-
PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS
Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES
COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENTICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS
DE CALDAS
ANDRES VICENTE CASTAEDA RANGEL
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA
BOGOT D.C.
2015
-
PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS
Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES
COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENTICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE
Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS
DE CALDAS
ANDRES VICENTE CASTAEDA RANGEL
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al ttulo de Licenciado en Biologa
Director
MSc. MIGUEL . PIRAGAUTA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA
BOGOT D.C.
2015
-
DEDICATORIA
Hay hombres que luchan un da y son buenos. Hay otros que luchan un ao y son mejores. Hay
quienes luchan muchos aos, y son muy buenos. Pero hay los que luchan toda la vida, esos son
los imprescindibles.
Bertolt Brech
Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a m que fueron un apoyo constante
durante estos aos en la universidad. De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas
que hicieron difcil mi camino, porque demostrarles que si poda cumplir mis objetivos pese a las
adversidades, result ser una motivacin an ms fuerte para m.
Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Caldern, una investigadora cuyas
enseanzas y apoyo afectivo estn muy relacionadas con la finalizacin exitosa de este proyecto.
-
AGRADECIMIENTOS
La realizacin de este trabajo fue posible gracias a mltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realizacin:
La Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, por haberme dado una formacin integral como
Licenciado en Biologa a travs de sus docentes y sus espacios.
A mi director, el docente Miguel . Piragauta MSc. por confiar en m y en mi trabajo, por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales, por su asesora y direccin.
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza, por su gua, sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realizacin del mismo.
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castaeda, quienes aportaron valiosa informacin y
experiencia durante mi estada en el laboratorio a travs de su proyecto.
A la docente Gloria Stella Acosta Pealoza MSc., quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientficos solemos
enfrascarnos.
A Gineth Adriana Caldern, por su colaboracin en distintas etapas de este trabajo.
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas, pido por ello disculpas a aquellos que no
mencion, pues sus aportes tambin fueron importantes para el xito de este proyecto.
-
CONTENIDO
RESUMEN .................................................................................................................................... 10
ABSTRACT ................................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 11
2. MARCO REFERENCIAL ........................................................................................................ 13
2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLGICAS. ........................................................................................................... 13
2.2. CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS. .......................................................... 14
2.2.1. Conservacin a corto plazo. .......................................................................................... 14
2.2.2. Conservacin a mediano plazo. Criopreservacin. ....................................................... 14
2.2.3. Conservacin a largo plazo. .......................................................................................... 15
2.2.3.1. Liofilizacin. .......................................................................................................... 15
2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado. ....................................................... 20
2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar. .................................................................................. 21
3. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 22
3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 22
3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................... 22
4. METODOLOGA ...................................................................................................................... 23
4.1. FASE INICIAL. ................................................................................................................. 23
4.1.1. Acervo Microbiano. ...................................................................................................... 23
4.1.2. Eleccin de los protectores. .......................................................................................... 23
4.1.2.1. Crioprotectores. ...................................................................................................... 23
4.1.2.2. Lioprotectores. ........................................................................................................ 23
4.2. FASE INTERMEDIA 1..................................................................................................... 24
4.2.1. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin. ................................................ 24
4.2.1.1. Viabilidad. .............................................................................................................. 24
4.2.1.2. Estabilidad Morfolgica. ........................................................................................ 25
4.2.1.3. Pureza. .................................................................................................................... 25
4.2.2. Recuperacin de los microorganismos. ........................................................................ 25
4.2.3. Criopreservacin. .......................................................................................................... 26
4.2.3.1. Precriopreservacin. ............................................................................................... 26
4.2.3.2. Preparacin del inculo bacteriano y ejecucin de la criopreservacin. ................ 26
4.2.4. Liofilizacin. Etapa 1. ................................................................................................... 26
4.2.4.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano. ........................................... 26
4.2.4.2. Ejecucin de la liofilizacin. .................................................................................. 26
-
4.2.4.3. Posliofilizacin (Rotulado y almacenaje). ............................................................. 27
4.2.5. Rehidratacin o Reconstitucin. Etapa 2. ..................................................................... 29
4.3. FASE INTERMEDIA 2..................................................................................................... 29
4.3.1. Liofilizacin definitiva. ................................................................................................. 29
4.3.1.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano. ........................................... 29
4.3.1.2. Ejecucin de la liofilizacin. .................................................................................. 30
4.3.1.3. Posliofilizacin. ...................................................................................................... 30
4.3.1.4. Rehidratacin. ........................................................................................................ 30
4.3.2. Control de calidad de la liofilizacin y ajustes tcnicos. .............................................. 30
4.3.2.1. Propiedades fsicas generales. ................................................................................ 30
4.3.2.2. Contaminacin. ...................................................................................................... 30
4.3.2.3. Tiempo de redisolucin o reconstitucin. .............................................................. 31
4.3.3. Pruebas adicionales. ...................................................................................................... 31
4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad msica. ........................................................................ 31
4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada. ............................................................................. 31
4.3.4. Control de esterilidad. ................................................................................................... 32
4.3.4.1. Medios. ................................................................................................................... 32
4.3.4.2. Ambiente. ............................................................................................................... 32
4.3.4.3. Tcnicas de siembra y manipulacin de elementos. .............................................. 32
4.4. FASE FINAL...................................................................................................................... 32
4.4.1. Base de datos. ................................................................................................................ 32
4.4.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 33
4.4.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer. ............................. 33
4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 33
4.4.5. Manual de procedimientos. ........................................................................................... 33
5. RESULTADOS .......................................................................................................................... 34
5.1. RECUPERACIN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIN DE LA
CRIOPRESERVACIN. ......................................................................................................... 34
5.2. CARACTERSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO. ................................................................................................................................. 35
5.3. EVALUACIN DE LA LIOFILIZACIN. PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL. ............................................................................................................................... 38
5.3.1. Viabilidad y seleccin del lioprotector general. ........................................................... 38
5.3.2. Aspecto fsico del liofilizado. ....................................................................................... 41
5.4. LIOFILIZACIN DEFINITIVA. .................................................................................... 41
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIN. ................................................ 42
5.5.1. Propiedades fsicas generales. ....................................................................................... 42
5.5.2. Contaminacin. ............................................................................................................. 45
-
5.5.3. Tiempo de redisolucin. ................................................................................................ 45
5.6. PRUEBAS ADICIONALES. ............................................................................................ 46
5.6.1. Prueba de higroscopicidad msica. ............................................................................... 46
5.6.2. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................... 47
5.7. PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIN. ...................................................... 47
5.7.1. Base de datos. ................................................................................................................ 47
5.7.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 47
5.7.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer. ............................. 47
5.7.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 48
5.7.5. Manual de procedimientos de conservacin. ................................................................ 48
6. ANLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................ 49
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 54
8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 55
9. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 56
10. BIBLIOGRAFA ..................................................................................................................... 60
11. ANEXOS .................................................................................................................................. 62
-
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema general de la conservacin de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacin. .......................................................................................................................... 16
Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado ................................. 17
Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. ........................................... 18
Figura 4. Descripcin global del proceso de liofilizacin .......................................................... 19
Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. .......................................... 21
Figura 6. Metodologa .................................................................................................................. 23
Figura 7. Rtulos creados para los viales liofilizados. .............................................................. 28
Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelacin .................................................................................... 35
Figura 9. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 38
Figura 10. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 39
Figura 11. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 39
Figura 12. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 40
Figura 13. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas
concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 40
Figura 14. Comparacin entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilizacin definitiva, por cepa bacteriana. .................................................................... 41
Figura 15. Transicin fsica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. ..................... 45
Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en funcin del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales. ........................................................................ 46
Figura 17. Organigrama de la base de datos. ............................................................................ 47
-
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas. .................................... 24
Tabla 2. Nmero de repeticiones (y tubos), segn lioprotector y concentracin. .................. 27
Tabla 3. Cdigo de colores propuesto segn la clasificacin de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. .................................................................... 28
Tabla 4. Rehidratacin de los crioviales. .................................................................................... 29
Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................. 31
Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados. ...... 33
Tabla 7. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin (criopreservacin). ............. 34
Tabla 8. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR004. .............................................. 36
Tabla 9. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR006. .............................................. 36
Tabla 10. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR007. ............................................ 37
Tabla 11. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR009. ............................................ 37
Tabla 12. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR010. ............................................ 38
Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad. ............................................................................................................................ 41
Tabla 14. Tabla de convenciones. ............................................................................................... 42
Tabla 15. Liofilizados en la fase intermedia 1. .......................................................................... 42
Tabla 16. Liofilizados de la prueba de estabilidad natural, liofilizacin definitiva y de la
prueba de estabilidad acelerada. ....................................................................................... 44
Tabla 17. Tiempo de redisolucin de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado. ............. 46
-
10
RESUMEN
La vida no es posible sin la intervencin de los microrganismos y, dada su importancia, se han
creado colecciones biolgicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia
y la tecnologa. Existe variedad de mtodos de preservacin, en este trabajo se determin el estado
de criopreservacin de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad, estandarizando e
implementando adems el sistema de liofilizacin, teniendo como punto de partida a los mismos,
evalundolos frente a tres compuestos protectores. Se realiz una evaluacin de los mtodos de
conservacin teniendo como base tres indicadores, viabilidad, estabilidad morfolgica y pureza;
encontrando que el sistema de criopreservacin implementado en el laboratorio es ptimo y el
glicerol al 67%v/v funciona para casi todas las cepas por largos perodos de tiempo; la sacarosa
10%p/v result ser el mejor lioprotector de los tres evaluados, designndolo como lioprotector
general para el laboratorio. Se cre un manual de laboratorio para la conservacin de cepas, que
incluye los protocolos de criopreservacin y liofilizacin y de seguridad de los mismos. Este
trabajo aporta al campo de la microbiologa de la conservacin y constituye un peldao ms para
el registro del Banco Gentico del Laboratorio de Microbiologa de la Facultad del Medio
Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC),
ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes.
PALABRAS CLAVE: Criopreservacin, liofilizacin, lioprotectores, conservacin,
microorganismos.
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and, given its importance, have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology. Exists variety of methods of preservation, in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing, standardizing and further
implementing the system freeze-drying, taking as a starting point to them, evaluating them against
three protective compounds. An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators, viability, morphological stability and purity was performed; finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67% v/v works for almost all strains for long
periods of time; sucrose 10% w/v lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated,
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory. It was created a manual for conservation
laboratory strains, including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves. This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions.
KEYWORDS: cryopreservation, freeze-drying, lyoprotectants, conservation, microorganisms.
-
11
1. INTRODUCCIN
La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible, pues, como lo menciona
Hurtado (2009), la vida no es posible sin la actividad de estos, ya que estn involucrados en todas
las dinmicas ambientales existentes en el planeta. Sin embargo, su importancia ha ido ms all,
desde que fueron descubiertos hace unos 300 aos por van Leeuwenhoek, potencializndose su
investigacin y utilizacin en distintos campos de la ciencia y la tecnologa en los ltimos 100
aos, iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi & Mayz, 2003).
Debido a esto, se han creado colecciones biolgicas, como mtodo para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho. Las colecciones de cultivos microbianos estn
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt, y a nivel internacional por
la Federacin Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC), en donde existen actualmente
2520.200 microorganismos en 711 colecciones de 71 pases registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM). Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM: el CIAT (Rhizobium Collection America) de cdigo
WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccin de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de cdigo WDCM 857 (WFCC, 2015).
No obstante, varias universidades del pas, instituciones pblicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias biolgicas, poseen colecciones microbiolgicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt, como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN); en otros casos las colecciones estn en proceso de registro o en formacin como en la
Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC), entre otras.
En este tipo de colecciones es imprescindible establecer mtodos de conservacin fiables,
que, entre otras cosas, eviten al mximo el riesgo de prdida o de variabilidad gentica de los
individuos. Existe variedad de mtodos de conservacin, segn sea el tiempo que estarn en la
coleccin o el tiempo en que tardarn en ser usados; dentro de ellos destacan la criopreservacin y
la liofilizacin, mtodos utilizados para la coleccin de la Universidad Distrital Francisco Jos de
Caldas y que fueron evaluados en este trabajo.
Martnez & Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Gentico en el Laboratorio
de Microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC, siglas de la coleccin microbiolgica), utilizando
la refrigeracin como mtodo primario implementando y estandarizando adems el sistema de
criopreservacin.
En este trabajo, se pretendi determinar el estado de criopreservacin de cinco cepas
bacterianas mediante pruebas de viabilidad, implementando y estandarizando adems el sistema de
liofilizacin, teniendo como punto de partida a los mismos, evalundolos frente a tres compuestos
protectores. Para ello, en primera estancia, se recibi una capacitacin sobre manejo y control de
microrganismos, preparacin de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los
laboratoristas encargados; posteriormente se evalu el estado de criopreservacin de las cinco
cepas seleccionadas, utilizando tcnicas de recuento en placa estndar, y se evalu a tres
lioprotectores para la liofilizacin de cepas microbianas del Banco Gentico; adems, se realizaron
-
12
los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacin y, se disearon los
protocolos para la implementacin del sistema de liofilizacin con las cinco cepas y el lioprotector
que present mejores resultados en este estudio.
Para la realizacin de estos fines, el trabajo fue dividido en cuatro fases, comenzando por los
criterios de eleccin de los microrganismos y los lioprotectores, seguido de la evaluacin de los
mtodos de preservacin, utilizando tres indicadores: viabilidad, estabilidad morfolgica y pureza;
posteriormente, una tercera fase de ajustes a la liofilizacin para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo, utilizando como indicadores las propiedades fsicas generales, la
posibilidad de contaminacin en el proceso y el tiempo de redisolucin; finalmente, una cuarta
fase, que corresponde al proceso de documentacin, este incluye la revisin y modificacin de la
base de datos, la elaboracin de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados, as como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccin y finalmente la
elaboracin del manual de procedimientos. Con lo anterior se encontr que el sistema de
criopreservacin desarrollado por Martnez & Mayorga (2013) es eficiente, y permite porcentajes
de recuperacin bastante altos, incluso superiores al 90% luego de dos aos; sin embargo, no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estn expuestas por
este mtodo. De otro lado se determin la sacarosa al 10% como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caractersticas propias de cada organismo)
y se estandariz el sistema de liofilizacin.
Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacin de un nuevo mtodo de
conservacin de microorganismos para el Banco Gentico de la Universidad Distrital Francisco
Jos de Caldas, adems aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacin en bacterias y ofrece
informacin y/o tips sobre el proceso de liofilizacin en general, que no suele mencionarse en otros
trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso. Tambin se constituye como otro
sustento para el proceso de registro del Banco Gentico en la comunidad cientfica, a nivel nacional
e internacional.
Este documento consta, en su orden, de un captulo de introduccin y un marco referencial; de los
objetivos tanto general como especficos alcanzados en este trabajo; una metodologa detallada
paso a paso perfectamente reproducible; los resultados encontrados as como el anlisis de los
mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacin;
finalmente, un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo, el campo de la
conservacin microbiana, y los captulos correspondientes a las referencias y bibliografa utilizada.
Se incluye tambin un captulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en
la comunidad cientfica del presente trabajo.
-
13
2. MARCO REFERENCIAL
2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLGICAS.
La vida en la Tierra no sera posible sin la actividad continua de los microorganismos
(Hurtado, 2009), ya que estn involucrados con las dinmicas en los ecosistemas terrestres, areos
y acuticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta. Existen
microorganismos que degradan la materia orgnica hacindola nuevamente disponible para las
plantas (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), evitando que el mundo sea un vertedero;
mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnolgicos de la humanidad.
Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea, Bacteria y
Eucarya, en donde, encontramos como primeros representantes a las bacterias, las ms numerosas,
encargadas de sostener la vida en nuestro planeta. Estos organismos ancestrales han colonizado
exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), muchas pueden
resultar benficas para ser utilizadas con fines biotecnolgicos, agrcolas, biomdicos, ecolgicos
y de biorremediacin (Morales-Garca et al., 2010). Otros microorganismos de gran importancia
son los micro hongos, estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia
distribucin en la naturaleza, contribuyendo a la descomposicin de la materia orgnica y
participando en los ciclos biolgicos (Pontn, Moragues, Gen, Guarro, & Quinds, 2002).
El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucin de los
graves problemas de la humanidad (Gonzles, de Oca Martnez, Rivern, & Nez, 2006), en la
agricultura, alimentacin, salud y en la bsqueda de nuevas fuentes de energa y la conservacin
del medio ambiente. Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar
variedad de funciones bioqumicas; para Atlas (citado por Olalde Portugal & Aguilera Gmez,
1998) dicha capacidad se basa en la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de
reacciones: oxidaciones, reducciones y precipitaciones, y que de manera directa o indirecta
gobiernan todos los procesos en la tierra (pg. 289).
Los recursos microbiolgicos (microorganismos, genes e informacin) son la materia prima
esencial para el avance de la tecnologa, las ciencias de la vida (Ivshina & Kuyukina, 2013), el
desarrollo de medicamentos farmacuticos, agentes agroqumicos, biocontroles, cosmticos y
productos industriales (Ten Kate, 1995). Adems, con el surgimiento de los medios de cultivo para
el crecimiento y el xito de los primeros aislamientos de microorganismos, se marc la necesidad
de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la
conservacin de toda la biodiversidad microbiana, logrando la inclusin de este tema en el
desarrollo de las polticas ambientales (Gonzles et al., 2006).
El mtodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta, fuera de sus
ambientes, ecosistemas y nichos, ha sido la creacin de colecciones biolgicas, cuyo principal
objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfolgicos, fisiolgicos o
genticos (Montes de Oca et al., 2008). Las colecciones de cultivos microbianos varan en forma,
funcin y tamao. Pueden ser pequeas, privadas, mantenidas por un solo investigador y limitado
a una fuente o taxones especficos (Dures Sette, Pagnocca, & Rodrigues, 2013).
-
14
El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura bsica de
investigacin en ciencias de la vida, llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones
ex situ (Stromberg, Dedeurwaerdere, & Pascual, 2013) de animales y plantas; pero se cuentan con
caractersticas especficas para los microorganismos. En primer lugar, los organismos microbianos
tienen una variacin gentica extremadamente alta y altos ndices de mutacin en la reproduccin
en las especies; por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex
situ (Stromberg et al., 2013) a su lugar de recoleccin. En segundo lugar, las colecciones
proporcionan material para analizar estrategias de conservacin, asegurar los recursos genticos
ante futuras necesidades imprevistas e importantes; para proporcionar biomateriales autenticados,
para materiales de investigacin, exploracin y produccin as como su uso contemporneo por
parte de las entidades privadas y pblicas (Stromberg et al., 2013).
Los microorganismos al igual que otros seres vivos, poseen una nica e irremplazable
secuencia de ADN, por lo que su desaparicin implicara la prdida irreversible de un conjunto
nico de informacin (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), de ah la gran importancia en la
creacin de comits, comisiones, federaciones y grupos de microbiologa como: World Federation
for Culture Collection (WFCC), International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros, encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacin
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC, 2010b).
2.2. CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS.
En las colecciones es necesario establecer mtodos de conservacin confiables y especiales,
pudiendo realizarse a corto, mediano y largo plazo, para asegurar la ptima viabilidad,
almacenamiento y pureza (WFCC, 2010b) de los diferentes microorganismos. Para brindar
seguridad y reducir los riesgos de prdida, cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en
mnimo dos mtodos (WFCC, 2010b) de conservacin, que consideren el tiempo a emplear en la
preservacin inicial, manipulacin y control peridico de las cepas, as como el espacio de
almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemn, Daz Rosa, & lvarez Molina, 2005).
Se debe tener especial cuidado con gneros y especies todava no conservadas en colecciones
(especies nuevas), contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos
ptimos (WFCC, 2010a) de conservacin de estos.
2.2.1. Conservacin a corto plazo.
Comnmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestin ser utilizado en un corto
periodo de tiempo. Suele utilizarse la tcnica de resiembra continua; en este, el microorganismo se
siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento, es almacenado a 4C,
donde se mantiene para su uso, resembrndolo en un lapso de tiempo no superior a un mes
(Morales-Garca et al., 2010).
2.2.2. Conservacin a mediano plazo. Criopreservacin.
Este concepto agrupa a las tcnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los
microorganismos de 2 a 5 aos (Weng et al., 2005). Existen variedad de tcnicas como la
desecacin el gel de slice o perlas de vidrio, el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al.,
2005) o la congelacin. La inclusin de esta ltima tcnica en este grupo es discutida por algunos
autores, ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacin como la criopreservacin (o
-
15
congelacin) son tcnicas de conservacin a largo plazo (Perry, 1995; Weng et al., 2005) y otros
insisten su inclusin en las tcnicas de conservacin a mediano plazo (Morales-Garca et al., 2010).
La criopreservacin consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas.
Esto permite la eliminacin del agua libre disponible, y que en el interior de los individuos, slo
una proporcin del total de agua se convierta en hielo (Perry, 1995, pg. 23),
El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 C a menudo conduce
a un buen nivel de viabilidad, teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta prdida de la
viabilidad del cultivo (Perry, 1995) por parte del laboratorio. Este mtodo es costoso debido a la
infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las clulas a -80C
(Morales-Garca et al., 2010). Heckly (citado por Perry, 1995) indica que ante estas bajas
temperaturas, la viabilidad celular es casi independiente del perodo de almacenamiento; adems
se cree que los individuos criopreservados, siguen siendo genticamente estables.
