Untersuchungen zum Gewebetropismus des Hepatitis A-Virus
im Mausmodell durch quantitative Analyse viraler Nukleinsäure
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
Im Fachbereich Biologie / Chemie
Universität Bremen
vorgelegt von
Alke Heitmann
Juni 2008
1. Gutachter: Dr. habil. Andreas Dotzauer 2. Gutachter: Dr. habil. Stephan Günther
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Heitmann A., Laue T., Schottstedt V., Dotzauer A., Pichl L.:
Occurrence of Hepatitis A Virus III in Germany Requ ires the Adaptation of
Commercially Available Diagnostic Test Systems
Transfusion 2005 Jul;45(7):1097-105
Pichl L., Heitmann A., Herzog P., Oster J., Smets H., Schottstedt V.:
Magnetic Bead Technology in Viral RNA and DNA Extra ction from Plasma Minipools
Transfusion 2005 Jul;45(7):1106-10
Zayc-Schmidt E.M., Pichl L., Laue T., Heitmann A., Schottstedt V.:
Travel-related Hepatitis A Detected by Hepatitis A Virus RNA Donor Screening
Transfusion 2005 Jun;45(6):1037-8
Danksagung
Zuallererst gilt mein Dank Dr. habil. Andreas Dotzauer für die Überlassung des Themas und
die ausgezeichnete Betreuung meiner Arbeit.
Ich danke Dr. habil. Stephan Günther für die bereitwillige Übernahme des Zweitgutachtens.
Der QIAGEN Hamburg GmbH gebührt mein Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes
und der Arbeitsmittel.
Herrn Thomas Laue danke ich für seine Unterstützung und ständige Gesprächsbereitschaft,
sein Vertrauen in meine Arbeit, was mir ein hohes Maß an Eigeninitiative erlaubte und die
vielen motivierenden Worte.
Meinen Kollegen in Hamburg und am Institut für Virologie in Bremen möchte ich danken, für
die angenehme Zusammenarbeit und ihre ständige Hilfsbereitschaft. Eure Worte, Gesten
und kleinen und großen Taten waren mir große Stütze und haben zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen. Den Mitarbeitern am Institut für Virologie möchte ich besonders für die
Hilfe bei der Betreuung der Tiere danken.
Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihre rückhaltlose Unterstützung, ihre
unendliche Geduld und das Interesse an meiner Arbeit. Bei Tim möchte ich mich besonders
bedanken, dafür dass er immer an meiner Seite ist.
1
1. EINLEITUNG................................................................................................................. 3
1.1 Hepatitis A-Virus .................................................................................................................................... 3 1.1.1 Historie.................................................................................................................................................3 1.1.2 Systematik............................................................................................................................................ 3 1.1.3 Epidemiologie ...................................................................................................................................... 4 1.1.4 Pathogenese ......................................................................................................................................... 5 1.1.5 Morphologie und Genomorganisation ................................................................................................. 5 1.1.6 Infektionszyklus................................................................................................................................... 6 1.1.7 Klinik, Immunantwort und Diagnostik ................................................................................................ 7
1.2 Zielsetzung............................................................................................................................................. 11
2. MATERIAL UND METHODEN........................... ..............................................................13
2.1 Material......................................................................................................................................................... 13 2.1.1 Versuchstiere........................................................................................................................................... 13 2.1.2 Virusstämme............................................................................................................................................ 13 2.1.3 Zelllinien ................................................................................................................................................. 14 2.1.4 Zellkulturmedien ..................................................................................................................................... 14 2.1.5 Antibiotika und Fungizide....................................................................................................................... 14 2.1.6 Synthetische Nukleinsäuren .................................................................................................................... 15 2.1.7 Enzyme.................................................................................................................................................... 15 2.1.8 Sonstige Proteine..................................................................................................................................... 16 2.1.9 Kits .......................................................................................................................................................... 16 2.1.10 Chemikalien .......................................................................................................................................... 17 2.1.11 Puffer und Lösungen ............................................................................................................................. 17 2.1.12 Verbrauchsmaterialien........................................................................................................................... 18 2.1.13 Geräte .................................................................................................................................................... 19 2.1.14 Software ................................................................................................................................................ 19
2.2 Methoden ....................................................................................................................................................... 20 2.2.1 Kultivierung von Zellen .......................................................................................................................... 20 2.2.2 Bestimmung der Zellzahl ........................................................................................................................ 20 2.2.3 Mykoplasmen-Test.................................................................................................................................. 21 2.2.4 Herstellung von Viruspools..................................................................................................................... 21 2.2.5 Bestimmung des 50 %-Endpunkttiters (TCID50/ml) ............................................................................... 21 2.2.6 Isolierung viraler RNA aus zellfreien Medien......................................................................................... 22 2.2.7 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ............................................................ 23 2.2.8 Real-time RT-PCR System zur Quantifizierung von HAV RNA............................................................ 23 2.2.9 PCR zum Nachweis von 18S rRNA und GAPDH RNA......................................................................... 27 2.2.10 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................................... 28 2.2.11 Infektion der Mäuse...............................................................................................................................28 2.2.12 Herstellung der Inokula zur Infektion ................................................................................................... 28 2.2.13 Immunisierung der Mäuse..................................................................................................................... 29 2.2.14 Blutentnahme aus dem retrobulbären Venenplexus .............................................................................. 29 2.2.15 Bestimmung des anti-HAV IgG Status der Mäuse................................................................................ 29 2.2.16 HAV Neutralisation durch Mausseren .................................................................................................. 29 2.2.17 Sektion der Mäuse.................................................................................................................................30 2.2.18 Isolierung der Nukleinsäure aus den Mausgeweben ............................................................................. 30 2.2.19 Neutralisation der anti-HAV/IgA-Komplexe in vitro............................................................................ 31 2.2.20 Herstellung strangspezifischer Kontrolltranskripte ............................................................................... 31 2.2.21 (-) Strang Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation.................................................................... 33 2.2.22 (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR................................................................................................... 36 2.2.23 Aufnahme einer HAV Wachstumskurve............................................................................................... 40
3. ERGEBNISSE..................................................................................................................41
2
3.1 Entwicklung eines real-time RT-PCR Systems zum Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus..................................................................................................................................................................... 41
3.1.1 Validierung des HAV real-time RT-PCR Systems ................................................................................. 41 3.1.2 Einsatz des real-time HAV RT-PCR Systems in der in vitro Diagnostik ............................................... 42
3.2 Entwicklung eines Systems zum quantitativen Nachweis von HAV Negativstrang RNA ...................... 43 3.2.1 Herstellung der strangspezifischen Kontrolltranskripte .......................................................................... 43 3.2.2 Strangspezifischer Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation........................................................ 44 3.2.3 Strangspezifischer Nachweis mittels Box-PCR ...................................................................................... 50
3.3 Untersuchung zum IgA vermittelten Carriermechanismus des Hepatitis A-Virus in experimentell infizierten Mäusen............................................................................................................................................... 53
3.3.1 Nachweis des HAV nach intravenöser, intraperitonealer und oraler Inokulation von HAV/anti-HAV IgA-Komplexen................................................................................................................................................ 53 3.3.2 Untersuchung zum HAV Targeting vermittelt durch anti-HAV IgA ...................................................... 55 3.3.3 Einfluss der Immunantwort auf den anti-HAV IgA Carriermechanismus .............................................. 67
4. DISKUSSION...................................................................................................................77
4.1 Entwicklung des quantitativen real-time RT-PCR Systems ...................................................................... 77
4.2 Entwicklung des strangspezifischen RNA Nachweises .............................................................................. 78
4.3 Verteilung des Hepatitis A-Virus im Mausmodell ..................................................................................... 81
4.4 Replikation im Modellorganismus............................................................................................................... 83
4.5 IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber ........................................................................................ 84
4.6 Abhängigkeit des anti-HAV IgA Carriermechanismus von dem Reifungsgrad der Immunantwort.... 87
5. ZUSAMMENFASSUNG ................................. ..................................................................90
6. LITERATUR....................................... ..............................................................................92
ABKÜRZUNGEN ........................................ .........................................................................98
3
1. EINLEITUNG
1.1 Hepatitis A-Virus
1.1.1 Historie
Das Hepatitis A-Virus (HAV), welches weltweit verbreitet ist, ist heute der häufigste Erreger
der Gelbsucht. Die HAV Infektion war bereits im Mittelalter unter dem Namen Feldzug-
Gelbsucht (Campaign jaundice) als ernste Erkrankung innerhalb der Armee bekannt. Die
ersten Berichte über eine epidemisch auftretende Gelbsucht in der zivilen Bevölkerung
Europas stammen aus dem 17. und 18. Jahrhundert(20). Die virale Ätiologie der „akuten
gelben Atrophie der Leber“ wurde 1908 von McDonald postuliert(85). 1912 sprach Cockayne
erstmals von der „infektiösen Hepatitis“ um die epidemisch auftretende Gelbsucht zu
beschreiben(20). Während des 2. Weltkrieges konnten aufgrund der hohen Inzidenz eine
Reihe an klinischen Studien zu dieser Erkrankung durchgeführt werden. Epidemiologische
Studien und Experimente an Freiwilligen bestätigten die virale Ätiologie und gaben u.a. erste
Einblicke in Inkubationszeit und klinischen Verlauf der infektiösen Hepatitis(10,70,55,68). 1947
führte MacCallum die Begriffe „Hepatitis A“ für die infektiöse Hepatitis und „Hepatitis B“ für
eine ähnliche Erkrankung bis dahin bekannt unter dem Namen „Serum-Hepatitis„ ein(78).
Nachdem Feinstone et al., 1973 die Identifizierung des Hepatitis A-Virus durch Immuno-
Elektronenmikroskopie gelang(41), erreichten Provost und Hillemann 1979 die in vitro
Kultivierung des Virus und ermöglichten damit die Entwicklung eines Impfstoffes(103).
1.1.2 Systematik
Anfang der 80er Jahre wurde das Hepatitis A-Virus aufgrund der zu diesem Zeitpunkt
bekannten biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften in der Familie der
Picornaviridae, dem Genus Enterovirus zugeordnet(51). Bereits zehn Jahre später wurde
diese Klassifizierung aufgrund neuerer Erkenntnisse korrigiert. Für das Hepatitis A-Virus
wurde ein neuer Genus, der Genus Hepatovirus, innerhalb der Familie Picornaviridae
geschaffen(87); es ist bis heute das einzige Mitglied dieses Genus. Das Hepatitis A-Virus wird,
aufgrund der genetischen Analyse von 152 weltweit verbreiteten HAV Stämmen, in sieben
Genotypen eingeteilt(107). Ein Vorschlag zur Neuklassifizierung in fünf Genotypen wurde 2002
von Costa-Mattioli gemacht. Dessen genetische Analysen ergaben, dass die Genotypen II
und VII Subtypen des gleichen Genotyps sind(24). Ein Genotyp ist definiert als eine
Virusgruppe mit mindestens 85%iger Sequenzhomologie. Zwei dieser Genotypen (Genotyp I
4
und Genotyp III) lassen sich noch weiter in Subgenotypen einteilen. Diese Subgenotypen
differieren in höchstens 7,5% ihrer Nukleotidsequenz(107). Es besteht ein Zusammenhang der
jeweiligen Geno- und Subgenotypen zu der geografischen Region ihres Auftretens. So
repräsentiert eine Untergruppe des Subgenotyps IA mit einer Sequenzhomologie von 97%
nahezu alle HAV Stämme aus den USA. In Europa dagegen ist dieses Muster heterogener,
es werden die Genotypen IA und IB sowie besonders in jüngster Zeit Genotyp III
gefunden(107,74,25,6).
1.1.3 Epidemiologie
Das Hepatitis A-Virus ist weltweit verbreitet, wobei die Durchseuchung in
Entwicklungsländern aufgrund des niedrigen Hygienestandards besonders hoch ist(3). In
diesen Ländern liegt die Prävalenz bei Kindern unter zehn Jahren nahezu bei 100%. In
industrialisierten Ländern wird eine Reduktion der Prävalenz bei Kindern beobachtet. Dies
basiert darauf, dass der Erstkontakt mit dem Virus mit fortschreitender Industrialisierung und
damit verbundenenen Hygienestandards erst in höherem Alter stattfindet(58,52). In den
Industrieländern wird die HAV Infektion in erster Linie durch Reisen in Länder mit niedrigem
Hygienestandard erworben(121,139,3), weshalb die Erkrankung durch Hepatitis A-Virus auch
„Reisehepatitis“ genannt wird. In Deutschland sind derzeit nahezu ein Viertel der gemeldeten
Hepatitiden auf HAV zurückzuführen(106).
Die Infektion mit Hepatitis A-Virus erfolgt fäkal-oral über den Kontakt mit infizierten
Personen, kontaminiertem Wasser oder Lebensmitteln. Besonders häufig ist dabei die
Übertragung durch den Verzehr von Meeresfrüchten, da diese das Virus durch Filtern des
Meerwassers aufkonzentrieren(29,119,32,3). Eine Übertragung durch Blut und Blutprodukte, z.B.
Faktor VIII Präparate, ist möglich und wurde in der Vergangenheit bereits mehrfach
beobachtet(29,96,79,19,95). Durch Aufnahme des Hepatitis A-Virus in die Testung der
Blutspendedienste und durch ständige Verbesserung der genutzten Nachweissysteme wird
dieses Risiko der Übertragung stark minimiert(98). Eine Übertragung durch die gemeinsame
Verwendung von Spritzen ist ebenfalls beschrieben. Bei etwa 40 – 50% der i.v.-
Drogenabhängigen in Nordeuropa sind Antikörper gegen HAV nachweisbar. Diese hohe
Rate ist neben der gemeinsamen Nutzung der Spritzen auch auf die schlechten
hygienischen Lebensbedingungen zurückzuführen(67).
5
1.1.4 Pathogenese
Nach der oralen Aufnahme gelangt das Virus über den Magen-Darmtrakt auf bisher
ungeklärte Weise in die Leber und infiziert die Hepatozyten. Das Hepatitis A-Virus weist in
vivo einen starken Hepatotropismus auf. Obwohl eine Vermehrung im Intestinaltrakt
diskutiert wird, ist die Leber sehr wahrscheinlich der einzige Replikationsort des Virus(119,83,82).
In verschiedenen Studien konnte die Anwesenheit des HAV in extrahepatischen Geweben
wie z.B. Milz, Niere, Darmschleimhaut und Tonsillen nachgewiesen werden. Dass das Virus
in Tonsillen und auch im Speichel auffindbar ist, deutet auf eine erste Replikation im
Rachenraum hin, dieses konnte bisher jedoch nicht belegt werden(21). Ebenso fehlen
Hinweise auf eine Replikation im Darmgewebe, wie sie für andere fäkal-oral übertragbare
Picornaviren üblich ist(21,82,83,62). Obwohl die HAV Replikation in vivo bisher nur in
Hepatozyten nachweisbar ist, lassen sich in Zellkultur eine ganze Reihe von Zellen, die nicht
der Leber entstammen, wie z. B. humane Lungenfibroblasten und Affennierenzellen
produktiv infizieren(119,43,34). Das die Leber eine zentrale Rolle im IgA-Metabolismus spielt,
indem sie IgA und IgA-Komplexe aus dem Organismus eliminiert(13), könnte auf eine
Verbindung des HAV mit seinem strikten Hepatotropismus und dem Immunglobulin A
hinweisen. Dotzauer et al., 2005 postulierte den Übergang des HAV aus dem Darm in den
Blutstrom und den Transport zur Leber durch Komplexierung mit Immunglobulin A(33). Die
HAV Replikation in der Leber erfolgt bereits acht bis zehn Tage vor dem Auftreten erster
Symptome. Die in der Leber synthetisierten Virionen gelangen über die Galle in den Darm
und werden mit dem Stuhl ausgeschieden(119,132,73,113). Die Menge der Viruspartikel im Stuhl
und im Blut ist vor Beginn der klinischen Symptome besonders hoch und nimmt im Verlauf
der Infektion deutlich ab(44,11).
1.1.5 Morphologie und Genomorganisation
Das Hepatitis A-Virus besteht aus einem ikosaedrischen, nicht umhüllten Capsid mit einem
Durchmesser von 27 – 32 nm und ist damit morphologisch nicht von anderen Picornaviren
zu unterscheiden(41,104). Das Genom besteht aus linearer, einzelsträngiger RNA in Plusstrang
Orientierung mit einer Länge von 7,5 kb(26,22). Das 5´Ende ist kovalent mit einem Protein
namens VPg (genomassoziiertes Virusprotein) verbunden. Der einzige offene Leserahmen
(ORF) wird am 5´- und 3´-Ende von nicht translatierten Regionen (NTR) flankiert. Die 5´NTR
ist deutlich länger als die 3´NTR und bildet eine komplexe Sekundärstruktur, die interne
ribosomale Eintrittsstelle (IRES), welche die Translation vermittelt. Am 3´Ende befindet sich
neben der NTR ein poly(A)-Anhang(47,14,15). Der offene Leserahmen kodiert für ein 250 kD
6
Polyprotein, welches durch die virale Protease (3C) in drei Polypeptide P1 (Strukturproteine),
P2 und P3 (Nicht-Strukturproteine) gespalten wird(108,60,80,46,114,102). Die P1 Region kodiert für
die Proteine VP1 bis VP4, welche das Capsid bilden. Die Proteine 2A, 2B und 2C entstehen
aus dem Polypeptid P2, ihre Funktionen sind noch nicht vollständig geklärt. Vermutlich erfüllt
das Protein 2A eine wichtige Aufgabe beim Assembly(101), die Proteine 2B und 2C haben
Einfluss auf die Adaptation der viralen Replikation in Zellkultur(36). Desweiteren ist vom
Protein 2C bekannt, dass es eine RNA Helikase Aktivität aufweist(49). Die Region P3 kodiert
für die weiteren Nicht-Strukturproteine; 3A, ein Protein dessen Funktion noch nicht
vollständig geklärt ist, 3B dem VPg Protein welches mit dem 5´Ende des Genoms assoziiert
ist und als Primer für die Replikation dient, sowie 3C und 3D(134). Hinter dem Protein 3D
verbirgt sich die RNA-abhängige RNA-Polymerase und das Protein 3C ist die bereits
erwähnte virale Proteinase(130,1).
1.1.6 Infektionszyklus
Die Infektion beginnt mit der spezifischen Adsorption des Virus an die Hepatozyten. Die
Struktur des Canyons, einer Vertiefung, die die Ikosaederecken (5-fach Symmetrieachsen)
umgibt und aus Aminosäureresten der Proteine VP1, VP2 und VP3 besteht, vermittelt die
Bindung des Virus an spezifische zelluläre Rezeptoren. Für die Transmembranproteine der
TIM-Familie, TIM-1 und TIM-3, konnte eine Bindungseigenschaft an HAV und eine
Unterstützung beim Virusentry gezeigt werden. Sie fungieren jedoch nicht als zellulärer
Rezeptor(122,8,40,61); dieser ist für das Hepatitis A-Virus noch nicht identifiziert. Das
Transmembranprotein TIM-1 wird ubiquitär expremiert(61,40,8) und steht damit in keinem
Zusammenhang mit dem starken Hepatotropismus des HAV. Tami et al., 2007 konnten
zeigen, dass Immunglobulin A spezifisch an TIM-1 bindet. Diese Interaktion könnte eine
wichtige Rolle in der Pathogenese des HAV durch verbesserte Infektion von Zellen, die IgA
und IgA-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie Kupfferzellen und Hepatozyten
spielen(125). Zahlreiche Untersuchungen belegen die Anwesenheit von sekretorischem,
virusspezifischem IgA im intestinalen Lumen. Die Antikörper treten sehr früh nach der
Infektion auf und liegen häufig im Komplex mit HAV vor(120,13). HAV/IgA-Komplexe werden
mittels pIgR (Polymeric immunoglobulin receptor) von Epithelzellen transcytiert und gelangen
so vom Darmlumen in die Blutbahn(33). Die HAV/IgA-Komplexe können über den ASGPR
(Asialoglykoproteinrezeptor) Leberzellen infizieren. Da dieser Rezeptor nur in Hepatozyten
expremiert wird, könnte dieser Infektionsweg den starken Hepatotropismus des Virus
erklären(118). Die Aufnahme der HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR konnte in vitro sowohl
in der murinen hepatozytären Zellinie NCTC als auch in der humanen Hepatomzellinie
7
HepG2 und primären Hepatozyten humanen Ursprungs gezeigt werden(35). In vivo
Untersuchungen zum Transport der Komplexe mit dem Blutstrom zur Leber stehen noch aus
und sind Ziel dieser Arbeit. Nach dem Eintritt des Virus durch Endocytose erfolgt das
uncoating. Um die Konformationänderung, welche zur Freisetzung der viralen RNA ins
Cytoplasma führt, zu induzieren, sind möglicherweise die zelluläre N-terminale cysteinreiche
immunglobulin-ähnliche Region D1 und die mucin-ähnliche Region des TIM-1
erforderlich(116,123). Die Translationsinitiation erfolgt durch IRES (Typ III IRES) vermittelte
Interaktion der ribosomalen Untereinheiten und den Translationsfaktoren mit einem
Startcodon(131,140). Bereits während der Synthese des Polyproteins beginnt die Spaltung in
die Polypeptide (Prozessierung). Nahezu zeitgleich mit der Translation findet die Synthese
der komplementären Negativstränge statt(140). Dazu wird das Protein VPg an den zellulären
Membrankompartimenten uridinyliert. Der so entstandene VPg-Primer assoziiert an den
Poly(A)-Anhang des Genoms und bildet die Erkennungstelle für die RNA-abhängige RNA
Polymerase, die zunächst ein Replikationsintermediat in Form von Negativstrang RNA
synthetisiert(134,88). Dieser Negativstrang [(-) Strang] weist am 3´Ende zwei Adenosinreste
auf, an die der VPg-Primer ebenfalls assoziiert, so dass neue RNA Positivstränge
synthetisiert werden können. Die so gebildeten neuen Positivstränge werden sofort in das
Capsid verpackt, so dass sie nicht als Template zur weiteren Replikation dienen können(4).
Kotranslational findet durch die Protease 3C die Spaltung des Polyproteins in die P1
(Strukturproteine), P2 und P3 (Nichtstrukturproteine) Polyproteine statt. Anschließend spaltet
3C das Polyprotein P1 in VP0, VP3 und VP1/2A, die Proteine bleiben in Komplexen
zusammen und assoziieren zu Pentameren. Zwölf dieser Pentamere bilden zusammen ein
Procapsid, welches das RNA Genom aufnimmt und so das Provirion bildet. Die
Reifespaltung des VP0 in die Proteine VP2 und VP4 findet vermutlich erst im Provirion statt.
Die assemblierten Virionen werden über einen noch unbekannten Weg aus der Zelle
ausgeschleust ohne diese zu lysieren(64,128). Aus den Leberzellen werden sie über die Galle
ins Darmlumen geleitet, wo sie erneut mit IgA komplexiert werden können(132,119,73).
1.1.7 Klinik, Immunantwort und Diagnostik
Eine Hepatitis A-Virus Infektion ist immer selbst-limitierend, d.h. das Virus wird vom Körper
vollständig eliminiert. Die Erkrankung kann symptomlos bis tödlich verlaufen. Der typische
Krankheitsverlauf lässt sich in vier klinische Phasen einteilen: die Inkubationsphase, das
Prodromalstadium, den Ikterus und die Konvaleszenz(90,65). Die Inkubationszeit beträgt 15 -
50 Tage und ist abhängig von der Infektionsdosis(69). Im Allgemeinen treten 30 Tage nach
Exposition die ersten unspezifischen Symptome wie Übelkeit, Fieber und ein generelles
8
Krankheitsgefühl auf(29). Nach diesem ungefähr eine Woche anhaltenden Prodromalstadium
bildet sich ein Ikterus mit typischer Gelbfärbung der Augen und Haut. Ausprägung der
klinischen Symptomatik und Mortalität sind altersabhängig, so verläuft die HAV Infektion bei
Kindern häufig inapparent. Während bei Kindern unter sechs Jahren bei weniger als 10%
ikterische Verläufe zu beobachten sind, ist dies bei ca. 75 - 90% der infizierten Erwachsenen
der Fall(53,3). In weniger als 1% aller ikterischen Verläufe kommt es zu einer fulminanten
Hepatitis und somit der schwersten durch Hepatitits A-Virus induzierten Verlaufsform(127),
wobei unter 1,5% aller ikterischen Verläufe fatal enden(57).
Hepatitis A-Virus Infektionen treten in verschiedenen atypischen Manifestationen auf. Man
unterscheidet die Entwicklung einer Cholestase, die protrahierte und die relapsierende
Verlaufsform(29,109,50,111,133). Die protrahierte Form tritt in bis zu 8,5 – 12,3% aller Fälle auf Sie
ist durch pathologisch erhöhte Transaminase- und Billirubinwerte über einen Zeitraum von
mehreren Monaten, teilweise bis zu 15 Monaten, gekennzeichnet(138,133). Leberbiopsien
dieser Fälle zeigen Entzündungen, Nekrosen und Fibrosen. Bei diesen Krankheitsverläufen
lässt sich während des gesamten Zeitraums, in dem die Alanin-Aminotransferase (ALT)
Werte erhöht sind, die virale RNA im Stuhl nachweisen(138). Coppola et al., 2007 beschreiben
einen Fall der protrahierten Hepatitis A in Zusammenhang mit Cholestase, bei dem sowohl
erhöhte Transaminase Werte als auch Virus im Plasma über einen Zeitraum von 7 Monaten
nachgewiesen wurde. Bei diesem Patienten konnten zu Beginn der Infektion die
Subgenotypen IA und IB parallel nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf änderte sich
diese Koinfektion. Zunächst konnte nur Genotyp IA und kurz vor der Konvaleszenz nur
Genotyp IB nachgewiesen werden. Diese Koinfektion könnte der oder zumindest einer der
Gründe für den protrahierten Krankheitsverlauf sein(23).
Bei der HAV assoziierten Cholestase leiden die Patienten unter Fieber, Diarrhö,
Gewichtsverlust und Malabsorption, der verminderten enteralen Resorption. Der Bilirubinwert
im Serum ist über drei Monate beträchtlich erhöht (über 10mg/dL; Normwert<0,3mg/dL).
Auch der ALT-Wert ist über diesen Zeitraum deutlich erhöht. Die Cholestase löst sich
langsam aber vollständig auf(29,89,50). Relapsierende Verläufe werden in bis zu 20% der
akuten Hepatitis A beobachtet(48,117). Dabei kommt es nach der initialen Erkrankung zunächst
zur vollständigen Remission der klinischen und biochemischen Symptome. Innerhalb von 4
bis 15 Wochen kommt es, trotz des Vorhandenseins neutralisierender Antikörper, zum
ikterischen Rezidiv, mit im Wesentlichen gleicher Symptomatik wie in der initialen Phase. Die
Enzymwerte sind bis zu 12 Monate erhöht, und in seltenen Fällen treten während dieser Zeit
weitere Rezidive auf, bevor das Virus vollständig eliminiert wird. Während der Rezidivphasen
befinden sich Hepatitis A-Viren sowohl im Blut als auch im Stuhl, wohingegen das Virus
9
während der Remission bisher nicht nachgewiesen werden konnte(48,111). Neben dem Virus
lässt sich in Serum und Stuhl dieser Patienten auch anti-HAV IgM Antikörper
nachweisen(48,29,117).
Abbildung 1: Model des IgA vermittelten HAV Carriermechanismus. Nach der oralen Aufnahme gelangt das Virus über den Magen in den Darm. Dort kann das Virus mit IgA,welches von der Galle sezerniert wird, komplexiert und durch den polymeren Immunglobulin Rezeptor (pIgR) in den Blutstrom abgegeben werden, oder aber das Virus gelangt zunächst unkomplexiert durch den Darm und kann in der Submucosa mit sekretorischem IgA oder aber im Blutstrom mit Serum IgA komplexiert werden. Mit diesem gelangen die HAV/anti-HAV IgA-Komplexe zur Leber und über den Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) in die Hepatozyten, in denen die Virusreplikation stattfindet. Die neu synthetisierten Virionen werden mit der Gallenflüssigkeit in den Darm geschleusst und können den Kreislauf trotz Anwesenheit von neutralisierender IgG Antikörper erneut durchlaufen. Es wäre möglich, dass die Aviditätssteigerung von anti-HAV IgG im Laufe der Infektion eine Verdrängung des IgA aus den Komplexen zur Folge hat, wodurch der Transport zur Leber unterbrochen wäre, und das Virus vollständig eleminiert werden könnte.
10
Mit Beginn der Symptome lassen sich IgM, IgG und auch IgA Antikörper gegen HAV
Strukturproteine im Serum nachweisen. IgG Antikörper erreichen ihren höchsten Wert in der
Konvaleszenzphase, persistieren lebenslang und schützen dadurch vor einer erneuten
Infektion. Immunglobulin A und IgM Antikörper erreichen innerhalb der ersten vier Wochen
der Erkrankung ihre höchsten Titer und persistieren dann für einen begrenzten Zeitraum.
Während IgM Antikörper in der Regel bereits nach 6 Monaten nicht mehr nachweisbar sind,
persistieren IgA Antikörper bis zu 2 Jahre(5). Die Rolle der IgA Antikörper während der HAV
Infektion ist bisher ungeklärt und Gegenstand der vorliegenden Arbeit(119,90,73). In Zellkultur
konnte bereits gezeigt werden, dass HAV komplexiert mit IgA aus dem Darmlumen in den
Blutstrom übergehen kann, und dass diese Komplexe über den ASGPR Hepatozyten
infizieren können. Ob diese HAV/IgA-Komplexe in vivo d.h. im Organismus den Weg vom
Eintritt in den Blutstrom hin zur Leber zurücklegen können, und damit den in Abb. 1
dargestellten enterohepatischen Kreislauf schließen können, wurde in dieser Arbeit anhand
eines Mausmodells untersucht. Es wäre denkbar, das HAV trotz funktionsfähiger adaptiver
Immunabwehr seine Anwesenheit im Organismus maskiert indem es IgA als Trägermolekül
verwendet. Das Virus kann die Hepatozyten komplexiert mit IgA über den ASGPR infizieren
und es kommt zur Synthese von Virionen. Diese gelangen mit der Galle in den Darm und
werden dort entweder direkt mit sekretorischem IgA aus der Galle oder aber in der
Submucosa oder dem Blut mit IgA komplexiert und könnten erneut im Komplex mit IgA die
Leber infizieren. Dieser enterohepatische Kreislauf des Virus könnte protrahierte und
relapsierende Verläufe der Infektion erklären. Die wiederholte Infektion der Leber durch die
HAV/anti-HAV IgA-Komplexe während des möglichen enterohepatischen Kreislaufs spiegelt
sich in der Symptomatik der Rezidive, die der initialen Infektion gleichen, wieder. D.h. durch
ein Molekül dessen Funktion eigentlich die Neutralisation von viralen Infektionen ist, wird die
HAV Infektion unterstützt. Der IgA induzierte, enterohepatische Kreislauf könnte eine
entscheidende Rolle bei den durch mehrere Rückfälle charakterisierten Krankheitsverläufen
mit ihren kaskadenartig auftretenden Neuinfektionen spielen. Die Komplexierung mit IgA
schützt das Virus vor IgG und IgM Antikörpern und damit vor der Eliminierung. Mit Reifung
des Immunsystems steigt die Avidität der IgG Antikörper und es wäre denkbar, dass diese
das IgA aus den Komplexen verdrängen und den Reinfektionszyklus damit unterbrechen.
Ähnliche Antikörper-vermittelte Infektionen sind für eine Reihe von Viren bereits beschrieben.
So gelangen Poliovirus und Maul- und Klauenseuche-Virus, weitere Vertreter der Familie
Picornaviridae, komplexiert mit IgG über den Fc-γ Rezeptor in die Zellen. IgA vermittelte
Infektionen über den pIgR (Polymeric immunoglobulin receptor) wurden z.B. bei Eppstein
Barr und Influenza Virus beobachtet(84,81,7,45).
11
Die Diagnostik einer HAV Infektion erfolgt neben der Messung der Transaminasewerte durch
Bestimmung der IgM Antikörper im Serum. Bevor die ersten Antikörper im Serum
detektierbar sind befinden sich hohe Mengen Virus im Blut, Stuhl und Speichel. Wobei sich
im Stuhl mit 109 Virionen/g die höchsten Mengen befinden(137). Der Nachweis von Hepatitis
A-Virus Antigen sowie der viralen RNA z.B. durch RT-PCR ist ebenfalls möglich und schließt
das diagnostische Fenster der Antikörper Detektion(128,82,31,59,137,117). Die PCR ist eine sehr
schnelle und sensitive Methode zur in vitro Amplifikation spezifischer Nukleinsäureabschnitte
und ermöglicht somit die Detektion geringster Nukleinsäuremengen. Im Gegensatz zur
herkömmlichen PCR und der damit verbundenen Endpunktanalyse erlaubt die real-time
Messung eine genaue Quantifizierung des Targets(129).
