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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
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Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC
Definición: Técnica que realiza la separación de
una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Definición:Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina)
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase estacionaria:
• Silica gel (polar)
• Carbonato de calcio
• Almidón
• Alúmina (polar)
Diámetro: 5 - 50 mm
Longitud:5 cm – 1 m
Tamaño40 - 63 μm.63 – 200 μm.
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente.
Serie eluotrópica
PentanoÉter de petróleoHexanoCiclohexanoTetracloruro de carbonoToluenoXilenoBencenoCloroformoAcetonaAcetato de etiloAcetonitriloIso-propanolMetanolAgua Rubinson & Rubison Química Analítica Contemporánea
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Mecanismo de separación:
K = CS/CM
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNATipos de cromatografía en columna:
Intercambio Iónico
Exclusión Molecular
Afinidad
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Cromatografía en columnaDesventajas de la cromatografía
en columna
Diámetro: 5 - 50 mmLongitud: 5 cm – 1 mTamaño de partícula: 40 – 200 μmGrandes volúmenes de fase móvilTiempos de análisis largosGran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado
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Antecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el
desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a
biopolímeros polímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos . Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la
instrumentación se mejora 1970-1980 Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la
eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna.
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Instrumentación: Reservorio de fase móvil
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Reservorios de fase móvil
Recipiente de vidrio
Filtro
Fase Móvil:Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 12μmLibre de aire
Tubo de Teflón 1/8’’
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Sistema de bombea
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Sistema de bombeo de fase móvil
Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna
Características:Resistente a los solventesAmplio intervalo de flujosFacilidad de cambiar un solvente por otroDe fácil manejo y mantenimiento
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Sistema de bombeo de fase móvil
Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática
Sistema de bombeo a flujo constante
Bomba tipo jeringa
Bomba reciproca
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Bomba neumática
10 bar
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Bomba tipo jeringa
Volumen de la cámara: 200 – 500 cm3
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Bomba reciproca
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Bomba reciproca
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Puerto de inyección
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Puerto de inyección
Válvula Rheodyne
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Características de la muestra
Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 μm
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Puerto de inyección
Diagrama de flujo válvula Rheodyne
Loop de 10 -50 μl
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Puerto de inyección
Diagrama de flujo válvula Rheodyne
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Columna
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Columna
Acero ( Cr-Ni-Mo)Relativamente inerte a la corrosión químicaLongitud: 10, 12.5 o 15 cmDiámetro: 4.6, 6.2 o 9 mmSoporte: 10, 5, 4 o 3 μm
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Soporte
Silica microporosa
Permeable a solventes (fase estacionaria)Diámetros : 3 - 10 μmÁrea superficial: 500 m2/g
Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Instrumentación: Fase estacionaria
Fase polar Fase no polar
R= (CH2)3NH2 Amino R= (CH2)17CH3 Octadecilo
R= (CH2)3C=N Ciano R= (CH2)7CH3 Octilo
R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH
Diol R= (CH2)3C6H5 Fenilo
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Modo de separación
Fase Normal Fase Reversa
Polaridad fase estacionaria
Alta Baja
Polaridad fase móvil
Baja- media Media- alta
Típica fase móvil Heptano/CHCl3 CH3OH/H2O
Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Fase reversa
• Separación de mezclas con polaridades diversas
• Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil
• Fácil, rápido y reproducible
• Picos menos coleados • Se estabiliza
rápidamente a cambios de fase móvil
• Reproducible
Fase normalVentajas
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Fase móvil
![Page 32: [PPT]Cromatografía en columna - Páginas Web …sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/gmta/QAA/HPLC.pptx · Web viewCromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Definición:](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062910/5bab797609d3f2e74b8c2c16/html5/thumbnails/32.jpg)
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Modalidades de separación
Isocrático Gradiente por etapas
Curvas de gradiente
+ +
+
--
-
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Modalidades de separación
Isocrático
Gradiente
Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Efecto de la temperatura
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Efecto del tipo de fase estacionaria
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Efecto del flujo de fase móvil
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Efecto del pH
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Efecto del fase móvil
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Detectores
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
![Page 41: [PPT]Cromatografía en columna - Páginas Web …sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/gmta/QAA/HPLC.pptx · Web viewCromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Definición:](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022062910/5bab797609d3f2e74b8c2c16/html5/thumbnails/41.jpg)
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Tipo Respuesta
Rango lineal Detecta
UV/VisArreglo de diodos
Selectivo 10-4 -10-5Enlaces C-O, aromáticos, alquenos
Florescencia Selectivo 10-3 – 10-4 Hidrocarburos policíclicos
Conductividad
Selectivo 10-3 – 10-4 NO3-, NO2
-, SO42-, Cl-
Índice de refracción Universal 10-3 – 10-4
Ácidos orgánicos, azúcares
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
Celda
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
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