UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Meire Karla Miguel Cruz
RECEPTORES DA IMUNIDADE INATA NA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
NATAL-RN 2017
MEIRE KARLA MIGUEL CRUZ
RECEPTORES DA IMUNIDADE INATA NA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Interação parasito/hospedeiro e bioecologia de vetores.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes (UFRN)
Coorientadora: Profa. Dra. Manuela Sales Lima Nascimento (IINN-ELS)
Natal/RN 2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Cruz, Meire Karla Miguel.
Receptores da imunidade inata na Leishmaniose visceral canina
/ Meire Karla Miguel Cruz. - Natal, 2017.
68 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de De Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes.
Coorientadora: Profa. Dra. Manuela Sales Lima Nascimento.
1. Leishmaniose visceral canina - Dissertação. 2. Receptores
da imunidade Inata - Dissertação. 3. Leishmania infantum -
Dissertação. 4. Receptores do tipo TOLL (TLRs) - Dissertação. 5.
Receptores do tipo NOD (NLRs) - Dissertação. I. Guedes, Paulo
Marcos da Matta. II. Nascimento, Manuela Sales Lima. III.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.993.161
MEIRE KARLA MIGUEL CRUZ
RECEPTORES DA IMUNIDADE INATA NA LEISHMANIOSE VISCERAL
CANINA
Dissertação apresentada ao Departamento de Parasitologia, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.
Área de concentração: Interação parasito/hospedeiro e bioecologia de vetores
APROVADA EM ____/____/ 2017
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________
Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Orientador)
_______________________________________________________________
Profª Maria Adelaide do Valle Matta
Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ - RJ
(Membro)
_______________________________________________________________
Profº Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Membro)
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Luiz Carlos e Maria Margarete por todos os esforços
realizados para me proporcionar uma boa educação e para que eu chegasse
até esta etapa da minha vida. A vocês, todo meu amor e gratidão.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, por me dar forças e fé para chegar ao fim
desta etapa.
Aos meus pais Luiz Carlos e Maria Margarete, meu abrigo seguro, pelo
amor incondicional. Por serem meu exemplo de vida, força e união.
Ao meu esposo Anderson Diego, pelo seu amor e por me incentivar a
seguir esse caminho, sempre me fazendo acreditar que posso mais do que
imagino. Por sua presença em todos os momentos de tristezas e alegrias.
Aos meus familiares e verdadeiros amigos pelo carinho e apoio.
Ao meu orientador e professor Dr. Paulo Guedes, do laboratório de
Imunoparasitologia (LIP) UFRN, pela confiança, paciência, orientação e
esforços realizados para a conclusão deste trabalho.
Às amigas do mestrado em Biologia Parasitária Joelma Dantas e Janete
Lima, pelas conversas agradáveis e pelo apoio nos momentos de dificuldades.
Aos colegas do laboratório de Imunoparasitologia (LIP) CB/UFRN,
Tamyres Queiroga e Denis Dantas, pela ajuda na execução dos experimentos
e coleta nos dias de eutanásia.
A equipe do Centro de controle de Zoonoses, CCZ – Natal/RN. Aos
veterinários Dra. Ádila Lorena e Dr. Ciro Fagundes.
Aos professores Dra. Adelaide da Matta, Dr. Valter Andrade, Dra.
Antônia Claudia Jacome, e Dra. Manuela Sales por contribuírem com
sugestões e análises significativas para a elaboração desta dissertação.
À professora Aurigena de Araújo, do Departamento de biofísica e
farmacologia da UFRN, pela disponibilidade de material. À Técnica de
laboratório Neida da Mata, pela ajuda na maceração de órgãos, sua ajuda foi
de grande importância.
A todos, meu muito obrigada!
RESUMO
Cães são os reservatórios primários dos parasitos do gênero Leishmania.
Receptores da imunidade inata fazem a detecção precoce do parasito e conduzem a
imunidade adaptativa específica na tentativa de controlar a infecção. Entretanto,
poucos estudos tem investigado a correlação entre a expressão de receptores da
imunidade inata e a resistência ou susceptibilidade em cães infectados por Leishmania
infantum. O objetivo deste estudo foi correlacionar os achados clínicos em cães
naturalmente infectados por L. infantum à expressão de receptores da imunidade inata
(Toll Like Receptors-TLRs e Nod Like Receptors-NLRs). Inicialmente, o soro de 76
cães foi coletado no Centro de Controle de Zoonoses de Natal, Rio Grande do Norte,
Brasil. A positividade dos cães para L. infantum foi confirmada pela reatividade nos
testes de ELISA e DPP®. Os cães foram clinicamente avaliados e classificados como
sintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19), assintomáticos (n=19) e não
infectados (n=19). Os cães naturalmente infectados por L. infantum e controles não
infectados foram eutanasiados e fragmentos de fígado foram coletados para
quantificação da expressão de RNAm de TLRs (TLR1-9), NLRs (NOD1, NOD2,
NLRP1 e NLRP3) citocinas (IL1β, IL-6, IL-12, IL-10, TNFα, IFN-γ) e iNOS com auxilio
da técnica de PCR em tempo real. Os resultados demonstram o aumento na
expressão da maioria dos receptores do tipo Toll e do tipo Nod nos cães naturalmente
infectados por L. infantum, comparado a animais não infectados. Entretanto, cães
sintomáticos apresentaram maior expressão de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5,
TLR7, TLR8, NLRP1, NLRP3, NOD1 e IL-1β quando comparado a animais
assintomáticos, mostrando significante aumento na transcrição destas moléculas com
a progressão da doença. Por outro lado, cães assintomáticos apresentaram maior
expressão de RNAm de citocinas (IFN-γ, IL-12) e iNOS quando comparado a animais
oligossintomáticos e sintomáticos. Este estudo gerou novos conhecimentos
envolvendo receptores da imunidade inata (TLRs, NLRs) na leishmaniose visceral
canina (LVC), podendo servir de base para o melhor entendimento dos mecanismos
de resistência ou susceptibilidade à infecção por L. infantum em cães, bem como dar
subsídio a estratégias profiláticas para o controle da LVC.
Palavras-Chave: Receptores da imunidade Inata. Leishmaniose visceral canina.
Leishmania infantum. Receptores do tipo TOLL (TLRs). Receptores do tipo NOD
(NLRs).
ABSTRACT
Dogs are the primary reservoirs of parasites of the Leishmania genus.
Innate immune receptors perform early detection of the parasite and lead to
specific adaptive immune response in attempt to infection control. However, few
studies have investigated a correlation between the expression of innate
immunity receptors and the resistance or susceptibility pattern in dogs naturally
infected with Leishmania infantum. The aim of this study was to correlate the
clinical status of dogs naturally infected with L. infantum with the mRNA
expression levels of innate imune receptors (Toll like receptors-TLRs and Nod
Like Receptors-NLRs). Initially, serum of 76 dogs was collected at the
Zoonoses Control Center in Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. The L. infantum
infection in dogs was confirmed by ELISA and DPP® tests. Subsequently,
animals were clinially evaluated and classified as asymptomatic (n=19),
oligosymptomatic (n=19), symptomatic (n=19) and uninfected (n=19). Dogs
naturally infected by L. infantum and uninfected controls were euthanasied and
liver samples were collected to quantify mRNA expression of TLRs (TLR1-9),
Nod Like receptors-NLRs (NOD1, NOD2, NLRP1, NLRP3), cytokines (IL1β, IL-
6, IL-12, IL-10, TNFα, IFN-γ) and iNOS using real-time PCR. The results
demonstrate the increased expression of almost all TLRs and NLRs in dogs
naturally infected by L. infantum compared with uninfected animals. However,
symptomatic dogs showed higher expression of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4,
TLR5, TLR7, TLR8 NLRP1, NLRP3, NOD1 and IL-1β than asymptomatic
animals, revealing significant up regulation of transcription with disease
progression. On the other hand, asymptomatic dogs presented greater cytokine
mRNA expression (IFN-γ, IL-12) and iNOS when compared to oligosymptomatic
and asymptomatic animals. This study unveil new knowledge involving innate
immunity receptors (TLRs, NLRs) and cytokines in canine visceral
leishmaniasis and may be used as a basis for better understanding of
resistance or susceptibility mechanisms in dogs infected with L. infantum, as
well as prophylactic strategies to control canine visceral leishmaniasis.
Keywords: Innate immune receptors. Canine visceral leishmaniasis.