1.2 Zielsetzung
In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob HAV-spezifisches IgA im Organismus als Carrier
für das Targeting des Virus zur Leber dient, d.h. ob das Virus im Komplex mit IgA die Leber
signifikant und selektiv erreicht. Anhand von Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden,
dass HAV komplexiert mit IgA aus dem Darmlumen in den Blutstrom übergehen kann, und
dass HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR Hepatozyten infizieren können. Mit Hilfe eines
Mausmodells soll in dieser Arbeit untersucht werden, ob HAV/IgA-Komplexe den Weg vom
Eintritt in den Blutstrom zur Leber zurücklegen können, und damit den anhand der
Zellkulturdaten postulierten unterstützenden Effekt auf die HAV Infektion der Leber sowie
den hypothetischen enterohepatischen Kreislauf schließen. Dieser IgA Carriermechanismus
verbunden mit dem enterohepatischen Kreislauf könnte eine entscheidende Rolle bei den
protrahierten und relapsierenden Krankheitsverläufen mit ihren kaskadenartig auftretenden
Neuinfektionen spielen. Zusätzlich zu dem postulierten Carriermechanismus wird die
Verteilung des Virus sowie das Replikationsverhalten im Modellorganismus nach
experimenteller Infektion untersucht.
Als Modell zur Untersuchung des IgA Carriermechanismus dienten Mäuse des Stammes
C3H/HEN. Generell lassen sich Mäuse nicht mit HAV infizieren. In Vorarbeiten konnte
anhand der murinen Hepatozytenzellinie NCTC, die dem Mausstamm C3H/HEN entstammt,
gezeigt werden, dass eine Infektion durch freies HAV in diesen Zellen nicht möglich ist, dass
aber eine experimentelle Infektion der Leber durch HAV/IgA-Komplexe über den ASGPR
stattfinden kann(35). D.h. die Mäuse des Stammes C3H/HEN bieten durch Ausschluß einer
Infektion durch noch vorhandenes freies HAV aus der Präparation der HAV/IgA-Komplexe,
12
die Möglichkeit eindeutig eine durch HAV/IgA-Komplexe verursachte Infektion
nachzuweisen, was mit den herkömmlichen Primatenmodellen nicht möglich ist.
Um einen generellen Eindruck der Virusverteilung im Organismus zu erhalten und um
nachzuweisen, ob die HAV/Antikörperkomplexe vor Erreichen der Leber von der Niere aus
dem Blut herausgefiltert werden, wurden zusätzlich zur Leber weitere Gewebe, wie Niere,
Milz, Thymus und Gekröse (Lymphgewebe des Darmbereichs) auf eventuell vorhandenes
Virus und virale Replikation untersucht. Im Mausmodell kann von einer eher geringen
recovery rate des Virus im Gewebe ausgegangen werden, daher war es notwendig ein
hochsensitives HAV Nachweissystem zu entwickeln. Zur Analyse der quantitativen
Verteilung des Virus in den Geweben wurde ein real-time RT PCR System und zur
Untersuchung der Virusreplikation ein real-time basierendes System zum Nachweis und zur
Quantifizierung des viralen (-) Stranges, als Replikationsmarker, entwickelt.
13
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material
2.1.1 Versuchstiere
Die Tierversuche wurden unter dem Aktenzeichen 522-27-11/2-0 von der Bremischen
Senatorischen Behörde für Arbeit, Frauen, Gesundheit, Jugend und Soziales (SAFGJS)/
Fachreferat Veterinärwesen genehmigt.
Die für diese Arbeit verwendeten Mäuse stammten von Charles River, Research Models and
Services Germany GmbH, Sulzfeld. Die Tiere hatten freien Zugang zu keimarmem Wasser
und Futter und wurden bis Versuchsbeginn unter pathogenfreien Bedingungen gehalten. Für
die Arbeit wurden männliche C3H/HEN-Mäuse im Alter von 42 – 46 (jugendlich) und 63 - 84
Tagen, wobei die Tiere ab einem Alter von 63 Tagen als erwachsen betrachtet werden,
verwendet.
2.1.2 Virusstämme
Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp IA:
HAV/GBM ein ursprünglich aus Stuhlproben gewonnenes Patientenisolat(44);
Passagierung : HAV GBM FRhK-4 62 FRhK-4(USA)
Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp IB:
HAV/7 als Variante des Stammes HM175(22), passagiert in FRhK-4-Zellen
HAV/PI als Variante des Stammes HM175(12,28), passagiert in FRhK-4-Zellen
Hepatitis A-Virus (HAV) Genotyp III:
HAV/HMH ein aus HAV positivem Frischplasma gewonnenes Patientenisolat(56)
14
2.1.3 Zelllinien
FRhK-4-Zellen: fetale Rhesusaffen Nierenzellen (CBER/FDA, Department of
Virology, Behesda, Maryland, USA)
NCTC Zellen: murine Hepatozyten Zelllinie Klon 1469 (ATCC CCL9.1
Mannassas, VA, USA)
2.1.4 Zellkulturmedien
Wachstumsmedium: Dulbecco´s Eagle´s medium (DMEM) mit
2 mM L-Glutamin
26 mM NaHCO3
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
10 % (v/v) fetales Kälberserumg (FCS)
Erhaltungsmedium: DMEM mit
2 mM L-Glutamin
26 mM NaHCO3
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
1 % (v/v) FCS
2.1.5 Antibiotika und Fungizide
Name Firma
Penicillin [10.000 U/ml] Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Streptomycin [10.000 µg/ml] Sigma-Aldrich, Taufkirchen
15
2.1.6 Synthetische Nukleinsäuren
2.1.6.1 Primer und Sonden
Alle Primer und Sonden wurden von Metabion, Martinsried synthetisiert.
Die Sequenzen für das HAV LC RT-PCR System, sowohl Primer und Sonden für die
spezifische als auch die interne Kontroll PCR und die Sequenzen für die (-) Strang
Nachweise unterliegen der Geheimhaltung und werden in dieser Arbeit nicht veröffentlicht.
Primer und Sonden für die PCR der 18S rRNA
18S RNA forward 5´- ACG GCT ACC ACA TCC AAG GA -3’
18S RNA revers 5´- CCA ATT ACA GGG CCT CGA AA -3`
18S RNA Sonde 5´-FAM- CAG GCG CGC AAA TTA CCC ACT CC -TAMRA-3´
Primer und Sonden für die GAPDH PCR
GAPDH forward 5`- CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG -3´
GAPDH revers 5´- CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA -3´
GAPDH Sonde 5´-FAM-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG GAC TCA TGA CC-TAMRA-3´
2.1.6.2 Andere
Name Firma
Poly (A) RNA Amersham Biosciences, Uppsala, SWE
1 kb DNA Längenstandard MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Marker 23 MBI Fermentas, St. Leon-Rot
2.1.7 Enzyme
Name Firma
Bst DNA Polymerase New England BioLabs®, Frankfurt
rBst DNA Polymerase EPICENTRE® Biotechnologies, Madison
Luna Taq DNA Polymerase Bioline Ltd., London, UK
phi29 DNA Polymerase New England BioLabs®, Frankfurt
16
Platinum® Taq DNA Polymerase Invitrogen, Karlsruhe
TaKaRa HS Taq DNA Polymerase TaKaRa Bio Inc., Madison, USA
T4 DNA Ligase New England BioLabs®, Frankfurt
T4 RNA Ligase 2 New England BioLabs®, Frankfurt
Transcriptor Reversen Transcriptase Roche Diagnostics, Mannheim
Trypsin mit Natrium-EDTA [0,2 g/l] Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2.1.8 Sonstige Proteine
Name Firma
Bovines Serum Albumin (BSA) Roche Diagnostics, Mannheim
Fetales Kälberserum (FCS) GIBCO BRL, Gaithersburg, USA
anti-HAV (mouse IgG2a), Klon 7E7 [5 mg/ml] mediagnost, Tübingen
anti-HAV (mouse IgA), Klon 1.193 [5 mg/ml] Stanley M. Lemon, UTMB, Texas, USA
anti-Maus IgG, FITC-markiert [0,5 mg/ml] Kierkegaard & Perry, Gaithersburg
T4 Gene 32 Protein Ambion, Austin, USA
Tth RecA BioHelix, Beverly, USA
2.1.9 Kits
Name Firma
High Pure PCR Purification Kit Roche Diagnostics, Mannheim
LightCycler® - HAV Quantification Kit Roche Diagnostics, Mannheim
MEGAscript® T7 Kit Ambion, Huntingdon, UK
RevertAid H- First Strand cDNA Synthesis MBI Fermentas, St. Leon-Rot
RNeasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden
T7 Transcription Kit MBI Fermentas, St. Leon-Rot
QIAamp® DSP Virus Kit QIAGEN, Hilden
QIAamp® Viral RNA Mini Kit QIAGEN, Hilden
QIAquick® PCR Purification Kit QIAGEN, Hilden
QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden
17
2.1.10 Chemikalien
Name Firma
Aceton Fluka, Buchs SG, Schweiz
Agarose (ultra-pure grade) Invitrogen, Karlsruhe
Betaine Fluka, Buchs SG, Schweiz
Calciumchlorid Fluka, Buchs SG, Schweiz
DAPI Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DMEM Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Dynabeads®MyOne™Streptavidin Dynal Biotech, Oslo
Essigsäure Merck, Darmstadt
Evans Blue Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Merck, Darmstadt
Isopropanol Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat Riedel-de Haen, Seelze
6 x Loading dye MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2-Mercaptotethanol Fluka, Buchs SG, Schweiz
Methanol Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Fluka, Buchs SG, Schweiz
Nuklease-freies Wasser Ambion, Huntingdon, UK
PBS Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Polyethylenglycol Sigma-Aldrich, Taufkirchen
TAE AppliChem, Darmstadt
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypanblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2.1.11 Puffer und Lösungen
Agarose Gelelektrophorese
1 x TAE 10 x TAE 1:10 verdünnt in Aqua dest.
18
Zellzahlbestimmung
0,4 % (w/v) Trypanblau in 0,81 % (w/v) NaCl/0,06 % (w/v) K2HPO4
Mykoplasmenfärbung
DAPI-Lösung 0,1 µg/ml DAPI in PBS
Methanol/Eisessig 75 % (v/v) Methanol in Eisessig
Indirekte Immunfluoreszenz
Aceton 90 % (v/v) Aceton in PBS
Antikörper anti-HAV (mouse IgG2a) Klon 7E7 1 : 600 in PBS
Antikörper anti-Maus-IgG (goat), FITC-markiert 1 : 80 in PBS
2.1.12 Verbrauchsmaterialien
Name Firma
Combitips® Eppendorf, Hamburg
Glasobjektträger Omnilab, Bremen
LightCycler® Kapillaren Roche Diagnostics, Mannheim
Optical Adhesive Covers Applied Biosystems, Foster City, USA
Pipettenspitzen Biozym, Hess. Oldendorf
PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf
Reaktionsgefäße 1,5 ml und 2 ml Eppendorf, Hamburg
Röhrchen, 15 ml und 50 ml Greiner-Bio One, Frickenhausen
RotorGene® Reaktionsgefäße Corbett Life Science, Sydney, AUS
96-Well Optical reaction plates Applied Biosystems, Foster City, USA
Zell- und Gewebekulturgefäße Nunc, Wiesbaden
19
2.1.13 Geräte
Name Firma
ABI Prism™ 7900HT SDS Applied Biosystems, Foster City, USA
Begasungsbrutschrank Heraeus Sepatech, Osterode
Biofuge pico Heraeus Sepatech, Osterode
Brutschrank Model B 5090 E Heraeus Sepatech, Osterode
Digitalkamera Model 120 Kodak digital science, Rochester, USA
ELISA-Reader Molecular Devices, München
Fluoreszenzmikroskop „Axioskop 2“ Zeiss, Jena
Fuchs-Rosenthal Zählkammer Assistent, Sondheim
Gelelektrophoresekammer Horizon 11.14 GIBCO BRL, Gaithersburg, USA
Lichtmikroskop Wilovert S Hund, Wetzlar
LightCycler® 1.2 und 2.0 Roche Diagnostics, Mannheim
Magnetic Particle Concentrator; Dynal MPC® Dynal Biotech, Oslo, NOR
Mastercycler Model 5333 Eppendorf, Hamburg
Mikrowelle AEG Micromat 16 AEG, Stockholm, SWE
Power-Supply Model 250 Ex GIBCO BRL, Gaithersburg, USA
RotorGene 3000 Corbett Life Science, Sydney, AUS
Thermomixer Model comfort, 2 ml und 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
Waage Model PB3002-S Delta Range Mettler Toledo, Giessen
Ultra Turrax T25 basic IKA® Werke, Staufen
UV Photometer BioPhotometer Eppendorf, Hamburg
UV Spectrophotometer SpectronHeliosβ Thermo Electron, Dreieich
UV Transilluminator Model TFX-35M GIBCO BRL, Gaithersburg, USA
Zentrifuge 5415D Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge J2-21 Beckman Coulter, Unterschleißheim
Zentrifuge Rotanta 96 RSC Hettich, Tuttlingen
2.1.14 Software
Name Firma
ABI 7900 HT SDS 2.1 Applied Biosystems, Foster City, USA
Chromas Vers. 1.45 Griffith University, Queensland, USA
DNASTAR:MegAlign und EditSeq 5.06 DNASTAR, Madison, USA
EndNote Vers.9.0.0 Thomson Scientific, London, UK
20
GraphicConverter V4.3 Lemke Software, Peine
Kodak ds 1D Vers. 2.0.3 Kodak digital science, Rochester, UK
LightCyclerSoftware Vers. 3 und 4 Roche Diagnostics, Mannheim
MacromediaFreeHandMX Vers. 10.3.9 Adobe Systems, München
MicrosoftExcel 2004 Vers. 11.2 Microsoft, Unterschleißheim
MicrosoftWord 2004 Vers. 11.2 Microsoft, Unterschleißheim
OmniGraffle Pro Vers. 3.2.4 The Omni Group, Seattle, USA
Primer Express Vers. 2.0.0 Applied Biosystems, Foster City, USA
PriProbit Vers. 1.63 Kyoto University, Kyoto, Japan
RotorGene 3000 Software 5.0 und 6.0 Corbett Life Science, Sydney, AUS
SPSS 11 SPSS Inc., Chicago, USA
2.2 Methoden
2.2.1 Kultivierung von Zellen
Bis zur Ausbildung eines konfluenten Zellrasens wurden die FRhK-4 Zellen in
Wachstumsmedium bei 37°C und 5% CO 2 kultiviert. Anschließend wurde auf
Erhaltungsmedium gewechselt, welches 1% FCS enthielt. Nach Bedarf, spätestens jedoch
alle zwei Wochen, wurden die Zellen im Verhältnis 1 : 6 gesplittet. Dazu wurde das Medium
abpipettiert, der Zellrasen gründlich mit Trypsin-EDTA-Lösung gewaschen und anschließend
bis zum Ablösen der Zellen in einem Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung inkubiert. Die
Zellsuspension wurde in Wachstumsmedium aufgenommen und entsprechend ihres
Splitverhältnisses in neue Kulturgefäße gegeben.
2.2.2 Bestimmung der Zellzahl
Für die Zellzahlbestimmung wurden die Zellen abtrypsiniert und im Verhältnis 1 : 2 mit einer
0,2%igen Trypanblaulösung vermischt. Mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal Zählkammer wurden
die vitalen Zellen der Suspension ausgezählt und unter Berücksichtigung des Kammerfaktors
und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor die Zellzahl pro Milliliter berechnet.
21
2.2.3 Mykoplasmen-Test
Die verwendeten Zellen wurden regelmäßig auf etwaige Kontamination durch Mykoplasmen
untersucht. Dazu wurden die Zellen im Verhältnis 1 : 30 gesplittet und auf Glasobjektträgern
bis zur Zelldichte von 30 – 50% kultiviert. Nach Entfernung des Mediums wurde der
Zellrasen zunächst je einmal mit PBS, PBS/75% Methanol in Eisessig (1 : 1) und 75%
Methanol in Eisessig gewaschen und im Anschluss für 15 min. in eiskaltem
Methanol/Eisessig bei Raumtemperatur fixiert. Nachdem der fixierte Zellrasen mit Wasser
gewaschen wurde, erfolgte die eigentliche Färbung der Mykoplasmen durch 10minütige
Inkubation mit 1 µg/ml DAPI in PBS bei Raumtemperatur und im Dunkeln. Die DAPI-Lösung
wurde entfernt, der Zellrasen erneut mit Wasser gewaschen und mit Eindeckmedium
benetzt. Nachdem ein Deckglas aufgelegt wurde erfolgte die Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop.
2.2.4 Herstellung von Viruspools
Zur Virusvermehrung wurden FRhK-4 Zellen in 80 cm2 Kulturflaschen bis zum Erreichen
einer Zelldichte von etwa 80% kultiviert und im Anschluss infiziert. Dazu wurde das
Kulturmedium abgenommen und durch 5 ml eines Infektionsmediums, welches aus
DMEM/1% FCS und der entsprechenden Virussuspension bestand, ersetzt. Die Kulturen
wurde 2 Stunden bei 37°C und 5% CO 2 mit dem Infektionsmedium inkubiert, wobei zur
Vermeidung des Austrocknens des Zellrasens alle 20 Minuten geschwenkt wurde.
Anschließend wurden 15 ml des Erhaltungsmediums DMEM/1% FCS zugegeben und für 24
Stunden bei 37°C und 5% CO 2 kultiviert. Danach folgt ein kompletter Medienwechsel mit
20 ml DMEM/1% FCS und die weitere Kultivierung für 14 Tage. Für die Virusernte wurden
die Kulturen dreimal bei – 80°C eingefroren und wie der aufgetaut. Das Zelllysat wurde in 50
ml Röhrchen überführt und um Virusaggregate zu lösen dreimal 20 sec. mit Ultraschall
behandelt. Anschließend wurden die Zelltrümmer durch 10minütige Zentrifugation bei 3.000
rpm und 4°C sedimentiert. Der das Virus enthaltende Überstand wurde abgenommen,
aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei – 80°C gelagert.
2.2.5 Bestimmung des 50 %-Endpunkttiters (TCID 50/ml)
Zur Bestimmung des Virustiters wurden FRhK-4 Zellen in Mikrotiterplatten bis zur Zelldichte
von 80% kultiviert und anschließend infiziert. Dazu wurden von den zu titrierenden
22
Viruspools (HAV/7, HAV/GBM und HAV/PI) serielle, logarithmische Verdünnungsreihen zur
Basis zehn (10-1 – 10-11) in Erhaltungsmedium hergestellt. Nach Entfernung des
Wachstumsmediums wurde in acht parallelen Ansätzen je 100 µl der jeweiligen
Verdünnungsstufe zu den Zellen gegeben und für zwei Stunden bei 37°C und 5% CO 2
inkubiert. Nach Entfernung der Virusverdünnung folgte ein zweimaliger Waschschritt mit
DMEM/1% FCS bevor zur weiteren Kultivierung bei 37°C und 5% CO2 200 µl
Erhaltungsmedium zugegeben wurde. Die Auswertung erfolgte nach 14 Tagen durch
indirekte Immunfluoreszenz. Dafür wurde das Medium abgenommen und der Zellrasen
einmal mit 100 µl PBS/Kavität gespült. Die Zellen wurden mit 100 µl eiskaltem 90%igem
Aceton in PBS für 20 Minuten bei – 20°C fixiert und anschließend zweimal mit 200 µl PBS
gewaschen. Die Bindung des primären monoklonalen anti-HAV-Antikörpers 7E7 erfolgte für
45 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer, wobei je Kavität 50 µl der
Antikörperverdünnung (anti-HAV 7E7 in PBS 1 : 600) zugegeben wurden. Nach Entfernung
des primären Antikörpers wurde der Zellrasen dreimal mit je 300 µl PBS gewaschen und es
folgte die Zugabe von 50 µl des sekundären, FITC-markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers
(1 : 80 in PBS verdünnt; mit 0,5 µl Evans Blue/ml) und erneute Inkubation für 45 Minuten bei
37°C in einer feuchten Kammer. Der sekundäre Antikö rper wurde entfernt und der Zellrasen
dreimal mit je 300 µl PBS/Kavität gewaschen. Die Auswertung erfolgte durch Begutachtung
unter dem Fluoreszenzmikroskop, wobei eine Kavität als positiv bewertet wurde, sobald
mindestens eine Zelle die für HAV typische granuläre Fluoreszenz zeigte.
Die Bestimmung der 50 % Endpunkttiter (TCID50) erfolgte mittels Kärber Gleichung:
Verd. lg. 5,0100
Verd.jeder aus %)(in Wellsinf. Summe Verd. geringste lgTCID lg 50
×
−−−=−
2.2.6 Isolierung viraler RNA aus zellfreien Medien
Alle Extraktionen viraler RNA aus zellfreien Medien wie z.B. Plasma, Serum oder auch
Zellkulturüberstand wurden mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit oder mit dem QIAamp
DSP Virus Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Das Aufreinigungsvolumen im QIAamp
Viral RNA Mini Kit betrug immer 140 µl, der im Protokoll als optional angegebene
Trocknungsschritt direkt vor der Elution wurde bei jeder Aufreinigung durchgeführt. Das
Elutionsvolumen betrug 60 µl bzw. 80 µl AVE Puffer. In die Aufreinigung mit dem QIAamp
DSP Kit ließen sich 500 µl einsetzen, eluiert wurde dabei in 60 µl AVE Puffer.
23
2.2.7 Photometrische Konzentrationsbestimmung von N ukleinsäuren
Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren wurden 100 µl einer
1 : 50 Verdünnung in Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm bei 260 nm, dem
Absorptionsmaximum für DNA/RNA, gegen Wasser gemessen. Eine OD260 (optische Dichte
bei 260 nm) entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Zusätzlich kann die Reinheit der RNA durch das
Verhältnis der Absorption von Nukleinsäure (A260) zu Proteinen (A280) bestimmt werden.
Der Quotient A260/A280 sollte bei reiner RNA ≥2,0 sein; kleinere Werte weisen auf eine
Verunreinigung durch Proteine hin.
2.2.8 Real-time RT-PCR System zur Quantifizierung von HAV RNA
Die real-time PCR zur HAV RNA Quantifizierung wurde für die Detektion aus Plasma, Serum
und Gewebeproben auf dem LightCycler 1.2 (Roche Diagnostics, Mannheim) entwickelt.
Die Quantifizierung erfolgt über eine externe Standardreihe, wobei die HAV Menge in
Internationalen Einheiten/Mikroliter (IU/µl) angegeben wird. Jeder PCR Lauf wurde mit
mindestens einer Positivprobe (HAV RNA oder Quantifizierunsstandard) und einer
Negativprobe (Wasser) durchgeführt. Die PCR enthält neben dem spezifischen HAV
Detektionssystem ein heterologes Amplifikationssystem (Interne Kontrolle), welches zur
Überprüfung der Extraktion und Amplifikation dient. Für die RT-PCR werden pro Reaktion zu
13 µl Mastermix 2 µl Magnesiumsolution und 5 µl Probe gegeben. Optional können zur
Überprüfung der Amplifikationsreaktion 0,5 µl RNA der Internen Kontrolle zu jedem PCR-
Ansatz und zur Überprüfung der Extraktion 0,1 µl RNA der Internen Kontrolle
pro µl Elutionsvolumen zur Probe gegeben werden.
2.2.8.1 Primer und Sonden Auswahl
Als Basis für die Auswahl der Primer und der Sonde diente die HAV-Sequenz des Stammes
HM-175 (Acc. No. M14707). Die Primer und die Sonde wurden mit Hilfe der Primer
Express Software im Sequenzbereich des VP1 Proteins des HAV Genoms ausgewählt
(Vers. 1.0; Applied Biosystems) und umfassen eine Amplikonlänge von 90 Basen. Als
Sondensystem wurde eine TaqMan®-Sonde gewählt. Die ausgewählten Primer und die
Sonde wurden mit Hilfe der Software MegAlign™ (DNASTAR, USA) auf die Homologie zu
24
allen bisher bekannten HAV Genotypen überprüft, so dass aufgrund der Auswahl der Primer
und der Sonde eine hohe Spezifität gewährleistet ist.
2.2.8.2 Titration der PCR Komponenten
Die Optimierung der PCR erfolgte in Bezug auf das Temperaturprofil und die Wahl und
Menge der einzelnen Reaktionskomponenten, wie Taq DNA Polymerase, Reverse
Transkriptase, Primer und Sonden, Sondenmarkierung, Magnesium, dNTP. Für jede
Komponente wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt und mit der gleichen Menge
Positivmaterial (HAV/7) in der RT-PCR getestet. Es wurden die Konzentrationen ausgewählt,
bei der der Schwellenwert bei geringster Zyklenzahl (CT) überschritten wird, und die Signale
größtmögliche Steigung und höchste Fluoreszenzsignale zeigen.
2.2.8.3 In vitro Transkription zur Herstellung der Quantifizierungs standards
Zur Generierung der Quantifizierungsstandards (QS) wurde ein RT-PCR Lauf mit HAV/7
RNA ohne Interne Kontrolle (IC) durchgeführt, bei dem am 5´-Ende des forward Primer die
T7-Promotor Sequenz gekoppelt war, die so ins Amplifikat integrierte. Das Amplifikat wurde
mit dem High Pure PCR Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) entsprechend den
Herstellerangaben gereinigt. 128 ng des Amplifikates mit dem MEGAscript® T7 Kit (Ambion,
Huntingdon) nach Angaben des Herstellers transkribiert und DNase I verdaut. Das in vitro
Transkript (IVT) wurde mit dem RNeasy® Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) gereinigt und
photometrisch vermessen. Über die Amplikonlänge von 90 Basen und die RNA
Konzentration des IVT´s wurde die Kopienzahl bestimmt. Der Vergleich der IVT
Verdünnungsreihe mit dem Internationalen Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC
Code 00/560) der Weltgesundheitssorganisation (WHO) ergab, dass zehn Kopien des IVT´s
einer Internationalen Einheit (IU) WHO Standard entsprechen. Als Quantifizierungsstandards
(QS 4 – QS 1) wurden IVT Verdünnungen festgelegt die mit einer, zehn, hundert und
tausend internationalen Einheiten übereinstimmen.
2.2.8.4 Sensitivitätsbestimmung
Unterschieden werden die Sensitivitätsbestimmung unter Berücksichtigung der Aufreinigung
mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit, welche das Sensitivitätslimit der HAV Detektion
25
bezogen auf einen Milliliter Plasma darstellt, und die Sensitivitätsbestimmung ohne
Aufreinigungsverfahren, bei der sich das Sensitivitätslimit auf die HAV Menge im Mikroliter
Eluat bezieht.
2.2.8.4.1 Sensitivitätsbestimmung unter Berücksicht igung der Aufreinigungsmethode
Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze der HAV RT-PCR wurde der Internationale
Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC Code 00/560) in HAV negatives Plasma
gegeben und halblogarithmisch von 571,5 IU/ml bis 0,181 IU/ml verdünnt. Jede
Verdünnungsstufe wurde in 24er Replikaten mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN,
Hilden) nach Herstellerangaben (Aufreinigungsvolumen 140 µl; Elutionsvolumen 80 µl)
aufgereinigt und an drei Tagen unter Verwendung von drei verschiedenen Geräten gleicher
Bauart mit der HAV RT-PCR analysiert. Die Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse
(PriProbit® Vers. 1.63).
2.2.8.4.2 Sensitivitätsbestimmung unabhängig von de r Aufreinigungsmethode
Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze der HAV RT-PCR wurde der Internationale
Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC Code 00/560) mit dem QIAamp® Viral RNA Mini
Kit (QIAGEN, Hilden) nach Herstellerangaben (Aufreinigungsvolumen 140 µl;
Elutionsvolumen 60 µl) aufgereinigt und halblogarithmisch von 1 IU/µl bis nominal
0,000316 IU/µl verdünnt. Die Analyse in der HAV RT-PCR erfolgte in achtfach Replikaten an
drei Tagen unter Verwendung von drei verschiedenen Geräten gleicher Bauart. Die
Auswertung erfolgt durch eine Probit-Analyse (PriProbit Vers. 1.63).
2.2.8.5 Robustheitsuntersuchung
Zur Untersuchung der Robustheit der HAV RT-PCR wurden 30 HAV negative
Plasmaproben mit je 0,39 IU/µl Internationale Standard für HAV RNA NAT Assays (NIBSC
Code 00/560) versetzt, mit dem QIAamp® DSP Virus Kit laut Herstellerangaben aufgereinigt
und mit der HAV RT-PCR analysiert. Neben der HAV spezifischen PCR wurde auf gleiche
Weise die Robustheit der Internen Kontrolle überprüft.
26
2.2.8.6 Spezifitätstest
Zur Untersuchung der Spezifität wurden 30 verschiedene HAV negative Plasmaspenden mit
der HAV RT-PCR analysiert. Zusätzlich wurden verschiedene Erreger auf ihre
Kreuzreaktivität untersucht sowie verschiedene humanpathogene HAV Genotypen getestet.
2.2.8.6.1 Kreuzreaktivitätstest
Für die Testung auf Kreuzreaktivität des HAV RT-PCR Systems wurden folgende Erreger
(siehe Tab. 1) mit dem QIAamp® DSP Virus Kit (QIAGEN, Hilden) aufgereinigt. Während der
Aufreinigung wurde Interne Kontroll RNA in das Probenmaterial gegeben. Die Analyse in der
HAV RT-PCR wurde jeweils in Doppelbestimmung durchgeführt, zusätzlich wurde in jedem
PCR Lauf eine Positivkontrolle (HAV/7 RNA) und eine Negativkontrolle (H2O) mitgeführt.
Tab. 1 : Liste der auf Kreuzreaktivität mit dem HAV RT PCR System untersuchten Erreger Virus Konzentration Ursprung Poliovirus 2 104 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus A9 107 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus A16 nicht quantifiziert Zellkultur Coxsackievirus B3 8 x 107 Kopien/ml Zellkultur Coxsackievirus B5 2 x 105 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 6 nicht quantifiziert Zellkultur Echovirus 9 108 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 11 2 x 105 Kopien/ml Zellkultur Echovirus 22 nicht quantifiziert Zellkultur Echovirus 30 108 Kopien/ml Zellkultur Rhinovirus 1b nicht quantifiziert Zellkultur Enterovirus 71 nicht quantifiziert Zellkultur Hepatitis B Virus 106 IU/ml Plasma Hepatitis C Virus 103 IU/ml Standard ACCURUN 305
(BBI Diagnostics, Boston)
2.2.8.6.2 Detektion aller relevanten Genotypen
Zu den für die humane Diagnostik relevanten Genotypen zählen die Genotypen I bis III und
VII. Von den Genotypen IA, IB und III wurde Zellkulturmaterial der Virusstämme
HAV/GBM (IA), HAV/7 (IB) und HAV/HMH (III) getestet. Da von den Genotypen II und VII
kein echtes Virusmaterial zur Verfügung stand, wurden synthetisch Nukleinsäuren
hergestellt. Basierend auf den Sequenzinformationen aus der Genbank für Genotyp II
(HAV/9F94 Acc. Nr AJ437317) und Genotyp VII (HAV/SLF88 Acc Nr, AY032861) wurde der
Targetbereich in zwei Oligonukleotide unterteilt, wobei die Einteilung so vorgenommen
27
wurde, dass ein 25 Basen langer Überlappungsbereich entstand. In einer
Polymerisationreaktion wurden die beiden Oligonukleotide zu einem doppelsträngigen DNA
Konstrukt vervollständigt. Dazu wurden je 10 pmol der Oligonukleotide (Metabion,
Martinsried), 5 mMol MgSO4 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), 0,2 mMol dNTP-Mix (Roche
Diagnostics, Mannheim) und 0,25 U Taq Polymerase (TaKaRa, Madison, USA) gemischt
und für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Nukleinsäur efragmente wurden in unterschiedlichen
Verdünnungen in der HAV RT-PCR getestet.
2.2.8.7 Präzision
Zur Bestimmung der Intra-Assay-Variabilität wurden acht Replikate einer Plasmaprobe mit
571,5 IU/ml HAV mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden) aufgereinigt und in
einem RT-PCR Lauf getestet. Für die Inter-Assay-Variabilität wurden drei verschiedene RT-
PCR Läufe an drei verschiedenen Geräten und von drei verschiedenen Personen
durchgeführt. Die Inter-Chargen-Variabilität ergibt sich aus der Testung von den gleichen
acht Replikaten mit drei unterschiedlichen Chargen des RT-PCR Mastermix.
2.2.9 PCR zum Nachweis von 18S rRNA und GAPDH RNA
Zur Normalisierung der HAV Menge aus den Geweben wurden diese sowohl auf die
18S rRNA als auch auf die GAPDH RNA Menge der Gewebe bezogen. Dazu wurde
zusätzlich zu der HAV RT-PCR aus jedem Eluat eine PCR zur relativen Quantifizierung der
18S rRNA und der GAPDH RNA durchgeführt. Diese PCRs wurden als two-step PCR
durchgeführt. Zunächst wurden je 5 µl der Eluate aus der Gewebeaufreinigung mittels des
RevertAid® H minus First Strand cDNA Synthesis Kits (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) unter
Verwendung des Random Hexamer Primers nach Herstellerangaben in cDNA
umgeschrieben. Diese cDNA wurde 1 : 100 verdünnt und je 2 µl in die eigentliche PCR
eingesetzt. Sowohl die 18S als auch die GAPDH PCR erfolgten in einem Reaktionsvolumen
von 25 µl bestehend aus PCR Puffer (2 x PCR Master Mix, Applied Biosystems, Foster City),
0,5 U Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe), je 10 pmol forward und
reverse Primer und 3 pmol der Taqman Sonde. Die PCR wurde im ABI Prism™ 7900HT
SDS mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 10 min Denaturierung (95°C) gefolgt von
45 Zyklen von 15 Sek. Denaturierung und 1 min. Annealing und Elongation bei 55°C.
28
2.2.10 Agarose-Gelelektrophorese
Die Amplifikate wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese in einem Gel mit 2% Agarose
in TAE-Puffer und 0,4 µg/ml Ethidiumbromid analysiert. Dazu wurden 8 µl der Probe mit 2 µl
6 x Ladepuffer vermischt und in die Taschen des Gels gegeben. Zusätzlich wurde als
Längenstandard ein 1 kb DNA-Längenmarker (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Die Auftrennung erfolgte in TAE-Puffer bei konstant 70 V für eine Stunde. Anschließend
wurde das Gel in einem UV-Transilluminator begutachtet und dokumentiert, wobei
besonderes Augenmerk auf die Höhe der Bande, d.h. Länge des Fragments, und die
Bandenanzahl gelegt wurde.
2.2.11 Infektion der Mäuse
Nach 7 Tagen der Eingewöhnung wurden die C3H/HEN-Mäuse gewogen und
versuchsabhängig mit 1 ml Zellkulturmedium (als Negativkontrolle), HAV/PI, HAV/anti-HAV
IgA- bzw. HAV/anti-HAV IgG-Komplexen intraperitoneal, intravenös oder oral, mittels
Magensonde, inokuliert. Die Inokula mit den Immunkomplexen enthielten die gleiche HAV
Konzentration wie das Inokula des nicht komplexierten HAV/PI, so dass jeder Maus
unabhängig vom Inokula die gleiche Virusmenge appliziert wurde. Vor und nach der
Inokulation wurden die Mäuse einer visuellen Vitalitätskontrolle unterzogen und bis zur
Sektion gehalten.
2.2.12 Herstellung der Inokula zur Infektion
Zur Herstellung der Inokula wurde zunächst ein in FRhK-4 generierter Viruspool (HAV/PI)
austitriert. Alle Inokula wurden aus diesem Stock mit 1 x 107 TCID50/ml hergestellt, dabei
wurde das nicht komplexierte Virus 1 : 10 in DMEM verdünnt eingesetzt. Zur Herstellung der
Immunkomplexe wurden HAV/PI 1 : 10 verdünnt mit anti-HAV IgG [5 mg/ml] (mediagnost,
Tübingen) 1 : 250 bzw. anti-HAV IgA [8,8 mg/ml] 1 : 440 verdünnt in DMEM angesetzt und
für 3 h bei RT geschwenkt. Anschließend wurden die Komplexe aliquotiert und bis zur
Verwendung bei -70°C eingefroren. Zur Überprüfung d er Antikörperbindung wurde von
jedem Aliquot ein Röhrchen aufgetaut und im Vergleich mit dem HAV/PI Inokula in FRhK-4
Zellen austitriert. Die Komplexe wurden für die Infektionsversuche eingesetzt, sofern die
Titration eine Reduktion der Infektiösität > 99% im Vergleich zur TCID50 des HAV/PI zeigte.
29
2.2.13 Immunisierung der Mäuse
Die Immunisierung der Mäuse erfolgte durch subkutane und intraperitoneale Inokulation der
Mäuse mit jeweils 0,5 ml HAV/PI [1 x 107 TCID50/ml] 1:10 verdünnt in PBS. Die
Immunisierung erfolgte dreimal, zu Beginn des Versuchs (t0) nach einem und nach drei
Monaten. Zur Kontrolle des Immunstatus wurde den Mäusen zu den Zeitpunkten t0, nach
einem, drei und sechs Monaten durch Punktion des retrobulbären Venenplexus Blut
entnommen und auf anti-HAV IgG untersucht.
2.2.14 Blutentnahme aus dem retrobulbären Venenplex us
Zur Blutentnahme wurden die Tiere mit CO2 narkotisiert. Während der Narkose wurde eine
Hämatokritkapillare im Augenwinkel eingeführt und das Venengeflecht hinter dem Augapfel
angestochen. Das gesammelte Blut wurde zur Agglutination für 30 Min. bei 37°C inkubiert.
Nach 10minütiger Zentrifugation bei 6.000 rpm wurde das Serum abgenommen und bis zur
anti-HAV IgG Titerbestimmung bei -20°C gelagert.
2.2.15 Bestimmung des anti-HAV IgG Status der Mäuse
Zur Überprüfung der Immunisierung wurde das Serum der Tiere auf anti-HAV IgG Antikörper
untersucht. Die Antikörperbestimmung wurde mit dem anti-HAV ELISA Kit der mediagnost®,
Tübingen durchgeführt. Die Messung erfolgte bei 450 nm im ELISA-Reader (Molecular
Devices, München). Sowohl Durchführung als auch Auswertung erfolgte nach Angaben des
Herstellers. Dabei sind Proben deren Extinktion größer ist als der cut-off als anti-HAV IgG
negativ und Proben, deren Extinktion kleiner ist als der cut-off als anti-HAV IgG positiv zu
bewerten, wobei gilt je niedriger der Extinktionswert desto höher der anti-HAV IgG Titer. Der
cut-off wird nach folgender Formel berechnet:
( )2
off-cut KontrollepositiveExtinktionKontrollenegativeExtinktion +=
2.2.16 HAV Neutralisation durch Mausseren
Zur Überprüfung der Immunantwort in den Seren der Mäuse wurde die HAV
Neutralisationsfähigkeit der zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Immunisierung
entnommen Seren analysiert. Zur Bildung der HAV Immunkomplexe wurden die Mausseren
30
1:100 verdünnt und in die Komplexbildung (siehe 2.2.12) eingesetzt. FRhK-4 Zellen wurden
in 6-well-Platten ausgesäht und bei einer Zelldichte von 80% mit 500 µl des jeweiligen
Inokula infiziert. Direkt nach der Infektion sowie nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C und
5% CO2 erfolgte die Analyse der Zellen. Dafür wurde das Zellkulturmedium abgenommen,
die Zellen abtrypsiniert und mittels Zentrifugation pelletiert. Die RNA Extraktion erfolgte nach
Angaben des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Die Nukleinsäure
wurde bis zur letzten Probenahme bei – 80°C gelager t, anschließend wurde sie auf den
HAV, 18S und GAPDH-Gehalt sowie die gesamte Nukleinsäuremenge untersucht.
2.2.17 Sektion der Mäuse
Die Mäuse wurden mit CO2 narkotisiert und während der Bewusstlosigkeit dekapitiert. Das
austretende Blut wurde direkt aufgefangen und bis zur weiteren Bearbeitung bei - 80°C
eingefroren. Anschließend wurden die Organe entnommen, gewogen und ebenfalls bis zur
Bearbeitung bei – 80°C gelagert.
2.2.18 Isolierung der Nukleinsäure aus den Mausgewe ben
Die Aufreinigung aller Gewebe sowie des Blutes erfolgte nach Herstellerangaben mit dem
RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Um eine Veränderung des Genexpressionsmusters und
der RNA Menge zu verhindern wurde besonders darauf geachtet, dass Gewebe und Blut bis
zur Zugabe des Lysepuffers RLT gefroren blieben. Das Elutionsvolumen betrug bei allen
Geweben 100 µl, bei Blut 50 µl AVE Puffer. Die Gewebe wurden in 15 ml Röhrchen
umgefüllt und entsprechend ihres Gewichtes (600 µl RLT pro 30 mg Gewebe) wurde
Lysepuffer RLT zugegeben. Gewebe, die über 50 mg wogen, in der Regel Milz, Leber und
Niere wurden in gefrorenem Zustand mit dem Skalpell halbiert, beide Hälften gewogen und
in zwei Durchgängen aufgereinigt. Das Gewebe/Lysepuffer Gemisch wurde für ca. 10 sek.
mit dem Ultra Turrax (IKA Werke, Staufen) homogenisiert. 600 µl dieses Homogenisates
wurde weiter laut Herstellerangaben aufgereinigt, war mehr Homogenisat vorhanden, wurde
dieses für evtl. Nachtestungen bei - 20°C eingelage rt. Von dem gefrorenen Vollblut wurden
aufgrund der geringen Nukleinsäuremenge 100 mg entnommen, mit 600 µl RLT versetzt,
homogenisiert und entsprechend den anderen Geweben weiter aufgereinigt.
31
2.2.19 Neutralisation der anti-HAV/IgA-Komplexe in vitro
Zur Untersuchung der IgA-Verdrängung aus den Immunkomplexen wurden zunächst NCTC
Zellen in 6-well-Platten ausgesäht und bei einer Zelldichte von 80% mit 500 µl des jeweiligen
Inokula infiziert. Für diesen Versuch wurden die Immunkomplexe wie in 2.2.12 beschrieben
frisch angesetzt, wobei vor der Infektion 10 mM CaCl2 zum Inokula gegeben wurde. Nach
2stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen zw eimal mit DMEM gewaschen, 2 ml
DMEM/1% FCS wurde aufgebracht und die Zellen wurden bis zur Probenahme bei 37°C und
5% CO2 inkubiert. Die erste Probennahme erfolgte direkt nach der 2stündigen Inkubation, die
weiteren nach einem und zwei Tagen. Dazu wurde das Zellkulturmedium abgenommen, die
Zellen wurden abtrypsiniert und mittels Zentrifugation pelletiert. Die RNA Extraktion erfolgte
nach Angaben des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden). Die
Nukleinsäure wurde bis zur letzten Probenahme bei – 80°C gelagert, anschließend wurde sie
auf den HAV, 18S und GAPDH-Gehalt sowie die Nukleinsäuremenge untersucht.
2.2.20 Herstellung strangspezifischer Kontrolltrans kripte
Zur strangspezifischen Quantifizierung wurden Transkripte in der jeweiligen Orientierung
hergestellt. Dabei wurde besonders darauf geachtet, dass diese keine DNA enthielten. Dazu
wurde ein RT-PCR Lauf mit HAV/7 RNA ohne Interne Kontrolle durchgeführt. Für die
Herstellung von (+) Strang orientierten Quantifizierungsstandards wurde ein forward Primer
eingesetzt, der am 5´-Ende eine Biotinmarkierung und eine T7-Promotor Sequenz enthielt,
die auf diesem Weg in das PCR Produkt integriert wurden. Für die Herstellung von (-) Strang
orientierten Quantifizierungsstandards wurde der revers Primer entsprechend modifiziert
eingesetzt. Die biotinylierte DNA aus der PCR wurde an Streptavidin gecoatete Beads
(Dynabeads®MyOne™Streptavidin; Dynal Biotech, Oslo) gebunden (lt. Herstellerangaben)
und mit dem MEGAscript® T7 Kit (Ambion, Huntingdon) nach Angaben des Herstellers
transkribiert. Nach vierstündiger Transkription wurden die Beads durch den Magnetic Particle
Concentrators (Dynal MPC®) aus der Lösung entfernt. Die Transkripte wurden DNase I
verdaut (MEGAscript® T7 Kit; Ambion, Huntingdon) und im Anschluss mit dem RNeasy® Mini
Kit (QIAGEN, Hilden) gereinigt und photometrisch vermessen. Über die Transkriptlänge von
90 Basen und die Konzentration wurde die Kopienzahl bestimmt. Zusätzlich wurden die
einzelnen Stränge mit der HAV RT-PCR quantifiziert, so dass eine Angabe in Internationalen
Einheiten (IU) auch für die spezifischen Stränge erfolgen konnte.
32
Abb. 2: Schematische Darstellung der strangspezifischen Detektion mittels Padlock ProbeSystem und Rolling Circle Amplifikation. A) durch Hybridisierung der Oligonukleotide und anschließender Ligation wird der Nukleotidring generiert. B) der geschlossene Ring wird im Rolling Circle System durch Primer RCA_1 vermehrt, durch einen zweiten Primer (RCA_2) wird der Doppelstrang generiert. Aufgrund der strand displacement Polymerasen kommt es zur hyperbranched Amplifikation, so dass Amplifikate entstehen, die unterschiedlich viele doppelsträngige Wiederholungen des Oligonukleotidringes entsprechen. Das eigentliche Detektionssignal wird durch die Bindung der Sonde (HAV MGB) an die Amplifikate generiert.
33
2.2.21 (-) Strang Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation
Für die Entwicklung einer PCR unabhängigen Methode zur Detektion des HAV (-) Stranges
wurde das Prinzip der Rolling Circle Amplifikation gewählt. Dieses basiert auf der linearen
Amplifikation eines geschlossenen Nukleotidringes mit Hilfe eines einzigen Primers und einer
Strand-Displacement Polymerase. Die Zugabe eines zweiten Primers (revers Primer) führt
zur hyperbranched Amplifikation und damit zu größerer Ausbeute. Ähnlich der real-time PCR
wird das Signal durch die fluoreszenzmarkierte Sonde generiert. Für die Spezifität des
Systems ist die Generierung des Ringes verantwortlich. Der Ring wird durch Hybridisierung
und Ligation eines bzw. mehrerer Oligonukleotide an das Target erzeugt, so dass die
Amplifikation und damit die Detektion nur bei erfolgreicher Ligation stattfinden. Zur
Entwicklung des (-) Strang Nachweises wurden verschiedene Oligonukleotidsysteme
konstruiert und auf ihre Eignung hin untersucht. Die Enden der Padlock
Probe/Oligonukleotide werden durch Ligation miteinander verbunden, so dass sich ein
geschlossener Ring bildet. Dieser Ring bildet die Grundlage für die Rolling Circle
Amplifikation und ermöglicht durch Einbau einer Sonde die real-time Detektion (Abb.2). Die
Bildung des Ringes wurde durch eine einzelne Padlock Probe, oder aber auch durch drei
kurze Oligonukleotide, von denen zwei (H1 und H2) wie die Padlock Probe ans Target
binden und das dritte (H3) diese beiden Oligonukleotide verbindet, generiert.
2.2.21.1 Oligonukleotidsysteme
Die Ligation erfolgte in einem 10 µl Ansatz mit 5 U T4 RNA Ligase 2 (New England Biolabs,
Frankfurt) und 40 U T4 DNA Ligase (New England Biolabs, Frankfurt), 1 x T4 Ligase Puffer
(New England Biolabs, Frankfurt) sowie je 0,0005 pmol der Oligonukleotide H1 und H2 und
0,5 pmol des Olgionukleotids H3 mit 5 µl Targetmaterial im Mastercycler® (Eppendorf,
Hamburg) für 1 h bei 37°C. 5 µl dieses Ligationsans atzes wurden in die Rolling Circle
Amplifikation eingesetzt und für ca. 1 - 1,5 h bei 61°C im RotorGene ® 3000 (Corbett Life
Science, Sydney) isothermal amplifiziert. Der Amplifikationsansatz besteht aus 24 U BST
(New England Biolabs, Frankfurt) und 1 U rBST Polymerase (EPICENTRE®, Madison), 1 x
Puffer, 0,25 mM dNTP-Mix (Roche Diagnostics, Mannheim), je 10 pmol forward und revers
Primer und 4,5 pmol der Sonde sowie 10 µg BSA (Roche Diagnostics, Mannheim) in einem
Endvolumen von 20 µl.
34
Es wurden vier verschiedene Oligonukleotidsysteme zur Bildung des Amplifikationsringes
getestet. Die unterschiedlichen Systeme sind in Abb. 3 schematisch dargestellt. Das Padlock
Probe System bildet den für die Amplifikation notwendigen Ring durch einfache
Hybridisierung der Oligonukleotidenden (siehe Abb. 3 A) an das Target. In diesem System
wurden Oligonukleotide verschiedener Länge getestet, deren Enden direkt aneinander
anschließen, so dass eine Ligationssite den Ringschluss ermöglicht. Das 2-Oligosystem
(siehe Abb. 3 B) enthält eine lange Padlock Probe, die mit ihren Enden ans Target
hybridisiert, sowie ein kurzes Oligonukleotid, welches zwischen den Enden der Padlock
Probe hybridisiert und diese durch Ligation verbindet. In diesem System sind zwei
Ligationsereignisse nötig um den Ring zu schließen. Das 3-Oligosystem (siehe Abb. 3 C)
enthält zwei Oligonukleotide, die mit je einem Ende ans Target binden und ein drittes
Oligonukleotid, welches an die anderen Enden der ersten beiden Oligonukleotide
hybridisiert. Auch in diesem System sind zwei Ligationsereignisse nötig. Das 4. System
(siehe Abb. 3 D) basiert auf dem 3-Oligosystem, jedoch ist eines der an das Target bindende
Abb. 3: Schematische Darstellung der Oligonukleotidsysteme. A) Padlock Probe System: die Enden der Padlock Probe hybridisieren an das Target, wobei die Enden direkt nebeneinander liegen. Durch Ligation wird dieser Nick und damit der Ring geschlossen. B) 2-Oligosystem: Die Enden der Padlock Probe hybridisieren in der Form an das Target, dass ein Gap frei bleibt. In dieses Gap bindet ein kleineres Oligonukleotid, zwischen den Enden der Padlock Probe und des Oligonukleotids ist keine Base frei. Es sind zwei Ligationsereignisse erforderlich um den Ring zu schließen. C) 3-Oligosystem: Der Ring wird aus zwei Oligonukleotiden (H1 und H2) gebildet, von denen ein Ende an das Target, das andere Ende an ein drittes Oligonukleotid (H3) bindet. Der Ringschluss erfolgt über Ligation der beiden Nicks. D) 3-Oligosystem-RNA: Das Oligonukleotid H2 ist in diesem System eine RNA/DNA Chimäre, bei dem das 3´-Ende des Moleküls aus Ribonukleotiden besteht. Besteht das Target aus RNA, so wird durch diese Kombination die Ligation des Nicks zwischen H1 und H2 erleichtert.
35
Oligonukleotid eine RNA/DNA Chimäre. Sowohl die Ligations- als auch die
Amplifikationsreaktionen wurden optimiert und auf ihre Eignung überprüft.
2.2.21.2 Sequenzierung
Zur Sequenzierung wurden die Proben zunächst in einem 2%igen Agarosegel
elektrophoretisch aufgetrennt, die zu sequenzierenden Banden ausgeschnitten und in ein
2 ml Gefäß überführt. Die Isolierung der Nukleinsäure aus dem Gel erfolgte mit dem
QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Im Anschluss
wurde die Konzentration der gewonnenen Nukleinsäure photometrisch bestimmt. Die
eigentliche Sequenzierung der Proben erfolgte durch den Sequenzierservice der Fa. GATC,
Konstanz.
2.2.21.3 Optimierung der Ligationsbedingungen
Zur Optimierung der Ligationsreaktion wurden zunächst verschiedene Ligasen bzw. Ligase-
Kombinationen getestet. Eingesetzt wurden T4 DNA Ligase, Taq DNA Ligase, E. coli DNA
Ligase und T4 RNA Ligase 2 (New England Biolabs, Frankfurt). Ligasemenge, -puffer
Ligationsdauer und –temperatur wurden entsprechend den empfohlenen Herstellerangaben
gewählt. Der Einsatz der Oligonukleotidmenge wurde durch eine entsprechende
Verdünnungsreihe bei gleicher Menge Positivmaterial bestimmt. Bei den Systemen mit
mehreren Oligonukleotiden wurde eine Kreuztitration durchgeführt. So dass jede
Mengenkombination der Oligonukleotide ausgetestet wurde. Der Einfluss der Additive PEG
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen), NaCl (Fluka, Buchs SG, Schweiz) und DMSO (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen) sowie der Proteine T4 Gene 32 Protein (Ambion, Austin), Tth recA (BioHelix,
Beverly) und SSBP (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) wurde ebenfalls getestet. Für jedes dieser
Additive und der Proteine wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt und mit der gleichen
Menge Target in die Ligation eingesetzt. Als Target wurde dabei jeweils synthetisches (-)
Strang Fragment oder IVT sowie als Negativkontrolle Wasser eingesetzt. Je 5 µl der
Ligationsreaktion wurden in die Amplifikation gegeben. Die Komponenten, bei denen im
Vergleich zu einem Ansatz ohne entsprechende Zugabe, das positive Signal bei früherer
Zyklenzahl (CT) messbar war, wurden in der entsprechenden Konzentration ausgewählt;
kam das Signal zu einer späteren Zyklenzahl (CT) als im Vergleichsansatz, wurde die
Komponente nicht verwendet.
36
2.2.21.4 Optimierung der Amplifikationsbedingungen
Die Optimierung der isothermalen Amplifikation erfolgte in Bezug auf die Wahl der
Polymerasen, Primer- und Sondenkonzentration, Magnesium Konzentration, dNTP
Konzentration und Auswahl der Additive Betaine und DMSO. Ausgetestet wurden die strand
displacement Polymerasen phi29 (New England BioLabs®, Frankfurt), Bst (New England
BioLabs®, Frankfurt) und rBst (EPICENTRE®, Madison) sowie eine Kombination dieser
beiden. Zusätzlich wurde der Einsatz der Transcriptor® Reversen Transkriptase (Roche
Diagnostics, Mannheim) getestet. Für jede Komponente wurde eine Verdünnungsreihe
angesetzt und mit der gleichen Ligationsreaktion getestet. Es wurden die Konzentrationen
ausgewählt, bei der der Schwellenwert bei geringster Zyklenzahl überschritten wird, und die
Signale größtmögliche Steigung und höchste Fluoreszenzsignale zeigen.
2.2.21.5 Sensitivitätsbestimmung
Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze des Strangspezifischen Nachweises mittels Padlock
Probe und Rolling Circle Amplifikation wurden (+) bzw. (–) Strang DNA und RNA Fragmente
logarithmisch von 1 fmol/µl bis nominal 10 zmol/µl sowie in vitro transkribierte RNA von
17 fmol/µl bis 170 zmol/µl verdünnt. Die Analyse durch Ligation und Rolling Circle
Amplifikation erfolgte in vierfach Replikaten. Ausgewertet wurden die Daten durch eine
Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63).
2.2.21.6 Spezifitätstest
Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden RNA Fragmente bzw. in vitro Transkripte in
komplementärer Orientierung in hohen Konzentrationen (1 fmol/µl und 100 amol/µl) getestet.
2.2.22 (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR
Der (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR basiert wie Abb. 4 zeigt auf zwei einzelnen
Schritten: dem Einbau der Box, einer spezifischen HAV unabhängigen Sequenz, während
der Erststrang-Synthese und der anschließenden PCR, die auf dieser Box basiert. Die
Strangspezifität wird durch den Einsatz eines Primers, der die eingebaute Box erkennt, und
37
einer TaqMan®-Sonde gewährleistet. Durch den Einsatz dieser Sonde kommt es nur zum
Signal, wenn diese abgebaut wird. Eine einfache Sondenbindung ist nicht ausreichend.
Zwischen Erststrang Synthese und PCR erfolgt die Reinigung der Erststränge um die
Reverse Transkriptase sowie überschüssige Box-Primer zu entfernen.
2.2.22.1 Erststrang Synthese mit Einbau der Box
Zum Einbau der Boxsequenz in den Erststrang wurde das RevertAid® H minus First Strand
cDNA Synthesis Kit verwendet (MBI Fermentas, St. Leon-Rot). Dabei wurden 5 µl Probe
unabhängig von der DNA bzw. RNA Menge mit 10 pmol des forward Primers (BOX_HAV for)
in einem Volumen von 12 µl gemischt. Der forward Primer bindet mit dem 3´Ende an den
HAV (–) Strang und enthält am 5´Ende die spezifische Boxsequenz. Nach 5minütiger
Inkubation bei 70°C und anschließendem Abkühlen auf Eis wurden 7 µl Reaktionsmix
bestehend aus 1 x Transkriptionspuffer und 1 mM dNTP-Mix zugegeben. Nach 5 Minuten bei
37°C werden 200 U RevertAid ® H- Reverse Transkriptase zugegeben und für 60 Minuten bei
42°C inkubiert. Die Transkription wird durch 10minü tige Inkubation bei 70°C gestoppt.
Abb. 4: Schematische Darstellung des (-) Strang Nachweises mittels Box-PCR. A) Während der Erststrang Synthese wird durch den HAV (-) Strang spezifischen Primer eine HAV unspezifische Sequenz (Box) in die cDNA eingebaut. Die RNA wird verdaut und die Nukleinsäure vor Einsatz in die PCR durch Aufreinigung von Primern, Nukleotiden und Enzymen befreit. B) Die PCR erfolgt mit einem HAV spezifischen Primer (F1) und einem Primer (R1) der an die Sequenz komplementär zur eingebauten Box bindet. Die Sonde (TaqMan®-Sonde) gibt ein Signal ab, wenn sie durch die Polymerase abgebaut wird, d.h. wenn der Box-spezifische Primer gebunden hat und die Amplifikation stattfindet.
38
2.2.22.2 RNA Verdau
Um die RNA Templates aus der Erststrang Synthese zu entfernen wurde ein RNAse H
Verdau durchgeführt. Dafür wurde jeweils 1 µl RNAse H (New England BioLabs®, Frankfurt)
zu der cDNA gegeben und für 30 Minuten bei 37°C ink ubiert.
2.2.22.3 Aufreinigung des Erststranges
Die Aufreinigung des Erststranges erfolgte mit Hilfe des QIAamp® Viral RNA Mini Kits
(QIAGEN, Hilden). Die 20 µl cDNA aus der Erststrang-Synthese wurden mit Nuklease freiem
Wasser (Ambion, Huntingdon) auf 140 µl aufgefüllt, 560 µl Lysepuffer AVL und 560 µl
Ethanol (Merck, Darmstadt) wurden zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde auf die
Säule gegeben und für 15 s bei 8.000 rpm zentrifugiert, das Filtrat wurde verworfen. Die
Säulenmembran wurde zunächst mit 500 µl Puffer AW1 (15 s 8.000 rpm) und dann mit
500 µl AW 2 (3 min. 14.000 rpm) gewaschen. Nachdem die Membran für 10 min. bei
14.000 rpm getrocknet wurde konnte die cDNA eluiert werden. Dazu wurden 20 µl AVE auf
die Membran aufgebracht, wobei zwingend darauf geachtet wurde, dass keinerlei Flüssigkeit
am Rand der Säule haften blieb. Die Elution erfolgte durch einminütige Zentrifugation bei
14.000 rpm. Das Eluat wurde bis zur weiteren Analyse bei – 20°C aufbewahrt.
2.2.22.4 Real-time PCR System zur Quantifizierung des HAV (-) Strange s
Das real-time PCR System zur HAV (-) Strang Quantifizierung wurde auf dem LightCycler®
1.2 (Roche Diagnostics, Mannheim) entwickelt. In dieser PCR ist nur der revers Primer HAV
spezifisch. Der forward Primer bindet an die eingebaute Box und ermöglicht damit den
strangspezifischen Nachweis. Die Quantifizierung erfolgt über eine externe Standardreihe,
wobei die HAV (–) Strang Menge in IU/µl angegeben wird. Jeder PCR Lauf wurde mit
mindestens einer Positivprobe [HAV (–) Strang IVT] und einer Negativprobe (Wasser)
durchgeführt. Alle Proben durchliefen vor Einsatz in der PCR die Erststrangsynthese und
Aufreinigung. Die PCR wurde im Endvolumen von 20 µl durchgeführt, wobei sich dieses aus
5 µl Probe und 15 µl Reaktionmix zusammensetzte. Im Reaktionsmix enthalten sind je
10 pmol forward und revers Primer, 3 pmol Taqman® Sonde, 10 µg BSA (Roche
Diagnostics, Mannheim), 1 x PCR Puffer (QIAGEN, Hilden), 0,5 mM dNTP-Mix (Roche
Diagnostics, Mannheim), 5 mM MgSO4, 1,25 U Takara HS Taq DNA Polymerase (Takara
39
Bio USA, Madison) und 0,5 U Luna Taq DNA Polymerase (Bioline, London). Der
Temperaturverlauf dieser PCR ist folgendermaßen: Nach einer Initialen Denaturierung für
15 Sekunden bei 95°C erfolgten 50 Zyklen mit 1 sek. 95°C, 20 sek. Annealing bei 55°C und
15 Sek. Extension bei 72°C. Im Anschluss wurden die Ansätze auf 40°C für 30 sek.
heruntergekühlt.
2.2.22.5 Sensitivitätsbestimmung
Zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenze des strangspezifischen Nachweises mittels Box-
PCR wurden (+) bzw. (–) Strang orientierte in vitro Transkripte logarithmisch verdünnt und in
vierfach Replikaten analysiert. Die (-) Strang IVT Verdünnungsreihe wurde von 4 x 102 bis
nominell 4 x 10-3 IU/µl, die der (+) Strang IVT von 1 x 103 bis nominell 1 x 10-4 IU/µl erstellt.
Ausgewertet wurden die Daten durch eine Probit-Analyse (PriProbit Vers. 1.63).
2.2.22.6 Spezifitätstest
Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden in vitro Transkripte in komplementärer
Orientierung in hohen Konzentrationen getestet und deren Einfluss auf die Quantifizierung
untersucht.
2.2.22.6.1 Detektion des Komplementärstranges
Zur Untersuchung der Spezifität, bzw. zur Bestimmung des Detektionslimits des
Komplementärstranges wurden (+) bzw. (-) Strang in vitro Transkripte logarithmisch verdünnt
[(+) Strang: 1 x 106 – 1 x 101 IU/µl; (-) Strang: 4 x 105 – 4 x 100 IU/µl] und in achtfach
Replikaten in dem entsprechenden Nachweis getestet. D.h. die Verdünnungsreihe der (+)
Strang IVT wurde im (-) Strang Nachweis, die der (-) Strang IVT im (+) Strang Nachweis
untersucht. Die Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63).
2.2.22.6.2 Untersuchung der linearen Quantifizierun g
Zur Untersuchung des Einflusses von (+) Strang auf die Quantifizierung des (-) Stranges
wurden zu jeder Verdünnungsstufe einer (–) Strang IVT Verdünnung (6 Stufen von 4 x 100 –
40
4 x 105 IU/µl) unterschiedliche Mengen an (+) Strang IVT (0 - 1 x 106 IU/µl) gegeben. Die so
präparierten Proben wurden im (-) Strang Nachweis quantifiziert und der erhaltene Wert mit
dem tatsächlich eingesetzten Material verglichen.
2.2.23 Aufnahme einer HAV Wachstumskurve
Zur Aufnahme der Wachstumskurve wurden FRhK-4 Zellen in 6 cm Zellkulturschalen bis zu
einer Dichte von 80% kultiviert und mit einer MOI 1 mit HAV/PI infiziert. Es wurden 35
Schalen infiziert, wobei die erste Schale direkt nach der Infektion geerntet wurde. Dazu
wurde der Überstand entfernt und der Zellrasen zweimal mit 0,5 ml Trypsin gewaschen. Die
Zellen wurden abtrypsiniert und die Zellzahl bestimmt. Anschließend wurden die Zellen
pelletiert und die Nukleinsäure mit dem RNeasy® Mini Kit extrahiert. Aus der gereinigten
Nukleinsäure wurde die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Menge bestimmt und in Bezug
zur Zellzahl gesetzt. Die weiteren Probenahmen erfolgten alle 12 Stunden bis alle Schalen
verarbeitet waren.
