Download - Uji Enumerasi (Enumeration)
Acara II
ENUMERASI
LAPORAN RESMI PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI PANGAN
Disusun oleh :
Nama : Yeremia Adi Wijaya
NIM : 12.70.0152
Kelompok : E3
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATASEMARANG
2012
1. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui cara menghitung jumlah
koloni mikrobia dengan metode hitungan cawan (HC terdiri dari pour plate dan spread
plate) dan most probable number (MPN), mengetahui pengaruh pengenceran terhadap
jumlah koloni mikrobia, mengetahui perbedaan antara metode HC dan MPN,
mengetahui perbedaan antara pour plate dan spread plate, mengetahui fungsi dari
tabung Durham, mengetahui apa itu spreader, dan mengetahui mikroorganisme yang
dapat memecah LB.
2. TINJAUAN PUSTAKA
Teknik pengukuran secara kuantitatif suatu kultur mikroba yang digunakan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme didalam suatu media didefinisikan sebagai
enumerasi. Pengukuran ini kuantitatif sering diperlukan didalam berbagai macam
penelaah mikrobiologi dimana pengukuran kuantitatif dibagi menjadi dua yaitu :
penentuan jumlah sel yang digunakan untuk organism yang bersel tunggal dan
penentuan massa sel yang dapat dilakukan tidak hanya untuk organisme bersel tunggal
tetapi juga organisme berfilamen. (Hadioetomo, 1993, 72:163). Perhitungan jumlah sel
dibagi hitungan mikroskopik langsung, hitungan cawan (HC), Most Propable Number
(MPN) sedangkan penentuan massa sel dibagi menjadi perhitungan volumetric,
gravimetric dan kekeruhan (turbidimetri). (Fardiaz, 1992, 118:308).
1. Metode Hitungan Cawan (HC)
Metode hitungan cawan mempunyai prinsip dimana jasad renik yang masih
hidup ditumbuhkan didalam media agar, yang kemudian mikroba tersebut akan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata. (Fardiaz, 1992, 123 :
320). Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan
hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi
indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik
pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan
mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi
dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk
1
2
penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi
30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung
dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan bersangkutan. (Suriawiria, 2005, 101 : 172).
Hitungan cawan mempunyai kelemahan-kelemahan antara lain :
1. Hasil perhitungan tidak menunjukan sejumlah sel yang sesungguhnya
karena beberapa sel yang saling berdekatan mungkin membentuk satu
koloni.
2. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama.
3. Mikrobia yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas serta tidak menyebar
4. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang
berbeda.
(Fardiaz, 1992, 124:320)
Metode hitungan cawan dibedakan menjadi dua jenis yaitu metode tuang (pour
plate) dan metode permukaan (spread plate).
Metode pour plate
Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk
mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah
membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak
memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan
menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran
dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal. Pengeceran
yang umum dilakukan adalah 10-1 hingga 10-8, walaupun pada tipe sampe
tertentu jarak tersebut dapat dilanggar. Sebagai contoh air yang tidak keruh,
pengenceran maksimal yang diperlukan adalah 10-6 karena diketahui jika ada 10-
7 atau lebih bakteri per milliliter, air akan menjadi keruh. Pada metode ini
inokulum mikroorganisme dicampur dengan agar cair (45°C - 50°C) sehingga
bakteri tercampur relatif merata pada media padat. Meskipun demikian tidak
3
semua bakteri dapat hidup pada temperature 45°C, dimana hal ini menunjukan
kelemahan dari prosedur ini. (Harmita & Radji, 2008, 127:171)
Metode Spread Plate
Metode spread plate merupakan salah satu teknik dari hitungan cawan yang
dilakukan dengan cara menyebarkan sampel yang telah diencerkan diatas
permukaan pelat agar didalam cawan petri. Umumnya antara 0,1 ml dan 1 ml
sampel disebarkan dipermukaan media padat dengan menggunakan hockey stick
steril. (Harmita & Radji, 2008, 129:171).Dalam metode ini pertumbuhan dari
koloni dipermukaan medium lebih banyak dibandingkan dengan metode pour
plate dimana biasanya metode ini pertumbuhan koloninya terlihat lebih sedikit
dan pertumbuhan koloninya terdapat didalam mediumnya. Lebih banyaknya
kolomi didalam metode spread plate disebabkan karena sampel yang
mengandung mikroba dituangkan kedalam medium yang padat sehingga antara
medium dengan sampel tidak akan bercampur dan juga koloni mikroba hanya
akan terbentuk pada bagian atas agar padat maka dari itu, pertumbuhan mikroba
yang terdapat dalam metode spread plate dapat lebih mudah diamati dan untuk
metode pour plate mikroba yang terkandung dalam sampel dengan medium akan
bercampur (Suriawiria, 2005, 105:172).
