Download - Resistencia a Quinolonas
Detección de resistencia a quinolonas
Luis Martínez MartínezServicio de Microbiología
Hospital Univ. Marqués de ValdecillaDpto. Biología Molecular. Univ. Cantabria
Santander
Núcleo de las Fluoroquinolonas
GRAMNEGATIVE BACTERIAGENERAL STRUCTURE
Peptidoglycan
Outer M.
PBPß-lactamase
Antimicrobial agent
PorinaPorina
LPS
Phospholipids
PhospholípidsInner M.
Cytoplasm Dianas
Periplasm
Replicación del DNA
Superenrollamiento del DNA
PREFERENCIA EN LA DIANA DE ACCIÓN DE LAS QUINOLONAS
1.- M. tuberculosis, Corynebacterium, H. pylori y T. pallidumGirasa como única diana.
2.- Bacterias que contienen DNA girasa y topoisomerasa IVA2.1.- Gram-: girasa como diana principal2.2.-Gram+: topoisomerasa IV como diana primaria(...pero depende de la quinolona y de la especie)
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
1. Disminución de la concentracion intracelular-permeabilidad reducida y/o -bombas de expulsión activas
2. Modificación de la diana: Cambios en las topoisomerasas
3. Protección de la diana:Proteínas Qnr
4. Inactivación enzimáticaAcetilasa AAC 6’ Ib-cr
MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
1. Disminución de la concentración intracelular
Gran complejidad de mecanismosEscaso interés para investigación “habitual”Relevancia en estudios pormenorizados de
mecanismos de resistencia
Es preferible realizar estudios fenotípicos:SDS-PAGE: Análisis de OMPs (porinas)
Demostración de expulsión activa
DETECCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A QUINOLONAS
K. pneumoniae SDS-PAGE OMP
10S 810R 738R
24
20
14 6
45
36
29
66
MW
Ardanuy et al, AAC 1998
LamB
Porinas
OmpA
Detección de secuencias de inserción en el gen ompK36 de K. pneumoniae
Detección de secuencias de inserción en el gen ompK36 de K. pneumoniae
EXPULSIÓN ACTIVA PRINCIPALES FAMILIAS
1. MFS: Major Facilitator Superfamily
2. RND: Resistance Nodulation-Division
3. SMR: Small Multidrug Resistance
4. ABC: ATP-Binding Cassette
5. MATE: Multidrug And Toxic Extrusion
SISTEMAS DE EXPULSIÓN ACTIVA
EXTERIOR
INTERIOR
EFECTO DE P.A.N. EN LA CMI DE LEVOFLOXACINO FRENTE A P. aeruginosa
CEPA PAN CMI Levofloxacino+[PAN]
0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L
WT >512 0,125 0,015 0,008
nalB >512 2 0,125 0,03
nfxB >512 2 0,125 0,03
nfxC >512 4 0,25 0,06
Mex(*) 32 0,015 0,015 0,008
Lomovskaya O et al, AAC 2001
PROPORCIONES DE LOS VALORES DE CMI DE NORFLOXACINO MÁS OTROS COMPUESTOS FRENTE A S. aureus
S. aureus 1199B
S. aureus K1748
S. aureus K2068
NorA (+++) Exp. Act(+) NorA (-)
Exp. Act.(+) NorA (-)
Reserpina 4 1 8
Clorpromazina 4 2 8
Flufenazina 4 2 8
Tioridazina 4 2 8
Cis(Z)-flupentixol 4 1 8
Kaatz GW et al, AAC 2003
ACUMULACIÓN DE NORFLOXACINO
acu
mu
lac
ión
K23 Mutante
Doménech-Sánchez et al. Datos no publicados
SOBREEXPRESIÓN DE BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA
MUTACIONES EN GENES REGULADORES:
acrR
mexR
mexT… (Etc, Etc!)
marC marO marBmarAmarR
Mar LOCUS
Nakae, Microbiología SEM, 1997 (Mod.)