Leishmania infantum. TOLL like receptors (TLRs). NOD like receptors (NLRs).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquematização de localização dos TLRs, NOD, NLRPs e cascata
de sinalização de citocinas .............................................................................. 20
Figura 2 – Delineamento experimental .......................................................... 28
Figura 3 – Sintomas observados na avaliação clínica realizada nos cães ..... 36
Figura 4 - Expressão do RNAm dos TLRs de membrana; TLR1, TLR2, TLR4,
TLR5 e TLR6 ................................................................................................... 37
Figura 5 - Expressão do RNAm dos TLRs intracelulares; TLR3, TLR7, TLR8 e
TLR9 ............................................................................................................... 39
Figura 6 - Expressão do RNAm dos NLRs ..................................................... 40
Figura 7 - Expressão do RNAm de IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α ....................... 41
Figura 8 - Expressão do RNAm de IL-10, IFN-γ e iNOS ................................ 42
Figura 9 - Correlação entre o número de sinais clínicos em cães naturalmente
infectados por Leishmania infantume os níveis de expressão de RNAm de
TLR2, TLR4 de IL12, IFN- γ e iNOS no tecido hepático. ................................. 43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Sequência de iniciadores específicos utilizados nas reações de
PCR em tempo real ......................................................................................... 33
Tabela 2 - Frequência dos sinais clínicos observados em animais portadores
de leishmaniose visceral Canina ..................................................................... 35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC - “Antigen Presenting Cells” - Células Apresentadoras de Antígenos
ANOVA - “Analysis of Variance” - Análise da Variância
CB - Centro de Biociências
DNAc - Ácido Desoxirribonucleico complementar
CLRs - “C-type Lectin Receptors” - Receptores de Lectina do tipo C
DALY - “Disability-Adjusted Life Year” - Anos de vida ajustados por
incapacidade
DAMPs - “Damage-Associated Molecular Patterns” - Padrões Moleculares
Associados ao Dano
DMP
DTH
HIV
-
-
-
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Delayed type hipersensibility - Hipersensibilidade tardia
“Human immunodeficiency vírus” - Vírus da imunodeficiência
humana
LIP - Laboratório de Imunoparasitologia
IκB - “Inhibitor of kappa B” - Inibidor de kappa B
IKK - “IκB Kinase” - Quinase Inibidora de κB
IL
LC
LV
LVC
-
-
-
-
Interleucina
Leishmaniose cutânea
Leishmaniose visceral
Leishmaniose visceral canina
M2 - Macrófagos ativados pela via alternativa
MyD88 - “Myeloid Differentiation Factor 88” - Fator de Diferenciação Mielóide
88
NF-κB - “Nuclear factor-κappaB” - Fator Nuclear-κB
NLR - “Nod-like Receptors” - Receptores do tipo Nod
OMS - Organização Mundial da Saúde
PAMPs - “Pathogen-Associated Molecular Patterns” - Padrões Moleculares
Associados à Patógenos
PBS - “Phosphate-buffered saline” Solução Salina Tamponada com
Fosfato
PCR - “Polymerase Chain Reaction” Reação em Cadeia de Polimerase
PRRs - “Pattern Recognition Receptors” - Receptores de reconhecimento de
padrão
RIP - “Receptor-interacting protein” - Proteína de interação com receptor
RLRs - “RIG-I-like Receptors” - Receptores do tipo RIG-I
RNAm - Ácido Ribonucléico mensageiro
RT - PCR
Th1
Th2
Th17
TIR
TLR
TNF-α
TRIF
UFRN
WHO
μg
μL
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
“Reverse transcription-PCR” - PCR-transcriptase reversa
“T helper cells type 1” - Células T Auxiliares do Tipo 1
“T helper cells type 2” - Células T Auxiliares do Tipo 2
“T helper cells type 17” - Células Th
“Toll-Interleukin 1 Receptor” - Receptor de IL-1/Toll
“Toll-like Receptors” - Receptores do tipo Toll
“Tumor Necrosis Factor-alpha” - Fator de Necrose Tumoral-alfa
“TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon β” -
Proteína adaptadora contendo o domínio TIR indutor de IFN-β
Universidade Federal do Rio grande do Norte
“World Health Organization” - Organização Mundial da Saúde
Micrograma
Microlitro
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 13
1.1 Leishmanias e Leishmanioses ................................................................ 13
1.2 Epidemiologia ........................................................................................... 15
1.3 Imunidade Inata: Receptores do tipo Toll (TLRs) e Receptores do tipo Nod
(NLRs)................................................................................................................17
1.4 Resposta imunológica na leishmaniose visceral .................................. 21
1.5 Resposta imunológica na leishmaniose visceral canina ...................... 23
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 27
2.1 Objetivo geral ........................................................................................... 27
2.2 Objetivos específicos............................................................................... 27
3 ANIMAIS, MATERIAL E MÉTODOS ............................................................ 28
3.1 Delineamento experimental ..................................................................... 28
3.2 Animais, classificação clínica e aspectos éticos .................................. 28
3.3 Teste Rápido (TR-DPP) ............................................................................ 29
3.4 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ..................................... 29
3.5 Extração de RNA e síntese de cDNA ...................................................... 30
3.6 Análise da expressão de citocinas, receptores da imunidade inata e iNOS
......................................................................................................................... 32
3.7 Análises Estatísticas ................................................................................ 34
4 RESULTADOS .............................................................................................. 35
4.1 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Toll de membrana ....... 37
4.2 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Toll intracelular ........... 38
4.3 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo NODs............................ 39
4.4 Expressão de RNAm de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α ............... 40
4.5 Expressão de RNAm de citocinas IL-10, IFN-γ e iNOS......................... 41
4.6 Correlações entre a expressão de receptores da imunidade inata (TLRs e
NLRs), citocinas e iNOS com as manifestações clinicas da leishmaniose
visceral canina ................................................................................................ 42
5 DISCUSSÃO ................................................................................................. 44
6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 50
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 51
ANEXO A ......................................................................................................... 68
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leishmanias e Leishmanioses
A leishmaniose é um conjunto de doenças endêmicas em regiões tropicais da
África, Américas, Índia e Sudoeste da Ásia. Os agentes etiológicos são protozoários
do gênero Leishmania sp, pertencentes a ordem Kinetoplastida e família
Trypanosomatidae (PEARSON, 2000; PITTA et al, 2009). Uma revisão mais recente
sobre a classificação de organismos eucariontes com ênfase em protistas eucariotos
propôs a reunião de diferentes táxons em grupos genéticos similares, baseada em
análises moleculares e filogenéticas (Revisado por ADL et al, 2012). A Leishmania
infantum, integrante do grupo de organismos que ocupam os níveis mais altos dos
protistas eucariotos dentro de uma topologia hierárquica, está classificado como a
seguir (ADL et al, 2012): Excavata (CAVALIER-SMITH, 2002; corrigido por
SIMPSON, 2003); Discoba, ribogrupo montado a partir de estudos filogenéticos
(HAMPL et al, 2009); Discicristata (CAVALIER-SMITH, 1998); Euglenozoa
(CAVALIER-SMITH, 1981, corrigido por SIMPSON, 1997); Kinetoplastea
(HONIGBERG, 1963); Metakinetoplastina, ribogrupo (MOREIRA, LÓPEZ-GARCÍA e
VICKERMAN, 2004); Trypanosomatida (KENT, 1880; corrigido por MOREIRA,
LÓPEZ-GARCÍA e VICKERMAN, 2004) que contém a espécie L. infantum (Revisado
por ADL et al, 2012).
Esses protozoários são parasitos intracelulares obrigatórios de células do
sistema fagocítico mononuclear de mamíferos, principalmente macrófagos, mas
também células dendríticas, fibroblastros e neutrófilos. Os parasitos do gênero
Leishmania podem ser encontrados nas formas promastigotas, no vetor e em
culturas acelulares; e amastigotas, no hospedeiro vertebrado e cultura de células
(PEARSON, 2000; PITTA et al, 2009). A infecção ocorre através do inóculo de
formas promastigotas metacíclicas no tecido subcutâneo do hospedeiro após a
picada de fêmeas de flebotomíneos, sendo a maioria das espécies transmissoras
incluídas nos gêneros Phlebotomus - vetores no velho mundo, e Lutzomyia - vetores
no novo mundo (ALVAR et al, 2004). No Brasil, duas espécies estão relacionadas
com a transmissão de L. infantum: Lutzomyia longipalpis, que é considerada a
principal transmissora, e Lutzomyia cruzi (Elkhoury, 2006). O ciclo de vida de
Leishmania spp é digenético, acontecendo uma parte em hospedeiro invertebrado e
outra em hospedeiro vertebrado (KAMHAWI, 2006).
14
O gênero Leishmania é dividido em dois subgêneros: Viannia e Leishmania de
acordo com seu desenvolvimento no intestino do inseto vetor. Enquanto a
classificação das espécies depende de fatores geográficos do parasito isolado,
dados moleculares, epidemiologia do vetor e reservatório, além da apresentação
clínica da doença. L. donovani e L. infantum são parasitos pertencentes ao
subgênero Leishmania e causam a forma visceral da leishmaniose (LAINSON E
SHAW, 1987) (BARRAL et al, 1986; HERNANDEZ et al, 1993; BATES, 2007). As
espécies L. chagasi e L. infantum são consideradas como uma única espécie. Desse
modo utilizaremos neste estudo a denominação de L. infantum por ser a
nomenclatura mais antiga.
A leishmaniose pode se manifestar em diferentes formas: cutânea (LC),
mucocutânea (LMC) e visceral (LV). Essas diferentes formas clínicas aparentemente
resultam de diferenças entre as espécies, seus reservatórios naturais, vetores e as
populações infectadas. Nas áreas endêmicas de LV, aproximadamente 10% das
pessoas infectadas pela L. infantum desenvolvem a doença clássica e podem evoluir
para morte se não tratadas. A maioria dos infectados podem permanecer
completamente assintomática ou assumir forma oligossintomática (HERWALDT,
1999). Nos casos não tratados, a doença progride na maioria das vezes com
acentuada hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, aumento do volume abdominal,
anemia com leucopenia, hipergamaglobulinemia, hipoalbuminemia, emagrecimento,
edema e estado de debilidade levando a caquexia e ao óbito (HERWALDT, 1999). A
LV ou calazar é considerada uma doença emergente e reemergente, em áreas
rurais e urbanas, seja devido à interrupção do programa de controle da doença
(MALAQUIAS et al, 2007), às mudanças climáticas globais (DHIMAN et al., 2010)
e/ou à co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana, HIV (ALEXANDRINO-
DE-OLIVEIRA et al, 2010). A leishmaniose tornou-se um problema crescente de
saúde pública em muitos países, visto que as alterações ambientais antropogênicas
aumentaram o risco desta doença (WHO, 2012).
O hospedeiro invertebrado com importância epidemiológica, Lutzomyia
longipalpis no Brasil, infecta-se com L. infantum ao realizar repasto sanguíneo
(telmofagia) em animal parasitado, ingerindo macrófagos contendo as formas
amastigotas. No tudo digestivo do inseto as amastigotas modificam-se para a forma
flagelada, promastigotas, as quais se multiplicam por divisão binária. As formas
15
promastigotas chegam ao intestino médio do inseto e danificam a válvula
estomodeal que faz a ligação com o intestino anterior e impede o refluxo sanguíneo.
Desta maneira as formas promastigotas atingem as glândulas salivares, se
transformam em formas promastigotas metaciclicas, que são a forma infectante para
o hospedeiro vertebrado. Ao realizar um novo repasto sanguíneo o flebotomíneo
regurgita essas formas, injetando assim, as formas promastigotas metacíclicas no
tecido subcutâneo do hospedeiro vertebrado (KAMHAWI, 2006).
No homem ou em outro mamífero, as formas promastigotas metacíclicas de L.
infantum penetram em macrófagos no local do repasto sanguíneo, se transformam
em amastigotas dentro do vacúolo parasitófago onde se multiplicam por divisão
binária simples. Após o rompimento dos macrófagos infectados são liberadas formas
amastigotas que infectam novas células adjacentes, principalmente macrófagos,
mas podem parasitar também células dendriticas, fibroblastros e neutrófilos. Após
alguns ciclos de multiplicação no local da picada do flebotomineo, ocorre
visceralização dos parasitos por via linfática e sanguínea, atingindo principalmente
órgãos linfoides, como linfonodo, baço, fígado e medula óssea, ocorrendo intenso
parasitismo nestes órgãos (DESCOTEAUX e TURCO, 1999; CUNNINGHAM, 2002;
KILLICK-KENDRICK, 1990; KIMBLIM et al, 2008).
1.2 Epidemiologia
Existem em média de 12 a 15 milhões de indivíduos infectados com
Leishmania em 88 países, dos quais 79 são considerados em desenvolvimento.
(WHO, 2005). Cerca de 0,2 a 0,4 milhão de novos casos de LV e 0,7 a 1,3 milhão de
novos casos de LC ocorrem todos os anos. (ALVAR et al, 2012; WHO, 2016). A
leishmaniose é uma doença de grande importância para saúde pública, devido à
elevada expansão geográfica e taxa de mortalidade, especialmente em crianças mal
nutridas, idosos e, principalmente, pacientes portadores de co-infecção Leishmania-
HIV (EZRA et al, 2010). A elevada incidência das leishmanioses, acompanhada por
lesões incapacitantes, desfigurantes (LC) e fatais (principalmente na LV), levou a
OMS a incluir as leishmanioses entre as seis endemias mais importantes no mundo.
A LV é causada por Leishmania donovani na Índia e na África Oriental, e por
L. infantum em todo o Mediterrâneo, Ásia central, China e América do Sul. Estima-se
que entre 3 e 4 milhões de pessoas estejam infectadas por L. donovani ou L.
16
infantum no mundo ( WHO, 2015). Mais de 90% dos casos globais de Leishmaniose
visceral ocorrem em apenas seis países: Índia, Bangladesh, Sudão, Sudão do Sul,
Brasil e Etiópia. Levando em conta uma taxa global de letalidade de 10% e
assumindo que praticamente todos os óbitos são de LV, há uma estimativa
provisória de 20.000 a 40.000 mortes de leishmaniose por ano (ALVAR et al, 2012).
No Brasil, a LV é endêmica, e de acordo com o Ministério da Saúde o número de
casos registrados é de 16.927 no período entre 2011 a 2015, com taxa de letalidade
de 6,8%, distribuídos em todas as cinco regiões do país. Atualmente, a região
nordeste apresenta o maior número de casos (54,9%), seguida da região sudeste
(16,3%), norte (14,2%), centro-oeste (4,8%) e sul (0,1%). No Estado do Rio Grande
do Norte foram registrados 375 casos entre 2011 e 2015 (MS, 2016).
A LV é uma doença que tem reemergido em várias localidades no Brasil a
partir dos anos 1980 e se espalhado para novas áreas, incluindo o sudeste e centro-
oeste do país. Anteriormente, a LV era uma doença que ocorria em áreas rurais do
nordeste brasileiro, afetando principalmente crianças. No entanto, a maioria dos
casos de LV no país hoje, vêm de áreas periurbanas de cidades em todas as
regiões do Brasil (NASCIMENTO et al, 2008). Os dados epidemiológicos da última
década mostram a urbanização da LV, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de
Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS),
Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e mais
recentemente as epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS), Campo
Grande (MS) e Palmas (TO) (MS, 2010). Essa expansão da LV para os centros
urbanos torna essa doença, antes dita tipicamente „rural‟, em uma doença associada
a modificações ambientais, ao êxodo rural, ao aumento da densidade populacional,
à adaptação do vetor ao ambiente urbano, e às precárias condições de vida nas
periferias urbanas, tornando-se um sério problema de saúde pública no território
brasileiro (DANTAS-TORRES, 2006; JERONIMO et al, 2004; NASCIMENTO et al,
2008; QUEIROZ et al, 2009).
O cão é considerado o principal reservatório doméstico e tem importância na
manutenção do ciclo da doença, por ser o principal elo na cadeia de transmissão da
leishmaniose visceral ao homem (ALVAR et al, 2004; BANETH et al, 2008;
NASCIMENTO et al, 2008). Sendo responsável pela manutenção do parasito nos
focos endêmicos, tanto pela alta prevalência da doença nestes animais, quanto pela
17
presença de formas amastigotas na pele e pela sua proximidade ao homem.
Quando a prevalência canina aumenta, a humana acompanha esses índices (LIMA
et al, 2012). Por esta razão, estes animais são considerados um dos alvos
estratégicos de controle da doença e é extremamente importante a vigilância
epidemiológica dos mesmos.
1.3 Imunidade Inata: Receptores do tipo Toll (TLRs) e Receptores do tipo Nod
(NLRs)
Durante o processo infeccioso a resposta imune inata pode manter o controle
do parasitismo até a ativação das respostas imunes adaptativas, as quais podem ser
direcionadas pela resposta imune inata (ABBAS, 2012). A imunidade inata é a
primeira linha de defesa contra a invasão de agentes patogênicos e é ativada pelo
reconhecimento de padrões moleculares conservados entre as espécies de
patógenos e as moléculas endógenas liberadas a partir de células danificadas,
conhecidos, respectivamente, como Padrões Moleculares Associados à Patógenos
(PAMPs) e Padrões Moleculares Associados ao Dano (DAMPs). O reconhecimento
de PAMPs e DAMPs dar-se por meio dos Receptores de Reconhecimento de
Padrões (PRRs) expressos nas células apresentadoras de antígenos (APCs)
profissionais, especialmente células dendríticas e macrófagos, em células imunes
como neutrófilos e mastócitos, e em células não imunes, como células epiteliais,
células endoteliais e fibroblastos (TAKEUCHI e AKIRA, 2010; KAWAI e AKIRA,
2011; AKIRA, UEMATSU, e TAKEUCHI, 2006).
Os PRRs são formados por várias famílias de receptores da imunidade inata,
as mais conhecidas são: Receptores do tipo Toll (TLRs), Receptores de Lectinas do
tipo C (CLRs), Receptores do tipo RIG (RLRs) e Receptores do tipo NLRs (NODs e
NLRPs) (ISHII et al, 2008; NEWTON e DIXIT, 2012). O reconhecimento de PAMPs
ou DAMPs por PRRs induz ao aumento da transcrição de genes envolvidos em
respostas inflamatórias. Estes genes codificam citocinas proinflamatórias, interferons
do tipo I (IFN-α e IFN-β), quimiocinas e proteínas antimicrobianas. A resposta
inflamatória é orquestrada por citocinas como, TNF-α, IL-1, IL-18 e IL-6, que, dentre
outras coisas, regulam morte celular de tecidos inflamados, modificação da
permeabilidade endotelial vascular, recrutamento de células sanguíneas para
18
tecidos inflamados, e a indução na produção de proteínas de fase aguda
(RODRIGUES et al, 2012; TAKEUCHI e AKIRA, 2010).
Os receptores Toll-like (TLRs) são uma classe de proteínas que possuem
papel chave no sistema imune inato. Em 1996, um grupo de pesquisa liderado por
Jules A. Hoffmann estudando a imunidade da mosca de frutas, Drosophila
melanogaster, à infecção por fungos descreveu o papel imunológico dos genes Toll.
Estes autores descreveram o papel essencial dos receptores do tipo Toll na defesa
contra a infecção por fungos e caracterizaram o papel crítico da via de sinalização
Toll na resposta imunológica (LEMAITRE et al, 1996). Este trabalho foi publicado em
1996 na revista Cell, e Hoffman ganhou o prêmio Nobel de Medicina em 2011.
Os TLRs são receptores de reconhecimento de padrões moleculares
frequentemente observados em patógenos e sinalizam via proteínas adaptadoras
contendo domínio TIR tais como MyD88 (myeloid differentiation primary response
gene 88), TIRAP [TIR-containing adaptor protein, também conhecida como MAL
(MyD88-adaptor-like)], TRIF [TIR-containing adaptorinducing IFN (interferon)-β] e
TRAM (TRIF-related adaptor molecule). De forma geral, a cascata de sinalização
mediada pela ativação dos TLRs leva à ativação de MAPK (mitogenactivated protein
kinases) e fatores de transcrição tais como NF-κB (fator nuclear κB) e IRFs (fatores
reguladores de Interferon) induzindo a produção de citocinas inflamatórias. Até o
momento foram descritos 10 TLRs em humanos, 12 TLRs funcionais em
camundongos (KAWAI e AKIRA, 2011) e 10 em cães (CUSCÓ et al, 2014). Os
membros da família dos TLRs são expressos em diversos tipos celulares, tais como
linfócitos T e B, células NK, células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células
epiteliais e endoteliais. Os TLRs possuem localizações celulares diferentes. TLR1,
TLR2, TLR4, TLR5 e TLR6 são expressos na superfície da célula, enquanto TLR3,
TLR7, TLR8 e TLR9 são expressos em vesículas endossomais (KAWAI e AKIRA,
2011) (Figura 1).
Foram descritos mais de 20 genes NLR em seres humanos e mais de 30 em
camundongos (DAVIS et al, 2011). NLRs incluem proteínas tais como NOD1 (do
inglês, nucleotide-binding and oligomerization domain 1), também conhecida como
CARD4; NOD2 (também conhecido como CARD15) (INOHARA et al., 2005); NALPs
(proteínas contendo domínios NACHT, LRR e pyrin); NLRC4 ou IPAF (fator ativador
19
da protease ICE, enzima conversora de IL-1), também conhecido como CARD12 (ou
CLAN) e NAIPs (proteínas inibidoras de apoptose neuronal) (TING; KASTNER e
HOFFMAN, 2006). Os NLRs apresentam uma estrutura característica, composta por
três domínios: um domínio carboxi-terminal LRR que é responsável pelo
reconhecimento do ligante; um domínio NOD (“Nucleotide-binding Oligomerization
Domain”), responsável pela oligomerização do receptor após sua ativação; e um
domínio amino-terminal distinto, o qual desencadeia a função efetora do receptor
(ATHMAN e PHILPOTT, 2004). Na ausência de infecção, o NLR encontra-se em
uma forma inativa; as regiões efetoras permanecem protegidas pela região LRR o
que bloqueia sua ativação. A ligação de moléculas ao LRR promove uma
modificação estrutural no receptor resultando na exposição de sítios de ligação ao
ATP, permitindo assim a ligação de ATP ao domínio NOD, o qual se oligomeriza
promovendo uma sinalização celular característica de cada NLR (ZINK et al, 2002).
NOD1 é expresso em muitos tipos de células e organismos, enquanto NOD2
parece ser mais restrito e tem sido descrito em células hematopoiéticas.NOD1
reconhece fragmentos relacionadas aos peptídeoglicanos contendo ácido meso-
diaminopimélico, encontrado em todas as bactérias gram-negativas e também em
algumas gram-positivas. Já o NOD2 reconhece muramildipeptídeo (MDP) MurNAc-L-
Ala-D-iso-Gln, conservados em peptídeoglicano de todos os tipos de bactérias
(MCDONALD et al, 2005; OGURA et al, 2001). Ambas as moléculas se localizam no
citosol, embora possuam uma pequena fração associada à membrana plasmática
(Franchi et al., 2009)
NLRs que apresentam um domínio pirina ou um domínio BIR na região N-
terminal são componentes dos inflamassomas, os quais são complexos multiméricos
de proteínas montados no citoplasma das células imunes inatas em resposta a
moléculas microbianas e outros sinais. Esses complexos estão associados a
clivagem e secreção de IL-1β e IL-18, e guiam a célula hospedeira a uma forma
específica programada de morte celular inflamatória, piroptose (SCHRODER e
TSCHOPP, 2010). Os inflamassomas são compostos por um sensor, molécula, que
determina a especificidade do inflammasoma, o qual, geralmente, é um membro da
família de NLR (CUNHA e ZAMBONI, 2013). Os NLRs incluem NLRP1, NLRP3,
NLRC4, NLRC5, NLRP6, NLRP7, NLRP12 (DAVIS et al, 2011; DUNCAN et al, 2007;
DOSTERT e PETRILLI, 2008; HORNUNG et al, 2009; MARTINON, 2010; FAUSTIN
20
e REED 2013; MUNOZ-PLANILLO ET AL, 2013; CIRELLI et al, 2014). O
inflamassoma mais estudado é NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing
protein 3), o qual recruta a proteína adaptadora ASC (Apoptosis-associated speck-
like protein containing a CARD) para ativar e induzir a clivagem de caspase-1, por
meio de um domínio interação proteína-proteína, o PYD contido na região N-terminal
de NALP3 interage com o PYD de ASC. Simultaneamente, o domínio CARD de ASC
se liga ao domínio CARD de caspase-1 (SUTTERWALA et al, 2006; SCHRODER e
TSCHOPP, 2010). Resumidamente, após a detecção de um PAMP ou DAMP, um
NLR forma um complexo de proteína multimérica conhecido como inflamossoma
através da associação da proteína adaptadora ASC (apoptose associada speck-like
protein contendo um domínio C-terminal de recrutamento caspase [CARD]). Isto
inicia a clivagem da pro-caspase-1 na sua forma ativa caspase-1. A caspase-1 ativa
é então capaz de clivar as formas imaturas de IL-1β e IL-18 nas suas formas ativas,
que levam a inflamação tecidual (CAI et al, 2014; LUET al, 2014) .
Figura 1 – Cascatas de sinalização dos receptores da imunidade inata (Toll Like Receptor – TLR e Nod Like Receptor - NRL). Após o reconhecimento de PAMPs pelos receptores do tipo TOLL e NOD, estes sofrem mudanças conformacionais, permitindo o recrutamento de moléculas adaptadoras, como Myd88, TRIF, RIP2 e ASC. O tipo de sinalização depende da combinação de diferentes PAMPs, resultando no recrutamento de diferentes moléculas reguladoras. As moléculas irão ativar NFκB, membros da família das MAP quinases e JUN quinases, induzindo a produção de mediadores inflamatórios.
Fonte: (Adaptado de PEREIRA, 2014).
