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LUCAS MIYAKE OKUMURA
INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS
DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS
DE Uncaria tomentosa Will DC.
CURITIBA
2008
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2LUCAS MIYAKE OKUMURA
INVESTIGAO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS
DE ARABINOGALACTANA-PROTENAS EXTRADAS
DE Uncaria tomentosa Will DC.
CURITIBA
2008
Projeto de monografia apresentado ao Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran, como requisito do grupo PET Farmcia. Orientadora: Professora Dra Juliana Bello Baron Maurer.Co-orientadora: Profa Dra Fabiola R. Stevan Hancke (Universidade Positivo)Colaboradores: Acad. Andreia Beraldo (Cincias Biolgicas - UPPR)Enf. Snia Hutul e Dr Rui Cepil (Programa de Fitoterapia de Londrina)Profa Dra Iara Taborda de Messias (Dep Patologia Mdica - UFPR)Profa Fernanda Bovo (Dep de Farmcia - UNICENTRO)
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3SUMRIO
1 TEMA............................................................................................................. 12 INTRODUO............................................................................................... 23 REVISO BIBLIOGRFICA......................................................................... 33.1 ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO,
PROPRIEDADES QUMICAS E FUNES BIOLGICAS DA AGP............................................................................................................... 3
3.2 MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA......................................... 43.2.1 Consideraes gerais sobre o sistema imune............................................... 53.2.2 Macrfagos.................................................................................................... 53.2.3 Sistema complemento................................................................................... 73.3 PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES
IMUNOMODULADORAS............................................................................... 83.4 MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa Will DC. (UNHA
DE GATO)...................................................................................................... 104 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS....................................................... 115 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 126 MATERIAIS E MTODOS............................................................................. 136.1 MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE.............................................. 136.2 EXPERIMENTOS BIOLGICOS................................................................... 13
6.2.1 Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal........................................ 146.2.2 Modelos experimentais utilizando macrfagos.............................................. 146.2.2.1 Obteno de macrfagos peritoneais............................................................ 146.2.2.2 Produo de xido ntrico.............................................................................. 156.2.2.3 Determinao da viabilidade celular e da contagem de clulas (Azul de
Tripan e MTT)................................................................................................15
6.2.2.4 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz..................... 166.2.2.5 Reteno de lisossomos................................................................................ 176.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento........................... 176.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho........................ 176.2.3.2 Avaliao da via alternativa........................................................................... 186.2.3.3 Avaliao da via clssica............................................................................... 186.3 Delineamento experimental e anlise estatstica..................................... 196.4 Aspectos bioticos e de biosegurana..................................................... 196.5 Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa Will DC. no
Programa de Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais ..................................................................
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7 CRONOGRAMA............................................................................................ 228 RECURSOS................................................................................................... 23REFERNCIAS............................................................................................................. 24ANEXO.......................................................................................................................... 29
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41 TEMA
O tema do projeto a ser desenvolvido a investigao das propriedades
imunomoduladoras de arabinogalactana-protenas (AGPs), extradas da Uncaria
tomentosa DC. (unha de gato), utilizando modelos animais in vitro.
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52 INTRODUO
Desde os primrdios, os povos antigos j faziam o uso de plantas para curar
feridas, doenas e infeces. Porm, na poca nada se sabia devido aos conceitos
primitivos sobre farmacologia alm da escassa tecnologia. Por isso, pouco se
compreendia sobre as molculas envolvidas nos processos biolgicos, e muito
menos sobre a sua estrutura (PAULSEN B. S., 2001). Com o avano da cincia,
novos mtodos de pesquisa foram criados e aperfeioados, e hoje, sabe-se que
certos constituintes de plantas, como polissacardeos e proteoglicanos, so
compostos bio-ativos no organismo. Estas substncias apresentam efeitos
biolgicos, como exemplo, a imunomodulao, a qual pode ter como resultado a
ativao ou supresso do sistema imune. Mleculas que atuam como moduladores
da resposta imunolgica so conhecidos como modificadores da resposta biolgica
(MRB). Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria por seus
ausentes ou diminudos efeitos colaterais. A avaliao da atividade bio-
farmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se tornado um
promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas.
Vrios exemplos de polissacardeos e glicoconjugados vegetais que
apresentam efeitos biolgicos como imunomoduladores j foram descritos (DIALLO
D. et al., 2000; CLASSEN B. et al., 2005; CLASSEN B., 2007, entre outros). Estes
estudos relataram o efeito biolgico imunomodulador, utilizando diferentes sistemas
animais, de arabinogalactanas, pectinas e/ou arabinogalactana-protenas (AGPs),
obtidas de espcies vegetais com interesse fitoterpico como, por exemplo,
Echinaceae purpurea Moench, Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitag., Malva
silvestris lus. nivea Priszter, Panax ginseng C. A. Mey, Plantago major L. e
Calendula officinalis Hohen .
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63 REVISO BIBLIOGRFICA
3.1 ARABINOGALACTANA-PROTENA (AGP): LOCALIZAO, PROPRIEDADES
QUMICAS E SUAS FUNES BIOLGICAS
Arabinogalactana-proteinas so uma famlia de proteoglicanas complexas,
includas no grupo de glicoprotenas vegetais ricas em hidroxiprolina (HRGPs),
encontradas em vegetais inferiores e superiores, de vrios grupos taxonmicos
(CLARKE et al., 1979). Em plantas superiores, as AGPs ocorrem em folhas, caules,
razes, orgos florais, sementes, e em grandes quantidades em troncos de algumas
angiospermas e gimnospermas (FINCHER et al., 1983). As AGPs esto presentes
em membranas celulares, na matriz extracelular e em gomas de exsudatos. Culturas
de clulas derivadas de diferentes tecidos vegetais produzem AGPs e as secretam
no meio de cultura (FINCHER et al., 1983; KREUGER & VAN HOLST, 1993).
Do ponto de vista estrutural, a poro glicdica (90% m/m) das AGPs
apresenta-se constituda, principalmente, de D-galactopiranose e L-arabinofuranose.
A cadeia principal constituda de unidades de -D-galactopiranose unidas por
ligaes do tipo O-3, O-6 e O-3,6, podendo estar substitudas por unidades de L-
arabinofuranose, podendo tambm apresentar outros monossacardeos menos
abundantes, como -L-Arap, -L-Rhap, -D-Glcp e -D-GlcpA, como extremidades
terminais no redutoras (FINCHER et al., 1983). Considerando a estrutura qumica
da poro glicdica, as AGPs so classificadas como arabinogalactanas tipo , que
correspondem as arabino-3-6-galactanas (FINCHER et al., 1983). Com relao
poro protica, as AGPs geralmente apresentam menos de 10% (m/m) de
contedo protico, o qual , usualmente, rico em hidroxiprolina/prolina (Hyp)/(Pro),
alanina (Ala), serina (Ser) e treonina (Thr) (CLARKE et al., 1979).
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7Tem-se atribudo s AGPs vrias funes como lubrificante, umectante e
agente de adeso, baseando-se na sua localizao extracelular e em suas
propriedades fsicas e qumicas (CLARKE et al., 1979; FINCHER et al., 1983).
Recentemente, tem-se relatado que as AGPs apresentariam vrias funes
relacionadas com o crescimento e desenvolvimento vegetal, tanto em nvel
vegetativo, como reprodutivo e celular (SERPE & NOTHNAGEL, 1996; MAJEWSKA-
SAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001). Vrios estudos sugerem que
as AGPs podem estar envolvidas, por exemplo, na formao de xilema, no
crescimento e na germinao do tubo polnico, nos processos de expanso e
proliferao celular, no estabelecimento de identidade celular, no controle de
embriognese somtica e da morte celular programada (SERPE & NOTHNAGEL,
1996; MAJEWSKA-SAWKA & NOTHNAGEL, 2000; SHOWALTER, 2001; MOTOSE
et al., 2004; PETTOLINO et al., 2006).
3.2 MODIFICADORES DA RESPOSTA BIOLGICA
Mleculas que atuam como moduladores da resposta imunolgica so
conhecidos como modificadores da resposta biolgica (MRB) (BOHN & BEMILLER,
1995). Os MRB podem atuar, por exemplo, na mediao da atividade de
macrfagos, do sistema complemento e nos mecanismos de adeso celular. Esta
importante classe de biomoduladores principalmente utilizada como agentes anti-
neoplsicos (BOHN & BEMILLER, 1995). Neste grupo esto includos frmacos que
atuam direta ou indiretamente sobre as clulas tumorais. O efeito indireto dos
biomoduladores est relacionado com a intensificao da resposta imunolgica a
clulas neoplsicas. Uma das vantagens da utilizao destes biomoduladores seria
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8por seus ausentes ou diminudos efeitos colaterais. Desta forma, a avaliao da
atividade bio-farmacolgica de molculas e novas descobertas de MRB tem-se
tornado um promissor campo na pesquisa das cincias biomdicas (BOHN &
BEMILLER, 1995; MORETO et al., 2003).
3.2.1 Consideraes gerais sobre o sistema imune
O sistema imunolgico dividido em dois grandes ramos: o sistema inato e o
adaptativo. O sistema inato caracteriza-se por responder aos estmulos de maneira
no especfica (ABBAS et al., 2003). Este composto por clulas, como neutrfilos,
eosinfilos, basfilos, moncitos, macrfagos e clulas NKs (natural killers), e por
fatores solveis, incluindo, o sistema complemento, protenas de fase aguda, e
enzimas (ABBAS et al., 2003). O sistema imune adaptativo caracteriza-se por
responder ao antgeno de modo especfico, apresentando memria, no qual, se
incluem as clulas linfcitos T e B e as imunoglobulinas (ABBAS et al., 2003). Essa
diviso didtica e elementos do sistema inato podem agir como efetores do
sistema adaptativo. Considerando os objetivos do presente projeto, sero
enfatizados aspectos mais relevantes sobre os macrfagos e o sistema
complemento.
3.2.2 Macrfagos
Os macrfagos tm um papel crtico na resposta imunolgica, pois, so
clulas efetoras importantes para a eliminao de microorganismos, exercendo um
papel central como mediadores entre o sistema imune inato e a adquirido. As
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9principais funes dos macrfagos demonstram que estes estariam envolvidos com
o processo inflamatrio, capacidade fagoctica, processamento e apresentao de
antgenos, co-ativao de linfcitos T e B, angiognese, processo de cicatrizao,
alm da atividade citotxica contra clulas tumorais e microorganismos (ABBAS et
al., 2003). O mecanismo microbicida utilizado pelo macrfagos, inclui duas vias
oxidativas, NADPH oxidase e oxido ntrico sintase, as quais, respectivamente, esto
envolvidas na sntese de nion superxido (O2-) e xido ntrico (NO) (ABBAS et al.,
2003). Os macrfagos tambm so capazes de produzir uma variedade de citocinas
como as interleucinas (IL), interferon (IFN) e fator de necrose tumoral- (TNF-). Os
macrfagos realizam essas funes efetoras somente depois que so ativados por
ligantes exgenos (p. ex, microorganismos) ou endgenos (p. ex, citocinas, clulas
tumorais). A expresso de uma grande diversidade de molculas de superfcie, ou
seja, vrias classes de receptores, capacita os macrfagos em reconhecer uma
variedade de ligantes tanto endgenos como exgenos (GORDON, 2002). Vrias
classes de receptores j foram identificadas (GORDON, 2002), cada classe
apresenta uma determinada especificidade e a interao entre o ligante e o receptor
tambm provocar uma resposta especfica. Apesar dos diferentes receptores
exercerem funes distintas, o objetivo final culmina na ativao de respostas
celulares convergentes. Vrias classes de receptores apresentam especificidade de
reconhecimento mediada por carboidratos. Pode-se sugerir que este tipo de
especificidade explicaria em parte, o efeito de vrios polissacardeos sobre
diferentes aspectos de ativao de macrfagos (SUZUKI et al. 1985; ARINAGA et al.
