1
Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biomateriałów
Rozprawa doktorska
RESORBOWALNE MEMBRANY DO STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK
mgr inż. Małgorzata Krok
Promotor: dr hab. inż. Elżbieta Pamuła, Prof. AGH
- Kraków 2012 -
2
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ..................................................................................... 7
1. WPROWADZENIE ........................................................................................................... 7
2. CHOROBY PRZYZĘBIA ................................................................................................ 8
3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA ........................................................ 10
3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia ............................................................................ 10
3.2. Chirurgiczne metody leczenia ................................................................................. 11
3.2.1.Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji ......................... 11
3.2.2.Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji ..................... 13
4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) ....... 15
4.1. Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej
regeneracji tkanek .................................................................................................... 15
4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR ................................................. 17
4.2.1.Membrany nieresorbowane ............................................................................... 17
4.2.2.Membrany resorbowalne .................................................................................. 19
4.2.2.1. Materiały membranowe pochodzenia naturalnego ...................................... 20
4.2.2.2. Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego .................................. 22
4.2.3.Membrany gradientowe .................................................................................... 28
II TEZA I CEL PRACY ...................................................................... 31
III CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ....................................................... 33 1. MATERIAŁY I METODY ............................................................................................. 33
1.1. Charakterystyka materiału matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu)
(PLGA) ...................................................................................................................... 33
1.2. Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG) ........................... 33
1.3. Otrzymywanie membran ......................................................................................... 34
1.4. Charakterystyka membran ..................................................................................... 35
3
1.4.1.Grubość i udział objętościowy porów ............................................................... 35
1.4.2.Mikrostruktura .................................................................................................. 35
1.4.3.Topografia powierzchni .................................................................................... 36
1.4.4.Zwilżalność powierzchni ................................................................................... 36
1.4.5.Właściwości chemiczne powierzchni ................................................................. 36
1.4.6.Wytrzymałość mechaniczna .............................................................................. 37
1.5. Szybkość odparowania rozpuszczalnika ................................................................ 37
1.6. Badania degradacji ................................................................................................... 38
1.7. Właściwości biologiczne ........................................................................................... 38
1.7.1.Badania na komórkach osteoblastopodobnych MG-63 .................................... 39
1.7.1.1. Żywotność komórek .................................................................................... 40
1.7.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 40
1.7.1.3. Morfologia komórek .................................................................................... 41
1.7.2.Badania z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ludzkich fibroblastów ............................................................ 41
1.7.2.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek ......................... 42
1.7.2.2. Morfologia komórek .................................................................................... 43
1.7.3.Badania w kokulturach komórkowych .............................................................. 43
1.7.3.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek ......................... 44
1.7.3.2. Morfologia ................................................................................................... 44
1.7.3.3. Hodowla komórek po obu stronach membrany ........................................... 45
2. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW ............................................................................ 46
2.1. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od
stężenia PEG ............................................................................................................. 46
2.1.1.Morfologia membran ........................................................................................ 46
2.1.2.Mikrostruktura .................................................................................................. 47
2.1.3.Właściwości mechaniczne ................................................................................. 49
4
2.1.4.Dyskusja wyników ............................................................................................ 51
2.2. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od
masy cząsteczkowej PEG ......................................................................................... 54
2.2.1.Mikrostruktura .................................................................................................. 54
2.2.2.Grubość membran i procent wypłukania PEG ................................................. 57
2.2.3.Wpływ odparowania rozpuszczalnika na mikrostrukturę membran ................. 57
2.2.4.Badania FTIR-ATR ........................................................................................... 59
2.2.5.Dyskusja wyników ............................................................................................ 61
2.3. Badania degradacji membran ................................................................................. 64
2.3.1.Ocena makroskopowa ....................................................................................... 64
2.3.2.Zmiany masy ...................................................................................................... 65
2.3.3.Zmiany pH ......................................................................................................... 66
2.3.4.Kąt zwilżania ..................................................................................................... 67
2.3.5.Wytrzymałość .................................................................................................... 69
2.3.6.Mikrostruktura i topografia powierzchni .......................................................... 72
2.3.6.1. SEM ............................................................................................................. 72
2.3.6.2. AFM ............................................................................................................ 76
2.3.7.Dyskusja wyników ............................................................................................ 78
2.4. Charakterystyka biologiczna membran ................................................................. 80
2.4.1.Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63 ............................................................................................................... 80
2.4.1.1. Żywotności komórek ................................................................................... 80
2.4.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 81
2.4.1.3. Morfologia komórek .................................................................................... 82
2.4.1.4. Dyskusja wyników ..................................................................................... 84
2.4.2.Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ................................................... 85
2.4.2.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 85
5
2.4.2.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 86
2.4.2.3. Morfologia komórek .................................................................................... 88
2.4.2.4. Dyskusja wyników ..................................................................................... 92
2.4.3.Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste ............................................................... 93
2.4.3.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 93
2.4.3.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 95
2.4.3.3. Morfologia komórek .................................................................................... 97
2.4.3.4. Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym ...................... 98
2.4.3.5. Dyskusja wyników ..................................................................................... 99
3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ................................................................................. 101
IV STRESZCZENIE ......................................................................... 107 V SUMMARY ................................................................................... 108
Spis Tabel: ........................................................................................................ 109
Spis Rysunków: ............................................................................................... 110
Literatura: ........................................................................................................ 115
6
W tym miejscu chciałam złożyć serdeczne podziękowania:
Prof. dr hab. inż. Elżbiecie Pamule, za nieocenioną pomoc, wiele cennych rad
oraz wiedzę przekazaną w czasie studiów doktoranckich.
Rodzicom, za to, że zawsze mnie wspierają.
„Przyjaźń poznaję po tym, że nic nie może jej zawieść, a prawdziwą miłość po tym, że nic nie może jej zniszczyć.”
- Pauli i Klaudiuszowi
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
7
I CZĘŚĆ LITERATUROWA
1. WPROWADZENIE
Zarówno w Polsce jaki i na świecie rośnie zapotrzebowanie na wszelkiego
rodzaju implanty do leczenia ubytków tkanki kostnej, również w dziedzinie
periodontologii i chirurgii stomatologicznej. Dzieje się tak dlatego, że wydłuża się
średnia długość życia ludzi, ale również przyczyniają się do tego zaniedbania
higieniczne w obrębie jamy ustnej. W konsekwencji prowadzi to do coraz częstszego
występowania różnego rodzaju chorób przyzębia. Obecnie choroby te zostały zaliczone
do grupy chorób społecznych; szacuje się, że co trzecia dorosła osoba w Polsce cierpi
na choroby przyzębia, w tym również na paradontozę [1]. W zależności od stopnia
zaawansowania parodontozy stosuje się różne techniki leczenia, mniej lub bardziej
inwazyjne. Jednakże w przypadku znacznego postępu choroby, największą szansą na
powodzenie charakteryzują się techniki implantacyjne nazywane sterowaną regeneracją
tkanek (GTR, ang. guided tissue regeneration) [2].
Technika GTR opiera się na zastosowaniu materiału w postaci
półprzepuszczalnej membrany. Jak wiadomo z doniesień literaturowych komórki tkanki
nabłonkowej i tkanki miękkiej proliferują szybciej niż komórki tkanki kostnej,
w wyniku czego miejsce ubytku w tkance kostnej zajmuje tkanka miękka, która nie daje
dostatecznego wsparcia dla zębów lub w przypadku bardziej zaawansowanego procesu
chorobowego uniemożliwia zastosowanie implantów zębów [3, 4, 5]. Zadaniem
membrany używanej w GTR, jest stworzenie właściwych warunków poprzez
odizolowanie tkanek dziąsła i zapewnienie odpowiedniego czasu niezbędnego do
odbudowy tkanki kostnej w pożądanym miejscu. Takie podejście wymaga zastosowania
materiału o zdefiniowanej strukturze i właściwościach. Membrana powinna
charakteryzować się asymetryczną budową: jedna strona przeznaczona do kontaktu
z tkanką miękką powinna sprzyjać adhezji fibroblastów i komórek nabłonkowych, zaś
druga strona powinna stymulować adhezję i wnikanie osteoblastów do miejsca ubytku,
co w konsekwencji pozwoli na odbudowę nowej, zdrowej tkanki kostnej [5, 6]. Ponadto
membrana powinna również umożliwiać wymianę płynów, gazów i składników
odżywczych. Jak każdy biomateriał membrana powinna także być nietoksyczna, nie
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
8
wykazywać właściwości alergizujących, być odporna na zasiedlanie drobnoustrojami
oraz powinna ulegać biodegradacji i bioresorpcji po spełnieniu swojej funkcji, co
wykluczałoby powtórną operację.
Obecnie na rynku dostępnych jest kilka różnych typów membran dla GTR.
Jednakże materiały te mają liczne wady, do których można zaliczyć trudności
w kontrolowaniu ich budowy mikrostrukturalnej, niebiodegradowalność czy
odzwierzęce pochodzenie, co stwarza zagrożenia przeniesienia na pacjenta chorób
i patogenów.
W części literaturowej niniejszej pracy omówiono zagadnienia dotyczące genezy
chorób przyzębia, sposobów ich leczenia jak i materiałów wykorzystywanych
w technice GTR.
2. CHOROBY PRZYZĘBIA
Choroby przyzębia stanowią bardzo poważny problem społeczny. Początkowe
ich objawy, tj. krwawienie dziąseł czy nieprzyjemny zapach z ust są często
lekceważone. Konsekwencją tego jest rozwijający się stan zapalny. W zależności
intensywności stanu zapalnego choroby przyzębia można podzielić na dwie
podstawowe grupy:
choroby dziąseł
zapalenia przyzębia
Zarówno choroby dziąseł jak i zapalenia przyzębia są warunkowane przez dużą liczbę
patogenów chorobotwórczych, co jest główną przyczyną częstego występowania
problemów w obrębie jamy ustnej. Czynniki wywołujące choroby przyzębia można
podzielić na te, które są niezależne od człowieka takie, jak choroby dziąseł i przyzębia
pochodzenia alergicznego czy urazowego lub będące wynikiem zmian hormonalnych
czy obciążeń genetycznych. Częściej jednak obserwuje się zmiany w obrębie przyzębia,
które spowodowane są czynnikami zależnymi od działalności człowieka, a konkretnie
wynikają one z małego stopnia świadomości, jak ważna jest prawidłowa higiena jamy
________________________________
ustnej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia
nazębnego, w którym gromadzą się resztki
bakterii, które są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych
ustnej [7, 8].
Niezależnie od przyczyny występowania chorób przyzębia p
dość podobny. W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez
bakterie znajdujące się w płytce nazębnej.
nazębny zajmują coraz większy obszar,
linii dziąseł w kieszonkach
może doprowadzić do tego, że
kością dziąsła a zębem), w wyniku cz
dziąsła, ale również głębiej położone
zniszczenia tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają
do głęboko umiejscowionej tkanki kostnej
co wywołuje zniszczenie więzadła zębo
się” kości dziąsła (Rys. 1 B
kontaktu dziąsło-ząb co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w
wypadania zębów.
Rys. 1 Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb
z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.).
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
nej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia
którym gromadzą się resztki pokarmu, co z kolei sprzyja rozwojowi
są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych
Niezależnie od przyczyny występowania chorób przyzębia przebieg każdej choroby jest
W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez
dujące się w płytce nazębnej. Płytka bakteryjna i tworzący się kamień
nazębny zajmują coraz większy obszar, wbudowując się w ząb oraz gromadząc
kieszonkach dziąsłowych. Długotrwałe nieleczone zapalenie dziąseł
może doprowadzić do tego, że bakterie zaatakują ozębną (tkankę znajdu
a zębem), w wyniku czego stan zapalny pogłębia się obejmując
głębiej położone obszary. W kolejnym stadium dochodzi do
tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają
głęboko umiejscowionej tkanki kostnej dziąsła. Zainfekowana kość ulega rozpadowi
nie więzadła zębodołowo-zębowego i powoduje
(Rys. 1 B, 2 B) [9]. W wyniku tego procesu
co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w późniejszym etapie
Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb-dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą
z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.).
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
9
nej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia
kolei sprzyja rozwojowi
są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych w obrębie jamy
rzebieg każdej choroby jest
W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez
Płytka bakteryjna i tworzący się kamień
wbudowując się w ząb oraz gromadząc poniżej
nieleczone zapalenie dziąseł
ozębną (tkankę znajdująca się między
ę obejmując nie tylko
. W kolejnym stadium dochodzi do
tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają się aż
dziąsła. Zainfekowana kość ulega rozpadowi,
zębowego i powoduje efekt „cofania
zmniejsza się pole
późniejszym etapie do
dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
10
Bardzo poważnym problem w przebiegu chorób przyzębia jest fakt, że choroba ta może
przebiegać bezobjawowo, nawet przez kilka lat, aż do momentu kiedy utrata zęba
będzie praktycznie nieunikniona. Dlatego bardzo ważnym zagadnieniem jest
profilaktyka, ale również opracowywanie nowych metod leczenia chorób przyzębia,
które zapobiegną utracie zębów.
3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA
Leczenie chorób przyzębia zależy od stopnia zaawansowania choroby, jak
również od tego czy mamy do czynienia z zapaleniem dziąseł, czy wystąpiło także
zapalenie przyzębia. Różnica między tymi dwiema jednostkami chorobowymi wynika
z głębokości osadzenia płytki bakteryjnej. W przypadku zapalenia dziąseł płytka
bakteryjna znajduje się nad dziąsłem, natomiast jeśli występuje również zapalenie
przyzębia, płytka bakteryjna sięga głębiej, poniżej linii dziąseł osadzając się
w patologicznej kieszonce dziąsłowej. Doboru metody leczenia dokonuje lekarz na
podstawie stopnia zaawansowania choroby oraz wywiadu ogólnego.
3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia
W przypadku niewielkiego stopnia zaawansowania choroby zadowalające efekty
dają mniej inwazyjne metody leczenia. Podstawowym zabiegiem, mającym działanie
lecznicze, ale również profilaktyczne jest usuwanie złogów płytki nazębnej (skaling
nad- i poddziąsłowy) jak również polerowanie szyjek i korzeni zębów. W niektórych
przypadkach skuteczna jest też farmakoterapia, w której stosuje się np. antybiotyki
o działaniu ogólnym lub miejscowym, sole metali ciężkich, witaminy, środki
dezynfekujące, ściągające lub/i przeciwzapalne [10].
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
11
3.2. Chirurgiczne metody leczenia
Leczenie chirurgiczne stosuje się w przypadku bardziej zaawansowanych
postaci chorób przyzębia, a ich celem jest:
regeneracja ubytków tkanki kostnej
przywrócenie fizjologicznych konturów dziąsła
odsłonięcie miejsc niedostępnych dla oczyszczenia uzębienia
Pierwszą grupą metod chirurgicznych są zabiegi polegające na poszerzeniu dziąsła
(metody plastyczne), do drugiej grupy zalicza się metody, których efektem jest redukcja
lub eliminacja kieszonek przyzębnych (metody resekcyjne). Jednak najbardziej
interesujące, z punktu widzenia skuteczności oraz inżynierii biomateriałów, wydają się
być metody regeneracyjne.
3.2.1. Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji
W przypadku rozległych uszkodzeń tkanek procesy naprawcze przebiegają poprzez
wytworzenie tkanki łącznej wypełniającej ubytek, tzw. blizny łącznotkankowej. Proces
ten określany jest mianem reperacji, bo umożliwia zachowanie integralności
uszkodzonych tkanek, ale nie prowadzi on jednak do przywrócenia ich pełnej
funkcjonalności i struktury. Czynnikami sprzyjającymi bliznowaceniu są intensywny
stan zapalny, duża wielkość ubytku oraz czynniki osobnicze (np. wiek pacjenta).
W wyniku bliznowacenia powstaje tkanka niemalże bezkomórkowa, uboga w naczynia
krwionośne zawierająca dużo kolagenu. Powstanie tkanki bliznowatej jest zwykle
procesem nieodwracalnym i niekorzystnym, gdyż w jego wyniku nie zostają
odtworzone naturalne struktury tkankowe.
W przypadku chirurgicznych metod leczenia chorób przyzębia zarówno metody
plastyczne jak i resekcyjne przyczyniają się jedynie do reperacji tkanek przyzębia, tj.
dochodzi do ustąpienia objawów klinicznych choroby (zapalenia), a w miejscu ubytku
powstaje tkanka łączna, wytworzona przez fibroblasty dziąsła. W wyniku tego tworzy
________________________________
się tzw. długi przyczep nabłonkowy, będący efektem szybkiego narastania nabłonka
dziąsła, który może sięgać aż do dna ubytku kostnego. Reparację można więc
zdefiniować jako proces gojenia się rany, w wyni
budowa i funkcje nie są identyczne z tkanką zniszczoną (Rys. 2 A
że reparacja nie zapewnia pełnego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek
przyzębia.
Rys. 2 Schemat prawidłowego obszaru ząb
z widoczna kieszonką dziąsłową
zębodołowo-zębowego (B.) oraz obszaru po leczeni
i regeneracji (D.) [12].
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
się tzw. długi przyczep nabłonkowy, będący efektem szybkiego narastania nabłonka
dziąsła, który może sięgać aż do dna ubytku kostnego. Reparację można więc
zdefiniować jako proces gojenia się rany, w wyniku którego powstają tkanki, których
budowa i funkcje nie są identyczne z tkanką zniszczoną (Rys. 2 A – C). Wynika z tego,
że reparacja nie zapewnia pełnego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek
Schemat prawidłowego obszaru ząb-dziąsło (A.), obszaru objętego
z widoczna kieszonką dziąsłową i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła
zębowego (B.) oraz obszaru po leczeniu metodą reparacji (C.)
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
12
się tzw. długi przyczep nabłonkowy, będący efektem szybkiego narastania nabłonka
dziąsła, który może sięgać aż do dna ubytku kostnego. Reparację można więc
ku którego powstają tkanki, których
C). Wynika z tego,
że reparacja nie zapewnia pełnego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek
dziąsło (A.), obszaru objętego chorobą
i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła
metodą reparacji (C.)
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
13
3.2.2. Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji
Odzyskanie pełnej funkcji i struktury tkanek przyzębia zapewnia metoda sterowanej
regeneracji tkanek – GTR (Rys. 2 D). Metoda ta opiera się na zastosowaniu
odpowiedniego materiału, w postaci membrany (błony) regeneracyjnej (Rys. 3 A).
Membranę wszczepia się pod płat dziąsłowy, tak aby jeden jej koniec opierał się
o brzeg zachowanego fragmentu wyrostka zębodołowego, a z drugiej strony
przymocowuje do szyjki zęba. Dzięki temu membrana oddziela tkanki dziąsła od
powierzchni korzenia zębowego na okres od kilku tygodni do kilku miesięcy. W tym
czasie możliwe jest zajście procesu regeneracji, ponieważ wszczepiony materiał
uniemożliwia komórkom nabłonka i fibroblastom dziąsła wnikanie do ubytku kostnego
i wytworzenie blizny łącznotkankowej. W wyniku tego, dochodzi do aktywacji
komórek ozębnej, które zaczynają odtwarzać nowy cement korzeniowy wraz
z włóknami kolagenowymi oraz dochodzi do aktywacji komórek osteogennych
odtwarzających kość (Rys. 3 B). Dzięki metodzie GTR możliwe jest odtworzenie
struktur, które mają znacznie większą odporność na uszkodzenia niż tkanki powstające
w trakcie procesu reperacji [11, 12]. GTR jest więc techniką, która umożliwia
odtwarzanie funkcji i struktury uszkodzonych tkanek poprzez wykorzystanie
naturalnych możliwości tkanek do ich regeneracji i przeciwdziałanie powstawaniu
tkanki bliznowatej. Jednakowoż proces regeneracji jest bardzo złożony i aby był
możliwy, czyli aby doszło do pełnej regeneracji tkanki kostnej, oprócz wyżej
wymienionej membrany, spełniającej funkcje nośnika/aktywatora komórek, muszą
zostać spełnione jeszcze dwa warunki. Pierwszym jest obecność komórek osteogennych
– macierzystych, częściowo zróżnicowanych (preosteoblasty) i komórek
zróżnicowanych (osteoblasty), czyli komórek które będą w stanie odtworzyć utracone
struktury kostne. Drugim warunkiem koniecznym do zajścia procesu regeneracji są
cząstki sygnałowe procesu gojenia, tj. czynniki wzrostu, cytokiny, hormony, witaminy
czy białka morfogenetyczne kości (BMP, bone morphogenetic proteins).
Razem te trzy czynniki: materiał będący aktywatorem, komórki kościotwórcze i cząstki
sygnałowe procesu gojenia, stanowią tzw. triadę Lyncha, która jest konieczna, aby
zaszedł proces regeneracji [13, 14, 15].
________________________________
Rys. 3 Schemat umieszczenia membrany
aktywacji osteoblastów (B.)
Rys. 4
Reasumując choroby przyzębia stano
W leczeniu tych chorób ogromną rolę odgrywa profilaktyka, jednakże z uwagi na to, że
choroba w stadium początkowym
dochodzi do znacznego
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
chemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchnią dziąsła (A.), proces
aktywacji osteoblastów (B.) [12].
4 Schemat przedstawiający triadę Lyncha [13]
Reasumując choroby przyzębia stanowią rozległy problem
W leczeniu tych chorób ogromną rolę odgrywa profilaktyka, jednakże z uwagi na to, że
w stadium początkowym często jest lekceważona lub przebiega bezobj
dochodzi do znacznego jego postępu. W takim wypadku niezbędne
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
14
powierzchnią dziąsła (A.), proces
].
rozległy problem społeczny.
W leczeniu tych chorób ogromną rolę odgrywa profilaktyka, jednakże z uwagi na to, że
lub przebiega bezobjawowo
. W takim wypadku niezbędne jest włączenie
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
15
w proces leczenia zabiegów chirurgicznych. Przeprowadzone badania dowodzą, że
najlepsze rezultaty osiągane są przy zastosowaniu metod sterowanej regeneracji tkanek
GTR. W metodzie tej wykorzystywane są biomateriały w postaci membran o ściśle
zdefiniowanej budowie i właściwościach.
W dalszej części rozprawy przedstawiono założenia, metody otrzymywania,
charakterystykę właściwości oraz wady i zalety obecnie używanych membran
stosowanych w technice GTR.
4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB
PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR)
Membrany są szeroko stosowane – nie tylko w sterowanej regeneracji tkanek,
ale w całej medycynie. Są wykorzystywane m.in. w sztucznych narządach,
bioseparatorach, inżynierii tkankowej, w systemach dostarczania leków czy
urządzeniach diagnostycznych [16]. Z uwagi na tematykę niniejszej pracy poruszane
w tym rozdziale zagadnienia będą dotyczyć membran stosowanych w technice GTR.
4.1. Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej regeneracji
tkanek
Membrany stosowane w technice GTR, w pierwszej kolejności powinny
spełniać wymagania stawiane wszystkim biomateriałom. Powinny być biozgodne,
umożliwiając integrację materiału z tkankami gospodarza, nie powinny wywoływać
stanu zapalnego o dużym nasileniu, a także powinien je cechować brak właściwości
alergizujących, kancerogennych i mutagennych [16, 17].
Oprócz tego membranom do GTR stawia się dodatkowe wymagania, które wynikają
ściśle z funkcji jaką tak membrana ma pełnić. Jak już wspomniano membrana do GTR
ma służyć jako bariera pomiędzy tkanką miękką a tkanką kostną. Z tego stwierdzenia
można wnioskować, że materiał taki powinien charakteryzować się odpowiednimi
właściwościami mechanicznymi i sztywnością [17, 18]. Membrana nie powinna ulegać
zapadaniu do wnętrza ubytku, ponieważ w przeciwnym razie nie zapewni odpowiednich
warunków potrzebnych do regeneracji tkanki kostnej. Powierzchnia membrany powinna
________________________________
również umożliwiać aktywację i proli
a z drugiej strony zapobiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej
budowa membrany powinna być asymetryczna
kontaktu z tkanką miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej
Rys. 5 Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany
sterowanej regeneracji tkanek.
Kolejną ważną cechą membrany
z którego jest wytworzona.
z faktu, że w przypadku materiału nie
funkcji musi zostać usunięta
przeprowadzenia kolejnego zabiegu,
oraz podniesieniem kosztów leczenia
biodegradacji czas jego działania po
ponieważ jest to czas, który z powodzeniem umożliwia
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
również umożliwiać aktywację i proliferację komórek kościotwórczych
obiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej
budowa membrany powinna być asymetryczna – gładsza ze strony
ą miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej
Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany
sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych.
ą membrany jest podatność na degradację i resorpcję materiału,
wytworzona. Nie jest to warunek konieczny, ale pożądany. Wynika to
że w przypadku materiału niedegradowalnego membrana po spełnieniu swojej
i musi zostać usunięta z organizmu. Wiąże się to z koniecznością
przeprowadzenia kolejnego zabiegu, a więc z dodatkowymi obciążeniami dla pacjenta
podniesieniem kosztów leczenia [6, 19]. W przypadku materiału ulegającego
biodegradacji czas jego działania powinien wynosić co najmniej 4
który z powodzeniem umożliwia regenerację periodontologiczną
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
16
ferację komórek kościotwórczych z jednej strony,
obiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej. Stąd
gładsza ze strony przeznaczonej do
ą miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej (Rys. 5).
Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany przeznaczonej do
Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych.
podatność na degradację i resorpcję materiału,
ale pożądany. Wynika to
po spełnieniu swojej
z organizmu. Wiąże się to z koniecznością
a więc z dodatkowymi obciążeniami dla pacjenta
W przypadku materiału ulegającego
winien wynosić co najmniej 4 – 6 tygodni,
regenerację periodontologiczną
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
17
[17, 20, 21]. Natomiast produkty degradacji nie mogą być toksyczne, a ich usunięcie
z organizmu powinno być możliwe na drodze metabolicznej [22].
Poza tym, uwzględniając cechy technologiczne, aby możliwe było wprowadzenie do
masowej produkcji nowego biomateriału, membrana powinna spełniać wymagania takie
jak: łatwa i szybka produkcja oraz możliwość dostosowana kształtu i wielkości wyrobu
do zapotrzebowania. Co więcej możliwe musi być przeprowadzenia procesu sterylizacji
materiału, który nie zmieni jego właściwości, a produkt końcowy powinien być
poręczny chirurgicznie i dawać możliwość łatwego zastosowania oraz dopasowania do
potrzeb indywidualnego pacjenta [23].
4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR
Membrany stosowane w GTR można podzielić na dwie podstawowe grupy.
Podział ten oparty został na zdolności materiału do degradacji, stąd możemy wyróżnić:
membrany nieresorbowalne
membrany resorbowalne
Jako osobną grupę materiałów wyróżnia się również:
membrany gradientowe (FGM, ang. functional gradient materials)
4.2.1. Membrany nieresorbowane
Pierwszą handlową membraną, która została wykorzystana do leczenia chorób
przyzębia metodą sterowanej regeneracji tkanek była nieresorbowalana membrana
z ekspandowanego politetrafluoroetylenu (e-PTFE, Gore-Tex Membrane®, W.L. Gore
& Assos., Flagstaff, AZ., USA) [5]. Pierwszy raz została ona użyta w 1984 roku, a jej
budowa odzwierciedla założenia stawiane membranom do GTR, gdyż posiada ona
asymetryczną, porowatą mikrostrukturę [24]. Membrana e-PTFE zbudowana jest
z litych węzłów polimerowych połączonych ze sobą włóknami (Rys. 6), a włókna
ułożone są tak, że z jednej strony tworzą strukturę o porowatości 90% i grubości około
1 mm, a z drugiej porowatość wynosi 30%, a grubość około 0,15 mm [17].
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
18
Rys. 6 Mikrostruktura e-PTFE [25].
Membrany e-PTFE są otrzymywane poprzez kontrolowane rozciąganie foli teflonowej
oraz wprasowanie jej w matrycę polimerową posiadającą określoną strukturę
(np. Dacron® lub Nylon®), dzięki czemu w PTFE dochodzi do samorzutnego tworzenia
się porów.
Obecnie na rynku dostępne są również inne membrany na bazie PTFE np.
politetrafluoroetylen o wysokiej gęstości (d-PTFE, Cytoplast® TXT-200) (Rys. 7) [17].
Membrany te zostały wprowadzone do użycia w 1993 roku. Posiadają inną budową niż
e-PTFE – posiadają pory o wielkości 0,2 m [17]. Badania pokazały, że membrany
z d-PTFE są w mniejszym stopniu zasiedlane przez drobnoustroje i łatwiejsze do
usunięcia po procesie leczenia, niż membrany e-PTFE [17, 26].
Stosowane są również membrany kompozytowe z d-PTFE połączone z siatką tytanową
(Cytoplast® Ti-250). Modyfikacja ta polega na umieszczeniu siatki tytanowej między
dwiema warstwami d-PTFE. Takie rozwiązanie poprawia wytrzymałość membran i ma
na celu zapobieganie ewentualnemu zapadaniu się membrany do wnętrza ubytku tkanki
kostnej, ponieważ ograniczenie obszaru pod membraną wpływa niekorzystnie na
warunki regeneracji [17, 24]. Oprócz siatki wzmacniającej sam tytan w postaci folii jest
również stosowany jako materiał membranowy. Tytan jest wykorzystywany jako
membrana ze względu na to, że posiada wysoką odporność na zakażenia bakteryjne
i w przypadku odsłonięcia implantu w trakcie leczenia, nie wywołuje i nie podtrzymuje
infekcji [27].
________________________________
Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości
(d-PTFE, Cytoplast®TXT
(Cytoplast®Ti-250) przeznaczone do GTR
Zaletą nieresorbowalnych materiałów jest to, że są one
i za biozgodne w kontakcie
barierowe, zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia.
materiałów jest to, że jeśli w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsłonięcia
membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, g
nieresorbowanych membran
swojej funkcji membrana musi zostać usunięta z
z koniecznością przeprowadzenie kolejnego
ponownego otworzenia już wygojonej rany.
pacjenta, przedłuża czas
4.2.2. Membrany resorbowalne
Drugą grupą materiałów
enzymatycznej lub hydrolitycznej
pochodzenia naturalnego,
pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzyszącym w czasie
rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkt
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości
PTFE, Cytoplast®TXT-200) i z d-PTFE wzmocnionego siatką tytanową
przeznaczone do GTR [28].