Metode perhitungan dengan melalui pengenceran dan ditumbuhkan pada media
mempunyai keuntungan karena cara ini mudah dan murah tanpa harus menggunakan
peralatan yang khusus yang kadang mahal, serta dari koloni biakan yang tumbuh dapat
diteruskan untuk pengamatan atau penelitian lebih lanjut. Selain itu juga mempunyai
kerugian yaitu bahwa sel yang terhitung adalah masih hidup, sedang yang sudah mati
tidak terhitung. (Suriawiria, 2005, 101 : 172).
Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan dengan menggunakan Quebec colony
counter dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
(Fardiaz, 1992, 125:320).
npengenceraFaktorcawanperkoloniJumlahmlperKoloni
1
4
Didalam perhitungan pour plate dan spread plate ada yang disebut sebagai spreader
yaitu suatu kondisi dimana jumlah koloni yang terbentuk lebih dari 300 koloni. Koloni
dihitung menjadi satu koloni bila koloni yang bergabung menjadi satu atau merupakan
koloni besar dimana jumlah koloninya. Selain itu suatu rantai koloni yang membentuk
suatu garis tebal juga dapat dianggap sebagai satu koloni. Hal yang mempengaruhi
kondisi ini antara lain jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, maupun
tingkat keaseptisan lingkungan. (Waluyo,2010, 211:305).
2. Metode Mikroskopik Langsung
Merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengamati struktur sel yang masih
hidup maupun yang sudah mati. Sel yang akan diamati diletakkan pada
hemasitometer dan pengamatan dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop.
Metode ini biasa dilakukan dengan menggunakan coulter counter. (Hadioetomo,
1993, 72 : 163). Metode hitungan mikroskopik langsung dibagi menjadi dua yaitu
metode Petroff-Hauser dan metode Breed. (Fardiaz, 1992, 119: 320).
Keuntungan dari metode ini adalah :
Metode yang mudah dilakukan, cepat dan sederhana serta membutuhkan
peralatan yang sedikit.
Morfologi bakteri dapat diamati bersamaan saat dihitung.
Dapat digunakan untuk menghitung suspensi yang sangat padat
Kekurangan dari metode ini adalah :
Sel mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup
Sel yang berukuran sangat kecil sangat susah dihitung, dan dapat
terlewatkan
Presisinya susah dicapai
tidak cocok untuk sel dengan tingkat kepadatan yang rendah
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam bahan harus cukup
tinggi
(Fardiaz, 1992, 122-123 : 320)
5
3. Metode MPN (Most Probable Number)
Metode MPN merupakan metode dengan menggunakan medium cair dalam
tabung reaksi dan perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung reaksi
yang positif yang ditandai dengan tumbuhnya jasad renik setelah diinkubasi
pada suhu dan waktu tertentu. (Fardiaz, 1992, 126-127 : 320).
Media yang digunakan didalam metode ini adalah Lactose broth, dimana lactose
broth biasa digunakan untuk menumbuhkan dan mendeteksi keberadaan dari
bakteri koliform dan Salmonella dalam makanan, air, dan hasil ternak juga
digunakan untuk mendekteksi bakteri pemecah laktosa. (Merck & Darmstadt,
1998, 70 : 133). Didalam metode MPN didalam tabung reaksi biasa digunakan
tabung durham. Tabung Durham merupakan tabung yang mempunyai bentuk
yang serupa dengan tabung reaksi hanya mempunyai ukuran yang lebih kecil.
Dalam penggunaannya tabung durham diletakkan secara terbalik dalam tabung
reaksi. Bila mikroba yang ditumbuhkan didalam media tersebut menghasilkan
gas maka gas tersebut akan terkumpul dan tampak sebagai gelembung pada
tabung durham dimana gelembung atau gas. Gas yang biasa dihasilkan oleh
mikroba adalah CO2 dan H2 dan keberadaan gas CO2 inilah yang menyebabkan
kekeruhan. Kekeruhan dan keberadaan gas atau gelembung ini menunjukan
tabung reaksi yang positif. (Bartram & Pedley, 1996).
Contoh perhitungan metode MPN misalnya pada pengenceran pertama 3 tabung
menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran kedua tabung 2 tabung
positif, pada pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pada pengenceran terakhir
tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0, dan jika diambil 3
pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini
kemudian dicocokan dengna tabel MPN
Rumus yang digunakan didalam perhitungan MPN adalah :
MPN sampel = Nilai MPN dari tabel × 1pengenceran tabung tengah
(Waluyo, 2010, 213-214 : 305)
6
SPC (Standart Plate Count) merupakan suatu standart perhitungan yang biasa
digunakan didalam analisa mikrobiologi dimana Standart Plate Count menjelaskan
tentang cara perhitungan koloni dalam cawan serta pemilihan data yang ada yang
digunakan untuk menghitung suatu jumlah koloni yang ada didalam suatu contoh.
