ISABELLE BANVILLE
ÉTUDE DES CARACTÉRISTIQUES BIOCHIMIQUES ET STRUCTURALES DE LA PROTÉINE DMC1 DE
SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc)
FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
NOVEMBRE 2004 © Isabelle Banville, 2004
Résumé Peu de données sont connues à savoir comment des protéines méiotiques régulent la
recombinaison homologue de façon biochimique. Lors d'études effectuées chez l'humain, il
a été démontré que hRad51 se comporte sensiblement comme le fait son homologue
bactérien, RecA. Malgré que hDmc1 possède une séquence d’acides aminés possédant
52% d’identité à celle de hRad51, ses caractéristiques et ses capacités sont différentes.
Afin d’étudier si cette disparité est conservée chez l'organisme Schizosaccharomyces
pombe nous avons purifié et étudié biochimiquement la protéine Dmc1 de cet organisme.
Nous montrons que spDmc1 lie préférentiellement l'ADN simple brin et protubérant à
l'ADN double brin, une propriété similaire à son homologue bactérien RecA. SpDmc1
purifiée est capable de catalyser des réactions d’échange de brins, telles que rencontrées
durant la recombinaison homologue. Contrairement à la protéine humaine, spDmc1 a la
capacité de lier l'ADN et d'y former un filament hélicoïdal, la signature des recombinases
classiques.
Remerciements Remerciement sincère à Jean-Yves Masson.
Merci pour l’aide, la patience et surtout, merci de nous aider à s’amuser en travaillant.
Merci à mon équipe de travail, Marie-Christine Gauthier, Ugo Déry et Mickaël Ploquin.
Merci d’avoir partager mes hauts et mes bas, vous m’avez fait passer de très bons moments.
Merci à ma famille.
Merci d’être là, et de m’avoir encouragée dans mon cheminement.
Merci à toi, Oli, de m’avoir remis sur pied lorsque j’en ai eu besoin.
À cette bière qui, quelques fois, nous donne le courage de tout recommencer, encore une fois.
Table des matières
1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1.1 LA MÉIOSE -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.1 Le cycle biologique de S.pombe ----------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.2 La diversité génétique ---------------------------------------------------------------------------------------- 4
1.2 LA RECOMBINAISON INTERHOMOLOGUE ---------------------------------------------------------------------- 5 1.2.1 Les cassures double brin de l’ADN ------------------------------------------------------------------------- 5
1.3 RÉPARATION DES CASSURES DOUBLE BRIN ------------------------------------------------------------------- 6 1.3.1 Non crossing-over vs crossing-over ------------------------------------------------------------------------ 6 1.3.2 Le non crossing-over ----------------------------------------------------------------------------------------- 7 1.3.3 Le crossing-over----------------------------------------------------------------------------------------------- 7
1.4 LES RECOMBINASES --------------------------------------------------------------------------------------------- 8 1.4.1 RecA : recombinase bactérienne ---------------------------------------------------------------------------- 8
1.4.1.1 Sa structure----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.4.1.2 Le filament ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.4.1.3 La réaction d’échange de brin ------------------------------------------------------------------------------------10 1.4.1.4 La renaturation------------------------------------------------------------------------------------------------------10
1.4.2 Rad51 --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 1.4.2.1 Similitudes et différences avec RecA----------------------------------------------------------------------------12 1.4.2.2 Les mutants de rad51 chez S.cerevisiae -------------------------------------------------------------------------13
1.4.3 Dmc1 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13 1.4.3.1 Sa structure----------------------------------------------------------------------------------------------------------14 1.4.3.2 La liaison a l’ADN et le filament --------------------------------------------------------------------------------14 1.4.3.3 La réaction d’échange de brin et la renaturation ---------------------------------------------------------------15 1.4.3.4 Les mutants----------------------------------------------------------------------------------------------------------15
1.5 BUTS DU PROJET DE MAÎTRISE -------------------------------------------------------------------------------- 16
2 MATÉRIELS ET MÉTHODES--------------------------------------------------------------------------------- 17
2.1 LE SYSTÈME D’EXPRESSION PET CHEZ ESCHERICHIA COLI ------------------------------------------------ 17 2.2 RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR)-------------------------------------------------------- 17 2.3 GEL D’AGAROSE ----------------------------------------------------------------------------------------------- 18 2.4 CLONAGE DES GÈNES RAD51(+) ET DMC1(+) DANS LES VECTEURS D’EXPRESSION -------------------- 19 2.5 PRÉPARATION DU VECTEUR PET16B------------------------------------------------------------------------- 20 2.6 EXTRACTION SUR GEL D’AGAROSE -------------------------------------------------------------------------- 20 2.7 CLONAGE ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21 2.8 TRANSFORMATION DES CELLULES COMPÉTENTES : -------------------------------------------------------- 21 2.9 PRÉPARATION D’ADN PLASMIQUE -------------------------------------------------------------------------- 22 2.10 SÉQUENÇAGE --------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 2.11 MUTAGENÈSE -------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 2.12 GEL D’ACRYLAMIDE------------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.13 PRODUCTION PROTÉIQUE-------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.14 EXTRACTION DE PROTÉINES ---------------------------------------------------------------------------------- 27 2.15 PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 EXPRIMÉE CHEZ E.COLI------------------------------------------- 28 2.16 PURIFICATION DE LA PROTÉINE RAD51 EXPRIMÉE CHEZ E.COLI------------------------------------------ 29 2.17 FILTRATION SUR GEL ------------------------------------------------------------------------------------------ 29 2.18 RENATURATION D’ADN SIMPLE BRIN ----------------------------------------------------------------------- 31 2.19 RETARDEMENT SUR GEL -------------------------------------------------------------------------------------- 32 2.20 ÉCHANGE DE BRIN --------------------------------------------------------------------------------------------- 34 2.21 MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE-------------------------------------------------------------------------------- 35
3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
3.1 CLONAGE ET MUTAGENÈSES---------------------------------------------------------------------------------- 36 3.2 EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------------- 36
iv
3.3 FILTRATION SUR GEL ------------------------------------------------------------------------------------------ 37 3.4 INTERACTION PAR DOUBLE HYBRIDE ------------------------------------------------------------------------ 38 3.5 LIAISON À L’ADN PAR DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------------ 39 3.6 ACTIVITÉ ATPASE DE DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------------- 40 3.7 RENATURATION DE L’ADN----------------------------------------------------------------------------------- 41 3.8 RÉACTION D’ÉCHANGE DE BRIN ------------------------------------------------------------------------------ 42 3.9 FILAMENT PROTÉIQUE SUR L’ADN -------------------------------------------------------------------------- 42
4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
BIBLIOGRAPHIE------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48
Liste des tableaux
1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
TABLEAU 1.1 : COMPARAISON STRUCTURALE DES PROTÉINES RECA ET RAD51 -------------------------------- 11 TABLEAU 1.2 : COMPARAISON DE RECA D'E.COLI AVEC LES PROTÉINES SCRAD51 ET HRAD51 -------------- 12
2 MATÉRIELS ET MÉTHODES--------------------------------------------------------------------------------- 17
TABLEAU 2.1 : AMORCES UTILISÉES LORS DE L'AMPLIFICATION PAR PCR -------------------------------------- 18 TABLEAU 2.2 : CELLULES COMPÉTENTES UTILISÉES LORS DES TRANSFORMATIONS PAR CHOC THERMIQUE - 21 TABLEAU 2.3 : TAMPONS NÉCESSAIRES À LA PRÉPARATION D'ADN PLAMIDIQUES ----------------------------- 23 TABLEAU 2.4 : AMORCES UTILISÉES LORS DU SÉQUENÇAGE------------------------------------------------------- 24 TABLEAU 2.5 : AMORCES UTILISÉES LORS DE LA DÉLÉTION DIRIGÉE DE L'INTRON GÉNOMIQUE --------------- 25 TABLEAU 2.6 : AMORCES UTILISÉES LORS DU RETARDEMENT SUR GEL ------------------------------------------ 33
3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Liste des figures
1 INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
FIGURE 1.1 : SÉGRÉGATION DES CHROMOSOMES LORS DE LA MÉIOSE.--------------------------------------------- 1 FIGURE 1.2 : ILLUSTRATION DU COMPLEXE SYNAPTONEMAL LORS DE LA PROPHASE MÉIOTIQUE I ------------- 2 FIGURE 1.3 : SCHÉMA DU CYCLE CELLULAIRE MÉIOTIQUE ---------------------------------------------------------- 3 FIGURE 1.4 : CELLULES DIPLOÏDES DE S.POMBE SUITE A LA MÉIOSE ----------------------------------------------- 3 FIGURE 1.5 : CYCLE BIOLOGIQUE DE S.POMBE ------------------------------------------------------------------------ 4 FIGURE 1.6 : LE NON-CROSSING-OVER --------------------------------------------------------------------------------- 7 FIGURE 1.7 : LE CROSSING-OVER --------------------------------------------------------------------------------------- 8 FIGURE 1.8 : RECA ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 FIGURE 1.9 : STRUCTURE OCTAMÉRIQUE DE DMC1 OBTENUE PAR CRISTALLOGRAPHIE ----------------------- 14
2 MATÉRIELS ET MÉTHODES--------------------------------------------------------------------------------- 17
3 RÉSULTATS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
FIGURE 3.1 : ILLUSTRATION DE LA MUTAGENÈSE EFFECTUÉE SUR L'ADN GÉNOMIQUE ------------------------ 36 FIGURE 3.2 : EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------ 37 FIGURE 3.3 : NATURE MULTIMÉRIQUE DE LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE ------------------------------------- 37 FIGURE 3.4 : INTERACTION PAR DOUBLE HYBRIDE ----------------------------------------------------------------- 38 FIGURE 3.5 : RETARDEMENT SUR GEL DE LA PRTÉINE DMC1 DE S.POMBE --------------------------------------- 39 FIGURE 3.6 : CONDITIONS FAVORABLES À LA LIAISON À L'ADN ------------------------------------------------- 40 FIGURE 3.7 : ACTIVITÉ ATPASE DE DMC1 DE S.POMBE------------------------------------------------------------ 40 FIGURE 3.8 : RENATURATION DE L'ADN PAR LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE--------------------------------- 41 FIGURE 3.9 : RÉACTION D'ÉCHANGE DE BRIN PAR LA PROTÉINE DMC1 DE S.POMBE---------------------------- 41 FIGURE 3.10 : MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE------------------------------------------------------------------------- 42
4 CONCLUSIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Liste des abréviations AD : Domaine d’activation Gal4 (double hybride)
ADE : Adénine
Amp : Ampicilline
Cam : Chloramphénicol
CDB : Cassure double brin
db : Double brin
DBD : « Gal4 DNA binding domain » (double hybride)
Dr : Docteur
DTT : Dithiothreitol
G1 : Intervalle de temps de croissance précédant la synthèse d’ADN
G2 : Intervalle de temps précédant la division cellulaire
h : Heure
his-tag : Étiquette d’histidine
IPTG : Isopropyl-β-thiogalactopyranoside
kb : Kilobase
LB : Milieu de culture bactérienne « Luria Broth »
M : Phase de division cellulaire (mitose, méiose)
min : Minute
nm : Nanomètre
pb : Paire de bases
pH : Potentiel hydrogène
S : Phase de synthèse de l’ADN
sb : Simple brin
SC : Complexe synaptonemal
viii
SDSA : « Synthesis dependent strand annealing »
SSB : « Single strand DNA binding protein »
Sp : Schizosaccharomyces pombe
RPA : « Replication protein A »
rpm : Révolution par minute
YPD : Milieu de culture de levure « Yeast extract, Peptone, Dextrose »
1 Introduction
1.1 La méiose Il existe, chez les eucaryotes, un type de division nucléaire et cellulaire caractéristique à la
reproduction sexuée appelé méiose. Celle-ci se singularise par le fait qu’elle génère quatre
cellules haploïdes (gamètes ou spores) génétiquement non équivalentes à partir d’une seule
cellule diploïde originale. Pour ce faire, la méiose procède à deux cycles de divisions
cellulaires pour une seule réplication du matériel génétique.
La première ronde de division méiotique, la division réductionnelle, amène la disjonction
des chromosomes homologues. Cette étape, si on la compare à la division mitotique du
cycle végétatif, diffère par le fait qu’il n’y a séparation des centromères (lien entre deux
chromatides sœurs formant un
chromosomes) (voir figure
1.1). Les chromatides sœurs
restent alors appariées
ensembles et, s’en suit la
ségrégation des chromosomes
homologues. Il y a donc
formation de deux cellules
contenant chacune un seul
exemplaire de chaque type de
chromosome dédoublé en deux
chromatides ( Roeder, 1997).
Division réductionelle et équationelle
En prophase, il y a condensation des chromosomes (apparition sous forme de deux
chromatides sœurs attachées par le centromère), migration des centrioles vers les pôles
opposés de la cellule et dissolution de l’enveloppe nucléaire à l’exception de celle des
levures. Cette première étape de la division réductionnelle occupe 90% de la méiose et est
subdivisée en cinq stades (http://webiologie.free.fr/cellules/domaines/meiose.html). Le
Figure 1.1: Ségrégation des chromosomes lors de la méiose. Les chromosomes homologues parentaux sont indiqués en vert (père) et en bleu (mère).