Zaletą nieresorbowalnych materiałów jest to, że są one uważane za chemicznie
w kontakcie z żywym organizmem. Posiadają one
zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia.
materiałów jest to, że jeśli w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsłonięcia
membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, g
nieresorbowanych membran, jak już wspomniano wcześniej, jest fakt, że po spełnieniu
swojej funkcji membrana musi zostać usunięta z leczonego miejsca
nością przeprowadzenie kolejnego zabiegu, w trakcie którego
ponownego otworzenia już wygojonej rany. Stanowi to dodatkowe obciążenie dla
pacjenta, przedłuża czas leczenia i podnosi jego koszty [6, 19, 29, 30,
Membrany resorbowalne
grupą materiałów używanych w GTR, są materiały ulegające
hydrolitycznej. Degradacji enzymatycznej ulegają materiały
pochodzenia naturalnego, natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach
pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzyszącym w czasie
rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkt
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
19
membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości
ego siatką tytanową
chemicznie obojętne
dobre właściwości
zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia. Wadą tych
materiałów jest to, że jeśli w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsłonięcia
membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, główną wadą
jest fakt, że po spełnieniu
leczonego miejsca. Wiąże się do
zabiegu, w trakcie którego dochodzi do
Stanowi to dodatkowe obciążenie dla
, 31, 32].
są materiały ulegające degradacji
enzymatycznej ulegają materiały
natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach
pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzyszącym w czasie
rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkty te mogą być
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
20
wydzielane poza organizm lub być w nim zatrzymywane. Ważne jest aby produkty
degradacji nie wywierały negatywnego wpływu na organizm żywy [33]. Dzięki
możliwości degradacji po spełnieniu swojej funkcji membrana zanika. Poprzez
zastosowanie membrany z materiału resorbowalnego lub degradowanego można
wyeliminować główną wadę materiałów stabilnych, tj. potrzebę powtórnej operacji
w celu usunięcia biomateriału.
Podział materiałów resorbowalnych na dwie grupy wynika z ich pochodzenia
i mechanizmu ich degradacji.
4.2.2.1. Materiały membranowe pochodzenia naturalnego
Podstawowym materiałem naturalnym, wykorzystywanym do wytworzenia membrany
dla GTR jest kolagen, najczęściej typu I. Może to być kolagen pochodzący z ludzkiej
skóry (Alloderm®, LifeCell, Branchburg, NJ, USA), bądź wyekstrahowany z wołowych
ścięgien Achillesa (Cytoplast® RTM Collagen, City, State, USA) lub świńskiej skóry
(Bio-Gide®, Osteohealth, Shirley, NY, USA) [13]. Pochodzenie kolagenu jest różne,
natomiast jak wiadomo kolagen jest podstawowym składnikiem macierzy
zewnątrzkomórkowej, stąd wynikają jego bardzo dobre właściwości biologiczne, zaś
membrany kolagenowe charakteryzują się bardzo dobrym powinowactwem do komórek
oraz biozgodnością [6, 34, 35].
Na Rys. 8 przedstawiono budowę membrany BioGide®. Jak widać membrana ta ma
asymetryczną budowę, z jednej strony przeznaczonej do kontaktu z tkanką miękką
membrana jest gładsza (Rys. 8 C), a z drugiej bardziej chropowata co sprzyja
proliferacji komórek kostnych (Rys. 8 D). Włóknista budowa membran kolagenowych
(Rys. 8, 9) przyśpiesza formowanie skrzepu i stabilizuje ranę, oprócz tego stymuluje
degranulację płytek krwi, w trakcie której uwalniane są np. czynniki wzrostu, co z kolei
może wpłynąć korzystnie na proces regeneracji [37].
Membrany kolagenowe są otrzymywane kilku etapowo. W pierwszym etapie kolagen
zostaje rozpuszczony, następnie przygotowany roztwór zostaje zamrożony (-20°),
a ostateczną, włóknistą strukturę otrzymuje się poprzez proces suszenia
sublimacyjnego (liofilizacji) i prasowania. Inną metodą może być przędzenie
w środowisku 99,5% alkoholu etylowego. Otrzymany produkt poddaje się procesowi
płukania i suszenia pod obniżonym ciśnieniem. Następnie kolagen sieciuje się
w aldehydzie gluarowym oraz poddaje ponownemu płukaniu i prasowaniu. [36].
________________________________
Rys. 8 Budowa membrany BioGide® A. powiększenie 40x
C. strona gładsza, powiększenie
10000x [37].
Rys. 9 Budowa membrany Cytoplast® RTM Collagen [
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
rany BioGide® A. powiększenie 40x B. powiększenie 100x,
C. strona gładsza, powiększenie 250x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie
rany Cytoplast® RTM Collagen [28].
I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________
21
B. powiększenie 100x,
0x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
22
Pomimo wielu zalet, stosowanie membran kolagenowych pociąga za sobą również
pewne ograniczenia. Po pierwsze koszty pozyskania surowca kolagenowego są
stosunkowo wysokie, a liczba źródeł ograniczona. Jednakże największym problemem
wydaje się być fakt, że kolagen jako materiał pochodzenia naturalnego charakteryzuje
się zmiennością właściwości oraz budowy, w wyniku czego pojawiają się trudności
w kontrolowaniu właściwości mechanicznych i jak czasu degradacji wyrobów finalnych
[13]. Badania pokazały, że wytrzymałość membran kolagenowych znacznie spada
w momencie, kiedy membrana zaczyna się degradować [6], co może sprzyjać zapadaniu
się membrany do wnętrza ubytku i powodować ograniczenie obszaru regeneracji tkanki
kostnej. Tę wadę można korygować stosując proces sieciowania struktury kolagenu
(cross-linking) za pomocą promieniowania ultrafioletowego czy środków chemicznych
tj. aldechydu glutarowego lub związków pochodzenia naturalnego np. genipiny [13, 38,
39, 40]. Sieciowanie poprawia wytrzymałość oraz wydłuża czas resorpcji membrany
kolagenowej, nie zmieniając przy tym jej mikrostruktury. Oprócz wyżej wymienionych
wad istnieje również ryzyko, że pomimo ostrych wymagań dotyczących przetwarzania
i produkcji membran z materiałów pochodzenia naturalnego, nastąpi przeniesienia
chorób i patogenów pochodzenia zwierzęcego do organizmu ludzkiego. W niektórych
kręgach również względy światopoglądowe (ze względu na pochodzenie kolagenu)
mogą powodować ograniczenia w użyciu membran kolagenowych.
Z uwagi na wymienione ograniczenia membran pochodzenia naturalnego oczywistą
alternatywą wydają się być degradowalne materiały pochodzenia syntetycznego.
4.2.2.2. Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego
Większość syntetycznych membran stosowanych w GTR wytwarzana jest z polimerów
należących do grupy poliestrów alifatycznych takich jak: poliglikolid (PGA), polilaktyd
(PLA), poli(-kaprolakton) (PCL) czy ich kopolimery. Poliestry alifatyczne są obecnie
wykorzystywane w medycynie jako resorbowalne materiały implantacyjne w postaci
nici chirurgicznych, śrub czy płytek. Znalazły one również zastosowanie w farmacji
jako nośniki leków w systemach kontrolowanego ich uwalniania [19, 22, 33, 41, 42].
Podstawowymi zaletami syntetycznych poliestrów alifatycznych są biozgodność,
biodegradacja, brak zagrożeń jakie niesie za sobą wykorzystanie materiałów
pochodzenia odzwierzęcego oraz możliwość lepszej kontroli ich struktury
i właściwości mechanicznych. Dzięki lepszej powtarzalności procesu otrzymywania
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
23
materiałów możliwe jest również kontrolowanie czasu degradacji i ustalenie po jakim
czasie następuje znaczny spadek wytrzymałości, który zagrażałby zapadaniu się
materiału do wnętrza ubytku.
Pierwszą, obecnie niedostępną komercyjnie degradowalną membraną używaną w GTR
była membrana o nazwie handlowej Guidor® [17], która została wytworzona z PLA
i poddana działaniu acetylocytrynianutributylu, w celu nadania jej większej
elastyczności. Membrana ta składa się z dwóch warstw: warstwa zewnętrzna,
przeznaczona do kontaktu z dziąsłem, charakteryzuje się dużymi, prostokątnymi
porami, natomiast warstwa wewnętrzna, małymi okrągłymi porami które mają na celu
opóźnienie penetracji ubytku przez tkankę miękką, przy jednoczesnym umożliwieniu
przepływu substancji odżywczych. Między tymi dwiema warstwami znajdują się
również bariery tworzące szczeliny, aby umożliwić wzrost tkanki kostnej. Producenci
podają, że struktura membrany nie zmienia się przez pierwsze 6 tygodni, mimo
degradacji, a całkowita resorpcja materiału zachodzi po upływie roku [43]. Kolejnym
przykładem membrany z PLA jest Epi-Guide®, która posiada trójwarstwową budowę
i różni się porowatością w zależności od strony oraz utrzymuje swoje właściwości przez
5 miesięcy, a całkowitej resorpcji ulega po roku od implantacji [44, 45]. Innym
rodzajem membran, ale również z PLA jest membrana Atrisorb®. Jest to materiał
w postaci żelu składający się z poli(D,L-laktydu) zawieszonego w N-metylo-2-
pirolidonie. Grubość membrany wynosi 600-750 m, a jej czas degradacji wynosi 6-12
miesięcy [46, 47].
Jednym z kopolimerów, używanych do wytwarzania membran do GTR jest kopolimer
laktydu z glikolidem (PLGA). Duże zainteresowanie tym materiałem wynika z faktu, że
posiada on bardzo dobre właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne. Liczne badania
pokazują, że PLGA jest materiałem biozgodnym [22, 48, 49]. Co więcej, PLGA ulega
degradacji hydrolitycznej, której produktami są nietoksyczne związki naturalnie
występujące w organizmie (kwas mlekowy i glikolowy), które usuwane są z niego
w trakcie przemian metabolicznych (cykl Krebsa) [50]. Kolejną zaletą PLGA jest to, że
dzięki zmianom udziału laktydu i glikolidu możliwe jest sterowanie właściwościami
mechanicznymi oraz kinetyką degradacji [22, 42, 48, 49]. Obecnie na rynku
medycznym dostępne są dwie membrany produkowane z PLGA: Vicryl Periodontal
Mesh® oraz Resolut®. Pierwsza zbudowana jest z włókien poliglaktyny 910 (kopolimer
glikolidu z laktydem w stosunku 9:1). Membranę Vicryl® cechuje brak odpowiedzi
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
24
antygenowej oraz to, że utrzymuje swoje właściwości mechaniczne przez 3-4 tygodnie
po implantacji [51], aczkolwiek badania na zwierzętach pokazały słabą integrację
membrany z tkankami [44, 52]. Druga komercyjnie dostępna membrana z PLGA –
Resolut®, zbudowana jest z dwóch warstw, bardziej zbitej, która zapobiega wnikaniu
komórek nabłonka do wnętrza ubytku oraz porowatej sieci włókien PGA ułatwiających
integrację z tkankami. Badania biologiczne tych membran pokazały, że ich właściwości
są podobne do właściwości membran nieresorbowanych, a całkowita resorpcja
następuje po upływie 5 – 6 miesięcy [52, 53]. Innym rodzajem kopolimeru testowanego
pod kątem zastosowania w GTR jest kopolimer laktydu i -kaprolaktonu (PLCL).
Kopolimer PLCL charakteryzuje się krótszym czasem degradacji, w porównaniu do
membran z czystego laktydu, dobrą biozgodnością oraz zapewnia odpowiednie miejsce
i wsparcie dla regeneracji tkanki kostnej. Kopolimer PLCL występuje pod handlowa
nazwą Vivosorb® i jest używany jako implant to regeneracji nerwów, ale prowadzone
badania pokazują możliwość wykorzystania go również w sterowanej regeneracji
tkanek przyzębia [54, 55].
Istnieje wiele metod używanych do wytwarzania membran z polimerów syntetycznych.
Ze względu na wymagania jakie stawia się membranom do GTR obecnie wiele
ośrodków badawczych zajmuje się testowaniem elektrospiningu jako metody ich
otrzymywania. Metoda ta daje możliwość otrzymania włóknistych membran o dużym
rozwinięciu powierzchni i jest alternatywą dla tradycyjnych metod, w których uzyskuje
się materiał tkany za pomocą procesu przędzenia z roztworu [13, 56, 57].
Powszechnie używanymi metodami do otrzymywania membran polimerowych są
odlewanie z roztworu połączone z wypłukiwanie porogenu lub inwersja faz (separacja
faz) [13, 58, 59, 60, 61, 62, 63]. W pierwszej metodzie rozpuszczony polimer miesza się
z porogenem, którym najczęściej jest sól nieorganiczna lub inny polimer.
Po zhomogenizowaniu mieszaninę odlewa się na płaską powierzchnię i pozostawia do
odparowania rozpuszczalnika. Ostatnim etapem jest wypłukanie porogenu, dzięki
czemu uzyskuje się porowatą strukturę. W drugiej metodzie otrzymywania separacja
faz zachodzi w układzie polimer-rozpuszczalnik-czynnik strącający (np. temperatura)
i polega na wytrącaniu polimeru z homogenicznego roztworu. Metoda odlewania
z roztworu oraz separacja faz dają możliwość uzyskania niewłóknistej, porowatej
mikrostruktury i przez to lepszej jej kontroli, wynikającej z możliwości zmiany
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________
25
parametrów fizykochemicznych użytych substratów tj. rodzaju i masy cząsteczkowej
porogenu, składu roztworu polimeru, rodzaju rozpuszczalnika oraz stężenia roztworu.
Scharakteryzowane wyżej membrany do sterowanej regeneracji tkanek zarówno
syntetyczne jak i te naturalne posiadają asymetryczną, włóknistą budowę. Budowa taka
stanowi pewną wadę tych materiałów ponieważ, może ona utrudniać kontrolę nad ich
budową mikrostrukturalną (udziałem procentowym i wielkością porów) [5, 29, 30, 64].
Dlatego celowe wydaje się prowadzenie badań nad otrzymaniem membrany, która
będzie spełniać wszystkie najważniejsze wymagania stawiane membranom dla GTR,
ale jej budowa nie będzie włóknista.
W Tabeli 1 zestawiono najważniejsze cechy membran nieresorbowanych
i resorbowalnych, stosowanych w sterowanej regeneracji tkanek. Przedstawiono ich
nazwę handlową, skład oraz wymieniono najważniejsze właściwości fizykochemiczne.
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________
26
Tabela 1 Charakterystyka porównawcza dostępnych na rynku membran do sterowanej regeneracji tkanek – GTR [13, 17].
Membrana – nazwa handlowa Materiał Charakterystyka
membrany syntetyczne nieresorbowalne
Gore-Tex Membrane® Ekspandowany politetrafluoroetylen (e-PTFE)
długa praktyka kliniczna
dobre właściwości barierowe
budowa włóknista – węzły połączone siecią włókien
stosunkowo sztywny
Cytoplast® TXT-200 Politetrafluoroetylen w wysokiej gęstości
(d-PTFE)
łatwy do usunięcia
włóknista budowa; pory ~ 0,2 m
odporny na infekcje
Cytoplast®Ti-250 d-PTFE wzmocniony siatką tytanową większa sztywność niż Cytoplast® TXT-200
membrany naturalne resorbowalne
AlloDerm® Kolagen typu I z ludzkiej skóry czas degradacji ~ 16 tyg [65], wytrzymałość 9,4 – 21,5 MPa [66]
BioGide® Kolagen typu I i III ze świńskiej skóry
dobre właściwości barierowe
długa praktyka kliniczna
włóknista, asymetryczna budowa
czas degradacji 24 tyg [67], wytrzymałość 7,75 MPa
BioMend Extend® Kolagen typu I ze ścięgna wołowego czas degradacji 18 tyg [69], wytrzymałość 3,5 – 22,5 MPa
Cytoplast® RTM Kolagen typu I ze ścięgna wołowego czas degradacji 26-38 tyg
I CZĘŚĆ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________
27
cd. Tabela 1
Membrana – nazwa handlowa Materiał Charakterystyka
membrany syntetyczne resorbowalne
Guidor® Poli-D,L-laktyd/Poli-L-laktyd
+ acetylocytryniantributylu
wycofana rynku
warstwowa budowa, pory większe na zewnątrz, mniejsze w środku
Epi-Guide® Poli-D,L-laktyd budowa trójwarstwowa
czas resorpcji 6-12 miesięcy
Atrisorb® Poli-D,L-laktyd z N-metylo-2-pirolidoem możliwość dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku
czas degradacji 6-12 miesięcy [68]
Vicryl® Poliglaktyna 910
Poliglikolid/poliaktyd (w stosunku 9:1)
membrana tkana
miękka
możliwość dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku
czas degradacji: początek 4-12 tyg, całkowity ~ 9 miesięcy [69]
Resolut LT® Poli-D,L-laktyd-co-glikolid
dobra integracja z tkankami
dobre właściwości barierowe
czas degradacji: początek 10 tyg, całkowity 5-6 miesięcy [53], wytrzymałość 11,7 MPa [29]
Vivosorb® Poli(D,L-laktyd--kaprolakton) (PLCL) właściwości mechaniczne utrzymujące się do 8 tyg.
właściwości antyadhezyjne
________________________________
4.2.3. Membrany gradientowe
Badania nad opracowaniem
spełniałyby wszystkie założenia stawiane materiałom
opracowania membran o budowie gradientowej. Taka me
z opisanymi powyżej dostę
właściwości mechaniczne i biologiczne. Obecnie wiele ośrodków badawczych prowadzi
badania nad gradientowymi materiałami funkcjonalnymi (FGM
materials). Zgodnie z najnowszymi doniesieniami materiał
komponent nieorganiczny
bioaktywne oraz komponent organiczny
Komponenty te w pewnyc
a w innych tworzą kompozyt. (Rys. 10).
takie składniki jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki
wspomagające procesy leczenia
nowe możliwości zarówno jeśli chodzi o procesy ot
i łączenia elementów nieorganicznych
(czas degradacji, biozgodność
regeneracji tkanek przyzębia.
Rys. 10 Schemat przedstawiający
Przykładem membrany FGM
glikolidu, -kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty
albo membrana z PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badani
że materiały te mogą stymulować różne procesy biologiczne
wpłynąć korzystnie na syntezę
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
Membrany gradientowe
pracowaniem coraz to doskonalszych rozwiązań
ie założenia stawiane materiałom do techniki GTR doprowadziły do
membran o budowie gradientowej. Taka membrana powinna, w porównaniu
dostępnymi obecnie rozwiązaniami, posiadać jeszcze lepsze
właściwości mechaniczne i biologiczne. Obecnie wiele ośrodków badawczych prowadzi
badania nad gradientowymi materiałami funkcjonalnymi (FGM, ang. functional gradient
Zgodnie z najnowszymi doniesieniami materiał taki powinien zawierać
komponent nieorganiczny np. hydroksyapatyt, fosforan triwapniowy
bioaktywne oraz komponent organiczny, czyli naturalny bądź syntetyczny polimer
pewnych obszarach materiału występują jako niezależne
tworzą kompozyt. (Rys. 10). Oprócz tego materiał może zawierać dodatkowo
jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki
wspomagające procesy leczenia [13]. Dzięki takiej konstrukcji membrany
nowe możliwości zarówno jeśli chodzi o procesy otrzymywania, ułożenia warstw jak
elementów nieorganicznych z organicznymi, tak aby zapewnić optymalne
zgodność, osteokonduktywność czy osteoinduktywność) do pełnej
regeneracji tkanek przyzębia.
Schemat przedstawiający ideę gradientowego materiału funkcjonalnego (FGM).
Przykładem membrany FGM może być membrana składająca się z kopolimeru L
kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty
PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badani
stymulować różne procesy biologiczne, tj. aktywności osteoblastów czy
wpłynąć korzystnie na syntezę kolagenu [71, 72].
I CZĘŚĆ LITERATUROWA__________________________________________
28
materiałowych, które
do techniki GTR doprowadziły do
mbrana powinna, w porównaniu
, posiadać jeszcze lepsze
właściwości mechaniczne i biologiczne. Obecnie wiele ośrodków badawczych prowadzi
ang. functional gradient
taki powinien zawierać
wapniowy -TCP lub szkło
syntetyczny polimer [17].
materiału występują jako niezależne elementy,
Oprócz tego materiał może zawierać dodatkowo
jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki
]. Dzięki takiej konstrukcji membrany, stworzone zostały
rzymywania, ułożenia warstw jak
, tak aby zapewnić optymalne warunki
tywność czy osteoinduktywność) do pełnej
radientowego materiału funkcjonalnego (FGM).
może być membrana składająca się z kopolimeru L-laktydu,
kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty -TCP [70]
PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badania in vivo pokazały,
aktywności osteoblastów czy
________________________________
Innym rozwiązaniem może być membran
Zaproponowana przez ten zespół badawczy membrana posia
(CL) oraz dwie zewnętrzne, funkcjonalne, warstwy
(Rys. 11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została
wzbogacona o nano-hydroksyapatyt
nowej tkanki kostnej. Druga warstwa zewnętrzna, przeznaczona do kontaktu z nabłonkiem
została sfunkcjonalizowana poprzez dodatek
przeciwbakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu za
przez drobnoustroje.
Rys. 11 Schemat membrany FGM [64].
Materiały FGM wydają s
różnych materiałów otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak
i biologicznym. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie
jak większość membran do GTR dostępnych na rynku posiadają
uznać za ich wadę, gdyż trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów
oraz ich wielkość (pkt. 4.2.2.2.)
I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________
może być membrana FGM zaproponowana przez Bottino i in. [
Zaproponowana przez ten zespół badawczy membrana posiada rdzeń zbudowany z PLCL
(CL) oraz dwie zewnętrzne, funkcjonalne, warstwy oparte na żelatynie
11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została
hydroksyapatyt, co miało na celu przyspieszenie
nowej tkanki kostnej. Druga warstwa zewnętrzna, przeznaczona do kontaktu z nabłonkiem
unkcjonalizowana poprzez dodatek metronidazolu, leku o działaniu
bakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu za
Schemat membrany FGM [64].
Materiały FGM wydają się być obiecującym rozwiązaniem, gdyż
otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak
. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie
jak większość membran do GTR dostępnych na rynku posiadają budowę
trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów
(pkt. 4.2.2.2.).
I CZĘŚĆ LITERATUROWA__________________________________________
29
FGM zaproponowana przez Bottino i in. [17, 73].
da rdzeń zbudowany z PLCL
żelatynie, PLCL i PLA (SL)
11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została
przyspieszenie procesu formowania
nowej tkanki kostnej. Druga warstwa zewnętrzna, przeznaczona do kontaktu z nabłonkiem
metronidazolu, leku o działaniu
bakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu zasiedleniu membrany
gdyż możliwości łączenia
otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak
. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie
budowę włóknistą, co może
trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów
I CZĘŚĆ LITERATUROWA __________________________________________________________________________
30
Podsumowując, w części literaturowej pracy omówiono zagadnienia dotyczące
zarówno samych chorób przyzębia, przyczyn ich występowania jak i obecnie stosowanych
sposobów leczenia. Jak wskazują doniesienia literaturowe najbardziej obiecującym sposobem
leczenia, szczególnie w bardziej zaawansowanych stadiach choroby, a dającym możliwość
pełnej regeneracji utraconych tkanek przyzębia jest metoda regeneracyjna opierająca się na
technice sterowanej regeneracji tkanek (GTR). Wykorzystywane w tej metodzie materiały,
w postaci membrany, powinny spełniać funkcję bariery między odtwarzającą się tkanką
kostną, a niepożądaną w miejscu ubytku tkanką łączną i nabłonkową. Ważne jest aby ich
właściwości zarówno fizyczne, chemiczne jak i biologiczne można było dostosować w taki
sposób aby zapewnić możliwie jak najlepsze warunki dla regenerującej się tkanki kostnej.
Obecnie na rynku medycznym dostępne są membrany, które umożliwiają zajście procesu
regeneracji tkanek przyzębia. Jednakże z uwagi na to, że materiały te nie są pozbawione wad,
w wielu ośrodkach badawczych prowadzone są badania nad otrzymaniem nowych materiałów
do GTR. Badania skupiają się przede wszystkim na materiałach degradowalnych, ponieważ
eliminuje to jedną z podstawowych wad materiałów biostabilnych, a mianowicie potrzebą
powtórnej operacji w celu usunięcia materiału po spełnieniu jego funkcji. Proponowane
modyfikacje dotyczą zarówno samych materiałów, tj. wykorzystania kopolimerów np. PLCL,
które używane są w innych obszarach medycyny jak i zmian w obrębie dodatków do
używanych już materiałów, w celu polepszenia ich właściwości.
W niniejszej rozprawie przedstawiono odmienne podejście w stosunku do materiałów
dostępnych na rynku, gdyż wprowadzone modyfikacje nie dotyczyły samego surowca
polimerowego czy wypełniaczy, a miały na celu lepsze kontrolowanie mikrostruktury
materiału membranowego. Większość dostępnych membran do GTR, na co wcześniej
zwracano uwagę, ma włóknistą budową, która utrudnia kontrolę parametrów
mikrostrukturalnych takich jak wielkość porów czy ich udział objętościowy. Cechy te mają
wpływ zarówno na właściwości mechaniczne, czas degradacji jak i integrację materiału
z otaczającą je tkanką kostną, a możliwość ich kontroli pozwoliłaby na dostosowywanie cech
materiału do konkretnego zapotrzebowania. Dlatego w tej pracy skupiono się na otrzymaniu
materiału spełniającego wymagania stawiane materiałom do GTR, ale posiadającego
odmienną, niewłóknistą budowę. Cel i teza pracy zostały omówione szczegółowo w części II,
a wyniki przeprowadzonych badań wraz z dokładniejszym opisem metody otrzymywania
i mechanizmu formowania się membrany oraz badań biologicznych przedstawiono w części
III – badawczej.
II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________
31
II TEZA I CEL PRACY
Celem rozprawy jest opracowanie nowego typu materiałów membranowych
z kopolimeru L-laktydu i glikolidu (PLGA), przeznaczonych do leczenia ubytków tkanki
kostnej w chirurgii stomatologicznej i periodontologii zgodnie z metodą sterowanej
regeneracji tkanek (GTR). Postawiony cel będzie realizowany poprzez realizację
następujących zadań cząstkowych:
1. Opracowanie metody otrzymywania membran z wykorzystaniem zjawiska separacji faz,
które zachodzi między polimerem matrycowym PLGA i porogenem poli(glikolem
etylenowym) – PEG.
2. Określenie mechanizmu formowania membran, który umożliwi kontrolowanie
mikrostruktury otrzymywanych materiałów.
3. Dobór odpowiedniego stężenia porogenu PEG, nadającego membranie maksymalną
porowatość przy zachowaniu homogeniczności i odpowiednich parametrów
mechanicznych.
4. Sprawdzenie wpływu masy cząsteczkowej użytego porogenu PEG na mikrostrukturę
membran.
5. Określenie mechanizmu degradacji i zbadanie czasu oraz kinetyki degradacji materiałów
w postaci membran.
6. Przeprowadzenie badań potencjalnej cytotoksyczności wytworzonych membran
w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63.
7. Przeprowadzenie badań in vitro w kontakcie z komórkami interesującymi z punktu
widzenia GTR – ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami
macierzystymi.
8. Przeprowadzenie badań w kokulturach komórkowych: fibroblasty i ludzkie
mezenchymalne komórki macierzyste.
W pracy postawiono tezę, że możliwe jest otrzymanie nowego rodzaju niewłóknistej,
resorbowalnej membrany przeznaczonej do GTR, posiadającej asymetryczną, porowatą
budowę, a dzięki znajomości mechanizmu separacji faz i formowania membrany, w czasie
procesu otrzymywania, możliwa będzie kontrola mikrostruktury otrzymanych materiałów,
II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________
32
która w dalszej kolejność pozwoli na dobór optymalnych warunków hodowli komórkowych,
zapewniających możliwość odbudowy tkanki kostnej w miejscu ubytku.
Przeprowadzone badania z wykorzystaniem różnych stężeń porogenu pozwolą na
dobranie takiego stężenia, które zapewni najwyższą porowatość, przy jednoczesnym
zachowaniu ciągłości (homogeniczności) materiału oraz będą stanowić podstawę do dalszych
badań nad określeniem wpływu zmian masy cząsteczkowej porogenu na mikrostrukturę
membran. Testowanie różnych mas cząsteczkowych porogenu daje możliwość dostosowania
parametrów budowy mikrostrukturalnej, tj. wielkości, kształtu porów, ich rozkładu
w objętości (asymetryczność) membrany, do założeń stawianych materiałom do GTR.
Przeprowadzone badania pozwolą również na scharakteryzowanie właściwości
mechanicznych opracowanych membran, tj. wytrzymałość na rozciąganie, moduł Younga czy
wydłużenia materiału oraz właściwości powierzchni, np. kąta zwilżania, topografii
i chropowatości powierzchni. Ocena materiału, pod kątem zachowania w środowisku
organizmu żywego, zostanie przeprowadzona zarówno w czasie badań degradacji
w środowisku wodnym jak i badań w kontakcie z komórkami in vitro. W czasie degradacji
oceniane będą zmiany masy, pH płynu inkubacyjnego, ale również właściwości mechaniczne
i chemiczne membran. Dzięki tak zaplanowanym badaniom określony zostanie czas
degradacji PLGA przetworzonego w postać membran, a także zostanie zaproponowany
mechanizm ich degradacji.
Badania biologiczne in vitro zostały podzielone na trzy etapy. W pierwszym etapie
oceniana będzie potencjalna cytotoksyczność otrzymanych membran w kontakcie
z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63. W kolejnych etapach zostaną wykorzystane
komórki interesujące z punktu widzenia leczenia chorób przyzębia metodą GTR – ludzkie
fibroblasty i ludzkie mezenechymalne komórki macierzyste. Najpierw określony zostanie
wpływ porowatości membran na zachowanie komórek, co pozwoli na zoptymalizowanie
warunków hodowli komórek kostnych i fibroblastów. Ponieważ w organizmie ludzkim oba
typy komórek, w tym samym czasie będą miały kontakt z membraną, w ostatnim etapie
zaplanowano badania komórkowe w kokulturze, aby możliwe najlepiej odwzorować warunki
w jakich znajdzie się otrzymana membrana w czasie praktyki klinicznej.
