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Transformación
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Objetivos
• Conocer el fundamento para transformar células bacterianas
• Realizar la técnica de transformación bacteriana
• Aprender a identificar células transformadas mediante su fenotipo
• Conocer la definición de organismo transgénico
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En la transformación, el DNA liberado de una célula
bacteriana entra a otra célula, generalmente de la misma
especie.
Actualmente hemos generado herramientas para realizar la
transformación de manera artificial y producimos: Organismos transformantes o transgénicos.
Transferencia de información genética
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Producción de Proteínas Recombinantes de uso médico
• Insulina: para diabéticos
• Factor VIII: para pacientes con hemofilia A
• Factor IX: para hemofilia B
• Hormona del crecimiento humana: enanismo
• Eritropoyetina: para el tratamiento de anemias
• Interferón: defensa contra infecciones
• Antígeno de superficie de hepatitis B: vacunas
• Activador del plasminógeno tisular: disolución de coágulos
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La transformación fue el primer mecanismo que se descubrió de intercambio de genes.
Frederick Griffith. 1928.Principio transformante
Streptococcus pneumoniae
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• Células competentes naturales:
– Células que pueden introducir material genético exógeno.
Funciones de la competencia
natural
Nutrición
El ADN es fuente de carbono y nitrógeno.
Reparación
La bacteria puede reparar daños en su
cromosoma.
Recombinación
Incrementa la diversidad y acelera
la tasa evolutiva.
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• Células competentes no naturales:
– Células que reciben un tratamiento apropiado para llevar a cabo laintroducción de material genético. Se busca aumentar lapermeabilidad membranal.
Electroporación Choque térmico
Las bacterias se mezclan con ADN y son expuestos a un campo eléctricofuerte.
Las bacterias se someten a temperaturas elevadas.
Se crean poros temporales con las cabezas de los fosfolípidos.
Se usan iones para disminuir la repulsión de cargas entre los fosfatosde nucleótidos y la membranaplasmática.
Puede usarse para ingresar ADN de cadena sencilla o doble.
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S. Das, H. R. Dash, Microbial Biotechnology- A laboratory Manual for Bacterial Systems. DOI 10.1007/978-81-322-2095-4_2, © Springer India 2015
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Matter of competence?
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¿Qué se necesita para hacer una célula transformante?
1. Transgen
2. Vector de clonación
3. Célula competente
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1) Transgen:
Gen de interésPromotor Terminador
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2) Vector de clonación:
Sistema que permite introducir en una célula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar.
Plásmido: 1. Origen de replicación autónomo2. Sitio múltiple de clonación3. Marcador de selección
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Mapa de pET-24a
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Enzima de restricción
Vector de clonación:
Transgen de interés
Vector recombinante:
Enzima de restricción
Gen de resistencia
Gen l deloperón de lactosa
Origen de replicación
Origen de replicación
5310 pb
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• 3) Célula competente:
En esta práctica se usará la línea E. coli BL21.
Deficiente en proteasas OmpT y Lon.
Conveniente para la expresión usando el promotor T7.
Incubar E. coli en medio Luria
Resembrar y cultivar hasta obtener una OD. De 0.6-0.8 (600nm)
Centrifugar y resuspender en NaCl
Centrifugar y resuspender en CaCl2
Incubar, centrifugar, y resuspender en CaCl2
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Transformación por choque térmico
Fenotipo
Células competentes
Plásmido o vector
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El experimento