2
premier, le leptotène est caractérisé par la condensation des chromatides sous forme de
minces filaments fixés à un axe protéique (voir figure 1.2). Ensuite, le zygotène amène
l’appariement des chromosomes homologues et la formation du complexe synaptonemal
(SC) entre les deux jeux de chromatides. Le pachytène, troisième étape de la prophase,
permet la recombinaison génétique entre les chromosomes homologues grâce au SC qui
assure un contact étroit entre ceux-ci. Vient ensuite la dissolution des SCs et le début de la
séparation des chromosomes homologues. Ces derniers s'éloignent l'un de l'autre, mais
restent joints au niveau des chiasmas; zone d'échange d'ADN entre deux chromatides par
crossing-over. Cette étape caractéristique se nomme diplotène. Ensuite, la diacénèse
marque le retour à la prophase normale. Dans chacune des tétrades, les chromatides sœurs
sont reliées par leur centromère et les chromatides non-sœurs par leurs chiasmas. La
prophase terminée, le cycle cellulaire continue avec la métaphase. L’ADN s’aligne alors
sur le plan équatorial de la cellule, attachée au niveau des centromères par les microtubules
reliés aux deux centrioles. L’anaphase amène ensuite le détachement des chromatides
sœurs et le déplacement de chacune d’elle vers un pôle opposé, par l’action des
microtubules. Lors de l’étape subséquente, la télophase, il y a relâchement des
chromosomes en chromatine et la cellule retrouve son état original. Il y a donc disparition
du fuseau mitotique, formation de la membrane nucléaire et du nucléole. L’apparition de
deux cellules filles se fait finalement, étape que l’on nomme cytocinèse.
Figure 1.2 : Illustration de la formation et du démembrement du complexe synaptonemal lors de la prophase méiotique I. Illustration provenant du livre Molecular Biology of the cell, 4eme édition.
3
Figure 1.3 : Schéma du cycle cellulaire méiotique. Obtention de 4 cellules filles haploïdes génétiquement différentes à partir d’une cellule diploïde parentale.
Figure 1.4 : Cellules diploïdes de S.pombe suite à la méiose. Coloration effectuée par DAPI. Image gracieusement fournie par Paul Nurse.
Suite à ces étapes, le cycle reprend et la deuxième division méiotique débute. Celle-ci se
rapporte à la division mitotique, puisqu’il y a séparation des chromatides sœurs
subséquente à la division des centromères. On la nomme mitose équationelle. Il en résulte
alors quatre cellules filles comprenant chacune une chromatide de chaque paire initiale de
chromosomes homologues (voir figure 1.3) (Roeder, 1997).
1.1.1 Le cycle biologique de S.pombe Schizosaccharomyces pombe est une levure cylindrique
possédant des extrémités arrondies. Sa taille varie selon
son état, de 3-4μM de largeur sur 6-15μM de longueur
lorsqu’elle est sous forme haploïde, et de 4-5μM de
largeur sur 10-25μM de longueur en phase diploïde
(voir figure 1.4). Sa taille est facilement observable au
microscope optique. Contrairement à Saccharomyces
4
cerevisiae, une levure à bourgeonnement, pombe se divise plutôt par fission transversale
(http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm).
Lors du cycle végétatif, cette levure se retrouve généralement sous forme haploïde.
L’avènement du cycle
sexué, lors de conditions
nutritives défavorables,
conduit à la fusion de 2
cellules haploïdes
compatibles sexuellement.
Il y a alors formation d’un
zygote. Ce zygote peut
alors suivre le cycle
végétatif sous forme
diploïde, et former quatre
ascospores lors d’une
éventuelle méiose (voir figure 1.5).
Le cycle biologique de Schizosaccharomyces pombe diffère en quelques points des autres
eucaryotes. En effet, son interphase est caractérisée par un stade G1 très court et un G2 très
long. De plus, la séparation des cellules s’effectue en phase S comparativement à la fin de
la phase M chez les autres organismes (http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm).
1.1.2 La diversité génétique Précédant les deux divisions cellulaires, la prophase du premier cycle méiotique (prophase
I) amène la nature à se diversifier en permettant la production de chromosomes
recombinants. Lors de cette prophase, l’alignement et la synapse des chromosomes
homologues permettent le transfert d’information génétique entre les chromosomes
parentaux au cours d’un phénomène appelé recombinaison interhomologue. Cet échange
favorise l’évolution des espèces en amenant la nature à se diversifier à une fréquence de
100 à 1000 fois supérieure que lors du cycle végétatif (Smith & Nicolas, 1998).
Figure 1.5 : Cycle biologique de S.pombe. Provient du site internet : http://www.didier-pol.net/4pombe1.htm
5
1.2 La recombinaison interhomologue La recombinaison interhomologue est induite suite au mécanisme de cassure double brin de
l’ADN (CDB). Il semblerait maintenant que le même procédé de réparation des CDBs
serait à la base du réarrangement génétique interhomologue.
1.2.1 Les cassures double brin de l’ADN Les cassures double brin de l’ADN (CDBs) sont une cause connue d’instabilité génomique
pouvant mener à la formation de cancer ou à la mort cellulaire (Masson & West, 2001).
Ces cassures peuvent être induites par des agents exogènes (radiation γ, agents chimiques),
des agents endogènes (radicaux libres, réplication de cassure simple brin) mais aussi par
des mécanismes spécialisés. Parmi ceux-ci, la recombinaison V(D)J permettant la création
d’anticorps variés pouvant nous protéger, et la méiose, qui mène à la recombinaison
méiotique.
Chez l’organisme Schizosaccharomyces pombe, les protéines Rec6, Rec7, Rec12, Rec14 et
Rec15 seraient essentielles à la formation des CDBs nécessaires à la recombinaison
interhomologue (Cervantes & al, 2000). La protéine Rec12, orthologue de la protéine
Spo11, est présente chez la majorité des organismes eucaryotes. Cette protéine de type
topoisomérase est en quelques sorte un homologue de l’unité A de la topoisomérase
archéobactérienne IV. Cette topoisomérase de type II est un hétérotétramère composé
d’unités A et B. L’unité A a pour fonction de cliver l’ADN suite à une réaction de
transestérification tandis que l’unité B coordonne le bris et la jonction de l’ADN. Chez la
plupart des eucaryotes, seule l’unité A (Spo11) a été découverte, l’unité B semble
généralement absente (Roeder, 1997 ; Villeneuve & Hilers, 2001). Cette réaction, de
transestérification, amenant la cassure de l’ADN prend lieu au stage leptotène de la
prophase I dans des régions relâchées de la chromatine. Par contre, lors d’expérimentation
par double hybride, des sites artificiels de coupure ont toutefois pu être créés
artificiellement près du site de liaison de Gal4 lors de la fusion de Spo11 au facteur de
transcription Gal4. Ce résultat démontre que la coupure effectuée par Spo11 est suffisante
à l’avènement de la recombinaison méiotique à d’autres sites dans le génome (Pecina & al,
2002). Suite à cette initiation de la recombinaison (effectuée par Spo11) les protéines
6
Rad50, Mre11 et Xrs2 vont resecté les extrémités 5’ des coupures (Roeder, 1997 ; Heyer,
2004). Il semble que Rad50 et Mre11 soient essentielles à la formation et la maturation de
la cassure double brin (Roeder, 1997). Les extrémités 3’ protubérantes générées seraient
alors à la base de l’invasion du duplex homologue permettant l’échange d’information
génétique. Ce mécanisme d’invasion impliquerait les mêmes protéines de réparation de
l’ADN, soit Rad51 et son homologue méiotique Dmc1.
1.3 Réparation des cassures double brin Lors du cycle mitotique, la cellule utilise deux méthodes différentes pour réparer les CDBs
créées de façon accidentelles. La première, s’effectue lors d’une cassure en phase G1 par
« Non Homologous End Joining ». Cette réparation, de type « couper-coller », ne nécessite
pas une homologie de séquence, elle relie simplement les extrémités de la cassure ensemble
(West & al, 2000). La deuxième méthode s’effectue par recombinaison entre chromatides
sœurs suite à la réplication de l’ADN. La réparation des cassures induite par la protéine
Spo11 lors du cycle méiotique a lieu entre chromosomes homologues et se distingue en
deux mécanismes. L’un mène à l’échange d’information génétique par la formation de
crossing-over, l’autre non.
1.3.1 Non crossing-over vs. crossing-over Le phénomène appelé crossing-over se définit comme l’échange de matériel génétique
entre les chromatides non-sœurs de chromosomes homologues. Dans une cellule en
division méiotique, 30 à 50% des recombinaisons mènent à un échange d’information
génétique par crossing-over (Pâques & Haber, 1999). Mais comment différencier les
mécanismes de réparation menant à la formation de crossing-over de ceux dont l’échange
est avorté ?
Selon des études effectuées, des distinctions cytologiques permettraient de distinguer les
CDBs menant à l’échange par crossing-over de celle ni menant pas. En effet, lors de
l’avènement des CDBs en prophase I, il y a formation de nodules protéiques aux lieux de
cassures (Roeder, 1997). L’évolution de la cellule en pachytène (voir figure 1.2) amène la
disparition de plusieurs nodules et l’évolution de certains en nodules tardifs (late nodule).
7
Il semble que les nodules primaires disparaissant durant la phase leptotène soient
responsables de la réparation par SDSA (Synthesis-dependent strand annealing),
phénomène ne menant pas à la formation de crossing-over (Pâques & Haber, 1999 ;
Villeneuve & Hilers, 2001). Pour ce qui est des nodules tardifs, leurs pourcentages relatifs
aux nodules primaires correspondent aux pourcentages de recombinaison méiotique menant
à la formation de crossing-over. Une étude a démontré que des mutants incapables
d’effectuer le pachytène ont un nombre normal de nodules primaires et de réparations sans
crossing-over. Ces mutants sont cependant incapables de résoudre le nombre élevé de
molécules jointes formées et ont un faible taux de crossing-over. En conclusion, on en
déduit que les nodules primaires marqueraient le site d’invasion de l’ADN tandis que les
nodules tardifs procèderaient par certains intermédiaires à la résolution par crossing-over et
que la décision de réparation suit l’invasion du brin resecté et implique l’homologie des
séquences (Allers & Lichten, 2001).
1.3.2 Le non crossing-over Le SDSA est un modèle conservateur de réparation initié
suite à une homologie de séquence de 25 à 60 nucléotides
(Allers & Hitchen, 2001). Selon ce modèle, suite à la
cassure, il y a résection 5’-3’ du brin endommagé et
invasion d’un seul brin sur son homologue (voir figure
1.6). Il y a, par la suite, synthèse d’ADN et,
contrairement aux différents modèles connus, le brin
réparé retourne par annelage à la molécule endommagée.
Il y a donc réparation sans échange d’ADN avec son
homologue.
1.3.3 Le crossing-over Hunter et Kleckner ont étudié le processus menant à la
formation de crossing-over. Suite à la cassure et à la
résection, il y aurait invasion et formation d’un
Figure 1.6 : Le non crossing-over. Réparation des cassures double brin par Synthesis dependant strand anneling.
8
intermédiaire sous forme de molécule jointe
apparaissant suite à la formation d’un complexe
synaptonemal. Le crossing-over résultant s’obtient
suite à la formation et à la résolution d’une double
jonction d’Holliday (voir figure 1.7) (Hunter &
Kleckner, 2001).
Contrairement au modèle précédant, celui-ci requiert
une homologie de 150 à 200 nucléotides et est résolu
en phase pachytène de la méiose (Heyer, 2004).
1.4 Les recombinases Par définition, une recombinase est une protéine
favorisant les interactions ADN-ADN (West, 2003).
Essentielles aux mécanismes de recombinaison, les
recombinases se lient à l’ADN afin de l’apparier à
son homologue. La première recombinase étudiée fut isolée de l’organisme procaryote
Escherichia coli. Cette protéine, RecA, est le modèle utilisé pour l’étude de la
recombinaison et du mécanisme de réparation de l’ADN. Ses fonctions biochimiques et
structurales bien connues sont aujourd’hui comparées à celles des nouvelles recombinases.
1.4.1 RecA : recombinase bactérienne Isolés pour la première fois dans les années 60 dans le laboratoire de John Clark, les
mutants bactériens RecA démontraient une forte sensibilité aux rayons U.V ainsi qu’aux
rayons X et comportaient des défauts de recombinaison génétique. Ce n’est cependant
qu’une vingtaine d’années plus tard que la protéine fût isolée et qu'elle put être étudiée
(Masson & West, 2001).
Ayant une chaîne polypeptidique de 352 acides aminés, cette protéine a un poids
moléculaire de 37 842 Da. De façon basale, RecA est exprimée de sorte qu’il y ait de huit à
dix milles monomères par cellule. Lorsque soumise à des agents endommageant l’ADN, la
Figure 1.7 : Le crossing-over Réparation des cassures double brin de l’ADN suite à la résolution de double jonction d’Holliday (DJH), menant ou non à l’échange d’information génétique.
9
cellule augmente sa quantité de monomère jusqu'à 70 milles afin d’induire la réponse SOS
(Cox, 2003). Il semble que la formation de filaments nucléoprotéiques permettrait un
changement de conformation amenant l’hydrolyse du répresseur Lex A. De cette façon, il y
aurait induction d’une vingtaine de gènes impliqués dans la réponse SOS (Baumann &
West, 1998).
1.4.1.1 Sa structure La structure protéique de RecA se divise en trois parties distinctes. La première, le
domaine N-terminal, semble impliquée dans les interactions entre les monomères
protéiques. Ce domaine jouerait donc un rôle dans la formation de filaments multimériques
sur l’ADN. Le second, que l’on nomme domaine central, inclut les acides aminés 34 à 269
et comporte des sites de liaisons à l’ATP et à l’ADN. Les résidus 47 à 74 seraient
essentiels à la liaison et à l’hydrolyse de l’ATP. Cette énergie apportée par l’hydrolyse de
l’ATP est essentielle aux changements de conformations caractéristiques des recombinases.
La presque totalité des organismes bactériens possèdent une recombinase RecA et, parmi
les différentes espèces, ce domaine est généralement bien conservé. Les résidus 270 à 352
comportent environ 25 résidus chargés négativement. De séquences généralement peu
conservées, ce domaine est appelé C-terminal (Cox, 2003).
