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Pourquoi un diagnosticdu paludisme ?
Bénéfice pour le maladeBénéfice pour la communauté Adaptation du traitement Maîtrise des résistances
Comment ?
Diagnostic de présomptionDiagnostic direct
MicroscopieQBCTest rapide ou «dipstick»PCR
Diagnostic indirect ou sérologique
1 . Diagnostic présomptif
CirconstancesEléments d’orientation
EpidémiologiquesCliniques Biologiques
AvantagesInconvénients
2. Diagnostic direct
Se fait à partir du sang
Quand effectuer le prélèvement ?Combien de prélèvements ? Procédure et précautions
Au moment du prélèvement : gants, matériel jetable, etc.Transport des prélèvements Traitement au laboratoire
1 Mise en évidence du parasite :MicroscopieQuantitative Buffy Coat (QBC)Cytométrie de flux
2 Mise en évidence d’ag parasitaireTest rapide sur bandelette (dipstick)ELISA, RIA
3 Mise en évidence d’ADN parasitairePCRSondes nucléiques
2. Diagnostic direct
2.1.a Microscopie
La goutte épaisse et le frottisRéalisation pratique
La colorationGiemsaAutres colorations
Points techniques importants
2.1.a Microscopie
La lecture au microscopeSensibilité de la méthode et expression de la densité parasitaire
Pour 100 champs de microscope soit 10 min. de lecture nb de GR nb de GB volume examiné sensibilité
Frottis 5x 10 4 60 0,01 µl 100-200 para /µl
Goutte épaisse 1x 10 6 1200 0,2 µl 10-20 para /µl
1 µl de sang il y a environ 5 000 000 de GR et 6000 GB
2.1.a Microscopie
La lecture au microscopeLes formes parasitaires
2.1.a Microscopie
La lecture au microscope
Les espèces parasitaires Pf, Pv, Po, Pm
Distribution hétérogène
Diagnostic d’espèce sur la base de critères morphologiques
2.1.a Microscopie
AvantagesFaible coût
Morphologie (stades, espèces)
Bonne sensibilité
Quantitatif
Lecture rétrospective
2.1.a Microscopie
InconvénientsDélai
Personnel expérimenté
Equipement
Problème des infections mixtes
2.1.b QBC
PrincipeSang au bout du doigt Tube capillaire+Acridine OCentrifugation Lecture microscope UV
FLUORESCENCE
SensibilitéVolume examiné : 60 µl vs 0.2 µl GESensibilité 1 para/µl
2.1.b QBC
P vivax P falciparum
P falciparum P vivax+ granulocytes Pf gametocyte
2.1.b QBC
AvantagesRapidité Bonne sensibilité
InconvénientsToxicité de l’acridine, coût élevé Equipements Personnel expérimenté Pas approprié au terrainPas quantitatif, espèces ?
2.1.c Cytométrie
Marquage des cellules avec un colorant fluorescent : Hoechst ou thiazole orange Tri des cellules en fonction de la fluorescence et de la taille Evaluation de la parasitémie. Très bonne sensibilité mais bruit de fond important dû aux réticulocytes Utilisée couplée avec immunofluorescencede surface pour analyse phénotypique GRP
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Principe : Détection d’antigènes parasitaires par immunochromatographie
Récolte du sang au bout du doigtLyse du sang Migration des antigènes libérés Détection avec un ou plusieurs Acmx marqués
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Quels antigènes ?
HRPIIP.falciparum (ICT, ParaSight, ParaCheck) Trophozoites et jeunes gamétocytesFonction de détoxification de l’hème ?
pLDHAntigène non spécifique (OptiMal)Tous les stades
Autres utilisationsAlternative aux méthodes isotopiques
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Sensibilité
>95% (comparé à la microscopie 100%) 100 % pour Pf pour des densités >300
p/µl Sensibilité moindre pour Pv (autres
espèces ?)
