Comparación de los promotores alcohol oxidasa y formaldehido deshidrogenasa en la producción heteróloga de la lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris en
cultivos discontinuo y fed-batch.
O. Cos, D. Resina, R. Ramón, P. Ferrer, J.L. Montesinos y F. Valero
Dept. Enginyeria Química. ETSE. UAB.
Optimización del sistema de producción de proteínas heterólogas en Pichia
pastoris: Aplicación a la producciónde lipasas y proteínas terapéuticas
Programa Nacional de Procesos y Productos Químicos CICYT PPQ2001-1908
BIOTEC’04F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Objetivo:
Utilizar como proteína modelo la lipasa del hongo Rhizopus oryzae, para explorar, con la producción de esta proteína heteróloga en Pichia pastoris, la influencia de aspectos genéticos, fisiológicos, estrategias de cultivo, monitorización, control y escalado con el objetivo de maximizar su producción de manera reproducible, y aplicar todo el conocimiento adquirido sobre el sistema en la producción de otras dos proteínas heterólogas del proyecto: la lipasa 2 de Candida rugosa y la gonadotropina coriónica equina.
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
ORIGEN SISTEMA DE EXPRESIÓN Pichia pastoris :
- Desarrollo de la tecnología de cultivo.- Elevadas densidades celulares (> 100 g l-1).
Sistema de expresión de proteínas heterólogasalternativo (SalK Institute, CA, EEUU)
E. coli, S. cerevisiae
Levadura metilotrófica interesante para la SCP:Single cell protein, 1970.
Consumo de metanol residual para la obtención de biomasa
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
¿QUÉ VENTAJAS OFRECE P. pastoriscomo sistema de expresión?:
Eucariota: modificaciones post-transcripcionales√Secreción√
No fermentativo√Manipulación genética sencilla√
Biomasa elevada ( > 100 g l-1)√
PAOX1: FUERTE y REGULABLE
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Levadura metilotrófica:
Pichia pastoris: SISTEMA DE EXPRESIÓN
Metanol
Fuente de C y E
Formaldehído
O2
H2O2
Alcohol oxidasa(AOX) Síntesis
AOX hasta un 30 %
de la proteína total soluble.
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Pichia pastoris: SISTEMA DE EXPRESIÓN
ASPECTOS GENERALES DEL SISTEMA PAOX1
Metanol
INDUCCION
PAOX1 Gen de interés
Proteína
REPRESION
Glucosa, glicerol
Metabolismo del metanol
GAP
ATP ADP
HCHO GS-CH2OH
GSH
NAD+ NADH
HCOOH
NAD+ NADH
CO2HCHO
O2
H2O2
1/2O2 + H2O
CH3OH
GAP DHA
3 42
CH3OH
5Xu5P
F6P
1/3 GAP BIOMASA
DHA DHAP
FBP
Pi
6
7 8
PEROXISOMA CITOSOL
AOXFLD
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Pichia pastoris: SISTEMA DE EXPRESIÓN
SISTEMA DE EXPRESIÓN basado en el PAOX1
Dirigidos al locus AOX1 del
genoma de Pichia
Gen AOX1PAOX1
Solo AOX2 funcional 10% AOX
MutS (Methanol utilisation slow)
AOX1TT
5’AO
X1 PTEF1
PEM
7
Zeoc
ina
Cyc1
TTpUC ori
MCS
5’AO
X1
AOX1TT
Zeoc
ina
MCS
AOX1 y AOX2 funcionales 100% AOX
Mut+ (Methanol utilisation plus)
Características intrínsecasdel gen/la proteína
Fenotipo MutS/Mut+
Condiciones de cultivo:composición medioetapa de inducción
4584868
Factores influyentes en la expresión :
SISTEMA DE EXPRESIÓN basado en el PAOX1
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Promotores alternativos:GAP, FLD
LIPASA DEL HONGO Rhizopus oryzae (ROL):
Rhizopus oryzae (R. arrhizus) : hongo filamentoso de elevado interés en biotecnología e investigación académica.
EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE LA ROL ENPichia pastoris
Producción de enzimas lipolíticas:
-Principal aplicación: investigación básica académica.
Resolución de compuestos quirales.
-ROL comercializada: nativa
CARACTERÍSTICAS DE LA ROL:
Secuencia señal 26 aa
pro-secuencia 269 aa32 kDa
4 sitios N-glicosilación3 puentes disulfuro
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
SISTEMA DE EXPRESIÓN ALTERNATIVOS
CONSTITUTIVOS GAP
POR INDUCCIÓN FLD
El promotor FLDCH3OH
Metanol MetilaminaCH3NH2CH3NH2CH3OH
NH4+
O2
O2
HCHO
Glutamato
H2O
H2O
DHA GAP
AOXMOX
HCHO GS-CH2OH
GSH
NAD+ NADH
HCOOH
NAD+ NADH
CO2
Constituents Cel.lulars FLD FMD
Fuente de Carbono
Fuente de Nitrógeno
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Glucosa+Amoni Glucosa+Metilamina Metanol+Amoni Metanol+Metilamina Glicerol+Metilamina Sorbitol+Metilamina Metanol+Amoni AOX
Act
ivita
t lip
olíti
ca U
A m
l-1
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
OD
600
nm
0
10
20
30Activitat lipolíticaOD 600nm
Cultivos con diferentes fuentes de C i N.
Gluc+NH 4
Met+NH 4
Met+MASorb+MA
Glic+MAMet+NH 4
AOXGluc+MA
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Fermentación batchAOX - Mut+ versus FLD
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
0.030.06µmax (h-1)
14861413YP/X* (UA g-1 X)
0.430.27YX/S (g X / g S)
15.46.05Actividad máxima* (U/ml)
FLDAOX Mut+
1447Productividad esp. (UA g-1X h-1)
145201Productividad* (UA L-1 h-1)
Biom
asa
(g/l)
0
1
2
3
4
5
Tiempo (h)0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Activ
idad
lipo
lític
a (U
A/m
l)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Met
anol
(g/l)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
15 UA/ml
6 UA/ml
YP/X similar
Menor µMAX del promotor FLD
Productividad esp. 2.2 mayorpara el promotor AOX
FLD promotor alternativo al AOX interesante
Tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Bio
mas
a (g
/l)
0
2
4
6
8
10
12
Sorb
itol (
g/l)
02468
1012141618202224
Activ
idad
lipo
lític
a (U
A/m
l)
0
5
10
15
20
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Fermentación fed-batchPromotor AOX
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Discontinuo 40 g/L de glicerolRápido crecimiento del microorganismoInicio fase de transición pO2/CER
BATCH
TRA
NSI
CIO
N FED-BATCH
Pichia Mut+ única copia
Tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60
Bio
mas
a (g
/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
Act
ivid
ad li
polít
ica
(UA
/ml)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200C
once
ntra
ción
met
anol
(g/ L
)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
MetOHGLI
Hora Glicerol Metanol1 300 02 300 0 3 160 1004 100 1005 65 100
BATCH
TRA
NSI
CIO
N FED-BATCH
Pichia Mut+ única copia
Tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60
Bio
mas
a (g
/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
Act
ivid
ad li
polít
ica
(UA
/ml)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Con
cent
raci
ón m
etan
ol (g
/ L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Etapa de transición
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
MetOH
Cromatografía de gases
Modificación delcaudal
Objetivo: Niveles de metanol por debajo de 2 g/l
BATCH
TRA
NSI
CIO
N FED-BATCH
Pichia Mut+ única copia
Tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60
Bio
mas
a (g
/L)
0
10
20
30
40
50
60
70
Act
ivid
ad li
polít
ica
(UA
/ml)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Con
cent
raci
ón m
etan
ol (g
/ L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Parámetros monitorizados en líneaTemperaturapHpO2
rpmCaudal aireaciónCaudal ácido/base
Caudal metanolCaudal glicerol
Acciones de control
DCU FermentadorMicroburetas
FERMENTADOR1 ml1 ml1 ml1 ml
MicroburetasAdición de metanol y glicerol
Monitorización
RS-422
RS-232