1992; JOHNSON et al. 1992; ROSS & VETVICKA, 1993; GORDON, 2002). Uma vez
que os macrfagos agem como clulas efetoras e mediadoras do sistema imune,
estudos visando a aplicao de molculas que modulem o aumento da funo
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macrofgica podem contribuir na teraputica de doenas infecciosas bacterianas e
neoplasias (POPOV et al., 1999).
3.2.3 Sistema complemento
O sistema do complemento compreende um grupo de, pelo menos, 18
protenas plasmticas que atuam em conjunto com o sistema imunolgico, na defesa
do organismo contra infeces ou invaso por substncias estranhas (ABBAS et al.,
2003). A reao do sistema do complemento ocorre em cadeia e completa a defesa
organizada pelo sistema imunolgico. Freqentemente, as protenas do
complemento conferem proteo imunitria, at que os anticorpos sejam produzidos;
o complemento tambm potencializa os efeitos da resposta dos linfcitos T e das
imunoglobulinas. Considerando, principalmente, os eventos de reconhecimento que
iniciam a ativao do sistema complemento, este dividido em trs vias, sendo
estas a via Clssica, Alternativa e da Lectina (ABBAS et al., 2003). Na via clssica
de ativao do complemento, esta ocorre em resposta ligao das
imunoglobulinas IgM ou IgG aos microorganismos invasores. A via alternativa de
ativao do complemento corresponde sua ativao pelos microorganismos cuja
superfcie tm antgenos protegidos por cpsulas de polissacardeos. Esta via
alternativa permite a fagocitose pelos macrfagos, independente da fixao dos
anticorpos. Outra via do complemento a via mediada por lectina, que ativada
pela ligao de uma protena ligadora de manose, nas superfcies de bactrias e
fungos. As trs vias levam ligao covalente de um fragmento particular de um
componente do complemento (fragmento C3b de C3) a superfcie do patgeno. Os
fragmentos do C3 so tambm opsoninas, molculas que podem ser reconhecidas
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pelos receptores de superfcies dos macrfagos. Os receptores C3R mediam a
interao entre os macrfagos e neutrfilos com os patgenos; assim, a
opsonizao de um patgeno pelo complemento facilita a fagocitose e a destruio
da mesma forma que a opsonizao com anticorpos (ABBAS et al., 2003). As
Arabinogalactanas tipo II, pectinas cidas, AGPs obtidas de diferentes plantas de
uso medicinal mostraram-se molculas moduladoras do sistema complemento
(YAMADA et al., 1985; CLASSEN et al., 2002; THUDE et al., 2006). Desta forma,
considerando que o sistema complemento um importante mediador do processo
de inflamao, a investigao da atividade biolgica de molculas que possam
modular o sistema complemento, mais especificamente, inibir a cascata de ativao
deste sistema, torna-se de grande relevncia teraputica para diversas doenas
como artrite reumtica e desordens degenerativas.
3.3 PLANTAS DE USO MEDICINAL E PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS
A utilizao de plantas com efeitos medicinais objetivando promover a cura de
doenas, vem desde pocas muito antigas. Recentes estudos indicam um aumento
no uso de plantas como medicamentos alternativos ou complementares aos
industrializados. A crise econmica, o alto custo das medicaes industrializadas,
alm dos efeitos colaterais causados pelas drogas sintticas, so alguns fatores que
contriburam para o aumento da fitoterapia (SIMES, 1989). considerado
fitoterpico toda preparao farmacutica (extratos, tinturas, pomadas e cpsulas)
que utiliza como matria-prima parte de plantas, como folhas, caules, razes, flores e
sementes, com conhecido efeito farmacolgico. O uso adequado dessas
preparaes traz uma srie de benefcios para a sade humana ajudando no
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combate a doenas infecciosas, disfunes metablicas, doenas alrgicas e
traumas diversos, entre outros. Associado s suas atividades teraputicas est o
seu baixo custo; a grande disponibilidade de matria-prima principalmente nos
pases tropicais; e a cultura relacionada ao seu uso.
Em relao aos componentes glicdicos presentes em plantas medicinais,
vrios estudos tm sugerido que as AGPs apresentam potenciais aplicaes na
medicina (PAULSEN, 2001; PETTOLINO et al., 2006). Tm sido descritos vrios
estudos relatando diferentes efeitos biolgicos imunomoduladores de AGPs
(PAULSEN, 2001 e 2002; CLASSEN, 2002; PETTOLINO et al., 2006). As principais
atividades biolgicas encontradas esto relacionadas com modulao da atividade
de macrfagos (fagocitose e liberao de citocinas), do sistema complemento e
atividade tumoral. Assim, importante destacar que apesar das vrias atividades
biolgicas relatadas, poucos trabalhos enfocam especificamente a atividade
biolgica de AGPs, exceo verificadas para as espcies vegetais Echinaceae
purpurea e Echinaceae pallida Britton (CLASSEN et al., 2000, 2002, 2005; THUDE
et al., 2006; PETTOLINO et al., 2006; CLASSEN, 2007). Outro fator de extrema
relevncia a falta da correlao entre a atividade biolgica observada e a estrutura
qumica das molculas testadas. Desta forma, imprescindvel a caracterizao
prvia da estrutura qumica de molculas a serem testadas para que possa ser
possvel estabelecer uma relao entre os eventuais efeitos biolgicos observados e
a estrutura qumica das molculas (BOHN & BEMILLER, 1995). Deve-se considerar
que aspectos relacionados estrutura da molcula, como composio
monossacardica neutra e cida, tipos de ligaes glicosdicas, presena ou
ausncia de ramificaes, presena e caractersticas de grupos substituintes,
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tamanho da massa molecular e conformao tridimensional, tm correlaes entre o
tipo de atividade biolgica e o grau de eficincia das molculas testadas.
3.4 MATERIAL VEGETAL EM ESTUDO: Uncaria tomentosa (UNHA DE GATO)
Esta planta medicinal, pertencente Famlia Rubiaceae, pode ser encontrada
em toda a amaznia peruana e principalmente nas bacias dos rios da selva central
do Peru. Apresenta vrias propriedades medicinais, sendo utilizada primariamente
pelos Incas e ndios locais da no tratamento de doenas como artrite, gastrite,
reumatismo e inflamaes em geral. A planta tambm benfica para o tratamento
de doenas reumticas e musculares, principalmente na terceira idade e indicada
no tratamento de enfermidades reumticas como a osteoartrite artrite reumatide.
