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Real Time qPCR en la mesada
Problemas, más y más problemas….
Feliz día a todas las mujeres!
Extracción de RNA
Material de partida
Tubos AXYGEN
Buffer TAE nuevo,
Más tiempo NaOH
H2O nueva (prep muestras)
Loading buffer
EtBr
Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosa
Tratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora
Usar agua estéril para preparación de buffer
NO reutilizar el buffer
Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer)
Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V)
Siempre usar agua miliQ para preparar muestras
Hígado:
- centrifugación luego del TriZol
- doble extracción con cloroformo
Sangre:
- menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul)
- GlycoBlue
Particularidades…
qPCR
¿¿ Cq > 32/33 ??
- Gen de baja expresión?
- Problema en la RT
- RNA realmente íntegro?
- Problema en la qPCR Control + !!
Pre-amplificación
Cambiar de gen !!
Degradación post-extracción?
SD
Enzimas?
Nueva tanda de cDNA
CHEQUEAR !
Con 1, 2 o 3 cDNAs
Pool de cDNAs
Lámpara de excitación? SYBR??
SYBR
Estabilidad
Inhibición
AMPLIFICA EL NTC !!!
- Dímeros de primer ??
- Contaminación ??
Dímeros de primer
- Diseñar nuevos
- T annealing
- Cc usada
Contaminación
• Juego de pipetas exclusivo
• NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas
• Gel agarosa en sala aparte
• No mezclar por pipeteo
• Alicuotar reactivos
• Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!!
• Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen
Lidiando con las contaminaciones…
Construyendo una Curva Standard…
Curva Standard
Ef = 10 ^ - (1/Pend)
Puntos a tener en cuenta…
- cDNA a utilizar
- Temperatura de annealing (1,6 1,9)
- Puntos de la curva!!!
- muy concentrados: se va de la linealidad
NO incluir diluciones 1/10 – 1/20
- muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!
Persevera…..
….. Y triunfarás!!