41
3. ERGEBNISSE
3.1 Entwicklung eines real-time RT-PCR Systems zum Nachweis
und zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus
Zur Untersuchung ob HAV durch einen IgA vermittelten Carriermechanismus zur Leber
gelangt und wie sich das Virus im Organismus auf die Organe verteilt wurde ein real-time
RT-PCR System zum Nachweis und zur Quantifizierung des Hepatits A-Virus entwickelt,
welches es ermöglicht bereits geringste HAV RNA Mengen in den Geweben der Mäuse
nachzuweisen. Das real-time RT-PCR System wurde für die Anwendung auf dem
LightCycler® 1.2 Instrument (Roche, Diagnostics) konzipiert. Das System besteht aus zwei
Amplifikationssystemen. Einem Primer- und Sondensystem zur Amplifikation und Detektion
eines 90 Basen langen HAV spezifischen Sequenzbereichs innerhalb der VP1 Region des
Genoms. Sowie einem zweiten Primer- und Sondensystem zur Amplifikation und Detektion
einer sogenannten Internen Kontrolle (IC). Diese Interne Kontrolle kann als
Aufreinigungskontrolle in die Nukleinsäureextraktionsprozedur oder aber als
Inhibitionskontrolle direkt in den RT-PCR Ansatz gegeben werden. Die HAV Quantifizierung
erfolgt über eine Standardreihe von vier Quantifizierungsstandards in den Konzentrationen
1000, 100, 10 und 1 IU/µl. Dazu wurde HAV PCR Produkt in vitro transkribiert, photometrisch
quantifiziert und in Kopien/µl umgerechnet. Vergleichsläufe mit dem Internationalen WHO
Standard (NIBSC Code 00/0560) ergaben, dass eine Internationale Einheit 10 Kopien des in
vitro Transkriptes entsprechen. Die IVT´s wurden entsprechend den oben angegebenen
Konzentrationen eingestellt.
3.1.1 Validierung des HAV real-time RT-PCR Systems
Zur Validierung des HAV RT-PCR Systems wurden verschiedene Leistungsdaten wie
Sensitivität, Spezifität und Robustheit erhoben. Die Sensitivitätslimits wurden durch Probit-
Analyse ermittelt. Unter Berücksichtigung der Aufreinigung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini
Kit (QIAGEN, Hilden) beträgt das Sensitivitätslimit 183,02 IU/ml (p ≤ 0,05). D.h. eine Probe
die 183 IU HAV/ml enthält wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% als positiv detektiert.
Das Sensitivitätslimit bezogen auf das Eluat der Aufreinigung, d.h. ohne Berücksichtigung
der Aufreinigungsprozedur liegt bei 0,13 IU/µl.
Durch Untersuchungen der Spezifität des HAV RT-PCR Systems wurde sichergestellt, dass
das System zum einen alle für die Humandiagnostik relevanten HAV Genotypen detektiert,
42
zum anderen nahe verwandte Viren sowie Erreger die ein ähnliches symptomatisches Bild
hervorrufen nicht detektiert. Getestet wurden Isolate der HAV Genotypen IA, IB und III, sowie
synthetisch hergestellte Nukleinsäurekonstrukte der Genotypen II und VII. Alle diese HAV
Genotypen konnten mit dem HAV RT-PCR System detektiert und quantifiziert werden.
Kreuzreaktivitäten mit anderen Erregern (siehe Tab.1) wurden nicht beobachtet.
Die Präzisionsdaten geben Aufschluss über die Varianz des Systems und setzen sich aus
der Intra-Assay, der Inter-Assay und der Inter-Chargen Variabilität zusammen. Die Daten,
erhoben für eine Konzentration von 571,5 IU HAV/ml zeigen, dass die maximale Variation
zweier Proben der gleichen Konzentration nur 31,40% beträgt. Tabelle 2 zeigt die Daten der
einzelnen Präzisionstests.
Tab.2: Präzisionsdaten des HAV RT-PCR Assays; generiert mit der HAV Konz. 571,5 IU/ml
Standardabweichung [IU/ml]
Varianz [IU/ml]2
Variationskoeffizient [%]
Intra-Assay Variabilität: 167,71 2,8 x 104 28,23 Inter-Assay Variabilität: 184,62 3,4 x 104 30,91 Inter-Chargen Variabilität: 183,80 3,4 x 104 30,69 Totalvarianz: 188,20 3,5 x 104 31,40
3.1.2 Einsatz des real-time HAV RT-PCR Systems in der in vitro Diagnostik
Das hier beschriebene real-time HAV RT-PCR System wird inzwischen von der QIAGEN
Hamburg GmbH als CE (Communauté Européenne)-markiertes Kit kommerziell vertrieben
und kommt dadurch u. a. im DRK Blutspendedienst, West in der in vitro Diagnostik (IVD)
zum Einsatz. Seine sehr gute Performance im Vergleich zu anderen Nachweissystemen hat
das real-time HAV RT-PCR System inzwischen mehrfach unter Beweis gestellt. So wurde
2003 eine HAV positive Blutspende identifiziert, die weder erhöhte Leberenzymwerte, noch
Antikörper gegen HAV aufwies. Die Symptomatik zum Spendezeitpunkt war unauffällig.
Diese Spende wäre ohne Testung mit dem real-time HAV RT-PCR System fälschlicherweise
als HAV negativ deklariert worden. Das Virus aus dieser Spende wurde sequenziert und
phylogenetisch analysiert. Es handelt sich bei diesem Isolat um ein in Europa erst in jüngerer
Zeit häufiger vorkommenden Hepatitis A-Virus Genotyp III. Die Performance des real-time
HAV RT-PCR Systems wird jährlich durch die Teilnahme an Ringversuchen überprüft. Dabei
stellte sich heraus, dass die Spezifität des real-time HAV RT-PCR Systems deutlich besser
ist als andere nukleinsäurebasierende HAV Nachweissysteme. Im Gegensatz zum real-time
HAV RT-PCR System sind sowohl kommerziell erhältliche als auch in house Assays
43
teilweise nicht in der Lage HAV Genotyp III nachzuweisen. Im Sommer 2004 wurden durch
das HAV RT-PCR System noch weitere drei HAV positive Blutspenden identifiziert, deren
Spender zum Spendezeitpunkt keinerlei Symptome zeigten(139). Durch das real-time HAV
RT-PCR System wurde verhindert, dass diese Spenden zur Weiterverarbeitung gelangten,
wodurch das Risiko der HAV Übertragung durch diese und andere mit diesem System
identifizierte Blutspenden verringert wird.
3.2 Entwicklung eines Systems zum quantitativen Nac hweis von
HAV Negativstrang RNA
Die Replikation des Hepatitis A-Virus erfolgt über Negativstrang RNA Intermediate. Diese
spezifische RNA liegt in geringer Menge für einen begrenzten Zeitraum in den Zellen vor und
ist eindeutiges Zeichen für die HAV Replikation. Zur Untersuchung, ob und in welchem Maße
in den Mausgeweben HAV Replikation stattfindet, wurde ein System zum Nachweis und zur
Quantifizierung von HAV Negativstrang [(-) Strang] als Replikationsmarker entwickelt.
3.2.1 Herstellung der strangspezifischen Kontrolltr anskripte
Voraussetzung für die Entwicklung eines strangspezifischen Nachweissystems ist die
Herstellung von geeignetem Kontrollmaterial. Dazu wurden mittels immobilisierter in vitro
Transkription (siehe 2.2.20) RNA Kontrolltranskripte in sense [(+) Strang] und antisense [(-)
Strang] Orientierung hergestellt. Die Kontrolltranskripte umfassen einen 90 Basen langen
Bereich in der VP1 Region des HAV Genoms, der als Targetbereich für den
strangspezifischen Nachweis ausgewählt wurde. Nach dem DNase Verdau wurden die
Transkripte photometrisch vermessen und im 2%igen Agarosegel kontrolliert (Abb. 5). Auf
dem Gelbild sind keinerlei Nebenbanden erkennbar und die Fragmente sind 90 Basen lang.
Über die Anzahl der Basen und die RNA Konzentration wurde die Kopienzahl bestimmt.
Zusätzlich wurden die Transkripte mittels des real-time HAV LC RT-PCR Systems (3.1)
quantifiziert. In Tab. 3 sind die entsprechenden Konzentrationen aufgeführt. Der
Umrechnungsfaktor von Internationalen Einheiten (IU) auf Kopien beträgt zehn, d.h. eine IU
entsprechen zehn Kopien HAV RNA. Von den in vitro Transkripten wurde jeweils eine
Verdünnungsreihe erstellt und zur strangspezifischen Quantifizierung herangezogen.
44
Zusätzlich zu den in vitro Transkripten wurden synthetisch hergestellte DNA und RNA
Moleküle (Metabion, Martinsried) in (+) Strang und (-) Strang Orientierung als
Kontrollmaterial eingesetzt.
3.2.2 Strangspezifischer Nachweis mittels Rolling Circle Amplifikation
Zur Entwicklung einer PCR unabhängigen Methode für die Detektion des HAV (-) Stranges
wurde das Prinzip der Rolling Circle Amplifikation gewählt. Dieses basiert auf der
Amplifikation einer Padlock Probe bzw. eines geschlossenen Nukleotidringes. Zur
Herstellung dieses Nukleotidringes wurden verschiedene Oligonukleotidsysteme konstruiert
und auf ihre Eignung untersucht.
3.2.2.1 Padlock Probe System
Abb. 6 zeigt die Amplifikation einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe (6A zusätzlich (-)
Strang DNA) vor (A) und nach (B) der Optimierung. Die Ligation erfolgte mit dem einfachen
Padlock Probe System (siehe Abb. 3A). Das Signal wird während der isothermalen
Amplifikation durch eine Sonde generiert, deren Bindungsstelle in der Padlock Probe
gegenüber der an die Zielsequenz bindenden Enden liegt. Durch Titration der einzelnen
Reaktionskomponenten wurde eine deutliche Sensitivitätssteigerung von (6A) 10 pmol/µl auf
0,001 pmol/µl (6B) erzielt. Auch konnte der Kurvenverlauf deutlich verbessert werden, die
Kurven zeigen einen sigmoidalen Verlauf und die Fluoreszenzhöhe ist deutlich gesteigert.
Obwohl Padlock Probe Systeme hoch spezifisch sind, zeigen die Wasserproben deutliche
Tab. 3: Konzentrationsbestimmung der Kontrolltranskripte
RNA Konz. Kopien/µl (berechnet)
IU/µl (lt. HAV RT-
PCR)
sense IVT 1234 ng/µl 1 x 1014 2 x 1013
antisense IVT 565 ng/µl 1 x 1013 2 x 1012
Abb. 5: Kontrolltranskripte im 2 %igen Agarosegel. Aufgetragen wurden je 5 µl der antisense und sense in vitroTranskription. Die IVTs beider Reaktionen sind 90 Basen lang, Nebenbanden sind nicht erkennbar.
45
Signale und erlauben keine Unterscheidung von negativen und positiven Proben. Die
einzelnen DNA Konzentrationen (6B) sind gut von einander abgegrenzt, wobei die Abstände
zwischen den Signalen geringer werden, je höher die eingesetzte DNA Konzentration ist.
A
B
Abb. 6: Vergleich der Rolling Circle Amplifikation mit dem Padlock Probe System vor (A) und nach (B) der Optimierung. Eingesetzt wurden Verdünnungen aus einzelsträngiger DNA. In A) wurde sowohl (+) Strang als auch (-) Strang orientierte DNA in B) nur (+) Strang orientierte DNA eingesetzt. A) Detektiert werden Signale bis zur Konzentration von 10 pmol/µl. Der komplementäre Strang und die Negativkontrolle zeigen kein Signal. B) Die Verdünnungsreihe zeigt bis zur letzten Stufe 0,001 pmol/µl gute Signale. Die Fluoreszenz ist deutlich höher und zeigt einen sigmoidalen Kurvenverlauf. Die Negativkontrollen werden falsch positiv detektiert.
46
Die Amplifikate aus Abb. 6B wurden auf einem 3%igem Agarosegel aufgetragen und zeigen
das erwartete Bandenmuster (Abb. 7) aus unterschiedlich vielen aneinander gereiten
Wiederholungen der Padlock Probe. Deutlich zu Erkennen ist eine Verschiebung des
Bandenmusters in den Wasserproben zu kürzeren Fragmenten, wobei das Muster selbst
erhalten bleibt. In der geringsten Targetkonzentration (0,001 pmol/µl) scheint eine Mischform
vorzuliegen, es ist sowohl das Bandenmuster der längeren als auch das der kürzeren
Fragmente sichtbar, dieses ist jedoch deutlich schwächer.
Die Sequenzierung von je zwei Banden der Konzentration 0,01 pmol/µl und den
Negativkontrollen ergab, dass es sich bei den Amplifikaten in den Wasserproben um die
unvollständige Sequenz der Padlock Probe handelt, es fehlt der an die Zielsequenz
bindende Bereich. Die Sequenzierung der Positivproben ergab die vollständige Padlock
Probe Sequenz. Der Einsatz anderer Padlock Probes sowie weitere Optimierungsschritte
konnten die Generierung der falsch positiven Signale nicht verhindern.
3.2.2.2 2-Oligosystem
Bei diesem System sind zum Ringschluss zwei nicks im Targetbereich (siehe Abb. 3B) zu
schließen. Diese stringenteren Ligationsbedingungen sollten die unspezifische Amplifikation
verhindern. Allerdings zeigte sich, wie bei dem einfachen Padlock Probe System, dass es
1 kb
Lei
ter
1 kb
Lei
ter
10 pmol/µl 1 pmol/µl 0,1 pmol/µl 0,01 pmol/µl 0,001 pmol/µl Wasser
Abb. 7: Amplifikate einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe sowie der Negativkontrolle (Wasser) nach isothermaler Amplifikation aufgetrennt in einem 3%igen Agarosegel. Das für RCA typische Bandenmuster zeigt in den Wasserproben eine deutliche Verschiebung der Fragmentgröße im Vergleich zu dem der Verdünnungsreihe.
47
auch ohne Target zur Bildung und Amplifikation des Nukleotidringes kommt, so dass eine
Unterscheidung von geringer positiven und negativen Proben auch mit diesem System nicht
möglich ist (Ergebnisse nicht gezeigt).
3.2.2.3 3-Oligosystem
Dieses System erfordert drei Oligonukleotide mit zwei nick closing sites zum Schließen des
Ringes (siehe Abb. 3C). Zusätzlich wurde eine Sonde eingesetzt, die auf dem Targetbereich
bindet, so dass das Sondensignal nur durch Amplifikation des vollständigen Ringes generiert
werden kann. Durch die drei Oligonukleotide, sowie den Einsatz der neuen Sonde soll die
Generierung der falsch positiven Signale ausgeschlossen werden. Abb. 8 zeigt die Rolling
Circle Amplifikation einer (+) Strang DNA Verdünnungsreihe (Abb. 8A) und einer kleineren
Verdünnungsreihe aus (-) Strang DNA (Abb. 8B).
Die Wasserproben im 3-Oligosystem (Abb.8) zeigen kein Signal, die positiven Proben sind
deutlich von den negativen Proben zu unterscheiden, d.h. die Detektion falsch positiver
Signale tritt bei diesem System nicht auf. Die einzelnen Targetkonzentrationen sind gut
voneinander unterscheidbar und in gleichmäßigem Abstand zueinander. Die
Doppelbestimmungen liegen dicht beieinander. Die Sensitivitätsgrenze für den (+) Strang
DNA Nachweis liegt bei ungefähr 1 zmol/µl, die für den (–) Strang DNA Nachweis bei
ungefähr 10 zmol/µl, da bei diesen Konzentrationen jeweils eine Probe ausfällt.
Der Nachweis von einzelsträngiger RNA in Form von in vitro Transkripten ist in Abb. 9
gezeigt. In das 3-Oligonukleotidsystem zur (-) Strang Detektion wurden (-) Strang orientierte
IVTs in den Verdünnungsstufen 10-3 – 10-5 (109 – 107 IU/µl) sowie als Positivkontrolle (-)
Strang DNA (1 fmol/µl) und als Negativkontrolle Wasser eingesetzt. Die Positivkontrolle und
die (-) Strang IVTs in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-4 wurden positiv detektiert, wobei
das Signal der Verdünnung 10-4 in der Doppelbestimmung zu deutlich unterschiedlichen
Zeitpunkten generiert wird. Die IVT Verdünnung 10-5, sowie die Wasserkontrolle werden
negativ detektiert.
48
Das 3-Oligonukleotidsystem zum Nachweis von (+) Strang zeigte bei Einsatz von RNA
dasselbe Ergebnis. Weitere Versuche (Daten nicht gezeigt) mit synthetisierter DNA und RNA
sowie IVTs zeigten, dass die Sensitivität des Systems bei RNA als Probenmaterial deutlich
schlechter ist als bei DNA. Für den strangspezifischen Nachweis von viraler RNA aus
Gewebe wurde das System modifiziert, so dass die Sensitivität bei Einsatz von RNA als
Probenmaterial verbessert wurde.
Abb. 8 Amplifikation einer (+) Strang DNA (A) und einer (-) Strang DNA (B) Verdünnungsreihe mit dem 3-Oligonukleotidsystem. Die Verdünnungen sind in beiden Reihen deutlich voneinander unterscheidbar. Die Kurven zeigen eine sehr gute Fluoreszenzhöhe. Die Negativproben werden als negativ detektiert, d.h. es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale.
A
B
49
3.2.2.4 3-Oligosystem-RNA
Dieses System basiert auf dem 3-Oligosystem, jedoch handelt es sich bei einem der an das
Target bindenden Oligonukleotide um eine RNA/DNA Chimäre. Das 3´-Ende des
Oligonukleotids H2 besteht aus Ribonukleotiden (Abb. 3D). Die Ligation erfolgt zusätzlich mit
Hilfe einer RNA-Ligase. Bei Bindung an ein RNA Target wird durch diese Kombination die
Ligation des nicks zwischen H1 und H2 erleichtert, und damit die Sensitivität des gesamten
Nachweises gesteigert. Das Sensitivitätslimit des RCA (+) und (-) Strang Nachweises mit
dem 3-Oligosystem RNA wurde mit Hilfe der Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63) sowohl
für synthetische RNA Fragmente als auch für in vitro transkribierte RNA bestimmt. Die
Ergebnisse der Probit-Analysen sind in Tab. 4 angegeben.
Abb. 9: Untersuchung von in vitro transkribierter RNA im RCA (-) Strang Nachweis. Eingesetzt wurde eine Verdünnungsreihe von (-) Strang orientierten IVTs sowie als Negativkontrolle Wasser. Die (-) Strang IVTs unterschiedlicher Konzentration sind gut voneinander unterscheidbar, es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale. Bei der Doppelbestimmung der Verdünnungsstufe 10-4 zeigt sich eine große Differenz zwischen den Signalen. die Verdünnung 10-5 zeigt kein positives Signal, dies deutet auf das Erreichen des Sensitivitätslimits hin.
50
Tab 4: Sensitivitätslimits der strangspezifischen Nachweise durch RCA
(+) Strang Nachweis (-) Strang Nachweis
synthetisches RNA Fragment 22,2 amol/µl ≡ 1,3 x 106 IU/µl 33,57 amol/µl ≡ 2,0 x 106 IU/µl
in vitro transkribierte RNA 372,3 amol/µl ≡ 2,2 x 107 IU/µl 535,48 amol/µl ≡ 3,2 x 107 IU/µl
Die HAV RNA Konzentrationen in den Geweben (siehe 3.3) liegen unterhalb des in Tab. 4
angegebenen Sensitivitätslimits. Für den Nachweis von (-) Strang RNA aus Gewebe ist die
Sensitivität dieses System daher nicht ausreichend, so dass eine andere Methode des
strangspezifischen Nachweises zur Untersuchung der Gewebeproben etabliert wurde.
3.2.3 Strangspezifischer Nachweis mittels Box-PCR
Der (-) Strang Nachweis mittels Box-PCR basiert auf zwei Schritten, dem Einbau der Box,
einer spezifischen HAV unabhängigen Sequenz, während der cDNA Synthese und einer
anschließenden PCR. Die Strangspezifität wird durch den Einsatz eines Primers, der an die
eingebaute Box bindet, und einer Taqman®-Sonde, die nur bei tatsächlicher Amplifikation,
ein Signal abgibt, gewährleistet. Im Gegensatz zum strangspezifischen Nachweis durch RCA
wurden im strangspezifischen Nachweis mittels Box-PCR alle Wasserproben als negativ
detektiert (Daten nicht gezeigt). Es kommt nicht zur Detektion falsch positiver Signale bei
Einsatz von Wasser als Probenmaterial, so dass positive und negative Proben von einander
unterscheidbar sind. Zur Etablierung des (-) Strang Nachweises mittels Box-PCR wurden
Spezifitäts- und Sensitivitätsdaten erhoben.
3.2.3.1 Spezifität
Zur Untersuchung der Strangspezifität wurden je acht Verdünnungsstufen (+) Strang IVTs im
(-) Strang Nachweis und (-) Strang IVTs im (+) Strang Nachweis getestet. Dabei wurde
analysiert, ab welcher Konzentration des komplementären Stranges ein Signal generiert
wird, d.h. bis zu welcher RNA Konzentration der jeweilige Nachweis strangspezifisch ist und
ab welcher Konzentration mit falsch positiven Ergebnissen gerechnet werden muss. Die
Auswertung erfolgte durch eine Probit-Analyse (PriProbit® Vers. 1.63). Der Spezifitätswert für
den (-) Strang Nachweis ist 2,7 x 104 IU/µl (p≤0,05). Der Spezifitätswert für den (+) Strang
Nachweis ist 2,5 x 102 IU/µl (p≤0,05), d.h. mit 95%iger Wahrscheinlichkeit werden (-) Strang
orientierte Nukleinsäuren in geringerer Konzentration im (+) Strang Nachweis nicht detektiert.
Bis zu diesem Wert kommt es in dem strangspezifischen Nachweis mittels Box-PCR nicht
zur Detektion falsch positiver Signale aufgrund des Komplementärstranges. Falsch positive
51
Abb. 10: Einfluss verschiedener (+) Strang Konzentrationen auf die Quantifizierung des (-) Stranges; Anhand der aufgetragenen Mittelwerte wird deutlich, dass der (+) Strang unabhängig von der Menge ab einer (-) Strang Konzentration von >40 IU/µl keinerlei Einfluss auf die Quantifizierung hat.
Signale durch den Komplementärstrang höher konzentrierter Proben lassen sich durch
Verdünnung der Proben unter den Spezifitätswert verhindert (Daten nicht gezeigt).
Um den Einfluss von (+) Strang auf die Quantifizierung des (-) Stranges zu untersuchen
wurden zu jeder Verdünnungsstufe einer (-) Strang IVT Reihe unterschiedliche Mengen an
(+) Strang IVT gegeben. Der (-) Strang dieser Ansätze wurde quantifiziert und mit der
tatsächlich eingesetzten Menge verglichen (siehe Abb. 10). Die Quantifizierung des (-)
Stranges ist unbeeinflusst von der evtl. vorhandenen (+) Strang Menge ab einer (-) Strang
Menge von 4 x 101 IU/µl. Geringere (-) Strang Mengen werden bei Vorhandensein von (+)
Strang Konzentrationen von mehr als 10.000 IU/µl überquantifiziert.
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
1 10 100 1000 10000 100000 1000000
- Strang IVT [IU/µl]
quan
tifiz
iert
- Stra
ng IV
T [I
U/µ
l]
0 IU/µl + Strang
10 IU/µl + Strang
100 IU/µl + Strang
1000 IU/µl + Strang
10000 IU/µl + Strang
100000 IU/µl + Strang
1000000 IU/µl + Strang
3.2.3.2 Sensitivität
Das Sensitivitätslimit wurde durch eine Probit Analyse ermittelt und beträgt für den (-) Strang
Nachweis 0,44 IU/µl (p≤0,05) (4,4 Kopien/µl). D.h. mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% wird
eine Probe mit dieser Konzentration noch als positiv detektiert. Das Sensitivitätslimit
bezogen auf den (+) Strang Nachweis ist 1,48 IU/µl (14,8 Kopien/µl). Damit liegt die
52
Sensitivität des (-) Strang Nachweises nur geringfügig über dem des real-time HAV RT-PCR
System und ist sensitiv genug um (-) Strang RNA aus Gewebeproben zu detektieren.
Tab 5: Detektionsbereich der strangspezifischen Nachweise mittels Box-PCR
Minimum (Sensitivitätslimit) Maximum (Spezifitätswert)
(-) Strang Nachweis 0,44 IU/µl 2,7 x 104 IU/µl
(+) Strang Nachweis 1,48 IU/µl 2,5 x 102 IU/µl
Tab. 5 zeigt den Bereich in dem eine eindeutige Aussage über die Orientierung des in der
Probe vorhandenen Stranges möglich ist. D.h. zeigt eine Probe mit weniger als 2,7 x 104
IU/µl HAV RNA im (-) Strang Nachweis ein positives Signal, so handelt es sich eindeutig um
(-) Strang HAV RNA, ein falsch positives Signal aufgrund von evtl. vorhandener (+) Strang
RNA tritt in diesem Bereich nicht auf.
3.2.3.3 Quantifizierung einer HAV Replikationskinet ik
Die Eignung des (-) Strang Nachweises wurde durch Detektion der Replikationsintermediate
einer HAV Wachstumskinetik getestet. Dazu wurden FRhK-4 Zellen in 6 cm Schalen infiziert
(HAV/PI; MOI 1). Die Entnahme der Proben erfolgte direkt nach der Infektion, nach
6 Stunden und weiter im 12 Stunden Rhythmus. Die Zellen wurden abtrypsiniert und gezählt.
Aus der gereinigten Nukleinsäure wurde die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Menge
bestimmt und in Bezug zur Zellzahl gesetzt. Die HAV RNA Menge steigt vom Zeitpunkt der
Infektion von 3 x 105 IU/106 Zellen innerhalb der ersten 30 Stunden auf 107 IU/106 Zellen
(siehe Abb. 11). Bis zu 210 Stunden p.i. nimmt die HAV RNA langsam aber stetig weiter zu
und bleibt bei ca. 4 x 107 IU/106 Zellen bis zum Versuchsende relativ konstant, wohingegen
das Replikationsintermediat im Zeitraum von 6 – 30 Stunden nach Infektion stark ansteigt
und bis zu 294 Stunden p.i. ein konstant hohes Level zeigt. Danach sinkt die Menge an (-)
Strang RNA um das Vierfache, und bleibt bis zum Versuchsende (390 Stunden p.i.) auf
diesem Level.
53
3.3 Untersuchung zum IgA vermittelten Carriermechan ismus des
Hepatitis A-Virus in experimentell infizierten Mäus en
3.3.1 Nachweis des HAV nach intravenöser, intraperi tonealer und oraler Inokulation
von HAV/anti-HAV IgA-Komplexen
3.3.1.1 Vergleich der Inokulationsarten
Zur Bestimmung der geeignetsten Inokulationsart der Mäuse wurden zwölf Tiere auf
unterschiedliche Weise (intravenös, intraperitoneal und oral) mit je einem Milliliter HAV/anti-
HAV IgA-Komplexen [2 x 108 IU/ml] inokuliert und im Anschluss sektioniert. Dabei wurden
sechs Tiere einmal und sechs Tiere zweimal inokuliert. Die einmal inokulierten Tiere wurden
nach vier Tagen sektioniert, die anderen Tiere wurden vier Tage nach der ersten Inokulation
ein zweites Mal behandelt und erst weitere sechs Tage später sektioniert. Zusätzlich zur
HAV Menge erfolgte die Quantifizierung der relativen 18S rRNA und GAPDH Mengen und
die photometrische Bestimmung der gesamten RNA Menge aus den Geweben.
Abb. 11: Replikationskinetik des HAV in FRhK-4 Zellen. Dargestellt ist der Verlauf der HAV RNA sowie der (-) Strang RNA Menge bezogen auf die FRhK-4 Zellzahl in Abhängigkeit von der Zeit. Aufgetragen sind die jeweiligen Mittelwerte zweier unabhängiger Infektionsversuche, die Standardabweichung ist durch Fehlerbalken dargestellt.
54
Die Tabellen 6, 7 und 8 zeigen die HAV Mengen in Bezug auf die gesamte RNA Menge, die
relative 18S rRNA und GAPDH Menge.
Tab. 6: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die gesamte RNA Menge in verschiedenen Geweben
Hepatitis A-Virus IU/µg RNA
Maus
Nr.
Infektion Leber
Lymph-
knoten Gekröse Thymus Milz Niere Blut
1 + 2 2 x i. p. 300,37 0,87 1197,31 n.q. 4483,75 59,60 n. q.
3 + 4 2 x oral - - - - - - -
11 2 x i. v. 1129,48 26,73 - n.q. 10402,90 72,60 29,90
6 + 9 1 x i. p. 83,48 46,45 255,07 36,17 2575,00 608,80 10,55
7 + 8 1 x oral - 71,19 1,31 n.q. - 1,80 -
5 + 12 1 x i. v. 800,70 100,92 83,46 n.q. 2668,35 35,80 9,65
10 nicht inf. - - - - - - -
n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar Tab. 7: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die 18S rRNA Menge in verschiedenen Geweben
HAV IU/rel. Einheit 18S rRNA
Maus
Nr.
Infektion Leber Lymph-
knoten
Gekröse Thymus Milz Niere Blut
1 + 2 2 x i. p. 9,8 x 10-3 0,5 x 10-5 1,8 x 101 n.q. 7,9 x 10-2 0,55 x 10-3 n.q.
3 + 4 2 x oral - 3,7 x 10-4 - n.q. - - n.q.
11 2 x i. v. 4,3 x 10-2 3,4 x 10-4 - n.q. 1,5 x 10-1 7,8 x 10-4 1,7 x 10-4
6 + 9 1 x i. p. 3,3 x 10-3 6,5 x 10-5 7,1 x 100 1,1 x 10-3 7,4 x 10-2 1,7 x 10-3 4,8 x 10-5
7 + 8 1 x oral 0,5 x 10-5 2,9 x 10-4 3,0 x 10-5 n.q. n.q. 1,0 x 10-5 -
5 + 12 1 x i. v. 1,7 x 10-3 4,7 x 10-4 8,8 x 10-4 n.q. 4,0 x 10-2 3,4 x 10-4 4,3 x 10-5
10 nicht inf. - - - - - - -
n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar Tab. 8: HAV RNA Menge (gemittelt) bezogen auf die GAPDH Menge in verschiedenen Geweben
HAV IU/rel. Einheit GAPDH
Maus
Nr.
Infektion Leber Lymph-
knoten
Gekröse Thymus Milz Niere Blut
1 + 2 2 x i. p. 1,6 x 10-1 0,5 x 10-5 1,9 x 10-1 n. q. 3,4 x 10-1 5,3 x 10-4 n. q.
3 + 4 2 x oral - 4,5 x 10-4 - n. q. - - n. q.
11 2 x i. v. 8,3 x 10-1 4 x 10-5 - n. q. 4,6 x 10-1 2,5 x 10-3 8,7 x 10-3
6 + 9 1 x i. p. 9,4 x 10-2 4 x 10-5 9,1 x 10-2 1,8 x 10-4 2,0 x 10-1 4,5 x 10-3 2,5 x 10-3
7 + 8 1 x oral 1 x 10-5 2 x 10-4 2,5 x 10-5 n. q. n. q. 1,5 x 10-5 -
5 + 12 1 x i. v. 3,8 x 10-1 4,6 x 10-4 1,1 x 10-3 n. q. 1,7 x 10-1 5,0 x 10-4 2,3 x 10-3
10 nicht inf. - - - - - - -
n. q. : nicht quantifizierbar - : nicht nachweisbar
55
Nach oraler Inokulation konnten nur unregelmäßig in einigen Geweben sehr geringe HAV
RNA Mengen detektiert werden. Da sich die Fragestellung dieser Arbeit auf den Transport
des Virus im Blut zur Leber bezieht und dadurch nicht den vollständigen natürlichen
Infektionsweg benötigt, war die orale Infektion für die nachfolgenden Experimente nicht
relevant. Die höchsten HAV Mengen wurden im Allgemeinen nach intravenöser Inokulation
detektiert. Trotz guter Ergebnisse wurde auf diese Inokulationsart verzichtet, da die
Applikation in die Schwanzvene aufgrund der geringen Größe und der bei diesen Mäusen
(braune Fell- und Hautfarbe) nicht sichtbaren Schwanzvene sehr schwierig, schlecht
durchführbar und dadurch fehlerbehaftet war. Es zeigte sich, dass nach einmaliger
intraperitonealer Inokulation ausreichend hohe Virusmengen detektiert werden konnten, so
dass alle weiteren Versuche mit intraperitonealer Inokulation und Sektion 4 Tage p.i.
durchgeführt wurden.
3.3.1.2 Auswahl des geeigneten Bezugssystems
Die HAV Menge einer einzigen Probe kann durch absolute Quantifizierung bestimmt werden.