Os princpios ativos de maior interesse so os alcalides oxindlicos pentacclicos
(rinocofilina, mitrafilina, isoteropodia A, pterodifina, isorincofilina e isomitrafilina) e os
compostos glicosdeos do cido quinvico que demonstram ser os responsveis
pelos efeitos antiinflamatrios. Atualmente, unha-de-gato est sendo estudada tanto
como agente microbiano como no tratamento de doenas como o cncer e Aids, em
razo de seu poder modulador do sistema imunolgico (BIESKI, 2006).
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4 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS
O objetivo geral desse projeto estudar as propriedades imunomoduladoras
de AGPs obtidas de Uncaria tomentosa. De forma mais especfica, os objetivos so:
1. Avaliar o efeito de AGPs sobre a atividade de macrfagos, avaliando
alteraes de morfologia celular e do burst respiratrio (produo de xido
ntrico e reteno e lisossomos);
2. Avaliar o efeito modulador de AGPs sobre o sistema complemento;
3. Correlacionar a estrutura qumica das molculas-teste com as atividades
biolgicas encontradas;
4. Coletar informaes sobre o conhecimento e a utilizao popular da Uncaria
tomentosa;
5. Coletar os dados sobre aplicao da Uncaria tomentosa na fitoterapia clnica;
6. Divulgar os resultados obtidos com o intuito de reforar a utilizao da U.
tomentosa como fitoterpico.
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5 JUSTIFICATIVAS
As plantas medicinais tm sido a base dos principais produtos indicados para
a sade desde a Antigidade. O reconhecimento do valor delas como recurso
clnico, farmacutico e econmico cresce progressivamente em vrios pases. O
Brasil um pas de grande biodiversidade vegetal. Alm disso, possui uma rica
diversidade tnica e cultural e detm valioso conhecimento tradicional relacionado
ao uso de plantas medicinais. Desta forma, considerando os vrios aspectos como:
(a) efeitos biomoduladores de AGPs encontradas na parede celular vegetal, como
mediadores do resposta imunolgica; (b) propriedades fisco-qumicas das AGPs,
como alta solubilidade em solues aquosas ou salinas; (c) relevncia na
descoberta de novos modificadores da resposta biolgica para uso na teraputica de
vrias doenas; (d) escassez de dados na literatura sobre as propriedades
imunomoduladoras de AGPs presentes na espcie vegetal Uncaria tomentosa
(unha de gato) e o conhecimento popular sobre essa planta sobre o seu uso como
fitoterpico; e finalmente (e) aspectos scio-econmicos da utilizao de plantas
medicinais. Ento de forma resumida, o presente projeto prope a avaliao da
atividade bio-imunomoduladora de AGPs, em modelos animais in vitro, respeitando
sempre os aspectos bioticos. Afim de reforar e/ou desmistificar o uso da Uncaria
tomentosa como planta medicinal de acordo com o uso popular.
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6. MATERIAIS E MTODOS
6.1 MATERIAL VEGETAL E AMOSTRAS-TESTE
O material vegetal da espcie Uncaria tomentosa (unha-de-gato) (raiz) ser
gentilmente cedido pela Fundao Herbarium, Colombo (PR).
O material vegetal in natura ser submetido extrao para obteno da
frao de protenas solveis (SPF), de acordo com a metodologia descrita por
SCHULTZ et al (2002). A frao SPF ser submetida precipitao seletiva com
reagente de Yariv (-glucosil)3 (GANE et al., 1995), para obteno da frao de
AGPs. O reagente de Yariv ser preparado de acordo com o mtodo de YARIV et al.
(1962).
Para os ensaios biolgicos, alm das fraes de AGPs da unha de gato,
tambm sero utilizadas como fonte AGPs, a goma arbica (Sigma Chem. Co.) e o
extrato de Echinacea purpurea L. Moench (Bioherb, Laboratrio Qumico
Farmacutico Tiaraju Ltda).
6.2 EXPERIMENTOS BIOLGICOS
O estudo da ativao do sistema imune por arabinogalactana-protenas ser
realizado com pesquisas bibliogrficas, reviso de artigos e prticas laboratoriais na
Universidade Positivo e Hospital de Clnicas. Os experimentos biolgicos sero
constitudos por uma anlise, detalhada a seguir, os quais verificam a
imunomodulao mediada por AGPs em macrfagos e eritrcitos. Vale ressaltar que
todos os procedimentos respeitaro os princpios bioeticos em todas as etapas.
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6.2.1 Procedimentos gerais utilizados no cultivo animal
Todas as solues utilizadas para o cultivo celular sero preparadas com
gua ultra pura ou bidestilada. Todo o material utilizado, como vidrarias e solues
aquosas no-termolbeis, ser esterilizado em autoclave a temperatura de 120C e
1 atm de presso por 30 min. A esterilizao das solues termolbeis, tais como
meio de cultura, sero realizadas por filtrao sob presso atravs de membranas
de acetato-nitrato de celulose (0,22 m).
6.2.2 Modelos experimentais utilizando macrfagos
6.2.2.1 Obteno de macrfagos peritoneais
Ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus) do biotrio da Universidade Positivo,
com aproximadamente trs meses de vida, pesando em torno de 300-350 g sero
utilizados para a obteno dos macrfagos peritoneais. Aps o sacrifcio dos animais
em cmara de gs, ser inoculado 10 ml de uma soluo estril de salina
tamponanda (PBS) mantida a 0C na cavidade peritoneal. As clulas do exsudato
peritoneal sero aspiradas e acondicionadas em tubos plsticos estreis, mantidos a
4 C at sua utilizao. As clulas sero centrifugadas por 1200 rpm por 7 minutos a
4 C e as clulas (pellet) sero ressuspensas em PBS estril. Para os experimentos,
a suspenso celular (105 clulas.ml-1) ser distribuda em placas de cultura estreis
de 24 poos com o meio de cultura essencial de Earle, na ausncia (controle) e na
presena das molculas-teste e, em seguida, as placas sero mantidas em estufa
incubadora de CO2 por 48 horas (MORETO et al., 2003).