1.4.1.2 Le filament L’assemblage des monomères hexamériques de RecA
permet la formation d’un filament hélicoïdal (voir figure
1.8). Son assemblage, sur l’ADN, se fait de façon
unidirectionnelle, soit de l’extrémité 5’ allant vers
l’extrémité 3’. Le désassemblage s’effectue lui aussi
dans la même direction (Cox, 2003). La création d’un
filament nucléoprotéique de RecA a lieu sur l’ADN
simple ou double brin avec une préférence marquée pour
le simple brin (Cox, 2003). Il est possible d’augmenter
la liaison in vitro de RecA à l’ADN double brin en réduisant le pH de la réaction sous les
Figure 1.8 : RecA Filament hélicoïdal de la protéine RecA sur ADN simple brin en microscopie électronique. Figure gracieusement fournie par Jean-Yves Masson et Andrzej Stasiak.
10
6,5 (Cox, 2003). Le filament formé se compose de 6,2 monomères par tour hélicoïdal,
ayant un écartement de 95Å et un diamètre de 100Å (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).
Ce filament augmente ainsi la taille du duplex de 1.5 fois (Masson & West, 2001).
1.4.1.3 La réaction d’échange de brin RecA d’E.coli fut la première protéine découverte capable d’effectuer la réaction d’échange
de brin. Cette activité composée essentiellement de trois phases nécessite l’apport
d’énergie par hydrolyse de l’ATP, on la nomme ATP dépendante.
Lors de la réaction, la protéine s’assemble sur l’ADN de façon à former un filament
hélicoïdal ce qui amène le relâchement de l’ADN. Une fois le filament formé, celui-ci se
met à la recherche d’une séquence homologue de 8 nucléotides ou plus. Lorsqu’il y a eu
reconnaissance, il y a alignement et appariement des homologues. Par la suite, il y a
élongation du brin endommagé de l’extrémité 5’ allant vers 3’. La copie du brin
homologue peut s’effectuer à un taux allant de deux à dix paires de bases sur une longueur
maximale de 7Kb et nécessite l’apport d’énergie par l’hydrolyse d’ATP. La présence de la
protéine SSB d’E.coli peut stimuler l’activité d’échange de brin de RecA. Lorsque bien
dosée, cette protéine défait la structure secondaire de l’ADN simple brin permettant ainsi a
RecA de s’y lier. On dit que 1 monomère de SSB par 15 nucléotides d’ADN simple brin et
que 3 nucléotides par monomère de RecA sont les conditions stœchiométriques optimales
pour la réaction d’échange de brin (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).
1.4.1.4 La renaturation de l’ADN RecA est aussi apte à effectuer la renaturation d’ADN, réaction permettant d’apparier
ensemble les ADN complémentaires. À plus faible ratio, la réaction nécessite seulement 1
monomère protéique pour 30 nucléotides. De plus, la réaction se voit stimuler de deux à
trois fois par l’ATP mais n’en est pas dépendante (Kowalczykowski & Eggleston, 1994).
1.4.2 Rad51 Cette recombinase eucaryotique a de nombreuses ressemblances biochimiques et
structurales avec la recombinase bactérienne RecA. Comme cette dernière, Rad51 a la
11
capacité de former des filaments sur l’ADN afin de promouvoir l’appariement des
homologues et la réaction d’échange de brin. Étudiée tout d’abord chez l’organisme
Saccharomyces cerevisiae au début des années 90s, Rad51 a ensuite été découverte chez
plusieurs autres organismes dont la souris, la mouche D.melanogaster, la levure de fission
S.pombe et l’humain. Chacune d’entres elles démontrent une bonne homologie avec la
recombinase bactérienne et une bonne conservation de séquence (voir tableau 1.1).
Certaines ont même une surprenante similitude entre elles. En effet, il a été découvert que
la protéine de souris a une séquence conservée à 98,8% avec celle de la protéine humaine
(Barlow & al, 1997) et de 81% avec celle de Saccharomyces cerevisiae (Haaf & al, 1995).
L’expression de cette recombinase a été observée dans la majorité des tissus de
mammifères avec une prépondérance au thymus, à la rate, à l’intestin, aux ovaires et aux
testicules (Haaf & al, 1995). Cette expression ciblée tend à démontrer un rôle de la
protéine Rad51 en recombinaison V(D)J et méiotique (Baumann & al, 1996). D’autres
études, cette fois effectuées chez la mouche D. melanogaster, ont su confirmer
l’implication méiotique de Rad51. En effet, la recombinase n’est exprimée que dans les
tissus méiotiques femelles. Leur absence chez le mâle concorde avec l’inaptitude du mâle à
effectuer la recombinaison méiotique (Barlow & al, 1997).
D’un autre point de vue, l’augmentation de l’expression protéique et la formation de foci
ont été observées suite aux dommages infligés à l’ADN (Haff & al, 1995). Chez la souris,
Tableau 1.1: Comparaison structurale des protéines RecA et Rad51
Information tirée de Kowalczykowski & al. 1994
Acides aminés
% Conservés % Identiques
RecA E.coli 352 38
ScRad51 S.cerevisiae 400 43 33-240 59 33
SpRad51 S.pombe 365 40 33-240 53 3031-260 56 3033-240 51 281-303 55 30
33-340 51 28mRad51 Souris 339 38
Séquence
hRad51 Humain 339 38
Nombre d'acides aminés
Protéine OrganismeMasse
moléculaire (KDa)
12
>>> >> >>
l’apparition de foci de Rad51 concorde avec la production de cassures double brin en phase
leptotène. Ces agglomérations protéiques se poursuivent jusqu’en fin de pachytène lors de
la résolution des doubles jonctions d’Holliday (Barlow & al, 1997). Une légère différence
a pu être observée avec la protéine humaine, l’apparition de foci protéique semblant se faire
seulement au stade zygotène. Ce résultat serait dû à l’absence de stade leptotène chez le
mâle (Barlow & al, 1997). On peut alors conclure que Rad51 est une protéine faisant partie
des nodules primaires et secondaires impliqués dans la recombinaison méiotique.
1.4.2.1 Similitudes et différences avec RecA Comme la recombinase bactérienne, Rad51 possède une activité d’échange de brin
dépendante de l’ATP pouvant être favorisée par l’ajout d’une protéine secondaire, RPA
(Pâques & Haber, 1999 ; Baumann & al, 1996). Toujours comme RecA, Rad51 forme des
filaments sur l’ADN simple et double brin, augmentant ainsi la taille du duplex de 1,5 fois
(Pâques & Haber, 1999). Sa
iaison sur l'ADN s'effectue à
un ratio de 1 monomère
pour 3 nucléotides (voir
tableau 1.2), ce qui
correspond à la
stœchiométrie de la
recombinase classique
(Baumann & al, 1996).
Cependant, Rad51 n’a pas
une préférence aussi
marquée que RecA pour
l’ADN simple brin et a une
liaison plus efficace avec
l’ADN double brin (Cox, 2003). Il semble aussi que la formation de filament protéique sur
l’ADN se produise plutôt de l’extrémité 3’ allant vers l’extrémité 5’ plutôt que de 5’ vers
3’. De plus, d’un point de vue énergétique, il semblerait que l’hydrolyse d’ATP par Rad51
soit de 30 à 40 fois inférieure à celle effectuée par son homologue (Cox, 2003) et que la
Tableau 1.2: Comparaison de RecA d'Echerichia coli avec les protéines Rad51 de Saccharomyces cerevisiae (scRad51) et de l'humain (hRad51).
Légende: sb: Simple brin, db: Double brin, pb: Paire de bases, sec: Seconde, kb: Kilobase, SSB: Single strand DNA binding protein, Information tirée de Baumann & West, TIBS 1998
RecA scRad51 hRad51Liaison à l'ADN sb db sb db sb db
Stoechiométrie (monomère/nucléotides) 1/3 1/3 1/3
Activité ATPase (ATP/minute)
30 0,7 0,16
Appariement des homologues
efficace rapide
efficace rapide
efficace rapide
Échange de brin 2-10pb/sec 6kb
Lent 4kb Lent 1-2kb
Polarité du transfert 5' vers 3' 3' vers 5' 3' vers 5'
Activité stimulée par SSBRPA,
Rad52, Rad55
RPA, Rad52
13
protéine Rad51 soit incapable d'effectuer une réaction d'échange de brin de façon extensive.
En effet, Rad51 permet la reconnaissance d'ADN homologue, initie la réaction d'échange
de brin, mais la formation d'un hétéroduplex extensif nécessite l'aide de protéines appelées
paralogues de Rad51 (Baumann & al, 1996).
1.4.2.2 Les mutants de rad51 chez S.cerevisiae Étudiés chez la levure, les mutants rad51 démontrent une hypersensibilité aux radiations.
Toutefois, contrairement aux cellules souches rad51-/- de souris, les mutants de la levure
sont viables (Baumann & al, 1996; Sonoda & al, 1998). Les études chez la souris ont
démontré que la délétion du gène rad51 entraînait une mort embryonnaire montrant ainsi
l’importance de réparer l’ADN lors du développement. Afin d'obtenir plus de
renseignements sur les rôles de cette protéine, l’équipe de Shunichi Takeda a effectué
l'inhibition de l'expression de Rad51 par inactivation conditionnelle de son expression dans
des cellules de poulet (Sonoda & al, 1998). Cette expérience a su démontrer qu'une
absence de Rad51 amène une accumulation des cellules en phase G2/M, une augmentation
des aberrations chromosomiques et une mort cellulaire subséquente. Toutes ces
expériences démontrent le rôle de la recombinase au cours du cycle cellulaire, dans le
maintien chromosomique, dans la réparation des cassures double brin de l'ADN, ainsi que
sa présence essentielle lors du développement et de la prolifération cellulaire (Sonoda & al,
1998).
1.4.3 Dmc1 : un homologue de RecA/Rad51 C’est lors d’une expérience visant à cibler les gènes exprimés en prophase méiotique chez
S.cerevisiae que fût découvert le gène Dmc1. Essentiel à la poursuite du cycle méiotique,
cette protéine y a tirée son nom, « Disrupted Meiotic cDNA 1 ». Découverte par la suite
chez les mammifères, il semble que son expression soit propre aux tissus méiotiques
(testicules, ovaires) et qu’elle soit induite des stades leptotène à zygotène de la prophase
(Yoshida & al, 1998).
14
1.4.3.1 Sa structure La séquence protéique de Dmc1 est fortement similaire à celle de Rad51. Chez l’humain,
la séquence est à 52% identique (Masson & al, 2001), pourcentage élevé à 62% chez la
levure S.pombe. Cette grande homologie coïncide avec la similarité de structure de ces
protéines. De poids moléculaires semblables (37707 Da pour hDmc1 et 36966 Da pour
hRad51), il semble en effet que les monomères protéiques soient similaires. Cependant,
contrairement à Rad51, aucun monomère de Dmc1 n’est retrouvé en solution (Masson & al,
1999). Il semblerait plutôt que la protéine se présenterait sous la forme d’octamères. Les
monomères se joindraient en formant un anneau d’un diamètre extérieur de 11 à 12 nm et
une cavité intérieure de 2 à 4 nm de diamètre (Masson & al, 1999), juste assez pour
permettre à l’ADN d’y pénétrer lors de la liaison ADN-protéine (Passy & al, 1999).
1.4.3.2 La liaison à l’ADN et le filament Capable de lier l’ADN simple et double brin sans
apport d’énergie sous forme d’ATP, Dmc1 a
cependant une préférence pour l’ADN simple brin
(Masson & al, 1999). Sa liaison, lorsqu’elle se fait
sur l’ADN simple brin, est de nature irrégulière et se
fait par amoncellement d’anneaux octamériques. Ces
amoncellements ont tendance, à concentration
croissante de protéine, à former des agrégats
protéiques (Masson & al, 1999). Sur l’ADN double
brin par contre, il y a formation de courts filaments
protéiques. Ces filaments, loin de ressembler à ceux
de RecA ou de Rad51, sont plutôt des anneaux enfilés
l’un derrière l’autre sur l’ADN (Passy & al, 1999 ; Masson & al, 1999). Une
cristallographie récente de la protéine humaine est venue confirmer un diamètre interne de
l’anneau à 27Å et un diamètre externe de 130Å. Cette cristallisation a aussi su mettre en
évidence le résidu Glu258 (présent chez Dmc1 mais absent chez Rad51), qui serait essentiel
à la stabilisation de l’anneau par la formation de liens hydrogènes. Ces liens, absents chez
Rad51, pourraient être à la base de la différence structurale des deux homologues sur
Figure 1.9 : Structure octamérique de la protéine Dmc1 obtenue suite à la cristallographie. Photo provenant de Kinebuchi et al. Molecular cell vol.14 p.363-374.
15
l’ADN (Kinebuchi & al, 2004). Cependant, une autre découverte, tout aussi récente,
démontre la formation de filament hélicoïdal de la protéine Dmc1 humaine sur l’ADN
(Sehorn et & al, 2004). Ces filaments, de tailles inférieures à ceux de RecA et de Rad51,
sont observés en présence d’ATP. En absence de cette molécule énergétique, ou lors de
son remplacement par un analogue faiblement hydrolysable (ATP-γs, AMP-PNP ou AMP-
PCP) aucun filament n’a pu être observé (Sehorn & al, 2004). Ainsi, il semble que
l’hydrolyse d’ATP serait indispensable à la recombinaison faite par la protéine Dmc1
humaine.
1.4.3.3 La réaction d’échange de brin et la renaturation La réaction d’échange de brin effectuée par les recombinases classiques, est aussi effectuée
par Dmc1. Cette recombinase méiotique a cependant une activité moins efficace que RecA
et que Rad51 (Masson & al, 1999). Son activité est ATP dépendante et elle nécessite un
certain apport en ion magnésium (Mg++) (Masson & al, 1999 ; Sehorn & al, 2004). De
plus, il semble que la protéine RPA aiderait la réaction en éliminant la structure secondaire
de l’ADN. En effet, en présence d’ATP et de la protéine RPA, hDmc1 effectue la réaction
d’échange de brin sur 20% du substrat en 80 minutes. La présence de RPA permettrait
l’échange complet du brin tandis que seul, hDmc1 effectuerait un échange partiel du brin.