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Promotor AOX efecto fenotipoCultivos fed-batch
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Degradación proteolítica
Niveles de actividad mayores en la MutS
Facilidad de controlar niveles demetanol mayor en la MutS
Diferencias en la velocidadde crec. del microorganismo
205 U/ml
Muts
Mut+
150 U/ml
YP/X 2.5 veces mayor en MutS
Productiv. similares
Tiempo (h)
0 15 30 45 60 75 90
Biom
asa
(g/l)
0
10
20
30
40
50
60
70
Activ
idad
lipo
lític
a (U
A/m
l)
0
50
100
150
200
250
Met
anol
(g/l)
0
1
2
3
4
5
6
B T FB
Biom
asa
(g·l-
1 )
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (h)
0 10 20 30 40 50 60
Activ
idad
lipo
lític
a (U
A·m
l-1)
0
50
100
150
200
250
Met
anol
(g·l-
1 )
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0B T FB
4563Productividad esp. (UA g-1X h-1)
28792246Productividad* (UA L-1 h-1)
23625775YP/X* (UA g-1 X)
150205Actividad máxima* (U/ml)
0.0450.005µ (h-1)
Muts Mut+F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Fermentación fed-batchPromotor FLD
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
Sorb
itol (
g/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
µ= 0.01 h-1
B T FB
Batch 40 g/l gliceroly amonio limitantes
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
Sorb
itol (
g/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
µ= 0.01 h-1
B T FB
Transición 10 g/l sorbitol3 g/l metilamina
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
Sorb
itol (
g/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
µ= 0.01 h-1
B T FB
Fed-batch Adición programadaµ constante = 0.01 h-1
( ) ( )[ ]( ) ( )[ ]0
0
00 exp ttSSYtVtXF
SX
−−
= µµ
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
Sorb
itol (
g/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
µ= 0.01 h-1
B T FB
170 U/ml
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
Sorb
itol (
g/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
µ= 0.01 h-1
B T FB
170 U/ml
Para intentar evitar la paradaen la síntesis de la proteína se
realiza un fed-batch manteniendoconstante la concentración de
sorbitol alrededor de 8 g/l.
YP/X y productividades específicas más próximas
a Muts
Productividades similares
4563Productividad esp. (UA g-1X h-1)
28792246Productividad* (UA L-1 h-1)
23625775YP/X* (UA g-1 X)
150205Actividad máxima*
(U/ml)
0.0450.005µ (h-1)
58
2402
4084
170
0.010
FLDMuts Mut+
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Sorb
itol (
g/L)
024681012141618202224262830
Activ
idad
Lip
olíti
ca (U
/mL)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
B T FB
Sorbitol = 8 g/L
385 UA/ml
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
El promotor FLD es unaalternativa real al AOX para la
producción de proteínasheterólogas en el microorganismo
huésped Pichia pastoris sinnecesidad de utilizar metanol
Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biom
asa
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Sorb
itol (
g/L)
024681012141618202224262830
Activ
idad
Lip
olíti
ca (U
/mL)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
B T FB
Sorbitol = 8 g/L
385 UA/mlActividades, productividades
y YP/X máximas para el promotor FLD manteniendoconstante la concentración
de sorbitol en el medio a 8 g/l
74
4379
6553
385
0.02
4563Productividad esp. (UA g-1X h-1)
28792246Productividad* (UA L-1 h-1)
23625775YP/X* (UA g-1 X)
150205Actividad máxima*
(U/ml)
0.0450.005µ (h-1)
58
2402
4084
170
0.010
FLDµ=0.01Muts Mut+ FLD
8 g/l
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04
Comparación de los promotores alcohol oxidasa y formaldehido deshidrogenasa en la producción heteróloga de la lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris en
cultivos discontinuo y fed-batch.
O. Cos, D. Resina, R. Ramón, P. Ferrer, J.L. Montesinos y F. Valero
Dept. Enginyeria Química. ETSE. UAB.