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6.2.2.2 Determinao da contagem e da viabilidade celular (mtodos de Azul de
Tripan e do MTT)
Na determinao da viabilidade celular e da contagem das clulas, ser
realizada pela tcnica do corante vital azul de Tripan (PHILLIPS, 1973). Este corante
penetra apenas em clulas em que a membrana plasmtica perdeu sua integridade.
As clulas coradas portanto, so consideradas como no viveis. A suspenso de
clulas ser diluda 50 vezes em soluo salina tamponada (PBS), e contadas
utilizando cmaras de Neubauer e microscpio ptico. A soluo de Azul de Tripan
ser preparada a 0,4% (m/v) em PBS. Para cada ml da suspenso celular ser
utilizado 0,1 ml da soluo do corante. A percentagem de clulas viveis ser
calculada atravs da seguinte relao: % clulas viveis = n de clulas no
coradas/n de clulas totais x 100. Neste trabalho sero utilizadas somente as
suspenses celulares com viabilidade acima de 95%.
Outro mtodo para se determinar a viabilidade celular, ocorrer pelo mtodo
do MTT (brometo de (3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazlio, Sigma Chem.
Co., St. Louis, USA) ser realizada de acordo com a metodologia descrita por
REILLY et al. (1998). Segundo o princpio do mtodo, as clulas viveis e
metabolicamente ativas reduzem o sal tetrazlio, formando cristais de formazan
solveis em 0,1ml de DMSO, possuindo cor roxa caracterstica. Para anlise da
viabilidade as clulas sero incubadas por 3 h a 37 C em atmosfera de 5% CO2 em
180 ml de soluo balanceada de Hanks (HBSS) mais 20 ml de soluo de MTT a
500 mg.ml-1, de modo a obter-se uma concentrao final em MTT de 5 mg.ml-1. A
seguir, o excesso de MTT ser removido e os cristais de formazan formados sero
dissolvidos em DMSO. A leitura da absorbncia em 550 nm, com filtro de 655 nm
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como referncia, ser realizada em leitor de microplacas, utilizando-se o solvente
DMSO como branco (REILLY et al., 1998).
6.2.2.3 Produo de xido ntrico
A avaliao da produo de xido ntrico (NO) ser realizada indiretamente, a
partir da determinao da concentrao de nitrito, o qual um produto estvel da
reao de produo de NO no sobrenadante das culturas de macrfagos. Alquotas
de 100 l de cada sobrenadante sero centrifugadas (2000 rpm, por 5 min),
transferidas para placas de 96 poos e misturadas em igual proporo com o
reagente de Griess. Este reagente, na presena de nitrito, reage produzindo um
composto de cor lils. A densidade ptica (D.O.) de cada amostra ser ento
determinada em leitor de microplaca em 540nm. A concentrao de nitrito, presente
no sobrenadante das amostras ser calculada em relao a curva padro (10 M
80 M), utilizando como padro de nitrito de sdio diludo em meio de cultura
(MORETO et al., 2003).
6.2.2.4 Reteno de lisossomos
Para esta anlise ser utilizado o mtodo descrito por PIPE et al. (1995), onde
em uma placa do tipo ELISA ser depositado 100 l da soluo de macrfagos, 100
l de extrato nas respectivas diluies e 20 l de vermelho neutro a 2%. Aps 30
minutos, a placa ser centrifugada por 5 minutos a 1.500 rpm. O sobrenadante ser
descartado e os poos lavados com PBS para eliminar o vermelho neutro que no
ser internalizado pelas clulas. Posteriormente, 100 l de soluo de extrao ser
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adicionado para solubilizar o vermelho neutro que estava dentro dos lisossomos.
Esta solubilizao possvel porque o vermelho neutro um corante catinico que
se difunde atravs da membrana celular e, uma vez presente no lisossomo, fica
aprisionado devido mudana de cargas causada pelo pH cido do sistema
lisossomal. Finalmente, aps 30 minutos, a placa ser analisada a 550 nm utilizando
o espectrofotmetro (Microplate reader Bio-rad - Benchmark). Vale ressaltar que os
dados sero expressos em nm/ 2x105 clulas.
6.2.2.5 Tcnica de anlise morfolgica atravs da microscopia de luz
As lamnulas que sero obtidas dos poos sero fixadas com soluo de
Bouin, durante 5 minutos temperatura ambiente e rotineiramente coradas com
Hematoxilina-Eosina, Giemsa e Hematoxilina-Azul de Alcian. A montagem da lmina
permanente ser realizada com resina Entelan (CUNHA, 2006).
6.2.3 Modelo experimental para avaliar o sistema complemento Modelo experimental
utilizando eritrcitos
6.2.3.1 Preparo das suspenses de eritrcitos de carneiro e coelho
Para a avaliao da hemlise sero utilizadas suspenses de eritrcitos de
carneiro (via clssica) e de coelho (via alternativa). Para o preparo da suspenso de
eritrcitos de carneiro sero colhidos, por puno venosa, 5 mL de sangue de
carneiro em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo anticoagulante
Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos a 1000 g. Os eritrcitos do
-
21
pellet sero lavados trs vezes com tampo HEPES e aps a centrifugao final,
ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final de 0,6%. Para o preparo
da suspenso de eritrcitos de coelho foram colhidos, por puno cardaca, 5 mL de
sangue de coelho em tubos plsticos contendo o mesmo volume da soluo
anticoagulante Alsever. O material ser centrifugado por 15 minutos 1000 g. Os
eritrcitos do pellet sero lavados trs vezes com Tampo HEPES/EGTA com Mg+2
aps a centrifugao final, ressuspendidos no mesmo tampo na concentrao final
de 0,6%.