Hublek (2003), menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservacin de microorganismos, desde las caractersticas propias del individuo (cepa,
especie, tamao y forma de celda, fase de crecimiento al momento de congelar, composicin de las
clulas, etc.), as como los factores antes (composicin del medio de crecimiento, pH, temperatura
de incubacin), durante y posterior al proceso de criopreservacin (densidad poblacional,
aditivos, temperatura y duracin del almacenamiento), e incluso en su descongelacin.
Los aditivos crioprotectores son compuestos qumicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los daos durante el proceso de congelacin (Gonzles et al., 2006, pg.
16). Estos protectores se pueden clasificar segn su peso molecular (bajo o alto) o segn su tasa
y/o capacidad de penetracin: los penetrantes, de bajo peso molecular, que desplazan el agua
intracelular evitando la formacin de hielo (por ejemplo el glicerol), y los no penetrantes, de alto
peso molecular, que promueven la rpida deshidratacin de la clula (por ejemplo los glcidos)
(Hublek, 2003).
2.2.3. Conservacin a largo plazo.
Este concepto agrupa a las tcnicas que adems de minimizar al mximo el riesgo de cambio
gentico en las clulas, mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 aos o ms (Weng et al., 2005).
La ms popular es la liofilizacin.
2.2.3.1. Liofilizacin.
La liofilizacin consiste en la eliminacin del agua de una sustancia congelada por
sublimacin del hielo bajo alto vaco y a presiones muy bajas (Gonzles et al., 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador. Si la liofilizacin es exitosa, se puede asegurar una viabilidad
posliofilizacin por varios aos de los microorganismos, sin embargo, dicho xito depende de
mltiples factores, entre otros, como los mencionados por Hublek (2003) para la criopreservacin
(puesto que la liofilizacin posee una etapa de congelacin); as mismo el tiempo de liofilizacin,
los parmetros de liofilizacin, el medio, aditivo o lioprotector usado, tipo de liofilizador o
accesorio utilizado, influyen en el producto final.
-
16
El proceso de conservacin de microorganismos por liofilizacin se puede dividir en mltiples
etapas, desde la formulacin del protector, hasta el modo en que se recuperarn los individuos de
las muestras liofilizadas (Figura 1).
Figura 1. Esquema general de la conservacin de microorganismos mediante el proceso de
liofilizacin. Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacin. As mismo, se
representa el efecto de cascada en trminos de la viabilidad de las muestras.
a) Formulacin. Se entiende como la mezcla de clulas con cualquier solucin protectora, que tras la
eliminacin del disolvente, permita obtener un producto (liofilizado) deseado. La solucin
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacin. Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de glcidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics, 2015).
Las soluciones protectoras ptimas contienen principalmente un soluto protector,
denominado lioprotector que estabiliza las clulas cuando se elimina el disolvente (agua);
y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla
o torta) durante y despus de la liofilizacin (Figura 2). Algunos lioprotectores en
determinadas concentraciones actan como su propia matriz, por ejemplo, la sacarosa al
10% (Ops Diagnostics, 2015).
La formulacin tambin comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los
microorganismos antes de liofilizarse, pudiendo variar de si se parte de un cultivo slido en
agar o de un cultivo lquido, hasta que sean cultivos slidos densos (edad de 1-2 das) o
lquidos en fase estacionaria. Cuando se parte de un medio lquido, y si es posible, las
clulas se centrifugan, retirando el medio de cultivo, y el sedimento se re-suspende con un
volumen igual de solucin protectora (Ops Diagnostics, 2015), o de lioprotector (Grauer,
Grunberg, & Zardo, 2015). Para cultivos desde agar, suele lavarse la placa/tubo con 5-10
ml de medio protector, posteriormente recogido con una pipeta estril (Ops Diagnostics,
2015). Aunque en esto ltimo se evita la centrifugacin, se obtiene un mayor nmero de
clulas partiendo de cultivos lquidos (Grauer et al., 2015).
-
17
Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado.
Fuente: Adaptado de Jennings, T. A. (2008). Lyophilization, Introduction and Basic Principles (pg. 5).
New York: Informa Healthcare USA, Inc.
b) Congelacin. La congelacin es la primera etapa del mtodo de liofilizacin, y uno de los ms
importantes para el xito de este. Su funcin consiste en obtener una matriz en donde est
separado el disolvente de los solutos. Cuando se congela la formulacin, el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regin intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings, 2008), la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la regin intersticial a casi 0, adems proporciona una estructura
con resistencia casi nula, al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings,
2008).
Disminuir el flujo de agua rpidamente es importante para evitar as la excesiva
concentracin de solutos; un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de
concentracin de solutos, evitando el estrs osmtico y permitiendo una organizacin
espacial de los componentes de la formulacin en forma similar a antes del congelamiento
(Grauer et al., 2015).
La temperatura y el tiempo para una congelacin completa de la formulacin
dependen de la naturaleza de la misma. Nireesha et al. (citado por Grauer et al., 2015) indica
que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la
microestructura del producto seco, de ah que una correcta congelacin, reduce la
desnaturalizacin trmica del liofilizado, inmoviliza componentes de la solucin, y evita
la formacin de espuma cuando se aplica el vaco (Adams, 2007).
c) Secado primario. Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacin, adems es la de ms larga
duracin. En este etapa, la presin se reduce y la temperatura de la formulacin congelada
es elevada, dando lugar a la sublimacin (Figura 3) y migracin de vapor de agua (Grauer
et al., 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador. Sin embrago, dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
eutctica, de colapso, de transicin vtrea (Tg), para minimizar el dao de la muestra
(Adams, 2007).
-
18
Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. Se indican los requerimientos de presin
y temperatura que hacen posible la sublimacin del agua durante la liofilizacin.
Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pg. 19). Journal of Validation Technology, 18-23.
El tiempo para el secado primario depende de mltiples factores, como la
composicin de la solucin protectora, la porosidad del congelado, la calidad o resistencia
de la matriz, la cantidad de muestras, as como tambin el volumen de la formulacin entre
otros. Respecto al volumen, para las bacterias, las muestras rara vez tienen que ser grandes
y por lo general son de 0,25 a 0,5 ml (Ops Diagnostics, 2015). Aunque no existe un
volumen establecido, hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de ms
tiempo.
Segn Ops Diagnostics (2015), un perodo de secado primario de un da es suficiente,
pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras, teniendo
como gua un tiempo de liofilizacin de una noche.
La etapa de secado primario finaliza cuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulacin, y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congelada (Jennings, 2008, pg. 6).
d) Secado secundario. Es la tercera y ltima etapa de la liofilizacin. Al terminar el secado primario, se ha
eliminado el agua mvil de la muestra. Sin embargo, existe agua atrapada dentro del slido
amorfo que es ms difcil de eliminar (Fetterolf, 2010). La cantidad de agua es discutible,
ya que flucta en funcin de la temperatura y las caractersticas propias de los
-
19
constituyentes de la formulacin, por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10% w/w del producto seco (Jennings, 2008) o del 2-4% (Ops Diagnostics, 2015).
