![Page 1: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/1.jpg)
Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica
St. 344
Laboratorio Chimica Bioorganica
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Laboratorio Chimica Bioorganica
Idrolisi dell'aspirina
Studio della reazione di deacilazione di un intermedio acil-chimotripsina
(Tutti)
(Tutti)
Determinazione della stechiometria e della costante di formazione del compleso proflavina-alfa chimotripsina(Tutti)
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Cos'è un meccanismo di reazione?
● Un meccanismo di reazione è una sequenza consecutiva di reazioni elementari
XR1
R2R3
R1
R2 R3
R1
R2 R3
YH Y
R1
R2R3
X-+
+k2
k1
+
+
Y
R1
R2R3
+ + H+
Slow
Fast
1.
2.
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Come studiare un meccanismo?
● Proporre una legge cinetica
● Proporre un meccanismo che giustifichi la legge cinetica
● Analizzare l'effetto del solvente (p.es. polarità) o la sostituzione isotopica per confermare il meccanismo proposto
● “Isolare”, intrappolare o monitorare la presenza di intermedi se ipotizzati nel meccanismo
● ...e molto altro...
Monitorare la composizione della miscela di reazione (reagenti e prodotti) nel tempo facendo uso di metodi spettroscopici, cromatografici, potenziometrici etc
![Page 5: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/5.jpg)
● Proporre una legge cinetica
Monitorare nel tempo la formazione del prodotto o la scomparsa dei reagenti
Velocità di formazione del prodotto
velocità=d [P (t )]
dt=kobs [A(t)]α [B(t )]β
Velocità di scomparsa dei reagenti
Il problema si riduce nella determinazione degli ordini di reazione α, β
A B P
Come studiare un meccanismo?
Metodi Differenziali Metodi Integrali
(convenienti) (poco convenienti)
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Metodo delle velocità iniziali
Nei primi istanti della reazione (fino a circa il 10%)
velocità=d [P (t )]
dt=kobs [A(t)]α [B(t )]β
[A(t )]≃[A(0)] ; [B(t )]≃[B(0)]
V 0=(d [P (t )]dt )
t →0
=kobs [A(0)]α [B (0)]β
A B P
Come studiare un meccanismo?
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Come determinare gli ordini di reazione?
V 0=(d [P (t )]dt )
→0
≃k obs[A(0)]α[B(0)]β
A1(0); B (0)
A2(0); B (0)
A3(0); B (0)
V 01≃kobs [A1(0)]α[B (0)]β
V 02≃kobs [A2(0)]α[B(0)]β
V 03≃kobs [A3(0)]α[B(0)]
β
Diverse composizioni della miscela di reazione
Diverse velocità iniziali
Come studiare un meccanismo?
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A1(0); B (0) → V 01
A2(0); B (0) → V 02
A3(0); B (0) → V 03
Composizioni V0
V 0=(d [P (t )]dt )
t →0
≃kobs [A(0)]α [B (0)]β
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 1 2 3 4 5 6
α = 0
α = 1
α = 2
α = 3
[A(0)]
V0
La natura del grafico dà informazione sull'ordine α
Come studiare un meccanismo?
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Stessa procedura per B e se
d [P (t )]dt
=kobs [ A(t )]Otterremmo semplicemente che
α =1 e β = 0
Cioè la reazione è del primo ordine in A
Cl N3- N3 Cl-
EtOH/Water
Un esempio tipico...
Come studiare un meccanismo?
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Come studiare un meccanismo?
d [P (t )]dt
=kobs [ A(t )] P (t )=A0 [1−e(−k obs t )
]
Metodi Integrali Richiedono di conoscere la legge cinetica (!)