Cette réaction in vitro d’échange de brin serait optimale en présence de 1 monomère de
hDmc1 pour 1 ou 2 nucléotides et de 1 monomère de RPA pour 10 à 15 nucléotides
(Sehorn & al, 2004). En présence de cette dernière, la protéine Dmc1 augmenterait sa
capacité à effectuer la réaction d’échange de brin (Sehorn & al, 2004). Il a aussi été
démontré que la recombinase méiotique était capable de renaturer l’ADN. En fait, Dmc1 a
la capacité d’apparier les ADNs homologues alors qu’elle est incapable d’effectuer la
réaction d’échange de brin en présence d’ADNs hétérologues (Masson & al, 1999).
1.4.3.4 Les mutants
Exprimée naturellement lors de la méiose, Dmc1 est une protéine essentielle à la poursuite
du cycle cellulaire. Les mutants déficients en Dmc1, observés chez la levure, ont de
nombreux défauts de recombinaison, une augmentation des CDBs de l’ADN non résolues,
16
une formation anormale du complexe synaptonemal et leur cycle cellulaire tend à s’arrêter
en prophase (Bishop & al, 1992). Chez la souris, les mutants possèdent des organes
génitaux de taille anormalement petite (Yoshida & al, 1998 ; Pittman & al, 1998). La
double délétion du gène provoque la stérilité de la souris et un mauvais appariement des
chromosomes.
1.5 Buts du projet de maîtrise La protéine Dmc1 humaine ne se comporte pas de façon identique à une recombinase
classique telle que RecA ou Rad51. Son activité d’échange de brin est peu efficace et,
contre toute attente, cette recombinase n’est pas connue pour former des filaments
hélicoïdaux sur l’ADN. Dernièrement, l’équipe de Patrick Sung a pu observer, dans des
conditions spécifiques, une structure hélicoïdale de hDmc1 propre aux recombinases
(Sehorn & al, 2004). La question qui se pose est de savoir pourquoi cette protéine n’est pas
toujours apte à former un beau filament? Afin d’y répondre, nous tentons, par ce projet de
recherche, d’obtenir le plus d’informations fondamentales sur cette protéine. Pour y
parvenir, j’avais comme objectifs, de cloner le gène de Dmc1 de Schizosaccharomyces
pombe dans un vecteur d’expression, d’exprimer cette protéine chez E.coli, et de purifier la
protéine de fusion produite. Le modèle S.pombe a été choisi pour effectuer ces recherches
pour des raisons stratégiques. D’abord contrairement à l’humain, il est facile d’obtenir des
cellules méiotiques chez la levure, ensuite, il y a moins de compétition chez la levure
S.pombe que chez S.cerevisiae. Une fois la purification protéique complétée, je me devais
d’étudier les caractéristiques biochimiques et structurales de cette protéine, ce qui nous
permettra de les comparer avec les connaissances acquises sur la protéine humaine. Toutes
ses informations permettront éventuellement de mieux comprendre le fonctionnement de
cette protéine et de corréler ces données avec les études génétiques et biochimiques
montrant l’importance de cette protéine lors de la recombinaison méiotique.
17
2 Matériels et méthodes
2.1 Le système d’expression pET chez Escherichia coli Nous avons utilisé le système pET16b (Novagen) afin de cloner et d’exprimer les protéines
Rad51 et Dmc1 de S.pombe chez l’organisme procaryote Escherichia coli. L’avantage de
ce système est que l’expression de la protéine est induite et contrôlée par l’ajout
d’isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture bactérienne. En effet, les gènes
sous le contrôle du T7lac promoteur sont exprimés suite à la transcription de la T7
polymérase bactérienne par l’induction à l’IPTG. Lors de l’utilisation de ce système, il est
important d’effectuer le clonage dans une souche exempte de T7 polymérase. La protéine
ne sera donc pas exprimée de façon basale, ce qui limitera l’instabilité du plasmide
d’expression et la toxicité (s’il y a lieu) pouvant être engendrée par l’expression protéique.
Une fois le clonage effectué dans la souche bactérienne DH5α, le plasmide est transféré
dans une souche d’expression. Nous avons utilisé la souche FB850 (E.coli BL21 DE3,
RecA-) comme souche d’expression. La délétion de RecA évite les risques de
contaminations par cette recombinase dans notre préparation protéique. Un autre avantage
majeur du système pET est qu’il permet d’ajouter une étiquette de type his-tag facilitant la
purification de la protéine recombinante sur une colonne de cobalt. Le vecteur pET16b
utilisé nous permet d’ajouter une étiquette d’histidine en extrémité amino-terminale de la
protéine produite. Ainsi, nous avons créé les protéines spRad51 et spDmc1 munies d’une
séquence 10-histidines.
2.2 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) L’amplification des gènes rad51(+) et dmc1(+) de Schizosaccharomyces pombe est la
première étape essentielle à la production protéique. Pour ce faire, les gènes ont été ciblés
dans une banque mitotique et méiotique d’ADN complémentaire de S.pombe à l’aide
d’amorces spécifiques. Le PCR a été effectué identiquement pour les 2 gènes .
Mélange réactionnel :
0,6 μL des amorces (voir tableau 2.1 pour concentration)
18
8 μL dNTPs (2.5mM) (Pharmacia) 1 μL S.pombe cDNA library (Clontech) 10 μL tampon Pfu 10 X (NEB) 2 μL Pfu polymérase (NEB) 100 μL volume final complété avec de l’eau, répartis en 3 réactions PCR
Programme d’amplification des gènes sprad51 et spdmc1 :
Dénaturation initiale : 95oC 30 secondes Dénaturation : 95oC 30 secondes Hybridation des amorces : 48oC 60 secondes Élongation : 68oC 3 minutes Nombre de cycles : 32
Les produits PCR sont précipités à l’acétate de sodium (Ajouter 1/10 volume de NaOAc pH
7.4 3 M et 2 volumes EtOH 100% à la solution à précipiter) et, suite à leur resuspension
dans 25 μL de TE pH 8.0, mis sur gel d’agarose 1%. La comparaison de la taille des
fragments obtenus s’effectue à l’aide du marqueur de poids moléculaire 1Kb (invitrogen).
2.3 Gel d’agarose La qualité, la taille et la concentration d’ADN sont vérifiées sur gel d’agarose. La
concentration du gel varie, généralement de 0.8 à 1.2% selon la taille de l’ADN à
visualiser. Afin de visualiser l’ADN, on ajoute du bromure d’éthidium (Sigma) au gel, de
façon à ce qu’il s’intercale entre les bases de la chaîne nucléiques. Le tampon de migration
est constitué de TAE1X, fait à partir d’une solution concentrée 50 X (242 g Tris, 57.2 mL
acide acétique et 100 mL EDTA 0.5 M pour un volume final de 1 litre). L’électrophorèse
est effectuée dans une cuve prévue à cet effet (Biorad) en s’assurant que le gel est submergé
de tampon. Les échantillons d’ADN sont déposés dans les puits à l’aide d’une solution de
Tableau 2.1 : Amorces utilisées lors de l’amplification par PCR Nom
Am orceug/uL de l'am orce
Gène am plifié
Taille du gène
NdeI
BglII StuI Stop
NdeI
Bam HI Stop
1 Kb
1 Kb
JYM1
JYM2
JYM11
JYM12 0,85
Séquence de l'am orce (5'-)
dm c1(+)
rad51(+)
TAAAGTCATATGGAAGAATTCGCAGAGGGG
AATAGAGATCT AGGCCT TTAGGAAACGTCTGCTATGCCAC
TAACAAGTTCATATGGCAGATACAGAGGTG
CTAAGGATCC TTAGACAGGTGCGATAATTTCCTTGGGATC
1,09
1,08
1,00
19
chargement 1 X (à partir de la solution 6 X: 50% glycérol, 0.25% bleu bromophénol, 0.25%
Xylène cyanol). La migration s’effectue généralement à 100 volts et la visualisation de
l’ADN se fait par autoradiographie.
2.4 Clonage des gènes rad51(+) et dmc1(+) dans les vecteurs d’expression
Lors de l’amplification par PCR, des sites de restrictions ont été ajoutés de part et d’autre
des gènes afin de faciliter le clonage. Ces sites, NdeI, BamHI et BglII sont compatibles
avec ceux des vecteurs utilisés. Cependant, le site NdeI se retrouve déjà dans la séquence
codante des deux gènes. La digestion partielle consiste à titrer une enzyme de digestion et
nous permet d’obtenir un produit partiellement digéré qui sera sélectionné, selon sa taille,
par extraction sur gel d’agarose.
Digestion de S.pombe Rad51 par NdeI et par BamHI :
SpRad51 possède un site NdeI à l’intérieur de sa séquence codante, cependant, suite à une
titration d’enzyme il semble que le site interne ne soit jamais digéré. Une double digestion
de SpRad51 peut donc être effectuée.
Mélange réactionnel :
5 μL réaction de PCR 1 μL NdeI (20 U/μL, NEB) 0.5 μL BamHI (20 U/μL, NEB) 2 μL tampon BamHI 10 X (NEB) 20 μL volume final complété avec de l’eau Digestion à 37oC durant une heure suivi d’un extraction sur gel d’agarose 1%.
Digestion de S.pombe Dmc1 par NdeI et BglII:
SpDmc1 possède un site NdeI interne nécessitant une digestion partielle. Pour ce qui est du
site BglII, il est compatible avec le site BamHI utilisé pour les différents clonages.
Mélange réactionnel :
5 μL réaction de PCR 1 μL NdeI des différentes dilutions* (20 U/μL, NEB) 0.5 μL BglII (10 U/μL, NEB)
20
2 μL tampon NEB2 10 X (NEB) 20 μL volume final complété avec de l’eau * Dilution de l’enzyme NdeI (20 U/μL) : non-dilué, 1 :1, 1 :3 et 1 :7 dans du tampon 1 X.
La digestion s’effectue à 37oC durant une heure et est déposée sur gel d’agarose 1% afin de
procéder à l’extraction du fragment d’approximativement 1 Kb.
2.5 Préparation du vecteur pET16b Le vecteur pET16b est utilisé pour le clonage de SpRad51 et de SpDmc1. Dans les deux
cas, le vecteur est préparé en le digérant par les enzymes NdeI et BamHI afin de permettre
l’insertion des gènes rad51(+) et dmc1(+).
Mélange réactionnel :
10μL vecteur pET16b (390ng/μL) 6μL tampon BamHI 10 X (NEB) 1μL NdeI (20U/μL, NEB) 1μL BamHI (20U/μL, NEB) 60μL volume final complété avec de l’eau
La digestion s’effectue dans un tube eppendorf à 37oC pour une heure. Suite à quoi, 1μL
de NdeI (20 U/μL) est ajouté pour compenser la demi-vie de trente minutes de cet enzyme.
L’incubation est reprise dans les mêmes conditions pour une deuxième heure. Suite à la
digestion, 1 μL de CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase,10 U/μL, NEB) est ajouté et le
tout est remis pour une troisième heure à 37oC. Cette dernière étape, la déphosphorylation,
nous assure que le plasmide ne se refermera pas sur lui-même lors du clonage.
Le produit de digestion est déposé sur gel d’agarose 1% afin de pouvoir vérifier la qualité
du produit et permettre sa purification par extraction sur gel (Qiaquick Gel Extraction Kit).
2.6 Extraction sur gel d’agarose Cette technique permet d’extraire des fragments d’ADN de 70 pb à 10 Kb de longueur. Le
dépôt sur gel de l’ADN permet de purifier le matériel génétique de tout enzyme. De plus,
21
la migration du gel permet de vérifier la taille du fragment obtenu suite à une digestion
enzymatique et la sélection du fragment désiré s’il y a lieu.
L’ADN est déposé sur un gel d’agarose comme décrit précédemment en section 2.3.
L’électrophorèse s’effectue dans un tampon TAE 1X et la visualisation du gel se fait sous
les U.V. de grande longueur (320 nm) d’onde afin de minimiser l’effet mutagène de ces
derniers. La bande désirée peut ensuite être découpée à l’aide d’un scalpel et l’extraction
de l’agarose s’effectue avec la trousse QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) selon les
instructions du manufacturier.
2.7 Clonage Une fois les produits purifiés, il suffit de les précipiter ensemble par la méthode à l’acétate
de sodium mentionné précédemment (section 2.2) pour ensuite procéder à la ligation par la
ligase T4. Le tout est resuspendu dans le mélange de ligation qui comporte en plus du
vecteur et de son insert, 40 U de T4 DNA ligase (NEB), 1 μL de tampon (T4 DNA ligase
10 X, NEB) pour un volume final de 10 μL. Le tout est incubé toute la nuit à 16oC.
2.8 Transformation des cellules compétentes Afin de maintenir de façon stable la construction, il est préférable d’effectuer la
transformation dans une souche qui ne produira pas la protéine. De cette façon, la toxicité
est réduite ce qui limite les probabilités de rejet du vecteur par la bactérie. Différentes
souches bactériennes ont été utilisées lors des transformations. Le tableau qui suit dévoile
les caractéristiques spécifiques à chacune d’elles.
Tableau 2.2 : Cellules compétentes utilisées lors de diverses transformation par choc thermique.
