Transcripción en eucariontes
Los organismos eucariontes tienen diferentes tipos de RNA polimerasas
RNA Polimerasa I (NRPA)
RNA Polimerasa II (NRPB)
RNA Polimerasa III (NRPC)
RNA Polimerasa IV (NRPD)
RNA Polimerasa V (NRPE)
RNA ribosomal (rRNA) 5.8S, 18S y 28S.
RNAs mensajeros (mRNA), RNAs pequeñosnucleolares (snoRNA), micro RNAs (miRNA),RNAs pequeños interferentes (siRNA) y lamayoría de RNAs pequeños nucleares(snRNA).RNAs de transferencia (tRNAs), rRNA 5S yalgunos RNAs pequeños nucleares (snRNAs)
Involucradas en la síntesis de ciertos siRNAs ysilenciamiento epigenético
En plantas:
Ȧȕ ȕ� Į, Į,,
Núcleo RNA polimerasa E.coli
RNA polimerasas eucariontes, ,, ,,,
Subunidades WLSR�ȕ�\�ȕ�
Subunidades WLSR�ĮSubunidades WLSR�Ȧ
Subunidadescomunes
Subunidades adicionales
1 2 1 2 1 2
+5 +3 +7
CTD
Las RNA polimerasas eucariontes tienen cierta homología con la polimerasa bacteriana
RNA Pol I RNAr
RNA Pol II RNAm
RNA Pol III RNAt
Similar a la
polimerasa bacteriana
La RNA polimerasa II eucarionte
- 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kDa
RNA pol bacteriana
cola que se fosforila (CTD)
La subunidad mayor (1) de la RNA pol II contiene un dominio carboxilo terminal (CTD) esencial.
La fosforilación del CTD es importante para la elongación de la transcripción y el procesamiento del RNAm.
En bacterias sólo se requiere Sigma parael reconocimiento eficiente del promotor.Cajas TATA (-10) y caja -35
Recononocimiento del promotor : Factores Generales o basales de la Transcripción (TFII)
Sitio de inicio transcripción-30 nt (TATA)
TFIIATFIID
TBPTFIIB
TFIIHTFIIE
TFIIFSitio de inicio transcripción
BacteriasEucariontes
Promotor para la RNA pol II eucarionte
DNA
Unidad Transcripcional
5’UTR 3’UTR
E1 E2 E3 E4+1
TSSsitio de inicio de la transcripción
PromotorCore
5’ 3’
Modulos de regulacióna distantia
Elementos CIS
PromotorDistal
Enhancers TF
GTF-II
TSS
PromotorCore
RNApolII
Nucleosomasdeslizados
Remodeladorescromatina
PromotorDistal
Loops
Nucleosomasdeslizados
TF
TF
Co-TF
TAFs
GGGCCACGCC TATA
A A AT T
CCTT AN TCC
ATTA A GG T
CGTG
BRE TATA Inr DPE
Elemento Secuencia consenso GTF
BRE
TATA
INR
DPE
G/C G/C G/A CGCC
TATA A/T A/T
C/T C/T AN A/T C/T C/T
A/G A/T CGTG
TFIIB
TBP
TFIID
TFIID
TFIIB TBP TFIID TFIID
GGGCCACGCC TATA
A A AT T
CCTT AN TCC
ATTA A GG T
CGTG
BRE TATA Inr DPE
Elemento Secuencia consenso GTF
BRE
TATA
INR
DPE
G/C G/C G/A CGCC
TATA A/T A/T
C/T C/T AN A/T C/T C/T
A/G A/T CGTG
TFIIB
TBP
TFIID
TFIID
TFIIB TBP TFIID TFIID
Genes and Development 16:2583 - 2592
-37 -32 -31 -26 -2 +4 +28 +32
Promotor basal para la RNA pol II eucarionte
Factores generales de la transcripción Clase II (TFII)
Dominio β plegado
TBP
Surco menoren TATA
TBP se une al DNA en la caja TATAprovocando una conformación másaplanada.
La unión de TBP a un sitio TATAdistorsiona la cadena y permiteel reconocimiento del sitio +1
TFIID
TBPTATA Binding
Protein
TAFsTBP associated
factors
+
TATA
TFIID es un complejo multiproteico
Factores generales de la transcripción Clase II (TFII)
TBP se une al DNA en la caja TATAprovocando una conformación másaplanada.
La unión de TBP a un sitio TATA distorsionala cadena y permite el reconocimiento delsitio +1 por las tres polimerasas eucariontes
TFIID
TBPTATA Binding
Protein
TAFsTBP associated
factors
+
TATA
TFIID es un complejo multiproteico
TATABRE
TFIIDTBP TAFs
TFIID
TFIIA TFIIB
BRETFIIA: Estabiliza la unión de TFIID-DNA.
TFIIB: Ayuda a posicionar alcomplejo de factores y la RNA pol IIsobre el promotor.
-Interacción TFIIB-TFIID y TFIIB-DNA(mediante elemento BRE)
- Se relaciona con la selección delsitio de inicio de la transcripción
TFIIF
RNA pol II
TFIIF: Se une fuertemente a la RNA polIIAfecta la topología del DNA.
Tiene actividad de helicasa para ayudar aabrir la doble cadena en el sitio +1
TFIIE: Recluta a TFIIH y regula susactividades de helicasa y cinasa
TFIIH: Complejo de 9subunidades:
Poseé 3 actividades:
Helicasa dependiente de ATP para abrir ladoble hélice e iniciar transcripción.