Differenziale Integrale
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200 250
Time [min]
[P]
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
0 50 100 150 200 250L
n(A
0-[P
])
Time [min]
-kobs
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Idrolisi degli esteri
A pH costante (tamponato) la velocità di scomparsa dell'estere è descritta da una cinetica dello pseudo primo ordine
Tre processi principali concorrono all'idrolisi degli esteri:
- l'idrolisi spontanea
- l'idrolisi acido-catalizzata (specifica e/o acido generale)
- l'idrolisi base-catalizzata (specifica e/o base generale)
velocità=−d [Estere]
dt=kobs [Estere]
R
O
OCH3
H2OR
O
OHCH3OH
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Idrolisi degli esteri - catalisi acida specifica
velocità=−d [Estere]
dt=kH [H+ ][Estere ]
![Page 13: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/13.jpg)
Idrolisi degli esteri - catalisi basica specifica
velocità=−d [Estere]
dt=kOH [OH− ][Estere ]
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Idrolisi degli esteri - catalisi acida generale
Idrolisi degli esteri - catalisi basica generale
velocità=−d [Estere]
dt=k AH [AH ][Estere ]
velocità=−d [Estere]
dt=kB [B ][Estere]
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Idrolisi degli esteri – visione generale
I processi possono avvenire contemporaneamente, quindi comprende diversi contributikobs
Un processo prevarrà sugli altri in funzione del pH
Lo
g k
ob
s
pH
k H [H+]
Lo
g k
ob
s
pH
kOH [OH−]
Lo
g k
ob
s
k HA[HA]
pH
Lo
g k
ob
s
k B [B]
pH
Catalisi Specifica Catalisi Generale
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Profilo reattività-pH per un estere tipicoL
og
ko
bs
pH
Lo
g k
ob
s
pH
Catalisi AcidaSpecifica
Catalisi BasicaSpecifica
Catalisi AcidaSpecifica
Catalisi BasicaSpecifica
No Cat
La reazione non catalizzata è sempre trascurabile
La reazione non catalizzata è osservabile in un intervallo ristretto di pH
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Idrolisi dell'Aspirina
pH Time [min] N° prelievi
1 10 10
2 15 10
3 15 10
4 10 10
5 10 10
6 10 10
7 10 10
8 5 10
9 2 10
10 1 10
O
OHO
OH
OHO
O
O
OHH2O 60 °C
Tampone
y = 0,0005x + 0,1213R² = 0,9987
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
0 1000 2000 3000 4000
pH 6,23
6,23
Lineare (6,23)
Ab
s @
29
8 n
mTime [s]
![Page 18: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/18.jpg)
Analisi Spettrofotometrica al punto isosbestico
OH
OHO
O-
O-O
Pun
to I
sosb
estic
o
![Page 19: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/19.jpg)
Metodo delle velocità iniziali
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 100 200 300 400
Time [min]
Ab
s @
29
8 n
m
A pH costante (tamponato) la velocità di scomparsa del reagente è descritta da una cinetica dello pseudo primo ordine lo stesso vale per la formazione del prodotto
velocità=−d [Asp]
dt=kobs [Asp ]=
d [Sal ]dt
[Sal ](t )=C (∞)sal [1−exp(−k obs t )]
dA(t )dt
=A(∞)sal kobs exp(−kobs t)
(dA(t )dt )
t →0
=A(∞)sal kobs
Nei primi istanti della reazione, quando t 0
A(t )=A(∞)sal [1−exp(−k obs t )]
y = 0,0005x + 0,1213R² = 0,9987
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
0 1000 2000 3000 4000
pH 6,23
6,23
Lineare (6,23)A
bs
@ 2
98
nm
Time [s]
A(∞)sal k obs
![Page 20: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/20.jpg)
Idrolisi dell'Aspirina
kobs
a 17°C in funzione del pH.
