Download - Uma tarde com a microbiologia clínica
Pedro F. Del Peloso
Uma tarde com a microbiologia clínica
área do laboratório de microbiologia,
equipamentos e as legislações vigentes
Louis Pasteur 1885
1905
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https://www.youtube.com/watch?v=8KiR-
cxZE4w#t=273
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Biossegurança
Conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir
ou eliminar os riscos inerentes as atividades que possam
comprometer a saúde humana, animal ou vegetal e ao meio
ambiente
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Classe 2 Classe 3
Classe 4
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O PAPEL DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E A
IMPORTÂNCIA DA COLETA DE AMOSTRAS
Coleta de Amostras
Resultados / Correlação Clínica / Avaliação Médica
/ Tratamento
Programas de Controle de
Infecção Hospitalar/Vigilân
cia de Microrganismos
Isolamento rápido, Identificação e Teste de Sensibilidade de
microrganismos envolvidos em
processos infecciosos
LABORATÓRIO DE
MICROBIOLOGIA
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CONSIDERAÇÕES GERAIS
- Os resultados obtidos no Laboratório de Microbiologia dependem diretamente da qualidade da amostra clínica colhida e de um correto acondicionamento e transporte;
- O material obtido deve ser representativo do processo infeccioso;
- Durante a coleta deve ser evitada a contaminação com a microbiota normal de áreas adjacentes;
- Sempre que possível colher a amostra antes do uso de antimicrobianos;
- Fornecer ao paciente instruções claras sobre os procedimentos de coleta;
- Utilizar material de coleta estéril e realizar as práticas de anti-sepsia antes de iniciar a coleta;
- Colher volumes suficientes das amostras. Quantidades inadequadas podem levar a resultados falso-negativos;
- Identificar corretamente todas as amostras colhidas;
- Transportar as amostras colhidas imediatamente ao laboratório ou utilizar alternativas para o acondicionamento de amostras.
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REQUISIÇÃO DE EXAMES
E IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
Requisição de Exames
1. Nome do Paciente
2. Sexo; Idade
3. Localização do Paciente
4. Nome do Médico e Contato
5. Tipo de Amostra e Topografia da Coleta
6. Data e Hora da Coleta
7. Diagnóstico Clínico/Hipótese Diagnóstica
8. Observações da Coleta
9. Antibioticoterapia Prévia
Identificação da Amostra
Nome do Paciente:
Leito/Setor:
Data e Hora:
Amostra: 41
CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO DE AMOSTRAS
Amostras não recomendáveis para serem processadas:
- Amostras com erros de identificação ou discrepantes em relação ao pedido médico;
- Amostras obtidas em frascos não estéreis;
- Amostras acondicionadas ou transportadas de forma inadequada;
- Urinas colhidas em um tempo superior a 24 horas ou sem acondicionamento adequado;
- Ponta de Cateter de Foley;
- Swabs secos;
- Material fixado em Formol;
- Um único swab para vários exames;
- Cultura para anaeróbios colhidas inadequadamente;
- Vômito
- Amostras de colostomia;
- Swabs de úlcera de decúbito e de queimaduras. 42
TRANSPORTE DE AMOSTRAS
. Todo o material deve ser transportado o mais rapidamente
possível ao laboratório.
Objetivos principais de um correto transporte de amostras:
Garantir a viabilidade dos microrganismos;
Evitar a atividade bactericida de substâncias utilizadas durante a coleta;
Garantir resultados mais fidedignos, principalmente nas culturas quantitativas.
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HEMOCULTURAS
Cada instituição deve estabelecer seu próprio protocolo de coleta de sangue para hemocultura, variando em função do sistema de cultivo utilizado (manual, automatizado), além de fatores como idade e condição clínica do paciente.
Número de Amostras e Intervalo de Coleta:
Sepse Aguda: 2 a 3 amostras de sítios anatômicos diferentes.
Endocardite Aguda: 3 amostras através de coleta distintas e, preferencialmente em braços diferentes, com intervalo mínimo de 15 minutos entre elas.