Tak zaplanowane badania umożliwią zarówno otrzymanie materiału jak i jego
kompleksowe scharakteryzowanie oraz dostosowanie do wymogów jakie stawiane są
materiałom dla sterowanej regeneracji tkanek w periodontologii i chirurgii szczękowo-
twarzowej.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
III CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
1. MATERIAŁY I METODY
1.1. Charakterystyka materiału matrycowego
Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer
i glikolidu poli(L-laktyd-
laktydowych do glikolowych
a gęstość 1,24 g/cm3. PLGA użyty do badań został otrzymany
polimeryzacji z otwarciem pierścien
acetyloacetonianu cyrkonu Zr(acan)
Rys. 12.
1.2. Charakterystyka porogenu
Jako środek porotwórczy (
Aldrich) o różnych masach cząsteczkowych.
różnymi właściwościami, tj.
topnienia: PEG 300 (Mn = 300
Da, = 1,128 g/cm3, Tm = 4 ÷ 8ºC), PEG 600 (M
25ºC), PEG 1000 (Mn = 1000
= 1,204 g/cm3, Tm = 54 ÷ 58ºC).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
ATERIAŁY I METODY
Charakterystyka materiału matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu) (PLGA)
Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer
-co-glikolid) (PLGA), w którym stosunek molowy
laktydowych do glikolowych wynosi 85:15. Masa molowa polimeru wynosi
. PLGA użyty do badań został otrzymany
polimeryzacji z otwarciem pierścienia, z użyciem inicjatora niskotoksycznego
acetyloacetonianu cyrkonu Zr(acan)4 [74]. Wzór półstrukturalny PLGA przedstawiono na
Rys. 12 Wzór półstrukturalny PLGA.
Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG)
środek porotwórczy (porogen) zastosowano poli(glikol
) o różnych masach cząsteczkowych. Zastosowane rodzaje PEG charakteryzują się
tj. różnymi wartościami masy cząsteczkowej, gęstości, temperatury
= 300 Da, = 1,125 g/cm3, Tm = -15 ÷ - 8ºC), PEG 400 (M
= 4 ÷ 8ºC), PEG 600 (Mn = 600 Da, = 1,128 g/cm
= 1000 Da, = 1,101 g/cm3, Tm = 39ºC) i PEG 3400 (M
= 54 ÷ 58ºC). Wzór półstrukturalny PEG przedstawiono na Rys. 13
Rys. 13 Wzór półstrukturalny PEG.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
33
glikolidu) (PLGA)
Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer L-laktydu
stosunek molowy jednostek
Masa molowa polimeru wynosiła Mn = 100 kDa,
. PLGA użyty do badań został otrzymany w wyniku procesu
toksycznego związku -
alny PLGA przedstawiono na
glikol etylenowy) (PEG,
PEG charakteryzują się
różnymi wartościami masy cząsteczkowej, gęstości, temperatury
8ºC), PEG 400 (Mn = 400
= 1,128 g/cm3, Tm = 20 ÷
i PEG 3400 (Mn = 3400 Da,
lny PEG przedstawiono na Rys. 13.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1.3. Otrzymywanie membran
Membrany zostały wykonane metodą odlewania
W pierwszym etapie PLGA zos
(CH2Cl2, POCh, Gliwice) po 24 h
wagowym, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80%
roztwór został odlany na
odparowania rozpuszczalnika.
blendy polimerowe PLGA-
w próżni. Ostatnim etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.
W tym celu blendy zostały
Elga, UK) i pozostawały w niej przez okres 3
wielokrotnie wymieniana (~ 40 razy)
na Rys. 14, a szczegółowy opis zosta
porównawczy odlano również czyste folie z PLGA.
Rys.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Otrzymywanie membran
Membrany zostały wykonane metodą odlewania z roztworu i wypłukiwania porogenu.
W pierwszym etapie PLGA został rozpuszczony w 10% roztworze chlorku metylenu
po 24 h do roztworu został dodany PEG (w odpowiednim stężeniu
20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80%). Po homogenizacji (około 30 min)
na szklaną szalkę Petriego i pozostawiony, aż do momentu
nika. Odparowanie rozpuszczalnika było prowadzone dwuetapowo,
-PEG były suszone przez 24 h w powietrzu i następnie przez 24 h
etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.
y zostały zanurzone w wodzie o ultra wysokiej czystości
wały w niej przez okres 3 dni; w czasie procesu wypłukiwania
(~ 40 razy). Schemat otrzymywania membran z
, a szczegółowy opis został ujęty w zgłoszeniu patentowym [
odlano również czyste folie z PLGA.
Rys. 14 Schemat otrzymywania membran PLGA
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
34
z roztworu i wypłukiwania porogenu.
w 10% roztworze chlorku metylenu
do roztworu został dodany PEG (w odpowiednim stężeniu
Po homogenizacji (około 30 min)
szalkę Petriego i pozostawiony, aż do momentu
Odparowanie rozpuszczalnika było prowadzone dwuetapowo,
rzu i następnie przez 24 h
etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.
zanurzone w wodzie o ultra wysokiej czystości (UHQ, PureLab,
wypłukiwania woda była
Schemat otrzymywania membran został przedstawiony
ł ujęty w zgłoszeniu patentowym [75]. Jako materiał
PLGA.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
35
1.4. Charakterystyka membran
1.4.1. Grubość i udział objętościowy porów
Grubość membran była mierzona za pomocą śruby mikrometrycznej. Pomiar był
wykonywany w dziesięciu miejscach dla trzech różnych membranach tego samego typu.
Udział objętościowy porów, odpowiadający procentowi wypłukanego PEG, został
wyznaczony na podstawie zmierzonych różnic masy blendy i membrany przed i po procesie
wypłukiwania. Do obliczeń został wykorzystany wzór (1).
%wypł. PEG � 100% � ����
∙ 100% (1)
Gdzie : M0 – oznacza masę blendy przed procesem wypłukiwania, a MP – masę membrany po
procesie płukania. Obliczenia zostały przeprowadzone dla 10 membran.
Wyniki pomiaru grubości membran jak i udziału procentowego porów zostały przedstawione
jako średnie ± błąd standardowy.
1.4.2. Mikrostruktura
Do scharakteryzowania mikrostruktury membran został użyty skaningowy mikroskop
elektronowy (SEM, Nova NanoSEM, FEI, USA). Napięcie przyspieszające wiązkę
elektronów miało wartość 18 kV. Zdjęcia wykonano dla obydwu powierzchni membran
górnej, tj. tej która w trakcie procesu otrzymywania miała kontakt z powietrzem i dolnej, tj.
tej która w trakcie procesu otrzymywania miała kontakt ze szklaną powierzchnią szalki
Petriego. Analizie poddano również przełamy membran, które zostały wykonane po
umieszczaniu fragmentów membran w ciekłym azocie. Wykonano również zdjęcia czystej
folii PLGA. Przed analizą próbki zostały napylone ultracienką warstwą węgla, która
przeciwdziałała gromadzeniu się ładunków w trakcie obserwacji mikroskopowej. Zdjęcia
zostały wykonane przy powiększeniach 2000 i 5000 razy.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
36
1.4.3. Topografia powierzchni
Obraz topografii powierzchni został zarejestrowany przy użyciu mikroskopu sił atomowych
(Explorer, Veeco, USA) w trybie kontaktowym. Dzięki oprogramowaniu (SPMLab6.0.2
Explorer) możliwe również było wyznaczenie średniej chropowatość powierzchni Ra
(zgodnie ze wzorem 2), jak i wyznaczenie wielkość porów.
� �1� �| ���|��
��
�(2)
Gdzie: Ra oznacza średnią arytmetyczną odchyleń profilu od linii średniej, Ir – długość
odcinka elementarnego, Z(x) – funkcja określająca odchylenia od profilu.
Podobnie jak w przypadku badań SEM analizie poddane zostały obie powierzchnie
membrany (górna i dolna) oraz czysta folia PLGA. Dla każdej powierzchni zarejestrowano po
sześć obrazów dla obszaru skanowania 100 m x 100 m z szybkością skanowania 3 linie/s.
Wartości Ra i wielkości porów zostały przedstawione jako średnia ± błąd standardowy.
1.4.4. Zwilżalność powierzchni
Zwilżalność powierzchni została wyznaczona poprzez pomiar kąta zwilżania przy pomocy
goniometru (DSA10, Krüss, Niemcy) wyposażonego w system to analizy kształtu kropli.
Cieczą pomiarową była woda UHQ (PureLab, Elga, UK), a analizowane krople miały
objętość 0,2 l. Pomiary zostały wykonane dla górnej i dolnej powierzchni membrany jak
i dla czystej folii PLGA. Kąt zwilżania został uśredniony z pomiaru dziesięciu kropli dla
każdej serii pomiarowej i przedstawiony jako średnia ± błąd standardowy.
1.4.5. Właściwości chemiczne powierzchni
Badania za pomocą spektroskopii w podczerwieni zostały wykonane techniką całkowitego
wewnętrznego odbicia (FTIR-ATR), w zakresie środkowej podczerwieni (4000 ÷ 550 cm-1)
z rozdzielczością 4 cm-1 na urządzeniu Digilab FTS 60V, Bio-Rad przy wykorzystaniu
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
kryształu ZnSe. Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak
i czystych polimerach: PLGA i PEG.
1.4.6. Wytrzymałość mechaniczna
Membrany oraz czysta folia PLGA zostały po
wyznaczenia wytrzymałości mechanicznej na rozciąganie
maksymalnego oraz odkształcenia przy zerwaniu.
maszynę wytrzymałościową Zwick 1435 (Niemcy).
wartość obciążenia wstępnego 0,1
5 mm. Wykonano po sześć pró
średnią ± błąd standardowy.
1.5. Szybkość odparowania rozpuszczalnika
W celu wyjaśnienia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran
przeprowadzono badania
PLGA/PEG jak i z czystych polimerów: PLGA i PEG.
sposób, że rozpuszczone i zhomogenizowane roztwory (przygotowane tak samo jak
w przypadku odlewania blend) były odlewane
wadze elektronicznej (RADWAG WPX 250, Radom, Polska)
Rys. 15
Zmiany masy były rejestrowan
kolejne 60 minut. Szybkość suszenia została obliczona na postawie krzywych zależności
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak
i czystych polimerach: PLGA i PEG.
mechaniczna
Membrany oraz czysta folia PLGA zostały poddane jednoosiowemu rozciąganiu w celu
wyznaczenia wytrzymałości mechanicznej na rozciąganie, modułu Younga, odkształcenia
maksymalnego oraz odkształcenia przy zerwaniu. W badaniu tym wykorzystano uniwersalną
maszynę wytrzymałościową Zwick 1435 (Niemcy). Prędkość testu wynosiła 100
ość obciążenia wstępnego 0,1 N, odległość między szczękami 40 mm i s
5 mm. Wykonano po sześć prób dla każdego rodzaju materiału, a wyniki przedstawiono jako
błąd standardowy.
Szybkość odparowania rozpuszczalnika
nia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran
szybkości odparowywania rozpuszczalnika zarówno z blend
PLGA/PEG jak i z czystych polimerów: PLGA i PEG. Doświadczenie przeprowadzono w ten
sposób, że rozpuszczone i zhomogenizowane roztwory (przygotowane tak samo jak
odlewania blend) były odlewane na szklane szalki Petriego umieszczone na
(RADWAG WPX 250, Radom, Polska) (Rys. 15).
15 Schemat odparowywania rozpuszczalnika
Zmiany masy były rejestrowane co minutę przez 60 minut, a następnie co 5 minut przez
kolejne 60 minut. Szybkość suszenia została obliczona na postawie krzywych zależności
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
37
Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak
ddane jednoosiowemu rozciąganiu w celu
, modułu Younga, odkształcenia
W badaniu tym wykorzystano uniwersalną
Prędkość testu wynosiła 100 mm/min,
mm i szerokość próbki
b dla każdego rodzaju materiału, a wyniki przedstawiono jako
nia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran
szybkości odparowywania rozpuszczalnika zarówno z blend
Doświadczenie przeprowadzono w ten
sposób, że rozpuszczone i zhomogenizowane roztwory (przygotowane tak samo jak
szalki Petriego umieszczone na
).
Schemat odparowywania rozpuszczalnika.
co minutę przez 60 minut, a następnie co 5 minut przez
kolejne 60 minut. Szybkość suszenia została obliczona na postawie krzywych zależności
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
38
zmiany masy od czasu trwania procesu. Szybkości odparowania rozpuszczalnika wyliczono
dla trzech różnych zakresów czasu: I okres (2 ÷ 10 min), II okres (30 ÷ 50 min) i III okres
(100 ÷ 120 min) i wyrażono w jednostkach g/cm2·s, uwzględniając powierzchnię szalki
Petriego. W celu wyznaczenia masy pozostałego rozpuszczalnika próbki zostały powtórnie
zważone po upływie 24 h.
1.6. Badania degradacji
Materiały były przygotowane według metody opisanej w punkcie 1.3, a następnie
umieszczono je w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS: 137 mM NaCl, 6,64 mM
KH2PO4, 2,67 mM KCl, 8 mM Na2HPO4), aby określić ich podatność na degradację
hydrolityczną. Próbki oceniano po 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 20 i 24 tygodniach inkubacji.
Oceniano wartości: pH PBS, w którym inkubowano próbki (pH-meter CP-411, Elmetron,
Gliwice, Polska), a także zmiany masy (RADWAG WPX 250, Radom, Polska) i parametry
mechaniczne membran (Zwick 1235, Niemcy). Obserwowano także zmiany zachodzące na
powierzchni materiału poprzez badanie kąta zwilżania (DSA10, Krüss, Niemcy) oraz
topografii powierzchni (AFM, Explorer), jak również zmiany mikrostruktury (SEM, FEI).
Przed pomiarami próbki wyciągnięte z PBS zostały wypłukane w wodzie destylowanej
i wysuszone w temperaturze 37°C przez 24 h. Względną zmianę masy membran po inkubacji
wyznaczono ze wzoru (3):
∆m � �������
∙ 100%(3)
gdzie: mi oznacza wyjściową masę membran, a m0 masę membran po degradacji. Badaniu
degradacji poddane zostały zarówno membrany jak i folie PLGA.
1.7. Właściwości biologiczne
Badania biologiczne w warunkach in vitro były wykonywane w Laboratorium Badań
Biologicznych Katedry Biomateriałów Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki (AGH)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
jak również w Max Bergman Center for Biomaterials na
w Dreźnie (staż naukowy w
1.7.1. Badania na komórkach osteobl
Membrany zostały przygotowane według wcześniejszego opisu (
z nich okrągłe próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały
poddane działaniu 70% etanolu, wypłukane w PBS oraz poddane sterylizacji
promieniowaniem UV (każda
zamocowane w specjalnych insertach (
materiału, oraz umieszczone w 24
(Rys. 16).
Rys. 16 Schemat hodowli komórek
Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej)
PLGA i na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu
hodowli komórkowych (TCPS,
jako próby kontrolne. Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa
komórek/próbkę. Do badań wykorzystano o
z Europejskiego Banku Komórek
pozyskane z linii komórek raka kości (
hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO
hodowlanym DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%
antybiotyków (penicylina/streptomycyna) i 2 mM L
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Bergman Center for Biomaterials na Uniwersyte
(staż naukowy w ramach Programu LLP Erasmus).
na komórkach osteoblastopodobnych MG-63
przygotowane według wcześniejszego opisu (pkt. 1.3), a następnie wycięto
próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały
poddane działaniu 70% etanolu, wypłukane w PBS oraz poddane sterylizacji
em UV (każda strona membrany po 20 min). Sterylne próbki zostały
zamocowane w specjalnych insertach (Scaffdex, Finlandia), które zapobiegały wypływaniu
oraz umieszczone w 24-dołkowych płytkach hodowlanych
Schemat hodowli komórek MG-63 w insertach i dołkach
Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej)
na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu
hodowli komórkowych (TCPS, ang. tissue culture polystyrene), które zostały wykorzystane
Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa
Do badań wykorzystano osteoblastopodobne komórki MG
Komórek – European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK
pozyskane z linii komórek raka kości (kostniakomięsaka, osteosarc
hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO
DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%
antybiotyków (penicylina/streptomycyna) i 2 mM L-glutaminy (PAA, Austria)
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
39
Uniwersytecie Technicznym
pkt. 1.3), a następnie wycięto
próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały
poddane działaniu 70% etanolu, wypłukane w PBS oraz poddane sterylizacji
strona membrany po 20 min). Sterylne próbki zostały
Scaffdex, Finlandia), które zapobiegały wypływaniu
dołkowych płytkach hodowlanych (Nunclon, Dania)
w insertach i dołkach.
Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej) jak również na folii
na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu do
), które zostały wykorzystane
Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa 1,6·104
podobne komórki MG-63 (pochodzące
Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK)
kostniakomięsaka, osteosarcoma). Komórki były
hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO2, w medium
DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%
(PAA, Austria).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
40
1.7.1.1. Żywotność komórek
Żywotność komórek oznaczono za pomocą testu MTT. Metoda ta jest oparta na zdolności
enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcenia pomarańczowej rozpuszczalnej
soli tetrazolowej (MTT, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) do
fioletowego formazanu. Kolorymetryczne oznaczenie ilości barwnego formazanu jest
skorelowane z liczbą żywych komórek.
Do dołków hodowlanych, w których na badanych materiałach hodowane były komórki,
dodano roztwór MTT (5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Niemcy). Następnie płytki hodowlane
zostały ponownie umieszczone w inkubatorze na 4 h, po tym czasie dodano 100 l
sulfotlenku dimetylu (DMSO, Poch. Gliwice, Polska) do zastopowania reakcji. Kolejno płytki
zostały odwirowane (200 rpm przez 5 min), a roztwór przepipetowano do pojemniczków
Eppendorfa i jeszcze raz odwirowano przy prędkości 13000 rpm przez 2 min (MPW-351R,
Warszawa, Polska). Gęstość optyczną wyekstrahowanego, zabarwionego na kolor granatowo-
fioletowy roztworu, wyznaczono dla długości fali równej 540 nm w spektrofotometrze
Multiscan FC Microplate (Thermo Scientific, USA). Wyniki zostały przedstawione jako
średnia ± błąd standardowy.
1.7.1.2. Poziom tlenku azotu
Poziom tlenku azotu (NO) został wyznaczony za pomocą reakcji Griessa. Zastosowana
technika pomiarowa polega na oznaczeniu stężenie metabolitów NO (azotanów i azotynów),
w nadsączu (supernatancie) pobranym znad hodowli komórkowej. Zachodząca reakcja polega
na dwuazowaniu azotynu z sulfanilamidem (odczynnik Griessa A: 1% sulfanilamidu w 5%
kwasie ortofosforowym) i połączeniu z N-1-naftyloetylenodiaminą (odczynnik Griessa B:
0.1% dichlorowodorek naftylenodiaminy w wodzie destylowanej). W wyniku reakcji
powstaje barwny związek dwuazowy, którego natężenie barwy mierzy się
spektrofotometrycznie.
Do pobranego znad hodowli komórkowej 100 l nadsączu, dodano 100 l mieszaniny
odczynników Griessa (A+B, w stosunku 1:1). Następnie mieszaninę inkubowano przez 5 min,
po czym zmierzono absorbancję dla długości fali 540 nm za pomocą spektrofotometru
Multiscan FC Microplate. Wyniki zostały przedstawione jako średnia ± błąd standardowy.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1.7.1.3. Morfologia komórek
Do obserwacji morfologii komórek został wykorzystany optyczno
Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Nie
paraformaldehydu; tak przygotowane próbki były przechowywane
czasu badania. Przed obserwacją pod mikroskopem materiały zostały wypłukane w PBS,
a następnie wybarwione za pomocą oranżu akrydyny (
Aldrich, Polska) o stężeniu 1 mg/ml. Przy takim stężeniu oranż
monomer i posiada maksimum abso
cytoplazmę komórek na zielono
1.7.2. Badania z wykorzystaniem
i ludzkich fibroblastów
Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i
w poprzednim eksperymencie,
niskotemperaturową plazmą
poddano dwa rodzaje membran, a
podobnie jak w pierwszym eksperymencie
powierzchniach membran (górnej i dolnej).
(hMSC) zostały dostarczone przez Klinikę Uniwersytecką
z Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z
Dermatologii, Wenerologii i Alergologii,
w Lipsku. Schemat przedstawiający hodowle komó
Rys. 17 Schemat hodowli
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Morfologia komórek
Do obserwacji morfologii komórek został wykorzystany optyczno-fluorescencyjny mikroskop
Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy). Po 24 h hodowli komórki utrwalono
tak przygotowane próbki były przechowywane w temperaturze 4°C aż do
czasu badania. Przed obserwacją pod mikroskopem materiały zostały wypłukane w PBS,
a następnie wybarwione za pomocą oranżu akrydyny (3,6-dimetylaminoakrydyna
) o stężeniu 1 mg/ml. Przy takim stężeniu oranż akrydyny występuje jako
monomer i posiada maksimum absorpcji przy długości fali 494 nm
na zielono.
z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
i ludzkich fibroblastów
Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i
poprzednim eksperymencie, zamocowane w insertach. Całość został
niskotemperaturową plazmą nadtlenku wodoru (Sterrad, ASP, J&J, USA
wa rodzaje membran, a jako próbę kontrolną zastosowano TCPS. Komórki
podobnie jak w pierwszym eksperymencie in vitro (rozdz. 1.7.1), hodowane były na obydwu
powierzchniach membran (górnej i dolnej). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste
zostały dostarczone przez Klinikę Uniwersytecką
Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z
Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Max-Bürger-Forschungszentrum
przedstawiający hodowle komórkowe został pokazany na Rys. 17
chemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
41
fluorescencyjny mikroskop
komórki utrwalono przy użyciu 4%
w temperaturze 4°C aż do
czasu badania. Przed obserwacją pod mikroskopem materiały zostały wypłukane w PBS,
dimetylaminoakrydyna) (Sigma
akrydyny występuje jako
rpcji przy długości fali 494 nm barwiąc jądra oraz
malnych komórek macierzystych
Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i podobnie jak
zamocowane w insertach. Całość została poddana sterylizacji
(Sterrad, ASP, J&J, USA). Badaniom
jako próbę kontrolną zastosowano TCPS. Komórki,
hodowane były na obydwu
nchymalne komórki macierzyste
Carl Gustav Carus
Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z Kliniki
Forschungszentrum z Uniwersytetu
pokazany na Rys. 17.
w insertach i w dołkach.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
42
Hodowla komórek była prowadzona przez okres 24 h oraz 14 i 21 dni. Komórki znajdowały
się w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7,0% atmosferze CO2; początkowa gęstość
wysianych komórek wynosiła 1·104 komórek/cm2 (8000 komórek/membranę). Przez okresy
czasu 24 h, 14 i 21 dni wszystkie komórki znajdowały się w medium podstawowym
(BM - DMEM, 10% FBS, 1% P/S, 2 mM glutaminy) i dla okresów 14 i 21 dni fibroblasty
hMSC hodowane były również w medium różnicującym w kierunku osteoblastów (DM),
w skład którego obok medium BM wchodził jeszcze kwas askorbinowy 300 mM,
glicerofosforan 10 mM i deksametazon 10nM (Sigma-Aldrich, Niemcy). W czasie trwania
hodowli media były wymieniane co drugi dzień. Na koniec każdego okresu czasowego
medium było odciągane, membrany płukane w ogrzanym PBS, a następnie próbki zamrażane
w temperaturze -80°C aż to czasu wykonania analiz.
1.7.2.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek
W celu oznaczenia liczby komórek wykorzystano badanie poziomu stężenia dehydrogenazy
mleczanowej (LDH). LDH jest enzymem z klasy oksydoreduktaz, który jest uwalniany
z komórek do medium hodowlanego na skutek ich lizy (rozpadu). Podobnie jak test MTT, test
LDH jest testem kolorymetrycznym, w którym zachodzi przemiana soli tetrazolowej do
barwnego formazanu. Badanie polega na spektrofotometrycznym pomiarze ilości LDH
uwolnionego z martwych komórek poprzez pomiar reakcji enzymatycznej konwersji wyżej
wymienionych związków. Zamrożone wcześniej komórki rozmrażano przez 20 min na lodzie,
następnie przeprowadzono lizę komórek w PBS zawierającym 1% Triton X-100, proces trwał
50 min, z tym, że ostatnie 10 min było przeprowadzone w płuczce ultradźwiękowej, w celu
rozbicia agregatów. Kolejno przeniesiono lizaty do 96-dołkowych płytek i dodano roztwór
reakcyjny LDH (LDH Cytotoxicity Detection Kit - Takara, Saint-Germain-en-Laye,
Francja). Po 8 min reakcja była zatrzymana za pomocą 0,5 M HCl. Procedura była zgodna
z instrukcją podaną przez producenta. Absorbancja była mierzona przy długości fali równej
492 nm. Wyznaczono również krzywą kalibracyjną, na podstawie, której przeliczono
otrzymane wyniki na liczbę komórek.
Różnicowanie komórek mezenchemalnych zostało zmierzone poprzez pomiar aktywności
fosfatazy alkalicznej (ALP), enzymu z grupy hydrolaz, którego stężenie wzrasta wraz ze
wzrostem aktywności osteoblastów. Rozmrażanie komórek oraz ich liza przeprowadzone były
tak samo jak w przypadku pomiaru LDH. Lizaty zostały przepipetowane do pojemniczków
Eppendorfa, do których następnie dodano roztwór reakcyjny ALP (1mg/ml p-nitrofenylu,
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
43
0,1M dietanolu-aminy, 0,1% Triton X-100, 1 mM MgCl2·6H2O, pH ~ 9,8), całość była
inkubowana przez 30 min w 37°C. Reakcja została zatrzymana za pomocą 1 M NaOH.
Po inkubacji próbki zostały odwirowane (10 min, 14000 rpm), nadsącz przepipetowany do
płytki 96-dołkowej i zmierzono absorbancję dla długości fali 405 nm. Mineralizacja została
zbadana poprzez pomiar koncentracji jonów wapnia Ca2+, w próbkach przygotowanych w
sposób powyżej opisany. Do badania użyto gotowych zestawów odczynników (Calcium
Liquicolor Kit - Fluitest Ca-CPC, Biocon, Germany). Absorbancja została zmierzona po
5 min inkubacji w temperaturze pokojowej przy długości fali 590 nm.
1.7.2.2. Morfologia komórek
Po inkubacji próbki zostały utrwalone w 3,7% paraformaldehydzie i umieszczone
w temperaturze 4°C. Morfologia komórek po 1 i 7 dniach była analizowana przy użyciu SEM
(Gemini DSM 982, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) przy powiększeniu 500 razy. Przed
analizą próbki zostały przepłukane w PBS, a następnie poddane procesowi dehydratacji
w szeregu alkoholowym: 30%, 50%, 70%, 80%, 90% i 100% etanolu, oraz suszeniu
w punkcie krytycznym dwutlenku węgla (Critical Point Dryer - BALTEC CPD 030, Witten,
Germany). Ostatnim etapem przygotowań było napylenie na próbki ultracienkiej warstwy
węgla.
1.7.3. Badania w kokulturach komórkowych
Ostatnim etapem badań komórkowych było przeprowadzenie hodowli w warunkach
kokultury komórkowej, z wykorzystaniem obu typów komórek. Fibroblasty i hMSC były
hodowane w jednym dołku hodowlanym, w taki sposób, że jedne komórki były hodowane na
membranie, a drugie na powierzchni płytki hodowlanej (Rys. 18). Do hodowli wykorzystano
tylko jedną powierzchnię membrany (górną), a dla kontroli komórki były hodowane na płytce
hodowlanej TCPS, w separowanych warunkach (osobno fibroblasty i osobno hMSC).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 18 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach
Warunki prowadzenia hodowli były takie same jak podane w pkt. 1.7.2. Komórki były
inkubowane w temperaturze
i DM). Gęstość początkowa komórek była równa
komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 7, 14, 21, i 28 dni.
1.7.3.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek
Liczba komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone
osobno dla komórek znajdujących się na membranach jak i płytce hodowlanej. W podobny
sposób sprawdzono różnicowanie komórek oraz ich mineralizację, wykonując odpowiednio
pomiar aktywności ALP oraz stężenia
1.7.3.2. Morfologia
Obserwacja morfologii komórek była prowadzona po
Axiovert 100M, Carl Zeiss, Germany)
Utrwalone komórki (dokładny opis w pkt. 1.7.2.2.)
2 min, następnie przepłukano w PBS i poddano działan
w PBS. Po tym procesie przystąpiono do barwienia. Jądro komórkowe zostało wybarwione
przy użyciu DAPI (4,6-diamidyno
amina – reagującą z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko
Do wybarwienia struktur komórkowych i
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach
Warunki prowadzenia hodowli były takie same jak podane w pkt. 1.7.2. Komórki były
inkubowane w temperaturze 37°C przy 7,0% stężeniu CO2, w dwóch rodzajach medium (BM
i DM). Gęstość początkowa komórek była równa 1·104
komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 7, 14, 21, i 28 dni.
Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek
komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone
osobno dla komórek znajdujących się na membranach jak i płytce hodowlanej. W podobny
sposób sprawdzono różnicowanie komórek oraz ich mineralizację, wykonując odpowiednio
oraz stężenia jonów wapnia Ca+2 (pkt. 1.7.2.1).
Obserwacja morfologii komórek była prowadzona pod mikroskopem fluorescencyjnym
Axiovert 100M, Carl Zeiss, Germany), po uprzednim wybarwieniu struktur komórkowych.
(dokładny opis w pkt. 1.7.2.2.) inkubowano w 0,2% Triton X
rzepłukano w PBS i poddano działaniu 1% surowicy bydlę
w PBS. Po tym procesie przystąpiono do barwienia. Jądro komórkowe zostało wybarwione
diamidyno-2-fenyloindol). DAPI jest to aromatyczna, heterocykliczna
z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko
barwienia struktur komórkowych i białek cytoszkieletu, użyto osteonektyny
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
44
Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach w kokulturze.
