• Je třeba rozlišovat metody vhodné pro akademický výzkum a pro
průmysl.
• Posledním faktorem, který je potřeba zohlednit, je pořizovací
cena přístroje, provozní cena přístroje a náklady na jeho údržbu.
Vyhodnocení výsledků
• Důležitými parametry z hlediska použití metody jsou specifičnost,
přesnost, opakovatelnost a robustnost metody.
• V následující tabulce jsou uvedeny definice těchto pojmů.
29
Metody vývoje a validace
• Validace dané metody musí být provedena s podobnými
částicemi, které budou analyzovány.
• Podobnost musí být jak ve velikosti, tak při přípravě těchto částic.
• Pokud je validace provedena s částicemi připravenými
krystalizací, je nevhodné používat metodu na analýzu částic
připravených mletím.
• Reprodukovatelnost se provádí s minimálně 5 vzorky s 5
opakovanými měřeními každého vzorku.
• Výsledky velikostí se uvádí jako d10, d50 a d90, což vyjadřuje, že
10 %, 50 % a 90 % částic má velikost nižší než uvádí dané číslo.
• Pro laserovou difrakci by pro velikost částic větších než 10 m
mělo být (při reprodukovatelnosti výsledků průměru částic
uvedených jako d50) RSD 3 % a u d10 a d90 RSD 5 %.
30
Metody vývoje a validace
• Metody pro stanovení velikosti a distribuce částic, stejně jako
finální farmaceutické produkty s určitou velikostí částic podléhají
mezinárodním směrnicím, jako jsou:
• Mezinárodní konference pro harmonizaci technických požadavků
na registraci farmaceutik pro humánní použití (ICH Q6A, ICH
Q2A and Q2B)
• Lékopis Spojených států (USP)
• Evropský lékopis (Ph. Eur.)
• USA: Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA)
• Evropa: Evropská agentura pro hodnocení léčivých přípravků
(EMEA).
31
Regulační směrnice
• ICH Q6A – se zabývá klasifikací částic podle specifických testů,
které jsou řazeny podle API a podle finálního produktu. Studuje
distribuci API, obsah nerozpuštěné API, rozpustnost, biologickou
dostupnost, zpracovatelnost, stabilitu, jednotný obsah, vzhled
konečného výrobku a další faktory.
• FDA – navrhuje studie stejných parametrů jako ICH Q6A
a doplňuje nutnost kontroly léčiva v průběhu skladování pro
kontrolu, zda dochází ke změnám velikosti částic.
• Obdobné požadavky na charakterizaci materiálů jsou uvedeny
také ve směrnici EMEA.
32
Regulační směrnice
• Jednou z možností podání léčivá je aplikace aerosolů do
dýchacích cest.
• Částice se podle velikosti ukládají na různá místa dýchacího
traktu.
• Obecně lze říct, že běžně používané částice z aerosolů
s velikostí 15 m jsou ukládány v extratorakální oblasti, menší
částice s velikostí 5 – 10 m jsou ukládány v tracheobronchiální
oblasti. Částice s velikostí 1- 3 m jsou ukládány v dolních
cestách dýchacích.
• Inhalované částice mají nejčastěji průměr od 1 do 5 m.
• Při podávání léčiv pomocí inhalátoru suchého prášku (DPI) nebo
pomocí inhalátoru pod tlakem (pMDI) je důležitým parametrem
velikost částic.
33
Příklad: medicinální aerosoly
• Farmaceutické částice určené pro inhalace mají typicky rozmezí
velikostí 0,5 – 10 m a pro jejich charakterizaci je nejvhodnější
laserová difrakce.
• Další možností charakterizace prášků používaných při DPI je
TOF, který lze použít i pro měření velikosti excipientů.
• Jedním z široce používaných excipientů je monohydrát -laktózy.
Velikost částic -laktózy hraje roli při zajišťování uniformity
podané látky.
• Velikost mikronizované -laktózy se obvykle pohybuje v rozmezí
10 – 500 m a může být charakterizována mikroskopickými
technikami, laserovou difrakcí nebo TOF.
• Výhodou je použití kombinace těchto technik, které poskytnou
údaje o velikosti částic, jejich distribuci, ale také o povrchové
struktuře a tvaru studovaných částic.
34
Příklad: medicinální aerosoly
• Aerodynamická velikost finálního farmaceutického produktu
může být velmi odlišná od velikosti částic API, protože obsahuje
také excipient.
• Pro hodnocení aerodynamické velikosti se podle úmluv USP
a Ph. Eur. používají techniky uvedené v následující tabulce.
35
Příklad: medicinální aerosoly
• Obvykle nejsou sledovány všechny body distribuce velikosti
částic.
• Obvykle se sleduje podíl jemné, průměrné a hrubé frakce.
• Průměrná velikost částice se vyjadřuje mediánem d50, jemná
frakce d10 a hrubá d90.
• Šíři distribuce velikosti částic lze vypočítat ze vzorce
𝑆𝑝𝑎𝑛 = 𝑑90 − 𝑑10
𝑑50
• Pro mikronizovaná léčiva určená pro inhalaci je třeba uvádět
podíl částic velkých 0,5-3 m, 3-5 m a 5-10 m.
36
Příklad: medicinální aerosoly
• Analýza velikosti částic je nezbytnou součástí farmaceutického
vývoje a kontroly farmaceutických produktů.
• Používané metody jsou do značné míry závislé na odběru
a přípravě vzorků, technice analýzy a zpracování dat.
• Různé techniky měření poskytují různé charakteristiky velikosti
částic.
• Neexistuje univerzální metoda pro měření velikosti
farmaceutických částic.
• Existuje však řada přístrojů, které jsou komerčně dostupné a jsou
široce používány.
• Pro měření farmaceutických produktů a vlastností finálních
farmaceutických produktů byla publikována řada mezinárodně
uznávaných směrnic.
37
Závěr