La reduccin del contenido de humedad en la torta se logra por desorcin (Adams,
2007), sin reducir el volumen de la misma (Jennings, 2008). Esto se consigue aumentando
la temperatura y reduciendo la presin parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings,
2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario, durante el secado secundario
(Ops Diagnostics, 2015). Es importante que la temperatura no se incremente velozmente, y
que se mantenga por debajo de la temperatura de transicin vtrea, la cual, aumenta
conforme el agua es eliminada (Fetterolf, 2010).
Segn Ops Diagnostics (2015), esta etapa es relativamente corta, con una duracin de
1 a 2 horas, aunque Grauer et al. (2015) indica que representa entre el 30-40% del tiempo
total del proceso; as mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo,
con una duracin de hasta varios das. Esto resulta importante puesto que la cantidad de
agua residente luego del secado, afecta la tasa de prdida de viabilidad durante el
almacenamiento (Grauer et al., 2015, pg. 16)
Finalmente, al ser removida la humedad residual, la muestra (denominada en adelante
liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al., 2015), obteniendo un contenido en forma
de torta porosa (Figura 2), o pastel esponjoso con poca (inferior al 1%) o nula humedad
residual (Fetterolf, 2010).
Las tres etapas del proceso de liofilizacin, en funcin de la temperatura y la presin
y en contraste con el diagrama de fases del agua, pueden ser observadas en la Figura 4.
Figura 4. Descripcin global del proceso de liofilizacin. De 1-3, Congelamiento (1-2 presin
atmosfrica); de 3-4, secado primario; de 4-5, Secado secundario.
Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pg. 19). Journal of Validation Technology, 18-23
-
20
e) Sellado y almacenamiento. Terminado el proceso de secado secundario, se deben sellar los viales al vaco (de ser
posible) o de forma hermtica tan pronto como sea posible, debido a que la torta actuar
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf, 2010), aunque
tambin es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams, 2007), e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de slice.
Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente. Sin embrago, aunque
se logre un correcto sellado al vaco, no se puede asegurar una larga vida til en condiciones
ambientales, ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo, y se alcanza mayor
supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al., 2015),
por ello, lo mejor es almacenar los liofilizados a 4 C en la oscuridad (Ops Diagnostics,
2015), reduciendo las posibilidades de prdidas aunque haya quedado agua despus del
secado.
f) Reactivacin o rehidratacin. Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacin original, esto
implica la adicin de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings, 2008;
Grauer et al., 2015). La dilucin rpida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings, 2008), da cuenta de un correcto proceso de liofilizacin.
Tiempos de reconstitucin excesivamente largos, la prdida de potencia, o la formacin
de una solucin turbia son indicios de un proceso de liofilizacin inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilizacin (Jennings, 2008, pg. 11).
La recuperacin de las clulas, sin embrago, tambin se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacin), el tipo
de diluyente, su temperatura, su pH, la osmolaridad (Grauer et al., 2015), la potencia del
lioprotector (Jennings, 2008), entre otras propiedades de la solucin resultante.
Grauer et al. 2015, sugieren la utilizacin de medios de cultivo nutritivos no
selectivos para la recuperacin de los microorganismos, con el fin de evitar el estrs
osmtico que pueden causar las soluciones diluidas; sin embargo, algunos laboratorios
venden los diluyentes de rehidratacin especficos para cada microorganismo o de forma
estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato.
Ops Diagnostics (2015), indican que una tasa de supervivencia superior al 50% se
considera aceptable por muchos laboratorios.
2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado.
Las propiedades fsicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a
nivel comercial y tienen en su mayora un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las
condiciones de almacenamiento tendrn sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del
mismo. Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacin entre los
parmetros de la formulacin y el proceso de liofilizacin, por ello, permiten el seguimiento y la
deteccin de falencias (Jennings, 2008).
-
21
Esta evaluacin permite caracterizar las diferentes propiedades fsicas, qumicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendrn sobre dichas propiedades. Jennings (2008) y Tic
G. (1987), recogen algunos de las tpicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado, por ejemplo, las propiedades generales fsicas de la torta (color, volumen, temperatura
de transicin, textura, porosidad, densidad, contraccin o colapso, estado del vial, entre otras, que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacin), su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfrica), la velocidad de redisolucin o
reconstitucin, la estabilidad (de la torta, el microorganismo o el lioprotector; evaluada de forma
natural o acelerada), nivel de humedad residual, posibles contaminantes, entre otras.
2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar.
Como ya se mencion inicialmente, el proceso de liofilizacin, requiere de un equipo llamado
liofilizador (Figura 5), este equipo consta esencialmente de tres partes:
a) Un sistema o bomba de vaco, que reduce la presin del ambiente de la cmara que contiene el material a secar. Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa
para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo daen. El nivel
de vaco requerido debe ser entre 50 y 100 bar (Grauer et al., 2015, pg. 9) aunque 200
bar son aceptables.
b) Un condensador con circuito de refrigeracin, que comunica con la cmara de secado y condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacin, sobre una superficie enfriada
inferior a los -40C.
c) Cmara o accesorio de secado, que es donde se coloca el material a secar. Segn Nireesha et al., (2013) puede ser de tres tipos:
- Manifold o colector mltiple. - Rotary. - Tray style, de bandejas con o sin estante de taponado, ste ltimo cuenta con un sistema
para sellado al vaco de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas.
Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. En la imagen, el liofilizador usa una
cmara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial.
Tomado de http://slideplayer.com.br/slide/84760/ el 15 de Agosto de 2015.
-
22
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de criopreservacin de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de
viabilidad, y liofilizacin de las mismas, evalundolas frente a tres compuestos protectores.
3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Evaluar el estado de la criopreservacin de cinco cepas bacterianas utilizando tcnicas de recuento
en placa estndar.
Evaluar tres lioprotectores para liofilizacin de cepas microbianas.
Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacin.
Disear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacin a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados.
-
23
4. METODOLOGA
La metodologa general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases, como es ilustrado en la
Figura 6:
Figura 6. Metodologa. Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia lgica de eventos,
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra.
4.1. FASE INICIAL.
4.1.1. Acervo Microbiano.
De la coleccin de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Gentico del laboratorio de
microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital
Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC), se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores
resultados individuales en la biodecoloracin de una mezcla de colorantes residuales generados por
el laboratorio de microbiologa; estas corresponden a CR004, CR005 (sustituida posteriormente
por CR009), CR006, CR007 y CR010, segn los resultados del trabajo de grado desarrollado por
Rodrguez (2013). Todas estaban conservadas por el mtodo de criopreservacin (o
criocongelacin) a una temperatura de -85 C 1C.
4.1.2. Eleccin de los protectores.
4.1.2.1. Crioprotectores.
El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99.999%) (Mallinckrodt, Mxico) en
proporcin 67% v/v segn lo establecido por Martnez & Mayorga (2013).
4.1.2.2. Lioprotectores.
Para la eleccin de los agentes protectores y sus concentraciones en %p/v (Tabla 1), se
tuvieron en cuenta diferentes estudios: en contraposicin a Hensel (1994), se tomaron
concentraciones superiores al 9% de Glucosa (Merck, Darmstadt), de forma aleatoria. En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck, Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed &
Roos (2004) y Palmfeldt, Radstrm, & Hahn-Hgerdal (2003). Para la leche descremada
(Proleche, Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al. (2003). Dichos estudios
fueron tomados como referencia terica, aunque los microorganismos en ellos especificados, no
correspondan con los del presente trabajo.