Warunki prowadzenia hodowli były takie same jak podane w pkt. 1.7.2. Komórki były
, w dwóch rodzajach medium (BM
komórek/cm2 (8000
komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 7, 14, 21, i 28 dni.
komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone
osobno dla komórek znajdujących się na membranach jak i płytce hodowlanej. W podobny
sposób sprawdzono różnicowanie komórek oraz ich mineralizację, wykonując odpowiednio
(pkt. 1.7.2.1).
d mikroskopem fluorescencyjnym (Jena
po uprzednim wybarwieniu struktur komórkowych.
w 0,2% Triton X-100 przez
iu 1% surowicy bydlęcej (BSA)
w PBS. Po tym procesie przystąpiono do barwienia. Jądro komórkowe zostało wybarwione
). DAPI jest to aromatyczna, heterocykliczna
z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko-fioletowe.
użyto osteonektyny (Sigma
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Aldrich, Niemcy) w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne
Vimentin, PN IM191, Beckman Coulter, Francja) dla fibroblastów.
1.7.3.3. Hodowla komórek po obu stronach membrany
Przeprowadzono również wstępne badania, które w dokła
z jakimi mamy do czynienia w organizmie ludzkim.
ludzkiego komórki będą docierały do obu powierzchni
również próbę osadzenia komórek i ich hodowli w
warunki są najbardziej zbliżone do tych w jakich materiał będzie pracował w organizmie.
Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12
fibroblasty. Poziom medium był tak dobrany aby insert
jednocześnie aby medium
wyschnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę
inkubatorze na okres 4 h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umies
medium w płytce 24-dołk
hMSC. Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono
i scharakteryzowano w punkcie 1.7.2.
komórek/cm2 (8000 komórek/membranę).
tych okresach czasu żywe
wykonane na mikroskopie optycznym
Rys. 19 Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne
N IM191, Beckman Coulter, Francja) dla fibroblastów.
Hodowla komórek po obu stronach membrany
ż wstępne badania, które w dokładniejszy sposób symulują
z jakimi mamy do czynienia w organizmie ludzkim. Po wszczepieniu materiału do organizmu
docierały do obu powierzchni materiału, dlatego przeprowadzono
również próbę osadzenia komórek i ich hodowli w sposób przedstawiony na Rys.
warunki są najbardziej zbliżone do tych w jakich materiał będzie pracował w organizmie.
Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12
fibroblasty. Poziom medium był tak dobrany aby insert był stabilny i nie pływał,
e aby medium nie przesączyło się przez membranę, co spowodowało
schnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę
h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umies
dołkowej. Następnie na drugą stronę membrany wysiano komórki
Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono
w punkcie 1.7.2. Początkowa gęstość komórek wynosiła 1·10
000 komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 24
żywe komórki zostały wybarwione za pomocą MTT
wykonane na mikroskopie optycznym Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy)
Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
45
w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne IOPath®+
sposób symulują warunki
Po wszczepieniu materiału do organizmu
materiału, dlatego przeprowadzono
rzedstawiony na Rys. 19. Takie
warunki są najbardziej zbliżone do tych w jakich materiał będzie pracował w organizmie.
Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12-dołkowej, osadzono
stabilny i nie pływał, ale
przez membranę, co spowodowałoby
schnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę umieszczono w
h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umieszczone w świeżym
stronę membrany wysiano komórki
Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono
komórek wynosiła 1·104
prowadzona przez 24 h i 14 dni. Po
komórki zostały wybarwione za pomocą MTT, a ich zdjęcia
Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy).
Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
46
2. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
2.1. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od stężenia PEG
W tej części pracy skupiono się nad otrzymaniem membran charakteryzujących się
różną porowatością. Jako porogenu użyto PEG o masie cząsteczkowej Mn = 400 Da. Na tym
etapie pracy najważniejszym zadaniem było opracowanie metody otrzymywania membran jak
również uzyskanie i wyselekcjonowanie membrany, której właściwości będą najbardziej
odpowiadały wymaganiom stawianym materiałom do sterowanej regeneracji tkanek, tj.
asymetryczność budowy, parametry wytrzymałościowe czy poręczność chirurgiczna. Bardzo
ważnym zagadnieniem analizowanym na tym etapie było również poznanie mechanizmu
powstawania membran. Umożliwiło to dobranie optymalnych warunków prowadzenia
procesu, co w konsekwencji pozwoliło na kontrolowanie budowy mikrostrukturalnej
otrzymanych membran.
Metoda otrzymywania membran została opisana w pkt. 1.3
2.1.1. Morfologia membran
Używając różnych proporcji PLGA/PEG otrzymano membrany o różnej porowatości. Użyto
pięciu różnych stężeń wagowych PEG 400. Na Rys. 20 przedstawiono morfologię
otrzymanych materiałów.
Z Rys. 20 wynika, że możliwe jest otrzymanie membran o homogenicznej strukturze,
w przypadku kiedy koncentracja PEG nie przekracza 60% wagowych (Rys. 20 A – C).
W przypadku kiedy udział objętościowy PEG był większy 70% (Rys. 20 D) i 80% (wyniki
nie zostały zaprezentowane) otrzymane membrany wykazywały brak homogeniczności.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
47
Rys. 20 Morfologia membran otrzymanych z użyciem porogenu PEG 400 o stężeniu
wagowym A. 20% , B. 40%, C. 60% i D. 70%.
2.1.2. Mikrostruktura
Wyniki obserwacji mikrostruktury pokazują, że udział objętościowy porów w membranie,
zależy od stężenia PEG i jest najwyższy dla stężenia 60% (Rys. 21 G – I). Membrany
charakteryzują się mniejszą porowatością na górnej powierzchni niż na dolnej (Rys. 21 A – B,
D – E, G – H). W przypadku membran otrzymywanych z mniejszym udziałem PEG różnice
między górą, a dołem są mniejsze niż dla membran otrzymanych z większym udziałem PEG.
Można również zauważyć, że pory występują w całej objętości membran (Rys. 21 C, F, I, L),
a wielkość porów rośnie od górnej do dolnej powierzchni. Jest to szczególnie widoczne
w przypadku membran z wyższym stężeniu PEG tj. 60% i 80% (Rys. 21 I, L). Na
powierzchni membrany otrzymanej z 80% udziałem PEG widać sferyczne cząstki
wytrąconego PLGA (Rys. 21 J, K).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 21 Mikrofotografia SEM membran otrz
400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); p
G, J), powierzchnia dolna (B, E, H, K) i przełamy
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Mikrofotografia SEM membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym
400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); powierzchnia
ia dolna (B, E, H, K) i przełamy (C, F, L, L).
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
48
ymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG
owierzchnia górna (A, D,
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.1.3. Właściwości mechaniczne
Przykładowe krzywe zależności wytrzymałość
przedstawione na Rys. 22
w procesie otrzymywania membran, maleje wytrzymałość na rozciąganie, ale rośnie
odkształcenie membran.
Uśrednione wyniki badań właśc
zależność, że wytrzymałość na rozciąganie (R
moduł Younga (E) (Rys. 23
(Fmax) (Rys. 23 C; Tabela 2
który został użyty w procesie
wydłużenia w momencie zerwania (
jego wzrost wraz ze wzrostem stężenia PEG
Rys. 22 Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla
reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzyman
wagowym PEG.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Właściwości mechaniczne
Przykładowe krzywe zależności wytrzymałość-odkształcenie folii i membran PLGA
przedstawione na Rys. 22. Pokazują one, że wraz ze wzrostem stężenia
w procesie otrzymywania membran, maleje wytrzymałość na rozciąganie, ale rośnie
yniki badań właściwości mechanicznych potwierdzają
wytrzymałość na rozciąganie (Rm) (Rys. 23 A; Tabela 2,
(E) (Rys. 23 B; Tabela 2, kolumna 2) i wydłużenie przy maksymalnej sile
abela 2, kolumna 3) membran spadają wraz ze wzrostem stężenia
procesie ich otrzymywania. Natomiast w przypadku całkowitego
wydłużenia w momencie zerwania (Ftotal) (Rys. 23 D; Tabela 2, kolumna 4) obserwujemy
wraz ze wzrostem stężenia PEG.
Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla
reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzymanych przy różnym stężeniu
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
49
odkształcenie folii i membran PLGA zostały
że wraz ze wzrostem stężenia PEG użytego
w procesie otrzymywania membran, maleje wytrzymałość na rozciąganie, ale rośnie
iwości mechanicznych potwierdzają powyżej opisaną
kolumna 1), ale także
wydłużenie przy maksymalnej sile
ją wraz ze wzrostem stężenia PEG,
przypadku całkowitego
, kolumna 4) obserwujemy
Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla
ych przy różnym stężeniu
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 23 Właściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym
wagowym PEG: A. wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy
maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania.
Tabela 2 Właściwości mechaniczne foliotrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)
PLGA
mPLGA_20% PEG 400
mPLGA_40% PEG 400
mPLGA_60% PEG 400
Wytrzymałość (Rm), moduł Younga (E), maksymalne wydłużenie (
( Ftotal). Wyniki przedstawione
statystyczną, w stosunku do kontroli
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
łaściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym
wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy
maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania.
Właściwości mechaniczne folii PLGA oraz membran PLGA (mPLGAotrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)
Rm [MPa] E [GPa] Fmax [%]
52,1 ± 0,5 1,96 ± 0,14 3,49 ± 0,
mPLGA_20% PEG 400 30,2 ± 2,4*** 1,48 ± 0,15* 3,54 ± 0,
mPLGA_40% PEG 400 19,9 ± 1,9*** 1,10 ± 0,07*** 2,32 ± 0,
mPLGA_60% PEG 400 12,6 ± 0,9*** 0,53 ± 0,03*** 1,97 ± 0,
), moduł Younga (E), maksymalne wydłużenie ( Fmax ), wydłużenie przy zerwaniu
). Wyniki przedstawione jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki o
, w stosunku do kontroli – czystej folii PLGA: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
50
łaściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym stężeniu
wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy
PLGA oraz membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)
[%] Ftotal [%]
± 0,20 4,2 ± 0,3
± 0,21 9,1 ± 1,2**
± 0,15** 21,1 ± 6,1*
± 0,10*** 56,4 ± 5,0***
), wydłużenie przy zerwaniu
jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność
czystej folii PLGA: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
51
2.1.4. Dyskusja wyników
Otrzymane wyniki, zgodnie z oczekiwaniami pokazują, że wzrost ilości porogenu
PEG w blendzie PLGA/PEG zwiększa porowatość otrzymanych membran, jednakowoż jeśli
użyte stężenie przekracza 70% wagowych, otrzymane membrany są niehomogeniczne na
poziomie makroskopowym. Może to być spowodowane faktem, że faza PEG staje się fazą
ciągłą, a wydzielenia PEG przybierają duże rozmiary (Rys. 20 i Rys. 21 K).
Badania mechaniczne pokazują, że wytrzymałość, moduł Younga oraz odkształcenie
w dużej mierze zależą od stężenia PEG, użytego do otrzymania membran. Ze wzrostem
stężenia PEG obserwuje się wzrost całkowitego odkształcenia (Ftotal) (Rys. 22 i Rys. 23 D;
Tabela 2, kolumna 4), jednocześnie spada wytrzymałość (Rys. 22, Rys. 23 A; Tabela 2
kolumna 1) i moduł Younga (Rys. 23 E; Tabela 2, kolumna 2). Właściwości mechaniczne,
membran otrzymanych z 60% udziałem wagowym PEG, wydają się być najlepsze, biorąc pod
uwagę przyszłe zastosowanie materiałów w medycynie i regeneracji tkanek GTR. Membrany
te posiadają akceptowalną wytrzymałość, a jednocześnie są najmniej kruche i najbardziej
elastyczne ze wszystkich otrzymanych membran. Uzyskane wyniki badań właściwości
mechanicznych są podobne do odnotowanych w literaturze wyników dla membran GTR
stosowanych w medycynie [31, 59, 76, 77, 78, Tabela 1].
Obrazy mikrostruktury membran zostały pokazane na Rys. 21. Na przełamach widać,
że w przypadku 20% i 40% udziału PEG pory są homogenicznie rozłożone w całej objętości
materiału; dla większych stężeń PEG (60% – 80%) wielkość porów wykazuje większą
polidyspersję. Ta zależność może zostać wytłumaczona w następujący sposób: kiedy stężenia
PEG jest niskie, w wyniku spontanicznej separacji faz tworzy on małe, pojedyncze krople,
w ciągłej matrycy PLGA. Spontaniczna separacja faz jest wynikiem tego, że PLGA lepiej
rozpuszcza się w dichlorometanie niż PEG. Dichlorometan jest dobrym rozpuszczalnikiem
zarówno dla PLGA jaki i dla PEG, ale porównując współczynniki rozpuszczalności
Hildebranda dla PLGA ( = 21,7 MPa0,5) [77], CH2Cl2 ( = 20,2 MPa0,5) [77] i PEG 400
( = 23,1 MPa0,5) [77], można zauważyć, że wartości dla PLGA i CH2Cl2 są do siebie bardziej
zbliżone niż w przypadku PEG 400 i CH2Cl2. Kolejną przyczyną występowania spontanicznej
separacji faz w układzie PLGA/PEG może być różnica swobodnych energii
powierzchniowych obydwu polimerów, gdyż wiadome jest, że PEG jest związkiem dużo
bardziej polarnym niż PLGA. W momencie dodania PEG do roztworu PLGA w niepolarnym
rozpuszczalniku, jakim jest CH2Cl2, faza PEG spontanicznie oddziela się, tworząc kuliste
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
52
domeny w matrycy PLGA, gdyż pozwala to na zmniejszenia swobodnej energii
powierzchniowej układu PLGA/PEG. Podobne wyjaśnienia tego zjawiska opisano w procesie
separacji faz w układzie poli--kaprolakton/PEG [59].
Dla dużych stężeń PEG, powyżej 70%, faza PEG staje się fazą ciągłą, a PLGA tworzy
pojedyncze, izolowane wtrącenia, w wyniku czego, po procesie wypłukiwania PEG
otrzymane membrany stają się heterogeniczne. Pojedyncze, kuliste wtrącenia PLGA są
szczególnie widoczne na górnej powierzchni membrany (Rys. 21 K), co potwierdza powyższą
hipotezę.
Zdjęcia mikrostruktury pokazują również, że we wszystkich przypadkach membran
otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG 400, rozmiar porów rośnie od górnej do
dolnej powierzchni membrany. Powstałą zależność można wytłumaczyć niejednorodnym
odparowywaniem rozpuszczalnika z roztworu PLGA/PEG, jak również łączeniem się
obszarów bogatych w PEG i ich sedymentacji w procesie suszenia. Przeprowadzone badania
szybkości odparowywania rozpuszczalnika pokazały, że rozpuszczalnik (CH2Cl2) odparowuje
bardzo szybko z roztworu PLGA; po 120 min zanotowano najniższą masę próbki, która nie
ulegała już zmianom, niezależnie od długości czasu suszenia. W przypadku układu PEG
400/PLGA rozpuszczalnik odparowywał znacznie wolniej (Tabela 4, kolumna 4, paragraf
2.3.1). Badania wykazały, że różnice w szybkości odparowywania wpływają na budowę
membran. Na górnej powierzchni membran obserwuje się efekt tworzenia „skórki” z PLGA,
podczas gdy na dolnej powierzchni dochodzi do gromadzenia się wytrąceń PEG. Kiedy
stężenie PEG przekracza 60%, wytrącenia PEG wykazują tendencję do łączenia się,
w wyniku czego zmniejsza się ich liczba, ale rośnie rozmiar. Zaobserwowana zależność jest
zgodna z teorią Kamide’a, która mówi o wzroście cząstek w czasie tworzenia się membrany
[79]. Oprócz tego domeny bogate w PEG sedymentują, w wyniku czego dochodzi do ich
gromadzenia w pobliżu powierzchni szklanej szalki Petriego.
Na podstawie otrzymanych wyników został zaproponowany mechanizm obrazujący
procesy zachodzące w czasie otrzymywania membran, do których otrzymania użyto różnych
stężeń PEG (Rys. 24) [80]. W przypadku niewielkiego stężenia porogenu liczba domen PEG
jest niewielka, a domeny te są od siebie izolowane. Biorąc pod uwagę, że rozpuszczalnik
odparowuje szybciej z PLGA niż z PEG oraz szybciej z powierzchni blendy, domeny PEG
zostają „uwięzione” we wnętrzu blendy bez możliwości sedymentacji oraz łączenia się ze
sobą. Po procesie wypłukiwania otrzymane membrany mają pory rozłożone homogenicznie
w całej objętości membrany. Obserwacje ponadto wskazują, że wraz ze wzrostem stężenia
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
użytego porogenu rośnie liczba domen PEG, w
łączenia się ich ze sobą. W początkowym okresie suszenia cz
uwięziona przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania
rozpuszczalnika z matrycy. W niższych warstwach odparowywani
utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstają
wewnątrz struktura jest dłużej mobilna i domeny
Zależność ta jest widoczna w pr
40% i jeszcze bardziej zazna
Rys. 24 Schemat otrzymywania membran
Przedstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawar
PEG są homogeniczne w
i asymetryczne. Membrany te posiadają również odpowiednie
Z tego powodu do dalszych badań
właśnie takim stężeniu porogenu
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
użytego porogenu rośnie liczba domen PEG, w wyniku czego rośnie prawdopodobieństwo
ze sobą. W początkowym okresie suszenia część domen PEG
przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania
rozpuszczalnika z matrycy. W niższych warstwach odparowywanie
utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstają
struktura jest dłużej mobilna i domeny PEG mają możliwość sedymentacji.
Zależność ta jest widoczna w przypadku membran otrzymywanych przy
jeszcze bardziej zaznacza się dla wyższych stężeń PEG, tj. 60% i 80% (Rys. 24
Schemat otrzymywania membran PLGA o różnej morfologii w zależności od
stężenia PEG.
dstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawar
w skali makroskopowej, a jednocześnie najbardziej porowate
i asymetryczne. Membrany te posiadają również odpowiednie właściwości mechaniczne.
do dalszych badań postanowiono wykorzystać membrany otrzymane przy
porogenu PEG.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
53
czego rośnie prawdopodobieństwo
ęść domen PEG zostaje
przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania
e rozpuszczalnika jest
utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstająca
PEG mają możliwość sedymentacji.
zypadku membran otrzymywanych przy stężeniu porogenu
tj. 60% i 80% (Rys. 24).
PLGA o różnej morfologii w zależności od
dstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawartością
, a jednocześnie najbardziej porowate
właściwości mechaniczne.
postanowiono wykorzystać membrany otrzymane przy
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
54
2.2. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od masy
cząsteczkowej PEG
Kolejnym etapem pracy było sprawdzenie czy masa cząsteczkowa porogenu ma
wpływ na mikrostrukturę otrzymywanych membran. Badania zostały wykonane dla PEG
o pięciu różnych masach cząsteczkowych: 300 Da, 400 Da, 600 Da, 1000 Da i 3400 Da.
Charakterystyka porogenów znajduje się w punkcie 1.2.
2.2.1. Mikrostruktura
Oceny mikrostruktury dokonano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego
(SEM) i mikroskopu sił atomowych (AFM).
Mikrofotografie SEM pokazują, że otrzymane membrany posiadają asymetryczną budową,
a ich morfologia jak również wielkość porów są zależne od masy cząsteczkowej PEG
(Rys. 25). Na zdjęciach można zaobserwować, że porowatość na górnej stronie membrany
maleje wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG (Rys. 25 A, D, G, J, M). W przypadku
membrany PEG 600, PEG 1000 i PEG 3400 na górnej powierzchni występuje nieporowata
skórka (Rys. 25 G, J, M). Wielkości porów na dolnej powierzchni (Rys. 25 B, E, H, K, N) są
większe niż w przypadku górnej powierzchni. Oprócz tego porowatość na dolnej powierzchni
rośnie wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej porogenu. Kształt porów jest kulisty dla PEG
300 i zmienia się na nieregularny wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG. Przełamy
pokazują, że we wszystkich przypadkach pory znajdują się w całej objętości membrany,
można również zauważyć, że pory są połączone miedzy sobą. Widoczne jest również, że
rozmiar porów na przekroju membrany rośnie w kierunku od górnej do dolnej powierzchni
(Rys. 25 C, F, I, L, O). Membrana otrzymana z PEG 3400 posiada inną mikrostrukturę, jest
niehomogeniczna, pory są niewielkie i nieregularne. Na dolnej powierzchni membrany można
również zauważyć kuliste wytrącenia PLGA.
Obrazy membran uzyskane z AFM (Rys. 26) pokazują podobną mikrostrukturę do tej
zaobserwowanej za pomocą SEM (Rys. 25). Oprócz tego analiza obrazów za pomocą
oprogramowania, umożliwiła wyznaczenie średniej chropowatości powierzchni (Ra) oraz
średnicy porów. Pomiary zostały wykonane zarówno dla górnej jak i dolnej powierzchni,
a wyniki umieszczone w Tabeli 3. Uzyskane wyniki pokazują, że średnica porów
(Tabela 3, kolumna 1) dla membran otrzymanych z PEG 300 i PEG 400 wynosi ~ 3 m,
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
jednocześnie średnica porów na dolnej powierzchni rośnie od ~ 3
wzrostem masy cząsteczkowej PEG z 300
(Tabela 3, kolumna 2) obserwujemy spadek
powierzchni dla zakresu mas
zaobserwować, że chropowatość na dolnej stronie jest zawsze wyższa niż na stronie górnej
w obrębie jednej membrany. Membran
stronach oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do
pozostałych membran.
Rys. 25 Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej
masie cząsteczkowej: PEG 300 (A,
(J, K, L), PEG 3400 (M, N,
(B, E, H, K, N) i przełamy (C,
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
jednocześnie średnica porów na dolnej powierzchni rośnie od ~ 3 m do ~ 20
wzrostem masy cząsteczkowej PEG z 300 Da do 1000 Da. W przypadku
, kolumna 2) obserwujemy spadek Ra z wartości ~ 500 do ~ 180 nm dla górnej
zchni dla zakresu mas cząsteczkowych PEG od 300 Da do 1000 Da. Można również
zaobserwować, że chropowatość na dolnej stronie jest zawsze wyższa niż na stronie górnej
w obrębie jednej membrany. Membrana otrzymana z PEG 3400 była nie
oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do
Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej
masie cząsteczkowej: PEG 300 (A, B, C), PEG 400 (D, E, F), PEG 600 (G,
N, O); górna powierzchnia (A, D, G, J, M), dolna powierzchnia
N) i przełamy (C, F, I, L, O).
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
55
m do ~ 20 m wraz ze
do 1000 Da. W przypadku chropowatości
~ 500 do ~ 180 nm dla górnej
1000 Da. Można również
zaobserwować, że chropowatość na dolnej stronie jest zawsze wyższa niż na stronie górnej
a otrzymana z PEG 3400 była nieporowata po obu
oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do
Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej
F), PEG 600 (G, H, I), PEG 1000
M), dolna powierzchnia
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 26 Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300
(A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna
powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300
(A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna
powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J).
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
56
Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300
(A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
57
2.2.2. Grubość membran i procent wypłukania PEG
Wyniki pomiarów grubości oraz procentowej ilości wypłukanego PEG zaprezentowano
w Tabeli 3, kolumna 3 i 4. Grubość wszystkich membran, zgodnie z założeniem wynosiła
~ 50 m. Ilość wypłukanego PEG wynosiła ~ 59%, za wyjątkiem membran z PEG 3400
i PEG 400. Uzyskane wyniki pokazują, że zarówno grubość jak i procent wypłukiwania
porogenu jest podobny dla wszystkich membran.
Tabela 3 Grubość, procent wypłukania PEG, rozmiar porów i chropowatość membran PLGA
(mPLGA) otrzymanych z 60% udziałem porogenu o różnych masach cząsteczkowych
(średnia ± błąd standardowy)
Membrana średnica porów [µm] Ra [nm] grubość
[µm] wypłukanie PEG [%wt] góra dół góra dół
mPLGA_60% PEG 300 3,5 ± 0,3 3,7 ± 0,4 505 ±
18 733 ±
86 50 ± 1 59, 2 ± 0,2
mPLGA_60% PEG 400 2,6 ± 0,2 12,5 ± 1,9 391 ± 5
457 ± 29
52 ± 2 58,9 ± 0,4
mPLGA_60% PEG 600 nd 15,3 ± 2,8 236 ±
7 575 ± 4 51 ± 1 59,6 ± 0,5
mPLGA_60% PEG 1000 nd 21,1 ± 3,5 184 ± 4
1186 ± 38
50 ± 2 59,0 ± 0,2
mPLGA_60% PEG 3400 nd nd 304 ±
62 877 ± 255
49 ± 2 57,0 ± 0,2
nd – wartość niemierzalna
2.2.3. Wpływ odparowania rozpuszczalnika na mikrostrukturę membran
Badania szybkości odparowania rozpuszczalnika pokazały, że rozpuszczalnik odparowuje
najszybciej z PEG o najwyższej masie cząsteczkowej, tj. 3400 Da, a najwolniej z PEG 300
(Rys. 27 A). Na zdjęciach przedstawiających morfologię PEG na szalce po odparowaniu
rozpuszczalnika (Rys. 27 B) można zaobserwować, że w przypadku PEG o niższych masach
cząsteczkowych (300 Da ÷ 600 Da) polimer ten jest przeźroczysty jak również posiada
półpłynną konsystencję, w przeciwieństwie do PEG o wyższych masach cząsteczkowych
(1000 Da i 3400 Da), które tworzą błony o typowej krystalicznej budowie.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
W Tabeli 4 zaprezentowano wyniki
PLGA/PEG w trzech okresach czasowych oraz pozostałość rozp
upływie 24 h. W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża
i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim o
min) szybkość odparowania malej
różnice pomiędzy blendami. Najwolniej rozpuszczalnik odparowuje z blendy PLGA/PEG
300, a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wr
masy cząsteczkowej PEG, za wyjątkiem blendy PLGA/PEG 3400. Tendencja ta utrzymuje się
również dla ostatniego przedziału czasowego (100 ÷120 min)
mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 30
wzrostem masy cząsteczkowej PEG.
różnica masy blendy suszonej przez 120 min
300 i malała ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG.
Rys. 27 Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych
A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300
PEG 3400 ►, B. obraz makroskopowy
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
zaprezentowano wyniki szybkości odparowania rozpuszczal
PLGA/PEG w trzech okresach czasowych oraz pozostałość rozpuszczalnika w blendzie po
W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża
i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim o
min) szybkość odparowania maleje dla wszystkich blend, z tym że w okresie
różnice pomiędzy blendami. Najwolniej rozpuszczalnik odparowuje z blendy PLGA/PEG
a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wr
masy cząsteczkowej PEG, za wyjątkiem blendy PLGA/PEG 3400. Tendencja ta utrzymuje się
również dla ostatniego przedziału czasowego (100 ÷120 min), szybkość odparowywania jest
mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 30
wzrostem masy cząsteczkowej PEG. Pozostałość masy rozpuszczalnika, policzona jako
blendy suszonej przez 120 min i 24 h, była najwyższa dla blendy PLGA/PEG
ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG.
Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych
A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300 ■, PEG 400 ●, PEG 600
, B. obraz makroskopowy PEG na szalce po odparowaniu rozpuszc
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
58
szybkości odparowania rozpuszczalnika z blend
uszczalnika w blendzie po
W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża
i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim okresie (30 ÷ 50
okresie tym widoczne są
różnice pomiędzy blendami. Najwolniej rozpuszczalnik odparowuje z blendy PLGA/PEG
a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wraz ze wzrostem
masy cząsteczkowej PEG, za wyjątkiem blendy PLGA/PEG 3400. Tendencja ta utrzymuje się
, szybkość odparowywania jest
mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 300 i rośnie wraz ze
Pozostałość masy rozpuszczalnika, policzona jako
dla blendy PLGA/PEG
Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych
, PEG 600 ▲, PEG 1000 ▼,
PEG na szalce po odparowaniu rozpuszczalnika.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
59
Tabela 4 Szybkość odparowania rozpuszczalnika i pozostałość rozpuszczalnika w blendach
PLGA/PEG
Blenda �� ��� ∙ ��
pierwszy okres
�� ��� ∙ �� drugi okres
�� ��� ∙ �� trzeci okres pozostałość
rozpuszczalnika
2 ÷ 10 [min] 30 ÷ 50
[min]
100 ÷ 120
[min]
[mg]a
[%]b
bPLGA_60%PEG 300 9,9 · 10-5 4,8 · 10-7 0,17 · 10-7 55 0,75
bPLGA_60%PEG 400 9,7 · 10-5 6,1 · 10-7 0,31 · 10-7 24 0,32
bPLGA_60%PEG 600 9,5 · 10-5 7,2 · 10-7 0,58 · 10-7 22 0,29
bPLGA_60%PEG 1000 9,9 · 10-5 8,4 · 10-7 0,73 · 10-7 21 0,27
bPLGA_60%PEG 3400 9,8 · 10-5 7,1 · 10-7 0,73 · 10-7 21 0,27 a różnica masy blendy PLGA/PEG po suszeniu przez 120 min i 24 h b różnica mas po suszeniu przez 120 min i 24 h odniesiona do masy początkowej roztworu
PLGA/PEG
2.2.4.Badania FTIR-ATR
Na Rys. 28 przedstawiono widma FTIR-ATR PEG 300 i PEG 1000 oraz odpowiednich blend
i membran jak również czystej folii PLGA. Badania w podczerwieni przeprowadzono dla
wszystkich rodzajów PEG wykorzystanych w pracy, jednak poniżej zaprezentowano wyniki
dla dwóch PEG o skrajnych masach cząsteczkowych, tj. PEG 300 i PEG 1000 (za wyjątkiem
PEG 3400 ponieważ membrany otrzymywane z użyciem tego porogenu wykazują inne cechy
niż pozostałe membrany i były niejednorodne).