Antibiotique ConcentrationDH5 Invitrogen Oui Oui Non Aucun
JM109 Stratagene Oui Oui Non AucunFB850 Oui Oui Oui Cam 25ug/mL
Souche recA1 endA1Résistance
Provenance T7 polymérase
22
Les cellules compétentes choisies doivent lentement être décongelées sur glace avant de
leur ajouter l’ADN à transformer. La quantité généralement utilisée est de 100 ng pour 200
μL de cellules. Une fois le produit de ligation ajouté, il suffit d’incuber les cellules trente
minutes sur glace avant d’effectuer un choc thermique de 90 secondes à une température de
42oC. Suite à quoi, les cellules sont reposées immédiatement sur glace pour une durée de
deux minutes. Finalement, on ajoute 1mL de milieu LB (1% tryptone, 0.5% extrait de
levures, 1% NaCl) aux cellules et on incube une heure à 37oC avant de centrifuger (10
minutes, 13000 rpm), de resuspendre dans 200 μL de milieu et d’étaler sur milieu de
croissance contenant les antibiotiques appropriés.
2.9 Préparation d’ADN plasmidique L’ADN plasmidique est purifié pour permettre l’obtention d’une grande quantité de
matériel nécessaire aux diverses manipulations et au séquençage. Dépendamment de la
quantité nécessaire, trois trousses peuvent être utilisées : QIAGEN plasmid mini, midi ou
maxi. Pour ce faire, il suffit d’inoculer un milieu de culture LB contenant 2% d’agar et les
antibiotiques appropriés à partir de la souche conservée dans le glycérol (50% culture
bactérienne, 25% glycérol conservé à –80oC). L’incubation d’une nuit à 37oC précède la
préculture de deux à cinq millilitres de milieu LB avec antibiotiques et une seconde
incubation, avec agitation, identique à la première. Le jour suivant, une dernière culture de
5, 100 ou 500 mL (selon que c’est une mini, midi ou maxi) est effectuée à partir d’une
dilution 1/500 de la solution de préculture. Cette dernière culture bactérienne est incubée
toute une nuit sous agitation à 37oC avant d’être centrifugée à 400 rpm durant 30 minutes à
4oC. Une fois le culot bactérien en main, il suffit de le resuspendre dans la quantité
appropriée de tampon de resuspension P1 (voir tableau 5 pour la composition des tampons
et les quantités requises). La lyse s’effectue en ajoutant le tampon de lyse P2. Il est bien
important de ne pas laisser agir ce dernier tampon plus de cinq minutes, après quoi on le
neutralise avec le tampon P3. Lors de la préparation d’ADN plasmique à l’aide de la
trousse « QIAGEN plasmid mini », on procède immédiatement à la purification sur
colonne. Pour ce qui est de la midi et de la maxi, doit d’abord laisser le mélange sur glace
pour 15 à 20 minutes avant de centrifuger le tout à 20000 g durant 30 minutes à 4oC. Le
23
surnageant peut alors être déposé sur la colonne prééquilibrée. Les lavages des colonnes
s’effectuent avec le tampon QC tandis que l’élution se fait à l’aide du tampon QF. Les
petites colonnes de mini donnent un éluat de 50 μL prêt à être utilisé tandis que les éluats
des midi et maxi doivent être précipités avec 0.7 volume d’isopropanol à 11000 rpm pour
30 minutes à 4oC. Ensuite, le culot est lavé avec de l’éthanol 70% avant d’être resuspendu
dans du TE pH 8.0.
La concentration d’ADN plasmidique a été déterminée par la densité optique de la solution.
Afin de pouvoir effectuer la lecture optique, il faut tout d’abord diluer la solution 1 :100.
La lecture de la valeur est prise sur le spectrophotomètre Spectronic Genesys2 suite à une
comparaison avec un blanc constitué de 500 μL d’eau déposé dans une cuvette de quartz
Tableau 2.3 : Composition des tampons et quantités nécessaires à la préparation d’ADN plasmidiques
Nom Fonction Composition Mini Midi Maxi50mM Tris-Cl pH8.0;
10mM EDTA;100ug/mL RNase A
200mM NaOH;1% SDS (p/v)
P3 Neutralisation du tampon de lyse
3.0M acétate de potassium pH5.5
0,35 4 10
750mM NaCl;50mM MOPS pH7.0;15% isopropanol (v/v);
0.15% Triton X-100 (v/v)
1.25M NaCl;50mM MOPS pH7.0;15% isopropanol (v/v)
1.25M NaCl;50mM Tris-Cl pH8.5;15% isopropanol (v/v)10mM Tris-Cl pH8.0;
1mM EDTA
2x30QC Lavage de la colonne
Non
PE 0,75 NonNonLavage de la colonne
Quantité utilisée (mL)Tampon
P1Resuspension de la culture bactérienne
0,25 4 10
10
QBTÉquilibration de
la colonne Non 4 10
P2 Lyse cellulaire 0,25 4
2x10
EB Élution de la colonne
TE Resuspension de l'ADN
Non Selon le culot
QF Élution de la colonne
Non
Selon le culot
0,05 Non Non
155
24
(Sigma). Afin de ne pas altérer les résultats, la lecture de l’échantillon est effectuée dans la
même cuvette de quartz nettoyée. La lecture de la densité optique s’effectue à la longueur
d’onde de 260 nm. La concentration se calcule selon la formule suivante, en n’oubliant pas
de prendre en compte le facteur de dilution :
ADN (μg/μL) = D.O.260 x facteur de dilution x 0.05 μg/μL
Amorce d’ADN (μg/μL) = D.O.260 x facteur de dilution x 0.033
(Puisque qu’il faut 0,05 μg/μL d’ADN pour obtenir une D.O.260 = 1 et 0,033 μg/μL lorsqu’il s’agit d’amorce d’ADN.)
2.10 Séquençage Le Laboratoire de Synthèse et d’Analyse d’acides nucléiques de l’Université Laval a
effectué le séquençage des divers clones construits. Les échantillons furent envoyés selon
leurs demandes sous forme
de plasmides dilués dans
l’eau à 100 ng/μL à raison de
1 μg par réaction suite à une
purification par trousse
QIAGEN. Les amorces (voir
tableau 2.4) sont quant à
elles expédiées à raison de 5
μL par réaction à une
concentration de 1.6 μM.
2.11 Mutagenèse Le « QuikChange® Site-
Directed Mutagenesis Kit » de Stratagene permet d’effectuer des mutations dirigées. Le
principe, basé sur l’amplification par PCR, utilise des amorces construites spécifiquement
pour forcer la mutation du produit PCR. Habituellement utilisé pour de courtes
insertions/délétions ou des mutations ponctuelles, nous avons utilisé ce principe afin
d’éliminer l’intron génomique que nous avions obtenu. En effet, l’utilisation d’une banque
Tableau 2.4 : Amorces utilisées lors du séquençage Nom
amorce Séquencede l'amorce (5'-) Gène cible
JYM 3 AAGGTTTCAGCGAAGCCAAA dmc1(+)JYM 4 GATACAGAAGGAACATTTCG dmc1(+)JYM 5 CTATTTCGGGTTGACTATTC dmc1(+)JYM 6 TGATGTTTGCGTCCAACGAT dmc1(+)JYM 7 AGGTGTAATCACATAACTGC dmc1(+)JYM 8 TTTGTTGCCTTTCTGATAAT dmc1(+)JYM 9 AATGCTACTTTTCCTTCGGC dmc1(+)
JYM 10 AGAAATCTCTTTGTGGACAT dmc1(+)JYM 13 GGGATTTACCACCGCCACTG rad51(+)JYM 14 GGTGGTGGTGAAGGTAAATG rad51(+)JYM 15 ATTCGGTATTGCTGTTGTCA rad51(+)JYM 16 TAGTGGTTGTGGTAGTCTTA rad51(+)JYM 17 GCATTTCAGGAGCAGAGAGC rad51(+)JYM 18 TAATGCTTCCAGTCTCAACC rad51(+)JYM 19 CATTTGTAAGGGCATAGGAC rad51(+)
25
d’ADNc partiellement mitotique a impliqué l’amplification génomique du gène méiotique
dmc1(+). Les amorces sont construites de façon à forcer la formation d’une boucle avec
l’ADN génomique à éliminer du produit PCR. Pour ce faire, nous avons conçu des
amorces composées de 42 nucléotides, 21 se situant de part et d’autre de l’intron (voir
tableau 2.5). Le protocole utilisé diffère légèrement de celui fourni par Stratagene.
Une première amplification est effectuée avec les amorces séparées. Ensuite, les produits
d’amplification de chaque amorce sont mélangés afin de procéder à l’amplification
exponentielle du gène en lui supprimant son intron. Le même programme d’amplification
est utilisé cette fois-ci effectuant 18 cycles.
Mélange réactionnel :
125 ng une seule des deux amorces 50 ng plasmide pET16b-spdmc1génomique 5 μL tampon 10 X Reaction buffer (Stratagene) 1 μL dNTPs mix (Stratagene) 50 μL volume final complété avec de l’eau
Programme de mutagenèse :
Dénaturation initiale : 95oC 30 secondes Dénaturation : 95oC 30 secondes Hybridation des amorces : 55oC 60 secondes Élongation : 68oC 14 minutes ( 1 min / kb de plasmide) Nombre de cycles de la première amplification : 10 Nombre de cycles de la deuxième amplification : 18
Une fois la mutation effectuée, on ajoute 1 μL d’enzyme de restriction DpnI (10 U/μL,
Stratagene) afin de digérer le brin parental. Ce dernier, provenant d’une souche d’E.coli
dam+ est méthylé et, contrairement au brin nouvellement formé, il sera reconnu et digéré
spécifiquement par l’enzyme DpnI. Une fois l’enzyme ajouté, on agite la réaction et on
Tableau 2.5 : Amorces utilisées lors de la délétion dirigée de l’intron génomique
Nom de l'amorce Séquence de l'amorce (5'-)
JYM74 TGAAGACCTAACTGCTCACGGGATTGGTATGACCGATATCATJYM75 ATGATATCGGTCATACCAATCCCGTGAGCAGTTAGGTCTTCA
26
incube une heure à 37oC après s’être assuré que le milieu réactionnel reposait au fond du
tube.
Les bactéries supercompétentes XL1-Blue (Stratagene) servent à transformer les produits
de la mutagenèse une fois l’ADN non muté digéré. Le protocole utilisé a préalablement été
décrit en section 2.8, toutefois, le temps de choc thermique de ces bactéries est de 45
secondes.
2.12 Gel d’acrylamide L’extrait protéique est déposé dans un tampon d’échantillonnage 2 X (0.125 M Tris-HCl
pH 6.8, 2% SDS, 10% glycérol et 1 mg/mL bleu bromophénol) de sorte à ce que la
concentration finale soit de 1 X. L’échantillon est ensuite bouilli pour trois minutes, afin de
réduire les ponts disulfures et de permettre l’observation des monomères protéiques.
L’échantillon est généralement déposé sur gel d’acrylamide 10% (0.125 M Tris-HCl pH
6.8, 0.1% SDS, 10% acrylamide, 0.1% amonium persulfate (APS), 0.01% TEMED) avec
un gel d’empilement de 6% ( 0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1% SDS, 6% acrylamide, 0.1%
APS, 0.01% TEMED ). Le tampon de migration 1 X est généré à partir de la solution 5 X
(125 mM tris base, 950 mM glycine, 0.5% SDS).
2.13 Production protéique
Production de spRad51 :
La production de protéine spRad51 s’effectue à partir d’une culture de huit litres de milieu
LB-amp (100 μg/mL)-cam (50 μg/mL) répartis en dix erlenmeyers de 800 millilitres
chacun. La culture est inoculée suite à une dilution 1 :100 d’une préculture elle même
inoculée à partir d’un pétri ensemencé. Il est préférable de partir avec une transformation
fraîche plutôt qu’à partir de la souche conservée dans 25% de glycérol. La souche FB850
transformée avec le plasmide d’expression pET16b-spRad51 croît en milieu LB-amp (100
μg/mL)-cam (50 μg/mL) à 37oC sous agitation à 250 rpm. La production de protéine
spRad51 est induite par l’ajout de 0.1 mM IPTG lorsque la densité de la culture à atteint la
phase logarithmique soit D.O600 de 0.48-0.5. L’induction se poursuit selon les mêmes
27
conditions d’incubation pour une durée de quatre heures. Les bactéries sont ensuite
récoltées par centrifugation dans une centrifugeuse de type Sorvall RC 26 plus à 6000 rpm
à 4oC durant quinze minutes dans le rotor SLA-3000. Les culots cellulaires sont ensuite
congelés sur glace sèche avant d’être conservés à –80oC.
Production de spDmc1 :
La première étape consiste à ensemencer une gélose LB-amp (100 μg/mL)-cam (50 μg/mL)
à partir d’une transformation fraîchement effectuée ou de la souche conservée dans 25 % de
glycérol. Les colonies isolées obtenues par l’incubation à 37oC de cette culture seront alors
prélevées afin d’ensemencer une préculture de milieu LB-amp (100 μg/mL)-cam (50
μg/mL). L’induction se fait en milieu tryptone-phosphate (20 g/L Bacto-tryptone, 2 g/L
Na2HPO4, 1 g/L KH2PO4, 8 g/L NaCl, 15 g/L extrait levure, 2 g/L glucose) suite à une
dilution 1 :100 à partir de la préculture. La croissance bactérienne a lieu à 37oC sous
agitation à 250rpm jusqu’à une D.O.600 de 0.48-0.5, suite à quoi il y a induction par ajout de
0.05mM IPTG. Le milieu de culture est transféré à 30oC avec agitation à 250 rpm pour une
induction de deux heures. Une fois l’induction terminée, les cellules sont récoltées par
centrifugation et conservées à –80oC comme décrit précédemment.
