UN PO’ DI STORIA...
1900
- Riscoperta delle leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, che Mendel aveva pubblicato nel 1865 e che avevano come assunto l'esistenza di fattori discreti, elementen, i geni, che
determinano i caratteri e che si trasmettono da una generazione all'altra.
1902
- Sutton ipotizza che i fattori mendeliani, i geni, siano localizzati sui cromosomi.
1910-1911
- Morgan inizia a mappare i geni sui cromosomi del moscerino della frutta D.Melanogaster
1944
- Avery MacLeod e McCarty stabiliscono che il DNA è il materiale ereditario.
1953
- Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica per il DNA
1956- Viene stabilito che il patrimonio cromosomico completo dell'uomo è di 46 cromosomi.
1961-1966- Viene decifrato il codice genetico, ovvero stabilito il rapporto tra le 64 triplette possibili a partire
dalle 4 basi nucleotidiche del DNA, e i 20 aminoacidi che formano le proteine.
1967
- Mary Weiss e Green introducono la tecnica dell'ibridazione delle cellule somatiche che rende più agevole la mappatura dei geni umani.
1972
- Berg costruisce la prima molecola DNA ricombinante in vitro utilizzando gli enzimi di restrizione. Vengono realizzati con successo i primi esperimenti di clonazione del DNA.
1973
- Cohen, Chang e Boyer costruiscono il primo batterio ricombinante. Si tiene la prima conferenza sulla mappatura dei geni umani.
1974
- Cohen e Boyer ottengono l'espressione di un gene estraneo trapiantato in un batterio con la tecnica del DNA ricombinante.
1975- Si tiene la conferenza di Asilomar che propone una moratoria sugli esperimenti con il DNA ricombinante
in assenza di linee guida per la sicurezza delle manipolazioni genetiche.
1977- Per la prima volta un gene umano viene ricombinato e inserito in un batterio per clonare una proteina,
la somatostatina Sanger, già premio Nobel come inventore del metodo per sequenziare le proteine, sviluppa un metodo nuovo ed efficiente per sequenziare il DNA (contemporaneamente
Gilbert e Maxam inventano un metodo analogo).
1978- Boyer costruisce una versione sintetica del gene dell'insulina e lo inserisce in un batterio. La
Genentech, fondata nel 1976 dallo stesso Boyer insieme a Swanson, otterrà il permesso di commercializzare l'insulina prodotta per ingegneria genetica nel 1982 e quindi il brevetto
1978-1980- Vengono sviluppate nuove tecniche basate sull'ibridazione molecolare e l'utilizzazione come marcatori
delle variazioni individuali del DNA per mappare fisicamente i geni e le sequenze geniche sui cromosomi. Grazie alle nuove tecniche e alla collaborazione internazionale tra i mappatori, i geni
mappati passano da 579 nel 1981 a 1.879 nel 1991: tra questi vengono mappati il gene della corea di Huntington (1983), il gene per la distrofia muscolare (1987) e il gene per la fibrosi cistica (1989).
1980- Viene concesso il primo brevetto su una forma di vita geneticamente modificata, un microrganismo
che si nutre di petrolio. Mullis inventa la tecnica della PCR.
1981- Viene prodotto il primo animale transgenico.
1983- Viene inventato il primo sequenziatore automatico.
1989- Viene creato il National Center for Human Genome Research (NCHGR), guidato da James Watson per
mappare e sequenziare tutto il DNA umano entro il 2005
1992- Craig Venter crea l'Institute for Genomics Research.
1993- Francis Collins assume la direzione del National Human Genome Research Institute (ex NCHGR).
1995- Viene pubblicata la prima sequenza completa del genoma di un organismo vivente diverso da un
virus, il batterio Haemophilus influenzae.
1996- Viene riportato il sequenziamento completo del primo organismo complesso, il lievito
Saccharomyces cerevisiae.
1997- Viene costruito il primo cromosoma umano artificiale e annunciata la clonazione di un mammifero,
Dolly .
1986
- Viene proposto da diversi biologi molecolari, tra cui Renato Dulbecco, di sequenziare completamente il genoma umano.
1988- Viene concesso il brevetto per un topo transgenico altamente suscettibile al tumore del seno.
1998- Viene pubblicata una prima bozza della mappa del genoma umano, che mostra la localizzazione di più di
30.000 geni. Viene pubblicata la sequenza completa del primo genoma di un animale, il verme Caenorhabditis elegans. Venter e la Perkin Elmer Corporation fondano la Celera Genomics con l'intento di
sequenziare tutto il genoma umano in tre anni con il metodo del whole genome shotgun.
2000- Viene pubblicata la sequenza completa del genoma di Drosophila melanogaster e viene annunciato dalla Celera Genomics il sequenziamento di tutte le basi nucleotidiche del DNA umano con il metodo
whole genome shotgun.
Date storiche della sequenza del DNA
1869
Miescher osservaper la prima volta il DNA
1953Watson e Crick determinano lastruttura della doppia elica
1944Avery propone il DNA come materiale genetico
1965Holley sequenza il tRNAdi lievito
1970
Vengono sviluppate le tecnicheper la sintesi degli oligonucleotidi e perla degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l’elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA
1980 Il DNA genomico viene clonato nel fago M13o in vettori plasmidici, nascono i primi programmiinformatici di analisi dei dati, vengono sviluppatenuove tecnologie per il sequenziamento
1977
METODO SANGER(terminazione di catena)METODO MAXAM-GILBERT(degradazione chimica)
1986KARY MULLISIntroduce la PCR 1989
AUTOMAZIONE PARZIALEVengono sviluppate le prime apparecchiatureper il sequenziamento che impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza.
2000Automazione completaSequenziamento completodel genoma umano
Sequenziamento
Estrazione di DNA o RNA
PCR o amplificazione mediante clonaggio
Purificazione del campione di DNA
Cycle Sequencing
Precipitazione dei prodotti di cycle sequencing
Sequenziamento automatico
Analisi dei dati
Sequenziamento del DNA
Metodi tradizionali ed odierni
Metodi di Maxam-Gilbert e di Sanger
Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNAA singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base.Frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati mediante Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide.A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radioraficaSulla quale lascia impressa la disposizione delle bande.L’immagine ottenuta, letta di seguito darà la sequenza delle basi.
Il metodo Maxam-Gilbert(o metodo di sequenziamento a degradazione
chimica)
Questo metodo, basato sulla degradazione chimica di frammenti di DNA a doppio filamento, è ormai poco utilizzato, perché non adattoal sequenziamento automatico e perché utilizza composti chimici dannosi alla salute
Si differenzia da tutti gli altri metodi perché non utilizza sintesi enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi.
I frammenti di DNA a doppio filamento possono essere generati per frammentazione o digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento e marcate terminalmente
Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento
Denaturazione e separazione dei due filamenti
Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognunodei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o due delle 4 basi del DNA.
G = DMS + piperidinaG + A = DMS + piperidina + acido formico C + T = idrazina + piperidinaC = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M
Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia
Il metodo Maxam-Gilbert
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)
Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento
Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da
•Elevata processività•Bassa attività esonucleasica 5’-3’•Bassa attività esonucleasica 3’-5’
(es. Klenow, Sequenasi)
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)
un innesco specifico (primer)
La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
Uno stampo a singola elica ha bisogno di:
5’-A T C T T T T A G A G T A C C3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
PRIMER DNA Polimerasi
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
DNA PolimerasiPRIMER
Sintesi del filamento marcato
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
• uno stampo a singola elica
• un innesco specifico (primer)
• la marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S
ha bisogno di:
• una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegueindefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento
perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
Terminazione della catena
ddCTPddCTP
ddCTPddCTP
ddCTPddCTP
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
DNA Polimerasi
PRIMER
+ ddNTP ( per es. ddCTP)
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A T G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
STOP
Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni dCTP
DNA stampo a singola elica
3’-GGCTAAC
3’-GGCTAAC5’ 3’
Ibridazione conIl primer
+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi
ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP
-CCG ddA -ddC-C ddC
-CC ddG-CCGATT ddG
-CCGA ddT-CCGAT ddT
Sequenza: 5’-CCGATTG
A C G T
-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC
GT
T
AGCC
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
Direzione dilettura
Pratica ormai superata dal seq. automatico
Marcatura Radioattiva
Primer marcati con 32P oppure 35S dNTP
Colorazione Silver Staining
Evidenzia direttamente su gel le bande senza ulteriori modificazioni, attraverso la precipitazione di Ag
Sequenziamento manuale
Nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica)
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Il pirosequenziamento
1 Colorante - 4 Corsie
Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di estensione separate (una per ogni ddNTP) utilizzando un unico colorante
L’uso di 4 corsie aumenta però la variabilità di corsa
Sequenziamento automatico
4 Coloranti - 1 Corsia
Unica reazione ed unica corsa;
Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione:
ddATP
Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa
ddTTP
ddGTP
ddCTP
Sequenziamento automatico
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggioe caricare il tutto in un solo pozzetto di gel
ddA
ddC
ddT
ddG
Metodi di Marcatura
Marcatura dei Primers
primers progettati con “tag” colorati a:
Fluorescenza UV
Fluorescenza IR minore Background
maggiore Sensibilità
Marcatura dei Terminatori
ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti
Sequenziamento automatico
Terminatori BigDye
Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker
Vantaggi:
Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità
maggiore, facilità interpretativa per A e G
attigueD A
Sequenziamento automatico
Dalla cycle sequencingall’elettroforetogramma...
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colorediverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
Prevede l’utilizzo di marcatura a fluorescenza rilevata automaticamente da un laser
reazione e caricamento dei campioni sono eseguite manualmente
Esistono kits in commercio che permettono di velocizzare e standardizzare tali operazioni fornendo mix di reazione, soluzioni di poliacrilammide a cui aggiungere soltanto Temed o gel preformati
Sequenziatori a GelSequenziatori a Gel
Sequenziamento automatico
“slab” gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea)Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm-1 m)
Il forte campo elettrico a cui vengono sottoposti produce elevato calore che deve essere dissipato con piastre di alluminio o ventole
Gel per elettroforesi
l’intervento dell’operatore è minimo
il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa
esegue la separazione elettroforetica
i frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare
Sequenziatori Capillari Sequenziatori Capillari
Sequenziamento automatico
Sequenziatori Capillari
Richiede campioni privi di: sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati
1 Capillare
16 Capillari
96 Capillari
(Scala di Produzione)
Sequenziamento automatico
Sistemi di Rilevamento
Camera CCD ( Charge - Coupled Device)
Altissima risoluzioneImmagine Elettroferogramma Sequenza in pochi minuti
Assenza di Filtri
Uso di qualsiasi colorante
Camera a Lettura Multipla
Doppio Laser Doppio Rilevatore Es. NIR o SBS
Sequenziamento automatico
Software
Controlla e ottimizza i parametri elettroforetici Normalizza le bande Sottrae il backgroundCorregge l’effetto “Smile” Adatta gli algoritmi se mobilità e spaziatura dei picchi escono dal range
Sequenziamento automatico
Possibili Cause Possibili Soluzioni
• Il primer non trova sito di annealing
• Cambiare primer
• Il DNA presenta contaminazioni di vario tipo
• Ripreparare il DNA
• La quantità di DNA e' insufficiente • Aumentare la quantità di DNA
• La quantià di primer è insufficiente • Aumentare la quantità di primer
• Il primer è stato disegnato male, es. temperatura di melting troppo bassa
• Ridisegnare il primer
Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo
Possibili Cause Possibili Soluzioni
Campione che presenta rumore di fondo
sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi
da parte del software
• La quantità di DNA e' insufficiente e il segnale troppo debole
• Aumentare la quantità di DNA
• Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione
• Purificare meglio il DNA
• Ci sono altri templati contaminanti• Ripreparare il DNA
Possibili Cause Possibili Soluzioni
Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi
sono sempre meno definiti
• Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione
• Purificare meglio il DNA
Possibili Cause Possibili Soluzioni
• Clone o PCR multiple con stesso tratto iniziale, es. vettore
• Ripreparare DNA in modo da avere un tipo di templato unico
• Siti multipli di attacco del primer sul DNA • Cambiare primer
• Mutazione frame shift
• Slittamento dopo una regione omopolimerica
Sequenza doppia dopo un
tratto buono
Possibili Cause Possibili Soluzioni
Sequenza fuori scala
• Troppo DNA • Riquantizzare e ridurre la quantità di DNA
• Struttura secondaria che blocca la reazione
• Pretrattare con DMSO
Possibili Cause Possibili Soluzioni
Regione ricca in GC
• Struttura secondaria che impedisce l'avanzamento della polimerasi perchè, per effetto dell'alta Tm del tratto di DNA, i due filamenti non si separano bene
• Sequenziare un prodotto di PCR amplificato sostituendo il 75% del dGTP con 7-deaza-dGTP
• Modificare il ciclo standard di sequenziamento con temperature più alte
Sequenziamento automatico:
Applicazioni in ambito biomedico
Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage)
• Primer walking
• Shotgun sequencing
utilizzo di vettori di clonaggio
Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale
utilizzo di PCR
• Vettori fagici a singolo filamento
• Vettori plasmidici a doppio filamento
• Vettori fagomidici
• Vettori per grossi inserti di DNA
MappingTecnica del
“Chromosome Walking”
Sequenziamento di Library
Progetto Genoma
Sequenziamento Ex Novo
Uso di Primers Universali
Es. M13
Sfrutta l’Overlapping dei vari frammenti
Assemblaggio ed Allineamento delle sequenze tramite
Computer
Tecnica del “Random Sequencing”
Le finalità principali del progetto genoma riguardano l'acquisizione i informazioni utili per individuare l'eventuale implicazione di alterazioni nella sequenza del DNA nello sviluppo di patologie genetiche nell'uomo, e per comprendere le basi genetiche dell'evoluzione e del funzionamento dell'organismo umano
Sintesi di Oligonucleotidi
Probe per Microarray
Oligonucleotidi antigene/antisenso
analisi dell’espressione genica
farmacogenomica
SNPs
Dare un senso ai dati di sequenza non è facile!!
Isole CpG: la citosina può essere metilata nei geni inattivi
Sequenze di siti di splicing in 5’ e 3’:come marcatori per gli introni e le zone di confine con gli esoni
ORF:
mRNA CUUAGCGUAGCUACUAGACUAG
fase 1 CUU/AGC/GUA/GCU/ACU/AGA/CUA/G
fase 2 CU/UAG/CGU/AGC/UAC/UAG/ACU/AG
fase 3 C/UUA/GCG/UAG/CUA/CUA/GAC/UAG
Open readingframe
Perché sequenziare anche organismi diversi da Homo Sapiens?
Ad esempio per confrontare le sequenze altamente conservate, è più probabile che codifichino proteine funzionalmente importanti
Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage)
• Primer walking
• Shotgun sequencing
utilizzo di vettori di clonaggio
Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale
utilizzo di PCR
• Vettori fagici a singolo filamento
• Vettori plasmidici a doppio filamento
• Vettori fagomidici
• Vettori per grossi inserti di DNA
Comparativa e/o Mutazionale Uso Diagnostico
Implicazioni Terapeutiche
Applicazione non di routine
Monitoraggio pazienti in terapia
Test di Genotyping Es. HIV
Dimensione della mutazione
Genoma
Cromosoma
Gene
Poliploidie
Aneuploidie
Riarrangiamenti cromosomici
Piccole delezioni/duplicazioni
Delezioni/duplicazioni geniche
Delezioni/duplicazioni nucleotidiche
Mutazioni nucleotidiche
Bandeggio cromosomico
Fish di interfase
Fish cromosomica
Genetica molecolare
Sequenziamento
Mutazione di unsingolo nucleotide
Mutazioni per inserzione o delezione di nucleotidi in eterozigosi
Sequenziamento del tratto nucleotidico delle immunoglobuline (Ig) relativo al riarrangiamento della regione variabile CDR3 specifica del clone tumorale, da utilizzare in neoplasie linfoidi di tipo B per il monitoraggio della malattia minima residua e come base per la produzione di vaccini anti-idiotipici paziente-specifici.
Sequenziamento della VH-CDR3
Pession et al, Leuk Lymphoma 2003
Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo
CDR 3
REGIONI CHE DETERMINANO LA COMPLEMENTARIETA’
Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo
Montagna et al int.j of cancer 2004
Genotipizzazione del genoma virale del lentivirus HIV, responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita umana (AIDS)
una delle caratteristiche di questo virus è quella di andare in contro spesso a mutazioni casuali nel proprio genoma.
ne consegue la selezione di ceppi resistenti ai farmaci
HIV
ViroSeq Kit (Applied Biosystems Inc.)
TRUGENETM HIV-1 Genotyping Kit (Visible Genetics Inc)
Individuazione Resistenze farmaci in
pazienti non rispondenti
Software allinea sequenza con WT
Rileva Mutazioni
Accesso a Banca Dati
Regole che correlano singole o combinazioni di mutazioni al grado di resistenza per ogni
farmaco
HIV
Valutazione dello stato di metilazione di un gene ed in particolare del suo promotore
Tecnica del bisufilto
Il trattamento con bisulfito converte le citosine non metilate in timine
Le citosine metilate (quelle delle isole CpG) rimangono tali
Attenzione nel progettare i primers !! (escludere le parti con CpG)
Decitabina: demetilante inibendo la DNA metil-transferasi
Dott.ssa Formica, dott.ssa Dan, lab. Oncoped.
LAM in particolare con riarrangemento di MLL
The Human Genome Project htt p://w ww.nhgri.nih.gov
un sito dedicato al Progetto GenomaUmano gestito dal NHGRI ( TheNational Human Genome ResearchI nstitute)
GenBank htt p://w ww.ncbi.nlm.nih.govun sito in cui si possono trovaresequenze di DNA e di proteine.
EMBL htt p://w ww.ebi.ac.uk un sito dove sono raccolte lesequenze del genoma umano.
GDB (genome database): htt p://w ww.gdb.org/il più importante databaseconcernente la mappatura delgenoma.
dbESThtt p://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ index.html
raccoglie le sequenze parzialiott enute dai cDNA
OMI M (on-line MendelianI nheritance in Man)
accesso attraverso GDBcatalogo elett ronico di MendelianI nheritance in Man di VictoMcKusick, un elenco delle malattieumane ereditarie.
MGD (Mouse Genome Database) htt p://w ww.informatics.jax.orgdatabase del genoma murino,
Généthon htt p://w ww.genethon.fr/ mappa genetica basata sui marcatoricon ripetizioni (CA)n
CHLC (Co-operative Human LinkageCenter)
htt p://lp g.nci.nih.gov/CHCL/
database contenente una mappagenetica e dati riguardanti ilgenotipo e i marcatori genetici,contenente un programma perl’analisi di linkage
CEPHhtt p://w ww.cephb.fr/ bio/ ceph-genethon-map.html
mappa f isica del genoma umanobasato sugli YAC.
CELERAhtt p://w ww.celera.com/ il sito internet della società privata
americana diretta da Greg Venter
bibliografia sul progett o genomaumano
www.nature.com/genomics/0
Whitehead I nstitutehtt p://w ww-genome.wi.mit.edu/
mappa f isica del genoma umanobasata sugli YAC
Elenco dei siti che contengono informazioni sul Progetto Genoma Umano e sui frammenti di DNA sequenziati.
Il clonaggio dell’intero genoma umano non è difficile tecnicamente e sono disponibili genoteche in fagi od in cromosomi artificiali di lievito abbastanza ampie da contenere diverse volte il genoma umano; ma il DNA di queste genoteche è stato clonato in modo casuale dal genoma.
Perché abbia un senso il DNA in questi cloni deve essere strutturato nell’ordine corretto, in modo da poter ricostruire il genoma , o suoi frammenti che siano abbastanza ampi da contenere porzioni di sequenze biologicamente interessanti.
Sospetto clinico(sintomatologia, storia familiare)
Isolamento dal sangue perifericodi linfociti circolanti
Analisi delcariotipoEstrazione del DNA
Amplificazione tramite PCR
Diagnosicitogenetica
Southern blot
Corsa su gel SSCP
sequenziamentoRFLP
Creazione odistruzione di un sito di restrizione
diagnosi di delezioniinserzioni duplicazioni
identificazione di nucleotidi alterati
diagnosi di specifichemutazioni puntiformi