Actividad de cinasa para fosforilar elDominio Carboxilo Terminal (CTD) de laRNA pol II y permitir escape del promotor.
Actividad de exonucleasa para repararerrores en MMR.
TFIIE
TFIIH
NTPATPADP
Escape del promotor en eucariontes
A diferencia de bacterias la apertura delpromotor y la formación de la burbujapara el inicio de la transcripción requierela hidrólisis de ATP y es mediada porTFIIH mediante su actividad de helicasa.
El escape del promotorrequiere de la fosforilación delCTD de la subunidad mayorde RNA pol II
El CTD está conformado porvarias repetidas delheptapéptido: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser(52 en humano)
Además de promover el escape del promotorLa (P) del CTD está involucrada en otros procesos
BacteriaEucariontes
Comparación del Inicio de la transcripción Eucarionte y Bacteria
Complejo cerrado
Unión Holoenzima
Complejo abierto
Síntesis de RNA
Escape del promotor
Unión TBP
Cambio conformacional
Unión TFIIB
Unión RNA pol II y TFIIF
Complejo de pre-inicio
Unión TFIIE y TFIIH
Complejo de inicio
Escape del promotor
Liberación de Sigma
Fosforilación de CTD de RNA pol II y liberaciónde varios factores TFII
Síntesis de RNA
TFIID
TFIIA TFIIB
BRE
TFIIE
TFIIH
TFIIF
RNA pol II
TATABRE
TBP
TAFs
NTPATPADP
Inhibidores de la Transcripción eucarionte
La Actinomicina D es producida por Streptomyces y es potente inhibidor de transcripción y replicación.
Se intercala entre G-C en la doble hélice de ADN e inhibe elongación.
La α-Amanitina es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides.
Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte a nivel de inicio y elongación.
Inhibidores de la Transcripción Eucarionte
Específico para la RNA pol II
Modificación del extremo 5’ del RNA
Modificación del extremo 3’ del RNARemoción de intrones
Elongación del RNAm por la RNA pol II
PROCARIONTESRNA pol II
1. Capping
1) La fosfatasa remueve unfosfato del 5´
2) Una guanil transferasa agrega GMP
3) Una metil transferasa agrega el grupo metilo
Adición de “cap” (7mGpppN) en el extremo 5’
¿Para qué añadir el 5’ Cap?
1. Le da estabilidad al mRNA en el extremo 5’ (evita corte por exonucleasas de RNA).
2. Permite la exportación nuclear del mRNA, o en su caso la retención en el núcleo.
3. Posibilita el inicio de la traducción en mRNAs eucariontes.
4. Promueve la degradación de mRNAs cuando están las señales celulares apropiadas.
2. Remoción de intrones (Splicing)
ORF: marco abiertode lectura; codificantepara la proteína
Intrón: secuencia que NO está presente en el RNA mensajeromaduro.
Exón: secuencia que SI permanece en el RNA mensajeromaduro (puede incluir secuencias no codificantes de proteínacomo las regiones 5’UTR y 3’ UTR).
Exon Exon
Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón (sitio 5’ y sitio 3’ para el splicing); así como una Adenina en contexto de secuencia (sitio de la rama) que promueve la catálisis.
Secuencias NECESARIAS para el Splicing
Splicing: ACTIVIDAD RIBOZIMA (catalisis realizada por RNA)
Primera reacción de trans-esterificación
Segunda reacción de trans-esterificación
EstructuraLARIAT (intron)
Exon:Exon
Sólo el RNA tiene 2’OH
SPLICEOSOMA ACTIVIDAD RIBOZIMA
El Spliceosomacontiene U1-U6: snRNAs unidos a proteínas (RNPs)
La catálisis del 2’OH de la adenina en la Rama es promovida por U2 y U6 snRNA
El apareamiento “aisla” a la adenina promoviendo su reactividad
El acercamiento al borde Exón/Intrón es promovido por U1
Splicing alternativo
Permite obtener DIFERENTES proteínas a partir de un mismo gen
Consecuencias de mutaciones en INTRONES
Creación de nuevos sitios 5’ splice
3. Poliadenilación en extremo 3’ TERMINACIÓN
RNAm5’ ……….. 3’
Secuencia de poliadenilación
Corte por endonucleasa
Degradación de esta porciónAdición de
adeninas
5’ ………..
Cap
Cap Cola poliA
3’
La enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega Adeninas (50-250) en el extremo 3’ del RNAm
TERMINACIÓN
Proteínas de unión a poli A (PABP) se unen y protegen el extremo 3’ del RNAm
TERMINACIÓN
El receptor de exporte nuclear dirige la salida del mRNA del núcleo al citoplasma
La salida del mRNA es coordinada por proteínas unidas a la molécula:
Complejo de proteínas de unión al “5’ Cap” (CBC)Complejo de “splicing” de intrones (EJC)Proteínas de unión a cola de poli A (PABP)
Procariontes Eucariontes1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa.
1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA
2. El mRNA se traduce durante la transcripción.
2. El mRNA es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de poliA, splicing
3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína.
3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones.
4. Los mRNAs son frecuentemente policistrónicos (operones)
4. Los mRNAs son monocistrónicos
5. La RNA polimerasa solo requiere a sigma para reconocer el promotor
5. Las RNA polimerasas requieren múltiples factores de transcripción adicionales para reconocer el promotor.
6. No hay procesamiento co-transcripcional del mRNA.
6. El mRNA sufre procesamiento extenso durante la transcripción.
Diferencias clave entre Transcripción eucarionte y bacteriana