2.14 Extraction de protéines Les protéines sont extraites à l’aide du tampon de lyse (0.1 M Tris-HCl pH8.0, 2 mM
EDTA, 5% glycérol, 0.5 mM DTT) ou à l’aide du tampon T (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500
mM NaCl, 10% glycérol, 0.02% Triton x-100 ) contenant 5 mM d’imidazole. La lyse est
effectuée sur glace à l’aide du sonicateur. De façon générale, une belle lyse est obtenue
suite à une série de trois traitements de 30 secondes entrecoupés de repos sur glace. Afin
de minimaliser la dégradation protéique par les protéases, certains inhibiteurs sont ajoutés
au tampon de lyse : PMSF (0.2 mg/mL), leupeptine (1 μg/mL), aprotinine (0.16 TIU/mL),
pepstatin A (1 μg/mL). Les concentrations inscrites correspondent aux concentrations
finales de chaque inhibiteur de protéase.
Un extrait total des protéines est obtenu suite à la sonication de la culture. La
centrifugation à 4oC à une vitesse de 35000 g pour une durée d’une heure permet d’obtenir,
28
par le surnageant, un extrait protéique soluble. Lors de petit échantillonnage quantitatif, la
centrifugation s’effectue à 4oC à une vitesse de 13000 rpm pour une durée de dix minutes.
2.15 Purification de la protéine Dmc1 exprimée chez E.coli Le culot bactérien du 8 litres obtenu lors de la production protéique est resuspendu sur
glace dans 180 mL de tampon de lyse comme décrit précédemment et centrifugé afin
d’éliminer la partie insoluble. Au matériel soluble récupéré, les inhibiteurs de protéases
PMSF (0.2 mg/mL), aprotinine (0.016 TIU/mL), leupeptin (1 μg/mL) sont ajoutés et une
dialyse de 8 heures (3 x 4.5 litres) est effectuée dans un tampon spermidine (20 mM tris-
acétate pH 7.5, 7 mM spermidine-NaOH pH 7.5 et 0.1 mM DTT). Le précipité blanc
obtenu est récupéré par centrifugation (T647.5, Sorvall) à 20000 rpm pour une durée de 20
minutes à 4oC et, resuspendu par la suite dans 120 mL de tampon T contenant 5 mM
imidazole et inhibiteurs de protéases; PMSF (0.2 mg/mL), aprotinine (0.016 TIU/mL) et
leupeptin (1 μg/mL).
Le surnageant est ensuite déposé sur une colonne de 20 mL Talon (Clontech) lavée dans le
tampon T contenant 30 mM et 40 mM d’imidazole pour un total de 18 volumes de colonne.
L’élution est produite par augmentation de la concentration d’imidazole de 40 mM à 0.8 M
lors d’un gradient de 8 volumes de colonne. Les fractions d’élution ont été analysées par
migration sur gel SDS-PAGE 10%, permettant ainsi de sélectionner les fractions d’élution
de la protéine de choix (Rad51 ou Dmc1 selon le cas). Les fractions d’élution
sélectionnées furent ensuite supplémentées en inhibiteurs de protéases (PMSF, aprotinine,
leupeptine) et dialysées pour 80 min (2 x 2L, en évitant les précipitations) dans du tampon
R (20 mM tris-HCl pH 8.0, 10% glycérol et 0.5 mM DTT) contenant 150 mM KCl. Les
inhibiteurs de protéases aprotinine et leupeptine sont ajoutés à la solution qui sera déposée
sur colonne Héparine de 10 mL (HiPrepTM16/10 Héparine FF, Amersham Pharmacia
Biotech). Ayant découvert que la protéine Dmc1 de S.pombe ne lie pas l’héparine mais que
certains contaminants s’y lient, nous n’avons pas effectué de lavages ni d’élution de cette
colonne. Le « flow through » contenant la protéine d’intérêt est observé sur gel SDS-
PAGE 10% et, est déposée sur colonne MonoQ de 1 mL (Mono QTM, Amersham
Pharmacia Biotech). Cette colonne est lavée à l’aide de 20 mL de tampon R contenant 150
29
mM KCl et l’élution se fait lors d’un gradient de 10mL contenant de 0.15 à 1.0 M KCl dans
le tampon R. Afin de conserver la protéine dans un tampon compatible aux essais
biochimiques, une dialyse de 10 minutes est effectuée dans un tampon de conservation
contenant 20 mM tris-acétate pH 7.5, 250 mM NaCl, 10% glycérol et 0.5 mM DTT. Le
tout fût conservé en aliquotes de 10 μL à –80oC.
2.16 Purification de la protéine Rad51 exprimée chez E.coli La purification de cette protéine s’effectue comme décrit par Baumann et al. (1997). Il
s’agit en fait d’une précipitation à la spermidine suivie de chromatographies sur colonnes
Hydroxylapatite, Héparine et MonoQ.
2.17 Filtration sur gel 30 μg d’échantillon de protéines purifiées sont déposés sur colonne Superdex 200 PC
3.2/30 (Pharmacia) à l’aide du système FPLC explorer 10. Le poids moléculaire des
protéines purifiées est alors déterminé par comparaison avec 200 μg d’un standard de poids
moléculaire (Biorad: bovine thyroglobulin (670 kDa), bovine gamma globulin (158 kDa),
chicken ovalbumin (44 kDa), horse myoglobulin (17 kDa), vitamine B-12 (1.35 kDa)).
2.18 Double-hybride Préparation des plasmides
Les vecteurs pGADT7 et pGBKT7 (Clontech) permettent d’exprimer un gène d’intérêt en
fusion avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (DBD, « DNA binding domain », via le
vecteur pGBKT7) et de vérifier son interaction avec un second gène exprimé en fusion avec
le domaine d’activation Gal4 (AD, domaine d’activation, via le vecteur pGADT7).
L’interaction entre les 2 protéines favorise le rapprochement entre les deux domaines. Il
s’en suit la transcription des gènes rapporteurs.
La préparation des vecteurs de double-hybride par digestion NdeI et BamHI a permis d’y
introduire plusieurs gènes disponibles dans le laboratoire (Dmc1 humain et de la levure
S.pombe et Rad51 de l’humain et de S.pombe).
30
Mélange réactionnel :
5 μg vecteurs pGBKT7 ou pGADT7 (Clontech) 2 μL NdeI (20 U/μL, NEB) 1 μL BamHI (20 U/μL, NEB) 5 μL tampon BamHI 10 X (NEB) 50 μL volume final complété avec de l’eau Le plasmide pGBKT7 contenant le gène Hop2 de souris a été gracieusement fourni par Dr
Dan Camerini-Otero (NIH, USA).
Transformation de levure Saccharomyces cerevisiae
Un milieu de culture YPD (1% extrait de levure, 2% Peptone, 20% Glucose) contenant 2%
agar est ensemencé à partir de S. cerevisiae AH109 (Clontech) ou de S. cerevisiae Y187
(Clontech). Cette dernière souche sera utilisée spécifiquement lorsque des tests de β-
galactosidase seront effectués. La culture est incubée à 30oC pour une durée de 3 jours. De
cette culture, seulement les colonies rouges (ADE-) seront prélevées afin d’inoculer 25 mL
de milieu YPD, lequel sera incuber durant 2 jours à 30oC. Par la suite, le nombre de
cellules présentes en solution sera déterminé d'après la règle de trois suivantes :
D.O.600= 0.1 =1 x 106 cellules/mL
Ce renseignement permet de déterminer le volume de culture nécessaire à l’obtention de 5 x
108 cellules. Une fois ce volume prélevé, on procède à sa centrifugation (3000 g ,5 min) et
on lave le culot avec 25 mL d’eau distillée stérile. On répète et on resuspend le culot
obtenu dans 3 mL d’une solution 0.1 M de lithium acétate stérile qui sera déposée 15
minutes au bain-marie (30oC) et centrifugée pour une troisième fois. Le culot sera cette
fois-ci resuspendu dans 1 mL de lithium acétate 0.1 M stérile et la culture sera répartie en
dix eppendorf de 100 μL Ces derniers seront centrifugés (13000 rpm, 1 min) afin de
conserver le culot cellulaire. Toujours en travaillant de façon stérile, l’ajout de 240 μL de
polyéthylène glycol 50%, 36 μL de lithium acétate 1 M, 25 μL « ssCarrier DNA » dénaturé
(2 mg/mL), et 2.5 μg des plasmides contenus dans un volume de 34 μL final sera effectué
en respectant l’ordre décrit. Suite à quoi, la solution sera resuspendue au vortex et incubée
successivement 30 minutes à 30oC et 30 minutes à 42oC. Lors du choc thermique,
l’inversion répétitive des eppendorfs favorise la transformation. Suite au choc thermique,
31
le culot cellulaire est récupéré (13000 rpm, 5 min) et le resuspendu dans 75 μL d’eau stérile
afin de pouvoir inoculer des milieux minimaux déficitaires en leucine et en tryptophane.
L’incubation de ces derniers se fera à 30oC pendant plusieurs jours.
Observation de l’interaction protéique
Les cellules transformées sont étalées sur un milieu minimal déficitaire en leucine,
tryptophane, adénine et histidine et complémenté de 2.5 mM aminotriazole. Les cultures
sont alors incubées à 30oC et une observation quotidienne de la croissance est effectuée.
Observation quantitative de l’interaction par β-galactosidase
Afin de quantifier les interactions entre protéines, des pétris minimaux déficitaires en
leucine et en tryptophane sont inoculés à partir des colonies Y187 transformées. Une
croissance adéquate est généralement obtenue suite à 2 jours d’incubation à 30oC. Lorsque
la taille des colonies est jugée convenable, on procède à un répliquât de celles-ci sur un
papier filtre Watman (VWR « brand filter paper qualitative »). Ce papier, une fois bien
imprégné des colonies sera déposé dans l’azote liquide. Ce traitement d’une durée de 15
secondes est effectué en s’assurant que les colonies se retrouve face vers le haut. Par la
suite, le papier filtre sera séché à température ambiante et déposé sur un deuxième papier
filtre ayant préalablement été submergé dans une solution Z-Xgal (100 mL tampon Z (16.1
g/L Na2HPO4-7H2O, 5.5 g/L NaH2PO4-H2O, 0.75 g/L KCl, 0.246 g/L MgSO4-7H2O, pH
ajusté à 7), 0.27 mL β-mercaptoéthanol et 1.67 mL X-gal (25 mg/mL)). Les papiers sont
ensuite incubés tels quel à 30oC. La coloration des colonies sera observée de façon
quotidienne.
2.19 Renaturation d’ADN simple brin par Dmc1 10 μL de réaction contenant la solution de renaturation (20 mM Hepes pH 7.5, 5 mM DTT,
100 μg/μL BSA, 5 mM Mg(OAc)2, 2 mM ATP pH 7.5, 100 mM NaCl) auquel on ajoute
400 nM de protéine Dmc1, sont conservés sur glace. Durant ce temps, la sonde pPB4.3
32
NdeI-HindIII marquée en 5’ est dénaturée 30 secondes dans l’eau bouillante. Suite à quoi,
la sonde est immédiatement déposée dans l’eau glacée afin d’éviter la renaturation
spontanée et, 450 nM sont déposés dans le mélange réactionnel. Une incubation de 5
minutes, ou du temps indiqué est effectuée à 20oC avant de procéder à l’arrêt de la
réaction. Pour ce faire, la protéine est dénaturée/dégradée par l’ajout de la solution d’arrêt
(10 % SDS, 10 mg/mL protéinase K) pour une période de 15 minutes à 20OC. L’analyse
des résultats est effectuée sur gel TBE 1X/acrylamide 4% par une migration de 2h15 à 150
volts. Le gel est ensuite séché sur papier DE81 et 3M pour ensuite permettre la
visualisation des résultats par autoradiographie. La quantification des résultats est effectuée
à l’aide du phosphorimager Storm 410.
2.20 Liaison de Dmc1 à l’ADN détectée par retardement sur gel Préparation des sondes
De l’ADN simple brin, double brin et protubérant 5’ et 3’ est préparé à partir d’un ADN
simple brin, SW136. 2.5 μg de ce simple brin est d’abord phosphorylé à l’aide de 2 μL de
T4 Polynucléotide kinase (10 U/μL, NEB), 15 μL de γATP (1 μCi/μL) dans 10 μL de
tampon PNK 10 X (NEB) dans un volume final de 100 μL. La réaction s’effectue durant
1h à 370C. Par la suite, la réaction est séparée en 5 aliquotes de 20 μL chacun auquel on
ajoute, selon la cas, 2.5 μg d’ADN (voir tableau 2.6) lequel sera soumise à un
réappariement avec le programme suivant :
Programme d’appariement des amorces:
Dénaturation initiale: 95oC 3 minutes Annelage : 65oC 10 minutes 50oC 10 minutes 37 oC 10 minutes 20 oC 10 minutes
33
Pause 4 oC
Les réactions sont déposées sur gel TBE 1X/10% acrylamide (à l’exception du numéro 5
qui est conservé pour le compte radioactif) pour une migration de 2 h à 275 volts.
L’autoradiographie permet ensuite d’aller recueillir les bandes d’ADN radioactif
correspondantes, lesquelles seront extraites du gel durant la nuit à l’aide de 250 μL de TE
0.5 X pH 8.0 sur rôtisseur. La radioactivité des échantillons est ensuite déterminée par
comptage en scintillation liquide, permettant ainsi de déterminer la concentration des
sondes. Les sondes sont conservées dans la boîte à cet effet à 4oC.
Réaction de retardement sur gel, titration protéique
La protéine est ajoutée à 10 μL d’une solution préchauffée 5 minutes à 37oC (20 mM
triethanolamine-HCl pH 7.5, 2 mM ATP, 2.5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT et 100 μg/μL
BSA) contenant 50 nM d’ADN (simple brin, double brin ou protubérant). La réaction
s’effectue durant 5 minutes à 37oC, laquelle sera arrêtée par fixation de la protéine sur
l’ADN par l’ajout de 0.2% de glutaraldéhyde et une incubation se poursuivant pour 15
minutes supplémentaires. La réaction est ensuite déposée sur gel TBE 1X/6% acrylamide
pour une durée de 2h15 à 150 volts suivie d’une autoradiographie.