21
1.4 - Resposta imunológica na leishmaniose visceral
A geração de uma resposta imune é crucial para a eliminação ou
desenvolvimento do parasito (Leishmania). Durante o repasto sanguíneo da fêmea
do flebótomo, promastigotas metacíclicas, presentes nas glândulas salivares, são
inoculadas junto com a saliva, na derme do hospedeiro mamífero (Ribeiro, 1995). Na
derme, as promastigotas metacíclicas podem penetrar em granulócitos, macrófagos
(LIMA et al, 1998; POMPEU et al, 1991) ou em células dendríticas (CDs) (Moll,
2000). Quando os macrófagos ingerem os neutrófilos apoptóticos infectados
(SAVILL et al, 1989), suas funções microbicidas não são ativadas (VAN et al, 2004).
Assim, acredita-se que a leishmania estaria entrando no macrófago, a sua principal
célula hospedeira, de uma maneira silenciosa (LASKAY et al, 2003). Embora a
leishmania consiga diferenciar-se em amastigotas e proliferar dentro de células
dendríticas (PRINA et al, 2004), os macrófagos são as células hospedeiras
preferenciais, onde os parasitos proliferam intensamente nos vacúolos parasitóforos
(KONECNY et al, 1999).
Várias evidências clínicas e experimentais demonstraram a função protetora de
células Th1 em detrimento à resposta tipo Th2. A secreção de IL-12 e IL-18 por
células dendríticas favorece o desenvolvimento de uma resposta do tipo Th1, com
secreção de IFN- e TNF-α, ativação da iNOS e produção de NO por macrófagos,
com consequente eliminação do parasito intracelular (MATTNER et al, 1996; WEI et
al, 1999). Nesses casos, normalmente o indivíduo evolui com um bom prognóstico.
Por outro lado, a expansão de clones Th2, mediada por IL-4 e IL-13 é promotora de
doença (HIMMELRICH et al., 1998; MATTHEWS et al, 2000), e os indivíduos que
apresentam esse tipo de resposta têm maior disseminação parasitária e maior
dificuldade em responder ao tratamento.
Os mecanismos imunológicos que conferem resistência ou suscetibilidade à
infecção por parasitos do gênero Leishmania foram bem caracterizados em modelos
experimentais de infecção com Leishmania major, uma espécie associada à LC no
Velho Mundo (DAVID e KRAFT, 2009). Uma eficiente apresentação antigênica com
os co-estímulos necessários e produção de IL-12 por células dendríticas que
fagocitam os parasitos no sítio de inoculação levam à diferenciação de linfócitos T
naïves em Th1 produtores de IFN-γ (ALEXANDER e BRYSON, 2005). Juntamente
com linfócitos T CD4+, células NK e T CD8+ também são fontes importantes de IFN-γ
22
(AWASTHI ET AL, 2004; BELKAID et al, 2002; BIRON e GAZZINELLI, 1995;
SCHARTON-KERSTEN et al, 1995). Esta citocina atua nos macrófagos, ativando a
enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS ou NOS2), com concomitante produção
de óxido nítrico (NO), que leva à morte dos parasitos fagocitados. A citocina TNF-α é
produzida por macrófagos e age em sinergismo com IFN-γ aumentando a ativação
de iNOS e assim levando a morte mediada por óxido nítrico (BOGDAN et al, 2000;
LIEW et al, 1990a; LIEW et al, 1990b). Em contrapartida, o desenvolvimento de uma
resposta imune Th2 durante a infecção por L. major, dominada pela produção de IL-
4, com ausência de IL-12, confere suscetibilidade à infecção (SACKS e NOBEN-
TRAUTH, 2002). Citocinas como IL-13 (MOHRS et al, 1999) e IL-10 (BELKAID et al,
2001; KANE e MOSSER, 2001; NOBEN-TRAUTH et al, 2003; PADIGEL et al, 2003)
também estão relacionadas com a suscetibilidade nesse modelo.
Na LV, a resposta Th1 também está associada com resistência à doença e
morte dos parasitos. In vitro, foi visto que a ativação de macrófagos com IFN-γ ou
TNF leva à morte de parasitos da espécie L. donovani (MURRAY et al, 1983;
PEARSON e STEIGBIGEl, 1981). Em pacientes assintomáticos é encontrada forte
resposta DTH (hipersensibilidade tardia- delayed type hipersensibility) e produção de
IL-2, IL-12 e IFN-γ por células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
(CARVALHO et al, 1989; CARVALHO et al, 1985). Por outro lado, ausência de DTH,
incapacidade de linfoproliferação e de produção de IL-2 e IFN-γ por PBMC em
resposta ao antígeno do parasito são encontrados em pessoas que desenvolvem LV
por L. infantum ou L. donovani (CARVALHO et al, 1985; SACKS et al, 1987). Além
disso, também foi visto que elevada produção de citocinas do padrão Th2, como IL-4
e IL-13, estão relacionadas com susceptibilidade e o desenvolvimento de LV em
humanos (BABALOO et al, 2001; THAKUR et al, 2003). A alta produção de IL-10
também foi correlacionada a alta carga parasitária e a LV ativa em pacientes
(NYLEN e SACKS, 2007; VERMA et al, 2010). O fato dos pacientes evoluírem para
uma forma sintomática parece estar associado a não indução de ativação dos
macrófagos para destruir o parasito, sendo o principal defeito para geração desta
doença, o que se associa com a multiplicação e disseminação do parasito e
acometimento de múltiplos órgãos (BACELLAR et al, 1996; CARVALHO et al, 1988).
Em modelos experimentais de LV a proteção contra a infecção também parece estar
relacionada à produção de IFN-γ e respostas Th1, uma vez que animais resistentes
à infecção experimental por L. donovani, como C3H/HeJ, produzem grande
23
quantidade desta citocina na fase inicial da infecção e são capazes de manter a
produção alta em fases mais tardias (LEHMANN et al, 2000).
1.5 Resposta imunológica na leishmaniose visceral canina
O curso da relação estabelecida entre parasito e hospedeiro durante a
leishmaniose é determinado por fatores complexos como os componentes da saliva
do inseto vetor, as proteínas de superfície e secretadas do parasito, além das
diferentes respostas imunológicas desencadeadas pelo hospedeiro (HOSEIN et al,
2016). Nesse contexto, respostas de padrões distintos e ainda pouco conhecidos
podem ser geradas, desde cura espontânea dos sintomas, formas
oligossintomáticas e assintomáticas, até manifestações graves que podem levar o
óbito do hospedeiro (PINELLI et al, 1994; PINELLI et al, 1995; GIUNCHETTI et al,
2006; REIS et al, 2006; NASCIMENTO et al, 2015). A resposta imunológica gerada
durante a LV tem sido amplamente estudada para melhor entendimento da
imunidade protetora assim como dos mecanismos imunopatológicos desencadeados
pelo parasito. No modelo canino os estudos realizados até o momento ainda são
insuficientes para estabelecer um padrão de resposta imune do tipo resistência
versus susceptibilidade em cães naturalmente e/ou experimentalmente infectados
por L. infantum, porém nota-se que animais assintomáticos apresentam uma
combinação tanto de citocinas Th1 quanto Th2, sendo crucial a ativação de
macrófagos para destruição dos parasitas e controle da doença.
Foi demonstrado que cães assintomáticos do estado de Pernambuco-Brasil e
de Portugal, naturalmente infectados por L. infantum, expressam maior quantidade
de RNAm para as citocinas IL-2, IL-12 nos linfonodos (BARBOSA et al, 2011). Além
disso, foi observada maior expressão de IL-10, TGF-β e elevada carga parasitária
nos linfonodos dos cães sintomáticos (Alves et al., 2009). Linfócitos do sangue
periférico de cães Beagle experimentalmente infectados por L. infantum expressam
grandes quantidades de RNAm para IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-18 e IL-10, indicando a
presença de um misto de respostas Th1 e Th2 (CHAMIZO et al, 2005). Também foi
descrito que cães oligossintomáticos experimentalmente infectados por L. infantum,
apresentaram uma baixa expressão de IFN-γ, IL-18, IL-10 e TNF-α em linfócitos do
sangue periférico, quando comparado aos animais assintomáticos (CARRILLO et al,
2007). Outros autores demonstraram alta expressão de citocinas (IFN-γ, IL-13, TNF-
24
α, IL-5) na pele de cães assintomáticos, naturalmente infectados por L. infantum em
Minas Gerais- Brasil (MENEZES-SOUZA et al, 2011).
Um dos órgãos mais importantes envolvidos na interface parasito hospedeiro,
durante a infecção por L. infantum é o fígado. Entretanto poucos trabalhos
correlacionam a produção de citocinas neste órgão à imunopatogênese da
leishmaniose visceral canina. Em estudo com cães naturalmente infectados,
provenientes de área endêmica de transmissão da doença em Araçatuba, São
Paulo, foi demonstrado que animais assintomáticos apresentam maior produção de
TGF-β1 e IFN-γ no tecido hepático, quando comparados aqueles animais que
desenvolveram sintomas da doença (CORREA et al, 2007). Grandes quantidades de
IL-10 e TGF-β foram detectados no fígado e baço de animais sintomáticos e
assintomáticos, indicando que durante a infecção por L. infantum em cães a
resposta imune predominante é do perfil Th2 (CORREA et al, 2007). Em outro
estudo, utilizando 52 cães (12 animais assintomáticos, 12 oligossintomáticos, 17
sintomáticos e 11 controles não infectados) de área endêmica em Belo Horizonte,
Minas Gerais, foi demonstrado maior parasitismo no fígado de animais sintomáticos
(GIUNCHETTI et al, 2008), o que poderia estar associado a deficiência na produção
de citocinas do perfil Th1, nestes animais e consequente falta de ativação de células
do sistema fagocítico mononuclear (STANLEY e ENGWERDA, 2007). Em outro
estudo, foi demonstrado elevada expressão de RNAm das citocinas TGF-β, IL-10,
TNF-α, IFN-γ e iNOS no fígado de 12 cães assintomáticos experimentalmente
infectados por L. infantum e eutanasiados 6 meses após a infecção (MAIA e
CAMPINO, 2012). Também foi demonstrado que o padrão inflamatório Th17 tem
papel protetor durante a LV por L. donovani em pacientes (PITTA et al, 2009) e o
mesmo é sugerido para infecção por L. infantum, indicando que não somente o
padrão Th1 atua na resistência nesses modelos.
A imunidade adaptativa é imprescindível para a resolução da infecção. No
entanto, há evidências crescentes de que mecanismos inatos desempenham papel
importante nas defesas anti-Leishmania (FARIA et al, 2012). O envolvimento de
TLRs na infecção por Leishmania tem sido extensivamente estudado em humanos e
camundongos (KROPF et al, 2004a; RAMAN et al, 2010; TUON et al, 2010;
GALLEGO et al 2011). Entretanto, existe limitada quantidade de informação sobre a
função que estes receptores desempenham na infecção por L. infantum em cães
25
(AMORIM et al, 2011; FIGUEIREDO et al, 2013; MELO et al, 2014a e 2014b,
HOSEIN et al, 2015).
Melo e colaboradores (MELO et al., 2014) avaliaram a expressão de TLR2 e
TLR4 por citometria de fluxo em células mononucleares do sangue periférico de 60
cães sintomáticos (com no mínimo 3 sintomas) naturalmente infectados por L.
infantum no município de Araçatuba-SP. Foi descrito que os monócitos derivados do
sangue periférico de cães infectados com L. infantum apresentam diminuição na
expressão de TLR2 quando comparado a animais não infectados. Não houve
diferença entre a expressão de TLR4 em animais não infectados e infectados
sintomáticos.