Mar Regulon
Activación de genes relacionados con la resistancia a los antimicrobianos: AcrAB, micF (ompF)
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
2. Modificación de la diana:
Detección de mutaciones en los genes que codifican las topoisomerasas, en particular en las llamadas regiones “QRDR” (posiciones 51-106 de GyrA).
Amplificación y secuenciación de la región QRDR de:gyrA, gyrB: Cambios en la ADN girasaparC, parE: Cambios en la Topoisomerasa IV
DETECCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A QUINOLONAS
En E. coli (y la mayoría de enterobacterias), los cambios más habituales ocurren en las posiciones 83 y 87 de gyrA y en las posiciones equivalente de parC. Las mutaciones en gyrB y parE tienen menor relevancia clínica
La combinación de mutaciones conduce a mayores niveles de resistencia.
Alelos que confieren resistencia a quinolonas (E. coli)
E. coli RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS
STRAIN CIP gyrA parC
I113 0.015 wt wt
I114 0.06 wt wt
I87 2 Ser83 wt
I237 16 Ser83 wt
I250 8 S83L D87G S80R
I253 32 S83L D87G S80R
Everett MJ et al., AAC 1996
ACTIVIDAD DE QUINOLONASMUTACIONES EN QRDR
GyrA ParC CIPRO Ac. NAL.
Ser83...Asp87 Ser80...Glu84 <0.12 4
Phe83 ó Tyr83 0.5-4 >128
Phe83Gly87 4-16 >128
Phe83Asn87 Ile/Arg80 16->256 >1024
Gly/Lys84
Alelos que confieren resistencia a quinolonas (Gram+)
RESISTENCIA A QUINOLONAS
ORIGEN MULTIFACTORIAL
Martínez Martínez, 1996, 1998, 2003
CEPA NORFLO GyrA OMPs Exp. Activa
LB3 2 Tyr83 SI NO
LB4 4 Tyr83 NO SI
CSUB10S 4 Phe83 SI NO
CSUB10R 16 Phe83 NO SI
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
3. Protección de la diana: Proteínas Qnr
QnrA, QnrB, QnrS
Proteínas de pentapéptidos repetidosGenes codificados por plásmidosRelacionados con genes cromosómicos de otras bacteriasEnterobacterias/Vibrionáceas/Shewanella ¿....?
Confieren bajo nivel de resistencia
Entornos genéticos complejos
MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS
SENSIBILIDAD DE K. pneumoniae C1, C2 y C3, E. coli J53 y P. aeruginosa PU21 CON/SIN pMG252
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
IDENTIDAD DE AMINOÁCIDOS (%) ENTRE GENES qnr Y GENES CROMOSÓMICOS RELACIONADOS
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
ENTORNO GENÉTICO DE qnrA, qnrB, qnrS
PCR target Primer name Primer sequence Product size Reference
intI1 Intn1 Intn2
5’-GCG AAG TCG AGG CAT TTC TGT C-3’ 5’-ATG CGT GTA AAT CAT CGT CGT AGA GA-3’
767 bp Designed in our laboratory
intI2 IntI2-F IntI2-R
5’-TTA TTG CTG GGA TTA GGC-3’ 5’-ACG GCT ACC CTC TGT TAT C-3’
233 bp Goldstein et al. AAC. 2001 45: 723-6
intI3 HS-208 HS-207
5'-TCA GCC GGG CGA CAA GTG CA-3' 5'-TGC ATG AAC AGG TAT AAC GG-3'
1044 bp Collis et al. JB. 2002 184:3017-26
orf513 341-A 341-B
5'-CGC CCA CTC AAA CAA ACG-3' 5'-GAG GCT TTG GTG TAA CCG-3'
469 bp Sabaté et al. AAC. 2002 46: 2656-61
qnrA QP1 QP2
5’-GAT AAA GTT TTT CAG CAA GAG G-3’ 5’-ATC CAG ATC GGC AAA GGT TA-3’
543 bp Jacoby et al. AAC. 2003 47: 559-62
blaTEM TEM-F TEM-R