Für den Vergleich der HAV Menge zwischen verschiedenen Proben ist die relative
Quantifizierung notwendig. Durch Normalisierung auf ein endogenes Referenzgen oder die
gesamte RNA werden experimentelle Unterschiede berücksichtigt und es wird die
Vergleichbarkeit der Proben über verschiedene Versuchsansätze hinaus ermöglicht. Die
einzelnen Proben wurden durch real-time PCR sowohl auf ihren 18S rRNA und ihren
GAPDH RNA Gehalt als auch durch photometrische Messung auf den Gesamt-RNA Gehalt
hin untersucht. Die HAV RNA Menge der Proben wurde auf das Referenzgen (18S rRNA
und GAPDH) sowie auf die Gesamt-RNA bezogen und die Daten miteinander verglichen
(Daten nicht gezeigt). Während die Daten bezogen auf 18S rRNA und die Gesamt-RNA im
Verhältnis keine wesentlichen Unterschiede zeigen, weichen die Daten bezogen auf GAPDH
von den anderen Bezugssystemen ab. Für die Auswertung und Darstellung der weiteren
Versuchsergebnisse wurde die HAV RNA Menge und die HAV (-) Strang RNA Menge auf
den Gesamt-RNA Gehalt bezogen.
3.3.2 Untersuchung zum HAV Targeting vermittelt dur ch anti-HAV IgA
In zwei zeitlich versetzt durchgeführten Versuchsreihen wurden je 4 Mäuse im Alter von 42 –
46 Tagen mit HAV, HAV/anti-HAV IgA- und als HAV/Antikörperkomplex Kontrolle mit
56
HAV/anti-HAV IgG-Komplexen inokuliert und nach vier Tagen sektioniert. Die RNA der
entnommenen Gewebe wurde isoliert und mittels quantitativer real-time PCR auf HAV,
GAPDH und 18S rRNA sowie photometrisch auf die Gesamt-RNA Menge untersucht.
Zusätzlich wurde die (-) Strang HAV RNA Menge bestimmt. Die quantifizierte HAV RNA und
(-) Strang RNA Menge wurde auf die total RNA Menge normalisiert. Die RNA Extraktion und
die anschließenden Quantifizierungen wurden in zwei Serien durchgeführt. Diese Serien
wurden zusammen ausgewertet, so dass pro Tier und Gewebe zwei Werte messbar waren.
Die Leber besteht aus verschiedenen Bereichen, die in unterschiedlichen Abständen zu den
zu- und abführenden Blutgefäßen angeordnet sind. Zur Untersuchung, ob ein Unterschied
der HAV Menge zwischen den Bereichen auftritt, wurde der kleinen Leberlappen (Lobus
quadratus) von der restlichen Leber getrennt analysiert. Direkt an diesem Leberlappen treten
die zuführenden Blutgefäße in die Leber ein. Da jedoch keinerlei Unterschiede zwischen den
Werten der Leberlappen zu beobachten waren (Daten nicht gezeigt), wurden diese in der
Auswertung des Versuchs (Abb. 12 und 13) wieder zusammengefügt, d.h. für die Leber
eines jeden Tieres ergaben sich 4 Werte. Neben den Organen Niere, Leber und Milz wurde
das Blut der Mäuse aufgefangen und auf HAV untersucht. Es zeigten sich jedoch keine bzw.
für eine Auswertung zu geringe Mengen HAV im Blut.
3.3.2.1 Nachweis des bevorzugten Virustransports z ur Leber durch anti-HAV IgA
Die HAV RNA und HAV (–) Strang RNA Menge bezogen auf die gesamte RNA aus den
aufgereinigten Leberproben nach i.p. Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und
HAV/IgG-Komplexen ist in Abb. 12 gezeigt. In Abb. 12 A und 12 B ist das Ergebnis der
ersten Versuchsreihe, in Abb. 12 C und D das der zweiten Versuchsreihe, dargestellt. In der
ersten Versuchsreihe ist die HAV Menge in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgG-
Komplexen deutlich geringer als nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen. Die als
Kontrolle für Antikörper-komplexiertes HAV eingesetzten HAV/IgG-Komplexe erreichen die
Leber deutlich schlechter als freies HAV, d.h. das Virus ist durch IgG inhibiert. Sowohl
Immunglobulin G als auch Immunglobulin A Antikörper neutralisieren das Hepatitis A-Virus.
Das Ergebnis zeigt, dass die Neutralisation des HAV durch IgA keinen inhibitorischen Effekt
auf das Erreichen der Leber hat. Nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen kommt
in etwa die gleiche Virusmenge in der Leber an. Der Median, d.h. die Viruskonzentration bei
der die Hälfte der Ergebnisse höhere und die andere Hälfte kleinere Viruskonzentrationen
zeigen, ist nach HAV/IgA Inokulation 327 IU/µg RNA. Nach HAV Inokulation liegt der Median
bei 250 IU/µg RNA (siehe Abb. 12 A). Durch die grafische Darstellung in Form eines Boxplot
Diagramms lässt sich die Streuung der Werte direkt ablesen. Die Länge der Box ist das Maß
57
der Streuung. Die Box wird begrenzt durch das Perzentil 25, unterhalb dieses Wertes liegen
25% der Daten und das Perzentil 75, unter dem 75% der Daten liegen. D.h die Box
repräsentiert 50% der Daten. Die horizontal verlaufenden Striche über und unter der Box
kennzeichnen den größten und den kleinsten Wert, der nicht als extremer Wert oder als
Ausreißer klassifiziert wird. Ausreißer werden durch kleine Kreise, extreme Werte durch
Sternchen dargestellt. Die Lage des Median innerhalb der Box gibt einen Eindruck von der
Schiefe der Datenverteilung. Die Streuung, also die Größe der Box, ist nach Inokulation von
HAV und HAV/IgA-Komplexen ebenfalls sehr ähnlich, wobei in beiden Fällen eine schiefe
Verteilung zu den niedrigen Konzentrationen vorliegt. D.h. viele der ermittelten Werte
enthielten geringe HAV RNA Konzentrationen und einige wenige zeigten extrem hohe HAV
RNA Konzentrationen. Bei allen Inokula wurden nur sehr geringe HAV (-) Strang RNA
Mengen in der Leber gefunden. Dabei ist ein deutlicher Unterschied (siehe Abb. 12 B) zu
beobachten, der jedoch nicht signifikant (p<0,5) ist. Die Streuung der Werte unterscheidet
sich deutlich, wobei bei allen Inokula eine Schiefe zu den niedrigen Konzentrationen vorliegt.
Nach Inokulation mit HAV/IgA sind die HAV Konzentrationen in der Leber und die Streuung
der Werte wesentlich größer als bei HAV/IgG und HAV Inokulation.
Generell sind die HAV RNA Konzentrationen in der Mäuseleber der zweiten Versuchsreihe
(Abb. 12 C und D) deutlich geringer als in denen der ersten Versuchsreihe. Während im
ersten Durchgang bis zu 2000 HAV RNA IU/µg total RNA gefunden werden, liegt der
Höchstwert des zweiten Durchgangs bei 700 HAV RNA IU/µg total RNA. Abb. 12 D zeigt das
Ergebnis der Untersuchung auf (-) Strang HAV RNA. Es konnten nur vier Einzelwerte
detektiert werden. Der Rest der Leberproben zeigte keinerlei Replikationsintermediat. Das
Ergebnis der HAV RNA weicht von dem der ersten Versuchsreihe ab. Nach Inokulation mit
HAV konnte in der zweiten Mausreihe signifikant mehr HAV in der Leber detektiert werden
als nach Inokulation mit HAV/IgG- und HAV/IgA-Komplexen. Abb. 12 C zeigt, dass die HAV
RNA Konzentrationen in den Leberproben nach Inokulation mit den beiden HAV
Immunkomplexen nahezu gleich sind. Während in der ersten Versuchsreihe nach Inokulation
mit HAV und HAV/IgA-Komplexen in etwa die gleiche Virusmenge in der Leber ankommt
(Abb. 12A), zeigt sich in der zweiten Versuchsreihe (Abb. 12C) nach Inokulation mit HAV/IgA
eine deutlich geringere Konzentration als nach Inokulation mit freiem HAV. In dieser
Versuchsreihe verhält sich HAV/IgA ähnlich der HAV/IgG Kontrolle.
58
Abb. 12: Boxplot Diagramme der HAV RNA (A, C) sowie HAV (-) Strang RNA (B, D) Konzentration in der Leber nach Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen. A und B zeigt das Ergebnis der ersten, C und D die der zweiten Versuchsreihe. Nach Inokulation von HAV und HAV/IgA-Komplexen sind bei der ersten Versuchsreihe die gleichen HAV RNA Konzentrationen in der Leber zu finden. Abweichend davon zeigen sich bei der zweiten Versuchsreihe nach Inokulation von HAV/IgA in etwa die gleichen Werte in der Leber wie nach Inokulation der HAV/IgG Kontrolle. D.h. deutlich geringere HAV RNA Konzentration als nach Inokulation von nicht Antikörper komplexiertem HAV. HAV (-) Strang RNA konnte in beiden Versuchsreihen in nur sehr geringen Konzentrationen detektiert werden, wobei die Werte bei der ersten Versuchsreihe, insbesondere nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen, etwas höher sind. In der zweiten Versuchsreihe konnte von den 16 Werten pro Inokula nur 2 bei HAV/IgA und je einer bei HAV und HAV/IgG Inokulation positiv für HAV (-) Strang RNA detektiert werden. °= Extremwerte; *= Ausreißer
A B
C D
59
Beide Versuchsreihen unterscheiden sich lediglich dadurch, dass andere Individuen
eingesetzt wurden. Obwohl mit Tieren im Alter von 42 – 46 Tagen gearbeitet wurde,
schienen die Mäuse in den beiden Versuchsreihen in ihrer Größe voneinander abzuweichen,
was auf unterschiedliches Alter der Individuen hindeutet. Aufgrund der unterschiedlichen
Reifung des Immunsystems könnte dies einen Einfluss auf das Ergebnis gehabt haben. Um
diese Schwankungen in den folgenden Versuchen zu minimieren, wurde das Gewicht der
Mäuse bestimmt. Obwohl das Alter der Mäuse in den beiden Versuchsreihen maximal 4
Tage auseinander lag (42 - 46 Tage alt), hatte dies großen Einfluss auf die Erreichbarkeit der
Leber. Nicht nur das Alter der Mäuse, auch andere allgemeine physiologische Unterschiede
zwischen den Individuen scheinen Einfluss auf die Infizierbarkeit der Mäuse zu haben. Um
vor dem Hintergrund mehrerer unabhängiger Variabler, die das Infektionsereignis
beieinflussen können, eine Aussage treffen zu können, wurde das Ergebnis beider
Versuchsreihen in Abb. 13 zusammengefaßt.
Abb. 13: Boxplot Diagramm zusammengefasst aus zwei Versuchstierreihen. HAV RNA Konzentration in der Leber nach Inokulation der Mäuse mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen. Nach Inokulation von HAV und HAV/IgA-Komplexen ist die Streuung der HAV RNA Konzentrationen in der Leber nahezu gleich, d.h. bei einigen Indiviuen kommen in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgA ähnliche virale RNA Konzentrationen an, als nach Inokulation von freiem HAV. Nach HAV/IgA Inokulation zeigt sich jedoch eine deutliche Schiefe in der Verteilung der Werte. Die Hälfte der Individuen zeigt in der Leber ähnliche HAV RNA Konzentrationen wie nach Inokulation der HAV/Antikörper Kontrolle HAV/IgG.D.h. die Erreichbarkeit der Leber in Tieren dieser Altersgruppe ist nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen stark vom Indiviuum abhängig. °= Extremwerte; *= Ausreißer
60
Die Zusammenfassung aller Individuen im Alter von 42 - 46 Tagen (d.h. Versuchsreihe 1
und 2) zeigt sich nach Inokulation mit unkomplexiertem HAV und nach Inokulation mit
HAV/IgA-Komplexen in Größe und Lage der Box ein ähnliches Bild. Der Median der HAV
Konzentrationen in der Leber nach Inokulation mit freiem HAV liegt über 200 HAV RNA IU/µg
total RNA, wohingegen durch Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen bei der Hälfte der Mäuse
in der Leber unter 100 HAV RNA IU/µg total RNA ankommen. Der Median der HAV/IgG
Kontrolle liegt bei 54 HAV RNA IU/µg total RNA, die Werte sind normalverteilt und zeigen
eine geringe Streuung. Die Streuung der Konzentrationen in der Leber nach Inokulation mit
HAV/IgA-Komplexen ist deutlich größer als nach HAV/IgG Inokulation und gleicht der
Streuung nach Inokulation mit freiem HAV. D.h. die Erreichbarkeit durch HAV/IgA-Komplexe,
aber auch durch freies HAV ist stark vom Indiviuum und dessen physiologischer Ausstattung
abhängig. Die deutliche Schiefe der Verteilung nach Inokulation von HAV/IgA (siehe Abb. 13)
zeigt, dass innerhalb dieser Altersklasse viele Werte mit geringer HAV RNA Konzentration
und einige wenige mit extrem hoher HAV RNA Konzentration in der Leber gefunden wurden.
Innerhalb der untersuchten Altersgruppe ist die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA in
einigen Individuen deutlich höher als durch HAV/IgG-Komplexe und vergleichbar mit der
Erreichbarkeit der Leber durch unkomplexiertes HAV. Auch generalisiert über beide
Versuchsreihe wurden bei allen Inokula nur sehr geringe HAV (-) Strang RNA Mengen in der
Leber gefunden. Dabei ist ein deutlicher Unterschied zwischen der HAV (-) Strang RNA
Konzentration in der Leber nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen und nach Inokulation
von HAV/IgG und unkomplexiertem HAV zu beobachten. Nach Inokulation der HAV/IgA-
Komplexe findet eine produktive Infektion der Leber statt. Die über beide Versuchsreihen
generalisierten Werte zeigen eine große Streuung, wobei 75 % der Daten unter 0,325 IU (-)
Strang RNA/µg total RNA liegen. Auch nach Inokulation von HAV/IgG-Komplexen und
unkomplexiertem HAV ist (-) Strang RNA in der Leber einiger Tiere nachweisbar, die
Infektion trat dabei aber nur sehr vereinzelt in einigen Tieren auf, wobei die einzelnen Daten
in der Höhe der (-) Strang RNA Konzentrationen vergleichbar mit denen nach HAV/IgA-
Komplex Inokulation waren.
3.3.2.2 Verteilung des HAV nach Inokulation von HAV , HAV/anti-HAV IgA- und
HAV/anti-HAV IgG-Komplexen
Abb. 14 zeigt die Verteilung der HAV RNA und der HAV (-) Strang RNA Konzentrationen auf
die Organe nach Inokulation von HAV und HAV-Immunkomplexen. In Abb. 14 A und B sind
die Ergebnisse der ersten Versuchstierreihe, in Abb. 14 C und D die der zweiten
Versuchstierreihe gezeigt. Die recovery rate nach Inokulation der Versuchstiere mit HAV
61
anti-HAV IgA-Komplexen ist in der ersten Tierreihe (Abb. 14 A) signifikant höher als nach
Inokulation von HAV bzw. HAV/anti-HAV IgG-Komplexen. Während es nach Inokulation von
HAV und HAV/IgG-Komplexen zwischen den HAV RNA Konzentrationen in den Organen
keinen signifikanten Unterschied gibt, zeigt sich nach Inokulation von HAV/IgA in der Milz
eine signifikant höhere HAV RNA Konzentration als in Leber und Niere. Bezogen auf das
gesamte Organ, d.h. unter Berücksichtigung des Organgewichtes, (siehe Abb.15 A) ist in der
Leber nach HAV/IgA Gabe eine deutlich höhere HAV RNA Menge vorhanden als in Niere
und Milz. Nach Inokulation mit HAV und HAV/IgG-Komplexen zeigen sich zwischen den
Medianen der Organe kaum Unterschiede. Die Streuung der Virusmenge ist in Niere und
Milz sehr gering (Abb. 15 A). In der Leber ist sie bei beiden Inokula wesentlich größer und
zeigt eine deutliche Schiefe der Verteilung zu den niedrigen Virusmengen. D.h. in der ersten
Versuchsreihe ist nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen deutlich mehr virale RNA in den
Organen als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG, desweiteren ist bei allen Inokula die
höchste Virusmenge in der Leber zu finden (Abb. 15 A). (-) Strang HAV RNA (Abb. 14 B)
wird in den einzelnen Geweben teilweise in sehr geringen Mengen detektiert, signifikante
Unterschiede zwischen den Inokula zeigen sich dabei nicht, jedoch lässt sich ein leichter
Trend zu häufigeren Replikationsereignissen nach HAV/IgA Inokulation beobachten. Wie bei
Betrachtung der Leber (siehe 3.3.2.1), zeigt sich auch in der Verteilung des Virus auf die
Organe in der zweiten Versuchsreihe (Abb. 14 C und 15 B) ein anderes Bild als in der ersten
Versuchstierreihe (Abb. 14 A und 15 A). Die detektierten Virusmengen sind deutlich geringer
als in dem ersten Versuchsdurchlauf. Die Tiere, die mit HAV/anti-HAV IgG-Komplexen
inokuliert wurden zeigen insgesamt die geringste Viruskonzentrationen, der Unterschied zu
den HAV und HAV/anti-HAV IgA-Komplex inokulierten Tieren ist jedoch geringer als im
ersten Versuchsdurchlauf. Wie Abb. 14 C zeigt ist kein signifikanter Unterschied der HAV
Konzentration in Abhängigkeit vom Inokula auszumachen. Korrelierend mit dem Ergebnis
der ersten Versuchsreihe ist nach Inokulation der Tiere mit HAV/IgA-Komplexen eine
signifikant höhere HAV RNA Konzentration in der Milz als in Leber und Niere vorhanden.
Nach Inokulation von HAV gibt es keine signifikanten Unterschiede der Viruskonzentration
(Abb 14 C) in den einzelnen Organen, wobei die Konzentration in der Niere nicht signifikant
(p<0,05), aber deutlich geringer ist als in Leber und Milz.
62
Abb. 14: Boxplot Diagramme der Hepatitis A-Virus RNA (A und C) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B und D) in den Organen der Versuchstiere nach vorheriger Inokulation mit HAV, HAV anti-HAV IgA- und HAV anti-HAV IgG-Komplexen. A) und B) zeigt die Verteilung der HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentration in den Organe der ersten Versuchstierreihe; C) und D) zeigt das Ergebnis der zweiten Versuchsreihe. Die erste Reihe (A) zeigt nach Inokulation mit HAV/IgA deutlich höhere Konzentrationen, wobei in der Milz die höchsten Konzentrationen auftreten, als nach Inokulation mit HAV/IgG und HAV. Dagegen zeigt die zweite Versuchsreihe (C) eine deutlich heterogenere Konzentrationsverteilung. HAV (-) Strang RNA (B und D) tritt in beiden Versuchsreihen in sehr geringen Konzentrationen sporadisch auf. Signifikante Unterschiede zwischen den Inokula sind dabei nicht zu beobachten. °= Extremwerte; *= Ausreißer
A B
C D
63
Im Gesamtorgan (Abb. 15 B) zeigt sich, im Gegensatz zu den Konzentrationen, nach HAV
Inokulation ein anderes Muster. In der Leber ist deutlich mehr HAV RNA vorhanden als in
Niere und Milz. Nach Inokulation von HAV/IgG-Komplexen treten ähnlich den HAV/IgA-
Komplexen höhere Viruskonzentrationen in der Milz als in Leber und Niere auf, wobei der
Unterschied zwar deutlich (p=0,09) aber nicht signifikant ist (Abb. 14 C).
Bezogen auf die Virusmenge im Organ lassen sich nach HAV/IgA Inokulation die höchsten
Mengen in der Leber (mit einer schiefen Verteilung zu geringeren Mengen) und nach
Inokulation mit HAV/IgG relativ ähnliche Virusmengen in allen drei Organen, jedoch ebenfalls
die höchsten Menge in der Leber (mit einer schiefen Verteilung zu geringeren Mengen)
finden. D.h. obwohl die Viruskonzentrationen bei Inokulation mit HAV/IgA und HAV/IgG in
der Milz am höchsten und in der Leber am niedrigsten sind, ist die Virusmenge bezogen auf
das gesamte Organ in der Leber, aufgrund der Größe des Organs, höher als in Niere und
Milz wohingegen Inokulation mit HAV sowohl die höchste Konzentration als auch die höchste
RNA Menge in der Leber zeigt. Die (-) Strang HAV RNA (Abb. 14 D) zeigte auch in dieser
Abb. 15: HAV RNA Menge in den Organen der Versuchstiere nach vorheriger Inokulation mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen dargestellt als Boxplot Diagramm. Abb. A zeigt die Verteilung der HAV RNA Menge in den Organen der ersten Versuchstierreihe; B zeigt das Ergebnis der zweiten Versuchsreihe. In beiden Versuchsreihen ist bei allen Inokula in der Leber die höchste HAV RNA Menge zu finden. Die erste Reihe (A) zeigt nach Inokulation mit HAV/IgA in allen Organen deutlich höhere Virusmengen, als nach Inokulation mit HAV/IgG und HAV. In der zweiten Versuchsreihe dagegen ist der Unterschied zwischen den Inokula deutlich geringer, wobei nach HAV Inokulation wesentlich mehr virale RNA in der Leber zu finden ist als in anderen Organen der gleichen und anderen Inokulationsarten.
°= Extremwerte; *= Ausreißer
A B
64
Tierreihe nur vereinzelte Daten, die keine signifikanten Unterschiede untereinander
beinhalten.
Sowohl bei der Betrachtung der Viruskonzentration als auch bei der Verteilung in den
verschiedenen Organen sind Unterschiede zwischen den Versuchstierreihen aufgetreten.
Die Versuchstiere der jeweiligen Reihen schienen subjektiv in der Größe voneinander
abzuweichen. Ein etwaiger Einfluss des Alters der Mäuse bzw. der Reifung des
Immunsystems könnte Einfluss auf die Versuchsergebnisse nehmen. Generalisiert über
beide Versuchsreihen lassen sich nach HAV/IgA Inokulation in allen Organen deutlich
höhere Virusmengen nachweisen als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG. Bei allen
Inokula ist in der Leber mehr virale RNA zu finden als in Niere und Milz. Innerhalb der
untersuchten Altersgruppe ist die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA in einigen
Individuen deutlich höher als durch HAV/IgG-Komplexe, jedoch unterliegt dies starken
individuellen Schwankungen.
3.3.2.3 Vergleich des anti-HAV IgA vermittelten Tra nsports zur Leber in Mäusen
unterschiedlichen Alters
Die Mäuse der ersten beiden Versuchsreihen hatten ein Alter von 42 - 46 Tagen. Obwohl der
Zeitraum nur sehr begrenzt ist, schienen die Mäuse der beiden Versuchsreihen in ihrer
Entwicklung, bezogen auf Größe und Gewicht, deutlich auseinander zu liegen. Um die Frage
zu klären, ob der Entwicklungsstand der Mäuse einen Einfluss auf die Verteilung des Virus
und die Erreichbarkeit der Leber hat, wurden Mäuse im Alter von 42 – 46 (jugendlich) und 63
– 84 Tagen (erwachsen) verglichen. Je vier Mäuse beider Altersgruppen wurden mit je
einem Milliliter HAV, HAV/anti-HAV IgA- und HAV/anti-HAV IgG-Komplexen [2 x 108 IU/ml]
i. p. inokuliert und nach vier Tagen sektioniert. Die Gewebe Leber, Niere, Milz, Gekröse
(Lymphgewebe des Darms) und Thymus wurden entnommen und die HAV RNA und
gesamte RNA Menge quantifiziert. Die jugendlichen Mäuse wogen 16,5 - 20,9 g, die älteren
Mäuse zwischen 23,0 und 25,8 g.
Abb. 16 zeigt einen signifikanten Unterschied in der HAV RNA Konzentration (Abb. 16 A)
und der HAV (-) Strang RNA Menge (Abb. 16 B) zwischen jugendlichen und erwachsenen
Mäusen. Generell liessen sich in den erwachsenen Mäusen deutlich höhere HAV RNA und
auch HAV (-) Strang RNA Konzentrationen nachweisen.
65
Abb. 16: Boxplot Diagramme der HAV RNA (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) aus den Organen von Versuchstieren unterschiedlicher Altersgruppen. In den jugendlichen Mäusen (42 – 46 Tage) ist die HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentration deutlich geringer als in den 63 – 84 Tage alten Mäusen. Gekröse und Thymus zeigen die höchsten HAV RNA und (-) Strang RNA Konzentrationen, wobei die Streuung der Werte wesentlich größer ist als in den anderen Geweben.
°= Extremwerte; *= Ausreißer
B
A
66
In beiden Altersgruppen sind nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen höhere HAV RNA
Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV/IgG und unkomplexiertem HAV.
Sowohl bei den jugendlichen als auch bei den erwachsenen Mäusen wurden die höchsten
Viruskonzentrationen in den Geweben Gekröse, Thymus und Milz detektiert. In Leber und
Niere sind im Vergleich zu den Lymphgeweben deutlich geringere Konzentrationen
auffindbar. Dieses Verteilungsmuster ändert sich bei Betrachtung der HAV RNA Menge im
gesamten Organ aufgrund der unterschiedlichen Organgrößen. Während die
Konzentrationen in der Leber deutlich geringer sind als in Gekröse und Milz, ist die Viruslast
in der Leber bezogen aufs gesamte Organ deutlich höher (siehe Abs. 3.3.2.2). Bei den HAV
(-) Strang RNA Konzentrationen (Abb. 16 B) ist der Unterschied zwischen den Organen nicht
ganz so deutlich. Lediglich die Streuung in den Proben des Gekröses ist größer, der Median
liegt aber vergleichbar mit den anderen Organen. Eine Ausnahme ist die (-) Strang RNA
Menge erwachsener Mäuse, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden. Bei diesen
Tieren lies sich im Gekröse deutlich mehr (-) Strang RNA nachweisen als bei den anderen
Mäusen, was auf eine bessere Replikation im Darmgewebe dieser Tiere hinweist.
In Abb. 17 A ist die HAV RNA Konzentration im Boxplot Diagramm aufgetragen, welche nach
Inokulation von Mäusen unterschiedlicher Altersklassen mit HAV, HAV/IgG- und HAV/IgA-
Komplexen in der Leber nachweisbar ist. Unabhängig von der Art des Inokula finden sich in
den jüngeren Mäusen signifikant geringere Viruskonzentrationen als in den älteren, d.h. das
Alter der Mäuse hat einen Einfluss auf den Transport des Virus. Bei den jüngeren Mäusen
lässt sich nach Inokulation mit HAV mehr Virus in der Leber detektieren als nach Gabe von
HAV/IgA- und HAV/IgG-Komplexen, wobei dieser Unterschied nicht signifikant ist. Bei den
älteren Mäusen wird deutlich (p = 0,08) mehr HAV RNA in der Leber nach Inokulation von
HAV/IgA detektiert, als nach Inokulation von HAV oder auch HAV/IgG. Der Nachweis des (-)
Stranges ergab in den jüngeren Mäusen trotz einer größeren Streuung der HAV
Konzentrationen nach Inokulation von HAV und HAV/IgG-Komplexen keinen vom Inokulum
abhängigen Unterschied (siehe Abb. 17 B). Die älteren Mäuse zeigen nach HAV/IgA
Inokulation deutlich mehr (-) Strang RNA in der Leber als nach Inokulation mit HAV und
HAV/IgG-Komplexen, d.h. die Erreichbarkeit der Leber ist mit HAV/IgA-Komplexen deutlich
besser als mit HAV bzw. HAV/IgG-Komplexen und es kommt zur Infektion und
Virusreplikation.
67
Abb. 17: Vergleich der HAV RNA (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) in der Leber von Mäusen unterschiedlicher Altersgruppen nach Inokulation mit HAV und HAV Immunkomplexen. In der Leber der älteren Tiere (63 – 84 Tage) sind nach HAV/IgA Inokulation deutlich höhere HAV RNA und HAV (-) Strang RNA Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV und HAV/IgG, wohingegen in den jugendlichen Mäusen die höchsten HAV RNA Konzentrationen nach Inokulation von unkomplexiertem HAV auftreten. °= Extremwerte; *= Ausreißer
Die Ergebnisse zeigen, dass IgA als Carrier für die Erreichbarkeit der Leber durch HAV
dienen kann, dieser Mechanismus aber vom individuellen physiologischen Zustand des
Tieres abhängig ist. In den älteren Tieren erreichen die HAV/IgA-Komplexe die Leber
deutlich besser, d.h. in höherer Konzentration als freies HAV. In der Gesamtheit der
untersuchten Tiere unterliegt die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe starken
Schwankungen. Ob und mit welcher Effinzienz die Leber erreicht wird ist stark vom
individuellen physiologischen Zustand der Tiere abhängig, jedoch wird die Leber nach
Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen auch generalisiert über alle Tiere besser erreicht als
durch die HAV/Antikörper-Komplex Kontrolle HAV/IgG.
3.3.3 Einfluss der Immunantwort auf den anti-HAV Ig A Carriermechanismus
In 3.3.2 wurde gezeigt, dass das Hepatitis A-Virus die Leber durch einen IgA vermittelten
Carriermechanismus erreichen kann. Durch die IgA Komplexierung ist das Virus zunächst
vor Neutralisation durch anti-HAV IgG Antikörper geschützt. Während der Reifung der
Immunreaktion werden hochavide anti-HAV IgG Antikörper gebildet, die das IgA aus den
A B
68
HAV/IgA-Komplexen verdrängen und so den Carriermechanismus zur Leber unterbrechen
könnten. Ob und ab welchem Zeitpunkt die Avidität der anti-HAV IgG Antikörper stark genug
ist das IgA aus den Komplexen zu verdrängen, das Virus zu neutralisieren und dadurch eine
Infektion bzw. den möglichen enterohepatischen Kreislauf zu unterbrechen, wurde in den
folgenden Experimenten untersucht.
3.3.3.1 Neutralisation der HAV/anti-HAV IgA-Komplex e mittels monoklonaler anti-HAV
IgG Antikörper in Zellkultur
In einem Zellkulturversuch wurde untersucht, ob anti-HAV IgG Antikörper in der Lage sind
den IgA vermittelten Carriermechanismus durch Veränderung der HAV/anti-HAV IgA-
Komplexe zu neutralisieren. Dazu wurden NCTC Zellen (murine Hepatozyten) mit
verschiedenen HAV/Immunkomplexen sowie zur Kontrolle mit unkomplexiertem HAV infiziert
und die HAV RNA Konzentrationen zum Zeitpunkt 0, 1 und 2 Tage nach der Infektion
bestimmt. In diesem Experiment wurde der hochavide monoklonale anti-HAV IgG Antikörper
7E7 verwendet. Zur Untersuchung einer möglichen Kompetition zwischen anti-HAV IgA und
anti-HAV IgG wurde die Komplexierung des Virus mit beiden Antikörpern auf
unterschiedliche Weise durchgeführt. In einem Ansatz erfolgte die Zugabe von anti-HAV IgA
und anti-HAV IgG zur Komplexbildung zeitgleich (Abb. 18: HAV/IgA/IgG), so dass eine
direkte Kompetition zu beobachten ist. In einem weiteren Ansatz sollte eine mögliche
Verdrängung des IgA durch anti-HAV IgG aus bereits gebildeten HAV/IgA-Immunkomplexen
geprüft werden. Dazu wurden zunächst HAV/anti-HAV IgA-Komplexe hergestellt, zu denen
dann Immunglobulin G gegeben wurde (siehe Abb. 18: HAV/IgA + IgG).
In NCTC Zellen findet nach Infektion mit HAV keinerlei Viruswachstum statt. Abb. 18 zeigt,
dass das direkt nach der Infektion vorhandene und an die Zellen gebundene Virus nach
einem und zwei Tagen deutlich reduziert ist und keine Replikation stattfindet. Im Gegensatz
dazu ist die Viruslast der Zellen nach Infektion mit HAV/anti-HAV IgA-Komplexen nach ein
und zwei Tagen höher bzw. gleichbleibend, d.h. Virusreplikation findet statt. HAV neutralisiert
mit anti-HAV IgG zeigt bereits direkt nach der Infektion deutlich weniger an die Zellen
gebundenes Virus als nach Infektion mit nicht komplexiertem Virus und den HAV/IgA-
Komplexen, d.h. die Bindung des Virus an die Zellen ist durch den anti-HAV IgG Antikörper
behindert. Auch wird das Virus bei den HAV/IgG-Komplexen nach einem und zwei Tagen
nahezu vollständig eliminiert, Virusreplikation findet nicht statt. Bei paralleler HAV
Komplexierung durch IgA und IgG wird der Effekt des IgA ebenso aufgehoben, wie bei
Zugabe des Immunglobulin G zu fertigen HAV/IgA-Komplexen. Bei Infektion mit diesen
Immunkomplexen findet trotz des vorhandenen IgA keinerlei Viruswachstum in den NCTC
69
Zellen statt. Bereits einen Tag nach der Infektion ist das Virus vollständig aus den Zellen
eliminiert, d.h. anti-HAV IgG Antikörper neutralisieren die Infektiösität der HAV/anti-HAV IgA-
Komplexe. Immunglobulin G ist durch Verdrängung des IgA oder zusätzliche Bindung in der
Lage HAV/IgA-Komplexe zu neutralisieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Abbruch des IgA
vermittelten Carriermechanismus in vivo durch Neutralisation der HAV/IgA-Komplexe mit
anti-HAV IgG Antikörpern möglich ist.
