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Schwermetalle und Pflanzen - eine komplizierte Beziehung (II)
Schwermetall-Hyperakkumulation im Wilden Westenmodified from:
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hem
men
d
Effe
kt
förd
erlic
h
Konzentration
nur Schadstoff (z.B. Quecksilber) Mikronährstoff (z.B. Kupfer)
Die Dosis macht das Gift - auch bei Schwermetallen!
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Ein scheinbar intakter, natürlicher Bachlauf - die Elodea canadensisdarin war jedoch an Zn-Vergiftung eingegangen, die ihr Chlorophyll in Zn-Chlorophyll umgewandelt hatte.
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66
Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität
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Umweltrelevanz von Schwermetall-Toxizität (II)
Wo? Wodurch? Für Wen?
• Natürlicherweise auf schwermetallhaltigen Böden (Cu: z.B. in Zaire, Afrika; Zn/Cd: rel. häufig, auch in Mitteleuropa; Nickel: rel. häufig, Serpentinböden z.B. in Afrika, Australien, Nord- und Mittelamerika): Schwermetallkonzentrationen hoch genug für Toxizität gegen die meisten Organismen.
• Natürlicherweise in kupferhaltigen Bereichen der Ozeane (z.B. Sargasso-See): Kupferkonzentrationen im nanomolaren Bereich hemmen bereits empfindliche Cyanobakterien.
• Anthropogen wegen Einsatzes von Schwermetallsalzen (z.B. CuSO4, z.B. Zn-Phosphid, Zn-Borat, Zn-Fluosilikat): Konzentrationen im mikromolaren Bereich sind toxisch für viele Pflanzen, v.a. Wasserpflanzen in angrenzenden Gewässern
• Anthropogen durch Erz-Abbau und -Verhüttung, Konzentrationen in der Umgebung von Minen, Hütten und Abraumhalden können extrem hoch und für alle Organismen toxisch sein.
• Anthropogen in geringerem Umfang auch durch andere Industrien. Der Rhein enthielt in den 70er Jahren bis zu 0.5 µM Kupfer, was für empfindliche Wasserpflanzen wie Stratiotes oder Elodea bei längerer Einwirkung letal ist.
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Wirkungsmechanismen von Schwermetall-Toxizitätund Resistenz-Mechanismen, die diese gezielt verhindern
--> direkte Hemmung der Photosynthese
--> oxidativer Stress, entweder direkt durch die Schwermetall hervorgerufen oder durch die Fehlfunktion der Photosynthese induziert.
--> Hemmung der Wurzelfunktion
--> Hemmung der Atmung und anderer weniger sensitiver Prozesse
--> Substitution von aktiven Zentren in Enzymen
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1. Hemmung der Wurzelfunktion
Warum Wurzeln?
• Bei terrestrischen Pflanzen ist die Wurzel generell das erste Organ der Pflanze, das mit den Schwermetallen in Berührung kommt.
• Bei Schwermetallen mit relativ geringer Mobilität, z.B. Cu+, werden auch die höchsten Konzentrationen in der Wurzel erreicht
Mechanismen
• Kompetition in der Aufnahme mit weniger verfügbaren essentiellen Spurenelementen, da z.T. von denselben Proteinen transportiert: umstritten da widersprüchliche Daten
• Vermutlich Hemmung von Transportproteinen
• Diverse relativ unspezifische Inhibierungen von cytoplasmatischen Enzymen
• Hemmung der Zellteilung (Wirkmechanismus unbekannt)
• Also Folge der Wurzeltoxizität sterben zunächst die Wurzelhaare und Wurzelspitzen ab
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1. Hemmung der Wurzelfunktion:Resistenzmechanismen
Strategien
• Verringerung der unspezifischen Durchlässigkeit der Wurzel für unerwünschte Schwermetalle: Expression von Peroxidasen verstärkt Lignifizierung
• Aktive (ATP-abhängige) Ausschleusung durch Efflux-Pumpen: Wurde für Cu in Silene vulgaris und für diverse Metalle in Bakterien gefunden.
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2 H2O O2 + 4 H+
P700*
P700
A0 A1
P680*
P680
PheoQA QB
WSC 4 e-
EChlChlPQ FeS/
Rieske
PC
electron transport
Antenna Chl-proteincomplexes,
main protein:LHCII4 h·ν
excitation energy transfer
ChlChl
Chl
heavy metals
2.1. Angriffspunkte in den photosynthetischenLichtreaktionen
2. Direkte Hemmung der Photosynthese
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“Sonnen-Reaktion”In hoher Lichtintensität ist dagegen nur ein kleiner Anteil der Chlorophylle der Mg-Substitution zugänglich, statt dessen findet die Hemmung direkt im PSIIRC statt. Der größte Anteil der Chlorophyllebleicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des Photosyntheseapparatesaus.
“Schatten-Reaktion”Bei geringer Lichtintensität mit einer Nachtphase ist der größte Teil derAntennenchlorophylle (v.a. LHCII) der Mg-Substitution zugänglich. Werden dabei stabile Schwermetallchlorophylle wie z.B. Kupferchlorophyll gebildet, bleiben die Pflanzen auch nach ihrem Absterben grün.
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
2.1. Der Mechanismus der Hemmung der photosynthetischenLichtreaktionen ist in Chlorophyta lichtabhängig
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Warum sind Schwermetallchlorophylle untauglich zur Photosynthese?
• Instabiler S1-Zustand
• Blauverschobene Absorptionsbande des S1-Zustandes
• Wegen der vorgenannten Gründe wirken Schwermetallchlorophylle in einem Mg-Chl-basierten System als „schwarze Löcher“ für Anregungsenergie
nur wenige (3-10) Prozent des Gesamtchlorophylls müssen inSchwermetallchlorophyll umgewandelt werden, um komplette Hemmung der Photosynthese zu erreichen.
• Schwermetall-Chlorophylle haben eine geringere Tendenz als Mg-Chl, eine Ladungstrennung durchzuführen.
• Schwermetall-Chlorophylle binden, im Gegensatz zu Mg-Chl, axiale Liganden nur schwach (z.B. Zn-Chl) oder gar nicht (Cu-Chl)
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Vergleich von Gausaustausch und steady state-Fluoreszenz in Elodea gestresst mit 0.2 µM Cu2+ im Schwachlicht
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
-20
0
20
40
60
80
100
photosynthesis
net p
hoto
synt
hetic
oxy
gen
rele
ase
days of heavy metal stress
0
20
40
60
80
100
µ y
fluor
esce
nce
fluorescence
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UV/VIS -Spektroskopie: Sonnen vs. SchattenreaktionSpektren von E. canadensis Extrakten
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1996) Journal of Experimental Botany 47 (295), 259-66
In vivo Spektren von E. canadensis
Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33
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Hemmung des PSIIRC
Diskutierte Mechanismen
• Hemmung des wasserspaltendenKomplexes
• Hemmung der primären Ladungstrennung:- durch Bindung ans D1-Protein- durch Insertion ins Pheophytin
• Hemmung des Elektronentransports- durch Bindung an Qa-Domänedes D1-Proteins- durch Bindung an nicht-Häm-Fe-Dömäne des D1-Proteins
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2.2. Hemmung der Dunkelreaktionen der Photosynthese(Calvin-Cyclus)
• Indizien aus Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz-Kinetik
• Mechanismus und Bedeutung unklar
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3. Oxidativer Stress
Mechanismen
• Direkt: Katalysiert von redox-aktiven Metallionen (Fe2+, Cu+) werden aus Wasserstoffperoxid durch die Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoff-Radikale:
• Indirekt: Durch Fehlfunktion der Photosynthese und Atmungskette können reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen. Deswegen kann auch bei in vivo redox-inerten Metallionen wie Zn2+ und Cd2+ oxidativer Stress auftreten.
• Oxidativer Stress kann zur Oxidation von Lipiden in Membranen und somit zu deren Undichtigkeit führen. Populärer aber in seiner Bedeutung in vivo umstrittener Mechanismus.
Bedeutung
• Umstritten: Studien mit geringen aber noch toxischen Schwermetall-Konzentrationen zeigen oft keinen oxidativen Stress
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3. Resistenzmechanismen gegen oxidativen Stress
• Verstärkte Expression von Enzymen, die reaktive Sauerstoffspezies entgiften (Superoxid-Dismutase+Katalase. Problem: Hemmung der Zn-Aufnahme ( SOD) bei Cd-Stress.
• Synthese von nicht-Enzym-Antioxidantien, z.B. Ascorbat und Glutathion
• Umbau der Zellmembranen, um sie resistenter gegen den Angriff von reaktiven Sauerstoff-Spezies zu machen: - Lipide mit weniger ungesättigten Bindungen- Austausch von Phosphatidylcholin durch Phosphytidyl-Ethanolamin als Lipid-“Kopf“- Verringerter Anteil von Lipiden und erhöhter Anteil von stabilisierenden Proteinen in der Membran
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4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden
Phytochelatine
• Binden mit sehr hoher Affinität Cd2+, andere Metallionen aber wenig
• Speziell zur Cd2+-Bindung synthetisiert von Phytochelatin-Synthase
• Sind der wichtigste Cd-Resistenzmechanismus in den meisten Pflanzen (außerHyperakkumulatoren) und vielen Tieren
• Phytochelatin-Synthase wird von (z.B. durch Cd-Bindung) blockierten Thiolen von Glutathion und ähnlichen Peptiden aktiviert
• Phytochelatine binden Cd2+ im Cytoplasma, dann Tranport des Komplexes in die Vakuole.
• In der Vakuole bilden sich große Phytochelatin-Cd-Aggregate
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4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen
4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden
Metallothionine
• MTs vom Typ I und II binden mit sehr hoher Affinität Cu2+ und scheinen an dessen Entgiftung beteiligt zu sein.
• Aber: Hauptrolle der MTs in Pflanzen vermutllich Metall-Verteilung während des normalen (nicht-gestressten) Stoffwechsels
Glutathion
• Auch Glutathion selbst, der Baustein der Phytochelatine, könnte Schwermetalle binden und somit entgiften - in vivo Bedeutung eher fraglich.
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4. Allgemeine Resistenz-Mechanismen
4.1. Schwermetall-Entgiftung mit starken Liganden
Freie Aminosäuren
• Wie beim Metalltransport unter normalen physiologischen Bedingungen, scheinen freie Aminosäuren (v.a. Histidin+Nicotianamin) eine Rolle bei der Entgiftung von Schwermetallen zu spielen.
Andere Liganden
• Diverse Proteine
• Anthocyane: Scheinen in Brassicaceen Molybdän zu binden (Entgiftung oderSpeicherung?)
• Zellwand
• Manche Algen scheiden unter Cu-Stress noch unidentifizierte Thiol-Liganden aus
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4.2. Schwermetall-Entgiftung durch Kompartimentierung
Mechanismen
• Generell: aktive Transportprozesse gegen den KonzentrationsgradientenTransportproteine beteiligt.
• Ausschluss aus der Zellen:- in Algen: bei Braunalgen beobachtet- in Wurzeln: siehe Wurzeln
• Einlagerung in die Vakuole: - Pflanzen-spezifischer Mechanismus (Tiere haben keine Vakuolen...)- sehr wirksam, da die Vakuole keine zu hemmenden Enzyme enthält- spart den Aufwand der Synthese von starken Liganden wie Phytochelatinen - wichtigster Mechanismus in Hyperakkumulatoren
• Einlagerung in wenig sensitive Gewebe, z.B. Epidermis ohne statt Mesophyll mit Photosynthese
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4.3. Weitere Resistenz-Mechanismen
• Reduktion durch Reduktasen, z.B. Hg2+ --> Hg0, Cu2+ --> Cu+
• Ausfällung unlöslicher Sulfide außerhalb der Zelle (auf der Zellwand)
• Methylierung, z.B. von Arsen
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--> Biologische Funktion der Hyperakkumulation
--> Mechanismen der Hyperakkumulation
--> Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung und zur Erzgewinnung
Cadmium zu allen Mahlzeiten: Pflanzen mit einem ungewöhnlichen Appetit
Schwermetall-Hyperakkumulation
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Effekte von Ni2+ auf das Wachstum und Ni2+ -Konzentrationen im Sproß
(a)
Ni added to the substrate (mg kg-1)
0 1000 2000 3000 4000
Shoo
t dry
wei
ght (
g)
0
2
4
6
8
10
12
14 Thlaspi goesingenseAlyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum
Alyssum lesbiacum
(b)
Ni added to the substrate (mg kg-1)
0 1000 2000 3000 4000
Ni c
once
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(µg
g-1 )
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000Thlaspi goesingenseAlyssum bertoloniiAlyssum lesbiacum
Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
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Mechanismen der Hyperakkumulation: Komplexierung von Cadmium
hyperakkumuliert von Thlaspi caerulescens (Ganges-Typ)Analysiert mit Röntgenabsorptions-Spektroscopie
young mature senescent dead0
20
40
60
80
Perc
ent o
f all
ligan
ds b
indi
ng to
Cd
Developmental stage of leaves sulphur ligands N/O ligands
stems petioles leaves0
20
40
60
80
Per
cent
of a
ll lig
ands
bin
ding
to C
d
Tissue
Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757
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Komplexierung von Kupferim Cu-sensitiven CdZn-hyperaccumulator T. caerulescens
Analysiert durch XAS von gefrorenen Blättern
Cd: Küpper H, Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH (2003) Plant Physiology 134 (2), 748-757Cu: Mijovilovich A, Meyer-Klaucke W, Kroneck PMH, Küpper H - unpublished
Cu-K-edge EXAFS
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Akkumulation der Metalle in Hyperakkumulatoren
• Größter Bioakkumulationskoeffizient bei kleinen Schwermetall-Konzentrationen (--> Tafelbild)
• Akkumulation meist in Epidermis-Vakuolen
• Aktiv gegen Konzentrationsgradient durch natürliche Überexpression von Metall-Transportproteinen
• Viele Transporter überexprimiert, aber bisher unklar, was primäre und was dadurch verursachte sekundäre Überexpression ist
• Regulation der Überexpression unbekannt
• Gene der meisten Metalltransporter bekannt
• biochemisch-biophysikalischer Mechanismus der Funktion, und dreidimensionaleProteinstruktur bei keinem Schermetall-Transportprotein vollständig bekannt
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Kompartimentierung der Metalle in BlätternZn/Cd/Ni -Akkumulation in Epidermis- Vakuolen
von Thlaspi und Alyssum -ArtenCompartmentation in leaves of Thlaspi caerulescens Alyssum bertolonii
Zn Mg P S Cl K0
2
4
6
8mature leaves
mM
/mM
Ca
Zn Mg P S Cl K0
2
4
6
8 young leaves
mM
/mM
Ca
upper epidermis upper mesophylllower mesophyll lower epidermis
Concentrations of elementsin leaf tissues
Zn K α line scan and dot map of a T. caerulescens leaf
Ni K α line scan and dot map of a A. bertolonii leaf
Zn: Küpper H, Zhao F, McGrath SP (1999) Plant Physiol 119, 305-11Ni: Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, Wieshammer G, McGrath SP (2001) J Exp Bot 52 (365), 2291-2300
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Kompartimentierung von Metallen in BlätternKorrelation zwischen Metallkonzentrationen
im Mesophyll von Arabidospis halleri
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25
data pointsregression line (R = 0.79; P < 0.0001) 95% confidence limits
Mg
/ mM
Cd / mM0 20 40 60
0
2
4
6
8
10
data points regression line (R = 0.94; P < 0.0001) 95% confidence limits
Cd
/ mM
Zn / mM
Küpper H, Lombi E, Zhao FJ, McGrath SP (2000) Planta 212, 75-84
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Cd-Stress im Zn-/Cd-hyperakkumulator T. caerulescens: Verteilung von Photosystem II-Aktivität
Cellular Fv/Fm distribution in a control plant
Distribution of Fv/Fm in a Cd-stressed plant
0
10
20
30
T. caerulescens
C
Con
trol
0
10
20 D
Stre
ssed
0
10
20 EAc
clim
atin
g
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
10
20 F
Fv / Fm
Acc
limat
ed
0
10
20
T. fendleri
Con
trol
A
0
10
20 B
Str
esse
dKüpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674
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Normal: Sequestration in epidermal storage cells
Acclimated: Enhanced sequestration in epidermal storage cells
Stressed: additional sequestration in selected mesophyll cells
vvv
Heterogenität als Resistenzmechanismus
Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytologist 175, 655-674
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Regulation der ZNT1-Transkription analysiert durchquantitative mRNA in situ-Hybridisierung (QISH)
in einer nicht-hyperakkumulierenden und einer hyperakkumulierenden Art
Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187
spon
gy m
esop
hyll
phloe
mbu
ndle
shea
thpa
lisad
e mes
ophy
ll
epide
rmal
metal
stor
age c
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epide
rmal
subs
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cells
epide
rmal
guard
cells
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
c(ZN
T1 m
RN
A) /
c(1
8s rR
NA
)
10 µM Zn2+ Thlaspi caerulescens 10 µM Zn2+ Thlaspi arvense 1 µM Zn2+ Thlaspi arvense
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Scheme from: Solioz M, Vulpe C 1996) TIBS21_237-41
Reinigung und Characterisierung einer Zn/Cd transportierenden P1B-typ ATPase aus natürlicher
Überexpression in Thlaspi caerulescens
Parameswaran A, Leitenmaier B, Yang M, Welte W, Kroneck PMH, Lutz G, Papoyan A, Kochian LV, Küpper H. (2007) BBRC 364, 51-56
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Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Bodenreinigung:Phytoremediation
Aufnahme des Metalls in Hyperakkumulatoren. Nach diesemProzess ist das Metall durch den hohenBioakkumulations-Koeffizienten der Hyperakkus in einem viel kleineren Volumen konzentriert. Die geernteten Pflanzen werden verbrannt; die Asche wird entweder deponiert oder erneut zur Metallgewinnung eingesetzt.
Pflanzenart Max. Cd Biomasse Cd-Entfernungmg/kg DW t DM/ha g/(ha*Jahr)
Arabidopsis halleri 100 2 200Thlaspi caerulescens (Prayon) 250 5 1250Thlaspi caerulescens (S. France) 2500 5 12500Dichapetalum gelonoides 2.1 5 10Athyrium yokosense 165 2 330Arenaria patula 238 2 476Sedum alfredii 180 5 900Weide/Pappel 2.5 20 50Upland Rice 40. 10 400
Daten aus Feldexperimenten von Rufus Chaney (USA), präsentiert auf Konferenz in Hangzhou 2005
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Vegetation auf natürlich nickelreichemBoden (Serpentin). Solcher Boden ist weder für die Landwirtschaft (Ni-Konz. viel zu hoch) noch für die konventionelle Erzgewinnung tauglich (Ni-Konz zu niedrig).
Anwendung von Hyperakkumulatoren zur Metallgewinnung:Phytomining
Werden Nickel-Hyperakkumulatoren auf solchen Böden angebaut, reichern sie mehrere Prozent ihrer Trockenmasse an Nickel an. Nach Verbrennung enthält die Asche 10 bis 50% Nickel, so dass sie als “Bio-Erz”genutzt werden kann.
So eine “Pflanzenmine” kann, Feldstudien unter kommerziell anwendbaren Bedingungen zufolge, etwas 170 kg Nickel pro Hektar und Jahr produzieren. Beim derzeitigen (6.12.07) Nickelpreis von fast 18 € pro Kilo Rohnickel sind das etwa 3000 €.ha-1.
Phytomining pictures from R. Chaney
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Interactions of plants with potentially toxic metals
Heavy metals in soil or water
root uptake exclusionmechanisms
damage to roots
root
± root to shoottranslocation
stemepidermis
regulation byboundary cells?
stemxylem
stemphloem
leaf xylemleaf phloem
photosynthetic cells(e.g. mesophyll cells, stomatal guard cells)
epidermis cells
vacuole
cell walls
cell walls vacuole
in the case of submerged
aquatic plants
metal-induced damage to photosynthesis
(e.g. Mg-substitution)
cyto-plasm
vacuole cytoplasm
cell walls
oxidative stress and other damagecomplexation by strong
ligands
complexation by strongligands
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Alle Folien meiner Vorlesungen im Internet unter
http://www.uni-konstanz.de/FuF/Bio/kuepper/Homepage/AG_Kuepper_education.html
weiterführende Literatur als pdf auf Anfrage