Aliquotes ADN forméConcentration
uM
1 AucunGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACCCCGGGTTCGAAATCGATAAGCTTACAGTCTCCATTTAAAGGACAAG
simple brin 3,57
2 sw279CTTGTCCTTTAAATGGAGACTGTAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGAGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC
double brin 3,58
3 sw148 CTTGTCCTTTAAATGGAGACTGTAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTA protubérant 5' 4,71
4 sw414 CCGAATTCCTCGAGTCTAGAGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC protubérant 3' 3,56
5 Aucunpour le compte
ADN ajouté (5'-)
Tableau 2.6 : Séquence des amorces destinées à la création d’ADN simple brin, double brin et protubérant utilisés lors du retardement sur gel. La concentration indiquée est la concentration finale obtenue suite à la purification des amorces.
34
2.21 Activité d’échange de brin de la protéine Dmc1 Préparation de la sonde
L’ADN pPB4.3 est clivé NdeI-HindII de la façon suivante; 66.5 μg d’ADN digéré 3h à
37oC dans une réaction de 250 μL contenant 12.5 μL NdeI (20 U/μL, NEB) et 6.25 μL
HindIII (20 U/μL,NEB) dans 25 μL de NEB2 10 X. Suite à l’incubation, la
déphosphorylation des extrémités 5’ s’effectue par l’ajout de 4 U de CIP (10 U/μLNEB)
par μg d’ADN pour une durée de 1h à 37oC. Le produit de digestion est purifié par
extraction sur gel TAE1X/agarose 1%, la bande attendue est de 400pb. Le marquage de la
sonde est effectué par l’ajout de 100μCi de γATP (10 μCi/μL), de 2 μL de T4
Polynucléotide kinase (10 U/μL, NEB) dans la solution T4 PNK 10 X buffer (NEB) et un
volume final de 92 μL incubé 1h30 à 37oC. La sonde est ensuite purifiée sur colonne S400
HR (microSpin columns, Amersham Pharmacia) selon les indications du manufacturier.
Titration de la protéine Dmc1
La solution d’échange de brin (20 mM triethanolamine-HCl pH7.5, 1 mM Mg(OAc)2, 2mM
ATP, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 100 μg/μL BSA) ainsi que l’ADN simple brin pPB4.3
(15 μM) sont préchauffés 5 minutes à 37oC avant d’y ajouter la protéine selon les
concentrations indiquées. Ensuite, 0.828 μM de sonde marquée de 400 pb, complémentaire
à l’ADNsb pPB4.3, est ajoutée afin de poursuivre la réaction 1h30 à 37oC. L’arrêt de la
réaction s’effectue par l’ajout de 1/10 de volume de solution d’arrêt (0.1 mM Tris-HCl pH
7.5, 0.1 mM MgCl2, 3 % SDS, 5 μg/μL bromure d’éthidium et 10 mg/mL protéinase K) et
incubé 45 minutes à 37oC. Le tout est déposé sur gel TAE 1X/0.8% agarose contenant 1
μg/mL de bromure d’éthidium pour une migration de 2h30 à 65 volts. Le gel est séché sur
papier 3M avant d’être visualisé par autoradiographie.
Test de dépendance d’ATP et de Mg2+
Afin de déterminer si la réaction est dépendante de l’ATP ou de magnésium, la réaction
suivante a été effectuée dans les conditions similaires à celles décrites précédemment à
l’exception de la concentration de Mg2+ qui, lorsque présent dans la réaction, est de 2.5
35
mM. La réaction a été effectuée en présence ou en absence de magnésium, ainsi qu’en
présence de 20 mM final d’ATP, d’ATPγ-s ou d’AMP-PNP.
2.22 Microscopie électronique 10 μL de solution (20 mM triethanolamine-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 2 mM ATP pH 7.5,
2.5 mM Mg(OAc)2) contenant 3 μM d’ADN simple brin (φX174 ), de l’ADN protubérant
ou «gap circular » (pJYMAT4.2), de l’ADN double brin linéaire (pPB4.3) sont préchauffés
5 minutes à 37oC. Par la suite, la protéine Dmc1 est ajoutée avant de continuer l’incubation
pour un 10 minutes supplémentaire. La protéine est fixée sur l’ADN par l’addition de 0.2%
de glutaraldéhyde et une incubation de 15 minutes à 37oC. Par la suite, la réaction est
congelée sur glace sèche avant d’être conservée à –80oC et d’être expédiée au Dr Andrzej
et à Alicja Stasiak du Laboratoire d’Analyse Structurale de l’Université de Lausanne.
Ceux-ci ont coloré l’ADN par un traitement à l’uranyle acétate (Sogo & al, 1987) et
photographié les résultats obtenus.
3 Résultats
3.1 Clonage et mutagenèse Le gène dmc1+, amplifié
d’une banque génomique de
Schizosaccharomyces pombe
lors de l’amplification par PCR
contenait un intron. Cet intron,
de nature génomique, a été
enlevé à l’aide du protocole
modifié de mutagenèse publié
par Wang (Wang & Malcom,
1999). La séquence d’ADNc obtenue suite à cette délétion dirigée (voir figure 3.1),
comparée à celle publiée par Fukushima et al. (Fukushima & al, 2000), nous a indiqué un
gène de type sauvage.
3.2 Expression et purification de la protéine Dmc1 de S.pombe Le gène Dmc1, ainsi obtenu, a été inséré à l’intérieur du vecteur d’expression pET16b
(Novagen), permettant ainsi l’ajout d’une séquence 10-Histidine à l’extrémité N-terminale
de la protéine qui sera transcrite. La protéine recombinante formée a ensuite été exprimée
et purifiée d’une souche d’Escherichia coli RecA-. Cette dernière caractéristique a permis
d’éviter une éventuelle contamination de l’extrait protéique par la recombinase bactérienne
RecA. La fraction soluble de protéine induite a été évaluée à environ 30% de l’extrait total
de Dmc1 (voir Figure 3.2 (A); ligne 2 et 3). Ce rendement a été obtenu avec une induction
à 30oC dans un milieu Tryptone-Phosphate. Une précipitation sélective à la spermidine a
été effectuée comme première étape de purification. La protéine a ensuite été remise en
solution et déposée sur une colonne d’affinité Talon (voir figure 3.2 (A) ; ligne 4 à 17),
particulièrement efficace pour éliminer les contaminants. L’éluat sélectionné a tout de
même été déposé sur une colonne Héparine et sur une colonne MonoQ afin d’éliminer les
Figure 3.1 : Illustration de la mutagenèse effectuée sur l’ADN génomique.
37
Figure 3.2 : Expression et purification de la protéine Dmc1 de S.pombe. (A) Surexpression et purification sur Talon de la protéine exprimé chez E.coli. Ligne 1 : Marqueurs de poids moléculaire. Ligne 2 : Extrait protéique total suite à l’induction à l’IPTG. Ligne 3 : Extrait protéique soluble après centrifugation. Ligne 4 : Flow through de la colonne Talon. Lignes 5-8 : Lavages de la colonne avec tampon T contenant 30 mM imidazole. Ligne 9 : Lavage avec tampon T contenant 40 mM imidazole. Lignes 10-17 : élution de Dmc1 à l’aide du tampon T lors d’un gradient de 40-800 mM imidazole. (B) Dmc1 purifiée suite à la colonne MonoQ. Ligne 1 : marqueurs de poids moléculaire, Ligne 2 : protéine purifiée. Gel SDS-page 10% coloré au bleu de Coomassie.
nucléases et de
concentrer l’éluat.
Les résultats de
l’élution finale après
la dernière étape de
purification sont
présentés en partie (B)
de la figure 3.2
L’expression et la
purification de la
protéine Rad51 de
Schizosaccharomyces
pombe ont été
effectuées
conjointement à celles
de son homologue Dmc1. La protéine purifiée a ensuite été prise en charge par Synthia
Sauvageau, étudiante à la maîtrise. Les résultats obtenus avec cette protéine vous seront
présentés par cette collègue dans
un ouvrage subséquent.
3.3 Filtration sur gel La filtration sur gel de la protéine
Dmc1 effectuée sur une colonne
Superdex 200 a permis de
déterminer la masse moléculaire
de la protéine en solution. Le pic
d’élution de Dmc1, a eu lieu aux
fractions 21, 22 (figure 3.3 ; ligne
21-22), indiquant un poids
Figure 3.3 : Nature multimérique de la protéine Dmc1 de S.pombe. Détermination de la masse moléculaire de la protéine en solution par filtration sur colonne Superdex 200. Graphique : Chromatographe des standards de poids moléculaire. Western : Révélation western des fractions d’élution (numérotées ci-haut) avec un anti-histidine.
38
moléculaire correspondant à 310 kDa. D’un poids moléculaire de 39373 Da, il semble que
la protéine de fusion se présente sous forme octamérique en solution. Des résultats
similaires ont auparavant été obtenus lors de la découverte de la formation d’anneaux
octamériques par la protéine humaine (Masson & al, 1999 ; Passy & al, 1999). Il est
important de noter qu’aucune élution protéique n’a été observée au poids moléculaire
monomérique (figure 3.3 ; ligne 30).
3.4 Interaction homotypique de Dmc1 par double hybride Puisque la protéine est apte à interagir avec elle-même en solution, il est intéressant de
découvrir à quel domaine protéique est due cette interaction et si elle est possible avec
d’autres protéines. La protéine liée aux domaines de liaison et d’activation GAL4 a été
conjointement exprimée et mise en croissance sur un milieu minimal. Afin de déterminer
le domaine d’interaction de la protéine avec elle-même, celle-ci a été divisée en 3 domaines
distincts (voir figure 3.4 (c); domaine 1 : acides aminés 1-111, 2 : acides aminés 112-218,
3 : acides aminés 219-333). Chacun a été mis en contact avec la protéine entière exprimée
Figure 3.4 : Interaction par double hybride. (A et B) Cotransformation de la levure S.cerevisiae AH109 par les différents vecteurs d’expression. Croissance sur milieu minimal dépourvu de tryptophane, leucine, adénine, histidine et supplémenté de 2.5mM aminotriazole. (C) Diagramme des constructions utilisées et quantification de la croissance par activité β-galactosidase. AD : désigne une fusion au domaine d’activation Gal4 et DBD une fusion au « Gal4 DNA-binding domain ».
39
avec le domaine d’activation. Seul le domaine comportant les 111 premiers acides aminés à
démontrer une interaction avec la protéine entière. Ce résultat semble affirmer que la
capacité de Dmc1 d’interagir avec elle-même serait comprise dans ces 111 premiers acides
aminés. La protéine Dmc1 de S.pombe n’a démontré aucune interaction avec les protéines
Rad51 de pombe et de l’humain, ni avec la protéine Hop2 de souris (résultats non illustrés).
De plus, aucune interaction n’a été observée avec la protéine Dmc1 humaine, que ce soit en
présence de la protéine de levure pleine longueur ou de l’un de ses trois domaines distincts.
Malgré leur 57% de séquence conservée, il semble que le domaine d’auto-interaction ne se
soit pas conservé d’une espèce à une autre.
3.5 Liaison à l’ADN par Dmc1 de S.pombe Une recombinase a la
propriété de lier l’ADN.
Pour le vérifier, une
expérience de retardement sur
gel a été effectuée avec de
l’ADN simple brin, double
brin et protubérant (voir
figure 3.5). L’incubation de
la protéine Dmc1 purifiée en
présence de ces ADN a
engendré la formation d’un
réseau protéine-ADN
observable par migration sur
gel. Le réseau, caractéristique à l’assemblage de plusieurs molécules d’ADN et de
protéines liées, est observé par une migration presque nulle, soit un grand retardement sur
gel. La protéine, Dmc1, lie préférentiellement l’ADN simple brin à l’ADN double brin
(figure 3.5 lignes 2-5 ; 6-10), une liaison qui tend à être coopérative en concentration élevée
de protéine (figure 3.5 lignes 4-5 ; 14-15 ; 19-20). Lors de la quantification, il a été
démontré que seulement 6% du duplex sont liés par l’ajout de 500nM de Dmc1
Figure 3.5 : Retardement sur gel de la protéine Dmc1 de S.pombe. Liaison de la protéine sur 15μM d’ADN. Protéine fixée par ajout de 0.2% de glutaraldéhyde et déposée sur gel SDS-PAGE 8%. Titration croissante de protéine sur ADN sb (lignes 1-5), sur l’ADNsb (lignes 6-10) , sur ADN protubérant 5’ (lignes 11-15) et sur ADN protubérant 3’ (lignes 16-20).
40
comparativement à 70% de l’ADN simple brin dans les
mêmes conditions. La liaison à l’ADN protubérant est
légèrement inférieure à la liaison au simple brin et elle ne
démontre aucune préférence directionnelle. Tant les
extrémités 5’ libres que 3’ libres sont liées par la protéine.
Les conditions nécessaires à la liaison de la protéine à l’ADN
ont été déterminées lors d’expériences avec ADN simple
brin. La protéine, Dmc1, nécessite la présence d’ATP mais
non de son hydrolyse, afin de se lier à l’ADN. Cependant la
présence d’ATPγs permet une liaison beaucoup plus faible
que la présence d’AMP-PNP (figure 3.6). La présence de
magnésium, étudiée sur une large vague de concentration
(1mM à 25mM), est aussi nécessaire à la liaison de Dmc1 sur
l’ADN et est optimale à 2.5mM. La présence de sel (NaCl)
en solution, permet une liaison optimale à 50mM et est
inhibée lorsque supérieure à 200mM (résultats non illustrés).