3.3.3.2 Untersuchung zur Inhibition des anti-HAV Ig A Carriermechanismus durch anti-
HAV IgG Antikörper
Die Immunisierung der 6 Wochen alten Mäuse (15 Mäuse) erfolgte zum Zeitpunkt 0, 1 und 3
Monate, wobei nicht immunisierte Mäuse nach gleichem Schema mit PBS inokuliert wurden.
Nach weiteren drei Monaten (6 Monate nach der ersten Immunisierung) erfolgte die
Inokulation von 4 nicht immunisierten und 5 immunisierten Mäusen mit HAV sowie 9 nicht
immunisierten und 10 immunisierten Mäusen mit HAV/IgA-Komplexen. Auf die Kontrolle der
Inokulation von HAV/IgG-Komplexen wurde verzichtet, da aus den vorangegangenen
Abb. 18: HAV RNA Konzentrationen in NCTC Zellen nach Infektion mit HAV, HAV/anti-HAV IgA- und IgG-Komplexen sowie Immunkomplexen mit anti-HAV IgA und IgG. Während nach Infektion mit HAV/IgA-Komplexen über zwei Tage Virus in den Zellen nachweisbar ist, ist das Virus nach Infektion mit unkomplexiertem HAV und den IgG enthaltenden Immunkomplexen bereits nach einem Tag nahezu vollständig eleminiert. HAV/IgA/IgG = kompetitive Komplexbildung HAV/IgA + IgG = Zugabe des IgG zu fertigen HAV/IgA Komplexen
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
HAV HAV/IgA HAV/IgG HAV/IgA/IgG HAV/IgA +IgG
Immunkomplexe
HA
V R
NA
IU/µ
g to
tal R
NA
0
1
2
Tage nach Infektion
70
Versuchen der schlechtere Transport des Virus im Vergleich zu HAV und HAV/IgA-
Komplexen ausreichend gezeigt wurde. Die Sektion der Tiere und Analyse der Gewebe
erfolgte weitere vier Tage später.
Tab. 9: Untersuchung des anti-HAV IgG Status mittels EIA aus dem Serum der immunisierten Mäuse
EIA Werte (OD) der Seren vom Maus Nr. 22.03.06 20.04.06 14.06.06 01.08.06
Immunstatus anti-HAV IgG
14 2,4147 2,2028 1,8701 1,8611 +
15 2,4241 2,2451 2,1069 2,4170 +/-
16 2,3185 2,3290 2,1336 2,1055 +/-
17 2,5186 2,2288 1,2410 0,9934 ++
18 2,3877 2,0724 1,2842 1,5996 ++
19 1,9898 1,8535 1,9102 1,7653 +
20 2,0574 1,8130 2,2131 2,0584 +/-
21 2,2596 1,9837 1,8719 1,8810 +
22 2,5369 1,9432 2,0292 1,4174 ++
23 2,4712 2,1325 1,9053 1,8776 +
24 2,5394 2,1567 0,8363 0,8455 ++
25 2,3451 1,8459 2,1151 1,7346 +
26 2,3485 2,1805 1,8863 1,8461 +
27 2,0725 1,7585 1,0885 1,1668 ++
28 2,2831 1,7426 0,9976 1,0363 ++ +/- = geringer anti-HAV IgG Titer + = mittlerer anti-HAV IgG Titer ++ = hoher anti-HAV IgG Titer
Den Mäusen wurde vor der ersten Immunisierung, nach 1, 3 und 5 Monaten durch Punktion
des retrobulbären Venenplexus Blut entnommen und auf anti-HAV IgG Antikörper im EIA
untersucht (siehe Tab. 9). Das Blut der nicht immunisierten Mäuse wurde vor der ersten und
nach der letzten PBS Inokulation im EIA getestet und war in allen Mäusen anti-HAV IgG
Antikörper negativ (Daten nicht gezeigt). Die Menge der anti-HAV IgG Antikörper verhält sich
direkt antiproportional zum OD-Wert aus der EIA, d.h. je kleiner der OD-Wert desto mehr
IgG-Antikörper sind vorhanden. Der cut-off für diese EIA Analyse war 1,5. Bei einem OD-
Wert unterhalb des cut-off ist die Reaktion positiv, d.h. IgG-Antikörper sind vorhanden. Die
Bildung der anti-HAV IgG Antikörper ist stark vom Individuum abhängig, die Schwankung ist
relativ groß und einige Mäuse zeigten sehr schlechte Antikörper Werte bzw. OD-Werte über
dem cut-off. Im Vergleich zu den OD-Werten der Seren vor der ersten Impfung konnten
jedoch alle Mäuse als immunisiert betrachtet, mit HAV bzw. HAV/IgA-Komplexen inokuliert
und mit den entsprechend behandelten nicht immunisierten Mäusen verglichen werden.
71
Abb. 19 A zeigt, dass nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen deutlich höhere HAV RNA
Konzentrationen in den nicht immunisierten Mäusen als in den immunisierten auftreten. Der
Median in den nicht immunisierten Mäusen ist 127,4 IU/µg RNA, wohingegen der Median der
immunisierten Mäuse bei 30 IU/µg RNA liegt. Die Konzentration der viralen RNA ist nach
HAV Inokulation in den nicht immunisierten Mäusen in etwa gleich mit der RNA
Konzentration nach Inokulation mit HAV/IgA in den immunisierten Mäusen. D.h. der für das
Virus positive Einfluss durch den IgA-Carriermechanismus kommt bei immunisierten Tieren
nicht zum tragen und die virale RNA Konzentration ist gleich der nach HAV Inokulation in
nicht immunisierten Mäusen. Korrelierend mit den Ergebnissen aus 3.3.2 zeigt sich, dass
auch hier in den nicht immunisierten Mäusen nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen
wesentlich höhere Viruskonzentrationen in der Leber auftreten als nach HAV Inokulation.
D.h. das Virus erreicht die Leber mit IgA komplexiert deutlich besser als nicht komplexiert. In
Mäusen die anti-HAV IgG Antikörper positiv sind, ist dies nicht mehr der Fall und der
Carriermechanismus des anti-HAV IgA ist aufgehoben. Die Verteilung der HAV RNA
Konzentrationen in den Organen (Abb. 19 B) bestätigt dies. Unabhängig von den Organen ist
in den nicht immunisierten Mäusen, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden,
Abb. 19: Vergleich der HAV RNA Konzentrationen in der Leber (A) von immunisierten und nicht immunisierten Mäusen nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-Komplexen, sowie der Verteilung der HAV RNA Konzentrationen in den Organen (B). Nach Inokulation mit HAV/IgA ist die Viruskonzentration in der Leber bei nicht immunisierten Tieren deutlich höher als bei immunisierten Tieren und auch deutlich höher als nach Inokulation von unkomplexiertem HAV. Die Verteilung der HAV RNA Konzentration in den Organen zeigt signifikant höhere Konzentrationen nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen. Besonders deutlich wird dies im Gekröse der nicht immunisierten Mäuse. °= Extremwerte; *= Ausreißer
A B
72
signifikant mehr Virus nachweisbar als in den immunisierten. Bei Inokulation mit HAV tritt
kein signifikanter Unterschied der HAV RNA Konzentrationen in den Organen zwischen den
immunisierten und nicht immunisierten Mäusen auf. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung
zu, dass der HAV IgA Carriermechanismus durch die Immunisierung bzw. anti-HAV IgG
Antikörper aufgehoben wird.
3.3.3.3 Abhängigkeit der anti-HAV IgA Verdrängung v om Reifungsgrad der
Immunantwort
Zur Klärung, ob die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe durch die Kompetition zwischen IgA-
und neutralisierenden IgG-Antikörpern von der Reifung der Immunantwort, d.h. von Menge
und Avidität der Antikörper abhängig ist, wurden Mäuse immunisiert und zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung mit HAV/IgA inokuliert. Es
wird vermutet, dass mit Reifung der Immunantwort antiproportional zur steigenden Avidität
der Immunglobulin G Antikörper der IgA vermittelte Carriermechanismus durch Verdrängung
von IgA aus den Komplexen durch das hochavide IgG inhibiert wird. In Abhängigkeit vom
Reifungsgrad der Immunantwort würde das hochavide IgG zum Abbruch des möglichen
enterohepatischen Kreislaufs, und dadurch schlussendlich zur endgültigen Beendigung der
Infektion führen. D.h. nach Inokulation zu den späteren Zeitpunkten der Immunisierung
würde weniger HAV in der Leber der Tiere ankommen als zu einem frühen Zeitpunkt, bei
dem die Avidität des IgG geringer ist. Sechs Wochen alte Tiere wurden mit HAV (bzw. PBS)
geimpft und eine und drei Monate später geboostert. Einen, drei und sechs Monate nach
Beginn der Immunisierung erfolgte die Inokulation. Dabei wurden zu jedem der Zeitpunkte je
vier immunisierte und vier nicht immunisierte Mäuse mit HAV/IgA-Komplexen, sowie jeweils
drei Mäuse mit HAV inokuliert (Daten nicht gezeigt). Jeweils vier Tage nach der HAV/IgA
Inokulation wurden die Tiere sektioniert und die HAV RNA Menge in den Organen analysiert.
Den Mäusen wurde vor der ersten Immunisierung, nach 1, 3 und 6 Monaten durch Punktion
des retrobulbären Venenplexus Blut entnommen und auf anti-HAV IgG Antikörper im EIA
untersucht (siehe Tab. 10), wobei den inokulierten Mäusen bei der jeweiligen Sektion das
Blut entnommen wurde. Das Blut der nicht immunisierten Mäuse wurde vor der ersten und
nach der letzten Mock-Immunisierung im EIA getestet und war in allen Mäusen anti-HAV IgG
Antikörper negativ, daher wurden diese Mäuse in der Tabelle 10 nicht gesondert aufgeführt.
73
Tab. 10: Untersuchung des anti-HAV IgG Status mittels EIA aus dem Serum der immunisierten Mäuse
EIA Werte (OD) der Seren zum Zeitpunkt nach Beginn der Immunisierung Immunstatus anti-HAV IgG
Maus Nr. 0-Serum 1 Monat 3 Monate 6 Monate 19 0,417 0,369 0,054 0,014 ++ 20 0,438 0,373 0,091 0,021 ++ 21 0,461 0,397 0,421 0,178 + 22 0,449 0,271 0,155 0,075 ++ 23 0,396 0,451 0,153 0,044 ++ 24 0,427 0,185 0,051 0,068 ++ 25 0,456 0,397 0,082 0,037 ++ 26 0,477 0,404 0,089 ++ 27 0,378 0,399 0,121 + 28 0,408 0,244 0,061 ++ 29 0,457 0,317 0,038 ++ 30 0,441 0,188 + 31 0,421 0,389 +/- 32 0,350 0,117 + 33 0,376 0,161 + 34 0,534 0,369 +/- 35 0,406 0,221 +/- 36 0,418 0,309 +/-
Mittelwerte EIA (OD) 0,428 0,251 0,077 0,062
rote Schrift: OD bzw. OD-Mittelwerte der Tiere, die zum angegebenen Zeitpunkt infiziert und 4 Tage später sektioniert wurden +/- = geringer anti-HAV IgG Titer + = mittlerer anti-HAV IgG Titer ++ = hoher anti-HAV IgG Titer
Tabelle 10 zeigt die Entwicklung der anti-HAV IgG Antikörper mittels EIA gemessen. Der
berechnete cut-off Wert für diese Untersuchung ist 0,16. OD-Werte unterhalb dieses Wertes
sind als anti-HAV IgG positiv zu betrachten. Anhand der Mittelwerte der OD des EIA lässt
sich die Zunahme der anti-HAV IgG Antikörper über die Zeit verfolgen. So zeigt das Serum
vor der Immunisierung (0-Serum) im Mittel eine OD von 0,428; einen Monat nach der ersten
Impfung 0,309, 3 Monate nach Beginn der Immunisierung ist der OD-Wert 0,119 und
6 Monate nach Beginn der Immunisierung ist die OD im Mittel 0,062. Die Menge der anti-
HAV IgG Antikörper verhält sich antiproportional zur OD des EIA, d.h. das Immunglobulin G
im Serum der Mäuse nimmt über die Zeit nach der Immunisierung deutlich zu. Die Fähigkeit
des IgG, Hepatitis A-Viren zu neutralisieren wurde in Zellkultur überprüft. Dazu wurde HAV
mit Mausseren komplexiert, und mit den so hergestellten Immunkomplexen wurde eine
Infektion in FRhK-4 Zellen durchgeführt. Nach 7 Tagen zeigt sich eine Neutralisation des
HAV durch eine Verringerung der Viruslast im Vergleich zur Infektion mit nicht
neutralisiertem HAV. In Abb. 19 ist das Ergebnis exemplarisch für zwei Seren (Maus Nr. 22
und Nr. 24) gezeigt. Die Komplexbildung mit den Seren zum Zeitpunkt 0, d.h. am Tag der
Impfung führte nicht zur Neutralisation des Virus. Die Infektiösität des Virus ist durch diese
Seren nicht eingeschränkt. Das Ergebnis des EIA (siehe Tab 10) zeigt direkt nach Beginn
der Immunisierung (0-Serum) ebenfalls kein IgG im Serum. Eine Abnahme der Infektiösität
ist mit dem Serum der Abnahmezeitpunkten 1, 3 und 6 Monate nach Beginn der
74
Immunisierung zu beobachten. Dabei ist bei beiden Seren eine Korrelation der
Neutralisationsfähigkeit mit den zugehörigen OD-Werten des EIA zu beobachten.
Die Inokulation von HAV/IgA-Komplexen in immunisierten bzw. nicht immunisierten Mäusen
zu unterschiedlichen Zeitpunkten ergab die in Abb. 21 gezeigten HAV RNA Konzentrationen
in der Leber (siehe Abb. 21 A) sowie in Niere, Milz, Gekröse und Thymus (siehe Abb. 21 B).
Die HAV/IgA-Komplex Inokulation einen Monat nach Beginn der Immunisierung, zeigt in der
Leber der nicht immunisierten Mäuse etwas höhere HAV RNA Konzentrationen als in den
immunisierten Mäusen, der Unterschied ist jedoch nicht signifikant. Die anti-HAV IgG
Antikörper Antwort zu diesem Zeitpunkt ist noch sehr gering, so dass kein signifikanter
Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren zu erwarten ist.
Anhand der OD des EIA zeigt sich, dass nach 3 Monaten ein sehr guter anti-HAV IgG
Antikörper Titer aufgebaut ist. Die Menge an anti-HAV IgG nimmt sechs Monate nach Beginn
der Immunisierung nur noch gering zu (OD 0,119 auf OD 0,062). In der Leber werden zu
diesen Zeitpunkten deutlich unterschiedliche HAV Mengen gemessen. Drei Monate nach
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
HAV
HAV/IgG
HAV/M22
0 M
o.
HAV/M22
1 M
o.
HAV/M22
3 M
o.
HAV/M22
6 M
o.
HAV/M24
0 M
o.
HAV/M24
1 M
o.
HAV/M24
3 M
o.
HAV/M24
6 M
o.
Inokula
HA
V R
NA
IU
/µg
tota
l RN
A
Abb. 20: HAV Neutralisation in FRhK-4 Zellen 7 Tage nach Infektion mit HAV, HAV/anti-HAV IgG sowie Immunkomplexen aus Serum der Mäuse Nr. 22 und Nr. 24 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung (0, 1, 3 und 6 Monate). Die Infektion mit HAV, welches mit dem Serum 1 Monat nach Erstimpfung komplexiert wurde (HAV/M22 1 Mo. Und HAV/M24 1 Mo.) zeigt bereits eine deutliche Reduktion der HAV RNA Konzentration im Vergleich zu den Komplexen des Serums zum Zeitpunkt 0. Die Komplexe der späteren Zeitpunkte zeigen eine verstärkte Reduktion bzw. Neutralisation des Virus, die mit den IgG Mengen korrelierend verläuft (ermittelt durch EIA, Tab. 10).
75
Beginn der Immunisierung (die Mäuse haben den zweiten Boost erhalten), zeigt sich ein
signifikanter Unterschied der HAV Menge in der Leber (p < 0,08). Die Viruslast in der Leber
der immunisierten Mäuse ist deutlich höher als in denen der nicht immunisierten Tiere. Bei
Inokulation der HAV/IgA-Komplexe sechs Monate nach Immunisierungsbeginn zeigt sich
kein signifikanter Unterschied in der Leber der immunisierten und nicht immunisierten
Mäuse. D.h. die Viruslast in der Leber der immunisierten Tiere nimmt bei nahezu
gleichbleibendem anti-HAV IgG Antikörpertiter deutlich ab, so dass nach 6 Monaten der
signifikante Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren
verschwunden ist. Die Betrachtung der anderen Organe (Niere, Milz, Gekröse und Thymus)
zeigt deutlich mehr Virus in den Geweben Gekröse und Thymus als in Niere und Milz. Dies
jedoch unabhängig davon, ob die Tiere immunisiert oder nicht immunisiert wurden und auch
unabhängig von der Reifung der Immunantwort. Die Analyse der (-) Strang RNA Menge
(Daten nicht gezeigt) ergab in keinem Gewebe signifikante Unterschiede und lies keine
Korrelation zur Menge der anti-HAV IgG Antikörper zu.
A B
Abb. 21: Vergleich der HAV RNA Konzentration in der Leber (A) von immunisierten und nicht immunisierten Mäuse nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen, sowie der Verteilung der Konzentrationsverteilung der HAV RNA in den Organen (B) zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung dargestellt im Boxplot Diagramm. Während die HAV RNA Konzentration in den nicht immunisierten Mäusen über die Zeit relativ konstant bleibt, ist sie in den immunisierten Mäusen 3 Monate nach Beginn der Immunisierung deutlich höher als einen Monat nach Beginn. 6 Monate nach Beginn der Immunisierung ist die HAV RNA Konzentration aber wieder deutlich geringer (A). Die Verteilung der HAV RNA Konzentration in den anderen Organen (B) zeigt keinen wesentlichen Unterschied zwischen den immunisierten und nicht immunisierten Tieren, auch im Zeitverlauf sind keine unterschiede auszumachen. °= Extremwerte; *= Ausreißer
76
Die Ergebnisse zeigen, dass die Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe generell
vergleichbar ist mit der durch unkomplexiertes HAV. In älteren Mäusen erreichen HAV/IgA-
Komplexe die Leber sogar in höherer Konzentration als durch HAV, wobei die HAV RNA
Konzentrationen in diesen Tieren nach HAV/IgA Inokulation in allen Organen höher ist als in
den jüngeren Mäusen. In in vitro Versuchen konnte gezeigt werden, dass monoklonale IgG
Antikörper die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe inhibieren. Auch in vivo wird durch
Immunisierung der Mäuse, vermutlich durch die dabei entwickelten neutralisierenden IgG
Antikörper, die bessere Erreichbarkeit der Leber durch HAV/IgA-Komplexe inhibiert. Im
Zeitverlauf zeigt sich in immunisierten Mäusen zunächst ein Anstieg der HAV RNA
Konzentration, der nach vollständiger Ausbildung der Immunantwort jedoch wieder reduziert
wird, d.h 6 Monate nach Beginn der Immunisierung wird die Infektiösität der HAV/IgA-
Komplexe neutralisiert.
77
4. DISKUSSION
Der Replikationsort der meisten Viren befindet sich direkt auf ihrem Infektionsweg. So
gelangen beispielsweise Polioviren, die wie HAV fäkal-oral übertragen werden, nach der
oralen Aufnahme in den Magen-Darm-Trakt, wo sie in Zellen des Intestinaltraktes vermehrt
werden. Die am Replikationsort produzierten Virionen werden über den Stuhl ausgeschieden
und schließen so den Infektionskreislauf. Der Replikationsort innerhalb des natürlichen
Infektionsweges hat für das Virus naheliegende Vorteile und garantiert die ausreichende
Anzahl neuproduzierter Virionen für die Transmission. Das Hepatitis A-Virus repliziert
entgegen seinem Infektionsweg nicht im Intestinaltrakt sondern gelangt nachdem es oral
aufgenommen wurde über den Magen in den Darm und von dort über den Blutweg in die
Leber, wo die Replikation in den Hepatozyten stattfindet. Über die Gallenflüssigkeit gelangen
die Virionen zurück in den Intestinaltrakt und werden mit dem Stuhl ausgeschieden. Warum
das Virus den Umweg über die Leber macht und wie es dorthin gelangt ist bisher unklar.
Diskutiert wird ein unterstützender Immunglobulin A-vermittelter Transport des Virus. Die
Leber hat unter anderem die Aufgabe IgA und IgA-Komplexe aus dem Organismus zu
eleminieren(13). IgA bindet spezifisch an TIM-1, welches vermutlich eine wichtige Rolle in der
zellulären Rezeptorbindung des Hepatitis A-Virus spielt(125). Der ASGPR
(Asialoglykoproteinrezeptor) wird ausschließlich von Hepatozyten expremiert und erlaubt
HAV in Form von HAV/IgA-Komplexen die Infektion der Zellen(118,35). Die Untersuchung, ob
das Hepatitis A-Virus tatsächlich mittels eines IgA Carriermechanismus zur Leber gelangt,
wie aufgrund der Zellkulturexperimente postuliert, war Ziel dieser Arbeit.
4.1 Entwicklung des quantitativen real-time RT-PCR Systems
Voraussetzung zur Untersuchung des Transportmechanismus des Hepatitis A-Virus ist die
Möglichkeit sehr geringe Virusmengen zu detektieren und auch zu quantifizieren. Die
erreichbare Sensitivität ist zum einen abhängig von der eingesetzten Nachweismethode,
zum anderen von der Abstimmung sowohl der Probengewinnung als auch Isolation und
Detektion. Zur Quantifizierung des Hepatitis A-Virus in den Geweben der Mäuse wurde ein
RT-PCR System entwickelt, welches in der Lage ist HAV der Genotypen I, II, III und VII
nachzuweisen. Die PCR gehört derzeit zu den Methoden, mit denen die größtmögliche
Sensitivität des Nachweises einer spezifischen Targetsequenz erreicht werden kann. Da mit
konventioneller PCR, d.h. mit Durchführung einer Endpunktanalyse eine Quantifizierung des
Targets nicht möglich ist, wurde ein real-time RT-PCR System entwickelt. Bei der real-time
PCR findet die Detektion des Targets während jedes einzelnen PCR Zykluses statt. Die
78
dabei entstehende Fluoreszenz verhält sich in der exponentiellen Phase der PCR
proportional zur Menge des Targets. Das entwickelte System wird mit vier
Quantifizierungsstandards verwendet, mit deren Hilfe eine Standardreihe erstellt und daran
die HAV Menge in den Mausgeweben bestimmt wird. Das Sensitivitätslimit des Systems ist
mit 0,13 IU/µl ausreichend um HAV in den Geweben der Mäuse, die mit 108 internationalen
Einheiten HAV inokkuliert wurden, nachzuweisen und ist mit anderen HAV PCR Assays(110)
vergleichbar. Die hohe Präzision des real-time HAV RT-PCR Systems stellt die
Vergleichbarkeit der Ergebnisse sicher, welche für die Untersuchung des Hepatitis A-Virus in
den verschiedenen Geweben unerlässlich ist. Das real-time HAV RT-PCR System wird
mittlerweile kommerziell vertrieben und konnte seine hervoragende Performance schon
mehrfach in verschiedenen Diagnostiklaboren unter Beweis stellen.
4.2 Entwicklung des strangspezifischen RNA Nachweis es
Mit Hilfe des real-time RT-PCR Systems kann das Hepatitis A-Virus in Gewebe identifiziert
und die Virusmenge quantifiziert werden. Um Aussagen über die Replikation in diesen
Geweben treffen zu können, muss auf das Vorhandensein von HAV (-) Strang untersucht
werden. Das (-) Strang Intermediat ist ein eindeutiger Indikator für die HAV Replikation und
wird daher häufig als Replikationsmarker genutzt. Für den Nachweis erschwerend ist, dass
nur eine geringe Menge (-) Strang RNA aber zeitgleich eine hohe Menge (+) Strang RNA
vorhanden ist. Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten zur strangspezifischen Nukleinsäure
Detektion. Die publizierten Protokolle reichen von einfachen Hybridisierungs-
assays(4,18,30,115,112) bis zu NASBA und PCR basierenden Assays(91,71,17). Allerdings konnte
sich bisher keine der Techniken dauerhaft durchsetzen. Während für viele Anwendungen die
Sensitivität der Hybridisierungsassays nicht ausreichend ist, sind die auf Amplifikation
basierenden Assays häufig zu unspezifisch. In dieser Arbeit wurde ein strangspezifisches
Nachweissystem entwickelt, welches die Spezifität der Hybridisierung durch ein Padlock
Probe ähnliches System mit der Sensitivität einer hyperbranched Rolling Circle Amplifikation
verknüpft. Padlock Probes sind lange Oligonukleotide, deren 3´ und 5´ Enden Bereiche
aufweisen, die in direkter Nachbarschaft an das Target binden und durch Ligation zu einem
Ring geschlossen werden(94). Die Hybridisierung an der Ligationsstelle erfordert exakte
Basenpaarungen, was zu hoher Spezifität der Padlock Probes führt(77,94,42,126,76,9). Eine der
häufigsten Anwendungen von Padlock Probes ist die Genotypisierung mittels SNP (Single
Nukleotid Polymorphismus) Analyse. Dabei liegt der SNP im Hybridisierungsbereich und
verhindert die Zirkularisierung der Padlock Probe(124,38,99). Im Gegensatz zur klassischen
Padlock Probe wurde der Ringschluss in dem hier beschriebenen System durch
Hybridisierung der jeweiligen 3´ und 5´Enden zweier kurzer Oligonukleotide an die
79
Zielsequenz und an ein drittes Oligonukleotid erreicht. Die Amplifikation der geschlossenen
Padlock Probe führt zur eigentlichen Detektion. Nilson et al., 2002 beschreiben den Einsatz
einer modifizierten molekularen Beacon Sonde zur real-time Messung während der Rolling
Circle Amplifikation (RCA)(93). Der Einsatz anderer fluoreszenzmarkierter Sondenformate,
wobei in diesem strangspezifischen Nachweissystem die Detektion durch eine Taqman®
Sonde erfolgt, ist ebenfalls möglich(136). Die lineare Amplifikation während der RCA erlaubt
eine genaue Bestimmung der geschlossenen Padlock Probes und damit des
Targetmaterials(93). Wie Abb. 5 zeigt, hat neben der Wahl der Detektionsmethode die
Abstimmung der einzelnen Komponenten enormen Einfluss auf Sensitivität, Spezifität und
Robustheit des Nachweissystems. Während das ursprüngliche Protokoll der RCA nur sehr
schlechte Fluoreszenzsignale und eine geringe Sensitivität zeigt wird nach Titration und
Optimierung der Komponenten eine 10.000fach höhere Sensitivität erreicht. Besonderes
Augenmerk ist dabei auf die Qualität und das Design der Padlock Probe, sowie des
zugehörigen Primersystems zu legen. Sie beeinflussen eine häufig vorkommende Target
unabhängige, unspezifische Amplifikation, wie sie auch in Abb. 5B und 6 ersichtlich ist(99,38).
Neben dem Design kommt es dabei auch auf die Konzentration der Padlock Probe an, so
führt ein Überschuss unzirkularisierte Padlock Probes im Reaktionsansatz zu unspezifischer
Amplifikation(38). Wie es zu dieser unspezifischen Amplifikation kommt ist bisher nicht geklärt.
Die Sequenzierung unspezifischer Amplifikate (siehe 3.2.2.1) zeigt, dass in diesem Fall der
an das Target hybridisierende Bereich der Oligonukleotide nicht amplifiziert wurde. Es wäre
denkbar, dass die Oligonukleotide ohne bzw. bei sehr geringer Targetmenge ringförmige
Sekundärstrukturen ausbilden, die eine Amplifikation ermöglichen. In dieser Arbeit wurde
dieses Problem durch Design verschiedener Padlock Probes, sowie durch Austesten
verschiedener Padlock Probe basierender Oligonukleotidsysteme und Veränderung der
Sondenbindungsstelle gelöst. Durch Änderung der Sonde wurde die Detektion der
unspezifischen Signale, nicht jedoch die Amplifikation an sich verhindert. Alsmadi et al., 2003
lösten dieses Problem durch Einbau einer Hairpin Sequenz am 3´Ende der Padlock Probe,
so dass durch self-priming des Hairpins unligierte Padlock Probes für die Amplifikation nicht
mehr zur Verfügung stehen(2). Die Ligationseffizienz eines DNA/RNA Hybrids, d.h. das
Schließen einer DNA Padlock Probe die an eine RNA Zielsequenz hybridisiert, ist geringer
als bei DNA/DNA Hybriden und erfordert besondere Ligationsbedingungen. Durch Einsatz
von Padlock Probes aus Ribonukleinsäure lässt sich die Effizienz der Ligationsreaktion
deutlich verbessern(16,37,63,92). Durch Einsatz einer DNA/RNA Chimäre konnte die Sensitivität
des stransspezifischen Nachweissystems bei RNA als Targetmaterial gesteigert werden. In
dieser Arbeit wurde ein strangspezifischer RNA Nachweis, basierend auf dem 3-
Oligosystem, entwickelt, der quantitiativ, hochspezifisch und sensitiv ist. Die mit dem real-
time HAV RT-PCR System quantifizierten HAV Mengen in den Geweben der Mäuse sind
80
jedoch geringer als das Sensitivitätslimit des (-) Strang Nachweises, so dass die Sensitivität
des strangspezifischen RCA Systems nicht ausreicht, um eine Replikation in den Geweben
nachzuweisen. Um dennoch einen (-) Strang Nachweis mit höherer Sensitivität zu
ermöglichen, wurde ungeachtet der bekannten Spezifitätproblematik eine strangspezifische
PCR entwickelt.
Aufgrund verschiedenster Nebenreaktionen, wie z.B. Selfpriming durch Sekundärstrukturen,
unspezifischer Primerbindung oder aber auch keiner bzw. nicht vollständiger Inaktivierung
der Reversen Transkriptase kommt es bei strangspezfischen PCRs immer wieder zu falsch
positiven Ergebnissen(72,135,75). Trotz unterschiedlichster Ansätze zur Minimierung der falsch
positiven Signale, ist eine vollständige Verhinderung bisher nicht gelungen(71,86,27). Durch
Untersuchung der Spezifität des in dieser Arbeit validierten (-) Strang RNA Box-PCR
Systems wurde ein Konzentrationsbereich definiert, indem eine eindeutige Aussage sowohl
über das Vorhandensein als auch der Konzentration an (-) Strang RNA möglich ist. Bis zu
einer HAV RNA Konzentration von 2,7 x 104 IU/µl ist der (-) Strang RNA Nachweis hoch
spezifisch. Erst wenn höhere HAV Konzentrationen detektiert werden, ist eine eindeutige
Aussage, ob es sich um (-) Strang RNA handelt nicht mehr möglich. Die Quantifizierung des
(-) Stranges wird durch Anwesenheit von mehr als 10.000 IU/µl (+) Strang RNA beeinflusst,
sofern weniger als 40 IU/µl (-) Strang RNA in der Probe enthalten sind. D.h. in dem
strangspezifischen Box-PCR System konnte die falsch positive Detektion nicht vollständig
verhindert werden, es konnte aber ein Bereich identifiziert werden, indem eindeutige
Aussagen möglich sind. Die Eignung des (-) Strang Box-PCR Systems wurde anhand einer
HAV Replikationskinetik in Zellkultur unter Beweis gestellt. Schmitz et al., 1998 stellten in
HAV infizierten FRhK-4 Zellen 8 – 36 h p. i. einen starken Anstieg, bis 6 Tage p. i ein
konstantes Level und 6 - 8 Tage p. i. einen erneuten leichten Anstieg an HAV (-) Strang RNA
fest(112). Abb. 10 zeigt, dass die Ergebnisse der BOX-PCR mit denen von Schmitz et al.,
1998 korrelieren. Nach 6 – 30 h. p. i konnte eine starke Zunahme detektiert werden, wobei
die (-) Strang Menge bis zu 12 Tage p. i. relativ konstant blieb. Die Korrelation unserer mit
den Ergebnissen anderer HAV Replikationskinetiken(17,112) bestätigt, dass die real-time Box-
PCR zur Identifizierung des HAV Replikationsintermediates geeignet ist. Die hohe
Sensitivität des Assays von 0,44 IU/µl erlaubt die Quantifizierung von (-) Strang RNA in den
Gewebeproben.