Aturan didalam melaporkan data sebagai SPC adalah :
1. Data yang dilaporkan harus terdiri dari dua angka
2. Apabila pengenceran yang dibuat menunjukan hasil kurang dari 30 koloni maka
hanya jumlah koloni yang terendah yang dihitung
3. Apabila pengenceran yang dibuat menghasilkan lebih dari 300 koloni maka
hanya pengenceran yang tertinggi yang dihitung.
4. Apabila hasil yang ditunjukan ada diantara 30 dan 300 dengan perbandingan
pengenceran tertinggi dan terendah sama dengan 2 atau lebih kecil maka yang
dihitung rata-rata dari kedua nilai pengenceran tersebut dan apabila
perbandingannya menunjukan lebih dari 2 maka pengenceran yang terkecil yang
dilaporkan
5. Bila menggunakan system duplo per pengenceran, data yang diambil harus dari
kedua cawan tersebut dan tidak boleh salah satu.
(Fardiaz, 1992, 126 : 320)
Pengenceran merupakan suatu peristiwa penurunan molaritas larutan dengan
penambahan volume larutan. (Chang, 2005, 108:433). Dalam perhitungan cawan
apabila bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per
ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan)
memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar dalam
cawan petri yang kemudian diinkubasi dan terbentuk koloni pada cawan dalam jumlah
yang dapat dihitung. Jumlah koloni yang baik adalah antara 30 hingga 300 koloni.
Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal seperti 1:10 atau 1:100 dan seterusnya
dimana hal ini dilakukan dengan tujuan untuk mempermudah perhitungan. semakin
tinggi seri pengencerannya maka akan tampak bahwa titik-titik koloni yang terbentuk
semakin jelas dan menyebar rata baik pada permukaan, di bawah, dan di dalam media
(Waluyo, 2010, 210:305). Larutan yang umum digunakan didalam pengenceran adalah
7
larutan garam fisiologi 0,85% atau larutan ringer, larutan buffer fosfat. (Fardiaz, 1992,
124 : 320).
Steril merupakan suatu keadaan dimana tidak adanya kontaminasi oleh mikroorganisme
yang tidak diharapkan baik pada peralatan maupun bahan yang digunakan didalam
percobaan mikrobiologi. (Suriawiria, 2005, 79:172).
Media NA (Nutrient Agar) Merupakan media pertumbuhan mikrobiologi yang
umumnya digunakan untuk budidaya bakteri non-fastidious, dan digunakan untuk
menguji air dan juga produk diary. Selain itu NA juga dapat digunakan untuk
menganalisa bakteri dalam air yang biasanya digunakan untuk mengisolasi bakteri
koliform. (Merck & Darmstad, 1998, 73 : 133). NA merupakan media padat yang
disebabkan karena adanya agar sebagai zat pemadat, selain itu NA juga tetap dalam
bentuk bentuk padat meski berada pada suhu yang relatif tinggi. Bakteri yang
ditumbuhkan pada media NA tumbuh pada bagian permukaannya dan tampak sebagai
koloni kecil. (Lapage et al, 1970, 4:357). Dalam Nutrient Agar mengandung : 0,5%
pepton, 0,3% ekstrak daging sapi, 1,5% agar, 0,5% NaCl dan mempunyai akhir pH 8,0
(Lapage et al, 1970, 117:357).
Media LB (Lactose Broth) biasa digunakan untuk menumbuhkan dan mendeteksi
keberadaan dari bakteri koliform dan Salmonella dalam makanan, air, dan hasil ternak
juga digunakan untuk mendekteksi bakteri pemecah laktosa. Lactose Broth memiliki
komposisi yaitu 10 gram pepton dan laktosa, 5 gram garam dapur, 3 gram ekstrak
daging sapi dan 0,02 gram bromocresol purple yang dilarutkan dalam 1 liter air suling.
Ekstrak daging sapi dan pepton digunakan sebagai nutrisi essensial untuk metabolisme
bakteri dan laktosa digunakan sebagai sumber karbohidrat. (Merck & Darmstadt, 1998,
70 : 133).
3. MATERI METODE
3.1. Materi
3.1.1. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi,
tabung durham, kapas, bunsen, korek api, cawan petri steril, pemanas elektrik, jarum
ose, vortex, kertas pembungkus, pipet, masker, colony counter, inkubator 30°C-32°C,
erlenmeyer, dan neraca.
3.1.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah aquades, alkohol, kultur Acetobacter
aceti, media NA cair, media Lactose Broth, air kolam udang.