No entanto, Amorim e colaboradores (AMORIM et al, 2011) avaliaram a
expressão de TLR2 por citometria de fluxo em células mononucleares do sangue
periférico de 48 cães sintomáticos naturalmente infectados por L. infantum no
município de Belo Horizonte-MG e descreveram alta expressão de TLR2 em
monócitos e granulócitos de cães com leishmaniose visceral canina. Quando o autor
agrupa determinado número de animais em dois grupos, cães com alto parasitismo
cutâneo (n=17) e animais com baixo parasitismo cutâneo (n=16); foi observado
maior expressão de TLR2 e NO em monócitos de cães com baixo parasitismo
cutâneo quando comparado aqueles com alto parasitismo cutâneo. Os autores
concluem que a expressão de TLR2 é importante para modular a resposta imune
celular e eliminação do parasito dos tecidos.
A expressão dos receptores da imunidade inata (TLR2 e TLR9) foi estudada
também por citometria de fluxo na região gastrointestinal, em células da lâmina
própria do jejuno e cólon de cães naturalmente infectados por L. infantum no
município de Belo Horizonte-MG (FIGUEIREDO et al, 2013). Animais infectados
apresentaram maior expressão de TLR2 e TLR9 no jejuno e colón que animais não
infectados. A análise histológica demonstrou que o cólon continha mais parasitas do
que o jejuno, sendo observada também maior frequência de células dendríticas
TLR2+CD11c+ no cólon do que no jejuno. Inversamente, as células dendríticas
TLR9+CD11c+ foram mais frequentes no jejuno (FIGUEIREDO et al, 2013).
Mais recentemente, Hosein e colaboradores (HOSEIN et al, 2015) avaliaram a
expressão de TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9 por PCR em tempo real na pele, baço,
26
linfonodos e fígado de cães Beagle experimentalmente infectados com L. infantum,
por seis meses (n = 24) e 15 meses (n = 7) após a infecção, e correlacionado aos
achados clínicos, densidade de parasitos nos órgãos e citocinas. No fígado foi
observada maior expressão de TLR2 nos animais infectados quando comparado
aqueles não infectados, não houve diferença entre a expressão de TLR3, TLR4 e
TLR9. O aumento na expressão de TLR2 pode estar associada com a progressão
da doença em cães. No linfonodo estes autores demonstraram que a expressão de
TLR2 nos animais infectados é semelhante aqueles não infectados, porém foi
observada redução na expressão de TLR3, TLR4 e TLR9, quando comparado a
animais não infectados. No baço foi observado aumento na expressão de TLR9 e
diminuição na expressão de TLR4 nos animais infectados. Na pele foi observado
aumento na expressão de TLR9 nos animais infectados, quando comparado aqueles
não infectados (HOSEIN et al, 2015). De maneira geral houve correlação positiva
entre o parasitismo e a alta expressão de TLR2 e TLR9. Assim, animais sintomáticos
e com elevado parasitismo expressam elevados níveis de RNAm de TLR2 e TLR9.
Assim, baseado no exposto acima o conhecimento sobre receptores da
imunidade inata na leishmaniose visceral canina é escasso e preliminar. Estes
receptores são importantes por realizar controle inicial do parasitismo e direcionar o
perfil de resposta imune adaptativa, que é crucial para determinar o perfil de
resistência e susceptibilidade a infecção por L infantum em cães. Desta forma é
importante investigar a relação entre a expressão de receptores da imunidade inata
com o desenvolvimento da LVC, ou proteção à doença. Este conhecimento pode
abrir novas perspectivas profiláticas, como também um melhor entendimento da
história natural da doença.
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão de receptores da imunidade inata em cães naturalmente
infectados por Leishmania infantum.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar as manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina nos animais
recolhidos para eutanásia pelo CCZ;
Investigar a relação entre a expressão de receptores do tipo Toll e do tipo Nod
e o perfil de suscetibilidade x resistência na leishmaniose visceral canina;
Determinar o perfil de expressão de citocinas e iNOS em cães naturalmente
infectados por L. infantum e correlaciona-los às manifestações clínicas da
doença, ou à apresentação da forma assintomática da infecção;
Correlacionar o perfil de expressão de receptores da imunidade inata (TLRs e
NLRs) ao perfil de expressão de citocinas produzidas apos ativação da
imunidade inata, adaptativa bem como de iNOS;
Correlacionar o perfil de expressão de receptores da imunidade inata,
citocinas e iNOS às manifestações clínicas da doença.
28
57 cães naturalmente infectados com Leishmania infantum:
Exame clínico
Correlacionar à expressão de citocinas, e receptores da imunidade inata
(TLRs e NLRs) às manifestações clínicas na Leishmaniose Visceral Canina
Determinação da expressão de
mRNA citocinas (IL-6, IL-10,
IL-12, IL-1β, TNF-α, IFN-γ),
iNOS, TLRs (TLR1-9), NLRs
(NOD1 e NOD2) e NLRPs
(NLRP1 e NLRP3)
Eutanásia e obtenção de
soro e fragmentos de
fígado
19 animais
assintomáticos
19 animais
oligossintomáticos
19 animais
sintomáticos
19 animais
controles não
infectados
Confirmação da infecção
TR-DPPP
ELISA
3 ANIMAIS, MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento experimental
Figura 2 – Delineamento experimental
Fonte: Autoria própria.
3.2 Animais, classificação clínica e aspectos éticos
Foram analisados 76 cães domésticos sem raça definida, de ambos os sexos
e diferentes faixas etárias, no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) no município
de Natal no período entre 2014 a 2016. Após a determinação dos cães que
apresentavam sororreatividade para L. infantum usando as técnicas TR-DPP e
ELISA, os animais sororreativos foram anestesiados, eutanasiados e avaliados
clinicamente.
A eutanásia ocorreu no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Natal-RN.
Os animais foram inicialmente anestesiados com Thiopentax B1® (Farmace) a 10%
em PBS, seguindo-se a eutanásia por injeção de cloreto de potássio a 3% (Cristália)
29
intravenoso. Após a eutanásia foi feita a avaliação clínica dos animais e a coleta de
amostras do fígado. Os cães foram agrupados de acordo com as manifestações
clínicas apresentadas seguindo a classificação dos animais em: (i) assintomáticos,
animais infectados que não apresentam sinais clínicos sugestivos de LVC, (ii)
oligossintomáticos, animais infectados que possuem até três sinais clínicos da
doença, incluindo moderada perda de peso e, (iii) sintomáticos, onde os cães
infectados possuem mais de três sinais clínicos sugestivos da doença, incluindo
acentuada perda de peso (Mancianti et al., 1988; Reis et al., 2006). Os sinais
clínicos observados utilizados para a classificação clínica foram: alopécia local,
alopecia generalizada, conjuntivite, dermatite furfurácea, emagrecimento, lesões nas
pontas das orelhas, úlcera na pele, onicogrifose, opacificação da córnea, edema e
parestesia das patas. Foram utilizados animais controles da mesma região
geográfica, que foram eutanasiados por serem animais agressivos.
Os experimentos foram conduzidos de acordo com a Comissão de Ética no
Uso de Animais/CEUA (e-mail:[email protected]) da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, sob nº de protocolo 020/2014.
3.3 Teste Rápido (TR-DPP ®)
As amostras de soro canino foram testadas conforme instruções fornecidas
pelo fabricante, Teste Rápido (TR-DPP®), Bio-Manguinhos, Fiocruz. Sendo
considerado resultado negativo, o aparecimento de apenas uma linha: controle (C);
e resultado positivo, o aparecimento de duas linhas: controle (C) e teste (T).
3.4 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
A reação de ELISA foi realizada utilizando-se como antígeno formas
promastigotas de Leishmania infantum. Para a obtenção, as promastigotas foram
isoladas de cultura em meio Schneider, na fase exponencial de crescimento. Estas
formas foram tratadas com uma solução de NaOH, 0,15M e mantidas a 4oC sob
agitação durante 18h. A seguir a solução foi neutralizada com HCl 0,15 M e
centrifugada a 10.000 × g durante 30min à 4ºC, para coleta das proteínas solúveis
(Vitor and Chiari, 1987). A quantidade de proteínas foi dosada pelo método de
Bradford (Bradford, 1976) com leitura na absorbância de 562 m, tendo como
padrão a albumina sérica bovina (BSA), e posteriormente foi realizada a titulação em
30
bloco, visando definir a concentração mínima de proteínas para a sensibilização das
placas de ELISA. O antígeno, assim preparado, foi distribuído em alíquotas e
armazenado a -20oC até o momento de uso.
A reação de ELISA foi realizada de acordo com a técnica de Voller et al.
(1976) e os conjugados utilizados foram anti-imunoglobulinas de cão (anti-IgG total)
(Bethyl laboratories, EUA). Foram utilizadas microplacas de 96 poços de fundo
chato. Em cada orifício da placa foram adicionados 100l do Ag diluído
(concentração de 4,5 μg x mL) em uma solução tampão carbonato/bicarbonato pH
9,6, seguida de incubação de 18 a 24h, à 4ºC. Após a sensibilização, o excesso da
solução antigênica foi removido das microplacas, por uma série de quatro lavagens
com solução salina contendo Tween-20 a 0,05% (PBS-T). Em seguida, após a
adição de PBS contendo soro fetal bovino a 5%, as microplacas foram incubadas a
temperatura ambiente por 60 minutos. A seguir, foi adicionado 100L de soro de
cão, diluídos em PBS-T, na concentração de 1:360. As microplacas foram incubadas
novamente a temperatura ambiente por 1h. Após quatro lavagens, foram
acrescentados 100l do conjugado (anti-IgG total, anti IgG1, anti-IgG2), diluído em
PBS-T, nas concentrações de 1:40.000, 1:10.000 e 1:60.000, respectivamente. Após
incubação por 60min à temperatura ambiente, foram lavadas como descrito
anteriormente, e adicionados 100L do substrato TMB (KPL, Inc. Gaithersburg, MD,
EUA), por 10 minutos em temperatura ambiente, em local protegido da luz.
Posteriormente, foi realizado o bloqueio da reação utilizando 35μL de ácido sulfúrico
2M por poço. A leitura das placas foi realizada a 450ηm em espectrofotômetro,
sendo os resultados expressos em valores de absorbância. A reação foi considerada
positiva quando a leitura em densidade ótica foi maior do que a média, somada a
duas vezes o desvio padrão (Cut-off), do valor obtido de 10 soros de animais não
infectados pela Leishmania infantum/chagasi testados em paralelo aos soros
avaliados.
3.5 Extração de RNA e síntese de cDNA
A extração de RNAm e síntese DNAc foram realizadas no Laboratório de
Imunoparasitologia (LIP) e no Laboratório de Biologia Molecular de Doenças
Infecciosas e do Câncer (LADIC) do Departamento de Microbiologia e Parasitologia
e (DMP) do Centro de Biociências (CB) na Universidade Federal do Rio Grande do
31
Norte (UFRN). A extração de RNA total foi realizada a partir de amostras de tecido
hepático obtidas dos cães avaliados clinicamente, utilizando o reagente Trizol
(Sigma). Brevemente, para cada amostra, em tubos de microcentrifugação de
2,0mL, adicionou-se 500μL do reagente Trizol (Sigma) seguido de trituração com
auxílio de macerador automático. Posteriormente, adicionado 200µL de clorofórmio
(Sigma), as amostras foram agitadas durante 30 segundos, deixados 15 min a
temperatura ambiente e os tubos centrifugados a 12000g por 15min a 4C. A fase
aquosa foi transferida para novos tubos, e acrescentou-se 200µL de etanol 95%,
foram homogeneizados e transferidos para colunas. Em seguida foram centrifugados
a 12000g por 2 min a 4C, sendo desprezado o filtrado. Em seguida a foi
adicionado 400µL de RNA Wash solution e centrifugado a 12.000 g por 2 min a
4oC e desprezado o filtrado. Após isso, foram adicionados 50µL de solução DNAse
sobre a membrana de cada coluna, as quais foram incubadas durante 15 minutos
em temperatura ambiente. Seguidamente foi colocado 200µL de DNAse Stop
Solution e os tubos foram centrifugados a 12.000 x g por 2 minutos a 4°C.
Posteriormente, o filtrado foi desprezado e 500µL de RNA Wash Solution foram
adicionados às colunas, seguindo-se centrifugação a 12.000 x g por 2 minutos a
4°C. As colunas foram colocadas em novos tubos de microcentrifugação e sobre a
membrana da coluna foram acrescidos 20µL de Água Nuclease Free. Depois os
tubos de microcentrifugação contendo as colunas foram centrifugados a 12.000 x g
por 2 minutos a 4°C. O filtrado contendo o RNAm foi então armazenado a -70 °C até
a confecção do DNA complementar (DNAc).
Para a confecção do DNAc foi utilizado o Kit High Capacity cDNA Reverse
Transcription (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido), e seguida as
especificações do fabricante para preparação do mix para transcrição reversa do
RNAm para DNAc. Após acrescentar o mix de transcrição (10μL) e as amostras
(10μL) em tubos de microcentrifugação, as amostras foram levadas ao termociclador
com o primeiro passo (desnaturação) realizado em 25°C durante 10 minutos, o
segundo passo (anelamento) em 37°C durante 120 minutos e o terceiro passo
(extensão) em 85°C durante 5 minutos, e por fim o quarto passo (término) em 4°C
ao∞. O DNAc foi então armazenado a -20°C até a realização das reações de PCR
em tempo real.
32
3.6 Análise de PCR de citocinas, receptores da imunidade inata e iNOS
A expressão quantitativa de genes de citocinas, receptores (Toll e Nod) e
iNOS, foi analisada através de reações de PCR em tempo real, utilizando-se o
sistema SYBR Green e o aparelho ABI Prism 7000 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Para tal, foram utilizados iniciadores
específicos para as citocinas (IL-6, IL10, IL-12 IL-1β, TNFα, IFN-γ), os receptores do
tipo Toll (Tlr1, Tlr2, Tlr3, Tlr4, Tlr5, Tlr6, Tlr7, Tlr8, Tlr9), receptores do tipo Nod
(Nod1, Nod2, NLRP1 e NLRP3) e iNOS; com suas respectivas sequências
demonstradas na (Tabela 1). Os iniciadores específicos utilizados nas reações
foram sintetizados com auxílio de software apropriado (“Primer Express”, Applied
Biosystems). O cDNA (2,5ng/reação) sintetizado a partir do RNA mensageiro e
oligonucleotídeos específicos (1-2g/reação) foi utilizado juntamente com os
tampões de reação contendo “SYBR Green” (Applied Biosystems), como
determinado pelo fabricante. As condições das reações foram 2min a 50ºC, 10min
95 ºC, e 40 ciclos de 15s a 95 ºC e 1min a 56 ºC. Um ciclo final de 20min com
temperatura crescente de 60 a 95ºC para a obtenção de uma curva de dissociação
dos produtos da reação, utilizada para a análise da especificidade de amplificação.
As condições de PCR para cada primer utilizado foram padronizadas de acordo com
a concentração, temperatura de anelamento, ausência de formação de dímeros,
eficiência de amplificação dos genes alvos e controle interno (gene constitutivo). A
determinação dos níveis de expressão dos genes alvo foi realizada por meio da
normalização das amostras quanto à expressão constitutiva de GAPDH. Após a
normalização dos resultados baseado na expressão do gene constitutivo, a
expressão das proteínas estudadas foram calculadas baseada na fórmula 2-(Ct),
onde Ct=ct do gene alvo – ct GAPDH; Ct= Ct do gene alvo do grupo infectado -
média do Ct do grupo não infectado.
33
Tabela 1 - Sequências dos iniciadores específicos utilizados nas reações de PCR em tempo Real.
Iniciadores Direto Reverso Temp. de
anelamento
GAPDH
GAAAGGCGGGGCCAAGAGGG
GGTGGTGCAGGAGGCATTGCT
64.9
Cit
oc
ina
s e
iN
OS
IL-1β
TNF-α
IL-12
IL-6
IL-10
IFN-γ
iNOS
ACCCGAACTCACCAGTGAAATG
CCCAAGTGACAAGCCAGTAGCTC
ACCTGCAGCTGAAGCCATTG
TCTGTGCACATGAGTACCAAGATCC
TCTGTTGCTGCCTGGTCCT
TTCAGCTTTGCGTGATTTTG
GAGATCAATGTCGCTGTACTCC
GGTTCAGGTCTTGGCAGCAG
ACAACCCATCTGACGGCACTATC
GTCTTGTCCACGCAGAGTCT
TCCTGCGACTGCAAGATAGCC
TGATGTCTGGGTCGTGGTT
CTGCAGATCGTTCACAGGAA
TGATGGTCACATTTTGCTTCTG
60.9
62.8
59.8
58.6
58.6
55.7
58.1
Rec
ep
tore
s
do
tip
o T
OL
L
TLR1
TLR2
TLR3
TLR4
TLR5
TLR6
TLR7
TLR8
TLR9
GCCATCCTACCGTGAACCT
TCGAGAAGAGCCACAAAACC
GCAACACCCAGCTACACAGA
CCTCTTGTCATTGGATACACTAGCTT
TCGTGTTGACAGACGGTTATTT
CAACAACCCTTTGGGGAATA
TGGAAATTGCCCTCGTTGTT
TCAGCTACAATGCACACTACTTCC
ACTGGCTGTTCCTCAAGTCC
GCACTCAACCCCAGAAACTC
CGAAAATGGGAGAAGTCCAG
ATGTGGAAGCCAGACAAAGG
TGCTGTTGTCCTTGTTCCTTGA
TCCGGTTGAGGGAAAAGTC
CACCTTGACCTTGGGAGGTA
GTCAATGCATCGAAAGCTGA
ACGCTTCTCAGGTCTTGCTC
AGTCATGGAGGTGGTGGATG
59.7
57.8
58.8
59.3
56.9
57.8
55.7
60
59.8
Rec
ep
tore
s d
o
tip
o N
OD
NOD1
NOD2
NLRP1
NLRP3
GTCACTCACATCCGCAACAC
GCACATCACCTTCCAGTGTTT
CCTCTTTGGCCTTCTGAGTG
GCAATGCTCTTGAGAACACA
CCACGATCTCCGCATCTT
GGCCCATGACAAATGAAGA
CTGAACAGAGCCACACTGGA
AGAGCAGCATGACCCCTAGA
58.5
56.7
59.8
58.8
34
3.7 Análises Estatísticas
Os dados foram expressos em média ± desvio padrão da média e foram
avaliados quanto a normalidade utilizando o método de Kolmogorov-Smirnov. O
teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparação entre a expressão de TLRs,
NLRs citocinas e iNOS nos grupos assintomático, oligossintomático e sintomático.
As correlações foram determinadas pelo teste de Spearman. Foram consideradas
estatisticamente significativas as diferenças que apresentaram valores de P igual ou
menor a 0,05. Todos os testes foram realizados com nível de 95% de confiança e as
analises foram realizadas usando PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego
CA, EUA).
35
4 RESULTADOS
A análise sorológica realizada neste estudo utilizando 76 amostras de soro
canino, por meio do teste rápido TR-DPP e ensaio imunoenzimático (ELISA)
demonstrou que 57 amostras foram positivas para ambos e 19 amostras foram
negativos para L. infantum. Após o diagnóstico sorológico da infecção dos animais,
ocorre a eutanásia no Centro de Controle de Zoonoses (CCZ). Posteriormente foi
realizada a avaliação clínica dos cães oligossintomáticos e sintomáticos,
demonstrando que os sinais clínicos mais frequentes foram esplenomegalia (92,1%),
hepatomegalia (89,5%), onicogrifose (79,0%), lesões nas pontas das orelhas
(57,9%), emagrecimento (47,4%) e conjuntivite (44,7%) (Tabela 2) (Figura 3). Os
animais não infectados utilizados neste estudo foram obtidos no Centro de Controle
de Zoonoses e normalmente possuem histórico de agressividade contra os
proprietários.
Tabela 2 - Frequência das manifestações clínicas observadas em animais oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19) portadores de leishmaniose visceral canina provenientes do município de Natal-RN.
Fonte: Autoria própria.
Sinais Clínicos Nº de cães (38) (%)
Esplenomegalia 35 92,1
Hepatomegalia 34 89,5
Onicogrifose 30 79,0
Lesões nas pontas das orelhas 22 57,9
Emagrecimento 18 47,4
Conjuntivite 17 44,7
Dermatite Furfurácea 14 36,8
Alopécia local 11 29,0
Alopécia generalizada 11 29,0
Úlcera na pele 08 21,1
Opcificação da córnea 02 5,3
Edema
Parestesia de patas posteriores
01
01
2,6
2,6
36
A B C
D E F
Figura 03 – Sinais clínicos observados em animais portadores de leishmaniose visceral canina no município de Natal-RN. Opacificação da córnea (A), conjuntivite e emagrecimento (B), esplenomegalia (C), onicogrifose e dermatite furfurácea (D), alopecia generalizada (E), onicogrifose (F).
Fonte: Autoria própria
37
TLR1
0
2
4
6
8
10
CNExp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliz
ad
o p
ara
GA
PD
H)
TLR2
0
4
8
12
CN
TLR4
0
2
4
6
8
CNExp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
TLR5
0
2
3
4
CN
TLR6
0
2
3
CN
Oligossintomático
Sintomático
Assintomático
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
A) B)
C) D)
E)
*
*
**
**
*
TLR1
0
2
4
6
8
10
CNExp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliza
do
para
GA
PD
H)
TLR2
0
4
8
12
CN
TLR4
0
2
4
6
8
CNExp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
TLR5
0
2
3
4
CN
TLR6
0
2
3
CN
Oligossintomático
Sintomático
Assintomático
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
A) B)
C) D)
E)
*
*
**
**
*
4.1 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Toll de membrana celular
Na tentativa de compreender os mecanismos imunológicos que levam a
susceptibilidade na infecção por L. infantum, quantificamos a expressão de RNAm
dos TLRs expressos na membrana celular no fígado de cães naturalmente
infectados. A análise da expressão de RNAm demostrou que cães sintomáticos
apresentam aumento de todos os TLRs de membrana quando comparados aos cães
não infectados (Figura 4). Animais sintomáticos apresentaram maior expressão de
TLR1, quando comparado a cães oligosintomáticos e assintomáticos (Figura 4A).
De maneira interessante, cães oligossintomáticos e sintomáticos apresentaram
maior expressão de RNAm de TLR2 e TLR4 (relacionados a resposta imune
protetora contra Leishmania), quando comparado a animais assintomáticos e
aqueles não infectados (Figura 4B e 4C). Animais sintomáticos também
apresentaram maior expressão de RNAm de TLR5, quando comparado àqueles
assintomáticos (Figura 4D). Cães naturalmente infectados por L. infantum
apresentam aumento na expressão de TLR6, quando comparado a animais não
infectados. Porém não foi observada diferença na expressão de TLR6 entre os
animais sintomáticos, oligossintomáticos e assintomáticos (Figura 4E).
Figura 4 - Animais sintomáticos infectados com L. infantum tem alta expressão de TLR1, TLR2, TLR4 e TLR5 no fígado quando comparado a animais assintomáticos. Expressão de RNAm de TLR1 (A), TLR2 (B), TLR4 (C), TLR5 (D) e TLR6 (E) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05].
38
TLR1
0
2
4
6
8
10
CNExp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliz
ad
o p
ara
GA
PD
H)
TLR2
0
4
8
12
CN
TLR4
0
2
4
6
8
CNExp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliz
ad
o p
ara
GA
PD
H)
TLR5
0
2
3
4
CN
TLR6
0
2
3
CN
Oligossintomático
Sintomático
Assintomático
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliz
ad
o p
ara
GA
PD
H)
A) B)
C) D)
E)
*
*
**
**
*
Fonte: Autoria própria
4.2 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Toll intracelulares
Os resultados mostram o aumento na expressão do RNAm de todos os TLRs
intracelular em cães naturalmente infectados por L. infantum quando comparados
aos cães não infectados (Figura 5). Os cães sintomáticos apresentaram maior
expressão de TLR3, quando comparado a animais assintomáticos (Figura 5A). A
análise da expressão de mRNA demostrou que cães sintomáticos e
oligossintomáticos apresentam aumento na expressão de TLR7 (Figura 5B) e TLR8
(Figura 5C), quando comparado àqueles assintomáticos. Todos os grupos de cães
naturalmente infectados por L. infantum (assintomáticos, oligossintomáticos e
sintomáticos), apresentaram exacerbado aumento na expressão de RNAm de TLR9
(Figura 5D).
39
TLR3
0
5
10
15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
alizad
o p
ara
GA
PD
H)
TLR7
0
5
10
15
20
25
CN
TLR8
0
5
10
15
20
25
CN
Assintomático Oligossintomático Sintomático
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
alizad
o p
ara
GA
PD
H)
TLR9
0
5
10
15
20
CN
A) B)
C) D)
* **
**
FIGURA 5 - Animais sintomáticos infectados com L. infantum tem alta expressão de TLR3, TLR7 e TLR8 no fígado comparado com os animais assintomáticos. Expressão do RNAm de TLR3 (A), TLR7 (B), TLR8 (C) e TLR9 (D) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *p<0,05].
Fonte: Autoria própria.
4.3 Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo NOD
A análise na expressão de RNAm de receptores do tipo Nod demonstrou
aumento na expressão nos cães naturalmente infectados por L. infantum (Figura 6),
o mesmo padrão observado nos receptores do tipo Toll. Animais oligossintomaticos
e sintomáticos apresentaram maior expressão de NLRP1 e NOD1, quando
comparado aqueles assintomáticos (Figura 6A e 6C). Ainda cães sintomáticos
apresentaram maior expressão de NLRP3 que animais assintomáticos (Figura 6B).
Os animais assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos naturalmente
infectados por L. infantum apresentaram grande aumento na expressão de RNAm de
NOD2, quando comparado aqueles animais não infectados (Figura 5D).
40
NLRP1
0
5
10
15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliza
do
para
GA
PD
H)
NLRP3
0
5
10
15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliza
do
para
GA
PD
H)
A) B)
NOD1
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2
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6
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CN
Assintomático Oligossintomático Sintomático
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
NOD2
0
5
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15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliza
do
para
GA
PD
H)
C) D)
*
*
*
**
Figura 6 - Animais sintomáticos infectados com L. infantum tem alta expressão de NLRP1, NLRP3 e NOD1 no fígado quando comparado a animais assintomáticos. Expressão do RNAm de NLRP1 (A), NLRP3 (B), NOD1 (C) e NOD2 (D) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05].
Fonte: Autoria própria.
4.4 Expressão de RNAm de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α
Cães sintomáticos e oligossintomáticos apresentaram maior expressão de IL-
1β quando comparado a animais assintomáticos (Figura 7A). Animais sintomáticos
apresentaram menor expressão de RNAm de IL-6, em comparação aqueles animais
oligossintomaticos e assintomáticos (Figura 7B) Entretanto, cães sintomáticos e
oligosintomáticos apresentaram reduzida expressão de RNAm da citocina IL-12 em
relação a animais assintomáticos (Figura 7C). Todos os grupos de cães
naturalmente infectados por L. infantum apresentaram exacerbado aumento na
expressão de RNAm de TNF-α (Figura 7D).
41
IL-1b
0
5
10
15
20
CN
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
IL-6
0
5
10
15
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25
CN
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
IL-12
0
2
4
6
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CNExp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
Oligossintomático SintomáticoAssintomático
TNF-a
0
10
20
30
CN
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
A)
C)
B)
D)*
*
** *
*
Figura 7 - Animais sintomáticos infectados com L. infantum tem baixa expressão de IL-6, IL-12, e alta expressão de IL-1β no fígado comparados com animais assintomáticos. Expressão do RNAm de IL-1β (A), IL-6 (B) IL-12 (C) e TNF-α realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05].
Fonte: Autoria própria.
4.5 Expressão de RNAm de citocinas IL-10, IFN-γ e iNOS
A análise da expressão de RNAm demonstrou que cães sintomáticos
apresentam uma redução na produção de IL-10, IFN-γ e iNOS no fígado, quando
comparado àqueles assintomáticos (Figura 8). Animais assintomáticos e
oligossintomáticos apresentaram maior expressão da citocina IL-10, comparado aos
cães sintomáticos (Figura 8A). A expressão de IFN-γ nos animais sintomáticos e
oligosintomáticos estava extremamente reduzida, semelhante a expressão
observada em animais não infectados (Figura 8B). De maneira interessante, a
expressão de iNOS foi maior nos animais assintomáticos quando comparado a
animais oligossintomáticos e sintomáticos. Ainda, animais oligossintomáticos
apresentaram maior expressão de RNAm de iNOS quando comparado aqueles
42
IL-10
0
2
4
6
8
CNExp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
IFN-g
0
5
10
15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m(n
orm
aliza
do
para
GA
PD
H)
iNOS
0
5
10
15
CN
Exp
ressão
de R
NA
m
(no
rmaliz
ad
o p
ara
GA
PD
H)
Oligossintomático
Sintomático
Assintomático
A) B)
C)
**
**
*
**
sintomáticos, os quais apresentaram níveis reduzidos de iNOS semelhante a
animais controles não infectados (Figura 9C).
Figura 8 - Animais sintomáticos naturalmente infectados com L. infantum tem baixa expressão de IFN-γ, IL-10 e iNOS no fígado comparado com animais assintomáticos. Expressão do RNAm de IL-10 (A), IFN-γ (B) e iNOS (C) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05].
Fonte: Autoria própria.
4.6 Correlações entre a expressão de receptores da imunidade inata (TLRs e
NLRs), citocinas e iNOS com as manifestações clinicas da leishmaniose
visceral canina
Os resultados também indicaram que há uma correlação positiva entre o
número de sinais clínicos e os níveis de expressão de RNAm de TLR2 (Figura 9A) e
TLR4 (Figura 9B) no tecido hepático. Em contraste, a análise de correlação mostrou
que a expressão de IL-12 (Figura 9C), IFN-γ (Figura 9D) e iNOS (Figura 9E) foram
negativamente associadas ao número de sinais clínicos. A análise da correlação
entre os demais TLRs (1, 3, 5, 6, 7, 8, 9), NLRs e citocinas com o número de sinais
clínicos, e entre estes marcadores avaliados, não demonstrou resultados
estatisticamente significantes.
43
0 2 4 6 8 100
10
20
30
Número de sinais clínicos
Exp
ressão
de R
NA
m d
e T
LR
4
(no
rmalizad
o p
ara
GA
PD
H) r=0,4971
P=0,0007
0 2 4 6 8 100
5
10
15
Número de sinais clínicos
Exp
ressão
de R
NA
m d
e iN
OS
(n
orm
alizad
o p
ara
GA
PD
H)
r=-0,6661P<0,0001
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25
Número de sinais clínicos
Exp
ressão
de R
NA
m d
e T
LR
2
(no
rmalizad
o p
ara
GA
PD
H)
r=0,4588P=0,0017
A B
C
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20r=0,5931P=0,001
Número de sinais clínicos
Exp
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Número de sinais clínicos
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P=0,0122
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E
Figura 9 - A forma sintomática da leishmaniose visceral canina está correlacionada a alta expressão de TLR2 e TLR4, e a baixa expressão de IL12, IFN- γ, iNOS no fígado. Correlação entre o número de sinais clínicos em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19) e sintomáticos (n=19) e os níveis de expressão de RNAm de TLR2 (A), TLR4 (B), IL-12 (C), IFN- γ (D) e iNOS (E) realizado por meio de PCR em tempo real no tecido hepático. Os resultados estão expressos em gráficos de dispersão de valores individuais obtidos através da correlação de Spearman. As linhas conectoras representam os índices de correlação positiva e negativa.
Fonte: Autoria própria.
44
5 DISCUSSÃO
Durante um processo infeccioso, a geração da resposta imunológica
adequada é o ponto crucial que distingue entre o desenvolvimento dos padrões de
suscetibilidade, resistência ou tolerância (IWASAKI e PILLAI, 2014). Os mecanismos
desencadeados durante a infecção por parasitos do gênero Leishmania são
altamente complexos e influenciados pela genética tanto do parasito, quanto do
hospedeiro e também pelos componentes da saliva do inseto vetor. Muito embora
essa complexidade dificulte e retarde estudos para o desenvolvimento de vacinas,
por exemplo, houve um avanço significativo no entendimento da biologia da
interação Leishmania versus hospedeiro nos últimos anos (KAYE e SCOTT, 2011) O
sequenciamento do genoma de diversas espécies de Leishmania (PEACOCK et al,
2007), as análises da era pós-genômica (KAYE e BLACKWELL, 2008), o estudo das
interações com o vetor (DOBSON et al, 2010; SADLOVA et al, 2010), e a melhor
compreensão da imunologia e da biologia celular, bem como das interações entre o
parasito e seus diversos hospedeiros, são exemplos de pesquisas que tem permitido
contribuir para a construção desse conhecimento. No presente estudo, nós
buscamos entender o padrão de expressão de receptores da imunidade inata em
hospedeiros caninos naturalmente infectados com L. infantum e sua relação com o
desenvolvimento da doença.
Os receptores da imunidade inata reconhecem padrões moleculares
associados a patógenos, e ativam mecanismos de sinalização intracelular levando à
produção de citocinas e direcionando à imunidade adaptativa (TAKEUCHI e AKIRA,
S., 2010). Estudos sobre a importância de TLRs e NLRs na LVC são escassos e
preliminares. Em virtude desse importante papel desempenhado pelos receptores na
interface entre as respostas inata e adaptativa, e objetivando compreender os
mecanismos imunológicos que levam a modulação da produção de citocinas
protetoras contra à infecção por L. infantum em cães, nós investigamos o padrão de
expressão de RNAm de receptores da imunidade inata e citocinas em grupos de
cães assintomáticos, oligossintomáticos, sintomáticos e controles não infectados.
Nossos dados mostraram que a expressão de transcritos para TLR1, TLR5, TLR7 e
TLR8 foi regulada positivamente nos cães sintomáticos. Não há, entretanto, ligantes
de Leishmania descritos para esses receptores, e essa alta expressão em cães
sintomáticos portadores de LVC poderia ser estimulada por outras infecções
45
associadas. A debilidade imunológica dos animais sintomáticos permite a instalação
de diversas infecções oportunistas nos cães, como por exemplo a conjuntivite
bacteriana, muito frequente, o que poderia influenciar a expressão de TLRs não
relacionados ao reconhecimento de Leishmania. Por exemplo, o dímero TLR1-TLR2
reconhece PAMPs de bactérias gram-positivas; TLR5 reconhece a flagelina de
algumas bactérias gram-positivas e negativas; o dímero TLR7-TLR8 é responsável
pelo reconhecimento do RNA viral de fita simples (TAKEUCHI e AKIRA, 2010;
KAWAI e AKIRA, 2011). Estes PAMPs estão presentes em microorganismos que
causam infecções oportunistas concomitantes em cães imunologicamente
debilitados portadores de LVC, tais como cistites, infecções cutâneas na pele
causada por bactérias (piodermites), dermatites fúngicas (ex.: malasseziose),
pneumonias bacterianas, dermatofitoses, conjuntivite virais e bacterianas
(CAVALCANTI, et al, 2004; CAFARCHIA et al, 2008; MYLONAKIS et al, 2014;
ANDRADE et al, 2014; KRAWCZAK et al, 2015; DINCER et al, 2015).