Endocardite Sub-Aguda: 3 amostras em intervalos de, no mínimo, 15 minutos. Se negativas em até 24 horas, colher mais 3 amostras.
Febre de Origem Desconhecida: Obter 2 amostras em um intervalo de, no mínimo, 1 hora. Se negativas em 24-36 horas, repetir mais 2 amostras no intervalo de no mínimo 1 hora.
Fungemia: Obter 2 amostras com intervalo mínimo de 15 minutos.
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HEMOCULTURAS
Volume da Amostra:
Em geral, o volume corresponde a 10% do volume total do frasco utilizado para a coleta. A proporção entre o volume de sangue coletado e meio de cultura deve ser obedecida para não acarretar resultados falso-negativos ou falso-positivos.
Exemplificação:
* Crianças: 1 a 4 ml por frasco colhido
* Adultos: 5 a 10 ml por frasco colhido
O sangue para Hemoculturas pode ser venoso, arterial ou ainda colhido através de cateter quando assim for solicitado pelo médico.
As amostras de sangue destinadas à Hemocultura devem ser colhidas antes das
amostras destinadas aos outros setore e exames. A coleta não pode ser realizada com serigas heparinizadas.
Antes de iniciar a coleta, ter em mãos todos os materiais a serem utilizados.
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HEMOCULTURAS
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PONTA DE CATETER INTRAVASCULAR
Tipos indicados para cultura: Central, Swan-Ganz, Periférico, Arterial; Umbilical, Hiperalimentação, CVP, Hickman, Broviac.
Procedimentos para retirada do cateter:
1) Fazer rigorosa anti-sepsia da pele ao redor do cateter
2) Remover o cateter, cortar assepticamente 5cm da porção distal transcutânea, ou seja, a que estava mais profundamente introduzida na pele;
3) Colocar a ponta obtida em frasco estéril;
4) Encaminhar ao laboratório imediatamente para que seja minimizado o ressecamento do cateter.
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TRATO RESPIRATÓRIO:
ESCARRO
- Instruir o paciente: escarro x saliva
- Lavar a boca (bochechar e gargarejar) com água ou salina antes de iniciar a coleta
- Expectoração espontânea ou indução ultrassônica
- Frasco estéril, boca larga, tampa de rosca
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TRATO RESPIRATÓRIO:
SECREÇÃO TRAQUEAL
- Este material não é recomendado para o diagnóstico etiológico de pneumonias hospitalares, uma vez que o resultado microbiológico de secreções traqueais pode indicar apenas a colonização microbiana local, dificultando a correlação clínica.
- A coleta é realizada pela equipe médica em pacientes entubados através de procedimentos de aspiração.
- Aspirado Transtraqueal: Objetiva-se evitar a contaminação da amostra com flora do trato respiratório superior.
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www.med.umich.edu 50
Métodos de Coleta
Mini-BAL
Cateter Protegido
Kimberly-Clark Corporation
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Culturas Quantitativas ?
O diagnóstico das PAV sempre foi cercado de incertezas pela falta de um padrão de referência.
Revisão: Amostras de BAL, Mini-BAL, Sec. Traqueal, métodos de quantificação usados, tipos de equipamentos e avaliação nos critérios de “cutoff”.
A quantificação de uma amostra respiratória, é inerentemente instável por uma perspectiva matemática, dada a variabilidade do volume instilado e re-aspirado e a complexidade da área a ser analisada. (BAL, Mini-Bal, Sec. Traqueal ?)
Nós predizemos que as culturas quantitativas serão olhadas um dia como uma tentativa curiosa mas mal sucedida no diagnóstico de PAV CID 2006:43 (Suppl 2) • Fujitani and Yu
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Sec. traqueal
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Mini-BAL 4x10e5 UFC/ml
Stenotrophomonas maltophilia
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Diretriz na Microbiologia
1) Preferência por cultura quantitativa
2) (BAL, Cat. Protegido e Mini-BAL)
3) Solicitar preenchimento adequado do pedido médico
4) Indicação Clínica (PAV ?, PH ?, Rastreamento de MDR ?, Cultura
de Vigilância ? Rastreamento de Infecção ?