3.2. Metode
3.2.1. Pengenceran Kultur
Mula-mula sebanyak 10 ml aquades yang sudah disterilkan ditambahkan kedalam
tabung reaksi bersama dengan kultur Acetobacter aceti kemudian tabung tersebut
divortex hingga didapatkan pengenceran 100. Dari pengeceran tersebut diambil 1 ml
kemudian dituangkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril lalu
divortex lagi dan didapatkan pengenceran 10-1 untuk kelompok 1. Lalu dari hasil
pengenceran 10-1 tersebut diambil lagi sebanyak 1 ml dan ditambahkan kedalam tabung
reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dan di vortex lagi sehingga didapatkan
pengenceran 10-2 untuk kelompok 2. Pengenceran dilanjutkan hingga mendapatkan
pengeceran 10-6 .
3.2.2. Metode Hitungan Cawan
3.2.2.1. Metode Pour Plate
Sebanyak 1 ml kultur Acetobacter aceti diambil dari masing-masing pengenceran dan
dimasukan kedalam cawan petri dan diputar-putar hingga merata. Kemudian media
yang sudah disterilkan dan duturunkan suhunya dituangkan kedalam cawan petri dan
diputar-putar hingga merata, setelah itu biarkan sejenak hingga medianya memadat dan
bungkus kembali dengan kertas buram. Setelah dibungkus, diinkubasikan pada selama
8
9
24 jam dengan posisi terbalik. Setelah proses inkubasi selesai amati dan hitung jumlah
koloni per ml dengan menggunakan rumus :
Koloni per ml = Jumlah koloni per cawan × 1Faktor pengenceran
3.2.2.2. Metode Spread Plate
Mula-mula tuangkan media LB kedalam cawan petri kemudian tunggu hingga
memadat. Setelah memadat ambil kultur Acetobacter aceti sebanyak 1 ml dari masing-
masing pengenceran dan dimasukan kedalam cawan petri, lalu cawan petri diputar-putar
untuk meratakan kulturnya lalu cawan tersebut dibungkus dengan menggunakan kertas
buram dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah proses inkubasi amati hasilnya dan
hitung jumlah koloni dan jumlah koloni per ml nya dengan menggunakan rumus :
Koloni per ml = Jumlah koloni per cawan × 1Faktor pengenceran
3.2.2.3. Metode Most Probable Number (MPN)
Mula-mula siapkan 9 buah tabung reaksi yang berisi media LB dan diisi dengan tabung
durham. Pada saat memasukan tabung durham pastikan tidak terdapat gelembung pada
tabung durham dan apabila terdapat gelembung maka percobaan harus diulang. Setelah
itu media disterilisasi dan diturunkan suhunya. Kemudian pada masing-masing tabung
ditambahkan 1 ml sampel air kolam udang; 3 tabung pertama diisi dengan pengenceran
10-1, 3 tabung kedua diisi dengan pengenceran 10-2, 3 tabung ketiga diisi dengan
pengenceran 10-3. Setelah selesai semua tabung tersebut diinkubasi selama 1 hari dan
keberadaan gelembung pada masing-masing tabung tersebut diamati. Apabila pada
10
tabung durham dengan pengenceran 10-1 hanya terdapat 1 gelembung maka pada hasil
pengamatan kolom 10-1 ditulis 1, apabila hasilnya terdapat 2 gelembung maka pada
hasil pengamatan ditulis 2 dan seterusnya. Setelah didapatkan hasilnya, ketiga angka
tersebut dicocokan dengan tabel nilai MPN untuk 3 seri tabung.
4. HASIL PENGAMATAN
4.1. Metode Spread Plate
Hasil pengamatan metode spread plate dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Metode Spread Plate
Kelompok Pengenceran Jumlah koloni/ml
E1 10-1 Spreader
E2 10-2 Spreader
E3 10-3 Spreader
E4 10-4 Spreader
E5 10-5 37 x 105
E6 10-6 11 x 106
Pada Tabel 1 dapat dilihat hasil perhitungan jumlah koloni per ml yang dilakukan oleh
kelompok E1 – E4 dengan menggunakan pengenceran 10-1 - 10-4 didapatkan hasil
spreader. Kelompok E5 dengan menggunakan pengenceran 10-5 didapatkan hasil 37 x
105. Kelompok E6 dengan menggunakan pengenceran didapatkan 10-6 hasil 11 x 106.
4.2. Metode Pour Plate
11
12
Hasil pengamatan metode pour plate dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Metode Pour Plate
Kelompok Pengenceran Jumlah koloni / ml
E1 10-1 Spreader
E2 10-2 Spreader
E3 10-3 Spreader
E4 10-4 Spreader
E5 10-5 117 x 105
E6 10-6 50 x 106
Pada tabel 2 dapat dilihat hasil perhitungan jumlah koloni per ml yang dilakukan oleh
kelompok E1 – E4 dengan menggunakan pengenceran 10-1 - 10-4 didapatkan hasil
spreader. Kelompok E5 dengan menggunakan pengenceran 10-5 didapatkan hasil 117 x
105. Kelompok E6 dengan menggunakan pengenceran 10-6 didapatkan hasil 50 x 106.
4.3. Metode Most Probable Number (MPN)
Hasil pengamatan metode most probable number (MPN) dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Metode Most Probable Number (MPN)
KelompokTabung Positif
MPN number
Keterangan
13
E1 3 3 2 53
Positif : keruh dan ada
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
E2 3 3 1 160
Positif : keruh dan ada
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
E3 3 2 1 150
Positif : keruh dan ada
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
E4 3 0 3 95
Positif : keruh dan ada
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
E5 3 2 0 93
Positif : keruh dan ada
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
E6 3 1 1 75 Positif : keruh dan ada
14
gelembung
Negatif : jernih, tidak
ada gelembung
Pada tabel 3 dapat dilihat bahwa pada kelompok E1 pada pengenceran 10-1 didapatkan
3 tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 3 tabung positif, dan pada
pengenceran 10-3 didapatkan 2 tabung positif dengan nilai MPN 53. Pada kelompok E2
pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada pengeceran 10-2 didapatkan
3 tabung positif dan pada pengenceran 10-3 didapatkan 1 tabung positif nilai MPN 160.
Pada kelompok E3 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada
pengenceran 10-2 didapatkan 2 tabung positif, pada pengenceran 10-3 didapatkan 1
tabung positif nilai MPN 150. Pada kelompok E4 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3
tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 0 tabung positif, dan pada
pengenceran 10-3 didapatkan 3 tabung positif nilai MPN 95. Pada kelompok E5 pada
pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada pengenceran 10-2 didapatkan 2
tabung positif, dan pada pengenceran 10-3 didaptkan 0 tabung positif nilai MPN 93.
Pada kelompok E6 pada pengenceran 10-1 didapatkan 3 tabung positif, pada
15
pengenceran 10-2 didapatkan 1 tabung positif, dan pada pengenceran 10-3 didapatkan 1
tabung positif nilai MPN 7.
5. PEMBAHASAN
Didalam melakukan praktikum enumerasi keaseptisan adalah salah satu hal yang perlu
diperhatikan dimana hal ini dilakukan dengan tujuan untuk menghindari terjadinya
kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan. (Suriawiria, 2005, 79:172).
Keaseptisan ini dapat dilakukan dengan menyemprotkan tangan dengan menggunakan
alkohol sebelum melakukan pengambilan kultur, menggunakan masker, dan selalu
mendekatkan tabung reaksi dan peralatan yang digunakan dekat dengan api bunsen.
Pada praktikum ini dilakukan tiga jenis percobaan yaitu metode pour plate, metode
spread plate dan metode most probable number (MPN). Berdasarkan pada teori yang
dikatakanoleh Fardiaz (1992, 118:308) yang mengatakan bahwa perhitungan jumlah sel
terdiri dari hitungan mikroskopik langsung, hitungan cawan dan most probable number
(MPN) maka dapat disimpulkan bahwa semua percobaan ini dilakukan untuk
menghitung jumlah sel.
5.1. Pengenceran Kultur
16
17
Pada percobaan ini mula-mula yang dilakukan adalah mencampurkan kultur
Acetobacter aceti dengan 10 ml aquades steril, setelah dicampurkan kemudian kultur
tersebut dipanen dengan menggunakan jarum ose yang sudah dipijarkan pada nyala api
bunsen dan dipindahkan pada tabung reaksi lain lalu divortex. Vortex dilakukan dengan
tujuan mencampurkan kultur tersebut dengan aquadesnya. Pada saat pemanenan kultur
dilakukan secara aseptis untuk mencegah terjadinya kontaminasi, pemanasan jarum
osepun dilakukan dengan tujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Setelah
divortex maka akan didapatkan pengenceran 100. Dari pengenceran 100 tersebut
diambil 1 ml dan pindahkan kedalam tabung reaksi yang sudah berisi aquades steril 9
ml kemudian di vortex. Setelah divortex maka akan didapatkan pengenceran 10-1 dan
dilanjutkan hingga 10-6. Prosedur pengenceran yang dilakukan ini sesuai dengan teori
yang dikatakan oleh Chang (2005, 108:433) yang mengatakan bahwa pengenceran
merupakan suatu peristiwa penurunan molaritas larutan dengan penambahan volume
larutan. Pengenceran yang semakin rendah ini dilakukan dengan tujuan supaya koloni
bakteri dapat terlihat lebih jelas sesuai dengan teori yang dikatakan oleh Waluyo (2010,
210:305) yang mengatakan bahwa semakin tinggi seri pengenceran maka titik koloni
18
yang terbentuk akan tampak semakin jelas dan menyebar rata baik pada permukaan,
dibawah maupun didalam media. Selain itu pengenceran yang dilakukan juga
menggunakan desimal sesuai dengan yang dikatakan oleh Fardiaz (1992, 124:308) yang
mengatakan bahwa pengenceran umumnya dilakukan secara desimal.