De maneira interessante, os transcritos para TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9
também foram regulados positivamente no tecido hepático de cães sintomáticos.
Esses receptores já foram descritos como tendo papel no reconhecimento de
padrões moleculares presentes na Leishmania, em modelo murino e em células
humanas, em que auxiliariam a fagocitose do parasito e induziriam a produção de
TNF-α, IL-12 e NO (BECKER et al, 2003; KROFF et al, 2004a; KROFF et al, 2004b;
FLANDIN et al, 2006; SCHLEICHER et al, 2007). No modelo canino, entretanto, nós
acreditamos que a regulação positiva do RNAm desses TLRs se deve ao fato de os
animais sintomáticos apresentarem maior parasitismo hepático, quando comparado
àqueles assintomáticos (MAIA e CAMPINO, 2012; NASCIMENTO et al, 2015;
HOUSEIN et al, 2016), e o maior estimulo antigênico seria responsável pela maior
indução desses TLRs nesse grupo de animais, em um mecanismo de feedback
positivo. Corroborando essa hipótese, observamos que a elevada expressão de
RNAm para TLR2 e TLR4 foi correlacionada positivamente com o número de sinais
clínicos apresentados pelos cães. De fato, a alta expressão de TLR2 e TLR4 já foi
relatada no fígado, linfonodo, cólon e jejuno de cães portadores de LVC
(FIGUEIREDO et al, 2013; MELO et al, 2014a; HOUSEIN et al, 2015). Esses
mesmos TLRs estariam envolvidos com a fagocitose de L. donovani e atividade da
iNOS (Kropf et al., 2004a; Flandin et al., 2006). Ademais, a alta expressão de TLR2
46
e TLR9 correlaciona-se ao parasitismo hepático em cães experimentalmente
infectados por L. infantum (HOUSEIN et al, 2015).
Foi demonstrado também que o reconhecimento de moléculas de Leishmania
por TLRs estimula vias de sinalização intracelulares dependentes de MAPks e NFκβ,
regulando a produção de citocinas, ROS e NO, e, portanto, exerce papel no controle
do parasitismo (BECKER et al, 2003; VEER et al, 2003). Na leishmaniose visceral
provocada por L. donovani, foi observado que TLR9 é requerido para a ativação de
células NK (SCHLEICHER et al, 2007) e essencial na produção de IL-12 por células
dendríticas infectadas com L. infantum (SACRAMENTO et al, 2015). Também, a
ativação de células dendríticas na infecção por L. major é dependente de TLR9/DNA
a qual favorece o desenvolvimento de resposta Th1 e consequente resolução da
lesão (BOU FAKHER et al, 2009).
É notável que os TLRs desempenham um grande papel na proteção contra
infecções por Leishmania, incluindo a infecção por L. infantum em cães. Contudo os
mecanismos de inibição da sinalização desses receptores necessitam ser melhor
investigados para poder dar subsídios para o desenvolvimento de estratégias
profiláticas para o controle da LVC.
Outra classe de receptores da imunidade inata que pode atuar na reposta
imune durante a infecção por L. infantum em cães são os NLRs. Esses receptores
podem ser ativados tanto pelo reconhecimento de moléculas microbianas, quanto
por fatores endógenos liberados pelo tecido submetido à destruição (MEYLAN;
TSCHOPP e KARIN, 2006). Neste trabalho, a análise dos NLRs demonstrou que
cães oligossintomáticos e sintomáticos aumentam a expressão de transcritos para
NLRP1, NLRP3, NOD1 e NOD2 quando comparado aos controles não infectados,
assim como de IL-1β, cuja indução é mediada pelo inflamassoma. A ativação de
inflamassomas leva ao recrutamento de caspases inflamatórias, contribuindo
significativamente para o aumento da inflamação e pode causar lesão tecidual. Em
modelo murino foi demonstrado que a ativação do inflamassoma de NLRP3 leva a
restrição da replicação intracelular dos parasitos, devido a produção de IFN-γ e
processamento de IL-1β, conduzindo ao aumento na expressão de iNOS, enzima
relacionada com a restrição da replicação de Leishmania em macrófagos mediada
pela produção de NO (GREEN, 1990; MUKBEL et al, 2007; LIMA-JUNIOR et al,
47
2013). De maneira contrária, NLRP3 apresentou função patogênica na infecção de
camundongos Balb/c com L. major. Camundongos Balb/c nocautes para NLPR3,
ASC e CASP1 apresentam edema e carga parasitária reduzidos, quando comparado
a animais WT (selvagens) (GURUNG et al, 2015). Estudos sobre os mecanismos
envolvidos neste papel patogênico demonstram que a IL-18 promove a
sobrevivência da L. major por induzir ao perfil de resposta imune Th2 e produção de
IL-4 (GURUNG et al, 2015). Nossos dados mostraram que os cães
oligossintomáticos naturalmente infectados por L. infantum aumentam bastante a
expressão de RNAm para IL-1β porém a expressāo de NLRP3 permanece
semelhante aos animais assintomáticos. Esse dado pode ser explicado devido ao
fato de a expressão de RNAm de IL-1 β não ser dependente de inflamassoma,
somente a clivagem da proteína pró-IL-1β na proteína ativa IL-1β, pronta para ser
liberada. Shio e colaboradores mostraram que a GP63 de Leishmania inibe
diretamente a ativação de NLRP3 e secreção de IL-1β (SHIO et al, 2015).
Mecanisticamente, GP63 inibe a produção de ROS necessária para a ativação do
inflamassoma de NLRP3. Além disso, a GP63 também induz a clivagem de NLRP3.
Corroborando nossos dados, a infecção murina também aumenta a
expressão de NOD2, e a via de sinalização de NOD2-RIP2 em células dendriticas é
importante para a produção de IL-12 via fosforilação de MAPK, induzindo perfil de
células Th1, importante para controle da infecção (NASCIMENTO et al, 2016).
Nesse estudo, nós observamos que o fígado de cães sintomáticos
naturalmente infectados com L. infantum possuem alta expressão de transcritos para
TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR3, TLR7, TLR8), NLRP1, NLRP3 e NOD1,
porém baixa para IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ e iNOS, quando comparado com os cães
do grupo assintomático. Esse dado, aparentemente conflitante, traz à luz a
necessidade de se estudar e compreender melhor os mecanismos de modulação
das diferentes vias de respostas produtoras de citocinas, ativação da iNOS e
eliminação do parasito. Vale ressaltar a importância de verificar também: a
expressão da proteína, visto que a regulação positiva de vários transcritos pode
estar relacionada com vias compensatórias em virtude de possíveis mecanismos de
regulação da expressão proteica; é possível que polimorfismo pra IL10 esteja
envolvido ou fatores ligados ao reparo de DNA em uma fase anterior; além do que é
provável que os genótipos diferentes da L. infantum estejam envolvidos na
48
imunomodulação; tipos de raças dos cães, variabilidade individual no hospedeiro.
Estes são fatores plausíveis a serem especulados futuramente pelo nosso grupo de
pesquisa.
Ainda, parasitos do gênero Leishmania podem inibir diversas moléculas
participantes das vias de sinalização de TLRs, como mecanismos de evasão da
resposta imune, de modo que mesmo tendo aumento da expressão dos receptores,
sua sinalização é defeituosa devido mecanismos de regulação downstream (SACKS
e SHER, 2002). De fato, já foi descrito que a L. donovani modula a ativação da
MAPK p38 mediada pelo TLR2, suprimindo a produção de IL-12 e conduzindo ao
aumento do parasitismo e desenvolvimento da forma sintomática da LV (CHANDRA
e NAIK, 2008). Ainda, macrófagos e células dendríticas infectadas com Leishmania
são refratárias a ativação de TLR por LPS (OLIVIER et al, 2005; CAMERON et al,
2004; CARRERA et al, 1996). A glicoproteína GP63, presente em Leishmania,
medeia à ativação da proteína tirosina fosfatase (SHP-1) a qual se liga nas principais
quinases (a via JAK/STAT, e MAPKs) presentes na via de sinalização dos TLRs,
inibindo sua ativação (Revisado por ABU-DAYYEH et al, 2008). Assim, especula-se
que os cães portadores de LVC poderiam ter inibição nas vias de sinalização dos
TLRs, falha na ativação de macrófagos e comprometimento da resposta imune com
disseminação do parasito.
O conhecimento de que cães sintomáticos naturalmente infectados por L.
infantum exibem diminuição significativa da expressão do RNAm para IL-12, IL-10,
IFN-γ e iNOS no tecido hepático já é bem consolidado (CORREA et al, 2007;
HOSEIN et al, 2015; NASCIMENTO et al, 2015). O IFN-γ, em conjunto com TNF-α
induz a expressão da enzima iNOS em células de Kupffer infectadas e auxilia na
formação do granuloma hepático e ativação de mecanismos leishmanicidas pelas
células (STANLEY e ENGWERDA, 2007). A produção deficiente destas citocinas
nos órgãos alvo do parasito está relacionada com a progressão da leishmaniose
visceral canina e ao alto parasitismo (PINELLI et al, 1994; CORREA et al, 2007;
MAIA e CAMPINO, 2012; TURCHETTI et al, 2015; NASCIMENTO et al, 2015). Por
outro lado, cães naturalmente infectados com L. infantum apresentam altos níveis de
TGF-β e IL-10 no fígado, e estas citocinas foram detectadas em concentrações
maiores que o IFN-γ, sugerindo que apesar de serem encontradas citocinas Th1
(IFN-γ) nos grupos sintomáticos e assintomáticos há predominância de citocinas Th2
49
(TGF-β e IL-10) que determinam a progressão da doença e aparecimento dos
sintomas (CORREA et al, 2007).
Este estudo gerou novos conhecimentos envolvendo receptores da imunidade
inata (TLRs e NLRs) na leishmaniose visceral canina (LVC), podendo servir de base
para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ou susceptibilidade a
infecção por L. infantum em cães, bem como dar subsídio a estratégias profiláticas
para o controle da LVC.
50
6 CONCLUSÕES
A infecção natural por L. infantum conduz ao aumento na expressão de todos
os receptores do tipo Toll (TLR1-TLR9), do tipo NOD (NOD1, NOD2, NLRP1 e
NLRP3) no tecido hepático.
Cães sintomáticos apresentam maior expressão de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4,
TLR5, TLR7, TLR8, NLRP1, NLRP3, NOD1 e IL-1β no fígado. Entretanto, estes
animais apresentam baixa expressão de RNAm de IFN-γ, IL-12, IL-10 e iNOS no
fígado, que poderia ser consequência da inibição de algumas vias de TLRs e NLRs.
Por outro lado, a infecção assintomática em cães foi correlacionada a alta
expressão de RNAm de IFN-γ, IL-12 e iNOS, responsáveis por controlar o
parasitismo e evitar o desenvolvimento da leishmaniose visceral canina.
51
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ANEXO A