Criterios de eleccin de los
microorganismos as como de
los lioprotectores a evaluar.
Evaluacin de los mtodos de
conservacin (criopreservacin
y liofilizacin).
Ajustes a la liofilizacin
para la generacin de
protocolos.
Proceso de Datado
Fase inicial
Fase intermedia 1
Fase intermedia 2
Fase final
-
24
Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas.
Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada
Concentracin
%p/v
10% 4% 10%
11.7% 10% 15%
27% 15% 20%
4.2. FASE INTERMEDIA 1.
4.2.1. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin.
En este trabajo se evaluaron dos mtodos de conservacin (criopreservacin y liofilizacin),
dicha evaluacin se realiz en trminos de tres (3) indicadores, valorados previamente (pre) y
posteriormente (pos) al mtodo en s.
4.2.1.1. Viabilidad.
Para evaluar este indicador se utiliz:
a) Conteo directo con cmara de Neubauer 1/10mm (Boeco), siguiendo la metodologa planteada por Valencia Z. (2004). Sin embargo, para obtener el nmero de bacterias, se
utiliz la ecuacin planteada por Bastidas (2015):
No de bacterias/ml=
*Fd: Factor de dilucin =
El conteo directo con cmara de Neubauer solo se realiz previamente al mtodo de conservacin
evaluado.
b) Conteo de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa, segn lo descrito por Valencia Z. (2004) y Camacho et al. (2009). Para el clculo de UFC/ml se
utiliz la siguiente frmula:
UFC/ml = N de colonias
Los clculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologa planteada por
Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales se utiliz los planteamientos del Instituto
de Salud Pblica del Gobierno de Chile (2008). Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilizacin, y solo pos a la criopreservacin, en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid,
England).
El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre y/o pos al proceso de conservacin,
fue calculado a travs de la ecuacin propuesta por Morales-Garca et al., (2010):
Tasa de supervivencia (BSR %) = *DD: Despus de la desecacin
**AD: Antes de la desecacin
N Total de bacterias contadas 250000
Fd* N de cuadrados contados
g o ml de muestra
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
1
Factor de dilucin
1
ml de muestra
Log (1 + N UFC/ml DD*) x 100
Log (N UFC/ml AD**)
-
25
4.2.1.2. Estabilidad Morfolgica.
Para evaluar este indicador se realiz:
a) Conteo en placa (caractersticas macroscpicas): Se elabor un formato (anexo 1) con las caractersticas macroscpicas descritas por Valencia Z. (2004), Prez & Mota (2006) y Daz
(2009), para las colonias desarrolladas en superficie, a partir del procedimiento de conteo
de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa. Se utiliz un
contador de colonias CC-1 (Boeco).
- Se seleccion solo una de dos placas, de una dilucin, conteniendo siempre un nmero de
UFC representativas, segn el rango estipulado por Camacho et al., (2009).
- Las caractersticas macroscpicas fueron observadas en al menos el 80% de las colonias
de la placa seleccionada.
b) Tincin de Gram (caractersticas microscpicas): Posterior al procedimiento anterior, se realiz una coloracin de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la
compatibilidad morfolgica con el microorganismo esperado (Snchez & Corrales, 2005,
pg. 24).
Se compararon con las caractersticas microscpicas y macroscpicas descritas por
Rodrguez (2013) y la informacin de la base de datos para cada cepa. De igual forma se tom
registro fotogrfico para la base de datos a travs de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con
cmara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue, y un estereoscopio (Zeiss)
con cmara Canon G9.
4.2.1.3. Pureza.
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfolgica en
cada conteo de clulas viables realizado por el mtodo de conteo de microorganismos mediante
tcnica de extensin superficial en placa.
4.2.2. Recuperacin de los microorganismos.
Para la recuperacin de los microorganismos se tom un criovial de cada cepa bacteriana,
sometido a una temperatura de 37C (Arcos, Ossa, & Daz, 2004) en bao serolgico, con agua
destilada, hasta su descongelacin, por aproximadamente cinco (5) minutos (Martnez & Mayorga,
2013). Los crioviales se introdujeron en bao serolgico una vez se lleg a la temperatura deseada,
no antes.
De cada criovial se tom un (1) ml con micropipeta, previamente agitado con Vrtex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (2240rpm) por diez (10) segundos, diluyndolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martnez & Mayorga, 2013). Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 C 1C de 18-24 horas.
Se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin a cada criovial (Thomas
Scientific, 5150636) por cepa, luego de preparado el tubo T01, antes de la incubacin. Se
compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacin
consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martnez & Mayorga
(2013) y Rodrguez (2013).
-
26
4.2.3. Criopreservacin.
4.2.3.1. Precriopreservacin.
Pasado el tiempo de incubacin, se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de
conservacin al tubo T01, con el fin de determinar el nmero de clulas totales y viables de la
muestra. El conteo en Cmara de Neubauer se realiz solo hasta el final de los procedimientos de
preservacin, por lo cual una vez preparadas las diluciones, estas fueron llevadas a nevera a 4C
1C, para evitar la generacin de nuevas clulas.
4.2.3.2. Preparacin del inculo bacteriano y ejecucin de la criopreservacin.
Se sigui el protocolo de criopreservacin establecido por Martnez & Mayorga (2013),
consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologa de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, con
algunas variaciones:
Con pipeta estril de 5ml, se depositaron en cinco (5) crioviales 1,2ml de glicerol anhidro estril.
Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 15s; diluyndolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02).
Posteriormente se tomaron alcuotas desde T02 de 600l, previo Vrtex nivel 7 por 15s, depositadas en cada criovial, para aforar un volumen final de 1800l. Se rotularon y se
realiz Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 5s para su homogenizacin.
Inmediatamente despus de la homogenizacin, fueron puestos en el Freezer Premium U570
(New Brunswick), a una temperatura de -85C 1C, en los respectivos racks para reemplazar los
crioviales existentes de la cepa en cuestin.
Este procedimiento se realiz en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminacin del medio, procurando adems, no sobrepasar veinte (20) minutos (Martnez &
Mayorga, 2013), desde la extraccin de la alcuota de T01 y la congelacin, esto con el fin de evitar
la generacin de nuevas clulas.
4.2.4. Liofilizacin. Etapa 1.
4.2.4.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano.
Se parti del tubo T01 de cada cepa bacteriana, como inculo inicial para el proceso de
liofilizacin. Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vrtex nivel
7 (2240rpm) por 15s, diluyndolo en nueve (9) ml agua destilada estril (T03).
4.2.4.2. Ejecucin de la liofilizacin.
Partiendo del tubo T03, previamente agitado con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 15s, se
extrajeron alcuotas de cien (100) l, veintisiete (27) veces, depositados en cada uno de los
crioviales a liofilizar. En cada criovial, se adicionaron novecientos (900) l de lioprotector, en tres
crioviales por cada concentracin de lioprotector, de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2).