6.2.3.2 Avaliao da via alternativa
Alquotas de 100 l dos soros dos camundongos (grupos controle e teste)
sero incubados em tubos do tipo eppendorfs com 50 l da suspenso de
eritrcitos de coelho 0,6% em HEPES/EGTA com Mg+2, seguido da adio de 50 l
do mesmo tampo. Os tubos sero incubados durante 90 minutos a 37 C Os tubos
sero centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos e o sobrenadante transferido para
placas de fundo chato para posterior leitura a 405 nm.
6.2.3.3 Avaliao da via clssica
Para obteno de anticorpos anti - hemcias de carneiro, sero inoculados IP
em camundongos suos com peso entre 20-30g, 200 l de suspenso estril, de
eritrcitos de carneiro 2%. O soro desses animais ser obtido seis dias aps a
inoculao. O soro obtido ser incubado a 50C por 30 minutos para inativao do
complemento. Sero incubados em tubos do tipo eppendorfs 80 l dos soros de
-
22
camundongos (duplicata para cada grupo experimental) com 50l da suspenso de
eritrcitos de carneiro 0,6% em Tampo Hepes e ainda 50 l de anticorpo anti-
eritrcitos de carneiro diludo 1/10 em mesmo tampo. Os tubos sero incubadas
por 90 minutos 37 C e ento centrifugados a 2000 rpm por 3 minutos. O
sobrenadante transferido para placas de fundo chato para leitura a 405 nm. Os
resultados obtidos de ambas as vias (percentagem de inibioda hemlise) sero
comparados com soros controles incubados apenas som o veculo dos extratos
onde a hemlise ser considerada como 100% de hemlise (sistema complemento
100% ativado).
6.3 Delineamento experimental e anlise estatstica
Para os ensaios biolgicos em macrfagos, cada tratamento consistir de 10
repeties (1 repetio = 1 poo da placa de cultura). Cada experimento ser
repetido pelo menos duas vezes. Para os ensaios biolgicos utilizando eritrcitos
humanos, cada experimento ser realizado em duplicata sendo repetido pelo menos
quatro vezes. Para os experimentos de ensaios de hemlise, os experimentos sero
repetidos trs vezes para concentrao a ser escolhida. Todos os dados obtidos nos
ensaios com macrfagos, viabilidade celular e teste de fixao de complemento e
inibio de hemlise sero submetidos a anlise de varincia ANOVA. Para avaliar
as diferenas entre os tratamentos e controle ser utilizado o teste de Tukey, que
permite estabelecer a diferena mnima significante entre duas mdias. Os
resultados sero expressos como mdia desvio padro (mdia dp) sendo
considerados estatisticamente significativos os valores comparados ao nvel de
significncia de p0,05.
-
23
6.4 Aspectos bioticos e de biosegurana
As atividades referentes ao bio-ensaios utilizando animais de laboratrios ou
sangue humano sero realizadas respeitando os critrios exigidos pelo conselho de
tica e pesquisa da Universidade Federal do Paran.
6.5 Coleta de dados sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no Programa de
Fitoterapia de Londrina e sobre o conhecimento popular de plantas medicinais
A coleta das informaes sobre a utilizao da Uncaria tomentosa no
Programa de Fitoterapia de Londrina ser realizada empregando o uso de formulrio
ou questionrio semi-estruturado (MARTIN, 1995), destacando os aspectos com
relao s indicaes, modo de administrao, efeitos colaterais, contra-indicaes
e principais resultados obtidos. O pblico alvo para esta etapa ser os profissionais
envolvidos no Programa de Fitoterapia de Londrina.
A metodologia empregada para coleta de informaes sobre o conhecimento
e a utilizao popular da Uncaria tomentosa, incluir o uso de formulrio semi-
estruturado (MARTIN, 1995), abordando os aspectos como tipos de plantas
utilizadas e suas propriedades medicinais, tipos de doenas, o modo de
administrao e o conhecimento sobre efeitos txicos ou colaterais das plantas
utilizadas (Anexo 1).
O pblico alvo para esta etapa estaro localizados em centros comunitrios
ou associaes de bairro, de preferncia populao de adultos e idosos, os quais,
trazem consigo os conhecimentos populares adquiridos por herana. A escolha da
comunidade ser feita em momento oportuno.
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24
importante destacar que a divulgao das informaes tcnico-cientficas
sobre a Uncaria tomentosa, ou qualquer outra espcie medicinal no tero o
propsito de incentivar a automedicao, nem indicar qualquer forma de tratamento
de quaisquer doena, nem substituir ou alterar qualquer tratamento sem o
consentimento mdico. Todo o material bibliogrfico dever ser publicado ou
transmitido de acordo com as normas tcnicas das legislaes vigentes*.
*(http://www.anvisa.gov.br, ANVISA Resoluo - RE n 88, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004
Determina a publicao da "Lista de referncias bibliogrficas para avaliao de segurana e eficcia
de fitoterpicos", Resoluo - RE n 89, de 16 de maro de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a
publicao da "Lista de registro simplificado de fitoterpicos" Resoluo - RE n 90, de 16 de maro
de 2004 D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para a realizao de estudos de
toxicidade pr-clnica de fitoterpicos" Resoluo - RE n 91, de 16 de maro de 2004
D.O.18/03/2004 Determinar a publicao da "Guia para realizao de alteraes, incluses,
notificaes e cancelamentos ps registro de fitoterpicos", http://www.ibpm.org.br/legislao)
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7 CRONOGRAMA
PERODO DE EXECUO
ETAPA MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
Reviso bibliogrfica X X X X X X X X X X
Elaborao do projeto X X X X
Apresentao do projeto X
Preparo de materiais, solues e
reagentes
X X X X X X
Isolamento e caracterizao de
AGPs presentes em Uncaria
tomentosa
X X X X X
Experimentos biolgicos em
macrfagos: produo de xido
ntrico, reteno de lisossomos e
anlises morfolgicas
X X X X
Experimentos biolgicos em
eritrcitos: via clssica e via
alternativa do sistema
complemento
X X X
Anlises dos resultados e
redao de trabalhos cientficos
X X X X X
Coleta de informaes
etnobotnicas em comunidades
nativas e no programa de
fitoterapia
X X X
Elaborao da monografia X X X X X
Defesa da monografia X
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26
8 RECURSOS FINANCEIROS
Os equipamentos e reagentes dos experimentos sero todos cedidos pelas
instituies de ensino: Universidade Federal do Paran (Departamento de
Bioqumica e Biologia Molecular; Departamento de Patologia Mdica), Universidade
Positivo e UNICENTRO (campus Guarapuava).