Trans. Farad. Soc. 1950, 46, 723
O
OHO
OH
OHO
O
O
OHH2O 60 °C
Tampone
![Page 21: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/21.jpg)
Regione A-B: catalisi acida specifica
Regione F-G: catalisi basica specifica
Regione C-E: catalisi basica generale INTRAMOLECOLARE
O
O-O
O
HO H
O
OHO
O-
OHOH
OHO O
O-
Idrolisi dell'Aspirina
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Alfa-Chimotripsina
Serina-Proteasi
Nel sito attivo presenta
-Asp-Ser-His
Presenta una certa selettività per la scissione di legami peptidici coinvolgenti residui idrofobici
![Page 23: Studio di meccanismi di reazione in Chimica Bioorganica · 2016-10-11 · Metodo delle velocità iniziali 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 Time](https://reader033.vdocuments.mx/reader033/viewer/2022042213/5eb6824d47681b0967314c23/html5/thumbnails/23.jpg)
Meccanismo di azione dell' Alfa-Chimotripsina
Acilazione
Idrolisi
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Acilazione dell' Alfa-Chimotripsina
Myron Lee Bender
NH
NH
O
O
OH
O
NN
O
OMe
O
NN
Enz O
O
N
HN
H2O
O
OH
EnzEnzVeloce Lento
Ser 195
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Principio del metodo
Colorato in giallo Incolore
Enz
O
NN
Enz O
O
N
HN
H2O
O
OH
Enz
N NH2H2N
EnzN NH2H2N
N NH2H2N
La velocità di deacilazione dell'enzima è un processo del primo ordine cinetico, dipende dalla concentrazione dell'acil-enzima (e dal pH)
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Principio del metodo
Come essere sicuri che la proflavina si lega al sito attivo ?
Con quale stechiometria si forma il complesso enzima-proflavina?
Quale è la costante di formazione del complesso enzima-proflavina?
La stechiometria può essere determianata usando il metodo delle variazioni continue (Job plot)
La costante di legame può essere determinata (nota la stechiometria) dal fitting di una curva di titolazione
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Principio del metodo
J. Chem. Educ. 1975, 6, 410 – 413
NH2N NH2
NH2N NH2
NH2N NH2
-
Spettroscopia di differenza
Ramo di misura Ramo di riferimento
NH2N NH2
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Principio del metodo
Con quale stechiometria si forma il complesso enzima-proflavina?
Quale è la costante di formazione del complesso enzima-proflavina?
metodo delle variazioni continue
STECHIOMETRIA DEL COMPLESSO
Fitting della curva di titolazione
COSTANTE DI COMPLESSAZIONE
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Principio del metodo
pH Time [s]
5,5 60
6 60
6,5 30
7 30
7,5 20
8 10
8,5 10
Campione Riferimento
Enzima (tampone)
Proflavina
Substrato
Tampone
Proflavina
Substrato
Letture di Assorbanza a 465 nm
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0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 500 1000 1500 2000
Time [s]
Ab
s @
46
5 n
m
Acilazione
Deacilazione
Time [s]
-6
-5
-4
-3
-2
-1
00 500 1000 1500 2000
Ln
(Ai n
f-A
( t))
La pendenza è la -kobs
Analisi dei dati
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Dipendenza dal pH
Quando la base responsabile della deprotonazione dell'acqua non è disponibile perchè protonata, l'idrolisi dell'intermedio acil-enzima è rallentata
L'analisi della reattività (kobs) in funzione del pH permette di avere informazioni sulla pKa della base coinvolta nel processo
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Effetto isotopico cinetico del solvente
Cosa accade se H2O viene sostituita da D
2O?
TS‡
∆GD
‡
∆∆G‡
O-H
O-D
∆GH
‡
N
HN
HO
H
N
HN
H
-OH
N
HN
HO
H
kD < k
Hk
H/k
D >1
Effetto isotopico normale
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Il legame Enzima-Proflavina
Enz
O
NN
Enz O
O
N
HN
H2O
O
OH
Enz
N NH2H2N
EnzN NH2H2N
N NH2H2N
1. Stechiometria del complesso Enzima-Proflavina
2. Determinazione della costante di complessazione
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Il legame Enzima-Proflavina
1. Stechiometria del complesso Enzima-Proflavina
mA + nB AmBn
Keq
C0 B = costante, variamo C
0 A
Curva di titolazione
Costante di complessazione
Fitting dei dati sperimentali
Richiede di conoscere la stechiometria del complesso!
[Am
Bn]
C0 A
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Metodo delle variazioni continue (Job Plot)
[Am
Bn]
XA
0.5 1.00.0
1:1 (AB)XA(m ax) = 0.5
2:1 (AB2)XA(m ax) = 0.33
Il legame Enzima-Proflavina
mA + nB AmBn
Keq
C0 A + C
0 B = costante
Ma
C0 A e C
0 B vengono variate entrambe
X A=C0 A
C0 A+C0 B
Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 11998 – 12013
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[AB ]=1+2cKeq−√1+2cKeq+[cK eq(1−2XA)]
2
2Keq
Il legame Enzima-Proflavina
Metodo delle variazioni continue (Job Plot)
A + B ABKeq
[AB]max
si ha per XA = 0.5
[AB
]
XA
0.5 1.00.0
Keq = 1
Keq = 10
Keq = 100
La forma della curva dipende dalla costante di complessazione
Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 11998 – 12013
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Il legame Enzima-Proflavina, Stechiometria
Metodo delle variazioni continue (Job Plot)
C0 A + C
0 B = costante MA C
0 A e C
0 B vengono variate entrambe
Ricordando che:
C0 Enz + C
0 Proflavina = 0.1 mM
Soluzione madre di ezima 0.75 mM in tampone fosfato 50 mM pH 7.5
Soluzione madre di Proflavina 0.43 mM in tampone fosfato 50 mM pH 7.5
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Il legame Enzima-Proflavina, Stechiometria
Metodo delle variazioni continue (Job Plot)
Campione Enzima (mM) Proflavina (mM) X Enzima X Proflavina
0 0 0,1 0 1
1 0,01 0,09 0,1 0,9
2 0,02 0,08 0,2 0,8
3 0,03 0,07 0,3 0,7
4 0,04 0,06 0,4 0,6
5 0,05 0,05 0,5 0,5
6 0,06 0,04 0,6 0,4
7 0,07 0,03 0,7 0,3
8 0,08 0,02 0,8 0,2
9 0,09 0,01 0,9 0,1
10 0,1 0 1 0
Proflavina (mM)
0,1
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
Campioni Riferimento
ATTENZIONE! Ogni Campione ha IL SUO riferimento
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Il legame Enzima-Proflavina
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Xproflavina
Ab
s @
46 5
nm
1:1
Campione:da 0 a 10
Riferimento:Stessa concentrazione di proflavina, SENZA enzima
Letture di Assorbanza a 465 nm
Misure spettrofotometriche
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2. Determinazione della costante di complessazione
Il legame Enzima-Proflavina
C0 B = costante, variamo C
0 A
A + B ABKeq
In Laboratorio manterrete fissa la concentrazione di proflavina e varierete la concentrazione di enzima
[AB
]
C0 A
Preparando dieci soluzioni a concentrazione fissa di proflavina e concentrazione variabile di enzima
Biopolymers, 1978, 17, 1773-1792.
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2. Determinazione della costante di complessazione
Il legame Enzima-Proflavina
Proflavina 16.7 µM in tampone fosfato 50 mM pH 7.5
Campione Enzima (M) Proflavina
0 0,00E+00 1,67E-05
1 1,00E-05 1,67E-05
2 2,00E-05 1,67E-05
3 3,00E-05 1,67E-05
4 5,00E-05 1,67E-05
5 7,00E-05 1,67E-05
6 8,00E-05 1,67E-05
7 1,00E-04 1,67E-05
8 1,50E-04 1,67E-05
9 2,00E-04 1,67E-05
10 3,00E-04 1,67E-05
Campioneda 0 a 10
Riferimento:Stessa composizione del campione 0
Letture di Assorbanza a 465 nm
Misure spettrofotometriche
Soluzione madre di ezima 1.0 mM in tampone fosfato 50 mM pH 7.5
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Campione Enzima (M) Proflavina
0 0,00E+00 1,67E-05
1 1,00E-05 1,67E-05
2 2,00E-05 1,67E-05
3 3,00E-05 1,67E-05
4 5,00E-05 1,67E-05
5 7,00E-05 1,67E-05
6 8,00E-05 1,67E-05
7 1,00E-04 1,67E-05
8 1,50E-04 1,67E-05
9 2,00E-04 1,67E-05
10 3,00E-04 1,67E-05
Il legame Enzima-Proflavina
Fitting dei dati sperimentali
Costante di complessazione
Programma di fitting consigliato: SciDAVis
http://scidavis.sourceforge.net/Biopolymers, 1978, 17, 1773-1792.
Dati di letteratura per la costante di complessazione