Con el fin de que la concentracin de lioprotector en el interior del criovial fuera lo ms
exacta posible al adicionarle la alcuota del tubo T03, se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparacin:
-
27
Donde el volumen inicial y la concentracin inicial corresponden al protector al momento de
ser preparado, en tanto que el volumen final y la concentracin final (Tabla 2) corresponden al
protector luego de agregada la alcuota del tubo T03.
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (alcuota ms protector), se
agit con Vrtex nivel 2 (640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacin.
Posteriormente, a los crioviales se les retiraron las tapas plsticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney, PM-996) esterilizado, realizando seis (6) perforaciones concntricas en la superficie
con aguja hipodrmica 21G x 1. Los crioviales fueron congelados en nitrgeno lquido por
15min aproximadamente, depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD, Thermo
Scientific) de 24-48 horas, a una presin inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45C, usando el colector mltiple (manifold).
Terminado el proceso, se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la cmara
de flujo laminar para evitar contaminacin de las muestras; all se les retir el Parafilm, se les tap
con tapas estriles y se les rotul.
Tabla 2. Nmero de repeticiones (y tubos), segn lioprotector y concentracin.
Lioprotector Concentracin
%(p/v)
Serie
A B C
Glucosa
10% 1 1 1
11.7% 1 1 1
27% 1 1 1
Sacarosa
4% 1 1 1
10% 1 1 1
15% 1 1 1
Leche
descremada
10% 1 1 1
15% 1 1 1
20% 1 1 1
Total crioviales segn N 9 9 9
Total crioviales usados por cepa 27
4.2.4.3. Posliofilizacin (Rotulado y almacenaje).
Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacin, utilizando una etiqueta o
rtulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacin:
Cdigo de la cepa: Cdigo asignado para cada microorganismo en la base de datos, el Freezer y el banco de liofilizados. Corresponde a la descripcin del tipo de coleccin
biolgica (coleccin microbiolgica, CM), siglas de la coleccin (Colorantes, CR),
nmero de la cepa en la coleccin (004) y el tipo de vial (Trabajo, T).
Nivel de riesgo Biolgico: Se utiliz una escala de colores para la clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3), con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). Esta clasificacin por grupos de riesgo
-
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratorio (OMS, 2005, pg. 1). El grupo de riesgo
biolgico solo aparece en las muestras liofilizadas, no en las criopreservadas, ya que stas
tienen rtulos distintos.
Ubicacin en el banco de liofilizados: Muestra la ubicacin exacta de cada vial. Corresponde a la bandeja (BAN A), la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1). Adicional
a ello, se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracin en este vial.
Fecha: Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccin.
Figura 7. Rtulos creados para los viales liofilizados.
Posterior al proceso de rotulado, los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano, a temperatura ambiente y protegido de la luz.
Tabla 3. Cdigo de colores propuesto segn la clasificacin de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS.
C.C.* en
CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcin
Grupo de riesgo 1
Riesgo individual y
poblacional escaso o nulo.
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o los animales.
Grupo de riesgo 2
Riesgo individual
moderado, riesgo
poblacional bajo.
Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
de entraar un riesgo grave para el personal de
laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente.
Grupo de riesgo 3
Riesgo individual elevado,
riesgo poblacional bajo.
Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades
humanas o animales graves, pero que de ordinario no se
propagan de un individuo a otro. Existen medidas
preventivas y teraputicas eficaces.
Grupo de riesgo 4
Riesgo individual y
poblacional elevado.
Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades
graves en el ser humano o los animales y que se
transmiten fcilmente de un individuo a otro, directa o
indirectamente. Normalmente no existen medidas
preventivas y teraputicas eficaces.
Grupo de riesgo
desconocido
Agentes desconocidos. Para su manipulacin referirse al
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
(2005).
Nota: *Cdigo de Color. Fuente: Adaptado de OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio
(pg. 1). Ginebra: Ediciones de la OMS. Recuperado de http://www.who.int/csr/resources/publications
/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf
-
29
4.2.5. Rehidratacin o Reconstitucin. Etapa 2.
Se realiz una prueba de estabilidad natural en trminos del aspecto fsico y la viabilidad de
cada liofilizado luego de un perodo prolongado de tiempo (Grauer et al., 2015) en almacenamiento
a temperatura ambiente. Por ello, la rehidratacin de los crioviales se realiz en tres intervalos de
tiempo (Tabla 4).
Tabla 4. Rehidratacin de los crioviales.
Primera rehidratacin Segunda rehidratacin Tercera rehidratacin
Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota: Intervalos de tiempo medidos en das, contados desde el da de almacenaje, en los cuales se rehidrat
cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie, ver Tabla 2). El aspecto fsico de cada
liofilizado fue datado antes de cada rehidratacin y comparado con su estado antes del almacenaje.
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37C, tomando
el tiempo de reconstitucin, luego incubados a 25C 1C por 30min y agitada con Vrtex nivel
2 (640rpm) por 7s. Posteriormente, se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de
conservacin. El indicador de viabilidad se evalu solo con el mtodo de conteo de
microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa.
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la ms alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa, se eligi el
lioprotector y la concentracin de ste, que permiti obtener un mayor nmero de clulas viables
posliofilizacin y que ofreci adems una menor variacin durante la prueba, para la liofilizacin
definitiva de las cepas en estudio. Dicho lioprotector se estableci adems como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados, del Banco
Gentico del laboratorio de microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC).
4.3. FASE INTERMEDIA 2.
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores, con el nimo de
generar un protocolo funcional, aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo, la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se parti de cultivos puros sobre medios slidos, se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacin, liofilizacin y posliofilizacin, para la
liofilizacin definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados.
4.3.1. Liofilizacin definitiva.
Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracin ptima, para cada cepa
de estudio, se realiz la liofilizacin definitiva.
4.3.1.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano.
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC, se tomaron 4 asadas con
abundante crecimiento microbiano, inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector
general. Posteriormente se agit con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 45s. Esto se realiz para cada
cepa.
-
30
4.3.1.2. Ejecucin de la liofilizacin.
El tubo T04 de cada cepa bacteriana, como inculo inicial para el proceso de liofilizacin
definitiva, se extrajeron cuatro (4) alcuotas de un (1) ml, previamente agitado con Vrtex nivel 7
(2240rpm) por 15s, que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass, 62113D-2)
posteriormente tapados con tapn de divisin. Cada vial se agit con Vrtex nivel 2 (640rpm) por
7s para su homogenizacin.
Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitrgeno lquido por 15min
aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas, a una presin
inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45C.
El proceso de destape parcial y congelacin se realiz en cmara de flujo laminar para evitar
al mximo la contaminacin. El transporte de los viales desde la cmara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitrgeno lquido,
para evitar contaminacin y descongelacin.
4.3.1.3. Posliofilizacin.
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacin. Dos viales,
designados como trabajo (T) y stock (S), fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente. Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4C 1C.
4.3.1.4. Rehidratacin.
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratacin de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento.
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio slido.
4.3.2. Control de calidad de la liofilizacin y ajustes tcnicos.
Se llev un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el nimo de
identificar falencias en el proceso de liofilizacin. Al identificarlas, se decidi repetir la
liofilizacin definitiva con los nuevos parmetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las
cepas estudio.
4.3.2.1. Propiedades fsicas generales.
Se observaron diferencias en volumen (encogimiento), color, textura, brillo, aspecto de la
torta y fractura de los crioviales y viales, teniendo como punto de comparacin la formulacin
luego de congelada. Esto se realiz para:
- Crioviales de la fase intermedia 1. - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.1). - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.3).