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Spécificité Autour de 90%
Faux positifs (HRPII essentiellement)
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Avantages
Rapide : 5 min.Peut être réalisé sans expérience Bonne sensibilité et bonne spécificité Ne nécessite pas d’équipements
spécifiquesAdapté au terrain
2.2.a Test Rapid «Dipstick»
Inconvénients
Coût : 1-2 USD.Pas quantitatif Ne distingue pas Pv des autres espèces Stabilité des réactifs sur le terrain ?Nombre important de faux positifsNe donne pas d’indication sur la
viabilité des parasites
2.2.a Test Rapid«Dipstick»
2.2.b RIA et ELISA
Principe : Détection d’antigènes para-sitaires
Utilisation d’anticorps monoclonaux
Technique en « sandwich »
Pas d’intérêt réel pour le diagnostic
Utilisables pour la détection de sporozoites chez les vecteurs
2.3 Diagnostic Moléculaire
Principe
ADN du parasite
PCR et /ou hybridation
Choix de séquences cibles avec régions polymorphes et conservées
Analyse
2.3.a Diagnostic Moléculaire
SSUrRNA genes
1
2
Spécifiquesde genre
Spécifiques d’espèces
P . falciparum
P. vivax
P. malariae
P. ovale
P. sp
PRIMAIRE
SECONDAIRES
DIAGNOSTIC PAR PCR
2.3.a Diagnostic Moléculaire
1. Amplification spécifique de genre
Pf Pv Po PM
Sec
1 2 3 4 5 6
Pri
V M F O
2.3.a Diagnostic Moléculaire
2. Amplifications spécifiques d’espèce
2.3.a Diagnostic Moléculaire
Avantages Petit prélèvement : «blood spot» ADN utilisable pour génotypage, clonage … Caractérisation fine par séquençage Bonne sensibilité : 1-3 parasites par µlBonne spécificité : proche de 100 %Détection de formes parasitaires atypiques Etudes rétrospectivesPartiellement automatisable Semi-quantitatif
2.3.a Diagnostic Moléculaire
Inconvénients
Temps nécessaire pour l’analyse Coût Equipement Bonne technicité (contaminations)
2.3.b Sondes Moléculaires
Principe Extraction ADN «Spotting »Dénaturation / neutralisation Hybridation avec des sondes
marquéesLecture
CommentairesSéquences répétées SSurRNA, rep 20
ou Tel Quantités importantes d’ADN
Parasites Ag parasitaires ADN Méthodes Microscopie QBC HRPII pLDH PCR Expertise +++ ++ - - ++++ Equipement + +++ - - ++++ Temps ++ + - - ++++ Diagnostic d'espèce +++ + Pf Pf /non Pf ++++Adaptation terrain + - ++++ ++++ - Enquêtes +++ - - - ++++Quantification ++++ + - - + +Sensibilité +++ +++ ++ ++ ++++Spécificité +++ + + ++ ++++Standardisation Meth +++ ++ ++ ++ + Coût (USD) 0,05 2,0-4,0 2 2 2
Comparaison des méthodes
Points forts Points faibles Intermédiaire
Principe :
Recherche d’anticorps spécifiques
Détection du complexe ag/ac par 1 . Immunofluorescence indirecte 2 . Elisa3 . Radioimmunoanalyse 4 . Test sérologique sur bandelette
3. Diagnostic sérologique
Parasites fixés à l’airou à l’acétone
Dilutions du sérum
Anti-anticorps fluorescent
Mesure de l’extinction de la fluorescence : titre en Ac spécifiques
3.1 IF indirecte
Ag parasitaire brut, ou fraction purifiée, ou peptide synthétique
Dilutions du sérum
Anti-anticorps marqué par un enzyme
Révélation de l’activité enzymatique
Mesure des DO
Titre en anticorps spécifiques parrapport à un seuil.
3.2 ELISA
3. 3 ELISA
Exemple d’inhibitionde la réactivitéd’anticorps spécifiquesAnti-CSP par le peptidesynthétique homologue Pf et par le peptide hétérologue Pm correspondant
Comparable aux autres tests dans la conception :
Gamme de dilutions des sérums
Anti-anticorps marqué avec isotope *
Mesure des cpm
Titre en Ac spécifiques par rapportà un seuil
3. 3 RIA
Format « dipstick »
Détection qualitative des Ac spécifiques dans le sang, plasma ou sérum.
Spécifique pour Pv et Pf
Sensibilisation du support avec les Ag CSP et MSP1
Enquêtes épidémiologiques
3.3 Dipsticks pour sérologie
Pas d’intérêt pour le diagnostic sauf :
Criblage des donneurs de sang
Complément d’information chez un patient suspecté de paludisme mais avec gouttes épaisses négatives
Diagnostic d’espèce rétrospectif
3.4 Utilité de la sérologie ?
PISTES DE RECHERCHE
Améliorations possibles
Tests rapides
Lecture quantitativeCaractérisation des espècesAméliorer la sensibilité et la spécificité Instaurer un contrôle qualitéDévelopper une banque de réactifs pour
tester la qualité des « dispticks »Combiner sur la même bandelette un
diagnostic paludisme et Dengue
PISTES DE RECHERCHE
Améliorations possibles
PCR
Standardiser la méthode Développer un kit PCR de diagnostic Automatiser la méthode pour des
études à grande échelle
PISTES DE RECHERCHE
Recherche
Tests rapides
Etudier la persistances des antigènes HRPII et pLDH après le traitement.
Etudier le polymorphisme HRPII et pLDHchez des parasites sauvages.
Développer d’autres systèmes antigéniques pour la détection spécifique des stades asexués et sexués
PISTES DE RECHERCHE
Recherche
Tests rapides
Evaluer la possibilité de mise au point d’un test rapide pour déterminer la sensibilité d’un isolats à un médicament
Etudier la durée de validité des « dipsticks » dans les conditions du terrain