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Técnicas ópticas aplicadas al estudio de procesos electrofisiológicos.
Nuevos desarrollos.
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Determinación del Ca intracelular por métodos ópticos
• Medidas de absorción• Medidas de fluorescencia
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x
I C
dI ∝ I C dx
dI = - k(λ) I C dx
I = Io e - k(λ) C X
log (I/Io) = 0.43 k(λ) C X
A = ε (λ) C X
ε (λ) M-1cm-1
Ley de Lambert y Beer
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La fluorescencia es el resultado de la absorción y emisión de energía por el indicador fluorescente.
1er paso : Excitación por absorción de un fotón2do paso : En el estado excitado parte de la energía se disipa
como calor o vibraciones3er paso : Emisión de un fotón de menor energía
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Iabs ∝ Io ε(λex) d [P]
F = Io ε(λex) d [P] φ(λ ex,λem)
Brillo ≡ ε(λex) φ(λ ex,λem)
F ∝ Iabs
Nro fotones emitidosNro fotones absorbidos
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Fluo 3
Ca2+
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Fluo-3
longitud de onda (nm)400 450 500 550 600 650
Fluo
resc
enci
a / a
bsor
banc
iaexcitaciónemisiónabsorbancia
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F = a[ind] + b[ind-lig]
[Ind] . [lig] [Ind-lig]Kd = ---------------- [lig] = Kd --------------
[Ind-lig] [Ind]
Fmax = b indtot y Fmin = a indtot
¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?
F - Fmin[lig] = Kd --------------
Fmax - F
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Ca indicator Mode Kd(nM)
Calcium Green-1 Em 530/Ex 488 190Calcium Green-5N Em 530/Ex 488 14000Fluo-3 Em 525/Ex 488 390Fluo-5N Em 520/Ex 488 90000Oregon Green 488 Bapta-1 Em 520/ex 488 20000
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Indicadores raciométricos
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Fura 2
Ca2+
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Efecto del Ca sobre el espectro de excitación
detección a 510 nm
longitud de onda (nm)250 300 350 400 450
Fluo
resc
enci
a
0
20
40
60
80
100
120
alto Ca
0 Ca
358 nmpto. isosb.
Indicador raciométrico: Fura-2
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F2 = a2[ind] + b2[ind-lig]
F1 = a1[ind] + b1[ind-lig]
F1R = -------
F2
[Ind-lig][lig] = Kd --------------
[Ind]
b1Rmax = -------
b2
a1Rmin = -------
a2
R - Rmin[lig] = Kd -------------- . γ
Rmax - R
a2γ = −−−
b2
¿Cómo obtenemos la [ligando] a partir de F?
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• El pigmento debe presentar un corrimiento en el espectro de excitación o emisión al unir el ligandoespecífico.
• Se requiere medir la fluorescencia a dos longitudes de onda.
• La ventaja es que las medidas son independientesde la concentración del indicador, de la longitud del paso, de la intensidad de iluminación y del detector.
Medidas raciométricas
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Ca2+ Indicator Mode Kd(nM)
Fura Red Ex 420/480 140Fura 2 Ex 340/380 145Indo-1 Em 405/480 Ex 360 230Mag-fura-2 Ex 340/380 25,000Fura-FF Ex 340/380 35,000
Indicadores raciométricos de Ca
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• Fuente de excitación• Óptica adecuada para excitar y para medir• Filtros para seleccionar las λ de excitación y de emisión• Sistema de detección
Instrumentación
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0 50 100 150 200
Fluo
resc
enci
a (m
V)
10
15
20
25
Tiempo (ms)0 50 100 150 200
[Ca2+
] (nM
)
0
100
200
300
400
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[Ca2+] = KD* (R - Rmin)/(Rmax - R)
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Microscopía de epifluorescencia
Microscopía confocal
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Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Emission Filter
Excitation Diaphragm
Ocular
Excitation Filter
Objective
Laser
Emission Pinhole
Excitation Pinhole
PMT
EmissionFilter
Excitation Filter
Confocal Microscope
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PSF (Point spread function)
Confocal
Wide field
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Scanning Galvanometers
x y
Laser in
Laser out
Point Scanning
ToMicroscope
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xy scan
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5 µm
0 4 8 1612 20 24 28
Sparks at high temporal resolution
F/F00 2.7
5 µm
0 4 8 1612 20 24 28
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10 µm500 ms
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Enhanced Green Fluorescence Protein
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FRET (Fluorescence resonance energy transfer)
Miyaki et al. Nature, 388, 882-887
Proteínas “Camaleon”
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Transfección EGFP
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RyR1
RyR3
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• Microscopía de dos fotones• STED• 4 Pi
OTRAS TECNICAS
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University of Durban
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Nature Biotechnology, vol 21 (11), 2003
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Ventajas de la microscopía multifotón
• Poco scattering por la mayor λ de excitación• Mejor separación de las λ de excitación y emisión• Menor citotoxicidad• Menor blanqueo del pigmento• No es necesario el pinhole• Mayor profundidad
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Three-dimensional reconstructed two-photon images of dermal and subcutaneous structures
Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000.
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Stimulated emission depletion microscopy
STED
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Fundamento STED
Se circuncribe la fluorescencia estimulando la emisión con un segundo pulso de mayor λ con forma de anillo.
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Willig et al. Nature 2006http://www.mpibpc.gwdg.de/groups/hell/
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Confocal
104 nm
244 nm
Klar et al. PNAS 2000
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STED
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Hell, PNAS, 2007
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Microscopía 4 Pi
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G.l.T lmaging & Microscopy 4/2004
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G. l.T lmaging & Microscopy 4/2004
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