5.2. Metode Hitungan Cawan
Didalam metode hitungan cawan ini percobaan yang dilakukan adalah dengan metode
pour plate dan spread plate. Kedua metode ini dilakukan karena menurut Fardiaz (1992,
124-125:320) menyatakan bahwa metode hitungan cawan (HC) dibagi menjadi dua
yaitu metode pour plate dan metode spread plate.
Menurut Fardiaz (1992, 124:320) mengatakan apabila metode perhitungan cawan ini
merupakan metode perhitungan yang sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena
hanya sel hidup saja yang dapat dihitung, beberapa jenis mikrobanya dapat dihitung
sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia. Perhitungan dari
metode hitungan cawan ini, baik metode spread plate maupun pour plate dapat dihitung
dengan menggunakan Quebec Colony Counter. (Fardiaz, 1992, 125:320)
19
5.2.1. Metode Spread Plate
Menurut Harmita & Radji (2008, 129:171) metode spread plate merupakan salah satu
teknik dari hitungan cawan yang dilakukan dengan cara menyebarkan sampel yang telah
diencerkan pada permukaan pelat agar didalam cawan petri. Hal ini sesuai dengan
percobaan yang dilakukan dimana mula-mula 1 ml kultur Acetobacter aceti pada
masing pengenceran dituangkan kedalam cawan petri yang sudah mengandun media
yang sudah memadat. Media yang digunakan didalam metode spread plate ini adalah
Lactose Broth (LB), digunakannya Lactose Broth (LB) dikarenakan mengandung unsur-
unsur yang sesuai dengan kebutuhan dari kultur Acetobacter aceti sendiri.
Pada hasil pengamatan yang dilakukan oleh kelompok E1 – E4 didapatkan jumlah
koloni berupa spreader. Spreader menurut Waluyo (2010, 211:305) didefinisikan
sebagai suatu kondisi dimana jumlah koloni yang terbentuk lebih dari 300 koloni.
Keadaan spreader ini bisa disebabkan oleh beberapa hal yang menurut waluyo (2010,
211:305) antara lain adalah jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, juga
tingkat keaseptisan. Kemudian pada kelompok E5 didapatkan hasil 117 x 105 dan pada
kelompok 6 didapatkan hasil 11 x 106. Berdasarkan hasil yang didapatkan oleh
20
kelompok E5 dan E6 maka dapat disimpulkan bahwa pengenceran akan membuat
jumlah koloni per ml nya semakin sedikit.
5.2.2. Metode Pour Plate
Menurut Harmita & Radji (2008, 129:171) metode pour plate ini mempunyai
kelemahan dimana mebutuhkan waktu dan bahan yang relatif lama dan banyak akan
tetapi tidak terlalu membutuhkan ketrampilan tinggi.
Metode pour plate ini dilakukan dengan menuangkan 1 ml kultur Acetobacter aceti
kedalam cawan petri bersama dengan media yang sudah disterilkan dan diturunkan
suhunya. Media yang digunakan didalam metode pour plate ini adalah NA (Nutrient
Agar). Penggunaan NA sebagai media dikarenakan mengandung komponen yang
mendukung perkembang biakan dari kultur Acetobacter aceti sendiri. NA menurut
Lapage et al (1970, 117:357) merupakan media padat yang disebabkan karena adanya
penambahan zat pemadat. Dan baktei yang ditumbuhkan didalam media ini akan
tampak sebagai suatu koloni kecil.
21
Berdasarkan pada hasil pengamatan yang dilakukan oleh kelompok E1 – E4 didapatkan
hasil spreader. Kondisi spreader ini menurut waluyo (2010, 211:305) disebabkan oleh
antara lain adalah jumlah kultur yang digunakan, tingkat pengenceran, juga tingkat
keaseptisan. Sedangkan pada kelompok E5 mendapatkan hasil 117 x 105 dan pada
kelompok E6 mendapatkan hasil 50 x 106. Jumlah koloni per ml yang didapat oleh
kelompok E5 dan E6 ini menunjukan bahwa pengenceran didalam metode pour plate
akan mempengaruhi jumlah koloni per ml nya dimana semakin banyak pengenceran
yang dilakukan maka jumlah koloni per ml nya pun akan semakin sedikit.