Na zaprezentowanych widmach można zauważyć, że widma PEG zawierają
charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (~ 3400
cm-1), drgań rozciągających (~ 2860 cm-1) i deformacyjnych (w zakresie 1450 ÷ 1240 cm-1)
grup –CH2, jak również drgania rozciągające grup C-O i C-O-C (w zakresie 1000 ÷ 1200
cm-1). Ponadto, w zakresie 840 ÷ 940 cm-1, można zauważyć pasma charakterystyczne dla
drgań zginających grup –CH2 [81]. Na widmach czystej folii PLGA i membran widoczne są
charakterystyczne pasma w 1746 cm-1 od drgań rozciągających grup C=O oraz grup –CH3,
gdzie obserwujemy drgania rozciągające (~ 2860 cm-1) i deformujące (w zakresie 1450 ÷
1240 cm-1), widoczne są również drgania rozciągające z grup C-O i C-O-C
(w zakresie 1000 ÷ 1200 cm-1) [82]. Podobnie jak w przypadku czystego PEG
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
w zakresie 840 ÷ 940 cm-1, można zauważyć pasm
pochodzących od węglowodorów z
zdecydowanie mniejsza niż ta obserwowana w przypadku PEG. Widma przedstawiające
blendy PLGA/PEG zawierają te same pasma, które są obserwowane dla czystego PEG oraz
próbek PLGA, co wskazuje na brak
Rys. 28 Widma FTIR-ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,
membran oraz folii PLGA.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
, można zauważyć pasma charakterystyczne dla drgań zginających
węglowodorów z grup –CH3 i –CH2, ale ich intensywność
zdecydowanie mniejsza niż ta obserwowana w przypadku PEG. Widma przedstawiające
blendy PLGA/PEG zawierają te same pasma, które są obserwowane dla czystego PEG oraz
próbek PLGA, co wskazuje na brak oddziaływania chemicznego pomiędzy PLGA i PEG.
ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
60
charakterystyczne dla drgań zginających
, ale ich intensywność jest
zdecydowanie mniejsza niż ta obserwowana w przypadku PEG. Widma przedstawiające
blendy PLGA/PEG zawierają te same pasma, które są obserwowane dla czystego PEG oraz
hemicznego pomiędzy PLGA i PEG.
ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
61
2.2.5. Dyskusja wyników
W punktach 2.2.1 – 2.2.4 przedstawiono wyniki badań dotyczących wpływu masy
cząsteczkowej porogenu PEG na mikrostrukturę otrzymanych membran. Badania te miały na
celu określenie oddziaływań pomiędzy PLGA, PEG i rozpuszczalnikiem, co pozwoliło na
zaproponowanie mechanizmu tworzenia się membran.
Przedstawione w Tabeli 3 wyniki pomiaru grubości membran pokazują, że grubość ta
jest zgodna z początkowymi założeniami i we wszystkich wypadkach wynosi około 50 m.
Również stopień wypłukania PEG we wszystkich membranach jest zbliżony do 60%, co
świadczy o całkowitym wypłukaniu porogenu z blend. Na podstawie badania FTIR również
możemy stwierdzić, że porogen uległ całkowitemu wypłukaniu ponieważ nie zaobserwowano
pasm charakterystycznych dla PEG w widmach membran. Można również zauważyć, że
widmo membrany jest podobne do widma czystej folii PLGA, co wskazuje, że nie występują
oddziaływania chemiczne pomiędzy PLGA a PEG.
Zaprezentowane w punkcie 2.2.1 i 2.2.2 wyniki dowodzą, że membrany otrzymane
z PEG o różnej masie cząsteczkowej (300 Da ÷ 1000 Da) posiadają asymetryczną budowę:
powierzchnia dolna membrany, która w czasie suszenia miała kontakt ze szklaną szalką, jest
zawsze bardziej chropowata i posiada więcej porów niż powierzchnia górna membrany, tj. ta,
która w czasie procesu suszenia miała kontakt z powietrzem. Można zauważyć również, że
porowatość i rozmiar porów na dolnej powierzchni rosną wraz ze wzrostem masy
cząsteczkowej PEG. Odwrotną zależność można zaobserwować w przypadku górnej
powierzchni membrany: ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG porowatość maleje, zaś
w przypadku PEG o masie cząsteczkowej 600 Da i większej na powierzchni tworzy się
nieporowata skórka (Rys. 25 G, J, M). Membrana, do której otrzymania użyto PEG o masie
cząsteczkowej 3400 Da jest niejednorodna i charakteryzuje się inną budową
mikrostrukturalną niż pozostałe membrany; jest poza tym niejednorodna
w skali makroskopowej, co wyklucza jej potencjalne zastosowanie w medycynie.
Różnice w budowie mikrostrukturalnej poszczególnych membran mogą być
wyjaśnione w następujący sposób: jeśli do otrzymania membrany użyto porogenu o niskiej
masie cząsteczkowej, tj. PEG 300, występuje dużo kulistych wydzieleń PEG w matrycy
PLGA, ale ich rozmiar jest niewielki. Są one również równomiernie rozłożone w całej
objętości bledy. Badania szybkości odparowania rozpuszczalnika pokazują, że rozpuszczalnik
w pierwszej kolejności odparowuje z fazy PLGA, w wyniku czego domeny PEG zostają
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
62
unieruchomione. Wyniki potwierdzające tę zależność zostały przedstawione na Rys. 27 oraz
w Tabeli 4, wiersz 1. Można zauważyć że najniższa szybkość odparowania rozpuszczalnika
jest obserwowana dla PEG 300 jak również w przypadku blendy PLGA/PEG 300, przy
jednoczesnej najwyższej pozostałości rozpuszczalnika po 24 h. Membrany otrzymane z tym
porogenem mają stosunkowo małe pory rozłożone homogenicznie na obu powierzchniach
(górnej i dolnej) jak również w całej objętości membrany.
W przypadku kiedy masa cząsteczkowa PEG wynosi 400 Da, 600 Da i 1000 Da, a stężenie
porogenu jest takie same tj. 60%, rozmiar domen PEG w blendach rośnie przy jednoczesnym
spadku ich liczby. Takie zjawisko może być wytłumaczone tym, że rozpuszczalność
polimerów maleje wraz ze wzrostem ich masy cząsteczkowej, ale wielość skłębionych
łańcuchów polimerowych rośnie [83]. W porównaniu do PEG 300, w tych próbkach
obserwujemy wyższą szybkość odparowania rozpuszczalnika oraz mniejszą pozostałość
rozpuszczalnika w blendach po upływnie 24 h (Tabela 4, wiersze 2 – 4). Tak samo jak przy
blendzie PLGA/PEG 300, rozpuszczalnik w pierwszej kolejności odparowuje z fazy PLGA,
ale ponieważ liczba domen PEG była niższa; na górnej powierzchni blendy dochodzi do
utworzenia nieporowatej skórki. Większy rozmiar domen PEG skutkuje łączeniem się domen
w agregaty oraz ich sedymentacją i akumulacją przy dolnej powierzchni blendy. Największy
rozmiar osiągają domeny PEG 1000, co może wynikać z faktu, że PEG 1000, w temperaturze
pokojowej, jest ciałem stałym (Rys. 27 B) i bardziej krystalicznym [84] niż pozostałe użyte
PEG o niższej masie cząsteczkowej. Schemat powstawania membran otrzymanych z 60%
stężeniem PEG o różnych masach cząsteczkowych został przedstawiony na Rys. 29 [80].
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 29 Schemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych
masach cząsteczkowych.
Membrany otrzymane z użyciem PEG 3400
powierzchni, natomiast na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.
Zaobserwowano ponadto, że
się dużych zakumulowanych domen
otrzymywania. Takie zachowanie może być wytłumaczone
krystaliczności PEG 3400,
Membrany te posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych
badaniach nie były brane pod
medycznych.
Podsumowując uzyskane rezultaty można stwierdzić, że
otrzymywania membran za pomocą separacji faz daje powtarzalne wyniki, a otrzymane
materiały spełniają założenia stawiane materiałom do GTR.
porowatą asymetryczną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki
zastosowaniu porogenu o różnych masach cząsteczkowych możliwa jest kontrola wielkości
porów i chropowatości uzyskanych membran.
Na podstawie otrzyma
i badania biologiczne, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem
porogenu PEG 400 i PEG 1000.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
chemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych
Membrany otrzymane z użyciem PEG 3400 posiadają nieporowatą skórkę na górnej
na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.
Zaobserwowano ponadto, że dolna powierzchnia uległa rozwarstwieniu na skutek tworzenia
ię dużych zakumulowanych domen PEG, które uległy wypłukaniu w czasie procesu
otrzymywania. Takie zachowanie może być wytłumaczone
w porównaniu do pozostałych PEG wykorzystanych w tej pracy.
posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych
badaniach nie były brane pod uwagę, ze względu na ich nieprzydatność do zastosowań
uzyskane rezultaty można stwierdzić, że zaproponowany sposób
otrzymywania membran za pomocą separacji faz daje powtarzalne wyniki, a otrzymane
materiały spełniają założenia stawiane materiałom do GTR. Uzyskane membrany mają
ną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki
zastosowaniu porogenu o różnych masach cząsteczkowych możliwa jest kontrola wielkości
porów i chropowatości uzyskanych membran.
Na podstawie otrzymanych wyników do dalszych badań – obejmujących deg
, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem
porogenu PEG 400 i PEG 1000. Głównym kryterium wyboru była mikros
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
63
chemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych
posiadają nieporowatą skórkę na górnej
na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.
dolna powierzchnia uległa rozwarstwieniu na skutek tworzenia
PEG, które uległy wypłukaniu w czasie procesu
wyższym stopniem
w porównaniu do pozostałych PEG wykorzystanych w tej pracy.
posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych
uwagę, ze względu na ich nieprzydatność do zastosowań
zaproponowany sposób
otrzymywania membran za pomocą separacji faz daje powtarzalne wyniki, a otrzymane
Uzyskane membrany mają
ną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki
zastosowaniu porogenu o różnych masach cząsteczkowych możliwa jest kontrola wielkości
obejmujących degradację
, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem
Głównym kryterium wyboru była mikrostruktura
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
64
otrzymanych materiałów: obie membrany posiadają porowatą, asymetryczną budowę i zostały
wybrane jako materiały najbardziej różniące się chropowatością. Membrana PLGA/PEG 400
jest porowata zarówno na górnej jak i na dolnej stronie, natomiast membrana PLGA/PEG
1000 posiada nieporowatą skórkę na górnej powierzchni i bardziej porowatą dolną
powierzchnię. Dzięki tym różnicom możliwe będzie sprawdzenie wpływu porowatości
materiałów na ich zachowanie w warunkach symulowanego środowiska biologicznego oraz
oddziaływań komórka/materiał w warunkach in vitro.
2.3. Badania degradacji membran
Badania degradacji były prowadzone w buforowanym płynie fizjologicznym PBS
(szczegółowy opis eksperymentu w pkt. 1.6) przez okres 24 tygodni. W kolejnych okresach
czasu ocenie były poddawane masa membran oraz pH płynu inkubacyjnego. Ocenie poddano
również parametry mechaniczne badanych membran oraz ich mikrostrukturę, topografię
i zwilżalność powierzchni.
2.3.1. Ocena makroskopowa
Ocena makroskopowa pokazała, że po upływie 9 i 6 tygodni dla membran, próbki stają się
bardzo kruche i ulegają rozpadowi (Rys. 30). Na zaprezentowanym zdjęciu zarejestrowanym
za pomocą aparatu cyfrowego (Rys. 30) można również zauważyć, że folia PLGA w miarę
upływu czasu zmienia kolor z przeźroczystego (próbka wyjściowa) na mlecznobiały (1 – 9
tydzień), aż do całkowicie białego (od 12 tygodnia). We wszystkich przypadkach po upływie
20 tygodni materiał przypominał wiórki i nie dało się uzyskać kawałka większego niż kilka
milimetrów.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
65
Rys. 30 Makroskopowy obraz foli PLGA (A), membrany PEG 400 (B) oraz membrany
PEG 1000 (C) przed i po inkubacji w PBS przez czas od 1 do 24 tygodni.
2.3.2. Zmiany masy
Na rysunku 31 umieszczono wykresy zależności ubytku masy od czasu inkubacji w PBS folii
PLGA oraz dwóch membran: uzyskanych za pomocą PEG 400 i PEG 1000.
Badania te wykazały, że we wszystkich przypadkach nastąpił spadek masy. Początkowe masy
wszystkich próbek były zbliżone do siebie, po okresie pierwszych sześciu tygodni spadek
masy dla wszystkich próbek wynosił około 4%. W następnych okresach różnice w spadku
masy stały się bardziej widoczne. Po 24 tygodniach największy spadek masy odnotowano dla
membrany PEG 400 (~ 67%), a najmniejszy dla czystej folii PLGA (~ 44%). W przypadku
folii PLGA najszybszy spadek masy obserwujemy od 15 tyg. (Rys. 31); dla membran ten
punkt jest przesunięty do 18 tyg. Jednakże, w przypadku membrany PEG 400 można również
zauważyć, że pierwszy duży spadek masy zaobserwowano już po 9 tygodniach.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 31 Zależność zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG
1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg.
2.3.3. Zmiany pH
Oprócz masy próbek, w czasie degradacji
w którym inkubowano folię i membrany PLGA
i po upływie tygodnia spadło do wartości ~ 6,5. Następnie zaczęło rosnąć i po 4 tygodniach
osiągnęło wartość ~ 7,0 dla wszystkich próbek.
(~ 6,7 dla membran i ~ 6,6
tygodnia można zauważyć różnice w wartościach pH dla poszczególnych próbek. Po 24
tygodniach najniższą wartość pH
PEG 400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy
Odpowiednio dla folii PLGA, dla której spadek ma
najwyższe pH (~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podob
jak w przypadku spadku masy
PEG 400.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG
1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg.
, w czasie degradacji zmianie ulegało również pH
inkubowano folię i membrany PLGA (Rys. 32). Początkowe pH wynosiło ~ 6,8
i po upływie tygodnia spadło do wartości ~ 6,5. Następnie zaczęło rosnąć i po 4 tygodniach
osiągnęło wartość ~ 7,0 dla wszystkich próbek. Po upływie 6 tygodni
,6 dla folii PLGA) i malało nieprzerwanie aż do 24 tygodnia.
tygodnia można zauważyć różnice w wartościach pH dla poszczególnych próbek. Po 24
wartość pH (~ 5,7) osiągnął PBS, w którym inkubowano membranę
400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy
Odpowiednio dla folii PLGA, dla której spadek masy był najmniejszy,
(~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podob
w przypadku spadku masy jest to wartość pośrednia pomiędzy
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
66
zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG
również pH roztworu PBS,
Początkowe pH wynosiło ~ 6,8
i po upływie tygodnia spadło do wartości ~ 6,5. Następnie zaczęło rosnąć i po 4 tygodniach
pH ponownie zmalało
dla folii PLGA) i malało nieprzerwanie aż do 24 tygodnia. Od 9
tygodnia można zauważyć różnice w wartościach pH dla poszczególnych próbek. Po 24
osiągnął PBS, w którym inkubowano membranę
400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy (patrz pkt 2.3.2).
sy był najmniejszy, odnotowano
(~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podobnie
pomiędzy PLGA i membraną
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 32 Zależność pH PBS w funkcji cza
2.3.4. Kąt zwilżania
Zmiany wartości kąta zwilżani
wyniki pokazują, że w przyp
membrany wydaje się być
się dla membran (Rys. 33 B, C).
PEG 1000, a najniższym folia PLGA. Z
procesu degradacji, zarówno
niewielkie i nie przekraczają
zwilżania nieznacznie spada dla wszystkich
są niewielkie i nieistotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa
znacząco na zwilżalność badanych materiałów
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
ależność pH PBS w funkcji czasu inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg.
Zmiany wartości kąta zwilżania w czasie degradacji przedstawiono na Rys. 33
w przypadku czystej folii PLGA (Rys. 33 A) powierzchna górna
bardziej hydrofobowa niż dolna, odwrotnie sytuacja prze
B, C). Najwyższym kątem zwilżania charakteryzuje się membrana
PEG 1000, a najniższym folia PLGA. Zaobserwowane zmiany kątów zwilżania,
zarówno dla czystej folii PLGA jak i membran PEG 400 i PEG 1000, są
e przekraczają 4% . Można jednak zauważyć, że w czasie inkubacji w PBS, kąt
zwilżania nieznacznie spada dla wszystkich materiałów. Jednak biorąc pod uwagę, że zmiany
istotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa
badanych materiałów.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
67
u inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg.
radacji przedstawiono na Rys. 33. Uzyskane
A) powierzchna górna
bardziej hydrofobowa niż dolna, odwrotnie sytuacja przedstawia
Najwyższym kątem zwilżania charakteryzuje się membrana
aobserwowane zmiany kątów zwilżania, w czasie
dla czystej folii PLGA jak i membran PEG 400 i PEG 1000, są
Można jednak zauważyć, że w czasie inkubacji w PBS, kąt
materiałów. Jednak biorąc pod uwagę, że zmiany
istotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 33 Wartość kąta zwil
i membrany PEG 1000 (C) w funkcji czasu degradacji.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Wartość kąta zwilżania dla czystej folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B
) w funkcji czasu degradacji.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
68
, membrany PEG 400 (B)
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
69
2.3.5. Wytrzymałość
Badania wytrzymałościowe zostały przeprowadzone na próbkach wyjściowych oraz po 1, 2, 4
i 6 tygodniu inkubacji w PBS. Wynikało to z faktu, że po dłuższym okresie degradacji
przebadanie próbek było niewykonalne, ponieważ membrany były tak kruche, że rozpadały
się w czasie próby zamontowania ich w szczękach maszyny wytrzymałościowej.
W przypadku membran PEG 400 już po upływie 4 tygodni nastąpił tak znaczny spadek
wytrzymałości, że w 6 tygodniu przeprowadzenie badań było możliwe.
Uśrednione wyniki badań właściwości mechanicznych folii PLGA i membran przedstawione
na Rys. 34 pokazują, że w czasie degradacji następuje obniżenie wytrzymałości
(Rm, Rys. 34 A) oraz modułu Younga (E, Rys. 34 B). W czasie degradacji zmienia się
również podatność folii i membran PLGA na odkształcenie maleje: zarówno odkształcenie
maksymalne, jak i odkształcenie przy zerwaniu. Na Rys. 35 przedstawiono charakterystyczne
krzywe zależności wytrzymałości od odkształcenia dla wybranych próbek. W przypadku folii
PLGA (Rys. 35 A) widać, że wyjściowy materiał charakteryzuje się większą kruchością, jest
mniej elastyczny niż membrany, a kruchość ta rośnie w miarę wydłużenia czasu inkubacji
w PBS. Wyjściowe próbki membran PEG 400 i PEG 1000 można określić jako
odkształcające się plastyczne. W przypadku wyjściowej membrany PEG 400 (Rys. 35 B)
odkształcenie przy zerwaniu wynosi ~ 50%, a po pierwszym tygodniu inkubacji spada do
około 15%. Po 2 i 4 tygodniu przetrzymywania w PBS próbki zachowują się jak materiały
kruche. Podobnie zachowuje się membrana PEG 1000 (Rys. 35 C): próbka wyjściowa ulega
~ 32% odkształceniu, zaś po pierwszym tygodniu wartość ta maleje do ~ 29%. W tym
przypadku znaczy spadek odkształcalności obserwujemy po 2 i 4 tygodniach degradacji
(~ 5%), a po upływie 6 tygodni próbka wykazuje brak plastyczności.
Duże wartość błędu standardowego (Rys. 34) pokazują, że w czasie degradacji próbki i stają
się niejednorodne.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 34 Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG
przed i po inkubacji w PBS w
Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG
przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni A. wytrzymałość
Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (Fmax) i D. wydłużenie całkowite (
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
70
Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG 400 i 1000
A. wytrzymałość (Rm), B. moduł
) i D. wydłużenie całkowite (FTotal).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 35 Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia
w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni
PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia
w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni dla wybranych próbek folii PLGA (A), membrany
PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C).
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
71
Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia przed i po inkubacji
wybranych próbek folii PLGA (A), membrany
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3.6. Mikrostruktura i topografia powierzchni
2.3.6.1. SEM
Analiza SEM pokazała, że nie
powierzchni folii PLGA w czasie procesu degradacji
dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie
(Rys. 31 D).
Rys. 36 Mikrofotografie SEM czystej folii
(wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni.
W przypadku membrany PEG 400 zauważalne różnice w
już po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją
powierzchniach (górnej i dolnej); pory były
z tym, że na dolnej powier
przełamie widać, że pory występują w całej objętości (R
inkubacji w PBS można dostrzec, że
(Rys. 37 D). Z kolei na dolnej powierzchni widzimy znaczny
w porównaniu do membrany wyjściowej
po 2 tygodniach inkubacji w PBS (R
niejednorodne można zauważyć
tj. 4 i 6, górna powierzchnia
po 2 tygodniach (Rys. 37 D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne
a powierzchnia stała się bardziej chropowata (R
w miarę upływu czasu stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej
porowatości i chropowatości, a pory stały się większe, zaś ich śc
(Rys. 37 H, K, N). Zmiany te były
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
i topografia powierzchni
pokazała, że nie obserwuje się istotnych zmian w budowie mikrostrukturalnej
w czasie procesu degradacji (Rys. 36). Powierzchnia
dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie
Mikrofotografie SEM czystej folii PLGA: A. próbka przed inkubacją w PBS
(wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni.
W przypadku membrany PEG 400 zauważalne różnice w budowie mikrostrukturalnej widać
ż po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją
órnej i dolnej); pory były niewielkie, okrągłe i podobnych rozmiarów,
że na dolnej powierzchni ich liczba była większa (Rys. 37 A, B). Oprócz tego na
y występują w całej objętości (Rys. 37 C). Po dwóch tygodniach
można dostrzec, że na górnej powierzchni pory stały się większe
D). Z kolei na dolnej powierzchni widzimy znaczny wzrost liczby
porównaniu do membrany wyjściowej jak i do górnej powierzchni membrany
inkubacji w PBS (Rys. 37 B i D, E). To, że pory stały się większe i
zauważyć również na przełamie (Rys. 37 F). W kolejnych tygodniach
górna powierzchnia membrany wyglądała podobnie to tej jaką
D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne
stała się bardziej chropowata (Rys. 37 M). Natomiast dolna powierzchnia
stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej
porowatości i chropowatości, a pory stały się większe, zaś ich ścianki uległy ścienieniu
H, K, N). Zmiany te były również zauważalne na przełamach
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
72
zmian w budowie mikrostrukturalnej
). Powierzchnia folii jest gładka,
dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie i nieliczne pory
A. próbka przed inkubacją w PBS
(wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni.
budowie mikrostrukturalnej widać
ż po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją była porowata na obu
i podobnych rozmiarów,
A, B). Oprócz tego na
C). Po dwóch tygodniach
na górnej powierzchni pory stały się większe
wzrost liczby porów,
i do górnej powierzchni membrany
ory stały się większe i bardziej
W kolejnych tygodniach
ła podobnie to tej jaką zaobserwowano
D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne,
Natomiast dolna powierzchnia
stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej
ianki uległy ścienieniu
również zauważalne na przełamach (Rys. 37 I, L, O),
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
73
szczególnie po 9 tygodniach widać, że struktura ulega stopniowemu niszczeniu, brzegi
membrany stają się nierówne, zauważyć można obszary zawierające lity polimer bez porów
(Rys. 37 O). Po 9 tygodniach mikrostruktura membrany ulegała kolejnym zmianom. Górna
i dolna powierzchnia stały się ponownie do siebie podobne (Rys. 37 P, R). Na obydwu
powierzchniach występowały kuliste pory o różnych rozmiarach, ale w dalszym ciągu na
dolnej powierzchni liczba porów była większa. Od 12 tygodnia wykonanie zdjęć przełamów
było niemożliwe ze względu na znaczą kruchość próbek. Po 15 tygodniach na powierzchniach
próbek pojawiły się kuliste fragmenty zdegradowanego polimeru (Rys. 37 S, T), a ich liczba
rosła w 18 tygodniu (Rys. 37 U, W). Po 18 tygodniach próbki miały niejednorodną strukturę,
powierzchnia ich była mocno zdegradowana, uwidaczniały się są pory znajdujące się w głębi
membrany. Po 20 i 24 tygodniach przeprowadzenie badań było niemożliwe ze względu na
kruchość próbek.
Membrana PEG 1000 wyjściowo charakteryzowała się inną budową niż membrana PEG 400
(pkt. 2.2.1, Rys. 37 A – C, Rys. 38 A – C). Membrana PEG 1000 posiadała nieporowatą
skórkę na górnej stronie oraz porowatą dolną powierzchnię. Na Rys. 38 przedstawiono
zmiany w mikrostrukturze membrany PEG 1000 w czasie procesu degradacji. Pierwsze
różnice, podobnie jak w przypadku membrany PEG 400, były widoczne już po pierwszych
dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Na górnej powierzchni pojawiły się pory (Rys. 38 D),
natomiast na dolnej zwiększyła się ich wielkość, a kształt stał się bardziej niejednorodny
(Rys. 38 E). Obserwacje przełamów wykazały, że brzegi membrany były postrzępione, a pory
bardziej płaskie (Rys. 38 F). W kolejnych tygodniach zmiany te jeszcze bardziej się
uwidoczniły. Pory na górnych powierzchniach stawały się coraz większe i lepiej widoczne
(Rys. 38 G, J), a po 9 tygodniach zaczynały łączyć się ze sobą (Rys. 38 M). Podobnie na
dolnej powierzchni zwiększał się rozmiar porów, powodując powstanie dużych, pustych
obszarów, w wyniku czego uwidaczniały się głębsze warstwy membrany (Rys. 38 H, K, N).
Zwiększały się również rozmiary porów w środku, a nie tylko na powierzchni membrany
(Rys. 38 I, L), aż stopniowo struktura przestrzenna membrany ulegała zniszczeniu
(Rys. 38 O). W kolejnych tygodniach na górnych powierzchniach pojawiły się kuliste
wytrącenia degradującego się polimeru (Rys. 38 S, U), a na dolnych powierzchniach
w dalszym ciągu zwiększała się niejednorodność powierzchni (Rys. 38 R, T, W). Podobnie
jak w przypadku membrany PEG 400 wykonanie preparatów mikroskopowych przełamów po
12 tygodniu inkubacji okazało się niemożliwe ze względu na kruchość próbek.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 37 Mikrofotografie SEM membrany PEG 400
D – F po 2 tygodniach, G
tygodniach, P – R po 12 tygodn
degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
T, W; przełamy C, F, I, L, O.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Mikrofotografie SEM membrany PEG 400: A – C przed degradacją (wyjściowe),
po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M
po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U –
rna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
T, W; przełamy C, F, I, L, O.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
74
C przed degradacją (wyjściowe),
L po 6 tygodniach, M – O po 9
W po 18 tygodniach
rna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 38 Mikrofotografie SEM membrany PEG 10
D – F po 2 tygodniach, G
tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S
degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
T, W; przełamy C, F, I, L, O.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
SEM membrany PEG 1000: A – C przed degradacją (wyjściowe),
po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M
R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U –
degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
przełamy C, F, I, L, O.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
75
C przed degradacją (wyjściowe),
L po 6 tygodniach, M – O po 9
W po 18 tygodniach
degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.3.6.2. AFM
Na Rys. 39, 40 i 41 zaprezentowano obrazy
i membran PEG 400 i 1000
obrazach nie były widoczne
(Rys. 39), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej
powierzchni wartość Ra ulega zwiększeniu (T
membran widać, że w czasie degradacji
ta jest również widoczna na
degradacją widoczne były
wzrosła. Widoczne było również, że wielkość
w PBS. Struktura dolnej powierzchni była
SEM (Rys. 37 K i Rys. 40
na górnej powierzchni i porowatą dolną
widoczne na obydwu stronach membrany (R
Analiza topografii powierzchni
zależności do tych obserwowanych za pomocą
Rys. 39 Obrazy topograficzne
(przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
zaprezentowano obrazy przedstawiające powierzchnię
i membran PEG 400 i 1000 przed i po 6 tygodniach inkubacji w PBS. W przypadku foli
nie były widoczne zmiany topografii, powierzchnia była gładka i jednorodna
), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej
ulega zwiększeniu (Tabela. 5, wiersz 1). Również w przypadku
membran widać, że w czasie degradacji wartość Ra rośnie (Tabela. 5 wiersz 2 i 3), zależność
widoczna na obrazach AFM. Na obrazach membrany PEG 400 (R
pory na dolnej i górnej powierzchni, a po degradacji liczba porów
wzrosła. Widoczne było również, że wielkość porów była większa, niż przed inkubacją
truktura dolnej powierzchni była podobna do tej, jaką zaobserwowano za pomocą
ys. 40 D). Membrana PEG 1000 charakteryzuje się nieporowatą skórką
ni i porowatą dolną stroną (Rys. 41 A i B), po 6 tygodniach pory są
idoczne na obydwu stronach membrany (Rys. 41 C i D).
Analiza topografii powierzchni membrany w funkcji czasu degradacji pokazała podobne
bserwowanych za pomocą SEM.
Obrazy topograficzne powierzchni foli PLGA: A. próba wyjściowa
inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
76
powierzchnię folii PLGA
. W przypadku folii na
hnia była gładka i jednorodna
), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej
Również w przypadku
wiersz 2 i 3), zależność
membrany PEG 400 (Rys. 40) przed
a po degradacji liczba porów
większa, niż przed inkubacją
serwowano za pomocą
się nieporowatą skórką
A i B), po 6 tygodniach pory są
degradacji pokazała podobne
A. próba wyjściowa
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 40 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400
(przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS
Rys. 41 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000
(przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400:
inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS.
Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000:
inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
77
A. próba wyjściowa
A. próba wyjściowa
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
78
Tabela 5 Wartości chropowatości (Ra) folii i membran przed i po inkubacji w PBS
(średnia ± błąd standardowy, n = 3)
Ra [nm] przed degradacja po 6 tygodniach degradacji
góra dół góra dół
PLGA 20 ± 11 17 ± 2 103 ± 5 162 ± 60
PEG 400 307 ± 99 620 ± 108 440 ± 71 934 ± 485
PEG 1000 208 ± 80 989 ± 110 549 ± 75 1227 ± 524
2.3.7. Dyskusja wyników
PLGA należy do grupy poliestrów alifatycznych i ulega degradacji hydrolitycznej,
której produktami końcowymi są kwas mlekowy i glikolowy. Produkty te są naturalnie
usuwane z organizmu na drodze metabolicznej [85]. Jednak mechanizm degradacji jest różny
i zależy między innymi od składu chemicznego polimeru, jego masy cząsteczkowej czy
struktury łańcucha; przeprowadzone badania pokazują również, że istotna jest wielkość oraz
kształt wyrobu [22, 49]. Na proces degradacji mają również wpływ czynniki środowiskowe
takie jak pH, temperatura czy obecność jonów [49]. Wykorzystywany w tej pracy polimer
został otrzymany przy użyciu biozgodnego inicjatora (pkt. 1.1), jego łańcuchy mają budowę
segmentową, w której bloki laktydowe i glikolidowe są dłuższe niż w polimerach
otrzymywanych przy użyciu typowych inicjatorów, np. związków cyny [86]. Ta cecha
również może wpływać na przebieg degradacji otrzymanych materiałów, stąd celowe było
przeprowadzenie kompleksowych badań nad procesem degradacji hydrolitycznej
opracowanych materiałów.
Obserwacje makroskopowe folii PLGA oraz membran pokazały, że materiały te
ulegają stosunkowo szybkiej degradacji: już po upływie 4 tygodni membrany PEG 400,
a po upływie 6 tygodni folie PLGA i membrany PEG 1000 stają się niespoiste i kruszą się.
Oprócz tego folia PLGA już po upływie tygodnia z przeźroczystej staje się mleczna, a po 12
tygodniach biała. Zmiana barwy może być spowodowana absorbcją cząsteczek wody przez
materiał lub/i wzrostem krystaliczności materiału w czasie degradacji [87]. Przeprowadzone
badania wytrzymałości potwierdzają poczynione obserwacje makroskopowe. Po upływie 4 i 6
tygodni wytrzymałość materiałów drastycznie spada (Rys. 34 A), zmieniają się również inne
parametry mechaniczne takie jak moduł Younga i odkształcenie, gdyż z materiałów
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
79
odkształcających się plastycznie membrany stają się materiałami kruchymi (Rys. 35).
W czasie procesu degradacji obserwowano także stopniowy spadek masy próbek. Zauważalne
zmiany pojawiły się już po 2 tygodniach inkubacji (Rys. 31), co może świadczyć o tym, że do
środowiska wodnego zaczęły wydzielać się produkty degradacji PLGA (rozpuszczalne
oligomery lub cząsteczki kwasów mlekowego i glikolowego) [71, 88]. Obniżenie pH
roztworu PBS, w czasie inkubacji w nim badanych materiałów (Rys. 32) również może
świadczyć o tym, że do środowiska wydzielają się produkty ich degradacji. Początkowo
zmiany te są niewielkie i w miarę postępu degradacji wartość pH drastycznie spada. Pierwszy
duży spadek pH został odnotowany po 4 tygodniu inkubacji, czyli w momencie kiedy dla
membrany PEG 400 odnotowano również największy spadek wytrzymałości.
Na wykresie zmian zależności pH od czasu degradacji (Rys. 32) możemy również zauważyć,
że najniższe pH odnotowano dla najbardziej zdegradowanego materiału (masa po degradacji
była najniższa), czyli membrany PEG 400. Badania mikrostruktury (Rys. 38, 39) i topografii
(Rys. 39 – 41, Tabela 5) pokazały, że w czasie degradacji zmienia się porowatość membran
oraz chropowatość powierzchni dla wszystkich próbek. Co więcej, na zdjęciach wykonanych
przełamów można zauważyć, że zmienia się również wnętrze degradującego się materiału.
W ciągu 6 tygodni widać, że pory wewnątrz membrany stają się coraz większe, aż w końcu
dochodzi do częściowego (Rys. 37 O) lub całkowitego (Rys. 38 O) zniszczenia struktury
wewnętrznej membran.
Z literatury wiadomo, że polimery z grupy poliestrów alifatycznych degradują się
w masie w sposób heterogeniczny [89, 90], który wynika z faktu, że krótsze łańcuchy
i oligomery, znajdujące się na powierzchni materiału mają możliwość dyfundowania do
płynów (np. tkankowych) otaczających materiał, w których ulegają neutralizacji. Natomiast
łańcuchy i oligomery znajdujące się we wnętrzu materiału nie mają takiej możliwości,
a w wyniku ich kumulacji, we wnętrzu materiału dochodzi do lokalnego obniżenia pH, które
przyspiesza (katalizuje) hydrolizę pozostałych łańcuchów polimerowych [91].
Podsumowując, przedstawione wyniki badań świadczą o tym, że w przypadku
badanych membran również zachodzi degradacja w masie w sposób heterogeniczny. Oprócz
tego czas degradacji membran i folii jest podobny, a średnia wytrzymałość po 6 tygodniach
dla membrany PEG 1000 wynosi ~ 7,30 MPa (Rys. 34 A) co świadczy o tym, że pomimo
znacznej porowatości i małej grubości będą one zapewniać odpowiednie wsparcie w obszarze
nowo odtwarzającej się tkanki kostnej (Tabela 1).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
80
2.4. Charakterystyka biologiczna membran
Badania biologiczne wybranych materiałów zostały podzielone na kilka etapów.
W pierwszym etapie sprawdzono potencjalną cytotoksyczność otrzymanych membran.
Kolejnym etapem było przebadanie wytworzonych membran w kontakcie z komórkami
ludzkimi interesującymi z punktu widzenia sterowanej regeneracji tkanek tj. fibroblastami
i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC). Zarówno w pierwszym jak i drugim
eksperymencie badania były prowadzone tak, aby określić jaką rolę odgrywa mikrostruktura
membran w zachowaniu się komórek w hodowli. Ostatnim etapem było przetestowanie
membran w kokulturach fibroblastów i hMSC.
2.4.1. Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63
W pierwszych badaniach biologicznych przeprowadzono test żywotności komórek MTT,
oceniono również poziom wydzielonego tlenku azotu (NO) w nadsączu (supernatancie) oraz
obserwowano morfologię komórek. Badania były prowadzone na trzech typach membran,
w których jako porogen został użyty PEG o różnych masach cząsteczkowych 300 Da, 400 Da
i 1000 Da. Taki wybór został podyktowany tym, że chciano również sprawdzić, czy różnice
w mikrostrukturze membran mają wpływ na zachowanie się komórek. Jako próbę kontrolną
wykorzystano czystą folię PLGA oraz powierzchnię płytki hodowlanej, wykonaną
z modyfikowanego polistyrenu – TCPS. Sposób przygotowania próbek do badań oraz
warunki hodowli opisano w pkt. 1.7.1.
2.4.1.1. Żywotności komórek
Wyniki pomiaru żywotności, wyznaczone za pomocą testu MTT (Rys. 42) pokazały, że na
górnych powierzchniach membran poziom żywotności komórek był taki sam lub
statystycznie wyższy niż dla próby kontrolnej TCPS. Z drugiej strony w przypadku dolnych
powierzchni, za wyjątkiem membrany PEG 400, komórki wykazywały niższą żywotność niż
na próbie kontrolnej. Dla wszystkich membran zaobserwowano wyższy poziom żywotności
dla górnej powierzchni. Najniższą różnicę między górną, a dolną powierzchnia widać było
w przypadku membrany PEG 300 (~ 6%), następnie dla membrany PEG 400 (~ 9%),
a największą dla membrany PEG 1000 (~ 12%). Wyniki wskazują, że komórki rosły najlepiej
na górnej stronie membrany PEG 400 oraz na folii PLGA.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4.1.2. Poziom tlenku azotu
Różnice w stężeniu NO w poszczególnych na
statystycznie (Rys. 43). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność
komórek była wyższa, tam obserwowano
wystąpił dla nasączy, gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany
PEG 1000, natomiast najniższe stężenie NO odnotowano
PEG 400.
Rys. 42 Żywotność komórek MG
1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd
standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statys
TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami
membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA:
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
tlenku azotu
stężeniu NO w poszczególnych nadsączach były niewielk
). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność
tam obserwowano niższy poziom NO. Najwyższy
gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany
najniższe stężenie NO odnotowano dla górnej powierzchni membrany
Żywotność komórek MG-63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG
1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd
standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną w odniesieniu
p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami
membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA: ●●p <0,01;
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
81
niewielkie i nieistotne
). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność
Najwyższy poziom NO
gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany
dla górnej powierzchni membrany
63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG
1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd
tyczną w odniesieniu do grupy kontrolnej
p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami
p <0,01; ●●●p < 0,001.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 43 Poziom tlenku azotu
300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS
próbkami wg. t-testu.
2.4.1.3. Morfologia komórek
Na Rys. 44 zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych
na membranach, folii PLGA i TCPS. Na wszystkich zdjęciach można zauważyć, że komórki
są dobrze rozpłaszczone, wielokątne i posiadaj
na membranach (Rys. 44 A
kontrolnych: folii PLGA (Rys. 44
powierzchniach membran oraz prób kontrolnych jest
powierzchnia membrany
heterogenicznie. Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek
na górnych powierzchniach membran (R
dolnych powierzchniach (R
zaprezentowanymi wynikami testu MTT i pomiaru poziomu NO.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Poziom tlenku azotu w nadsączu hodowli komórek MG-63 na membranach PEG
300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS. Brak istotności statystycznej pomiędzy
komórek
zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych
na membranach, folii PLGA i TCPS. Na wszystkich zdjęciach można zauważyć, że komórki
są dobrze rozpłaszczone, wielokątne i posiadają wrzecionowaty kształt.
A – F) nie różnią się wyglądem od tych hodowanych na pr
folii PLGA (Rys. 44 G) i TCPS (Rys. 44 H). Rozkład komórek na
powierzchniach membran oraz prób kontrolnych jest jednorodny, wyjątkiem jest dolna
PEG 1000 (Rys. 44 F) gdzie komórki układają się bardziej
Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek
ch membran (Rys. 44 A, C, E) jest nieznacznie większa
dolnych powierzchniach (Rys. 44 B, D, F). Wyniki badań są zgodne z wcześniej
zaprezentowanymi wynikami testu MTT i pomiaru poziomu NO.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
82
63 na membranach PEG
. Brak istotności statystycznej pomiędzy
zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych
na membranach, folii PLGA i TCPS. Na wszystkich zdjęciach można zauważyć, że komórki
wrzecionowaty kształt. Komórki hodowane
F) nie różnią się wyglądem od tych hodowanych na próbach
H). Rozkład komórek na
, wyjątkiem jest dolna
F) gdzie komórki układają się bardziej
Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek
A, C, E) jest nieznacznie większa niż na
B, D, F). Wyniki badań są zgodne z wcześniej
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 44 Morfologia komórek MG
PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia
(B, D, F) oraz na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Morfologia komórek MG-63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B),
PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia
az na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
83
63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B),
PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia
az na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
84
2.4.1.4. Dyskusja wyników
Przeprowadzone badania pokazały, że komórki adherują oraz dobrze proliferują na
wszystkich badanych materiałach (Rys. 42). Różnice żywotności komórek na poszczególnych
materiałach są stosunkowo niewielkie, choć statystycznie istotne. Najwyższa żywotność
komórek została zanotowana dla górnej strony membrany PEG 400, natomiast najniższa dla
dolnej powierzchni membrany PEG 1000. Biorąc pod uwagę chropowatość badanych
membran (Ra, Tabela 3, pkt. 2.2.2.) można stwierdzić, że komórki rosły najlepiej
powierzchni, której chropowatość wynosiła ~ 400 nm, a najgorzej na najbardziej chropowatej
powierzchni (~ 1200 nm). Można również zaobserwować, że w miarę jak pojawiają się coraz
większe różnice w chropowatości górnej i dolnej powierzchni membrany zwiększają się
również różnice pomiędzy zmierzoną wartością żywotności komórek. Tlenek azotu jest
bardzo aktywnym związkiem chemicznym regulującym wiele procesów fizjologicznych [92],
między innymi reguluje funkcję neuronów, zmniejsza napięcie ścian naczyń krwionośnych
oraz bierze udział w zabijaniu mikroorganizmów, wielokomórkowych pasożytów i komórek
nowotworowych [93]. Wysoki poziom NO w hodowli komórek in vitro może świadczyć
o pewnych jej nieprawidłowościach wywołanych np. cytotoksycznością materiału, z którym
kontaktują się komórki. Przedstawione na Rys. 43 wyniki pomiaru NO zgadzają się
z wynikami testu MTT. Poziom NO jest niski dla wszystkich próbek, a dla membran
porównywalny do próby kontrolnej PLGA i TCPS. Można było dostrzec tendencję, że
najwyższy poziom NO występował dla próbki, gdzie żywotność komórek była najniższa,
czyli dla membrany PEG 1000, chociaż nie był to wynik istotny statystycznie. Obserwacje
mikroskopowe zdają się potwierdzać wyniki uzyskanych pomiarów. Najmniej komórek
zaobserwowano na dolnej powierzchni membrany PEG 1000, co więcej na zdjęciach jest
widoczne, że w tym wypadku komórki wykazują tendencję do łączenia się w agregaty
(Rys. 44 F). Na pozostałych powierzchniach membran komórki wykazują morfologię
podobną do tej obserwowanej na próbie kontrolnej.
Wyniki badań pokazały, że otrzymane membrany są cytozgodne i mogą być brane pod uwagę
jako materiał do zastosowań medycznych. Co więcej badania wskazują, że różnice w budowie
mikrostrukturalnej membran wpływają na morfologię komórek i ich stopień agregacji. Można
wyciągnąć wniosek, że poprzez kontrolowanie mikrostruktury membran (pkt. 2.2.5) możliwe
jest dobranie optymalnych warunków dla hodowli komórek kostnych.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4.2. Badania membran w kontakcie z
komórkami macierzystymi
Dalsze badania biologiczne
1000. Oba rodzaje komórek miały
hodowane na górnej i na dolnej powierzchni). Szczegóły prowa
w punkcie 1.7.2.
2.4.2.1. Proliferacja komórek
Potencjał proliferacyjny komórek wyznaczono
badań przedstawiono na Rys.
Rys. 45 Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B
stężenia LDH po 14 dniach
oznacza istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi
komórkami macierzystymi
Dalsze badania biologiczne były prowadzone na dwóch rodzajach membran PEG 400 i PEG
Oba rodzaje komórek miały kontakt z obiema powierzchniami membran (komórki były
hodowane na górnej i na dolnej powierzchni). Szczegóły prowadzenia hodowli opisano
Proliferacja komórek
Potencjał proliferacyjny komórek wyznaczono za pomocą pomiaru aktywności
badań przedstawiono na Rys. 45.
Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B) wyznaczona na podstawie pomiaru
LDH po 14 dniach hodowli komórek w dwóch rodzajach medium: BM i DM. Kółko
istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
85
ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi
ch rodzajach membran PEG 400 i PEG
kontakt z obiema powierzchniami membran (komórki były
dzenia hodowli opisano
aktywności LDH, wyniki
na na podstawie pomiaru
odzajach medium: BM i DM. Kółko
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
86
Przedstawione wyniki pokazują, że proliferacja fibroblastów utrzymuje się na jednakowym
poziomie, niezależnie od rodzaju membrany (PEG 400, PEG 1000) jak i powierzchni
(góra, dół), na której komórki były hodowane (Rys. 45 A). Ponadto widać, że liczba komórek
jest porównywalna do liczby komórek na próbie kontrolnej TCPS. W przypadku komórek
hMSC różnice w proliferacji są bardziej widoczne (Rys. 45 B). Proliferacja komórek
w medium różnicującym (DM) jest wyższa niż w medium podstawowym (BM). W przypadku
BM można zaobserwować, że komórki lepiej rosną na górnych powierzchniach membran.
Podobny wynik, ale już istotny statystycznie, został uzyskany w DM dla membrany PEG
1000. Widać, że w tym wypadku komórki zdecydowanie lepiej rosły na górnej, mniej
chropowatej stronie membrany. Proliferacja hMSC na dolnej powierzchni membrany PEG
400 była nieznacznie wyższa niż na górnej powierzchni. W przypadku DM liczba komórek na
próbce kontrolnej TCPS była wyższa niż na membranach.
2.4.2.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek
Różnicowanie komórek zostało wyznaczone poprzez pomiar aktywności ALP, natomiast
mineralizację określono na podstawie pomiaru stężenia jonów Ca2+. Wyniki badań zostały
przedstawione na Rys. 46.
Zgodnie z oczekiwaniem hMSC ulegały w większym stopniu różnicowaniu osteogennemu
w DM niż w BM (Rys. 46 A). W BM poziom zróżnicowania był porównywalny dla
wszystkich próbek oraz podobny to tego obserwowanego na próbie kontrolnej TCPS.
Najwyższy stopień zróżnicowania osiągnęły komórki hodowane w DM na górnej powierzchni
membrany PEG 400, ale poziom zróżnicowanie komórek hodowanych na dolnej powierzchni
tej membrany był tylko nieznacznie niższy. W przypadku membrany PEG 1000 różnice
między górną, a dolną powierzchnią były większe i istotne statystycznie. W tym wypadku
również na górnej powierzchni membrany hMSC różnicowały się lepiej niż na dolnej
powierzchni. Najniższy poziom zróżnicowana osiągnęły hMSC hodowane na najbardziej
chropowatej powierzchni membrany – była to dolna powierzchnia membrany PEG 1000.
Na obydwu powierzchniach membrany PEG 400 hMSC były bardziej zróżnicowane niż na
próbie kontrolnej TCPS, zaś dla obydwu powierzchni membrany PEG 1000 wynik był niższy
niż dla próby kontrolnej.
Wyniki analizy stopnia mineralizacji komórek hMSC (Rys. 46 B) pokazują podobne
zależności jak w przypadku stężenia ALP. HMSC wykazują większą mineralizację w DM niż
BM. W przypadku membrany PEG 400 mineralizacja w BM jest wyższa niż w przypadku
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
próby kontrolnej TCPS. Dla membrany PEG 1000 można
Najwyższy poziom mineralizacji wykazują komórki
membrany PEG 400, zaś w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.
Podobną zależność można zaobserwowa
mineralizacja występuje w przypadku
membran obserwujemy istotną
kontrolnej TCPS.
Badania mineralizacji zostały również przeprowadzone dla membran inkubowanych
w medium bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.
Rys. 46 Różnicowanie – aktywność ALP (A
mierzona po 14 dniach hodowli
istotność statystyczną w stosunku do
oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01.
wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
próby kontrolnej TCPS. Dla membrany PEG 1000 można zaobserwować taką samą tendencję
Najwyższy poziom mineralizacji wykazują komórki hodowane w DM,
w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.
zależność można zaobserwować w przypadku membrany PEG 1000;
mineralizacja występuje w przypadku górnej powierzchni membrany. W przypadku ob
membran obserwujemy istotną statystycznie, wyższą mineralizację komórek niż na próbie
Badania mineralizacji zostały również przeprowadzone dla membran inkubowanych
bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.
aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca
hodowli w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają
w stosunku do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05;
oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01.
wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
87
zaobserwować taką samą tendencję.
hodowane w DM, na górnej stronie
w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.
ny PEG 1000; wyższa
górnej powierzchni membrany. W przypadku obydwu
komórek niż na próbie
Badania mineralizacji zostały również przeprowadzone dla membran inkubowanych
bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.
stężenie Ca+2 (B) hMSC
w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają
p <0,05; **p <0,001. Kółka
oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01. Maksymalne
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4.2.3. Morfologia komórek
Obserwacje morfologii obydwu rodzajów komórek prze
SEM. Zdjęcia zostały wykonane po 24 h (R
(Rys. 49 i 50).
Rys. 47 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych prze
membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
Po 24 h obecność pojedynczych komórek została
komórki posiadały wielokątne kształty,
powierzchni materiałów za pomocą licznych pseudopodiów
w obydwu membranach fibroblasty (Rys. 47
kształt niż hMSC (Rys. 47
fibroblastów (Rys. 49 A, B; R
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
komórek
Obserwacje morfologii obydwu rodzajów komórek przeprowadzono przy uż
ły wykonane po 24 h (Rys. 47 i 48) oraz po
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych prze
membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
obecność pojedynczych komórek została potwierdzona na wszystkich
wielokątne kształty, były dobrze rozpłaszczone i przylegały
za pomocą licznych pseudopodiów. Widoczne jest
fibroblasty (Rys. 47 A, B; Rys. 48 A, B) maj
kształt niż hMSC (Rys. 47 C, D; Rys. 48 C, D). Po 7 dniach hodowli, w przypadku
A, B; Rys. 50 A, B) i hMSC hodowanych w DM
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
88
prowadzono przy użyciu mikroskopu
) oraz po 7 dniach hodowli
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na
membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
na wszystkich materiałach:
obrze rozpłaszczone i przylegały do
Widoczne jest również, że
A, B) mają bardziej wydłużony
C, D). Po 7 dniach hodowli, w przypadku
(Rys. 49 E, F; Rys. 50
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
E, F), widać że całą powierzchnię
szczelną monowarstwę. HMSC hodowane w B
monowarsty, widoczne są przestrzenie między komórkami, ale komórki są wielokątne
i dobrze rozpłaszczone. Te obserwacje znajdują potwi
(Rys. 47 B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych
w BM jest niższa niż w przypadku DM.
Rys. 48 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowa
membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
powierzchnię membran pokrywają przylegające komórki
szczelną monowarstwę. HMSC hodowane w BM (Rys. 49 C, D; Rys. 50
monowarsty, widoczne są przestrzenie między komórkami, ale komórki są wielokątne
i dobrze rozpłaszczone. Te obserwacje znajdują potwierdzenie w wynikach
B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych
w BM jest niższa niż w przypadku DM.
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowa
00; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
89
komórki, które tworzą
ys. 50 C, D) nie tworzą
monowarsty, widoczne są przestrzenie między komórkami, ale komórki są wielokątne
erdzenie w wynikach badań LDH
B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na
00; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 49 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
przez 14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
(B, D, F).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
90
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 50 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
przez 14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
(B, D, F).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
91
Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych
14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
92
2.4.2.4. Dyskusja wyników
Przedstawione powyżej badania biologiczne pokazały, że fibroblasty rosną dobrze na
wszystkich powierzchniach membran, niezależnie od ich chropowatości. Co więcej, liczba
komórek na badanych materiałach była porównywalna do liczby komórek na próbie
kontrolnej TCPS (Rys. 34 A). Uzyskane wyniki nie są zgodne z doniesieniami
literaturowymi, z których wynika, że chropowatość powierzchni ma wpływ na zachowanie
fibroblastów [94, 95]. W przypadku hMSC hodowanych w medium podstawowym (BM)
można zauważyć tendencję, że komórki rosną lepiej na mniej chropowatych stronach
membran (Rys. 34 B). Zależność tą widać również w przypadku komórek hodowanych
w medium różnicującym (DM) w przypadku membrany PEG 1000. Z drugiej strony,
w przypadku membrany PEG 400, liczba komórek była nieznacznie niższa dla mniej
chropowatej powierzchni, jednakże w tym przypadku nie zaobserwowano różnic istotnych
statystycznie pomiędzy wynikami. Z literatury wiadome jest, że na zachowanie komórek mają
wpływ nie tylko warunki hodowli, ale również fizyczne i chemiczne parametry powierzchni
[96], takie jak wielkość porów czy chropowatość powierzchni oraz ich skala (nano-, mikro-)
[97, 98]. Na podstawie wyników przedstawionych na Rys. 45 można wnioskować, że
w przypadku badanych membran chropowatość powierzchni nie wpływa istotnie na
proliferację fibroblastów, natomiast hMSC rosną lepiej na powierzchniach, gdzie
chropowatość jest niższa niż ~1000 nm (Tabela, 3 pkt. 2.2.2). Ponadto, również różnicowanie
i mineralizacja komórek zależą, nie tylko od liczby komórek, ale także od chropowatości
powierzchni. Najmniejszą liczbę komórek zaobserwowano na najbardziej chropowatej
powierzchni, tj. dolnej powierzchni membrany PEG 1000 i dla tych membran obserwowano
również najniższy poziom różnicowania i mineralizacji (Rys. 46 A, B). Największą liczbę
komórek zaobserwowano w przypadku górnej powierzchni membrany PEG 1000, ale stopień
różnicowania i mineralizacji był niższy niż w przypadku obydwu powierzchni membrany
PEG 400.
Przedstawione wyniki sugerują, że membrana PEG 400 posiada korzystniejszą
topografię powierzchni dla hMSC niż membrana PEG 1000 ponieważ pomimo niższej
proliferacji komórki wykazują lepsze zróżnicowanie oraz wyższą mineralizację. Co więcej
widać, że w przypadku membrany PEG 400, gdzie różnica w budowie górnej i dolnej
powierzchni była niewielka (Ra góra ~ 390 nm, Ra dół ~ 460 nm) również nie zauważono
znaczących różnic pomiędzy proliferacją, różnicowaniem i mineralizacją hMSC. Zauważalna
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
93
jest jedynie tendencja, że na powierzchni górnej pomimo niższej proliferacji obserwujemy
nieznacznie lepsze różnicowanie i mineralizację [99]. Obserwacje morfologii komórek
(Rys. 47 – 50) nie uwidoczniły żadnych nieprawidłowości – na wszystkich badanych
materiałach komórki są dobrze rozpłaszczone, posiadają wrzecionowate i wielokątne kształty.
Przedstawione wyniki jeszcze raz potwierdziły biozgodność badanych membran, jak również
pokazały, że dzięki modyfikacjom właściwości powierzchni i budowy mikrostrukturalnej
proponowanych materiałów, możliwe jest kształtowanie optymalnych warunków do wzrostu
i różnicowania komórek kostnych.
2.4.3. Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne
komórki macierzyste
Na podstawie wyników badań przedstawionych w pkt. 2.6.2. zdecydowano, że dalsze badania
będą prowadzone na jednej stronie membran. Wybrano górne powierzchnie membran. Taki
wybór został podyktowany faktem, że dla fibroblastów strona membrany nie wpływała na
proliferację, natomiast w przypadku hMSC górna powierzchnia membrany wywierała
korzystniejszy wpływ na namnażanie i różnicowanie się komórek. Szczegóły prowadzenia
hodowli zostały opisane w pkt. 1.7.3.
2.4.3.1. Proliferacja komórek
Badania wykazały, że proliferacja fibroblastów hodowanych w kokulturze z hMSC jest niższa
niż dla próby kontrolnej TCPS (Rys. 51). Wyniki pokazują również, że liczba komórek dla
membrany PEG 1000 (~ 52 tys.) jest mniejsza niż dla membrany PEG 400 (~ 65 tys.).
Po 7 dniach proliferacja komórek na membranie PEG 400 była wyższa, ale po 14 dniach
liczby komórek były podobne dla obydwu membran. Między 14 a 21 dniem odnotowano
najszybszą proliferację komórek (~ 60%). W przypadku membrany PEG 1000 między 21 a 28
dniem proliferacja była niewielka. Biorąc pod uwagę, że w drugim eksperymencie
(pkt. 2.6.2.) proliferacja fibroblastów na membranach była zbliżona do proliferacji na próbie
kontrolnej TCPS (Rys. 45 A), to można zauważyć, że proliferacja fibroblastów w kokulturze
jest inhibitowana przez obecność hMSC.
Na Rys. 52 przedstawiono wyniki badań proliferacji hMSC hodowanych w kokulturze
z fibroblastami w medium różnicującym (DM). Jak widać na wykresie proliferacja hMSC na
membranach jest wyższa niż proliferacja hMSC na próbie kontrolnej TCPS. Liczba komórek
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
po 28 dniach hodowli na obydwu membranac
w przypadku fibroblastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14
(~ 65%). Porównując otrzymane wyniki z wynik
można zauważyć, że proliferacja hMSC w ko
komórki rosły bez kontaktu z fibroblastami (R
Przedstawione wyniki ba
o wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy komórkami.
Rys. 51 Proliferacja fibroblastów hodowanych w ko
podstawie pomiaru stężenia
istotność statystyczną względem
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
na obydwu membranach, jest podobna (~ 44 tys
blastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14
Porównując otrzymane wyniki z wynikami z drugiego eksperymentu (pkt. 2.6.2.)
ażyć, że proliferacja hMSC w kokulturze jest wyższa niż w przypadku kiedy
bez kontaktu z fibroblastami (Rys. 45 B).
Przedstawione wyniki badania proliferacji komórek w kokulturze mogą świad
o wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy komórkami.
ja fibroblastów hodowanych w kokulturze z hMSC, wyznaczo
podstawie pomiaru stężenia LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki
względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; ***p <0,001.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
94
h, jest podobna (~ 44 tys.). Podobnie jak
blastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14 a 21 dniem
ami z drugiego eksperymentu (pkt. 2.6.2.)
kulturze jest wyższa niż w przypadku kiedy
kulturze mogą świadczyć
kulturze z hMSC, wyznaczona na
LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają
p <0,001.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 52 Proliferacja hMSC hodowanych w ko
podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki
istotność statystyczną względem
2.4.3.2. Różnicowanie i mineralizacja
Badania różnicowania komórek (R
inkubacji. Poziom ALP dla próby kontrolnej TCPS był wyższy niż dla badanych membran.
Biorąc pod uwagę liczbę komórek (R
proliferacji (wyższej niż dla próby kontrolnej TCPS)
Również mineralizacja komórek (R
membranach niż na próbie kontrolnej
DM niż BM. Wyższą mineralizację
Ca+2 odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było
również porównywalne do
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
oliferacja hMSC hodowanych w kokulturze z fibroblastami, wyznaczona na
podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki
istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,01.
óżnicowanie i mineralizacja komórek
omórek (Rys. 53 A) pokazały najwyższy poziom ALP po 21 dniach
inkubacji. Poziom ALP dla próby kontrolnej TCPS był wyższy niż dla badanych membran.
orąc pod uwagę liczbę komórek (Rys. 52) można zauważyć, że pomimo wysokiej
proliferacji (wyższej niż dla próby kontrolnej TCPS) stopień różnicowani
Również mineralizacja komórek (Rys. 53 B) była niższa dla komórek hodowanych na
membranach niż na próbie kontrolnej. Poziom mineralizacji komórek był wyższy w medium
DM niż BM. Wyższą mineralizację obserwowano po 28 dniach. Najwyższe stężenie jonów
odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było
próby kontrolnej TCPS.