5'-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG-3' 5'-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA-3'
868 bp Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53
blaSHV SHV-F SHV-R
5'-GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC-3' 5'-TTA GCG TTG CCA GTG CTC-3'
931 bp Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53
blaCTX-M CTX-MU1 CTX-MU2
5'-ATG TGC AGY ACC AGT AAR GT-3' 5'-TGG GTR AAR TAR GTS ACC AGA-3'
593 bp Pagani et al. JCM. 2003 41: 4264-9
blaCTX-M-9 group CTX-M9-F CTX-M9-R
5’-GTG ACA AAG AGA GTG CAA CGG-3’ 5’-ATG ATT CTC GCC GCT GAA GCC-3’
857 bp Sabaté et al. AAC. 2000 44: 1970-3
REP-PCR REP-1 REP-2
5'-III-GCG CCG ICA TCA GGC-3' 5'-ACG TCT TAT CAG GCC TAC-3'
variable size Vila et al. JMM. 1996 44: 482-9
Detección de qnrA y genes
relacionados en enterobacterias
-
Result by PCR for: Group Isolate Species Date of isolation Specimen REP-pattern IntI1 IntI2 IntI3 qnrA blaCTX-M
A O-63 O-197 O-213
C. freundii M. morganii M. morganii
2/2004 3/2004 4/2004
urine urine urine
B A A
+ + +
ND ND ND
ND ND ND
- - -
- - -
B 2312 2519
E. coli E. coli
9/2004 10/2004
urine urine
E E
+ +
ND ND
ND ND
- -
- -
C
1108 1933 2252 2539 2982 2983 700 3384 3703 365 603 1013
E. coli E. coli E. coli E. coli
E. cloacae C. freundii
E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli
5/2004 8/2004 9/2004 10/2004 11/2004 11/2004 2/2005 11/2004 12/2004 2/2005 2/2005 3/2005
urine sputum urine urine
wound wound urine urine
sputum ascitic fluid
urine urine
F G F H D C I J K L M N
+ + + + + + + - - - - -
ND ND ND ND ND ND ND - - - - +
ND ND ND ND ND ND ND - - - - -
- - - - + + - - - - - -
+ + + + + + + + + + + +
Detección de qnrA y genes
relacionados en enterobacterias
Detección de qnrS en E. cloacae
E. cloacae E. aerogenes E. cloacae E. aerogenes (N=118) (N=22) 140 (N=37) (N=25) 62
qnrS 22 (18.6%) 0 (0%) 22 (15.7%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
qnrA 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
orf513 29 (24.6%) 0 (0%) 29 (20.7%) 2 (5.4%) 0 (0%) 2 (3.2%)
intI1 58 (49.1%) 3 (13.6%) 61 (43.6%) 8 (21.6%) 2 (8%) 10 (16.1%)
SANTANDER SEVILLE
qnrS-positive isolates
isolates intI1 orf513 qnrA qnrS15 + - - +2 + + - +5 - - - +
REP-PCR pattern A B C D E
Isolates number 14 4 2 1 1
MIC nalidixic acid (mg/L) >256 (R) 8 (S) 8-16 (S) >256 (R) 32 (R)
MIC ciprofloxacin (mg/L) >32 (R) 0.38 (S) 2-4 (I/R) 3 (R) 1.5 (I)
Mutations in gyrASer83Ile (14)
Asp87Asn (1)
None None Ser83Phe None
Mutations in parCSer80Ile (2)
Not done (12)
Not done
None Not done None
REP-PCR
Detección de qnrS en E. cloacae
Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas
4. Inactivación enzimática: Acetilasa AAC 6’ Ib-cr Origen plasmídico N-acetilación del grupo amino del radical piperacinilNo compromete la actividad frente a aminoglucósidos
Afecta a ciprofloxacino y norfloxacino (pero no a otras FQ)
Moderado incremento en la CMIFavorece la aparición de mutantes más resistentes
MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS