Corso di Biotecnologie interfacoltàModulo: Laboratorio di Microbiologia
medica ed applicata Prof.ssa Christine Schwienbacher
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI FERRARA
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica
Sezione di Microbiologia
Anno Accademico 2011 - 2012
Presentazione corso batteriologico:
• Urinocoltura:
semina quali-quantitativa
• Valutazione della crescita batterica su diversi terreni
• Antibiogramma secondo Kirby-Bauer
• Identificazione mediante sistema biochimico (API oppureEnterotube)
• PAR test
Campione urine
ESAMINARE IL CAMPIONE ENTRO
2 ORE DAL PRELIEVO oppure
CONSERVARE A +4°C PER 24 ORE
Semina quali-quantitativa (Ricerca patogeni causa
di infezione) : TSA terreno TVC totale.
TERRENI SELETTIVI:
MacConkey, mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar
Chromogenic UTI Medium
Dopo incubazione
Interpretazione:
lettura piastre
2-Identificazione : test
biochimici (Enterotube II)
1-Antibiogramma
(Test sensibilità MIC=
Minima concentrazione
inibente)
PAR test
(Potere antibatterico residuo)
Refertazione
• FASE 1
– Semina quali-quantitativa urine su piastra di diversi terreni:
– TCV => TSA TERRENO GENERICO BASE
– TERRENI SELETTIVI:
• Agar MacConkey 3
• Agar mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar
• Chromogenic Urinary Tract Infection(UTI) Medium
• FASE 2:
– Interpretazione semina su piastra
– Allestimento PAR test
• FASE 3
– Interpretazione PAR test
• FASE 4:
– Allestimento Antibiogramma
– Allestimento API oppure Enterotube
• Fase 5:
– Interpretazione Antibiogramma
– Interpretazione API oppureEnterotube
– Conclusioni finali: REFERTO
FASE 1: Semina quali- quantitativa urine su TSA agar, MacConkey, mEnterococcus , Columbia agar, Cetrimide agar e Chromogenic Urinary Tract (UTI) Medium.
AGAR MACCONKEY n.3Terreno selettivo per differenziare in modo ottimale i coliformi
ed enterobatteri patogeni non fermentanti il lattosio :
Composizione
.
DescrizioneÈ una modificazione altamente selettiva del terreno MacConkey,adatta per la crescitae il conteggio dei batteri coliformi ed anche per la loro differenziazione dagliAltri coliformi, gli enterobatteri patogeni come Salmonella e Shigella, che nonfermentano il lattosio.La presenza i una frazione particolare di sali biliari in aggiunta al cristal-violetto, ilterreno migliora la differenziazione fra coliformi e microrganismi che nonfermentano il lattosio. I cocchi gram positivi (esempio Staphylococcus spp.) sonocompletamente inibiti.
Peptone 20.0 g/l
Lattosio 10.0 g/l
Sali biliari n3 1.5 g/l
Sodio cloruro 5.0 g/l
Rosso neutro 0.03 g/l
Cristal violetto 0.001 g/l
Agar 12.0 g/l
pH = 7.0 +/- 0,2
ASPETTO DELLE COLONIE
Le caratteristiche delle colonie rappresentano un’identificazione
solo presuntiva, che deve essere confermata mediante test
biochimici specifici (esempio Enterotube II).
I batteri che fermentano il lattosio (es. E. coli) danno coloniecircondate da un alone di sali biliari precipitati (questa reazione èdovuta all’azione di acidi prodotti dalla fermentazione del lattosiosui sali biliari e il successivo assorbimento del rosso neutro(perciò le colonie di E. coli risultano di colore rosso-viola).I batteri che non fermentano il lattosio (es. Salmonelle) nonmodificano il colore del terreno; danno una reazione alcalina e lecolonie appaiono trasparenti.
Tecnica:Inoculare le piastre ed incubare a 35±2°C per 16- 24 ore perbatteri che non fermentano il lattosio e fino a 48 h per batteri che fermentano illattosio.
MICRORGANISMO COLORE OSSERVAZIONI
ESCHERICHIA COLI COLONIA VIOLA CON ALONE DI
PRECIPITAZIONE ROSSO
PSEUDOMONAS AERUGINOSA INCOLORE -ROSA COLONIE IRREGOLARI
COCCHI GRAM+ INIBITI : NON CRESCONO
ENTEROBACTER AEROGENES ROSSO MATTONE SENZA ALONE DI
PRECIPITAZIONE
COLONIE PIÙ PICCOLE DI E.COLI
SALMONELLA/SHIGHELLA INCOLORE TRASPARENTE
mENTEROCOCCUS
Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.
Composizione
Descrizione
Questo terreno evidenzia gli enterococchi (streptococchi del gruppo D); tutte le
colonie rosse, marroni o rosa sono da considerare presunti enterococchi.
Inibito E. coli.
Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.
Triptosio 20.0 g/l
Estratto di lievito 5 .0 g/l
Destrosio 2.0 g/l
Sodio fosfatomonoacido idrato 4 .0 g/l
Sodio azide 0.4 g/l
Tetrazolio cloruro (TTC) 0.1 g/l
Agar 10.0 g/l
pH = 7.2 +/- 0,2
mENTEROCOCCUS
Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.
ASPETTO DELLE COLONIE
MICRORGANISMO COLORE
ENTEROCOCCHI (STREPTOCOCCHI DEL GRUPPO D)
COLONIE DI COLORE ROSA-ROSSO SCURO-MARRONE
ESCHERICHIA COLI NESSUNA CRESCITA
ENTEROCOCCUS FAECALIS CRESCITA ABBONDANTE CON COLONIE DI COLORE ROSA -ROSSO SCURO
Tecnica: Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le
caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.
CHROMOGENIC TRACT URINARY INFECTION (UTI) MEDIUM
Terreno cromogeno per l’identificazione presuntiva e la differenziazione della maggior parte di
patogeni che possono causare infezioni del tratto urinario (UTI).
Il terreno contiene due substrati cromogeni specifici che sono scissi da enzimi prodotti da
Enterococcus spp., da Escherichia coli e dai coliformi.
Contiene, inoltre, triptofano per mettere in evidenza l’attività dell’enzima triptofano deaminasi che, a
sua volta, indica la presenza di Proteus spp..
Lo scarso contenuto di elettroliti che presenta il terreno Chromogeni UTI impedisce la sciamatura
del batterio Proteus spp..
Composizione
DescrizioneIl bersaglio del primo cromogeno, X-Glucoside, è la b-glucosidasi e consente di identificare in
modo spedifico gli enterococchi che formano colonie blu.
L’altro cromogeno, Rosa-Galattoside, è scisso dall’enzima b-galattosidasi che è prodotto da
Escherichia coli, che forma colonie rosa.
Quando vi sono incertezze di identificazione si può eseguire il test biochimico seguente: si
preleva dalla piastra una colonia di E. coli sospetta e si esegue il test dell’indolo con reattivo
DMAC.
Peptone 15.0 g/l
Miscela cromogena 13.0 g/l
Agar 15.0 g/l
pH=7,0+/-0,2
I coliformi vengono differenziati perché si avviene la scissione
di entrambi i cromogeni formando colonie di colore porpora.
Il terreno contiene inoltre triptofano che si comporta da
Indicatore dell’attività triptofano deaminasica: Proteus, Morganella e
Providencia spp. formano colonie circondate da un alone marrone.
E’ importante precisare che i batteri con “pattern” enzimatici atipici
possono fornire reazioni anomale.
Per esempio, durante una semina
su terreno Chromogenic UTI, oltre il 45% di Enterobacter cloacae
saggiati ha evidenziato la mancanza della b-glucosidasi.
Le colonie di tali ceppi sono risultate di colore rosa, difficilmente
distinguibili da quelle di E. coli.
In questi casi si esegue su carta da filtro il test dell’indolo con reattivo
DMAC oppure utilizzare il reattivo di Kovacs, si dovrebbe evidenzia re il colore rosa - bordeaux della reazione positiva del test dell’indolo).
Questo test consente di differenziare E. coli da Enterobacter spp. ,
nonché Proteus mirabilis da altre specie.
ASPETTO DELLE COLONIE:
Tabella delle reazioni colorimetriche tipiche
Tecnica:Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le
caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.
MICRORGANISMO b-D GALATTOSIDASI
b -GLUCOSIDASI
TDA TRIPTOFANO DEAMINASI
COLORE DELLE COLONIE
ENTEROCOCCHI + BLU
ESCHERICHIA COLI + ROSA
COLIFORMI + + PORPORA
PROTEUS /MORGANELLA E PORVIDENCIA SPP.
+ MARRONE
PSEUDOMONAS FLUORESCENTE
STAPHYLOCOCCUS PIGMENTAZIONE NORMALE
Organism ß-galactosidase ß-glucosidase TDA Colony colour
Enterococci - + - Blue
E. coli + - - Pink
Coliforms + + - Purple
Proteus/Morganella& Providencia spp.
- - + Brown
Pseudomonads - - - Fluoresce
Staphylococci - - -Normal
pigmentation
Terreno:
Chromogenic UTI Medium :
Blu-verdi = Colonie di Enterococchi
Rosa= colonie di Escherichia coli
Azzurre= colonie di coliformi (Gruppo KES)
Pseudomonas
aeruginosa
Enterobacter
cloacae
Proteus mirabilis
Enterococcus
faecalis
Escherichia Coli
Staphylococcus
aureus
Metodo: SEMINA QUANTITATIVA
• Materiale:– urine
– 1 piastra Macconkey3
– 1 piastra mEnterococcus
– 1 piastra Chromogenic Urinary Tract Infection (UTI) Medium
– 3 anse blu da 10 l (1 ansa blu per ogni terreno :
Macconkey3, mEnterococcus e Chromogenic UTI Medium)
– 1 pennarello
– Guanti
• Procedimento:
– Scrivere il nome e la data sul fondo delle piastre
– Immergere l’ansa blu da 10 l nella provetta delle urine per prelevare il campione eseminare su piastra Chromogenic UTI Medium nel seguente modo:
– Immergere l’ansa blu da 10 l nella provetta delle urine per prelevare il campione e
1 2
Dipslide
• IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE L'INFEZIONE contando il numero di colonie: più di 20-25 corrispondono a una conta di 100.000
IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE L'INFEZIONE contando il numero di colonie: più di 20-25 corrispondono a una conta di 100.000 (Clicca sull'immagine per ingrandirla)
Giorno 2:
INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRALettura piastra:
si esegue visivamente la conta delle colonie;
In caso di:
1)-assenza di crescita (nessuna colonia presente): il risultato si esprime come segue:
< 1000 CFU/ml;
2)-presenza di colonie:2.1- eseguire visivamente la conta delle colonie; 2.2- il N.° di colonie conteggiate deve essere moltiplicato x 100 se si utilizza l’ansa da 10 microlitri = 1/ 100 ml [oppure x 1000 se si utilizza l’ansa gialla da 1 microlitro];2.3- L’unità di misura si esprime nel seguente modo:
CFU/ml oppure UFC/ml (CFU o UFC = Unità Formante Colonia / ml).La determinazione della carica microbica deve essere eseguita per ogni tipo di colonia morfologicamente diversa.Per indicare positiva una urinocoltura (presenza di infezione) si deve ottenere una conta = o > a 105 CFU/ml (= 100.000 germi/ml) per campione ottenuto da mitto intermedio.In caso di valori inferiori a 10 4 CFU/ml sono indice di contaminazione.
Giorno 2:
INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRALettura piastra:
si esegue visivamente la conta delle colonie;
Tipo colonia (specificare l’aspetto) numero
Somma delle colonie
Test del POTERE ANTIMICROBICO RESIDUO (PAR test)
• Il test individua
– Residui di farmaci antibiotici
– Residui di farmaci non antibiotici dotatidi attività antimicrobica
– Sostanze naturali con effettoantimicrobico simile
Numerose piante sono dotate di potere antimicrobico:
• Vari cereali
• Carote
• Patate
• Liliacee come aglio e cipolla
• Crocifere (senape, rafano)
• Propoli
• Aloe vera
• Estratti di semi di pompelmo
• Rosmarino
• Ceci
• Salvia
• Timo
• Fragole
• Aceto di mele
Numerosi oli essenziali hanno azione antisettica perché contengono
FENOLI ED ALDEIDI (Thymol da Thymus vulgaris)
ALCOOLI (Linalol da Lavandula vera, L. latifolia/spica)
• Alcuni farmaci NON antibiotici sono dotati di attivitàantibatterica evidenziabile nei liquidi biologici: Esempi:
– Neurolettici
– Antimalarici
– Antistaminici
– Diuretici
– Anti-ulcera
– Anti-ipertensivi
– Anestetici
• Alcuni fattori naturali e principi attivi diversi dagliantibiotici sono dotati di attività antibattericaevidenziabile nei liquidi biologici: Esempi:
– Frazioni del complemento
– Opsonine ed anticorpi specifici
– Proteine di derivazione fagocitaria
– Beta-lisine
Par test: saggio di diffusione in agar
Inoculo con spore
di Bacillus subtilis
Dischetto imbevuto di urine
Dischetto sterile (CONT NEG)
Dischetto imbevuto di
Penicillina (CONT POS)
37 °C
PAR positivo PAR negativo
POS
POSNEG
NEGURINE
URINE
PAR TEST POSITIVO PAR TEST NEGATIVO
Par test: interpretazione
Par - Coltura - Il risultato della coltura è avvalorato
Par- Coltura + Il risultato della coltura è avvalorato
Par+ Coltura - Attenzione alle basse cariche batteriche
Germi difficili?
Esecuzione di test di approfondimento
Richiesta di informazioni cliniche (paziente sintomatico?, terapia antibiotica in atto?)
Assunzione di sostanze antibatteriche con l’alimentazione?terapie alternative con effetto antimicrobico?
Par+ Coltura + Se i paziente è in terapia antibiotica, questa è inefficace
Par test: ruolo nella diagnosi delle infezioni delle vie urinarie
• Il Par test in associazione all’urinocoltura èfondamentale per una corretta diagnosi delleinfezioni delle vie urinarie
• In assenza di dati clinici: Aiuta il microbiologonell’interpretazione dell’esame colturale
• Strumento aggiuntivo nella diagnosi delle infezionidelle vie urinarie
Il PAR test è un saggio di diffusione da eseguire in piastre di agar nutritivo inoculato con spore del microrganismo Bacillus subtilis. E’ utilizzato per determinare la presenza di sostanze dotate di
potere antibatterico nei liquidi biologici (latte, urine, sangue, ecc.).
Materiale-piastre di PAR test con la coltura vitale di Bacillus subtilis;
-pinzetta;-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare per immergere nel campione di urine in esame;
-dischetti CONTROL di diametro 13 mm imbibiti di antibiotico come controllo positivo;-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare come controllo negativo.
PROCEDIMENTO:Prelevare con pinzetta un dischetto BLANK ed immergerlo nel campione di urine in esame;
allontanare il liquido in eccesso;-porre il dischetto sulla piastra di PAR Test esercitando una leggera pressione su di esso in modo
da assicurare un buon contatto con la superficie dell’agar;
-porre su ogni piastra un dischetto CONTROL come controllo positivo e un dischetto BLANK come controllo negativo.
-Incubare le piastre a 37 °C per 24 - 48 ore.
Giorno 4: PAR TEST
ATTENZIONE: prima di passare da un dischetto al successivo pulire accuratamente la pinzetta usata con alcool isopropilico, in modo da evitare il trasferimento di eventuali sostanze antibatteriche da
un dischetto all’altro.
Giorno 4: PAR TEST
DISCHETTO IMBEVUTO
DI URINADISCHETTO BLANK
(CONTROLLO NEGATIVO)
DISCHETTO CONTROL
(CONTROLLO POSITIVO)
INOCULO CON SPORE
DI BACILLUS SUBTILIS
Giorno 5:
INTERPRETAZIONE DEL PAR TEST
-Osservare controluce le piastre dopo incubazione per individuare la presenza di un
alone di inibizione attorno al dischetto imbibito con il campione in esame.In presenza di alone significa che sono presenti nel campione sostanze ad azione
battericida.-Il controllo negativo non deve presentare alcun alone;
-Il controllo positivo deve esibire un alone chiaramente visibile.
URINEPOS
NEG
URINE
POS
NEG
PAR TEST POSITIVO PAR TEST NEGATIVO
TEST DELLA SENSIBILITA’ DEI BATTERI AGLI ANTIBIOTICI: metodo di diffusione in agar
Materiale:1 piastra petri con terreno Mueller-Hinton
1 provetta di soluzione fisiologica 4-5 ml.1 ansa
1 tampone sterile
guanti pennarello
pinzettedischetto antibiotato
PROCEDIMENTO:1-INOCULO DELLE PIASTRE DI MUELLER HINTON AGAR:
-scegliere , da una coltura in MAC CONKEY AGAR, 4 o 5 colonie ben isolate e morfologicamente simili e con un’ansa sterile toccare la parte superiore della colonia;
- sospendere in una provetta contenente 4- 5 ml di soluzione fisiologica;-agitare bene le colonie raccolte con l’ansa nella provetta del terreno liquido,
aiutandosi con il vortex, fino ad ottenere una soluzione con torpidità omogenea = CORRISPONDENTE AD UNA TORBIDITA’ DI MAC FARLAND ( corrispondente a 106 di
batteri).
-Immergere un tampone sterile nella provetta, prelevare una certa quantità di sospensione; eliminare l’eccesso di sospensione presente nel tampone con cura ,
ruotando diverse volte e premendo contro la parte superiore della provetta, sopra dal menisco della sospensione.
Giorno 2: ANTIBIOGRAMMAMETODICA DI KIRBY- BAUER o TEST DI DIFFUSIONE IN AGAR o TEST DI SENSIBILITA’
MIC ( MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE)
Metodo di diffusione in agar (KIRBY-BAUER) è un metodo quantitativo per valutare la sensibilità agli antibiotici basato sulla misurazione degli aloni di inibizione.
Si utilizzano piastre pronte del terreno agarizzato Mueller Hinton.
MUELLER HINTON AGAR
Terreno raccomandato per i test di sensibilità agli antibiotici
ComposizioneInfuso di carne di manzo 300 g/LIdrolisato di caseina 17,5 g/lAmido solubile 1,5 g/l
Agar 17,0 g/l
Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.
-Inoculare strisciando il tampone uniformemente sulla superficie della piastra del terreno Mueller-Hinton Agar ruotando la piastra di circa 60° . Ripetere per altre due volte per garantire una semina uniforme e quindi una crescita confluente ( per fornire aloni di
inibizione uniformemente circolari).
-Prima di porre i dischetti impregnati di antibiotico, lasciare assorbire l’inoculo chiudendo la piastra con il coperchio e lasciarla a temperatura ambiente per 5 minuti.
2-DEPOSIZIONE DEI DISCHETTI-per mezzo di una pinza, pulita e disinfettata con alcool isopropilico, porre i dischetti di antibiotici sulla superficie del terreno effettuando una leggera e delicata pressione del
dischetto sul terreno.
-Temperatura e tempo di incubazione in termostato: + 35 / +37 °C per 16-18 ore.
Giorno 3:
INTERPRETAZIONE ANTIBIOGRAMMA
-INTERPRETAZIONE DEGLI ALONI
-Dopo incubazione si esegue la lettura delle piastre: misurare gli aloni di
inibizione completa (arrotondando al millimetro più prossimo), utilizzando un
calibro o un idoneo dispositivo di misurazione = righello.
Si misura il diametro dell’alone comprendente anche il diametro del
dischetto. In base all’ampiezza dell’alone si classifica l’efficacia
dell’antibiotico e in base a apposite tabelle si classifica il microrganismo
come sensibile, moderatamente sensibile oppure resistente .
In caso di nessun alone si ha assenza di inibizione e quindi non
efficacia dell’antibiotico.
Diametro alone di inibizione (mm)
Antibiotico Contenuto del
disco(g)Resistente Intermedi
o
Moderatament
e sensibile
Sensi
bileAc.nalidixico(NA) 30 13 14-18 / 19
Ampicillina(AMP) 10 13 / 14-17 17
Ceftazidime(CAZ) 30 14 / 15-17 18
Nitrofurantoina(F) 300 14 15-16 / 17
Norfloxacina(NOR) 10 12 13-16 / 17
INTERPRETAZIONETabella di riferimento
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazioneAcido nalidixicoAmpicillinaCeftazidimeNitrofurantoinaNorfloxacina
Diametro
dell’alone di
inibizione
Dischetto
antibiotato
Prato o coltura
batterica
Diametro alone di inibizione (mm)
Antibiotico Contenuto del
disco(g)Resistente Intermedio Moderatamente
sensibile
Sensi
bileNetilmicina(NET) 30 13 14-18 / 19
Ac.Pipemidico ( Pi)
2 10 / 11-16 16
Cefuroxima (CXM) 30 14 / 15-17 18
20 14 15-16 / 17
Clindamicina(CC)
15 10 11-14 / 14
INTERPRETAZIONETabella di riferimento
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazione
Diametro
dell’alone di
inibizione
Dischetto
antibiotato
Prato o coltura
batterica
Eritromicina (E)
Diametro alone di inibizione (mm)
Antibiotico Contenuto del
disco(g)Resistente Intermedio Moderatamente
sensibile
Sensi
bileCefoperazon (CF) 30 13 14-18 / 19
Piperacilina ( PiP)
1 10 / 11-16 16
Gentamicina (GM) 10 12 / 13-16 16
100 14 15-16 / 17
Oxicillina (OX)
10 10 11-14 / 14
INTERPRETAZIONETabella di riferimento
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazione
Diametro
dell’alone di
inibizione
Dischetto
antibiotato
Prato o coltura
batterica
Penicilllina (P)
.
Giorno 2: IDENTIFICAZIONE MICROBICA
In campo microbiologico molto importante è l’isolamento e l’identificazione delle colture
microbiche cresciute dopo semina su terreno selettivo. Se sul terreno selettivo sonopresenti colonie ben isolate si procede con l’identificazione batterica basata suspecifici test biochimici necessari per identificare il genere e la specie batterica.
Per l’ identificazione si utilizzano dei sistemi pronti appositamente preparati che sibasano sulla capacità di fermentazione degli zuccheri e di test biochimici chepossiedono i batteri a seconda della famiglia microbica di appartenenza.Questi sistemi di identificazione sono i SITEMI API ( esempio API STAF per Staphylococcuso API E per enterobacteriaceae) oppure gli ENTEROTUBE , per esempio ENTEROTUBE IIutilizzato per identificare i batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceacresciuti su terreno selettivo MacConkey Agar.
Giorno : IDENTIFICAZIONE MICROBICA
Materiale:-ENTEROTUBE II : un kit formato da una provetta di plastica con 12 sezioni, ciascunadelle quali contiene un substrato di coltura diverso. Presenta un ago metallico perl’inoculazione che passa attraverso i vari substrati e sporge da entrambe le estremitàdella provetta;-colture isolate cresciute su MacConkey Agar.
PROCEDIMENTO:-Inoculazione : con l’estremità del filo metallico che sporge si preleva una colonia benisolata dal terreno di coltura e si fa passare attraverso tutte le sezionidell’Enterotube II.
Giorno 2: Interpretazione Enterotubeistruzioni per l’impiego
2)
INOCULARE ENTEROTUBE II RUOTANDO
PRIMA L’AGO ED ESTRAENDOLO POI
CON MOVIMENTO ROTATORIO
ATTRAVERSO TUTTI GLI SCOMPARTI DEL
TUBO. REINSERIRE NELL’ENTEROTUBE
L’AGO (SENZA STERILIZZARE) FINO A
FAR CORRISPONDERE LA TACCA
ALL’APERTURA DEL TUBO. LA PUNTA
DEVE ARRIVARE FINO ALLO SCOMPARTO
DEL CITRATO.
1)SVITARE ENTRAMBI I CAPPUCCI DELL’
ENTEROTUBE II.
LA PUNTA DELL’AGO DA INOCULO SI TROVA
SOTTO IL CAPPUCCIO BIANCO. PRELEVARE
UNA COLONIA BEN ISOLATA DIRETTAMENTE
CON LA PUNTA DELL’AGO.
FARE ATTENZIONE A NON PENETRARE
NELL’AGAR.
3)
SPEZZARE L’AGO, PIEGANDOLO IN
CORRISPONDENZA DELLA TACCA. LA
PARTE DI AGO CHE RIMANE
ALL’INTERNO DELL’ENTEROTUBE II
ASSICURA, DURANTE L’INCUBAZIONE ,
UN AMBIENTE ANAEROBIO NECESSARIO
PER LA VERA FERMENTAZIONE DEL
DESTROSIO E PER LA
DECARBOSSILAZIONE DELLA LISINA E
DELL’ORNITINA E PER
L’EVIDENZIAZIONE DELLO SVILUPPO DI
GAS.
4)
CON L’AGO RIMASTO PERFORARE LA
PELLICOLA DI PLASTICA IN
CORRISPONDENZA DEGLI ULTIMI 8
SCOMPARTI ( ADONITOLO,
LATTOSIO,ARABINOSIO,SORBITOLO, VOGES-
PROSKAUER,DULCITOLO/FENILALANINA,UREA,CITRAT
O) PER CREARE UN AMBIENTE
AEROBIO. RIAVVITARE EMTRAMBI I
CAPPUCCI.
5)INCUBARE ENTEROTUBE II. ALLA
TEMPERATURA DI + 35° / + 37°C PER 20 – 24
ORE IN POSIZIONE VERTICALE IN
PORTAPROVETTE, CON LO SCOMPARTO DEL
DESTROSIO RIVOLTO VERSO L’ALTO.
6)DOPO INCUBAZIONE PROCEDERE CON LA
LETTURA REGISTRARE SULL’APPOSITO
FOGLIO DI IDENTIFICAZIONE LE REAZIONI
POSITIVE, TRANNE INDOLO E VOGES-
PROSKAUER, CONFRONTANDO IL TUBO CON
LA TABELLA DELLE REAZIONI E/O CON UN
ENTEROTUBE II NON INSEMENZATO.
GLI SCOMPARTI CHE NON PRESENTANO
VARIAZIONI CORRISPONDONO A REAZIONI
NEGATIVE.
7)
EFFETTUARE DUE TEST
1- TEST DELL’INDOLO;
2-TEST DI VOGES-PROSKAUER.
TENERE ENTEROTUBE II IN POSIZIONE
ORIZZONTALE ED AGGIUNGERE I
REAGENTI FACENDO UN FORO NELLA
PELLICOLA SUL FONDO
DELL’ENTEROTIBE . (I REAGENTI
VERRANO AGGIUNTI DIRETTAMENTE NEI
SEGUENTI SCOMPARTI:
1- NELLO SCOMPARTO H2S/INDOLO
INIETTARE 3 o 4 GOCCE DEL REAGENTE DI
KOVACS o REAGENTE DI JAMES
POSITIVO= VIRAGGIO AL ROSSO ENTRO
POCHI MINUTI;
2- NELLO SCOMPARTO DI VOGES-
PROSKAUER, INIETTARE 3 GOCCE DI VP
1 (SOLUZIONE DI ALFANAFTANOLO) E 2
GOCCE DI VP 2 (IDRATO DI POTASSIO).
POSITIVO =QUANDO VI NOTA UNA
VARIAZIONE DI COLORE , VIRA AL
ROSSO, DOPO
10 MINUTI.
REAZIONI
SUBSTRATO OSSERVAZIONI
NEGATIVO POSITIVO
DESTROSIO O GLUCOSIO
ROSSO GIALLO Dalla fermentazione del substrato si ha acidificazione con variazione di colore dell’indicatore
SVILUPPO DI GAS CERA ADESA CERA STACCATA
La cera serve per creare le condizioni di anerobiosi e aiuta la fermentazione con sviluppo di gas.
In presenza di gas si ha il sollevamento o il distacco della cera dall’agar delo scomparto.
LISINA GIALLO VIOLA Per decarbossilazione della lisina si forma cadaverina, composto alcalino che provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.
ORNITINA GIALLO VIOLA Per decarbossilazione della ornitina si forma putrescina, composto alcalino che provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.
H2S BEIGE NERO-MARRONE L’acido solfidrico reagisce con ioni ferro e forma un precipitato insolubile nero di solfuro di ferro.
INDOLO INCOLORE ROSSO La produzione dell’indolo nella decomposizione del triptofano si evidenzia dalla colorazione rossa che assume il REAGENTE DI KOVACS aggiunto nello scomparto dopo l’incubazione.
ADONITOLO
ROSSO GIALLO
Durante la fermentazione dei carboidrati si formano prodotti acidi che sono rivelati dalla variazione di colore dell’indicatore.
In presenza di colore arancio la reazione è negativaLATTOSIO
ARABINOSIO
SORBITOLO
VOGES- PROSKAUER
INCOLORE ROSSO
Dalla fermantazione del destrosio si forma l’acetoina che viene rivelata dall’aggiunta nello scomparto dei reagenti di Voges-Praskauer dopo incubazione. Se entro 10 minuti si nota una colorazione rossa la reazione è positiva.
DULCITOLO VERDE GIALLO La fermentazione del dulcitolo porta ad acidificazione con viraggio dell’indicatore al colore giallo.
Interpretazione Enterotube: Tabella delle reazioni
Giorno 3: Interpretazione Enterotube
InterpretazioneL’identificazione del microrganismo preso in esame si ottiene
procedendo con la determinazione di un profilo numerico.
Il profilo numerico è un codice di 5 cifre da ricercare nella lista dei profili microbici
identificati e catalogati nel l’INDICE ANALITICO. Registrazione dell’identità del
microrganismo:
Codice identificativo:
Specie microbica :
API® Yeast Identification
API 20C AUX – 48 to 72-hour identification of yeasts