81
4.3 Verteilung des Hepatitis A-Virus im Mausmodell
Das natürliche Wirtsspektrum des Hepatitis A-Virus ist auf Menschen und einige andere
Primatenarten (Schimpansen, Krallen- und Nachtaffen) begrenzt. In den 80er Jahren wurden
eine Reihe von Untersuchungen zur Verteilung des HAV im Organismus an experimentell
infizierten Krallenaffen durchgeführt(82,83,21,100,66,97). So konnten Mathiesen et al., 1978 bei
Krallenaffen nach intravenöser Infektion zusätzlich zur Leber bei einigen Tieren Virus in Milz,
Niere und den abdominalen Lymphknoten nachweisen, wobei Dünndarm und Colon
transversum HAV frei waren(82). Nach oraler Infektion von Krallenaffen konnte die gleiche
Gruppe 1980 HAV in Leber, Dünndarm und Galle, jedoch nicht in der Milz und dem Gekröse
der Tiere zeigen(83).
Tab.11 Recovery rate der viralen RNA in den Organen nach i.p. Infektion von Mäusen zweier Altersgruppen mit HAV, HAV/IgA- und HAV/IgG- Komplexen
Alter Inokula Leber Milz Niere Thymus Gekröse recovery rate
HAV/IgG 0,27 % 0,92 % 0,13 % 0,06 % 0,12 % 1,50 HAV/IgA 0,38 % 1,28 % 0,25 % 1,51 % 0,74 % 4,16
42 - 46 Tage
HAV 0,59 % 0,90 % 0,38 % 0,06 % 0,17 % 2,10 HAV/IgG 0,92 % 0,88 % 0,13 % 1,51 % 0,59 % 4,03 HAV/IgA 2,31 % 2,42 % 0,18 % 3,44 % 1,02 % 9,40
63 - 84 Tage
HAV 1,16 % 0,45 % 0,67 % 0,94 % 0,73 % 3,96
Pinto et al., 2002 konnte ebenfalls bei oral infizierten Krallenaffen Hepatitis A-Virus in Leber
und Galle jedoch nicht im Zwölffingerdarm nachweisen(100). Das in Milz und Gekröse kein
Virus nachgewiesen werden konnte bestätigt das Ergebnis von Mathiesen et al., 1980(83).
Diese Studien stellen zum Teil, vermutlich aufgrund der eingesetzten Nachweismethoden
und deren Sensitivitätsgrenzen, recht widersprüchliche Ergebnisse dar. Studienübergreifend
konnte in Primaten nach experimenteller Infektion in den Geweben Leber, Milz, Niere,
Gekröse, Dünndarm, Galle und den Tonsillen Hepatitis A-Virus nachgewiesen werden, über
die Virusmenge in den Organen ist dabei leider nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde die
Verteilung des Virus im Mausmodell untersucht. Es zeigte sich, dass in diesem
Modellorganismus das Virus in den gleichen Organen nachgewiesen werden konnte wie im
natürlichen Wirt. Obwohl eine hepatozytäre Zelllinie (NCTC) des hier verwendeten
Mausmodells nicht mit HAV infizierbar ist(35), konnte in dieser Arbeit bei intraperitoneal
infizierten Mäusen sowohl in der Milz als auch im Gekröse Hepatitis A-Virus RNA
nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde virale RNA in der Leber, der Niere und dem
Thymus der Tiere detektiert. Der natürliche Infektionsweg des Virus, d.h. die orale Aufnahme
ist mit diesem Modellorganismus jedoch nicht möglich. Das Virus gelangt nach oraler
82
Applikation vom Magen in den Darm. Es wäre denkbar, dass der Übergang vom Darm in den
Blutstrom im Mausmodell verhindert und das Virus daher direkt über den Darm
ausgeschieden wird, ohne die Leber und andere Organe zu erreichen. Nach intravenöser
und intraperitonealer Infektion, bei denen der Übergang aus dem Darm ins Blut entfällt,
konnte in den Mäusen in den oben genannten Organen HAV RNA nachgewiesen werden.
Die recovery rate in den Organen der nach intraperitonealer Inokulation detektierten HAV
RNA Mengen aus dem Ergebnis, das in Abb. 16 dargestellt ist, ist in Tab. 11 nochmals
zusammengefasst. Die höchsten HAV RNA Menge in diesem Mausmodell befinden sich in
den lymphatischen Organen Milz und Thymus sowie im Targetorgan des Hepatitis A-Virus,
der Leber. Die blutreinigende Funktion der Milz, d.h. der Abbau von Blutzellen die mit
Antikörpern beladen sind, von Immunkomplexen und anderen im Blut befindlichen Partikeln,
erklärt die hohe Virusmenge in diesem Organ. Im Blut selbst konnte in den meisten Fällen
kein bzw. nur sehr wenig Virus im Mausmodell nachgewiesen werden. Wohingegen bei HAV
Infektion im Menschen eine mehrwöchige Virämie mit Titern um von 104 - 105 HAV IE/ml Blut
auftritt(11). Der prozentuale Anteil in Niere und Gekröse ist wesentlich geringer als der in
Leber, Milz und Thymus. In beiden Altersgruppen filtert die Niere ungebundenes HAV in
deutlich höherem Anteil aus dem Blut heraus als in Immunkomplexe gebundenes Virus. Die
recovery rate aller getesteten Organe aus Abb. 16 ist nach Inokulation mit HAV und
HAV/IgG- Komplexen bei den jungen Mäusen 1,5 - 2,1% und bei den älteren Mäusen 3,96 –
4,03%. Nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen ist die recovery rate mit 4,16% bei den
jungen Mäusen und 9,4% bei den älteren Mäusen deutlich höher. Die insgesamt eher
geringe recovery rate ist zum einen abhängig von der unterschiedlichen Physiologie der
Individuen, zum anderen aber auch stark beeinflusst durch die Art der Applikation. Die
intravenöse Infektion sowie die orale Gabe wären aufgrund der besser kontrollierbaren
Applikation von Vorteil, jedoch war die intravenöse Gabe nicht durchführbar (siehe 3.3.1.1.)
und nach oraler Inokulation war keinerlei virale RNA in den Geweben der Mäuse
nachweisbar. Die Substanzaufnahme nach intraperitonealer Applikation erfolgt über den
Blutweg und erfüllt damit die für diese Arbeit insbesondere für die Untersuchung des IgA
vermittelten Carriermechanismus notwendigen Vorraussetzungen. Diese Applikationsart birgt
jedoch generell das Risiko der Fehlinjektion. So ist es bei einer Maus vorgekommen, dass
das Inokula versehentlich in die Blase appliziert und direkt sichtbar mit dem Harn
ausgeschieden wurde.
83
4.4 Replikation im Modellorganismus
Das (-) Strang Box-PCR System ermöglicht durch Nachweis des Replikationsintermediates
eindeutige Aussagen über die Replikation des Hepatitits A-Virus in den untersuchten
Geweben. Obwohl sich Mäuse generell nicht mit HAV infizieren lassen, konnte bei den
meisten Tieren eine sehr geringe virale Replikation in der Leber festgestellt werden. Dabei
zeigten die Tiere, die mit HAV/IgA-Komplexen inokuliert wurden, deutlich mehr produktive
Infektionen als die Tiere die mit unkomplexiertem HAV bzw. HAV/IgG-Komplexen inokuliert
wurden. Vorarbeiten im Zellkulturexperiment zeigten, dass hepatocytäre Mauszellen (NCTC-
Zellen) mit HAV/IgA-Komplexen produktiv infiziert werden können, nicht jedoch mit
unkomplexiertem HAV. Feigelstock et al., 2005 beschreiben, dass das Wachstum des HAV
in einer Mauszelllinie nach Transfektion mit viraler HAV RNA grundsätzlich möglich ist. Die
Infektion durch intakte Viruspartikel ist jedoch, vermutlich durch eine Blockierung des
Viruseintritts in die Zellen, inhibiert. Diese Blockierung lässt sich durch veränderte
Wachstumsbedingungen der Mauszellen aufheben(39), was einen Rückschluss auf die
individuelle Physiologie der Tiere und ihre Empfänglichkeit für die HAV Infektion zulässt.
Im Gegensatz zu den bisherigen Befunden in der Literatur konnte in dieser Arbeit gezeigt
werden, dass sich im Mausmodell nach intraperitonealer Inokulation auch in
extrahepatischen Geweben (-) Strang RNA befindet. In der Milz und auch in Gekröse und
Thymus konnte (-) Strang nachgewiesen werden, wobei im Gekröse deutlich höhere (-)
Strang RNA Konzentrationen auftraten als in Milz und Thymus. Die (-) Strang RNA im
Gekröse, dem Lymphgewebe des Darms, zeigt die Replikation des Hepatitis A-Virus im
Darmbereich des hier verwendeten Mausmodells. Obwohl die Replikation des HAV im Darm
immer wieder diskutiert wird, konnte sie jedoch bisher beim Menschen nicht nachgewiesen
werden(119,83,82). Der Vergleich zwischen den älteren und den jüngeren Versuchstieren zeigt
dabei generell deutlich mehr Replikationsintermediat in den älteren Tieren. Eine Korrelation
zu der schwereren Symptomatik nach einer HAV Infektion bei älteren Menschen wäre
denkbar. Da der hier verwendete (-) Strang Nachweis deutlich sensitiver ist als die bisher in
der Literatur verwendeten Techniken, wäre eine Übertragung der Ergebnisse durchaus
vorstellbar. Im Gegensatz zur natürlichen Infektion beim Menschen ist eine orale Inokulation
der Mäuse nicht möglich. Desweiteren liess sich, eventuell aufgrund der nur sehr geringen
viralen Replikation, in den Mäusen keine Virämie, wie sie bei natürlicher Infektion auftritt,
nachweisen. Ob es sich bei den Befunden um Artefakte aufgrund des verwendeten
Mausmodells und der Inokulationsart oder um auf eine natürliche Infektion übertragbare
Ergebnisse handelt, muss im Weiteren noch geklärt werden.
84
4.5 IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber
Die ubiquitäre Expression des für HAV diskutierten Rezeptors TIM-1 und die Tatsache, dass
das Virus in Zellkultur in einer Reihe von nicht hepatischen Zellen repliziert, wohingegen dies
in vivo offensichtlich nicht möglich ist(8,43,61,40,34,119), erlaubt die Hypothese eines
zielgerichteten Carriermechanismus des Virus zur Leber. Durch die Aufnahme über den
Gastrointestinaltrakt treten die Immunzellen des Darm-assoziierten Lymphgewebes (GALT),
wie die Peyerschen Plaques, als erstes mit dem infektiösen Agens in Kontakt.
Sekretorisches, virusspezifisches IgA tritt im intestinalen Lumen direkt nach der Infektion auf
und liegt häufig im Komplex mit HAV vor(120,13). Purcell et al., 1984 konnten in einer Studie
anhand von Infektionsversuchen mit Krallenaffen zeigen, dass die Infektiösität des Hepatitis
A-Virus von der Art des Probenmaterials abhängig ist. So war aus Stuhlproben isoliertes
Virus 100.000fach infektiöser als aus Serumproben gewonnenenes Virus. Dieses wiederum
war 10.000fach infektiöser als aus Speichelproben isoliertes Virus(105). Ob es sich dabei um
freies oder komplexiertes Virus handelt ist nicht bekannt. Es besteht jedoch ein
Zusammenhang zwischen der Art des Probenmaterials und der Immunglobulin Neutralisation
des Virus, z.B. ist im Stuhl befindliches Virus stärker mit Antikörpern komplexiert als Virus
aus Serum oder Plasma. Sodass ein Zusammenhang zwischen Infektiösität des Virus und
Immunglobulin Komplexierung denkbar wäre. Dotzauer et al., 2000 konnten zeigen, dass die
Stabilität von HAV/IgA-Komplexen ausreicht um nach oraler Aufnahme die Magenpassage
als Komplex zu überstehen(35). Da im Stuhl deutlich mehr HAV mit IgA komplexiert vorliegt
als in Serum und Speichel, wäre die heterogene Infektiösität des Virus durch einen IgA
vermittelten Carriermechanismus erklärbar.
Das Ergebnis der ersten beiden Versuchsreihen zum IgA vermittelten Carriermechanismus
(Abb. 12 und 14) zeigte in Abhängigkeit von den Versuchstieren inhomogene Ergebnisse.
Während mit den ersten Versuchstieren ein IgA vermitteltes Targeting von HAV zur Leber
bestimmt werden konnte (Abb. 12A), gelangte bei Wiederholung des Versuchs weniger Virus
nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen zur Leber als nach Inokulation mit freiem HAV
(Abb. 12C). Sowohl die erste als auch die zweite Versuchsreihe wurde mit Tieren im Alter
von 42 - 46 Tagen vorgenommen. Trotz des ähnlichen Alters schienen die Tiere der beiden
Gruppen subjektiv in Größe und Gewicht stark von einander abzuweichen. Leider wurde das
Gewicht der Tiere nicht bestimmt, so dass keine objektiv vergleichbaren Daten vorliegen.
Generalisiert über beide Versuchsreihen zeigte sich nach Inokulation mit HAV und HAV/IgA-
Komplexen ein wesentlich anderes Bild als nach Inokulation mit der HAV/Antikörperkomplex
Kontrolle HAV/IgG. Die Streuung der HAV RNA Konzentration in der Leber nach Inokulation
von unkomplexiertem HAV entsprach in etwa der nach Inokulation von HAV/IgA-Komplexen.
85
Generalisiert über alle Individuen dieser Altersgruppe erreicht das Virus die Leber durch
HAV/IgA in Abhängigkeit von den physiologischen Bedingungen in den gleichen
Konzentrationen wie durch unkomplexiertes HAV. Der Vergleich des Carriermechanismus in
Mäusen unterschiedlichen Alters bestätigt den Verdacht, dass das IgA vermittelte Targeting
von HAV zur Leber altersabhängig ist. Bei den älteren Mäusen (63 – 84 Tage) konnte neben
einer generell höheren recovery rate (Abb. 15) ein Targeting durch HAV/IgA-Komplexe
gezeigt werden, d.h. nach HAV/IgA Inokulation ist signifikant mehr Virus in der Leber
angekommen als nach Inokulation von HAV/IgG und freiem HAV, wohingegen dies in den
jüngeren Mäusen nicht der Fall war (Abb. 17). Tami et al., 2007 zeigten, dass IgA ein
natürlicher Ligand des ubiquitär expremierten TIM-1 Rezepors ist, und dass die IgA-
Assoziation einen synergistischen Effekt auf die Virus-Rezeptor-Interaktion hat(125). Die
Bindung der HAV/IgA-Komplexe an den Rezeptor könnte die generell (d.h. in allen
Geweben) höhere recovery rate der HAV/IgA-Komplexe erklären, wirft aber gleichzeitig die
Frage auf, ob es sich bei dem IgA Carriermechanismus um eine generell bessere HAV/IgA
Bindung im Organismus oder um einen zielgerichteten Transport zur Leber handelt. Es wäre
möglich, dass die Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit TIM-1 zu einer verbesserten,
längeren und gehäuften Bindung an die Zelloberfläche führt und dadurch die Interaktion der
HAV/IgA-Immunkomplexe mit dem Asialoglykoproteinrezeptor und die damit verbundene
Infektion der Leber unterstützt.
In Abb. 22 ist eine Zusammenfassung der Untersuchungen an erwachsenen Mäusen
dargestellt. Gegenübergestellt ist die HAV RNA Konzentration sowie die (-) Strang RNA
Konzentration in der Leber von je vier mit HAV und HAV/IgA-Komplexen inokulierten Mäusen
aus den Versuchsreihen 3.3.2.3 und 3.3.3.2. In beiden Versuchsreihen (Abb. 22 A) ist in der
Leber nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen signifikant mehr Virus nachweisbar als nach
Inokulation mit HAV, d.h. das Virus, welches mit IgA komplexiert und neutralisiert ist, erreicht
die Leber besser als frei vorliegendes Virus. Tendenziell wurde nach Inokulation von
HAV/IgA-Komplexen auch mehr (-) Strang HAV RNA in der Leber gefunden als nach
Inokulation von HAV, jedoch ist aufgrund der geringen Datenmenge eine sicherere Aussage
in Bezug auf die (-) Strang RNA nicht möglich.
Dotzauer et al. 2005 konnte zeigen, dass HAV/IgA-Komplexe mittels Transcytose von
Epithelzellen aus dem Darmlumen in die Blutbahn gelangen können(33). In dieser Arbeit
wurde gezeigt, dass HAV mit IgA komplexiert im Mausmodell bevorzugt oder zumindest mit
gleicher Effizienz wie unkomplexiertes HAV zur Leber gelangt. Die bessere Erreichbarkeit
durch HAV/IgA-Komplexe im Vergleich zu freiem HAV beschränkt sich nicht nur auf die
Leber. Nach Inokulation von HAV Immunkomplexen zeigen auch andere Organe wie Niere,
86
Milz und Thymus höhere Virusmengen im Vergleich zur Inokulation mit freiem HAV. Unsere
Untersuchungen haben ergeben, dass dieser IgA Carriermechanismus altersabhängig ist,
was auf einen Einfluss des Immunsystems oder anderer altersabhängiger physiologischer
Parameter hindeutet.
Die Aufnahme der HAV/IgA-Komplexe in die Hepatozyten durch den
Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) wurde von Dotzauer et al., 2000 beschrieben. Die
Neutralisation des Virus mit IgA fördert die Infektion der Hepatozyten über den ASGPR,
verhindert jedoch gleichzeitig die Aufnahme in extrahepatische Gewebe, d.h. Zellen ohne
IgA Rezeptor. Es wäre denkbar, dass das Hepatitis A-Virus aufgrund der Komplexierung mit
IgA über den ubiquitär expremierten TIM-1 Rezeptor generell besser an den Organen bindet
und gegenüber freiem HAV dadurch bevorzugt ist. Eine gehäufte Bindung an der
Zelloberfläche könnte die Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit dem ASGPR der
Hepatozyten unterstützen. Die Aufnahme der Komplexe über den ASGPR erklärt den in vivo
Hepatotropismus des Virus(35). In der Leber neuproduzierte Virionen gelangen über die Galle
ins Darmlumen und werden dort in den Blutstrom abgegeben. Die Komplexierung des Virus
kann sowohl in der Submucosa durch sekretorisches IgA als auch im Blut durch Serum-IgA
Abb. 22: Vergleich der HAV RNA Konzentrationen (A) und (-) Strang RNA Konzentrationen (B) in der Leber von erwachsenen Mäusen nach Inokulation mit HAV und HAV IgA Komplexen. In den Boxplot Diagrammen aufgetragen sind zwei verschiedene Versuchsreihen (3.3.2.3. und 3.3.3.2). In beiden Reihen sind in der Leber nach Inokulation mit HAV/IgA deutlich höhere HAV RNA Konzentrationen nachweisbar als nach Inokulation von HAV, korrelierend dazu sind nach HAV/IgA Inokulation mehr Proben positiv für HAV (-) Strang als nach HAV Inokulation °= Extremwerte; *= Ausreißer
A B
87
erfolgen. Die Komplexierung im Darmlumen durch von der Galle sezerniertes IgA ist
ebenfalls möglich, diese HAV/IgA-Komplexe können mittels Transcytose aus dem Darm in
die Blutbahn gelangen und die Leber erreichen. Im Verlauf der Infektion, d.h. mit Reifung der
Immunantwort, steigt die Avidität der Antikörper, sodass im Laufe der Infektion eine
Unterbrechung dieses enterohepatischen Kreislaufs durch hochavides IgG denkbar und eine
Erklärung für sehr lange protrahierende und relapsierende Krankheitsverläufe wäre. D.h. der
Effekt des IgA würde durch die gesteigerte Avidität des IgG verringert, die IgA vermittelte
Bindung des Virus an die Zellen würde vermindert und das Virus könnte entgültig eliminiert
werden.
4.6 Abhängigkeit des anti-HAV IgA Carriermechanismu s von dem
Reifungsgrad der Immunantwort
Die in 3.3.2.3 dargestellten Ergebnisse zeigen den Einfluss des Alters der Versuchstiere auf
das IgA vermittelte Targeting des Virus zur Leber; d.h. bei Mäusen im Alter von 63 - 84
Tagen ist ein Einfluss der IgA-Komplexierung vorhanden, die Leber wird durch HAV/IgA-
Komplexe deutlich besser erreicht als mit freiem HAV. Bei jüngeren Tieren ist dieser Einfluss
nicht bzw. nur deutlich geringer nachweisbar. Die Schwere der Symptomatik bei einer
Hepatitis A Infektion ist stark altersabhängig, so verlaufen bei Kindern unter 5 Jahren 80 -
95% der Infektionen inapparent, bei Erwachsenen nur 10 – 25%(54). Eine Übertragung von
Ergebnissen aus Tierexperimenten auf den Menschen ist generell problematisch. Dennoch
konnte eine Korrelation zwischen der Verteilung des Virus in den Organen des Mausmodells
mit den bisher bekannten Daten aus Primatenstudien gezeigt werden. Das Blutkreislauf- und
Immunsystem der Maus ist dem des Menschen in vielerlei Hinsicht ähnlich, daher wäre
denkbar, dass die altersabhängige Symptomatik mit dem IgA vermittelten
Carriermechanismus in Zusammenhang stehen könnte. Während der Reifung des
Immunsystems ist das vollständige Wirkpotential der IgA-Immunreaktion erst mit Erreichen
der Pubertät abgeschlossen. Es wäre denkbar, dass die Unterstützung durch IgA-
Komplexierung bei Kindern nicht stattfindet. Die Erreichbarkeit der Leber durch das Virus ist
dadurch schlechter als das bei Erwachsenen der Fall ist, wodurch die Infektion inapparent
bzw. mit nur milden Symptomen verläuft.
Zur Untersuchung, ob hochavides anti-HAV IgG die HAV/anti-HAV IgA-Immunkomplexe
neutralisieren und dadurch den enterohepatischen Kreislauf unterbrechen, wurden die
Mäuse mit HAV geimpft und entnommenes Serum auf anti-HAV IgG Antikörper untersucht.
Nach 6 Monaten wurden immunisierte und nicht immunisierte Mäuse mit HAV/IgA-
88
Komplexen sowie freiem HAV inokuliert. Die Mäuse wurden sektioniert und die Gewebe auf
HAV untersucht. Es stellte sich heraus, dass die bessere Erreichbarkeit durch die HAV/IgA-
Komplexe gegenüber freiem HAV in den nicht immunisierten Mäusen bei den immunisierten
Mäusen nicht vorhanden ist. D.h. das durch die Immunisierung gebildete anti-HAV IgG
bewirkt ein schlechteres Targeting der HAV/IgA-Komplexe. Dieser Einfluss könnte auf einem
Verdrängungs- bzw. Neutralisationsmechanismus des IgA in den Immunkomplexen durch
anti-HAV IgG Antikörper beruhen. Dieser Effekt wurde bei Mäusen mit bereits ausgereiftem
Immunsystem beobachtet. Der Einfluss der Immunsystemreifung, d.h. der Einfluss
steigender Avidität der anti-HAV IgG Antikörper, wurde durch Inokulation zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Immunisierung untersucht. Während die
nicht immunisierten Mäuse zu allen Zeitpunkten nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen in
etwa die gleiche HAV Menge in der Leber zeigen, variierte diese bei den immunisierten
Tieren deutlich. Einen Monat nach Beginn der Immunisierung war die HAV RNA Menge in
der Leber der immunisierten und der nicht immunisierten Mäuse in etwa gleich, wohingegen
nach drei Monaten die immunisierten Tiere mehr HAV RNA in der Leber zeigten als die nicht
immunisierten Tiere. D.h. trotz nachweislich (siehe Tab.10) erfolgter Immunantwort bzw.
gebildeter anti-HAV IgG Antikörper erreichten zu diesem Zeitpunkt mehr Virionen die Leber
als ohne neutralisierende IgG Antikörper. Eine Erklärung dafür liegt direkt in der
Immunisierung. Diese erfolgt mit infektiösem Hepatitis A-Virus, welches zum Zeitpunkt der
Sektion zusätzlich zu den HAV/IgA-Komplexen der Inokulation in den Tieren vorliegen
könnte. Zusätzlich kommt es durch die Immunisierung neben den IgG Antikörpern auch zur
Bildung von IgA, welches mit dem HAV der Immunisierung Komplexe bilden kann und so
den Transport zur Leber unterstützt. D.h. in den immunisierten Tieren könnte sich generell
mehr HAV befinden als in den nicht immunisierten Tieren, dabei ist weiterhin zu beachten,
dass die nach 3 Monaten untersuchten Tiere bereits zwei Impfungen, die nach 6 Monaten
untersuchten Tiere 3 Impfungen und die einen Monat nach Beginn der Immunisierung
untersuchten Tiere nur eine Impfung erhalten haben. In vitro konnte anhand von
monoklonalen Antikörpern gezeigt werden, dass die Infektiösität von HAV/IgA-Komplexen
durch anti-HAV IgG neutralisiert wird. In den Mäusen scheint 3 Monate nach Beginn der
Immunisierung die Avidität der anti-HAV IgG Antikörper jedoch noch nicht hoch genug, die
IgA Antikörper aus den HAV-Komplexen zu Verdrängen. Bei gleichbleibender IgG Menge
(siehe Tab. 10) scheint dies nach 6 Monaten jedoch der Fall zu sein. Die HAV Menge in den
immunisierten und nicht immunisierten Tieren in der Leber war nahezu gleich und das
obwohl aus den o.g. Gründen in den immunisierten Tieren mehr HAV zu erwarten gewesen
wäre. Es kann angenommen werden, dass 6 Monate nach Beginn der Immunisierung, also
nach vollständiger dreifach Impfung, die Avidität der IgG Antikörper so gestiegen ist, dass
das IgA aus den Immunkomplexen wirkungslos und das Virus durch IgG neutralisiert werden
89
kann. D.h. bei Infektion wird das Virus mit IgA komplexiert zur Leber transportiert, während
es dort repliziert wird und die Virionen die Leber verlassen, werden anti-HAV IgG Antikörper
gebildet. Die Virionen gelangen mit der Galle in den Darm, wo sie entweder direkt im Darm
oder aber nach Eintritt in die Blutbahn erneut mit IgA Antikörpern komplexiert werden
können. Die Avidität der IgG Antikörper ist zunächst nicht ausreichend um diese Komplexe
zu neutralisieren, so dass es erneut zur Infektion der Leber kommt. Diese protrahierten oder
relapsierenden Verläufe, d.h. der enterohepatische Zyklus, der zu frühen Zeitpunkten der
Infektion möglich ist, wird durch die Reifung der Immunantwort, durch Steigerung der Avidität
der IgG Antikörper unterbrochen. Wie im Experiment sicher gezeigt wurde, neutralisieren
hochavide IgG Antikörper die Infektiösität der HAV/IgA-Komplexe, so dass eine weitere
Infektion der Leber nicht mehr möglich ist.
90
5. ZUSAMMENFASSUNG
Der Replikationsort eines Virus befindet sich meist direkt innerhalb seines Infektionsweges.
Bei Viren die fäkal-oral übertragen werden findet die primäre Replikation häufig im
Intestinaltrakt statt. Die dort produzierten Virionen werden direkt mit dem Stuhl
ausgeschieden. Abweichend davon repliziert das Hepatitis A-Virus ausschließlich in der
Leber, d.h. nach der oralen Aufnahme muss das Virus vom Dünndarm zur Leber gelangen,
von wo es mit der Gallenflüssigkeit wieder zurück in den Intestinaltrakt gelangt.
Virusspezifisches Immunglobulin A tritt sehr früh nach der Infektion auf und liegt häufig im
Komplex mit HAV vor(120,13). In Zellkultur konnte gezeigt werden, das diese Immunkomplexe
mittels Transcytose vom Darmlumen in die Blutbahn gelangen können(33), von wo sie zur
Leber transportiert werden. In dieser Arbeit konnte im Modellorganismus gezeigt werden,
dass Immunglobulin A im Blut dabei als Carrier fungiert. Dabei gilt für das Mausmodell, dass
in der Leber nach i.p. Inokulation von HAV/IgA-Komplexen wesentlich höhere
Viruskonzentrationen nachweisbar sind als nach Inokulation von unkomplexiertem HAV, d.h.
bei gleicher Inokulationsmenge erreichen HAV/IgA-Komplexe die Leber deutlich besser als
nicht komplexiertes Hepatitis A-Virus. Dieser IgA vermittelte Carriermechanismus ist
altersabhängig. Bei Mäusen im Alter von 42 – 46 Tagen zeigt sich kein wesentlicher
Unterschied in Abhängigkeit vom Inokulum, wohingegen bei Mäusen im Alter von 63 - 84
Tagen eine Bevorzugung der HAV/IgA-Komplexe deutlich zum Tragen kommt. Diese
Altersabhängigkeit des Virustransports könnte mit der Schwere der Erkrankungen beim
Menschen korrelieren. Gerade bei Kindern verläuft die Hepatitis A Infektion häufig inapparent
oder zumindest symptomarm. Ein ineffektiver Transport des Virus zur Leber hat aufgrund der
Immunpathogenität der Erkrankung einen symptomarmen Verlauf zur Folge. Nach
Inokulation der Tiere mit HAV/IgA-Komplexen konnten im Vergleich zu HAV/IgG und HAV
nicht nur höhere Virusmengen in der Leber sondern auch in allen anderen untersuchten
Geweben nachgewiesen werden. IgA ist ein natürlicher Ligand des TIM-1 Rezeptors, der
ubiquitär exprimiert wird(125), wodurch es zu einer generellen Bevorzugung der HAV/IgA-
Komplexe kommen könnte. Die gehäufte Bindung der HAV/IgA-Komplexe an die
Zelloberfläche durch die Bindung an TIM-1 könnte, aufgrund der Häufung, zu einer
verbesserten Interaktion der HAV/IgA-Komplexe mit dem Asialoglykoproteinrezeptor
(ASGPR) führen. Der ausschließliche in vivo Hepatotropismus des Virus erklärt sich durch
die Aufnahme der Immunkomplexe über den ASGPR (Asialoglykoproteinrezeptor), der nur in
Hepatozyten exprimiert wird(118). Die in der Leber produzierten Virionen werden über die
Galle zum Darmlumen transportiert, und mit dem Stuhl ausgeschieden. Desweiteren können
die Virionen im Darmbereich erneut mit IgA-Molekülen komplexieren und mittels Transcytose
in das Blut und schließlich zur Leber gelangen. Dieser enterohepatische Kreislauf ist neben
91
dem akuten Verlauf ein Erklärungsmodel für relapsierende und protrahierte Hepatitis A
Verläufe. In vivo konnte nach Inokulation mit HAV/IgA-Komplexen durch Reifung der
Immunantwort eine Reduktion der HAV Menge in der Leber gezeigt werden. Eine
Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs durch die Steigerung der Avidität des anti-
HAV IgG im Verlauf der Infektion ist denkbar. Während der Reifung der Immunantwort steigt
die IgG Avidität, so dass dieses in der Lage ist Immunglobulin A aus den HAV/IgA-
Komplexen zu verdrängen und den Carriermechanismus aufzuheben, wodurch
schlussendlich das Virus vollständig aus dem Organismus eliminiert werden würde.
Die mit dem Modellorganismus Maus erhaltenen Befunde unterstützen somit die auf
Zellkulturdaten basierende Hypothese, wonach die Assoziation von Virionen mit HAV-
spezifischem IgA den Transport des Virus zur Leber unterstützt. Die Infektion der Leber
durch HAV/IgA-Immunkomplexe erfolgt dabei über den Asialoklykoproteinrezeptor.
Neuproduzierte Virionen gelangen über die Galle in den Darm, und können von dort durch
die Bildung von HAV/IgA-Komplexen trotz Anwesenheit neutralisierender IgG Antikörper im
Blut ihren Weg zurück zur Leber finden.
92
6. LITERATUR 1. Allaire, M., M. M. Chernaia, B. A. Malcolm, and M. N. James. 1994. Picornaviral 3C
cysteine proteinases have a fold similar to chymotrypsin-like serine proteinases. Nature 369:72-6.
2. Alsmadi, O. A., C. J. Bornarth, W. Song, M. Wisniew ski, J. Du, J. P. Brockman, A. F. Faruqi, S. Hosono, Z. Sun, Y. Du, X. Wu, M. Egholm, P. Abarzua, R. S. Lasken, and M. D. Driscoll. 2003. High accuracy genotyping directly from genomic DNA using a rolling circle amplification based assay. BMC Genomics 4:21.
3. Alter, M. J., and E. E. Mast. 1994. The epidemiology of viral hepatitis in the United States. Gastroenterol Clin North Am 23:437-55.
4. Anderson, D. A., B. C. Ross, and S. A. Locarnini. 1988. Restricted replication of hepatitis A virus in cell culture: encapsidation of viral RNA depletes the pool of RNA available for replication. J Virol 62:4201-6.
5. Angarano, G., F. Trotta, L. Monno, T. Santantonio, and G. Pastore. 1985. Serum IgA Anti-Hepatitis A Virus as Detected by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Diagnostic Significance in Patients with Acute and Protracted Hepatitis A. Diagn Micro Infect Dis 3:521-523.
6. Apaire-Marchais, V., B. H. Robertson, V. Aubineau-F erre, M. G. Le Roux, F. Leveque, L. Schwartzbrod, and S. Billaudel. 1995. Direct sequencing of hepatitis A virus strains isolated during an epidemic in France. Appl Environ Microbiol 61:3977-80.
7. Arita, M., H. Horie, M. Arita, and A. Nomoto. 1999. Interaction of poliovirus with its receptor affords a high level of infectivity to the virion in poliovirus infections mediated by the Fc receptor. J Virol 73:1066-74.
8. Ashida, M., and C. Hamada. 1997. Molecular cloning of the hepatitis A virus receptor from a simian cell line. J Gen Virol 78 ( Pt 7):1565-9.
9. Baner, J., M. Nilsson, M. Mendel-Hartvig, and U. La ndegren. 1998. Signal amplification of padlock probes by rolling circle replication. Nucleic Acids Res 26:5073-8.
10. Boggs, J. D., J. L. Melnick, M. E. Conrad, and B. F . Felsher. 1970. Viral hepatitis. Clinical and tissue culture studies. Jama 214:1041-6.
11. Bower, W. A., O. V. Nainan, X. Han, and H. S. Margo lis. 2000. Duration of viremia in hepatitis A virus infection. J Infect Dis 182:12-7.
12. Brack, K., W. Frings, A. Dotzauer, and A. Vallbrach t. 1998. A cytopathogenic, apoptosis-inducing variant of hepatitis A virus. J Virol 72:3370-6.
13. Brown, B. S. 1984. Viral hepatitis update: transmission and outcome. Dent Hyg (Chic). 58:277-80.
14. Brown, E. A., S. P. Day, R. W. Jansen, and S. M. Le mon. 1991. The 5' nontranslated region of hepatitis A virus RNA: secondary structure and elements required for translation in vitro. J Virol 65:5828-38.
15. Brown, E. A., A. J. Zajac, and S. M. Lemon. 1994. In vitro characterization of an internal ribosomal entry site (IRES) present within the 5' nontranslated region of hepatitis A virus RNA: comparison with the IRES of encephalomyocarditis virus. J Virol 68:1066-74.
16. Bullard, D. R., and R. P. Bowater. 2006. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J 398:135-44.
17. Chaves, R. L., J. Graff, A. Normann, and B. Flehmig . 1994. Specific detection of minus strand hepatitis A virus RNA by Tail-PCR following reverse transcription. Nucleic Acids Res 22:1919-20.
18. Cho, M. W., and E. Ehrenfeld. 1991. Rapid completion of the replication cycle of hepatitis A virus subsequent to reversal of guanidine inhibition. Virology 180:770-80.
19. Chudy, M., I. Budek, B. Keller-Stanislawski, K. A. McCaustland, S. Neidhold, B. H. Robertson, C. M. Nubling, R. Seitz, and J. Lower. 1999. A new cluster of hepatitis A infection in hemophiliacs traced to a contaminated plasma pool. J Med Virol 57:91-9.
20. Cockayne, E. A. 1912. Catarrhal jaundice, sporadic and epidemic, and its relation to acute yellow atrophy of the liver. Q J Med. 6:1–29.
21. Cohen, J. I., B. Rosenblum, S. M. Feinstone, J. Tic ehurst, and R. H. Purcell. 1989. Attenuation and cell culture adaptation of hepatitis A virus (HAV): a genetic analysis with HAV cDNA. J Virol 63:5364-70.
22. Cohen, J. I., J. R. Ticehurst, S. M. Feinstone, B. Rosenblum, and R. H. Purcell. 1987. Hepatitis A virus cDNA and its RNA transcripts are infectious in cell culture. J Virol 61:3035-9.
23. Coppola, N., D. Genovese, M. Pisaturo, S. Taffon, C . Argentini, G. Pasquale, C. Sagnelli, F. Piccinino, M. Rapicetta, and E. Sagnelli. 2007. Acute hepatitis with severe cholestasis
93
and prolonged clinical course due to hepatitis A virus Ia and Ib coinfection. Clin Infect Dis 44:73-7.
24. Costa-Mattioli, M., J. Cristina, H. Romero, R. Pere z-Bercof, D. Casane, R. Colina, L. Garcia, I. Vega, G. Glikman, V. Romanowsky, A. Cast ello, E. Nicand, M. Gassin, S. Billaudel, and V. Ferre. 2002. Molecular evolution of hepatitis A virus: a new classification based on the complete VP1 protein. J Virol 76:9516-25.
25. Costa-Mattioli, M., S. Monpoeho, C. Schvoerer, B. B esse, M. H. Aleman, S. Billaudel, J. Cristina, and V. Ferre. 2001. Genetic analysis of hepatitis A virus outbreak in France confirms the co-circulation of subgenotypes Ia, Ib and reveals a new genetic lineage. J Med Virol 65:233-40.
26. Coulepis, A. G., S. A. Locarnini, E. G. Westaway, G . A. Tannock, and I. D. Gust. 1982. Biophysical and biochemical characterization of hepatitis A virus. Intervirology 18:107-27.
27. Craggs, J. K., J. K. Ball, B. J. Thomson, W. L. Irv ing, and A. M. Grabowska. 2001. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods 94:111-20.
28. Cromeans, T., M. D. Sobsey, and H. A. Fields. 1987. Development of a plaque assay for a cytopathic, rapidly replicating isolate of hepatitis A virus. J Med Virol 22:45-56.
29. Cuthbert, J. A. 2001. Hepatitis A: old and new. Clin Microbiol Rev 14:38-58. 30. De Chastonay, J., and G. Siegl. 1987. Replicative events in hepatitis A virus-infected MRC-5
cells. Virology 157:268-75. 31. Dienstag, J. L. 1980. Hepatitis viruses: characterization and diagnostic techniques. Yale J
Biol Med 53:61-9. 32. Dienstag, J. L., I. D. Gust, C. R. Lucas, D. C. Won g, and R. H. Purcell. 1976. Mussel-
associated viral hepatitis, type A: serological confirmation. Lancet 1:561-3. 33. Dotzauer, A., M. Brenner, U. Gebhardt, and A. Vallb racht. 2005. IgA-coated particles of
Hepatitis A virus translocalized antivectorially from the apical to the basolateral site of polarized epithelial cells via the polymeric immunoglobulin receptor. J Gen Virol 86:2747-51.
34. Dotzauer, A., S. M. Feinstone, and G. Kaplan. 1994. Susceptibility of nonprimate cell lines to hepatitis A virus infection. J Virol 68:6064-8.
35. Dotzauer, A., U. Gebhardt, K. Bieback, U. Gottke, A . Kracke, J. Mages, S. M. Lemon, and A. Vallbracht. 2000. Hepatitis A virus-specific immunoglobulin A mediates infection of hepatocytes with hepatitis A virus via the asialoglycoprotein receptor. J Virol 74:10950-7.
36. Emerson, S. U., Y. K. Huang, and R. H. Purcell. 1993. 2B and 2C mutations are essential but mutations throughout the genome of HAV contribute to adaptation to cell culture. Virology 194:475-80.
37. Fareed, G. C., E. M. Wilt, and C. C. Richardson. 1971. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid. VIII Hybrids of ribo- and deoxyribonucleotide homopolymers as substrates for polynucleotide ligase of bacteriophage T4. J Biol Chem 246:925-932.
38. Faruqi, A. F., S. Hosono, M. D. Driscoll, F. B. Dea n, O. Alsmadi, R. Bandaru, G. Kumar, B. Grimwade, Q. Zong, Z. Sun, Y. Du, S. Kingsmore, T. Knott, and R. S. Lasken. 2001. High-throughput genotyping of single nucleotide polymorphisms with rolling circle amplification. BMC Genomics 2:4.
39. Feigelstock, D., P. Thompson, and G. Kaplan. 2005. Growth of Hepatitis A Virus in a Mouse Liver Cell Line. J Virol 79:2950-2955.
40. Feigelstock, D., P. Thompson, P. Mattoo, Y. Zhang, and G. G. Kaplan. 1998. The human homolog of HAVcr-1 codes for a hepatitis A virus cellular receptor. J Virol 72:6621-8.
41. Feinstone, S. M., A. Z. Kapikian, and R. H. Purcell . 1973. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness. Science 182:1026-8.
42. Fire, A., and S. Q. Xu. 1995. Rolling replication of short DNA circles. Proc Natl Acad Sci U S A 92:4641-4645.
43. Flehmig, B. 1981. Hepatitis A virus in cell culture. II. Growth characteristics of hepatitis A virus in Frhk-4/R cells. Med Microbiol Immunol (Berl) 170:73-81.
44. Flehmig, B., H. Frank, G. G. Frosner, and H. J. Ger th. 1977. Hepatitis A-virus particles in stools of patients from a natural hepatitis outbreak in Germany. Med Microbiol Immunol 163:209-14.
45. Gan, Y. J., J. Chodosh, A. Morgan, and J. W. Sixbey . 1997. Epithelial cell polarization is a determinant in the infectious outcome of immunoglobulin A-mediated entry by Epstein-Barr virus. J Virol 71:519-26.
46. Gauss-Muller, V., D. Jurgensen, and R. Deutzmann. 1991. Autoproteolytic cleavage of recombinant 3C proteinase of hepatitis A virus. Virology 182:861-4.
94
47. Glass, M. J., X. Y. Jia, and D. F. Summers. 1993. Identification of the hepatitis A virus internal ribosome entry site: in vivo and in vitro analysis of bicistronic RNAs containing the HAV 5' noncoding region. Virology 193:842-52.
48. Glikson, M., E. Galun, R. Oren, R. Tur-Kaspa, and D . Shouval. 1992. Relapsing hepatitis A. Review of 14 cases and literature survey. Medicine 71:14-23.
49. Gorbalenya, A. E., V. M. Blinov, and E. V. Koonin. 1985. Prediction of nucleotide-binding properties of virus-specific proteins from their primary structure. Mol. Genet. 11:30-36.
50. Gordon, S. C., K. R. Reddy, L. Schiff, and E. R. Sc hiff. 1984. Prolonged intrahepatic cholestasis secondary to acute hepatitis A. Ann Intern Med 101:635-7.
51. Gust, I. D., A. G. Coulepis, S. M. Feinstone, S. A. Locarnini, Y. Moritsugu, R. Najera, and G. Siegl. 1983. Taxonomic classification of hepatitis A virus. Intervirology 20:1-7.
52. Gust, I. D., N. I. Lehmann, and M. Dimitrakakis. 1979. A seroepidemiologic study of infection with HAV and HBV in five Pacific Islands. Am J Epidemiol 110:237-42.
53. Hadler, S. C. 1991. Global impact of hepatitis A virus infection changing patterns, p. 14-20. In F. B. Hollinger, S. M. Lemon, and H. S. Margolis (ed.), Viral hepatitis in liver disease. Williams & Wilkins, Baltimore.
54. Hadler, S. C., H. M. Webster, J. J. Erben, J. E. Sw ansons, and J. E. Maynard. 1980. Hepatitis A in day-care centers. A community-wide assessment. N Engl J Med 302:1222-7.
55. Havens, W. P. 1947. The etiology of infectious hepatitis. JAMA 134:653-655. 56. Heitmann, A., T. Laue, V. Schottstedt, A. Dotzauer, and L. Pichl. 2005. Occurrence of
hepatitis A virus genotype III in Germany requires the adaptation of commercially available diagnostic test systems. Transfusion 45:1097-105.
57. Hollinger, F. B., and J. Ticehurst. 1996. Hepatitis A Virus, p. 735-782. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Virology, vol. 3. Lippincott-Raven, Philadelphia.
58. Iwarson, S., G. Frosner, A. Lindholm, and G. Norkra ns. 1978. The changed epidemiology of hepatitis A infection in Scandinavia. Scand J Infect Dis 10:155-6.
59. Jansen, R. W., G. Siegl, and S. M. Lemon. 1990. Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method. Proc Natl Acad Sci U S A 87:2867-71.
60. Jia, X. Y., E. Ehrenfeld, and D. F. Summers. 1991. Proteolytic activity of hepatitis A virus 3C protein. J Virol 65:2595-600.
61. Kaplan, G., A. Totsuka, P. Thompson, T. Akatsuka, Y . Moritsugu, and S. M. Feinstone. 1996. Identification of a surface glycoprotein on African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. Embo J 15:4282-96.
62. Karayiannis, P., T. Jowett, M. Enticott, D. Moore, M. Pignatelli, F. Brenes, P. J. Scheuer, and H. C. Thomas. 1986. Hepatitis A virus replication in tamarins and host immune response in relation to pathogenesis of liver cell damage. J Med Virol 18:261-76.
63. Kleppe, K., J. H. van de Sande, and H. G. Khorana. 1970. Polynucleotide ligase-catalized joining of deoxyribo-oligonucleotides on deoxyribopolynucleotide templates and of ribo-oligonucleotides on deoxyribopolynucleotide templates. Proc Natl Acad Sci U S A 67:68-73.
64. Klinger, M. H., R. Kammerer, B. Hornei, and V. Gaus s-Muller. 2001. Perinuclear accumulation of hepatitis A virus proteins, RNA, and particles and ultrastructural alterations in infected cells. Arch Virol 146:2291-307.
65. Koff, R. S. 1993. Viral hepatitis, p. 492-577. In L. Schiff and E. R. Schiff (ed.), Diseases of the liver. JB Lippincott, Philadelphia.
66. Krawczynski, K. K., D. W. Bradley, B. L. Murphy, J. W. Ebert, T. E. Anderson, I. L. Doto, A. Nowoslawski, W. Duermeyer, and J. E. Maynard. 1981. Pathogenetic aspects of hepatitis A virus infection in enterally inoculated marmosets. Am J Clin Pathol 76:698-706.
67. Krook, A., J. Albert, S. Andersson, G. Biberfeld, J . Blomberg, I. Eklund, A. Engstrom, I. Julander, K. Kall, C. Martin, P. Stendahl, J. Struv e, and A. Sonnerborg. 1997. Prevalence and risk factors for HTLV-II infection in 913 injecting drug users in Stockholm, 1994. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 15:381-6.
68. Krugman, S., J. P. Giles, and J. Hammond. 1967. Infectious hepatitis. Evidence for two distinctive clinical, epidemiological, and immunological types of infection. Jama 200:365-73.
69. Krugman, S., R. Ward, and J. P. Giles. 1962. The natural history of infectious hepatitis. Am J Med 32:717-28.
70. Krugman, S., R. Ward, J. P. Giles, O. Bodansky, and A. M. Jacobs. 1959. Infectious hepatitis: detection of virus during the incubation period and in clinically inapparent infection. N Engl J Med 261:729-34.
71. Lanford, R. E., D. Chavez, F. V. Chisari, and C. Su reau. 1995. Lack of detection of negative-strand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other
95
extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. J Virol 69:8079-83.
72. Lanford, R. E., C. Sureau, J. R. Jacob, R. White, a nd T. R. Fuerst. 1994. Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR. Virology 202:606-14.
73. Lemon, S. M. 1997. Type A viral hepatitis: epidemiology, diagnosis, and prevention. Clin Chem 43:1494-9.
74. Lemon, S. M., R. W. Jansen, and E. A. Brown. 1992. Genetic, antigenic and biological differences between strains of hepatitis A virus. Vaccine 10 Suppl 1: S40-4.
75. Lerat, H., F. Berby, M. A. Trabaud, O. Vidalin, M. Major, C. Trépo, and G. Inchauspé. 1996. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. J Clin Invest 97:845-51.
76. Liu, D., S. L. Daubendiek, M. A. Zillmann, K. Ryan, and E. T. Kool. 1996. Rolling Circle DNA synthesis: small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases. J Am Chem Soc 118:1587-1594.
77. Lizardi, P. M., X. Huang, Z. Zhu, P. Bray-Ward, D. C. Thomas, and D. C. Ward. 1998. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet 19:225-32.
78. MacCallum, F. 1947. Homologous serum jaundice. Lancet 2:691-692. 79. Mannucci, P. M., E. Santagostino, E. Di Bona, G. Ge ntili, A. Ghirardini, M. Schiavoni,
and A. Mele. 1994. The outbreak of hepatitis A in Italian patients with hemophilia: facts and fancies. Vox Sang 67 Suppl 1: 31-5.
80. Martin, A., N. Escriou, S. F. Chao, M. Girard, S. M . Lemon, and C. Wychowski. 1995. Identification and site-directed mutagenesis of the primary (2A/2B) cleavage site of the hepatitis A virus polyprotein: functional impact on the infectivity of HAV RNA transcripts. Virology 213:213-22.
81. Mason, P. W., B. Baxt, F. Brown, J. Harber, A. Murd ing, and E. Wimmer. 1993. Antibody-complexed foot-and-mouth disease virus, but not poliovirus, can infect normally insusceptible cells via the Fc receptor. Virology 192:568-77.
82. Mathiesen, L. R., J. Drucker, D. Lorenz, J. A. Wagn er, R. J. Gerety, and R. H. Purcell. 1978. Localization of hepatitis A antigen in marmoset organs during acute infection with hepatitis A virus. J Infect Dis 138:369-77.
83. Mathiesen, L. R., A. M. Moller, R. H. Purcell, W. T . London, and S. M. Feinstone. 1980. Hepatitis A virus in the liver and intestine of marmosets after oral inoculation. Infect Immun 28:45-8.
84. Mazanec, M. B., C. L. Coudret, and D. R. Fletcher. 1995. Intracellular neutralization of influenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutinin monoclonal antibodies. J Virol 69:1339-43.
85. McDonald, S. 1908. Acute yellow atrophy of the liver. Edin Med J. 1:83-88. 86. Mellor, J., G. Haydon, C. Blair, W. Livingstone, an d P. Simmonds. 1998. Low level or
absent in vivio replication of hepatitis C virus and hepatitis G virus/GB virus C in peripheral blood mononuclear cells. J gen Virol 79:705-14.
87. Minor, P. 1991. Picornaviridae, p. 320-326. In R. I. B. Francki, C. M. Fauquet, D. L. Knudson, and F. Brown (ed.), Classification and nomenclature of viruses. Springer-Verlag, Wien.
88. Morrow, C. D., and A. Dasgupta. 1983. Antibody to a synthetic nonapeptide corresponding to the NH2 terminus of poliovirus genome-linked protein VPg reacts with native VPg and inhibits in vitro replication of poliovirus RNA. J Virol 48:429-39.
89. Mourani, S., S. M. Dobbs, R. M. Genta, A. K. Tanodn , and B. Yoffe. 1994. Hepatitis A virus-associated cholecystitis. Ann Intern Med 120:398-400.
90. Nainan, O. V., G. Xia, G. Vaughan, and H. S. Margol is. 2006. Diagnosis of hepatitis a virus infection: a molecular approach. Clin Microbiol Rev 19:63-79.
91. Nakagawa, H., H. Shimomura, T. Hasui, H. Tsuji, and T. Tsuji. 1993. Detection of Negative Strand RNA of Hepatitis C Virus in Infected Liver and Serum. Acta Med Okayama 47:311-316.
92. Nilsson, M., D.-O. Antson, G. Barbany, and U. Lande gren. 2001. RNA-templated DNA ligation for transcript analysis. Nucleic Acids Res 29:578-581.
93. Nilsson, M., M. Gullberg, F. Dahl, K. Szuhai, and A . K. Raap. 2002. Real-time monitoring of rolling-circle amplification using a modified molecular beacon design. Nucleic Acids Res 30:e66.
94. Nilsson, M., H. Malmgren, M. Samiotaki, M. Kwiatkow ski, B. P. Chowdhary, and U. Landegren. 1994. Padlock Probes: Circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science 265:2085-2088.
96
95. Noble, R. C., M. A. Kane, S. A. Reeves, and I. Roec kel. 1984. Posttransfusion hepatitis A in a neonatal intensive care unit. JAMA 252:2711-5.
96. Normann, A., J. Graff, and B. Flehmig. 1994. Detection of hepatitis A virus in a factor VIII preparation by antigen capture/PCR. Vox Sang 67 Suppl 1: 57-60; discussion 61.
97. Oba, I. T., A. M. Spina, C. P. Saraceni, M. F. Lemo s, R. Senhoras, R. C. Moreira, and C. F. Granato. 2000. Detection of hepatitis A antibodies by ELISA using saliva as clinical samples. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 42:197-200.
98. Pichl, L., A. Heitmann, P. Herzog, J. Oster, H. Sme ts, and V. Schottstedt. 2005. Magnetic bead technology in viral RNA and DNA extraction from plasma minipools. Transfusion 45:1106-1110.
99. Pickering, J., A. Bamford, V. Godbole, J. Briggs, G . Scozzafava, P. Roe, C. Wheeler, F. Ghouze, and S. Cuss. 2002. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res 30:e60.
100. Pinto, M. A., R. S. Marchevsky, M. L. Baptista, M. A. de Lima, M. Pelajo-Machado, C. L. Vitral, C. F. Kubelka, J. W. Pissurno, M. S. Franca , H. G. Schatzmayr, and A. M. Gaspar. 2002. Experimental hepatitis A virus (HAV) infection in Callithrix jacchus: early detection of HAV antigen and viral fate. Exp Toxicol Pathol 53:413-20.
101. Probst, C., M. Jecht, and V. Gauss-Muller. 1999. Intrinsic signals for the assembly of hepatitis A virus particles. Role of structural proteins VP4 and 2A. J Biol Chem 274:4527-31.
102. Probst, C., M. Jecht, and V. Gauss-Muller. 1998. Processing of proteinase precursors and their effect on hepatitis A virus particle formation. J Virol 72:8013-20.
103. Provost, P. J., and M. R. Hilleman. 1979. Propagation of human hepatitis A virus in cell culture in vitro. Proc Soc Exp Biol Med 160:213-21.
104. Provost, P. J., B. S. Wolanski, W. J. Miller, O. L. Ittensohn, W. J. McAleer, and M. R. Hilleman. 1975. Physical, chemical and morphologic dimensions of human hepatitis A virus strain CR326 (38578). Proc Soc Exp Biol Med 148:532-9.
105. Purceli, R. H., S. M. Feinstone, J. Ticehurst, R. J . Daemer, and B. M. Baroudy. 1984. Hepatitis A Virus, p. 9-22. In G. N. Vyas, J. L. Dienstag, and J. H. Hoofnagle (ed.), Viral hepatitis and liver disease. Grune & Stratton, Orlando.
106. Robert-Koch-Institut. 2007. Infektionsepidemiologisches Jahrbuch für 2006, Berlin. 107. Robertson, B. H., R. W. Jansen, B. Khanna, A. Totsu ka, O. V. Nainan, G. Siegl, A. Widell,
H. S. Margolis, S. Isomura, K. Ito, and et al. 1992. Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions. J Gen Virol 73 ( Pt 6):1365-77.
108. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J Virol 50:957-9.
109. Sagnelli, E., N. Coppola, C. Marrocco, M. Onofrio, F. Scarano, A. Marotta, C. Scolastico, A. Catuogno, A. Salzillo, C. Sagnelli, F. Piccinino , and P. Filippini. 2003. HAV replication in acute hepatitis with typical and atypical clinical course. J Med Virol 71:1-6.
110. Sanchez, G., S. Populaire, S. Butot, T. Putallaz, a nd H. Joosten 2006. Detection and differentiation of human hepatitis A strains by commercial quantitative real-time RT-PCR test. J Virol Methods 132:160-5.
111. Schiff, E. R. 1992. Atypical clinical manifestations of hepatitis A. Vaccine 10:18-20. 112. Schmitz, G., and A. Dotzauer. 1998. Proof of hepatitis A virus negative-sense RNA by
RNA/DNA-hybrid detection: a method for specific detection of both viral negative- and positive-strand RNA species. Nucleic Acids Res 26:5230-2.
113. Schulman, A. N., J. L. Dienstag, D. R. Jackson, J. H. Hoofnagle, R. J. Gerety, R. H. Purcell, and B. L. F. 1976. Hepatitis A antigen particles in liver, bile, and stool of chimpanzees. J Infect Dis 134:80-4.
114. Schultheiss, T., Y. Y. Kusov, and V. Gauss-Muller. 1994. Proteinase 3C of hepatitis A virus (HAV) cleaves the HAV polyprotein P2-P3 at all sites including VP1/2A and 2A/2B. Virology 198:275-81.
115. Shaffer, D. R., S. U. Emerson, P. C. Murphy, S. Gov indarajan, and S. M. Lemon. 1995. A hepatitis A virus deletion mutant which lacks the first pyrimidine-rich tract of the 5' nontranslated RNA remains virulent in primates after direct intrahepatic nucleic acid transfection. J Virol 69:6600-4.
116. Silberstein, E., L. Xing, W. van de Beek, J. Lu, H. Cheng, and G. G. Kaplan. 2003. Alteration of hepatitis A virus (HAV) particles by a soluble form of HAV cellular receptor 1 containing the immunoglobin-and mucin-like regions. J Virol 77:8765-74.
117. Sjogren, M. H., H. Tanno, O. Fay, S. Sileoni, B. D. Cohen, D. S. Burke, and R. J. Feighny. 1987. Hepatitis A virus in stool during clinical relapse. Ann Intern Med 106:221-6.
97
118. Spiess, M. 1990. The asialoglycoprotein receptor : a model for endocytic receptors. Biochemistry 29:10009-18.
119. Stapleton, J. T. 1995. Host immune response to hepatitis A virus. J Infect Dis 171 Suppl 1:S9-14.
120. Stapleton, J. T. 1992. Passive immunization against hepatitis A. Vaccine 10 Suppl 1: S45-7. 121. Steffen, R., M. A. Kane, C. N. Shapiro, N. Billo, K . J. Schoellhorn, and P. van Damme.
1994. Epidemiology and prevention of hepatitis A in travelers. Jama 272:885-9. 122. Sui, L., W. Zhang, Y. Chen, Y. Zheng, T. Wan, Y. Ya ng, G. Fang, J. Mao, and X. Cao.
2006. Human membrane protein Tim-3 facilitates hepatitis A virus entry into target cells. Int J Mol Med 17:1093-9.
123. Superti, F., L. Seganti, N. Orsi, M. Divizia, R. Ga brieli, and A. Pana. 1987. The effect of lipophilic amines on the growth of hepatitis A virus in Frp/3 cells. Arch Virol 96:289-96.
124. Szemes, M., P. Bonants, M. de Weerdt, J. Baner, U. Landegren, and C. D. Schoen. 2005. Diagnostic application of padlock probes - multiplex detection of plant pathogens using universal microarrays. Nucleic Acids Res 33.
125. Tami, C., E. Silberstein, M. Manangeeswaran, G. J. Freeman, S. E. Umetsu, R. H. DeKruyff, D. T. Umetsu, and G. Kaplan. 2007. Immunoglobulin A (IgA) is a natural ligand of hepatitis A virus cellular receptor 1 (HAVCR1), and the association of IgA with HAVCR1 enhances virus-receptor interactions. J Virol 81:3437-46.
126. Thomas, D. C., G. A. Nardone, and S. K. Randall. 1999. Amplification of padlock probes for DNA diagnostics by cascade rolling circle amplification or the polymerase chain reaction. Arch Pathol Lab Med 123:1170-6.
127. Tibbs, C., and Williams. 1995. Viral causes and management of acute liver failure. J Hepatol. 22:68-73.
128. Ticehurst, J. R., S. M. Feinstone, T. Chestnut, N. C. Tassopoulos, H. Popper, and R. H. Purcell. 1987. Detection of hepatitis A virus by extraction of viral RNA and molecular hybridization. J Clin Microbiol 25:1822-9.
129. Tichopad, A., A. Didier, and M. W. Pfaffl. 2004. Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue-specific contaminants. Mol Cell Probes 18:45-50.
130. Totsuka, A., and Y. Moritsugu. 1999. Hepatitis A virus proteins. Intervirology 42:63-8. 131. Tsarev, S. A., S. U. Emerson, M. S. Balayan, J. Tic ehurst, and R. H. Purcell. 1991. Simian
hepatitis A virus (HAV) strain AGM-27: comparison of genome structure and growth in cell culture with other HAV strains. J Gen Virol 72 ( Pt 7):1677-83.
132. Vallbracht, A., B. Fleischer, and F. W. Busch. 1993. Hepatitis A: hepatotropism and influence on myelopoiesis. Intervirology 35:133-9.
133. Vallbracht, A., P. Gabriel, J. Zahn, and B. Flehmig . 1985. Hepatitis A virus infection and the interferon system. J Infect Dis 152:211-3.
134. Weitz, M., B. M. Baroudy, W. L. Maloy, J. R. Ticehu rst, and R. H. Purcell. 1986. Detection of a genome-linked protein (VPg) of hepatitis A virus and its comparison with other picornaviral VPgs. J Virol 60:124-30.
135. Willems, M., H. Moshage, F. Nevens, J. Fevery, and S. H. Yap. 1993. PCR and detection of negative HCV RNA strands. Hepatology 17:526.
136. Yi, J., W. Zhang, and D. Y. Zhang. 2006. Molecular Zipper: a fluorescent probe for real-time isothermal DNA amplification. Nucleic Acids Res 34:e81.
137. Yotsuyanagi, H., S. Iino, K. Koike, K. Yasuda, K. H ino, and K. Kurokawa. 1993. Duration of viremia in human hepatitis A viral infection as determined by polymerase chain reaction. J Med Virol 40:35-8.
138. Yotsuyanagi, H., K. Koike, K. Yasuda, K. Moriya, Y. Shintani, H. Fujie, K. Kurokawa, and S. Iino. 1996. Prolonged fecal excretion of hepatitis A virus in adult patients with hepatitis A as determined by polymerase chain reaction. Hepatology 24:10-3.
139. Zayc-Schmidt, E. M., L. Pichl, A. Heitmann, and V. Schottstedt. 2005. Travel-related hepatitis A detected by hepatitis A virus RNA donor screening. Transfusion 45:1037-8.
140. Zhang, B., R. Seitz, Y. Kusov, R. Zell, and V. Gaus s-Muller. 2007. RNA interaction and cleavage of poly(C)-binding protein 2 by hepatitis A virus protease. Biochem Biophys Res Commun 364:725-30.
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Abkürzungen
a atto A Adenin ADAR dsRNA-spezifische Adenosin-Desaminase ALT Alaninaminotransferase AS Aminosäure AST Aspartataminotransferase ATP Adenosintriphosphat b Base bp Basenpaar BSA Bovines Serumalbumin cDNA komplementäre DNA CPE Cythopathischer Effekt C Cytosin CP Crossing Point Ct Treshold Cycle CTP Cytidintriphosphat d Tag DAPI 4-6-Diamidino-2-phenylindol-di-hydrochlorid dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat DEAE-Dextran Diethylaminoethyl-Dextran DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium DMSO Dimethysulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphas ds doppelsträngig dTTP Desoxythymidintriphosphat DTT Dithiothreitol EDTA Ethyslendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N´-tetraessigsäure EIA Enzyme Immuno Assay ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay f femto FCS fetales Kälberserum FRhK-4 fetale Rhesusaffen-Nierenzellen g Gramm G Guanin GALT Gut associated lymphoid tissue geq Genomäquivalent GIT Guanidiniumisothiocyanat GTP Guanosintriphosphat h Stunde HAV Hepatitis A-Virus HDA Hybrid-Detection-Assay I Inosin IFN Interferon IgG Immunglobulin G IgA Immunglobulin A IRES internal ribosomal entry site IU Internationale Einheit Kb Kilobasen
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Kbp Kilobasenpaare kDA Kilodalton IE Infektiöse Einheit IU Internationale Unit l Liter m milli M molar Min Minute MALT Mucosa-associated lymphoid tissue MOI multiplicity of infection mRNA messenger Ribonukleinsäure µ mikro NASBA Nucleic acid sequence based amplification NIH National Institute of Health nt Nucleotid NTR nicht translatierte Region NTP Nukleosidtriphosphat OAS 2´,5´Oligoadenylatsynthetase OD optische Dichte ORF open reading frame p Pico PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction pfu plaque-forming unit p.i. post infectionem P/S Penicillin/Streptomycin RCA Rolling Circle Amplifikation rRNA ribosomale Ribonucleinsäure RNA Ribonucleinsäure RNase Ribonuclease rpm revolutions per minute RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction s Sekunde SD Standardabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat ss einzelsträngig TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBS tris buffered saline TCID50 tissue culture infectious dose 50 %
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin T Thymin Taq Thermus aquaticus Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan Tween-20 Synonym für Polyethylenglykol-sorbitan-fettsäureester U Units UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen pro Volumen Vol Volumen w/v Gewicht pro Volumen wt Wildtyp y Yocto z Zepto