3.6 Activité ATPase de Dmc1 de S.pombe Dmc1, membre de la famille des
recombinases, possède des sites
de liaison à l’ATP. Comme ses
confrères, la présence d’ADN
stimule l’activité ATPase de
Dmc1. Calculé en présence
d’ADN simple brin, Dmc1
hydrolyse 0.86 ATP/min, vitesse
qui diminue en présence d’ADN
double brin et en absence d’ADN
(voir figure 3.7). L’hydrolyse
Figure 3.7 : Activité ATPase de Dmc1 de S.pombe. % ATP hydrolysé en fonction du temps lorsque mise en présence et en absence d’ADN, comme indiqué dans la légende.
Figure 3.6 : Conditions favorables à la liaison à l’ADN. Liaison de Dmc1 à l’ADN simple brin en présence ou absence de différents facteurs.
41
effectuée par la protéine de pombe est similaire à celle de cerevisiae (0.7 ATP/min ; Hong
& al, 2001) et celle de l’humain (1.5 ATP/min ; Li & al, 1997).
3.7 Activité de renaturation de l’ADN par Dmc1 de S.pombe Sachant que Dmc1 lie efficacement l’ADN, on a voulu déterminer si cette protéine était
capable d’effectuer l’annelage d’ADN homologue. Effectué avec de l’ADN double brin
préalablement dénaturé, il a été possible
d’observer une renaturation spontanée
(figure 3.8 ; lignes 2-6) stimulée par l’ajout
de la recombinase méiotique (figure 3.8 ;
lignes 7-11). Cette réaction a été observée
dans le temps entre de 30 secondes et 10
minutes d’incubation, temps nécessaire au
plafonnement de la réaction (figure 3.8 ;
lignes 7-11). La renaturation, optimale en
présence de 2.5mM magnésium (figure 3.8 ;
ligne 12), est diminuée de moitié en absence
d’ATP (résultats non illustrés). Cette
dépendance de l’ATP a aussi été observée
Figure 3.8 : Renaturation de l’ADN par la protéine Dmc1 de S.pombe. Renaturation d’un duplex d’ADN de façon spontanée (sans protéine) et lors de l’ajout de Dmc1. (A) Renaturation dans le temps. (B) Renaturation en présence de diverses concentrations de magnésium lors d’une réaction de 5 minutes à 20oC. Réaction déposée sur gel SDS-PAGE 8% suite à sa déprotéinisation. En 1, duplex avant dénaturation, lignes 2-6 : Renaturation spontanée de la sonde dans le temps (A) ou en présence de concentration croissante de magnésium (B), lignes 7-11 : Renaturation stimulée par l’ajout de 400 nM de Dmc1 dans le temps (A) ou en présence de concentration croissante de magnésium (B).
Figure 3.9 : Réaction d’échange de brin par la protéine Dmc1 de S.pombe. Titration protéique sur 15μM ADN circulaire simple brin mis en présence de 828nM d’ADN double brin marqué. Ligne 1 : Réaction en absence de protéine, lignes 2-9 : augmentation croissante de protéine, selon l’indication de la figure.
42
Figure 3.10 : Microscopie électronique. (A) Filament hélicoïdal de Rad51 humain sur ADN simple brin. (B) Formation d’agrégats de Dmc1 humain sur ADN simple brin. (C) Protéine Dmc1 de S.pombe formant un filament hélicoïdal sur l’ADN protubérant (D) Filament désorganisé sur ADN simple brin. (E) Anneau octamérique de la protéine de levure en solution.
lors de la renaturation par la recombinase RecA (Bryant & Lehman, 1985).
3.8 Activité d’échange de brin Capable de stimuler l’appariement d’ADN homologue dénaturé, la réaction a été reprise
avec un ADN simple brin circulaire long de 4300 nucléotides, et un duplex de 400 paires de
bases homologues au simple brin. Malgré le fait que la protéine humaine est incapable
d’effectuer cette réaction dans ces conditions (résultats non illustrés), la protéine Dmc1 de
S.pombe a su effectuer la réaction d’échange de brin (voir figure 3.9). La réaction
d’échange de brin amenant la formation de molécules jointes est optimale à 5.25 μM de
Dmc1 (voir figure 3.9 ; ligne 8), ce qui correspond à un ratio d’un monomère pour 2.85
nucléotides. Résultat semblable au ratio 1 pour 3 de RecA et de Rad51.
3.9 Observation de filament protéique sur l’ADN par microscopie électronique
Sachant maintenant que la protéine étudiée est apte à lier l’ADN, à effectuer la renaturation
et l’échange de brin, nous avons décidé d’observer directement son interaction avec l’ADN.
En effet, lors de sa liaison à l’ADN, est-ce que cette recombinase adopte une structure
hélicoïdale propre aux recombinases ? Pour y répondre, nous avons observé, par
microscopie électronique, la protéine liée sur différents fragments d’ADN. D’après les
résultats obtenus, Dmc1 forme des filaments sur l’ADN. Cependant, deux purifications
43
distinctes ont été effectuées et, selon la préparation, la protéine ne réagit pas de façon
identique. Il semble qu’en présence d’ADN, la protéine pourrait former un filament
semblable à celui de la protéine Rad51 humaine (comparaison des figures 3.10 (A) et (C)
respectivement) tandis que certaines autres molécules ont plus tendance à former des
agrégats, un peu comme fait Dmc1 humain (figure 3.10 (B) et (D)).
4 Conclusions La recombinaison homologue a lieu lors de la méiose. Ce mécanisme découvert depuis de
nombreuses années est toutefois méconnu. Son étude, chez l’homme, n’est pas tâche facile.
Les enjeux éthiques d’un approvisionnement en tissus méiotiques humains (ovaires /
testicules) et l’inexistence de lignée cellulaire méiotique stable en sont la cause. Cette
inaccessibilité de tissus humains a amené notre équipe à étudier les différentes composantes
de la recombinaison homologue chez l’organisme eucaryote Schizosaccharomyces pombe.
Cette levure se reproduit de façon sexuée par la simple ablation de l’azote de son milieu de
culture.
La protéine Dmc1 est une recombinase d’expression uniquement méiotique. Homologue
aux protéines RecA et Rad51, on peut s’attendre à des propriétés similaires de la part de
Dmc1. Cependant, il fut démontré que la protéine humaine a, contre toute attente, une
faible activité d’échange de brin et une difficulté à former des filaments hélicoïdaux sur
l’ADN. Les premières études structurales de la protéine ont démontré la formation
d’anneaux octamériques en solution (Passy & al, 1999 ; Masson & al; 1999). Ces anneaux
en présence d’ADN, avaient tendance à s’enfiler l’un derrière l’autre afin de créer un
filament (Masson & al, 1999). Ce filament, désordonné, n’avait rien d’une structure
hélicoïdale propre aux recombinases. Des études plus récentes ont su démontrer la
présence de filament hélicoïdal en présence d’ATP. Filament qui serait stimulé par la
présence de la protéine RPA (Sehorn & al, 2004). Afin d’apporter des informations
complémentaires, nous avons étudié les caractéristiques biochimiques et structurales de la
protéine Dmc1 de Schizosaccharomyces pombe.
Interactions protéine-protéine et structure en solution
Plusieurs enzymes impliquées dans la recombinaison sont reconnues pour leur capacité à
interagir avec elles-mêmes, menant ainsi à la formation de structures de conformation
toroïdale (Hingorani & O’Donell, 1998). Afin de déterminer si la protéine de levure Dmc1
peut former des structures d’une telle conformation, nous avons tout d’abord vérifié si cette
protéine était capable d’interagir avec elle-même. Suite aux résultats positifs de
l’interaction par double hybride, nous avons déterminé le domaine protéique responsable de
45
cette interaction. Les résultats démontrent que, tout comme la protéine Rad51 de
S.cerevisiae (Chen & al, 1998), le domaine N-terminal est celui qui est essentiel aux
interactions protéines-protéines. Il semble que la protéine Dmc1 ne se retrouve pas sous
forme de monomère en solution. Les analyses de filtration sur gel démontrent une élution
protéique variant de 270 à 340 kDa avec un pic d’élution à 310 kDa. D’un poids
moléculaire de 39373 Da, il semble que la protéine de fusion produite se retrouverait sous
forme octamérique en solution. L’analyse de protéine en absence d’ADN, lors de la
microscopie électronique, vient confirmer ces résultats, corroborant ceux obtenus avec la
protéine humaine (Passy & al, 1999; Masson & al, 1999).
Propriétés conservées de la recombinase
L’hydrolyse de l’ATP permet aux recombinases de séparer les duplex d’ADN et de tester
l’homologie entre diverses molécules. Étant une recombinase, Dmc1 est apte à hydrolyser
l’ATP. Cependant, comme pour toutes les recombinases eucaryotes, son activité est
beaucoup plus faible que celle de RecA. Son activité, calculée ici à 0.86 ATP/min
ressemble beaucoup plus à celle de son homologue humain Rad51, qui s’élève à 0.16
ATP/min (Baumann & al, 1996). Leur activité respective pourrait cependant être plus
élevée lorsque étudiée in vivo. Une autre similitude avec les recombinases classiques est la
préférence marquée de Dmc1 pour l’ADN simple brin. Cette préférence est consistante
avec la liaison de la recombinase au brin resecté, étape nécessaire à l’invasion prenant lieu
lors de la recombinaison.
Activité d’appariement et d’échange de brin
L’alignement et l’annelage d’ADNs complémentaires sont des étapes essentielles à la
renaturation. Diverses protéines, telles que RecA, Rad51 de l’humain et de la levure ainsi
que Rad52 humain, sont aptes à effectuer une telle réaction. La protéine, Dmc1 de
S.pombe, est aussi apte à effectuer la renaturation d’ADN complémentaire. Cette réaction
d’annelage pourrait supporter l’idée qu’il y ait réparation de cassures double brin par
« synthesis-dependent strand annealing »(voir section 1.3.2) (Pâques & Haber, 1999).
46
Le filament hélicoïdal formé par les recombinases classiques sur l’ADN est nécessaire à
l’échange de brin. Le filament nucléoprotéique permet de maintenir à proximité deux
particules d’ADN. De cette façon, l’homologie des séquences peut être testée permettant
ainsi d’aligner l’ADN complémentaire et de procéder à l’échange de brin (West &
Connolly, 1992). À l’aide d’un ADN simple brin circulaire et d’un duplex homologue à ce
premier, il fut possible de mettre en évidence la capacité de Dmc1 à effectuer une réaction
d’échange de brin. Dans une même lancée, des données in vivo permettaient de conclure à
ce même résultat. En effet, il semblait que Dmc1 était apte à effectuer la réaction
d’échange de brin puisque des mutants DMC1 démontraient un haut taux de cassures
double brin et une hypersection des extrémités endommagées (Bishop & al, 1992).
Cependant, l’efficacité de Dmc1 à effectuer un échange d’information génétique est limitée
par rapport à celle de la recombinase procaryote.
Filament nucléoprotéique formé par Dmc1
Les recombinases RecA et Rad51 sont connues pour être actives lorsque sous forme de
filament hélicoïdal. Pour ce qui est de Dmc1 humain cependant, il semble que la protéine
soit plus ou moins apte à former un filament de type hélicoïdal. Selon plusieurs, la protéine
a une structure octamérique en solution (Passy & al, 1999; Masson & al, 1999 ; Kinebuchi
& al, 2004). La formation de filament ressemblerait à un alignement d’anneaux enfilés sur
l’ADN. Toutefois, l’équipe de Sehorn (Sehorn & al, 2004) a pu observer des filaments
hélicoïdaux formés par la protéine humaine. Cette étude vient corroborer ces faits. Nous
avons été capables de visualiser des filaments protéiques de la protéine de S.pombe sur
l’ADN. Ces filaments, parfois désorganisés, parfois hélicoïdaux sont toutefois incompris.
Pourquoi, dans des conditions identiques obtenons-nous différents résultats? Afin de
répondre à cette question, la protéine sera produite avec une étiquette de 10-histidine en
extrémité C-terminale. Des résultats (non publiés) nous font croire que le clivage partiel de
cette extrémité limite la formation d’un filament hélicoïdal attendu. Peut-être résoudrons-
nous le mystère entourant la structure filamenteuse de cette recombinase.
De plus, il faut envisager d’étudier l’action des cofacteurs dans la recombinaison. Par
exemple, on sait que les mutants hop2/mnd1 de S.cerevisiae ont de la difficulté à juxtaposer
47
les brins homologues. Ces mutants sont aussi incapables de transformer les CDBs de
l’ADN en intermédiaires ou en produits de la recombinaison homologue (Petukhova et al,
2003). Par contre, des études ont su démontrer une stimulation de la recombinase Dmc1
par l’ajout du complexe Hop2/Mnd1 de S.cerevisiae ou par l’ajout de Hop2 de la souris
(Chen et al, 2004; Enemoto et al, 2004) L’analyse plus complète de la coopération
Hop2/Mnd1 et Dmc1 peut peut-être nous aider à résoudre la problématique du filament de
la recombinase méiotique. Il ne faut pas oublier que la formation de filaments hélicoïdaux
caractéristiques aux recombinases a pu être observée en présence de la protéine RPA.
Hop2 est peut-être le cofacteur méiotique nécessaire à la formation de filaments corrects et
d’une réaction efficace d’échange de brin.
Perspectives
La recombinaison homologue est impliquée dans le réarrangement génique, la diversité
génétique et la bonne ségrégation des chromosomes. Une défectuosité dans la ségrégation
des chromosomes peut être fatale pour une cellule par l’avènement d’une aneuploïdie
(cellule comportant un nombre inexact de chromosomes). Sur le plan clinique, cette
aneuploïdie a de lourdes conséquences puisqu’elle est la cause du retard mental et de
l’altération de développement caractéristiques de la trisomie 21 (Hassold & Hunt, 2001). À
long terme, le laboratoire tentera de comprendre tous les mécanismes de recombinaison
pouvant provoquer la non-disjonction des chromosomes et, par le fait même, une
aneuploïdie. Un pas de plus sera fait vers la compréhension et le contrôle des maladies
reliées à une recombinaison défectueuse.
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