Berdasarkan pada perbandingan hasil antara spread plate dan pour plate didapatkan
hasil dimana jumlah pada pour plate lebih banyak dibandingkan pada metode spread
plate. Hal ini tentu tidak sesuai dengan teori yang dikatakan oleh Suriawiria (2005,
105:172) yang mengatakan bahwa metode spread plate akan menghasilkan jumlah
koloni yang lebih banyak dibandingkan metode pour plate dimana banyaknya jumlah
koloni pada metode spread plate disebabkan karena sampel yang dicampurkan kedalam
suatu media padat. Kesalahan pada hasil yang didapatkan ini bisa disebabkan oleh
jumlah kultur yang digunakan dimana seharusnya penggunaan kultur sebanyak 1 ml
22
akan memberikan hasil spreader, akan tetapi pada percobaan ini tetap dianggap dapat
dihitung, hal ini sangatlah subjectif karena pandangan seseorang terkadang berbeda-
beda.
Berdasarkan percobaan spread plate dan pour plate keduanya mempunyai kelebihan dan
juga kelemahan. Untuk seorang yang masih dalam tahap belajar akan lebih baik bila
menggunakan metode pour plate karena meskipun membutuhkan waktu yang relatif
lama akan tetapi metode ini tidak begitu membutuhkan keterampilan (Harmita & Radji,
2008, 129:171). Hal ini tampak pada materi metode yang dilakukan, pada metode
spread selain dibutuhkan ketelitian didalam melakukan pengenceran, waktu yang
dibutuhkan untuk memadatkan medianya juga lebih lama dibandingkan metode pour
plate karena pada metode spread plate digunakan media LB yang pada dasarnya adalah
media cair.
5.3. Metode Most Probable Number (MPN)
Menurut Fardiaz (1992, 126-127:320) mengatakan bahwa metode MPN merupakan
metode dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi. Teori yang dikatakan
23
ini sesuai dengan metode yang dilakukan dimana pertama-tama menyiapkan 9 tabung
reaksi yang berisi media LB (Lactose Broth) dan diberi tabung durham. Dimana LB
(Lactose Broth) merupakan media cair yang disebabkan karena tidak adanya zat
pemadat. Tabung durham menurut Bartram & Pedley (1996) adalah tabung yang
mempunyai bentuk yang serupa dengan tabung reaksi hanya saja mempunyai ukuran
yang lebih kecil. Tabung durham ini digunakan sebagai penanda adanya reaksi positif
pada tabung reaksi dimana reaksi positif ini ditandai dengan adanya gelembung atau gas
dan kekeruhan. Menurut Bartram & Pedley (1996) gas ini dihasilkan oleh mikroba
dimana gas yang terbentuk adalah CO2 dan H2. Keberadaan dari gas CO2 inilah yang
menyebabkan kekeruhan. Didalam percobaan ini dilakukan 3 dari tabung reaksi yang
berisi media tersebut diisi dengan 1 ml sampel yang berasal dari pengenceran yang
berbda-beda, pengenceran ini bertujuan sesuai dengan nama metodenya yaitu untuk
mengetahui berapa nilai MPN berdasrkan kemungkinan yang ada yang didapatkan
berdasarkan kombinasi tabung reaksi positif yang dihasilkan oleh ketiga tabung
tersebut. Sampel yang digunakan disini adalah air kolam udang. Setelah dilakukan
pengenceran kemudian semua tabung reaksi diinkubasikan dengan tujuan untuk
24
membiakan mikroorganisme yang terkandung didalam air kolam udang tersebut.
Mikroorganisme yang menghasilkan gas berasal dari air kolam udang tersebut.
Berdasarkan pada hasil pengamatan yang dilakukan didapatkan hasil nilai MPN dari E1
– E6 adalah 53, 160, 150, 95, 93, 75. Nilai-nilai MPN ini menunjukan jumlah mikroba
yang tumbuh atau membentuk koloni. Pada hasil pengamatan ada yang jumlah
gelembungnya 0 (reaksi negatif) dan tampak jernih. Hal ini sesuai dengan teori yang
dikatakan oleh Bartram & Pedley (1996) yang mengatakan bahwa tabung reaksi yang
positif akan ditandai dengan terbentuknya gelembung atau gas serta tampak keruh.
Berdasarkan pada percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode MPN
mempunyai kelemahan dimana untuk mendapatkan ketelitian yang tinggi maka
dibutuhkan jumlah seri tabung yang banyak, akan tetapi metode ini juga mempunyai
kelebihan dimana hasil yang didapatkan lebih akurat dibandingkan dengan
menggunakan metode hitungan cawan karena dalam metode hitungan cawan sangat
sensitif dalam menghitung jumlah mikroba dan banyak hal yang mempengaruhi yang
membuat keakuratannya menurun.
6. KESIMPULAN
Perhitungan jumlah koloni pada metode hitungan cawan dilakukan dengan
menggunakan quebec colony counter.
Dikatakan spreader pada metode hitungan cawan apabila jumlah koloni yang
terbentuk lebih dari 300 koloni.