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
95
z fibroblastami, wyznaczona na
podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają
p <0,01.
pokazały najwyższy poziom ALP po 21 dniach
inkubacji. Poziom ALP dla próby kontrolnej TCPS był wyższy niż dla badanych membran.
można zauważyć, że pomimo wysokiej
różnicowania komórek był niski.
B) była niższa dla komórek hodowanych na
neralizacji komórek był wyższy w medium
obserwowano po 28 dniach. Najwyższe stężenie jonów
odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 53 Różnicowanie – aktywność ALP (A
hodowanych w kokulturze z fibroblastami, mierzone
rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki
kontrolnej TCPS: *p <0,05;
mediami BM i DM: ■■■p < 0,0
przyjęto jako 100%.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca
lturze z fibroblastami, mierzone po 21 i 28 dniach inkubacji w dwóch
rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną
p <0,05; **p <0,001. Kwadraty oznaczają istotność statystyczną pomiędzy
p < 0,001. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS)
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
96
stężenie Ca+2 (B) hMSC
dniach inkubacji w dwóch
czną względem grupy
totność statystyczną pomiędzy
Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4.3.3. Morfologia komórek
Na obrazach z mikroskopu fluorescencyjnego
hodowane w kokulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.
Widoczne są jądra wybarwione na
zielono) takie jak osteonektyna dla hMSC
liczby jąder można oszacować, że liczba hMSC w ko
kontrolnej (Rys. 54 A, B). Odwrotne zjawisko występuje
liczba komórek w kokulturze jest niższa
Obserwacje te zgadzają się z
Rys. 54 Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibr
w kokulturze (A, C) oraz w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400
dniach hodowli. Barwienie fluorescencyjne: DAPI,
(fibroblasty).
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
komórek
mikroskopu fluorescencyjnego (Rys. 54) widać, ż
kulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.
wybarwione na kolor niebieski oraz specyficzne białka (wybarwione na
steonektyna dla hMSC oraz wimentyna dla fibroblastów.
oszacować, że liczba hMSC w kokulturze jest wy
A, B). Odwrotne zjawisko występuje w przypadku fibroblastów,
kulturze jest niższa niż dla próby kontrolnej TCPS (R
Obserwacje te zgadzają się z wynikami badań proliferacji (Rys. 51, 52).
Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibroblastów (C, D) hodowanych
w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400
Barwienie fluorescencyjne: DAPI, osteonektyna (hMSC)
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
97
) widać, że zarówno komórki
kulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.
oraz specyficzne białka (wybarwione na
oraz wimentyna dla fibroblastów. Na podstawie
kulturze jest wyższa niż dla próby
w przypadku fibroblastów, gdzie
niż dla próby kontrolnej TCPS (Rys. 54 C, D).
).
oblastów (C, D) hodowanych
w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400 po 28
(hMSC) i wimentyna
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2.4.3.4. Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym
Ostatnim etapem badań by
jakie panują w organizmie żywym.
wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani
charakter pilotażowy, a przedstawione wyniki obrazują
modelu.
Największym problemem był
kiedy insert był obrócony. Wynikało to z
insert nie pływał, a jednocześnie poziom medium
wyschły i komórki nie uległy uszkodzeniu. Do osadzenia
fibroblasty, z tego względu, że ich adhezja i proliferacja przebiega
Na Rys. 54 przedstawiono
rozpoczęcia eksperymentu.
bardzo mała (Rys. 55 A)
kontrolnej TCPS. Taki wynik mógł świadczyć o tym, że liczba fibroblastów osadzonych na
membranie była za mała, ale również
do powierzchni i uległa odczepieniu
po 14 dniach hodowli (R
części membrany jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na
próbie kontrolnej (Rys. 56
liczby komórek fibroblasty
również zdjęcia hMSC (Rys. 56
nie zauważono różnic między
kontrolnej TCPS.
Rys. 55 Morfologia fibroblastów
odwróconym insercie (A) i
h, zdjęcia wykonane przy 5
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym
ań była próba stworzenia warunków jak najbardziej zbliżonych do tych
jakie panują w organizmie żywym. Szczegóły hodowli oraz schemat przedstawiający sposób
wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani
a przedstawione wyniki obrazują możliwość rozwoju opracowanego
Największym problemem było osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie
kiedy insert był obrócony. Wynikało to z konieczności zapewnienia takich waru
, a jednocześnie poziom medium był na tyle wysoki
nie uległy uszkodzeniu. Do osadzenia na dolnej stronie zostały wybrane
fibroblasty, z tego względu, że ich adhezja i proliferacja przebiegają s
przedstawiono zdjęcia membrany i płytki hodowlanej wykonane po 24 h od
rozpoczęcia eksperymentu. Jak można zauważyć liczba fibroblastów
w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie
kontrolnej TCPS. Taki wynik mógł świadczyć o tym, że liczba fibroblastów osadzonych na
membranie była za mała, ale również, że część komórek nie przylgnęła
egła odczepieniu po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzon
hodowli (Rys. 56) pokazują, że liczba fibroblastów hodowanych
jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na
ys. 56 A, C). Świadczy to o tym, że pomimo niewielkiej początkowej
liczby komórek fibroblasty zaadherowały do podłoża i zaczęły się namnażać.
ys. 56 B, D). Również w tym przypadku, co jest bardzo korzystne,
między morfologią i liczbą komórek na membranie
ibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany
odwróconym insercie (A) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (B).
djęcia wykonane przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
98
jak najbardziej zbliżonych do tych
Szczegóły hodowli oraz schemat przedstawiający sposób
wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badania miały
możliwość rozwoju opracowanego
osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie
konieczności zapewnienia takich warunków, aby
na tyle wysoki, aby membrany nie
na dolnej stronie zostały wybrane
ją szybciej niż hMSC.
wykonane po 24 h od
Jak można zauważyć liczba fibroblastów na membranie jest
w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie
kontrolnej TCPS. Taki wynik mógł świadczyć o tym, że liczba fibroblastów osadzonych na
ła wystarczająco mocno
po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzone
hodowanych na dolnej
jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na
o tym, że pomimo niewielkiej początkowej
i zaczęły się namnażać. Wykonano
, co jest bardzo korzystne,
na membranie, i na próbie
powierzchni membrany przy
TCPS (B). Czas hodowli 24
po wybarwieniu MTT.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Rys. 56 Morfologia fibroblastów
hodowanych na górnej powierzchni
TCPS (C, D). Czas hodowli
wybarwieniu MTT.
2.4.3.5. Dyskusja wyników
Głównym celem badań w ko
ludzkie fibroblasty i hMSC
po wszczepieniu, będą reagowały na właściwości mikrostrukturalne membran. Wiadome jest,
że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i ko
się ze sobą, co wpływa na ich proliferację czy różnicowanie
w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, będące znacznie bardziej
zaawansowanym sposobem badań cytozgodności nowych biomateriałów.
Przedstawione wyniki
fibroblastów jest niższa niż na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotną sytuację
obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest
znacząco niższa niż na membranach (
proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), można
zauważyć, że proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest niższa
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany (A)
powierzchni membrany (B) i w próbie kontrolnej
hodowli 14 dni, zdjęcia wykonano przy 5-krotnym powiększeniu
Dyskusja wyników
Głównym celem badań w kokulturach komórkowych było sprawdzenie czy komórki
ludzkie fibroblasty i hMSC – z którymi materiał będzie miał kontakt w organizmie ludzkim
po wszczepieniu, będą reagowały na właściwości mikrostrukturalne membran. Wiadome jest,
że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i ko
się ze sobą, co wpływa na ich proliferację czy różnicowanie [100
w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, będące znacznie bardziej
zaawansowanym sposobem badań cytozgodności nowych biomateriałów.
Przedstawione wyniki proliferacji pokazują, że na obydwu membranach liczba
fibroblastów jest niższa niż na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotną sytuację
obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest
znacząco niższa niż na membranach (Rys. 52). Porównując otrzymane wyniki
proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), można
zauważyć, że proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest niższa
I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
99
powierzchni membrany (A) i hMSC
i w próbie kontrolnej – na dnie płytki
krotnym powiększeniu po
kulturach komórkowych było sprawdzenie czy komórki –
z którymi materiał będzie miał kontakt w organizmie ludzkim
po wszczepieniu, będą reagowały na właściwości mikrostrukturalne membran. Wiadome jest,
że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i komunikują
100, 101, 102]. Dlatego
w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, będące znacznie bardziej
zaawansowanym sposobem badań cytozgodności nowych biomateriałów.
proliferacji pokazują, że na obydwu membranach liczba
fibroblastów jest niższa niż na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotną sytuację
obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest
równując otrzymane wyniki z wynikami
proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), można
zauważyć, że proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest niższa
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
100
w kokulturach niż w separowanych warunkach (Rys. 51, Rys. 45 A). Biorąc również pod
uwagę, że w separowanych warunkach proliferacja fibroblastów była porównywalna do próby
kontrolnej TCPS, a w przypadku kokultury liczba fibroblastów była znacząco niższa niż na
TCPS, można stwierdzić, że proliferacja fibroblastów jest obniżona na skutek obecności
hMSC. Dla hMSC obserwujemy odwrotną zależność. Liczba komórek hodowanych na
membranach, w kokulturze jest istotnie wyższa niż na próbie kontrolnej TCPS
i w porównaniu do hodowli w separowanych warunkach (Rys. 52, Rys. 45 B). Przedstawione
wyniki sugerują, że hMSC rosną lepiej jeśli mają kontakt z fibroblastami. Niemniej jednak,
pomimo wysokiego poziomu proliferacji hMSC, w kokulturze, zaobserwowano niski stopień
różnicowania i mineralizacji hMSC (Rys. 53 A, B). W separowanych warunkach liczba
komórek była niższa niż na próbie kontrolnej, a mimo to zarówno poziom ALP jak
i mineralizacji były wyższe dla komórek hodowanych na membranach, w porównaniu do
próby kontrolnej (Rys. 46 A, B). Z tej zależności wynika wniosek, że obecność fibroblastów
korzystnie wpływa na proliferację hMSC, ale powoduje również osłabienie ich różnicowania
i mineralizacji. Obserwacje morfologii nie uwidoczniły istotnych zmian w budowie komórek
hodowanych w kokulturze (Rys. 54).
Wyniki badań w kokulturach, w modelu symulującym warunki panujące w organizmie
żywym dowodzą, że możliwa jest hodowla in vitro w układzie polegającym na jednoczesnej
hodowli fibroblastów oraz hMSC na obu stronach membrany. Jednakże, względu na problem
z osadzeniem komórek na dolnej części membrany zastosowany model powinien zostać
udoskonalony, tak aby możliwe było uzyskanie powtarzalnych warunków hodowli, a dzięki
temu wiarygodnych wyników badań.
Podsumowując, przeprowadzone badania membran w kokulturach komórkowych
pokazały, że badane membrany są cytozgodne w warunkach jednoczesnego kontaktu z oboma
typami komórek. Co ważniejsze, zauważono że w warunkach kokultur komórkowych
fibroblasty mające kontakt z membraną proliferują wolniej niż hMSC. Taki wynik sugeruje,
że opracowane membrany będą spełniać swoją funkcję jako bariera przeciwdziałająca
wnikaniu miękkiej tkanki łącznej (wytwarzanej przez fibroblasty) do miejsca ubytku
kostnego. Zapewnią zatem korzystne warunki do odtworzenia się tkanki kostnej.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
101
3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI
Przeprowadzone w rozprawie badania dotyczyły możliwości wykorzystania
kopolimeru laktydu i glikolidu (PLGA), przetworzonego w postać membran jako materiałów
do sterowanej regeneracji tkanek (GTR) w periodontologii. Zakres badań obejmował zarówno
otrzymanie materiału w postaci membran i badania ich właściwości fizykochemicznych oraz
biologicznych.
W części teoretycznej pracy (część I) przedstawiono zagadnienia dotyczące genezy
chorób przyzębia oraz metod ich leczenia (rozdział 2 i 3), skupiając się na metodzie
regeneracyjnej. Metoda ta opiera się na zastosowaniu techniki (GTR), która zakłada użycie
materiału w postaci membrany, izolującej tkanki dziąsła od ubytku kostnego i stwarzającej
korzystne warunki do odbudowy tkanki kostnej. Następnie przedstawiono przegląd literatury
dotyczącej materiałów wykorzystywanych w technice GTR (rozdział 4). Uwzględniono
wymagania jakie stawia się takim materiałom, a następnie ocenie poddano materiały, które
obecnie stosowane są do leczenia chorób przyzębia. Przedstawiono ich charakterystykę jak
również zalety i wady, wskazując na to jakie parametry należałoby zmodyfikować, aby
uzyskać materiał o jak najlepszych właściwościach dla zastosowania w GTR.
W części II pracy przedstawiono cel i tezę rozprawy oraz pokrótce opisano
zrealizowane zadania cząstkowe.
W części doświadczalnej (część III) scharakteryzowano użyte materiały, tj. polimer
matrycowy PLGA oraz poli(glikol etylenowy) – PEG, wykorzystany jako porogen, opisano
metodę otrzymywania membran, a następnie scharakteryzowano metody badań otrzymanych
materiałów (rozdział 1). Następnie przedstawiono uzyskane wyniki i poddano je analizie
(rozdział 2).
W pierwszej kolejności otrzymane membrany scharakteryzowano pod względem budowy –
makro- i mikrostrukturalnej oraz właściwości fizycznych i chemicznych (podrozdz. 2.1, 2.2).
Ustalono optymalne stężenie porogenu, zapewniające maksymalną porowatość przy
jednoczesnym zachowaniu ciągłości struktury membrany. Zbadano również wpływ masy
cząsteczkowej porogenu na mikrostrukturę membran. Przeprowadzone badania zostały
uzupełnione o pomiary szybkości odparowywania rozpuszczalnika, co pozwoliło na
zaproponowanie mechanizmu tworzenia się membran. Badania wykazały, że w układzie
PLGA/PEG/dichlorometan dochodzi do spontanicznej separacji faz, która jest spowodowana
różnicą współczynników rozpuszczalności oraz swobodnych energii powierzchniowych
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
102
użytych polimerów. W przypadku stężenia porogenu (mniejszego lub równego 60%), PEG
tworzy izolowane, kuliste wydzielenia równomiernie rozłożone w całej objętości blendy.
Wraz ze wzrostem stężenia PEG (powyżej 70%) rośnie liczba wydzieleń, a faza PEG staje się
fazą ciągłą powodując jednocześnie nieciągłość drugiej fazy, tj. polimeru matrycowego
PLGA. Badania przeprowadzone z użyciem różnych mas cząsteczkowych porogenu
wykazały, że w przypadku kiedy masa cząsteczkowa PEG jest niska (300 Da) w matrycy
PLGA tworzy się duża liczba niewielkich i kulistych wydzieleń PEG. Wraz ze wzrostem
masy cząsteczkowej PEG liczba wydzieleń maleje, ale rośnie ich rozmiar. Uwzględniając
wyniki pomiarów szybkości odparowania rozpuszczalnika wysunięto wniosek, że tworząca
się asymetryczna mikrostruktura jest wynikiem sedymentacji oraz łączenia się ze sobą dużych
wtrąceń PEG, które akumulują się przy dolnej powierzchni membran. Dzięki zdobytej wiedzy
możliwe było sterowanie procesem otrzymywania membran, co w efekcie pozwoliło uzyskać
membrany o najbardziej pożądanych i najlepiej zdefiniowanych właściwościach
z punktu widzenia medycyny.
W drugim etapie pracy najbardziej obiecujące membrany zostały poddane badaniom
degradacji w płynie PBS (podrozdz. 2.3). Celem badań było określenie kinetyki
i mechanizmu degradacji, a co za tym idzie, ich przydatności w technice GTR. Wcześniejsze
badania degradacji użytego polimeru obejmowały badania PLGA w postaci rusztowań lub
folii, dlatego istotnym elementem niniejszej pracy było sprawdzenie czy inna budowa
mikrostrukturalna otrzymanych materiałów nie wpłynęła w znaczący sposób na mechanizm
i kinetykę degradacji. Otrzymane wyniki badań potwierdziły, że PLGA w postaci membrany
degraduje w sposób heterogeniczny w masie. Oprócz tego czas degradacji membran, który
okazał się być porównywalny do czasu degradacji folii oraz wytrzymałość po degradacji,
która jest podobna do tej z doniesień literaturowych, świadczą o tym, że membrana będzie
zapewniać odpowiednie warunki dla odtwarzającej się w miejscu ubytku nowej tkanki
kostnej.
Ostatnią grupą badań były badania biologiczne in vitro (podrozdz. 2.4). Badania te zostały
podzielone na trzy etapy, tj. od podstawowych do najbardziej zaawansowanych. Pierwsze
badania zostały przeprowadzone z wykorzystaniem komórek osteoblastopodobnych MG-63
(podrozdz. 2.4.1). Do badań zostały wytypowane trzy membrany otrzymane z 60% udziałem
wagowym PEG o różnych masach cząsteczkowych: 300 Da, 400 Da i 1000 Da. Oprócz tego
badaniom poddano obie powierzchnie membran: górną, która w trakcie procesu
otrzymywania miała kontakt z powietrzem i dolną, które w trakcie procesu otrzymywania
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
103
miała kontakt ze szklaną powierzchnią szalki Petriego. Celem tych badań było sprawdzenie
jak PLGA w postaci membran o różnej mikrostrukturze i porowatości będzie zachowywał się
w kontakcie z komórkami oraz czy różna chropowatość poszczególnych powierzchni
membran wpływa na proliferację i różnicowanie komórek. Test żywotności komórek MTT
pokazał, że komórki dobrze adherują i proliferują na wszystkich badanych materiałach,
a różnice miedzy poszczególnymi powierzchniami są stosunkowo niewielkie, ale istotne
statystycznie. Badanie poziomu tlenku azotu nie wykazało żadnych nieprawidłowości
w hodowli i było zgodne z badaniem MTT. Obserwacje morfologii komórek również
zgadzały się z wynikami wcześniejszych badań i pokazały, że komórki hodowane na
membranach miały wrzecionowaty, wielokątny kształt i były dobrze rozpłaszczone. Badania
te wykazały, że przetworzony w postać membrany PLGA jest cytozgodny, a jego
mikrostruktura wpływa na zachowanie się komórek.
Na podstawie uzyskanych wyników do dalszych badań komórkowych wytypowano
membrany PEG 400 i PEG 1000 (podrozdz. 2.4.2). Taki wybór został również podyktowany
faktem, że z założenia membrana do GTR powinna posiadać asymetryczną budowę,
w wyniku czego wybrano dwie membrany istotnie różniące się mikrostrukturą – membranę
uzyskaną za pomocą PEG 400 charakteryzującą się niewielką asymetrycznością i najbardziej
asymetryczną membranę otrzymaną przy udziale PEG 1000. Hodowla komórek była
prowadzona na obu powierzchniach membran (górnej i dolnej). Badania zostały
przeprowadzone z wykorzystaniem ludzkich komórek – fibroblastów oraz ludzkich
mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), czyli komórek z którymi membrana
będzie miała kontakt w po wszczepieniu do organizmu ludzkiego. Przedstawione wyniki
pokazują, że komórki fibroblastów proliferują na jednakowym poziome niezależnie od
rodzaju materiału, a liczba komórek jest porównywalna do liczby komórek na próbce
kontrolnej TCPS. W przypadku hMSC różnice w proliferacji są bardziej widoczne. Liczba
komórek jest większa w medium różnicującym (DM) niż medium podstawowym (BM).
Istotne statystycznie różnice widać było również pomiędzy stronami membran – najwięcej
komórek zaobserwowano na górnej powierzchni membrany PEG 1000, a najmniej na dolnej
powierzchni membrany PEG 1000. Znaczące różnice obserwowane były również
w przypadku różnicowania (poziom ALP) i mineralizacji komórek. Wyniki pokazały, że
najbardziej zróżnicowane i zmineralizowane komórki znajdowały się na membranie PEG 400.
Taki wynik może świadczyć o tym, że ta membrana posiada korzystniejszą mikrostrukturę dla
różnicujących się komórek, ponieważ pomimo mniejszej ich liczby (w porównaniu do górnej
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
104
powierzchni membrany PEG 1000), komórki macierzyste łatwiej różnicują się w kierunku
osteoblastów. Obserwacja komórek, za pomocą metod mikroskopowych, nie pokazała
żadnych nieprawidłowości w ich morfologii. Już po 24 h na powierzchniach membran można
było zaobserwować pojedyncze, ale dobrze rozpłaszczone komórki o wrzecionowatych
kształtach, a po 7 dniach komórki tworzyły szczelnie przylegającą do powierzchni materiału
monowarstwę. Budowa mikrostrukturalna membran miała wpływ nie tylko na proliferację,
ale również na różnicowanie i mineralizację hMSC.
W ostatnim etapie badań biologicznych hodowla była prowadzona w kokulturach
komórkowych (podrozdz. 2.4.3); wykorzystano te same komórki, tj. ludzkie fibroblasty
i hMSC, ale były one hodowane na górnych stronach membran PEG 400 i PEG 1000. Takie
rozwiązanie zostało podyktowane faktem, że w wyżej opisanym eksperymencie dowiedziono,
że fibroblasty rosły dobrze, niezależnie od strony membrany, natomiast hMSC wykazywały
wyższą proliferację na górnych powierzchniach membran. Eksperyment w kokulturze
komórkowej miał na celu sprawdzenie zachowania membran w warunkach najbardziej
zbliżonych do warunków jakie panują w organizmie żywym. Uzyskane wyniki pokazały, że
w warunkach kokultury komórkowej fibroblasty hodowane na membranach wykazują niższą
proliferację niż na próbie kontrolnej TCPS. Odwrotne zjawisko zaobserwowano w przypadku
hMSC, gdzie liczba komórek hodowanych na membranie była wyższa niż na próbie
kontrolnej TCPS. Porównując uzyskane wyniki z wynikami wcześniejszych badań można
wnioskować, że proliferacja fibroblastów kontakcie z hMSC została wyhamowana,
a proliferacja hMSC, jest lepsza w kontakcie z fibroblastami niż w separowanych warunkach.
Jednakże pomimo wyższej liczby hMSC ich stopień zróżnicowania i mineralizacji był niższy
niż komórek z próby kontrolnej, co było najprawdopodobniej wynikiem oddziaływania
między komórkami, poprzez rozpuszczalne w medium cytokininy. Przemawia również za tym
fakt, że tak samo jak w poprzednich eksperymentach, obserwacje morfologii komórek nie
wykazały żadnych nieprawidłowości w ich budowie.
Reasumując, przeprowadzone badania potwierdziły tezę postawioną w rozprawie, iż
możliwe jest otrzymanie materiału w postaci resorbowalnej membrany o zdefiniowanej
mikrostrukturze, charakteryzującego się niewłóknistą asymetryczną budową. Zaproponowany
w pracy mechanizm separacji faz w układzie PLGA/PEG/rozpuszczalnik w zależności od
stężenia porogenu i jego masy cząsteczkowej pozwala na kontrolowanie mikrostruktury
i właściwości fizykochemicznych produkowanych membran. Przeprowadzone badania
biologiczne potwierdziły, że mikrostruktura membran ma istotny wpływ na zachowanie
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
105
komórek, co stwarza wiele możliwości doboru optymalnych warunków dla odbudowy tkanki
kostnej.
Uzyskane wyniki badań pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków:
1. Opracowano skuteczną metodę otrzymywania resorbowalnych membran opierającą się
na separacji faz w układzie PLGA/PEG/dichlorometan, która polegała na odlewaniu
z roztworu i wypłukiwaniu porogenu.
2. Optymalne stężenie porogenu, użytego do otrzymania membrany, zostało ustalone na
60% wagowych, ponieważ przy takim stężeniu otrzymywane membrany mają
maksymalną porowatość przy jednoczesnym zachowaniu homogeniczności i przy
najkorzystniejszych parametrach mechanicznych.
3. Przeprowadzone badania pozwoliły na zaproponowanie mechanizmu tworzenia się
membran oraz wpływu stężenia porogenu i jego masy cząsteczkowej na mikrostrukturę
membran.
4. Masa cząsteczkowa użytego porogenu ma istotny wpływ na budowę mikrostrukturalną
materiału. W przypadku niskiej masy cząsteczkowej PEG otrzymywane membrany
posiadają niewielkie, kuliste pory, które są równomiernie rozłożone w całej objętości
membrany. W miarę wzrostu masy cząsteczkowej rośnie wielkość porów, stają się one
miej kuliste, a ich rozkład w objętości jest mniej jednorodny, w wyniku czego rośnie
asymetryczność otrzymywanych membran.
5. Proces degradacji membran zachodzi w sposób typowy dla poliestrów i oparty na reakcji
hydrolizy. Czas degradacji jest wystarczający, aby materiał spełnił swoją funkcję jako
materiał barierowy, zapewniając warunki korzystne do odbudowy struktury tkanki
kostnej w miejscu ubytku.
6. Przeprowadzone badania in vitro z wykorzystaniem komórek osteoblastopodobnych
MG-63 pokazały, że membrany nie są cytotoksyczne.
7. Badania biologiczne z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów i ludzkich komórek
mezenchymalnych (hMSC) pokazały, że oba typy komórek dobrze proliferują na
membranach. Proliferacja fibroblastów nie zależała od rodzaju i mikrostruktury
membran, natomiast proliferacja hMSC zależała od porowatości i chropowatości
powierzchni.
III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
106
8. W kokulturze proliferacja fibroblastów została wyhamowana, a proliferacja hMSC była
istotnie wyższa, niż dla próby kontrolnej TCPS, co jest bardzo korzystne z punktu
widzenia GTR.
9. Opracowane membrany spełniają założenia stawiane materiałom do sterowanej
regeneracji tkanek i mogą być brane pod uwagę jako potencjalny materiał do zastosowań
w medycynie.
IV STRESZCZENIE __________________________________________________________________________
107
IV STRESZCZENIE
Celem przedstawionej pracy było opracowanie nowego materiału membranowego
przeznaczonego do leczenia ubytków tkanki kostnej w periodontologii i chirurgii
stomatologicznej zgodnie z założeniami sterowanej regeneracji tkanek (GTR). Dotychczas
używane membrany GTR wytwarza się głównie z kolagenu lub syntetycznych polimerów
resorbowalnych i nadaje im się formę włóknistą, przez co ich mikrostruktura i porowatość są
trudne do kontrolowania. Proponowane w tej pracy rozwiązanie umożliwia otrzymanie
niewłóknistych, anizotropowych membran o zdefiniowanej budowie mikrostrukturalnej.
W pierwszym etapie pracy podjęte zostały badania nad otrzymaniem szeregu
membran polimerowych z kopolimeru L-laktydu z glikolidem za pomocą metody separacji
faz z wykorzystaniem poli(glikolidu etylenowego) jako porogenu. Po otrzymaniu membrany
zostały poddane badaniom mającym na celu scharakteryzowanie ich mikrostruktury
i właściwości mechanicznych oraz powierzchniowych. Kolejnym krokiem było
przeprowadzenie badań degradacji w warunkach symulujących środowisko biologiczne.
Badania te pozwoliły na określenie mechanizmu i czasu degradacji materiału w postaci
membrany. Następnie membrany przebadano w warunkach in vitro. Dzięki badaniom
przeprowadzonym z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63 oraz ludzkimi fibroblastami
i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC) potwierdzono
cytozgodność otrzymanych membran jak również wykazano wpływ porowatości membrany
na proliferację i różnicowanie analizowanych komórek. W ostatnim etapie przeprowadzono
badania z wykorzystaniem kokultur komórkowych, które polegały na jednoczesnej hodowli
komórek tkanki łącznej (fibroblastów) z jednej strony membrany i tkanki kostnej (hMSC)
z drugiej strony membrany. Tak zaprojektowany eksperyment miał na celu przebadanie
wytworzonych membran w warunkach najbardziej zbliżonych do tych, jakie panują
w organizmie żywym.
Efektem końcowym pracy było opracowanie resorbowalnych membran do sterowanej
regeneracji tkanek o ściśle zdefiniowanej budowie mikrostrukturalnej i właściwościach
biologicznych najlepiej przystosowanych do leczenia ubytków tkanki kostnej wywołanych
przez choroby przyzębia.
V SUMMARY __________________________________________________________________________
108
V SUMMARY
The aim of this study was to develop a new membrane material for the treatment of
bone defects in periodontics and oral surgery according to guided tissue regeneration (GTR)
approach. Commercially available membranes used in GTR technique are made from
collagen or resorbable synthetic polymers. They possess a porous, fibrous microstructure
which is difficult to control. The solution proposed in this PhD-thesis allows to obtain
non-fibrous, anisotropic membranes with defined microstructure.
First step of the research was to obtain the range of polymeric membranes from
poly(L-lactide-co-glycolide) using phase separation method, with poly(ethylene glycol) as a
porogen. Afterwards, the material tests of the membranes were conducted, allowing to assess
and characterize the microstructure, as well as mechanical and surface properties. The next
step of the experiment was to determine the degradation of the material under conditions
simulating the biological environment. Those experiments permitted to describe the
mechanism and time of membrane degradation. Subsequently membranes were tested in vitro.
As a result of the experiments conducted with the presence of MG-63 osteoblast-like cells,
human fibroblasts and human mesenchymal stem cells (hMSCs) cytotoxicity of the obtained
membranes was evaluated. In addition the influence of the membrane porosity on
proliferation and differentiation of analyzed cells was determined. Finally, the examination of
the membranes in cell co-cultures was proceeded. The connective tissue cells (fibroblasts)
were cultured on the one side of the membrane simultaneously with the culture of hMSCs on
the other side. This design of the experiment was meant to examine obtained membranes
under the conditions as similar as possible to those prevailing in living organisms.
The final result of the thesis was obtaining resorbable membranes for the guided tissue
regeneration with strictly defined microstructure and biological properties, which were most
suitably adapted for the treatment of bone tissue defects induced by periodontium diseases.
SPIS TABEL __________________________________________________________________________
109
Spis Tabel:
Tabela 1 Charakterystyka porównawcza dostępnych na rynku membran do sterowanej regeneracji tkanek – GTR [11, 15]. .......................................................................................... 26
Tabela 2 Właściwości mechaniczne folii PLGA oraz membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400). ......................................................... 50
Tabela 3 Grubość, procent wypłukania PEG, rozmiar porów i chropowatość membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z 60% udziałem porogenu o różnych masach cząsteczkowych (średnia ± błąd standardowy). .................................................................................................. 57
Tabela 4 Szybkość odparowania rozpuszczalnika i pozostałość rozpuszczalnika w blendach PLGA/PEG. .............................................................................................................................. 59
Tabela 5 Wartości chropowatości (Ra) folii i membran przed i po inkubacji w PBS. ............. 78
SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________
110
Spis Rysunków:
Rys. 1 Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb-dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.). .............................................................................. 9
Rys. 2 Schemat prawidłowego obszaru ząb-dziąsło (A.), obszaru objętego chorobą z widoczna kieszonką dziąsłową i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła zębodołowo-zębowego (B.) oraz obszaru po leczeniu metodą reparacji (C.) i regeneracji (D.) [12]. .......................................................................................................................................... 12
Rys. 3 Schemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchnią dziąsła (A.), proces aktywacji osteoblastów (B.) [12]. ............................................................................................. 14
Rys. 4 Schemat przedstawiający triadę Lyncha [13]. ............................................................... 14
Rys. 5 Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany przeznaczonej do sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych. ............... 16
Rys. 6 Mikrostruktura e-PTFE [25]. ......................................................................................... 18
Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości (d-PTFE, Cytoplast®TXT-200) i z d-PTFE wzmocnionego siatką tytanową (Cytoplast®Ti-250) przeznaczone do GTR [28]. ............................................................................................. 19
Rys. 8 Budowa membrany BioGide® A. powiększenie 40x B. powiększenie 100x, C. strona gładsza, powiększenie 250x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie 10000x [37]. ...... 21
Rys. 9 Budowa membrany Cytoplast® RTM Collagen [28]. .................................................. 21
Rys. 10 Schemat przedstawiający ideę gradientowego materiału funkcjonalnego (FGM). ..... 28
Rys. 11 Schemat membrany FGM [64]. ................................................................................... 29
Rys. 12 Wzór półstrukturalny PLGA ...................................................................................... 33
Rys. 13 Wzór półstrukturalny PEG .......................................................................................... 33
Rys. 14 Schemat otrzymywania membran PLGA .................................................................... 34
Rys. 15 Schemat odparowywania rozpuszczalnika .................................................................. 37
Rys. 16 Schemat hodowli komórkowej MG-63 w insertach i dołkach .................................... 39
Rys. 17 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach ............................... 41
Rys. 18 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach w kokulturze ......... 44
Rys. 19 Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany ....................................... 45
SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________
111
Rys. 20 Morfologia membran otrzymanych z użyciem porogenu PEG 400 o stężeniu wagowym A. 20% , B. 40%, C. 60% i D. 70% ........................................................................ 47
Rys. 21 Mikrofotografia SEM membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG 400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); powierzchnia górna (A, D, G, J), powierzchnia dolna (B, E, H, K) i przełamy (C, F, L, L). .............................................. 48
Rys. 22 Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG. ........................................................................................................................ 49
Rys. 23 Właściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym stężeniu wagowym PEG A. wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania. ............................................................. 50
Rys. 24 Schemat otrzymywania membran PLGA o różnej morfologii w zależności od stężenia PEG ........................................................................................................................................... 53
Rys. 25 Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej masie cząsteczkowej: PEG 300 (A, B, C), PEG 400 (D, E, F), PEG 600 (G, H, I), PEG 1000 (J, K, L), PEG 3400 (M, N, O); górna powierzchnia (A, D, G, J, M), dolna powierzchnia (B, E, H, K, N) i przełamy (C, F, I, L, O). ............................................................................... 55
Rys. 26 Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300 (A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J). ......................................... 56
Rys. 27 Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300 ■, PEG 400 ●, PEG 600 ▲, PEG 1000 ▼, PEG 3400 ►, B. obraz makroskopowy PEG na szalce po odparowaniu rozpuszczalnika. ..... 58
Rys. 28 Widma FTIR-ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend, membran oraz folii PLGA. ....................................................................................................... 60
Rys. 29 Schemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych masach cząsteczkowych. .......................................................................................................... 63
Rys. 30 Makroskopowy obraz foli PLGA (A), membrany PEG 400 (B) oraz membrany PEG 1000 (C) przed i po inkubacji w PBS przez czas od 1 do 24 tygodni. ..................................... 65
Rys. 31 Zależność zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG 1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg. ............................................................. 66
Rys. 32 Zależność pH PBS w funkcji czasu inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg. .................................................................................................................................................. 67
Rys. 33 Wartość kąta zwilżania dla czystej folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C) w funkcji czasu degradacji. .......................................................... 68
SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________
112
Rys. 34 Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG 400 i 1000 przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni A. wytrzymałość (Rm), B. moduł Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (eFmax) i D. wydłużenie całkowite (eFTotal) ............. 70
Rys. 35 Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni dla wybranych próbek folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C). ......................................................................................... 71
Rys. 36 Mikrofotografie SEM czystej folii PLGA A. próbka przed inkubacją w PBS (wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni. ....................... 72
Rys. 37 Mikrofotografie SEM membrany PEG 400 A – C przed degradacją (wyjściowe), D – F po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M – O po 9 tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U – W po 18 tygodniach degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R, T, W; przełamy C, F, I, L, O. .............................................................................................................. 74
Rys. 38 Mikrofotografie SEM membrany PEG 1000 A – C przed degradacją (wyjściowe), D – F po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M – O po 9 tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U – W po 18 tygodniach degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R, T, W; przełamy C, F, I, L, O. .............................................................................................................. 75
Rys. 39 Obrazy topograficzne powierzchni foli PLGA A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ....................................................................................... 76
Rys. 40 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400 A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ......................................................... 77
Rys. 41 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000 A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ......................................................... 77
Rys. 42 Żywotność komórek MG-63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG 1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA: ●●p <0,01; ●●●p < 0,001. ........................ 81
Rys. 43 Poziom NO w nadsączu hodowli komórek MG-63 na membranach PEG 300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS. Brak istotności statystycznej pomiędzy próbkami wg. t-testu. ...................................................................................................................................... 82
Rys. 44 Morfologia komórek MG-63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B), PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia (B, D, F) oraz na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny. ........................................ 83
SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________
113
Rys. 45 Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B) wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 14 dniach hodowli komórek w dwóch rodzajach medium: BM i DM. Kółko oznacza istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05 ............................................... 85
Rys. 46 Różnicowanie – aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca+2 (B) hMSC mierzona po 14 dniach hodowli w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna w stosunku do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100% .................................................. 87
Rys. 47 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D). .................... 88
Rys. 48 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D). .................. 89
Rys. 49 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych przez 14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia (B, D, F). ................................................................................................................................... 90
Rys. 50 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych przez 14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia (B, D, F). ................................................................................................................................... 91
Rys. 51 Proliferacja fibroblastów hodowanych w ko-kulturze z hMSC, wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; ***p <0,001.................... 94
Rys. 52 Proliferacja hMSC hodowanych w ko-kulturze z fibroblastami, wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,01. ...................... 95
Rys. 53 Różnicowanie – aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca+2 (B) hMSC hodowanych w ko-kulturze z fibroblastami, mierzone po 21 i 28 dniach inkubacji w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kwadraty oznaczają istotność statystyczną pomiędzy mediami BM i DM: ■■■p < 0,001. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%. .................................................................................................................. 96
Rys. 54 Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibroblastów (C, D) hodowanych w kokulturze (A, C) oraz w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400 po 28 dniach hodowli. Barwienie fluorescencyjne: DAPI, osteonektyna (hMSC) i wimentyna (fibroblasty). ............................................................................................................................. 97
Rys. 55 Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany przy odwróconym insercie (A) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (B). Czas hodowli 24 h, zdjęcia wykonane przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT. ...................... 98
SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________
114
Rys. 56 Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany (A) i hMSC hodowanych na górnej powierzchni membrany (B) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (C, D). Czas hodowli 14 dni, zdjęcia wykonano przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT. ................................................................................................................... 99
LITERATURA __________________________________________________________________________
115
Literatura:
[1] GUS – „Stan zdrowie ludności Polski w 2004 r.”.
[2] Y. Ikada: Tissue Engineering Fundamentals and Applications, Interface Science and Technology, Vol.8., Elsevier, Amsterdam 2006, 36-42,70-87.
[3] T. Karring, S. Nyman, J. Gottlow, J. Laurell: Development of biological concept of guided tissue regeneration-animal and human studies, Periodontal 2000 1 (1993) 26-35.
[4] F. Yang, S. K. Both, X. Yang, X. F. Walboomers, J. A. Jansen: Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application, Acta Biomaterialia 5 (2009) 3295-3304.
[5] J. D. Bashutski, H-L. Wang: Periodontal and Endodontic Regeneration, JOE, Vol. 35, No 3, 2009.
[6] J. Behring, R. Junker, F. Walboomers, B. Chessnut, J.A. Jansen: Toward Guided Tissue and Bone Regeneration: morphology, attachment, proliferation and migration and cells cultured on collagen barrier membranes. A systematic review, Odontology 96 (2008), 1-11.
[7] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 69-135.
[8] A. Stavropoulous, A. Sculean, T. Karring: GTR treatment of intrabony defects with PLGA/PGA copolymer or collagen bioresorbable membranes in combination with deproteinized bovine bone (Bio-Oss), Clinical Oral Investigation 8 (2004) 3-159.
[9] S. Ivanovski: Periodontal regeneration, Australian Dental Journal 54 (2009) S118-S128.
[10] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 136-146, 209-224.
[11] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 146-192.
[12] T. G. Jr. Wilson: Periodontal regeneration: enhanced clinical applications of enamel matrix proteins, Quintessence Publishing Co. Inc., USA 1999, 1-18.
[13] M. C. Bottino, V. Thomas, G. Schmidt, Y. K. Vohra, T-M. G. chu, M. J. Kowolik, G. M. Janowski: Recent advanced in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration – a materials perspective, Dental Materials 28 (2012) 703-721.
[14] D. Jiang, R. Dziak, S. E. Lynch, E. B. Stephans: Modyfication of an osteoconductive anorganic bovine bone mineral matrix with growth factors, Journal of Periodontology 70 (1999) 834-839.
LITERATURA __________________________________________________________________________
116
[15] A. Cieślik –Bielecka, T. Bielecki, T. S. Gaździk, T. Cieślik: Growth factors in the platelet-rich plasma as autogenic material which stimulates bone healing processes, Journal of Stomatology 59, 7 (2006) 510-517.
[16] D. F. Stamatialis, B. J. Papenburg, M. Girones, S. Saiful, S. N. M. Bettahalli, S. Schmitmeier, M. Wessling: Medical Applications of membranes: Drug delivery, artificial organs and tissue engineering, Journal of Membrane Science 308 (2008) 1-34.
[17] P. Gentile, V. Chiono, Ch. Tondra-Turo, A. M. Ferreira, G. Ciardelli: Polymeric membranes for guided bone regeneration, Review, Biotechnology Journal 6 (2011) 1187-1197.
[18] G. Owen, J. Jacson, B. Chehroudi, D. Brunette, H. Burt: A in vitro study of plasticized poly(lactic-co-glicolic acid) films as possible tissue regeneration membranes: Materials properties and drug release kinetics, Journal of Biomedical Materials Research Part A 3 (2010) 857-869.
[19] A. Sculean, D. Nikolidakis, F. Schwarz: Regeneration of periodontal tissue: combinations of barrier membrane as and grafting materials – biological foundation and preclinical evidence: a systematic review, Journal of Clinical Periodontology 35 (2008) 106-116.
[20] T. Karring: Regenerative periodontal therapy, Journal of the International Academy of Periodontology 2 (2000) 101-109.
[21] S. Liao, W. Wang, M. U. S. Okhawa, T. Akasaka, K. Tamura, et al.: The degradation of three layered nano-carbonated hydroxyapatite/collagen/PLGA composite membrane in vitro, Dental Materials 23 (2007) 1120-1129.
[22] L. S. Nait, C. T. Laurencin: Biodegradable polymers as biomaterials, Progress in Polymer Science 32 (2007) 762-798.
[23] K. Fuijhara, M. Kotaki, S. Ramakrishna: Guided bone regeneration membrane made of policaprolactone/calcium carbonatecomposite nano-fibre, Biomaterials 26 (2005) 4139-4147.
[24] M. Simion, C. Dahlin, K. Blair, R. K. Schen: Effect of different microstructures of e-PTFE membranes on bone regeneration and soft tissue response: a histological study in canine mandible, Clinical Oral Implants Research 10 (1999) 73-84.
[25] Zdjęcie ze strony: http://www.ptfe-membrane.com (2.11.2012).
[26] H. D.Barber, J. Ligneli, B. M. Smith, K. Bartee: Using a dens PTFE membrane without primary closure to achieve bone and tissue regeneration, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 65 (2007) 748-752.
LITERATURA __________________________________________________________________________
117
[27] F. Watzinger, J. Luksch, W. Millesi, C. Achopper, J. Neugebauer, D. Moser, R. Ewers: Guided bone regeneration with titanium membranes: a clinical study, British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 38 (2000) 312-315.
[28] Wykorzystane zdjęcia pochodzą z broszury: Osteogenics clinical education; Implant Site Development and Extraction Site Grafting Manual: Bone Biology & Physiology, Selection of Grafting Materials, Selection of Barrier Membranes, and Surgical Technique, B.K. Bartee, DDs. MD.
[29] E. Milella, P. A. Ramires, E. Brescia,G. La Sala, L. Di Paola, V. Bruno, Physicochemical, mechanical and biological properties of commercial membranes for GTR, Journal of Biomedical Materials Research (Appl Biomater) 58 (2001) 427-435.
[30] S. Zhao, E. M. Pinholt, J. E. Madsen, K. Donath, Histological evaluation of different biodegradable and non-degradable membranes implanted subcutaneously in rats, Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery 28 (2000) 116-122.
[31] B. Alpar, G. Leyhausen, H. Günay, W. Geurtsen: Compatybility of resorbable and nonresorbable guided tissue regeneration membranes in cultures of primary human periodontal ligament fibroblasts and human osteoblast-like cells, Clinical Oral Investigation 4 (2000) 219-225.
[32] A. Kasaj, C. Reichert, H. Gotz, B. Rohig, R. Smeets, B. Willershausen: In vitro evaluation of various bioabsorbable and nonresorbable barrier membranes for guided tissue regeneration, Head & Face Medicine 4 (2008) 22-29.
[33] M. Nałęcz: Biocybernetyka I inżynieria biomedyczna, Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT, Warszawa 2003,tom 4: S. Błażewicz, L. Stoch: Biomateriały 257-330.
[34] M. Felipe, P. F. Andreade, M. F. M. Grisi, S. L. S. Souza, M. Taba, DB Palioto, et al.: Comparision of two surgical procedures for use of the acellular dermal matix graft in the treatment of gingival recession: a randomized controlled clinical study, Journal of Periodontology 78 (2007) 1209-1217.
[35] A. Santos, G. Goumenos, A. Pascula: Management of gingival recession by the use of acellular dermal graft material: a 12-case series, Journal of Periodontology 76 (2005) 1982-1990.
[36] Matsuda: Suturable adhesion-preventing membrane, United States Parent no. US 6,997,231 B1, 20.12.2005.
[37] Zdjęcia pochodzą z prospektu firmy Geistlich: The original remains unique, zdjęcia wykonane przez Dr. Bufler Wolhusen.
LITERATURA __________________________________________________________________________
118
[38] M. C. Bottino, V. Thomas, M. V. Jose, D. R. Dean, GM. Jaworski: Acellular dermal matrix graft: synergistic effect of rehydration and natural crosslinking on mechanical properties, Journal of Biomedical Research Part B: Applied Biomaterials 25 (2010) 276-282.
[39] A. D. Bhrany, C. J. Lien, B. L. Beckstead, N. D. Futran, N. H. Muni, C. M. Giachelli, et al.: Crosslinking of an oesophagus acellular matrix tissue scaffold, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2 (2008) 365-372.
[40] H. G. Sundararaghavan, G. A. Monteiro, N. A. Lapin, Y. J. Chabal, J. R. Miksan, D. I. Shreiber: Ganipin-induced changes in collagen gels: correlation of mechanical properties to fluorescence, Biomedical Research Part A 87 (2008) 308-320.
[41] A. N. Versypt, D. W .Pack, R. D. Braatz: Mathematical modeling of drug delivery from autocatalytically degradable PLGA microspheres-A Review, Journal of Controlled Release doi: 10.1016/j.jconrel.2012.10.015
[42] H. Seyednejad, A. H. Ghassemi, C. F. van Nostrum, T. Vermonden, W. E. Hennink: Functional aliphatic polyesters for biomedical and pharmaceutical applications, Journal of Controlled Release 152 (2011) 168- 176.
[43] J. Gottlow: GTR Rusing resorbable and nonresorbable devices: initial healing and long term results, Journal of Priodontology 64 (1993) 1157-1165.
[44] A. Bilir, B. Aybar, S. H. Tanrikulu, H. Issever, et al.: Biocompatybility of different barrier membranes in cultures of human CRL 11372 osteoblast-like cells: an immunohistochemical study, Clinical Oral Implants Research 18 (2007) 46-52.
[45] T. Takata, H. L Wang, M. Miyauchi: Migration of osteoblastic cells on various guided bone regeneration membranes, Clinical Oral Implants Research 12 (2001) 332–338.
[46] B. A. Coonts, S. L. Whitman, M. O’Donnell, A. M. Polson, et al.: Biodegradation and biocompatibility of a guided tissue regeneration barrier membrane formed from a liquid polymer material, Journal of Biomedical Materials Research 42 (1998) 303-311.
[47] P. M. Camargo, V. Lekovic, M. Weinlaender, N. Vasilic, et al: Platelet-rich plasma and bovine porous bone mineral combined with guided tissue regeneration in the treatment of intrabony defect in humans, journal of Periodontology Research 37 (2002) 300-306.
[48] G. Rh. Owen, J. Jackson, B. Chehroudi, H. Burt, D. M. Brunette: A PLGA membrane controlling cell behaviour for promoting tissue regeneration, Biomaterials 26 (2005), 7477-7456.
[49] M. L. Houchin, E.M. Topp: Physical Properties of PLGA Films During Polymer Degradation, Journal of Applied Polymer Science 114 (2009) 2848 – 2854.
LITERATURA __________________________________________________________________________
119
[50] P. Hoser: Fizjologia organizmów z elementami anatomii człowieka, WSiP, Warszawa 1999, 160-187.
[51] M. De Sanctis, G. Zucchelli: Guided tissue regeneration with a resorbable barrier membrane (Vicryl) for the management of buccal recession: a case report, International Journal of Periodontics and Restorative Dentristy 16 (1996) 435-441.
[52] R. Pontoriero, J. Wennström, J. Lindhe: The use of barrier membranes and enamel matrix proteins in the treatment of angular bone defects. A prospective controlled clinical study, Journal of Clinical Periodontology 26 (1999) 833-840.
[53] N. Donos, L. Kostopoulos, T. Karring: Alveolar ridge augmentation using a resorbable copolymer membrane and autogenous bone grafts. An experimental study in the rat. Clinical Oral Implants Research 13 (2002) 203–113.
[54] M. F. Meek, K. Jansen, R. Steendam, W. Van Oeveren, et al.: In vitro degradation and biocompatibility of poly(DL-lactide-epsilon-caprolactone) nerve guides, Journal of Biomedical Materials Research 68 (2004) 43-51. .[55] E. J. Hoogeveen, P. F. Gielkens, J. Schortinghuis, J. L. Ruben, et al.: Vivosorb as a barrier membrane in rat mandibular defects. An evaluation with transversal microradiography, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 38 (2009) 870-875.
[56] S. Agarwal, J. H. Wendorff, A. Greiner: Use of electrospinning technique for biomedical application, Polymer 49 (2008) 5603-5621.
[57] K. H. Kim, L. Jeong, H. N. Park, S. Y. Shin, W. H. Park, S. C. Lee, T. I. Kim, Y. J. Park, Y. J. Seol, Y. M. Lee, Y. Ku, I. C. Rhyu, S. B. Han, C. P. Chung: Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for guided bone regeneration, Journal of Biotechnology 120 (2005) 327-339.
[58] Y. J. Park, K. H. Nam, S. J. Ha, Ch. M. Pai, Ch. P. Chung, S. J. Lee: Porous poly(L-lactide) membrane as a guided tissue regeneration and controlled drug delivery: membrane fabrication and characterization, Journal of Controlled Release 43 (1997) 151-160.
[59] W-J. Lin, C-H. Lu: Characterization and permeation of microporous poly(ε-caprolactone) film, Journal of Membrane Science 198 (2002) 109-118.
[60] Ch. Xianmiao, L. Yubao, Z. Yi, Z. Li, L. Jidong, W. Huanan: Properties and in vitro biological evaluation of nano-hydroxyapatite/chitosan membranes for bone guided regeneration, Materials Science and Engineering C 29 (2009) 29-35.
LITERATURA __________________________________________________________________________
120
[61] S. W. Song, J. M. Torkelson: Coarsening effects on the formation of microporous membranes produced via thermally induced phase separation of polystyrene-cyclohexanol solution, Journal of Membrane Science 98 (1995) 209-222.
[62] W. K. Kim, K. Char, C. K. Kim: Control of droplet size of polymer – diluents blends through thermally induces phase separation, Journal of Polymer Science: Part B 38 (2000) 3042-3052.
[63] P. L. Hanks, D. R. Lloyd: Deterministic model for matrix solidification in liquid-liquid thermally induced separation, Journal of Membrane Science 306 (2007) 125-133.
[64] Y. Tagauchi, N. Amizuka, M. Nakade, H. Ohnishi, N. Fujii, K. Oda, S. Nomura, T. Maeda: A histological evaluation for guided bone regeneration induced by a collagenous membrane, Biomaterials 26 (2005) 6158-6166.
[65] K. Owens, R. Yukna: Collagen membran resorption in dog: a comparative study, Implant Dentristy 10 (2001) 49-58.
[66] M. C. Bottino, M. V. Jose, V. Thomas, D. R. Dean, G. M. Janowski: Freez-dried acellular dermal matrix graft: effect of dehydrationon physical, chemical and mechanical properties, Dental Materials 25 (2009) 1109-1115.
[67] P. Bunyaratavej, H. L. Wang: Collagen membranes: a review, Journal of Periodontology 72 (2001) 215-229.
[68] L. T. Hou, J. J. Yan, A. Y. M. Tsai, C. S. Lao, S. J. Lin, C. M. Liu: Polymer-assisted regeneration therapy with Atrisorb® barriers in human periodontal intrabony defects, Journal of Clinical Periodontology 31 (2004) 68-74.
[69] U. Klinge, B. Klosterhalfen, M. Muller, V. Schumpelick: Foreign body reaction to meshes used for the repair of abdominal wall hernias, European Journal of Surgery 165 (1999) 665-673.
[70] M. Kikuchi, Y. Koyama, T. Yamada, T. Okada, et al.: Development of guided bone regeneration membrane composed of β-tricalcium phosphate and poly(L-lactide-co-glycolideco-ε-caprolatone) composites, Biomaterials 25 (2004) 5979–5986.
[71] H. H. Lu, S. F. El-Amin, K. D. Scott, C. T. Laurencin: Threedimensional, bioactive, biodegradable, polymer-bioactive glass composite scaffolds with improved mechanical properties support collagen synthesis and mineralization of human osteoblast-like cells in vitro, Journal of Biomedical Materials Research, Part A 64 (2003) 465-474.
[72] J. Yao, S. Radin, P. Leboy, P. Ducheyne: The effect of bioactive glass content on synthesis and bioactivity of composite poly (lactic-co-glycolic acid)/bioactive glass substrate for tissue engineering, Biomaterials 26 (2005) 1935–1943.
LITERATURA __________________________________________________________________________
121
[73] M. C. Bottino, V. Thomas, G. M. Janowski: A novel spatially designed and functionally graded electrospun membrane for periodontal regeneration, Acta Biomaterialia 7 (2011) 216-224.
[74] P. Dobrzynski, J. Kasperczyk, H. Janeczek, M. Bero: Syntesis of biodegradable copolymers with the use of low toxic zirconium compounds. Copolymerisation of glycolide with L-lactide initiated by Zr(acac)4, Macromolecules 34 (2001) 5090-5098.
[75] P-391519. Method of manufacturing of resorbable membrane for guided tissue regeneration / Sposób wytwarzania resorbowalnej membrany do sterowanej regeneracji tkanek inventors / inventors / wynalazcy: E. Pamuła, S. Błażewicz, M. Krok, D. Kościelniak, P. Dobrzyński. (2010-06-15).
[76] F. Yang, S. K. Both, X. Yang, X. F. Walboomers, J. A. Jansen: Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application, Acta Biomaterialia 5 (2009) 3295-3304.
[77] S. Schenderlein, M. Luck, B.W. Muller: Partial solubility parameters of poly(D,L-lactide-co-glycolide), International Journal of Pharmaceutic 286 (2004) 19-26 .
[78] K. Sepassi, S. H. Yalkowsky: Solubility Prediction in Octanol: A Technical Note, AAPS Pharmaceutic Science and Technology 7(1) (2006) E1-E8.
[79] T. Nieminen, I. Kallela, J. Keränen, I. Hiidenheimo, H. Kainulainen, E. Wuolijoki, I. Rantala: In vivo and in vitro degradation of a novel bioactive guided tissue regeneration membrane, International Journal of Oral Maxillofacial Surgery 35 (2006) 727-732.
[80] M. Krok, E. Pamula: Poly(L-lactide-co-glycolide) microporous membranes for medical application produced with the use of polyethylene glycol as a pore former, Journal of Applied Polymer Science 125 (2012) E187-E199.
[81] K. Pielichowska, S. Gkowinkowski, J. Lekki, D. Binias, , K. Pielichowski, J. Jenczyk: PEO/fatty acid blends for thermal energy storage materials. Structural/morphological features and hydrogen interactions, Eurpean Polymer Journal 44 (2008) 3344–3360.
[82] E. Pamula, M. Blazewicz, C. Paluszkiewicz, P. Dobrzynski: FTIR study of degradation products of aliphatic polyesters-carbon fibres composites, Journal of Molecular Structure 596 (2001) 69-75.
[83] Sperling, L.H. Introduction to Physical Polymer Science, third ed., Wiley, New Jersey, 2006.
[84] K. Pielichowski, K. Flejtuch: Differential scanning calorimetry studies on poly(ethylene glycol) with different molecular weight for thermal energy storage materials, Polymers for Advanced technology 13 (2002) 690-696.
LITERATURA __________________________________________________________________________
122
[85] A. Gopferich: Mechanisms of polymer degradation and erosion, Biomaterials 17 (1996) 103-114.
[86] P. Dobrzynski, J. Kasperczyk, H. Janeczek, M. Bero: Synthesis of biodegradable copolymers with the use of low toxic zircinium compounds 1. Copolymerization of glycolide with L-lactide by Zr(acac)4, Macromolecules 34 (2001) 5090-5098.
[87] E. Pamula, E. Dryzek, P. Dobrzynski: Hydrolitic degradation of poly(L-lactide-co-glycolide) studied by positron anihilation spectroscopy and Rother techniques, Acta Physica Polonica A 110 (2006) 631-639.
[88] R. T. Morrison R. N. Boyd: Chemia Organiczna, Tom 1 Wydawnictwo PWN, Warszawa, 194, 700-702.
[89] I. Grizzy, H. Garreau, S. Li, M. Verte: Hydrolytic degradation of devices based on poly(DL-lactic acid) size dependence, Biomaterials 16 (1995) 305-311.
[90] L. Lu, S. J. Peter, M. D. Lyman, H-L. Lai, S. M. Leite, J A. Tamada, S. Uyama, J P. Vacanti, R. Lager, A. G. Mikos: In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glicolic acid) foams, Biomaterials 21 (2000) 1837-1845.
[91] S. Li, S. MaCrthy: Futures investigations on the hydrolytic degradation of poly(DL-lactide), Biomaterials 20 (1999) 35-44.
[92] P. Mastalerz: Elementarna Biochemia, Wydawnictwo Chemiczne, Wrocław 2009, 145-165.
[93] S. Stokłosowa: Hodowla Komórek i Tkanek, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2006.
[94] L. Scheideler, D. Geis-Gerstorfer, D. Kern, F. Pfeiffer, F. Rupp, H. Weber, H. Wolburg: Investigation of cell reactions to microstructured implant surfaces, Materials Science and Engineering C 23 (2003) 455-459.
[95] C. C. Berry, G. Campbell, A. Spadiccino, M. Robertson, A. S. G. Curtis: The influence of microscale topography on fibroblast attachment and motility, Biomaterials 25 (2004) 5781-5788.
[96] L. Bacakova, E. Filova, M. Parizek, T. Ruml, V. Svorcik: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on material designed for body implants, Biotech Adv 29 (2011) 739-767.
[97] G. Mendonca, D. B. S. Mendonca, F. J. L. Aragao, L. F. Cooper: Advancing dental implant surface technology – from micron- to nanotopography, Biomaterials 29 (2008) 3822-3835.
LITERATURA __________________________________________________________________________
123
[98] Y. Wan, Y. Wang, Z. Liu, X. Qu, B. Han, J. Bei, S. Wang: Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(L-lactide), Biomaterials 26 (2005) 4453-4459.
[99] M. Krok, R. Hess, I. Wojak, D. Kościelniak, D. Scharnweber, E. Pamuła: In vitro evaluation of poly(L-lactide-co-glicolide) membrane, Engineering of Biomaterials 94 (2010) 7-10.
[100] I. N. W Wang, W. H. Lu.: Role of Cell-Cell Interaction on the Regeneration of Soft Tissue-to-Bone Interface, 28th IEEE, EMBS Annual International Conference, NYC, USA, 30-Sept 3, 2006
[101]C. Johnen, I. Steffen, D. Beichelt, K. Brautigam, T. Witascheck, N. Toman, V. Moser, C. Ottomann, B. Hartmann, J. C. Gerlach: Culture of subconfluent human fibroblasts and keratinocytes using biodegradable transfer membranes, Burns 34 (2008) 655-663
[102] Fan H., Liu H, Toh S. L., Goh J. C. H., Enhanced differentiation of mesenchymal stem cells co-cultured with ligament fibroblasts on gelatin/silk fibroin hybrid scaffold, Biomaterials 29 (2008) 1017-1027.