-
27
REFERNCIAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular, 4a
Ed, Revinter, RJ, Brasil, 2003.
ARINAGA, S., KARIMINE, N., TAKAMUKU, K. et al. Enhanced production of
interleukin-1 and tumor necrosis factor by peripheral monocytes after lentinan
administration in patients with gastric carcinoma. Int. J. Immunopharmacol., v. 14,
p. 43-47, 1992.
BOHN, J. A.; BEMILLER, J. N. (13)--D-glucans as biological response modifiers: a review of structure-functional activity relationships. Carbohydrate Polymers, v. 28,
p. 3-14, 1995.
CLARKE, A.E.; ANDERSON, R.L.; STONE, B.A. Form and function of
arabinogalactans and arabinogalactan-proteins. Phytochemistry, v. 18, p. 521-540,
1979.
CLASSEN B, WITTHOHN K, BLASCHEK W Characterization of an arabinogalactan-
protein isolated from pressed juice of Echinacea purpurea by precipitation with the
beta-glucosyl Yariv reagent. Carbohydr Res 327:497504, 2000.
CLASSEN, B.; BLASCHEK, W. An arabinogalactan-protein from cell culture of Malva sylvestris. Planta Medica, v. 68(3), p. 232-236, 2002.
CLASSEN B, MAU S-L, BACIC A The arabinogalactanproteins from pressed juice of
Echinacea purpurea belong to the hybrid class of hydroxyproline-rich glycoproteins.
Planta Med 71:5966, 2005.
-
28
CLASSEN, B. Characterization of an arabinogalactan-protein from suspension
culture of Echinacea purpurea Plant Cell Tiss Organ Cult, v. 88, p. 267275, 2007.
CUNHA, M. M. Atividade imunomoduladora e produo de xido ntrico em
macrfagos intraperitoneais de ratos wistar, na presena de polissacardeos
de Anacardium occidentale Monografia (Cincias Biolgicas). Setor de Ciencias
Biolgicas e da Sade, Centro Universitrio Positivo, Curitiba, PR, 2006, 14 p.
GANE, A.M.; CRAIK, D.; MUNRO, S.L.A.; HOWLETT, G.J.; CLARKE, A.E.; BACIC,
A. Structural analysis of the carbohydrate moiety of arabinogalactan-proteins from
stigmas and styles of Nicotiana alata. Carbohydr. Res., v. 277, p. 67-85, 1995.
GORDON, S. Pattern Recognition Receptors Doubling Up for the Innate Immune Response Cell, v. 111, p. 927-930, 2002.
FINCHER, G.B.; STONE, B.A.; CLARKE, A.E. Arabinogalactan-proteins: structure,
biosynthesis, and function. Ann. Rev. Plant Physiol., v. 34, p. 47-70, 1983.
JOHNSON, H. M., RUSSELL, J. K., PONTZER, C. H. Superantigens in human
disease. Scientific American, p. 42-73, April 1992.
JOHNSTON Jr, R.B.; GODZIK, C.A.; COHN, Z.A. Increase superoxide anion
production by immunologically activated and chemically elicited macrophages. J.
Exp. Med., v. 48, p. 115-127, 1978.
KAJDACSY-BALLA, A.; DOI, E.; BAGASRA, O. Activation of factor B of the
alternative pathway of complement: Assessment by rocket immunoelectrophoresis.
Amer J. Pathol., v. 88, p. 66-73, 1987.
KREUGER, M.; VAN HOLST, G-J. Arabinogalactan proteins are essential in somatic
embryogenesis of Daucus carota L. Planta, v. 189, p. 243-248, 1993.
-
29
MAJEWSKA-SAWKA, A.; NOTHNAGEL, E. A. The multiple roles of arabinogalactan
proteins in plant development. Plant Physiol, v. 122, p.3-9, 2000.
MAYER, M.M. Complement and complement fixation. In: Experiment
immunochemistry. KABAT, E.A.; MAYER, M.M. (Eds). C.C. Thomas, Springfield, p.
133-154, 1973.
MESSIAS, I.T.; MOHREN, D.; KAJDACSY-BALLA. A inhibition of the classical and
alternative pathways of the humam complement system by glycosaminoglycan
polysulfate. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology, v.
4(4), p. 172-176, 1994.
MICHAELSEN, T.E.; GILJE, A.; SAMUELSEN, A.B.; HGSEN, K; PAULSEN, B.S.
Scan, J. Immunol., 2000, 52, 483.
MILGROM, H.; CURD, J.G.; KAPLAN, R.A.; MUELLER-EDERHARD, HJ.;
VAUGHAN, J.H. Activation of the fourth component of complement (C4):
Assessment by rocket immunoelectrophoresis and correlation with the metabolism of
C4. J. Immunol., v. 124, p. 2780-2785, 1980.
MORETO, M.; et al . Effect of an acidic heteropolysaccharide (ARAGAL) from the
gum of A. colubrina on peritoneal macrophages. Immunology Letters, v. 89, n. 2-3,
p. 175-185, 2003.
MOTOSE, H.; SUGIYAMA, M.; FUKUDA, H. A proteoglycan mediates inductive
interaction during plant vascular development. Nature, v. 429, p. 873-878, 2004.
PAULSEN, B. S. Plant Polysaccharides with Immunostimulatory Activities, Current
Organic Chemistry, v. 5, p. 939-950, 2001.
-
30
PLANT NAMES PROJECT. The Internacional Plant Names Index. Disponvel em:
Acesso em: 24 de jun. 2008.
PETTOLINO, F.; LIAO, M-L.; ZHU, Y.; MAU, S.L.; BACIC, A. Structure, function and
cloning of arabinogalactan-proteins (AGPs): an overview. Foods Food Ingredients
J. Jpn., v 211, p. 12-25, 2006.
PLATTS-MILLS, T.A.E.; ISHEZAKA, K.. Activation of the alternative pathway of
human complement by rabbit cells. J. Immunol, v. 113, p.348-358, 1974.