Spreader dapat disebabkan oleh faktor pengenceran, jumlah kultur yang digunakan
dan tingkat keaseptisannya
Metode spread plate dan pour plate mempunyai perbedaan pada media yang
digunakan dan jumlah koloni yang dihasilkan, dimana spread plate akan
menghasilkan jumlah koloni lebih banyak dari pour plate.
Metode pour plate merupakan metode yang lebih mudah dilakukan daripada
metode spread plate karena tidak terlalu membutuhkan keterampilan.
Metode MPN merupakan metode yang dilakukan dengan mencocokan
kemungkinan yang ada berdasarkan tabung reaksi yang positif
Metode MPN dilakukan dengan menggunakan Lactose Broth yang merupakan
media cair.
Tabung durham merupakan tabung yang serupa dengan tabung reaksi hanya
berukuran lebih kecil
Tabung durham digunakan sebagai alat bantu didalam menunjukan adanya suatu
reaksi positif didalam tabung reaksi.
Reaksi positif dalam metode MPN ditandai dengan munculnya gelembung dan
adanya kekeruhan.
Gas yang terbentuk didalam metode MPN adalah gas CO2 dan H2
Pengenceran mempengaruhi jumlah koloni yang terbentuk dimana semakin banyak
faktor pengenceran yang dilakukan maka jumlah koloni yang terbentuk juga akan
semakin sedikit.
Metode hitungan cawan merupakan metode yang sangat sensitif oleh berbagai
macam faktor oleh karena kurang akurat apabila dibandingkan dengan metode
MPN.
25
26
Didalam tiap percobaan enumerasi aseptis adalah salah satu faktor yang paling
mempengaruhi.
Semarang, 5 Juni 2013 Asisten Dosen :
Yeremia Adi Wijaya - Stefany Widjaya
12.70.0152 - Seteven George
7. DAFTAR PUSTAKA
Bartram, J. & Pedley, S.(1996). Microbiological Analyses. Published on behalf of United Nations Environment Programme and the World Health Organization
Chang, R. (2003). Kimia Dasar : Konsep-Konsep Inti edisi ketiga. Erlangga. Jakarta.
Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Hadioetomo, R.S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Harmita, A & Radji M. (2008). Analisis Hayati edisi 3. EGC. Jakarta.
Lapage, S ; Shelton, J & Mitchell,T. (1970). Methods in Microbiology', Norris J. and Ribbons D edition. Vol. 3A. Academic Press. London
Merck, E. & Darmstadt. ( 1998 ). Handbook of microbiology 1st Suplement. Federal Republic Germany.
Suriawiria, U. (2005). Mikrobiologi Dasar. Penerbit Papas Sinar Sinanti. Jakarta.
Waluyo, L. (2010).Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi.UMM Press.Malang.
27
8. LAMPIRAN
8.1. Perhitungan
8.1.1. Metode Spread Plate
Kelompok E1 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−1
Jumlah koloni per ml=Spreade r
Kelompok E2 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−2
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E3 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−3
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E4 :
Jumlah kolo∋ per ml=Jumlah koloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−4
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E5 :
28
29
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=37 x1
10−5
Jumlahkoloni per ml=¿ 37 x105
Kelompok E6 :
Jumlah koloni per ml=J umlah koloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=11 x1
10−6
Jumlah koloni per ml=37 x 106
8.1.2. Metode Pour Plate
Kelompok E1 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahko loni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−1
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E2 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Fak tor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−2
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E3 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengen ceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−3
Jumlah koloni per ml=Spreader
30
Kelompok E4 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=Spreader x1
10−4
Jumlah koloni per ml=Spreader
Kelompok E5 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=117 x1
10−5
Jumlah koloni per ml=117 x105
Kelompok E6 :
Jumlah koloni per ml=Jumlahkoloni x1
Faktor Pengenceran
Jumlah koloni per ml=50 x1
10−6
Jumlah koloni per ml=50 x106
8.1.3. Metode Most Probable Number (MPN)
Kelompok E1 :
MPN Count=Nilai MPN x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=53 x1
10−2
MP N Count=5,3 x 103
Kelompok E2 :
MPN Count=Nilai MPN x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=160 x1
10−2
MPN Count=1,6 x 104
31
Kelompok E3 :
MPN Count=Nilai MP N x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=150 x1
10−2
MPN Count=1,5 x 104
Kelompok E4 :
MPN Count=Nilai MPN x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=95 x1
10−2
MPN Count=9,5 x103
Kelompok E5 :
MPN Count=Nilai MPN x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=93 x1
10−2
MPN Count=9,3 x103
Kelompok E6 :
MPN Count=Nilai MPN x1
Pengencerantabung yangditengah
MPN Count=75 x1
10−2
MPN Count=7,5 x 103
8.2. Tabel MPN
8.3. Laporan Sementara