4.3.2.2. Contaminacin.
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad, en
bsqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio.
-
31
4.3.2.3. Tiempo de redisolucin o reconstitucin.
Se midi el tiempo de reconstitucin de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase
intermedia 1 y, el tiempo de los crioviales que contenan el lioprotector general, fue comparado
con el tiempo de reconstitucin de los viales de la liofilizacin definitiva y los viales sometidos a
la prueba de estabilidad acelerada.
4.3.3. Pruebas adicionales.
Para estas pruebas solo se us la formulacin del lioprotector general y la cepa CM-CR010,
por su alta tasa de crecimiento respecto a las dems cepas evaluadas.
4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad msica.
Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el
lioprotector general. Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Tic G., 1987), se
tomaron los pesos con balanza analtica (AND, GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por
una (1) hora y se promediaron sus pesos. El cuarto vial y criovial, se abrieron solo una vez, luego
fueron sellados completamente, tomando sus pesos de la misma forma ya descrita.
Para determinar si existe un tiempo mximo admisible de cerrado, se midi el contenido de
agua absorbida por parte del lioprotector general en funcin del tiempo, utilizando la ecuacin
descrita por Garca C. (2007):
*Wt (%) es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)
*Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)
*Mo (kg) es el peso seco de la muestra
4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada.
Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa, uno fue rehidratado a los cero (0) das y el otro
luego de siete (7) das en el interior de la cmara de envejecimiento, ambos en las condiciones que
se muestran en la tabla 5. Adicionalmente se dataron sus propiedades fsicas generales al finalizar
el secado y antes de rehidratar.
Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada.
N vial t T - HR
1 0 - ambiente - 25%
2 7 - 37C - 100%
Nota: Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos. t= Tiempo en das;
T=Temperatura; HR=Humedad relativa. La prueba de estabilidad se realiz en una cmara de
envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas.
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37C, luego
incubados a 25 C 1C por 30min y agitada con Vrtex nivel 2 (640rpm) por 7s. Posteriormente,
se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin midiendo viabilidad con el mtodo
de conteo de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa.
-
32
4.3.4. Control de esterilidad.
Todos los medios, reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave
Tuttnauer (3850 EL) a 121C y 210Kpa por 20 minutos; las puntas de micropipetas, los viales,
crioviales y sus respectivas tapas, fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presin y
temperatura en un tiempo de 15 minutos. Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de
Petri y pipetas), fueron esterilizados en horno Binder a 160C por 120 minutos.
Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo, desde la
preparacin de medios hasta el sellado de los viales, como se describe a continuacin:
4.3.4.1. Medios.
Se realiz control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid, England) (en solucin de
rehidratacin y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejndolos en incubacin en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacin. Se determin como indicador de contaminacin
cambios pticos (turbidez u opacidad) en los medios lquidos y presencia de colonias en medios
slidos.
4.3.4.2. Ambiente.
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. El proceso de control de ambiente se realiz con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab, 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas. El periodo de exposicin fue de 15 a 30 minutos, dejndolos en
incubacin de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacin de las cepas de trabajo.
b) Cabina de flujo laminar. Se realiz el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento, pero en este
caso la caja de control de ambiente se dej abierta desde el inicio hasta el final de los
procesos que requeran el uso de la cabina, esto es, tiempos de exposicin de hasta 3 o 4
horas. Este control se llev a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar.
4.3.4.3. Tcnicas de siembra y manipulacin de elementos.
Aunque la mayor parte del trabajo se desarroll en el interior de la cabina de flujo laminar,
se procur mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo, siguiendo no solo los protocolos
de uso de la cabina, sino adems un riguroso uso de elementos de proteccin como guantes y
tapabocas. Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente
con alcohol 70% al iniciar el trabajo con cada cepa.
4.4. FASE FINAL.
4.4.1. Base de datos.
Se realiz una revisin a la base de datos del Banco de cepas creado por Martnez & Mayorga
(2013) en el programa Access, modificando algunos aspectos generales he introduciendo una
seccin para la informacin de los organismos liofilizados.
-
33
4.4.2. Fichas de resumen.
Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccin, tanto del Freezer
como del banco de liofilizados, utilizando el programa Word 2013.
4.4.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer.
Se realiz una revisin de la informacin en los rtulos de los crioviales y de etiquetas en las
cajas respecto a la base datos, con el nimo de verificar si se haban cumplido los protocolos y la
logstica establecida por Martnez & Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles
falencias.
4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados.
Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013, para el control de cepas en el banco
de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martnez & Mayorga (2013) en la seccin
de criopreservacin.
Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados.
Cdigo Tipo de registro Ubicacin Uso
FLf-01 Registro de entrada de cepas.
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando ingresa una nueva cepa
a la coleccin.
FLf-02 Proceso de liofilizacin.
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cuando se realice liofilizacin a
una cepa.
FLf-03 Registro de control de calidad.
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Al rehidratar una cepa de la
coleccin y antes de liofilizar
una cepa para la coleccin.
FLf-04 Solicitud salida de cepas.
Archivero del laboratorio y Base
de datos
Cada vez que una cepa sea
pedida y salga del banco de
liofilizados.
Fuente: Adaptado de Martnez Bentez, H. L., & Mayorga Burgos, L. P. (2013). Implementacin de un
sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologa de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (Tesis de
pregrado). (pg. 44). Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, Bogot, Colombia.
4.4.5. Manual de procedimientos.
Se realiz una revisin de la cartilla de procedimientos elaborada por Martnez & Mayorga
(2013). Se tom la decisin de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013.
-
34
5. RESULTADOS
5.1. RECUPERACIN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIN DE LA
CRIOPRESERVACIN.
A raz de la evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin en cada criovial por cepa,
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004, CM-CR006, CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno. En cuanto a CM-CR005, se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer, pero no fue posible recuperarla, por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009, la sexta mejor respecto al criterio de eleccin de cepas.
Con los datos del proceso precriopreservacin de las cepas de inters correspondientes a la
coleccin de colorantes, consignados en el trabajo de Martnez & Mayorga (2013), en conjunto con
los datos de viables poscongelacin del presente trabajo, se calcul la BSR para cada cepa (Tabla
7). Se encontr que los porcentajes de BSR son superiores al 70% luego de dos (2) aos de estar
en criopreservacin (Figura 8), salvo CM-CR005.
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martnez & Mayorga (2013) (slo se compararon los datos de la cepa CM-CR010, ya que las dems
cepas no figuran en su trabajo) se encontr un porcentaje inferior de recuperacin
poscriopreservacin por parte de las autoras, por lo cual se revis la metodologa, encontrando un
error metodolgico al calcular la BSR en su trabajo. Usando los datos de resultados prueba de
viabilidad poscongelacin, tabla 19 (en Martnez & Mayorga, 2013, pg. 54), se corrigi la BSR
para esta cepa, evidenciando ser la cepa ms resistente al proceso de criopreservacin, entre las
evaluadas, con alrededor de 6.6% de cada luego de dos aos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8).
Tabla 7. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin (criopreservacin).
Nota: Se muestran los resultados al evaluar la conservacin de las cinco (5) ce