5) Integração com CCIH e Médico assistente
6) Dados da Epidemiologia local
7) Análise crítica na tomada de decisão com o maior número de
informações possíveis sobre o paciente e amostra (idade, uso de
antibiótico, método de coleta, tempo de internação, doença de
base, condições da coleta, etc.
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TRATO RESPIRATÓRIO:
LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)
- Método mais fidedigno para o diagnóstico de pneumonias, realizado pela equipe médica;
- Cultura Quantitativa;
- O transporte ao laboratório deve ser feito em até 2 horas após a coleta;
- Colher em frasco estéril (Tubo de Lukens ou similar); destinar um frasco em separado para a Microbiologia;
- Evitar a presença de sangue obtendo o LBA antes de realizar biópsias ou escovados pulmonares
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LÍQUIDOS ORGÂNICOS ESTÉREIS
Liquido Pleural/Pericárdico/Sinovial/Ascítico
- A coleta destes materiais é feita por procedimento médico através de punção percutânea ou cirúrgica;
- Obter a amostra em tubo estéril, sem aditivos ou ainda inocular diretamente em frascos de hemoculturas;
- Devem ser obtidos volumes suficientes para todos os tipos de cultura solicitados.
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SECREÇÕES DE FERIDA,
ABSCESSOS E EXSUDATOS
Procedimentos para Amostragem de Feridas Profundas ou Abscessos:
1) Desinfetar a superfície da pele
2) Aspirar a porção mais profunda da lesão, evitando a contaminação com a superfície da ferida.
- Feridas superficiais: Limpar as adjacências ao sítio de coleta com soro fisiológico e gaze estéreis, obter material de camadas não expostas em swab contendo meio de cultura.
- Vesículas: Obter o fluido.
É dada preferência à coleta por aspiração em seringa no lugar de um swab.
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TECIDOS
-O meterial deve ser colhido pelo médico assistente através de aspirado ou fragmento de biópsia. Amostras em swabs não fornecem boa representatividade do material;
- A amostra deve ser obtida por procedimeto médico específico e colocada em frasco estéril contendo solução salina fisiológica (NaCl 0,85%) estéril.
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BIÓPSIAS DE PELE E TECIDO SUBCUTÂNEO
Materiais colhidos através de procedimentos médicos específicos.
1) Desinfetar a superfície da pele
2) Obter fragmentos de 3 a 4mm;
3) Enviar ao laboratório em frasco estéril. Não adicionar Formol.
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SECREÇÃO DE OUVIDO
- Infecções externas (otite externa): limpar o canal auditivo externo com salina estéril e obter a amostra com swab estéril com meio de transporte
- Infecções profundas (otite interna): amostra colhida por timpanocentese
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URINA
Considerações Gerais:
- Amostras de urina nunca devem ser coletadas a partir de coletores hospitalares (“comadres”);
- Antes da coleta deve ser feita uma limpeza com água e sabão neutro da região genital externa para evitar contaminação com microrganismos que colonizam a área;
- As amostras devem ser processadas em até duas horas após a coleta. Em caso de demora, refrigerar (2 - 8°C).
Tipos de Amostras de Urina:
- Micção espontânea;
- Urina colhida por cateter;
- Punção supra-púbica.
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COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS PARA ANAERÓBIOS
- A coleta de amostras para germes anaeróbios deve ser feita evitando-se a contaminação com a flora normal endógena;
- O transporte de amostras deverá ser imediato (crítico), garantindo a manutenção das condições ideais dos microrganismos e minimizando a perda de viabilidade dos mesmos;
- A solicitação de Cultura para Anaeróbios deve ser claramente explicitada na Requisição Médica;
- O tipo de amostra ideal é aquela obtida por aspiração com agulha e seringa ou de fragmentos possivelmente infectados;
- A coleta por swabs é desencorajada, pois o material poderá estar contaminado por organismos da pele ou mucosa, além da amostragem ser relativamente pequena e os swabs estarem sujeitos a ressecamentos;
- Para coletas com swab, utilizar meios de transporte específicos (ex: atmosfera pré-reduzida);
- O material obtido através de punção/aspiração poderá ser enviado na própria seringa (com retirada de ar residual e sem agulha) ou ainda transferido para o frasco de hemocultura automatizada com anaerobiose (neste caso, o volume da amostra deverá obedecer as especificações do sistema utilizado).
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TECIDOS
-O meterial deve ser colhido pelo médico assistente através de aspirado ou fragmento de biópsia. Amostras em swabs não fornecem boa representatividade do material;
- A amostra deve ser obtida por procedimeto médico específico e colocada em frasco estéril contendo solução salina fisiológica (NaCl 0,85%) estéril.
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Comitê Brasileiro de Testes de
Susceptibilidade Antimicrobiana
BrCast
SBPC: Sociedade Brasileira de Patologia Clínica
SBAC: Sociedade Brasileira de Análises
Clínicas SBI: Sociedade Brasileira de Infectologia SBM: Sociedade Brasileira de Microbiologia
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A COLORAÇÃO DE GRAM E SEUS PRINCIPAIS
ACHADOS CLÍNICOS
ASPECTOS GERAIS SOBRE A COLORAÇÃO DE GRAM
1884 – Hans Christian Gram;
Um dos procedimento mais utilizados no Laboratório de Microbiologia;
Técnica de coloração utilizada para detectar bactérias e fungos, evidenciando suas características morfo-tintoriais;
São utilizados 4 reagentes: Cristal Violeta, Lugol, Descorante, Safranina (ou Fucsina Básica);
Fundamento baseia-se na habilidade da parede celular bacteriana reter o corante cristal violeta durante o tratamento com solvente.
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
A coloração de Gram tem uma relação e efeito diretos no tratamento do paciente;
Achados na coloração de Gram de fluidos estéreis são critérios para uma possível internação do paciente;
A escolha terapêutica inicial de antimicrobianos é guiada pelos resultados do Gram
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FUNDAMENTOS
- As bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas coram de maneira diferente em função da estrutura de suas paredes celulares;
- Gram-Positivas e Leveduras coram roxo escuro;
- Gram-Negativas coram rosa.
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RELATO DOS RESULTADOS
Deve ser observada e relatada a presença de células, bactérias e leveduras;
Utilizar terminologia sistemático-descritiva para os resultados de Gram;
Não é possível determinar a espécie bacteriana somente pela coloração de Gram. A identificação do agente etiológico requer Cultura e provas bioquímicas.
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CONTROLE DE QUALIDADE
Preparar lâminas para controle que contenham microrganismos Gram-Positivos de Gram-Negativos;
Estabelecer uma freqüência para as rotinas de controle de acordo com a demanda de seu laboratório (recomendação: semanal).
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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS
Morfologias Básicas – Gram-Positivas:
COCOS: Bactérias esféricas; representam vários grupos de relevância clínica:
1) DIPLOCOCO: cocos aparecem aos pares; podem ter formato alongado;
2) CADEIA: cocos formam cadeias de comprimento variado; os fragmentos da cadeia podem parecer diplococos;
3) TÉTRADE: grupos de exatos 4 cocos; também chamados de grupamentos ou cachos;
4) GRUPAMENTOS: grupos de cocos de número variável.
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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS
Morfologias Básicas – Gram-Positivas:
BASTONETES OU BACILOS: Retangulares, variam de comprimento, espessura e intensidades na coloração. Há 4 formas clinicamente significativas:
1) LONGOS E FINOS;
2) LONGOS E ESPESSOS (podem formar cadeias);
3) COCOBACILOS (possuem características entre cocos e bacilos; são bastões curtos);
4) RAMIFICADOS (longos e estreitos, podem apresentar coloração falhada).
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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
Morfologias Básicas – Gram-Negativas:
COCOS: Esféricos, podem se apresentar como:
1) COCOS (não formam cadeias ou grupamentos);
2) DIPLOCOCOS (aos pares, podem ter formato de “rim”).
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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
BASTONETES: Forma retangular, variam em comprimento, espessura e na intensidade da coloração. Há 4 formas de relevância clínica:
1) LONGOS E ESPESSOS (a coloração geralmente é uniforme, podem aparecer em pequenas cadeias);
2) COCOBACILOS (são muito curtos e estreitos – não confundir com os cocos gram-negativos);
3) CURVADOS (curtos, estreitos e curvados, podem formar cadeias);
4) FUSIFORMES (longos e estreitos com extremidades pontudas);
5) ESPIRALADOS (longos, estreitos, com muitas curvas).
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MORFOLOGIAS ENCONTRADAS NA COLORAÇÃO DE GRAM – LEVEDURAS
Esporos/Blastoconídios:
- Geralmente aparecem como brotamentos;
Pseudohifas:
- Aparecem como projeções alongadas das leveduras.
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Exemplo :TRATO RESPIRATÓRIO Bactérias Gram-Negativas
Haemophilus influenzae - Escarro
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URINA – Bactérias Gram-Positivas
Enterococcus faecalis 102
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ESwab – New Liquid Based Transport System for Microbiology
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Meio Cromogênico
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No Laboratório ......
Cef. 3ª g
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CIQ
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MRSA
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As Vantagens da Automação em Microbiologia
Conceito:
Automação (do latim Automatus, que significa mover-se por si) , é um sistema automático de controle pelo qual os mecanismos verificam seu próprio funcionamento, efetuando medições e introduzindo correções, sem a necessidade da interferência do homem.
Automação é a aplicação de técnicas computadorizadas ou mecânicas para diminuir o uso de mão-de-obra em qualquer processo, especialmente o uso de robôs nas linhas de produção. A automação diminui os custos e aumenta a velocidade da produção.
Também pode ser definida como um conjunto de técnicas que podem ser aplicadas sobre um processo objetivando torná-lo mais eficiente, ou seja maximizando a produção com menor consumo de energia, menor emissão de resíduos e melhores condições de segurança, tanto humana e material quanto das informações inerentes ao processo.
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E na Microbiologia ?
Semeadura
Bacterioscopias/BAAR
Incubação
Identificação e Teste de Sensibilidade
Hemoculturas
Culturas para Micobactérias
Culturas para Fungos
Diagnóstico Microbiológico
Correlação Clinica/Laboratorial
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Pilotar ou Conduzir ?
O termo pilotagem deve ser utilizado
quando a complexidade da condução é
maior.
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Gram
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Aerospray Gram™
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POLY STAINER 5300 automated system for Gram stain
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BAAR
Heating system for Ziehl-Neelsen hot
staining method
Auto Stainer, the heating function was
built in to fix sputum smear on a slide
automatically and to stain it with
heating. Temperature in the tray can be
controlled. Duration and level of
temperature can be preprogrammed. 126
BAAR
Using the new AFB-0010 with Rapid Modified
Auramine O (SDL), process time is reduced to two
minutes - fifteen seconds per test. This single slide
machine delivers quality and consistency for every test.
Counterstain quenches fluorescence of all non-acid fast
organisms and debris resulting in a cleaner field of
view. It is just as sensitive as other Auramine Stains.
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Semeadura Primária
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Semeadura Primária
Frascos ≠
Alças ≠ calibres
Câmera interna
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Vários volumes
de rotina
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AccuPAS
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Identificação e Teste de Sensibilidade
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Identificação
Qual método usar?
Qual é o seu Perfil?
Tamanho laboratório
Recursos financeiros disponíveis
Perfil de atendimento (hospitalar, ambulatorial, apoio)
Recursos humanos
Expertise
Acurácia e relevância clínica (rotinas manuais e automatizadas)
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64 wells gives more tests for greater
accuracy.
VITEK® 2 Compact
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WalkAway® plus System
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Phoenix 100 Instrument
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MALDI-TOF
2002
ionização por dessorção a laser assistida por matriz
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140
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1 hora !
2.000 espécies
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Custo ?? R$ 600.000,00
R$ 3,61
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Teste de Sensibilidade
Disco Difusão ou Microdiluição em Caldo
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Sistemas Automatizados e Semi-Automatizados
Os sistemas automatizados e semi-automatizados são aprovados pelo
FDA (EUA), baseados nas normas do CLSI (reprodutibilidade do
método >95%)
- O CLSI não recomenda nenhum sistema comercial
- Mas e o MIC ??
Gram-negative bacteremia and cefepime
28 d mortality, Cart-analysis
Prognostic and Outcome
Bhat et al, AAC 51:4390 (2007) 146
Vantagens
Painéis pré-definidos (Gram-negativos, Gram-positivos, Perfil Urinário)
Agilização de rotinas; redução das variáveis do método
Gerenciamento da rotina por software atualizado frente às normas do CLSI; Alertas; Customização
Screening de Resistência
Estatística Epidemiológica (Relatórios CCIH)
Gerenciamento de dados de CIQ
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Desvantagens:
Não pode ser considerada metodologia de referência
Falha na indicação de procedimentos prévios incorretos (microrganismos misturados; contaminações; erros técnicos);
Problemas no TSA de microrganismos fastidiosos (tempo e condições de crescimento)
Falta de acurácia em TSA para determinados microrganismos (P. aeruginosa, Acinetobacter spp, S. pneumoniae)
Necessidade de pessoal técnico especializado e com conhecimento avançado em Microbiologia
Falha na detecção de carbapenemases (KPC) marcador ERTA
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Detecção fenotípica de mecanismos de resistência
ESBL: Extended Spectrum Beta-Lactamase (Beta-lactamase de espectro ampliado - com
teste confirmartório)
Staphylococcus produtor de Beta-lactamase
MRSA: Methicilin (Oxacillin) Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus
resistente à meticilina (oxacilina/cefoxitina)
VRE: Vancomycin Resistant Enterococci (Enterococcus resistente à vancomicina)
HLAR: High Level Aminoglycoside Resistance (altos níveis de resistência a
aminoglicosídeos) – Gentamicina: HLGR; Estreptomicina: HLSR
Altos níveis de resistência a macrolídeos em estreptococos (Efflux/MLSb)
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VITEK 2 Card - A unique concept in ID/AST •Designed to provide ID/AST results in as little as 5 to 8 hours. (2) •Reduced hands-on time, no additional reagents are required. •Optimised user safety as it is a closed disposable. •Maximum traceability provided with the pre-applied card barcodes. •Lightweight reduces disposable costs
VITEK 2 Card - A unique concept in ID/AST
Designed to provide ID/AST results in as little as 5 to 8
hours.
Reduced hands-on time, no additional reagents are
required.
Optimised user safety as it is a closed disposable.
Maximum traceability provided with the pre-applied card
barcodes.
Lightweight reduces disposable costs
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•A broad menu of current antimicrobials to meet your formulary needs for clinically significant pathogens of gram-negative bacteria, staphylococci, enterococci and beta-streptococci •Visual confirmation of biochemical and susceptibility results for added confidence •PROMPT™* or turbidity inoculation method supports workflow
flexibility •Fits any laboratory workflow by offering either manual or automated processing on the autoSCAN®-4 and WalkAway® systems •Testing both ID and AST in one panel with our Combo format reduces workload •ID-only and MIC-only formats offer testing choice •Room temperature stability with 1-year shelf-life provides convenient storage •Offers extensive identification coverage of clinically significant gram-negative and gram-positive bacterial pathogens •ESBL confirmation on most gram negative panels
WalkAway® plus System
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Real MIC for 14 to 21 Drugs per Panel
Novo Painel 2013 – 8 diluições
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Hemoculturas
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Principais Vantagens:
- Padronização do método
- Maior sensibilidade
- Rapidez na detecção
- Monitoramento contínuo
- Protocolo menor (5 dias)
- Coleta com antibioticoterapia em curso
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Porinas - Efluxo Ativo - Enzima
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Interpretação???
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Obrigado !!
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