POPOV, S.V.; POPOVA, G.Y.; OVODOVA, R.G.; BUSHNEVA, O.A.; OVODOV, Y.S.
Effects of polysaccharide from Silene vulgaria on phagocytes. Int. J.
Immunopharmacol., Kidlington, v. 21, p. 617-624, 1999.
REILLY, T.P.; BELLEVUE, F.H.; WOSTER, P.M.; SVENSSON, C.K. Comparison of
the in vitro cytotoxicity of hydroxylamine metabolites of sulfamethoxazole and
dapsone. Biochem. Pharmacol., v. 55, p. 803-810, 1998.
ROSS, W. D., VETVICKA, V. CR3 (CD11b, CD18): a phagocyte and NK cell
membrane receptor with multiple ligand specificities and functions. Clin. Exper.
Immun., v. 92, p. 181-184, 1993.
SCHULTZ, C. J.; JOHNSON, K. L.; CURRIE, G.; BACIC, A. The classical
arabinogalactan protein gene family of Arabidopsis. The Plant Cell, v. 12, p. 1751-
1767, 2000.
SERPE, M. D.; NOTHNAGEL, E. A. Heterogeneity of arabinogalactan-proteins on
the plasma membrane of Rose cells. Plant Physiol., v. 112, p. 1261-1271, 1996.
SHOWALTER, A.M. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.
Cell. Mol. Life Sci., v. 58, p. 1399-1417, 2001.
-
31
SIMES, C. M. Plantas Medicinais Populares do Rio Grande do Sul. Porto
Alegre, Editora da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3 rd Ed., 1989.
SUZUKI, I., ITANI, T., OHNO, N. et al. Effect of a polysaccharide fraction from Grifola
frondosa on immune response in mice. J. Pharmacobiodynamics, v. 8, p. 217-226,
1985.
TAKADA, Y.; ARIMOTO, Y. MINEDA, H. TAKADA, A. Inhibition of the classical and
alternative pathways by amino acids and their derivatives. Immunology, v. 34, p.
1625-1630, 1978.
THUDE, S.; CLASSEN, B.; BLASCHEK, W.; BARZ, D.; THUDE, H. Binding studies
an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea to leucocytes. Phytomedicine,
v. 13, p. 425-427, 2006.
YAMADA, H.; NAGAI, T.; CYONG, J.C.; OTSUKA, Y.; TOMODA, M.; SHIMIZU, N.;
SHIMADA, K. Relationship between chemical structure and anti-complementary
activity of plant polysaccharides Carbohydr. Res., 1985,144, 101.
YARIV, J.; RAPPORT, M.M.; GRAF, L. The interaction of glycosides and saccharides
with antibody to the corresponding phenylazo glycosides. Biochem. J., v. 85, p. 383,
1962.
-
32
ANEXO
FORMULRIO PARA PESQUISA DE CAMPO ETNOBOTNICA E ETNOFARMACOLGICA DA UNHA DE GATO (Uncaria tomentosa Will DC.)
1. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADO N: ________________________1.1. Nome....................................................................................................................................................1.2. Sexo [ ] masculino [ ] feminino1.3. Endereo: R: .........................................................................Bairro: ..................................................1.4. [ ]rea urbana [ ] rea rural1.5. Religio ou Crena...............................................................................................................................1.6. Idade: .............anos 1.7. Profisso:.............................................................................................................................................1.8. Estado civil [ ] solteiro(a) [ ] casado(a) outro:............................................................................1.9. Idade e nmero de pessoas que vivem na mesma casa:......................................................................1.10. Local de Nascimento, cidade e estado:..............................................................................................1.11. Onde foi criado (a), cidade e estado: ................................................................................................1.12. Grau de instruo ou escolaridade: [ ] analfabeto [ ] alfabetizado [ ] 1 grau completo [ ] 2 grau completo [ ] 3 grau completo Outros:.......................................................................1.13. Renda familiar [ ] 3SM [ ] conta prpria*SM salrio mnimo
2. CONHECIMENTO GERAL SOBRE A FITOTERAPIA E PLANTAS MEDICINAIS2.1. Compare a alopatia com a fitoterapia, citando vantagens e desvantagens.
2.2. Voc acredita que o uso de plantas medicinais no tratamento complementar alopatia? Pode ser usado como terapia nica?
2.3. Voc conhece e utiliza alguma planta de carter medicinal? E a unha de gato? Cite a(s) outra(s).
2.4. Qual(is) a(s) doena(s) que voc conhece na(s) qual(is) utiliza o tratamento base de plantas medicinais ?
2.5. Cultiva alguma planta medicinal? Como cultiva essas plantas?
2.6. Voc acredita na fitoterapia? Voc acha que esta terapia seja utilizada no combate ou controle de alguma doena?
2.7. Como adquiriu informaes sobre o tratamento de sintomas ou doenas usando plantas?[ ] Com familiar que conhecia o assunto [ ] Em livros [ ] Experincia pessoal Outros:....................................................................................................................................................
2.8. Sabe qual a origem do conhecimento da pessoa que lhe ensinou, caso tenhaaprendido com algum?..........................................................................................................................
2.9. Ensina para outras pessoas? [ ]Sim [ ] NoComo:.....................................................................................................................................................
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33
3. CONHECIMENTO ESPECFICO DAS PLANTAS MEDICINAIS
Nome popular da planta
Descrio da planta(Como a reconhece)
Indicao no tratamento, contra-indicao e efeitos
colaterais (sintomas)
Parte utilizada da planta e melhor poca de
colheita*
Modo de extrao para no matar a planta (se
for raiz ou caule)
Freqncia e quantidade da dose administrada
Modo de preparo
Modo de Conservao
Observaes
* Estao do ano, fase da lua, hora do dia e/ou estado da florao
4. IDENTIFICAO DO ENTREVISTADOR4.1. Nome: ..................................................................................................................................................4.2.Idade:..............................................................4.3.Profisso:................................................................4.4. Contato:................................................................................................................................................